JP7305087B2 - 全細胞生体内変換によるステビオールグリコシドの産生 - Google Patents
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Description
本願は、2018年7月16日に出願された米国仮出願第62/698,617号に対する優先権及びその利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
項1
グリコシド中間体からグリコシル化産物を産生するための方法であって、
1つ以上のUDP依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素を細胞内で発現する微生物細胞を提供することと、
微生物株を前記グリコシド中間体と一緒にインキュベートすることと、
前記グリコシル化産物を回収することと、を含む、前記方法。
項2
前記グリコシド中間体が、植物抽出物またはその画分として提供される、項1に記載の方法。
項3
前記グリコシド中間体が、任意選択的に、グリコシル化テルペノイド、グリコシル化フラボノイド、グリコシル化カンナビノイド、グリコシル化ポリケチド、グリコシル化スチルベノイド、及びグリコシル化ポリフェノールから選択される、グリコシル化二次代謝産物である、項1に記載の方法。
項4
前記グリコシド中間体が、グリコシル化テルペノイドである、項3に記載の方法。
項5
前記グリコシド中間体が、ステビオールグリコシドまたはモグロシドである、項4に記載の方法。
項6
前記グリコシド中間体が、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのグリコシル基を有する、項1に記載の方法。
項7
前記グリコシル基が、独立して、グルコシル、ガラクトシル、マンノシル、キシロシル、及びラムノシル基から選択される、項6に記載の方法。
項8
前記グリコシル化産物が、少なくとも5つのグリコシル基、または少なくとも6つのグリコシル基を有する、項6に記載の方法。
項9
前記グリコシル化産物が、7つ、8つ、または9つのグリコシル基を有する、項8に記載の方法。
項10
前記産物の生合成が、前記微生物細胞内の前記中間体の少なくとも2つのグリコシル化反応を伴う、項8に記載の方法。
項11
前記グリコシド中間体が、ステビア葉抽出物由来のステビオールグリコシドである、項1のいずれか1項に記載の方法。
項12
前記ステビオールグリコシド中間体が、ステビオシド、ステビオ-ルビオシド、レバウジオシドA、ズルコシドA、ズルコシドB、レバウジオシドC、及びレバウジオシドFのうちの1つ以上を含む、項11に記載の方法。
項13
前記抽出物が、顕著な成分として、ステビオシド、ステビオ-ルビオシド、及びレバウジオシドAを含む、項12に記載の方法。
項14
前記グリコシル化産物がRebMを含む、項13に記載の方法。
項15
前記グリコシル化産物が、RebK、RebC+1、及び/またはRebC+2を含む、項12に記載の方法。
項16
前記微生物細胞が細菌細胞である、項1~15のいずれか1項に記載の方法。
項17
前記細菌細胞が、Escherichia属、Bacillus属、Rhodobacter属、Zymomonas属、またはPseudomonas属である、項16に記載の方法。
項18
前記細菌細胞が、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Zymomonas mobilis、またはPseudomonas putidaである、項17に記載の方法。
項19
前記細菌細胞がE.coliである、項18に記載の方法。
項20
前記細菌細胞が、以下の遺伝子修飾:ushA及びgalETKMが欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、pgiが欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ならびにpgm及びgalUが過剰発現すること、を含む、項19に記載の方法。
項21
前記微生物細胞が酵母細胞である、項1~15のいずれか1項に記載の方法。
項22
前記酵母が、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Pichia属、Phaffia属、Kluyveromyces属、Candida属、Talaromyces属、Brettanomyces属、Pachysolen属、Debaryomyces属、またはYarrowia属である、項21に記載の方法。
項23
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastori、またはYarrowia lipolyticaである、項22に記載の方法。
項24
前記微生物細胞が、配列番号1~45のいずれか1つのアミノ酸配列を含む1つ以上のUGT酵素またはその誘導体を発現する、項1~23のいずれか1項に記載の方法。
項25
前記微生物細胞が、1-3’グリコシル化UGT酵素を発現する、項24に記載の方法。
項26
前記1-3’グリコシル化UGT酵素が、SrUGT76G1、MbUGT1-3、MbUGT1-3_1、MbUGT1-3_1.5、MbUGT1-3_2、及びそれらの誘導体から選択される、項25に記載の方法。
項27
前記1-3’グリコシル化UGT酵素が、L200A置換を含むSrUGT76G1である、項26に記載の方法。
項28
前記1-3’グリコシル化UGT酵素が、配列番号15、配列番号16、または配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含む、項26に記載の方法。
項29
前記微生物細胞が、1-2’グリコシル化UGT酵素を発現する、項1~28のいずれか1項に記載の方法。
項30
前記1-2’グリコシル化UGT酵素が、SrUGT91D2、SrUGT91D1、SrUGT91D2e、OsUGT1-2、MbUGT1,2、MbUGT1,2.2、及びそれらの誘導体から選択される、項29に記載の方法。
項31
前記微生物細胞が、C13 O-グリコシル化UGT酵素を発現する、項1~30のいずれか1項に記載の方法。
項32
前記C13 O-グリコシル化UGT酵素が、SrUGT85C2またはその誘導体であり、任意選択的にP215T置換を含む、項31に記載の方法。
項33
前記微生物細胞が、C19 O-グリコシル化UGT酵素を発現する、項1~32のいずれか1項に記載の方法。
項34
前記C19 O-グリコシル化UGT酵素が、SrUGT74G1、MbUGTc19、またはその誘導体である、項33に記載の方法。
項35
前記微生物細胞が、1-3’グリコシル化UGT酵素及び1-2’グリコシル化UGT酵素、ならびに任意選択的に、C13 O-グリコシル化UGT酵及びC19 O-グリコシル化酵素を発現する、項24に記載の方法。
項36
前記微生物細胞が、1-3’グリコシル化UGT酵素、1-2’グリコシル化UGT酵素、C19 O-グリコシル化UGT酵素、及びC13 O-グリコシル化UGT酵素を発現する、項35に記載の方法。
項37
前記微生物細胞が、SrUGT85C2またはその誘導体;MbUGT1,2またはその誘導体;SrUGT74G1またはその誘導体;ならびにSrUGT76G1またはその誘導体、MbUGT1-3_1またはその誘導体、MbUGT1-3_1.5またはその誘導体、及びMbUGT1-3_2またはその誘導体から選択される酵素を発現する、項36に記載の方法。
項38
前記UGT酵素が、前記微生物細胞の染色体に組み込まれる、項1~37のいずれか1項に記載の方法。
項39
前記UGT酵素が、染色体外で発現される、項1~37のいずれか1項に記載の方法。
項40
前記微生物細胞が、UDP-グルコース利用能を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項1~39のいずれか1項に記載の方法。
項41
前記微生物細胞が、UDP-グルコースを消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、項40に記載の方法。
項42
前記微生物細胞が、ushAもしくはそのオーソログ、及び/またはgalE、galT、galK、及びgalMのうちの1つ以上もしくはオーソログの欠失、不活性化、もしくは減少した活性を有する、項41に記載の方法。
項43
galETKM遺伝子が、不活性化される、欠失する、または発現において減少する、項42に記載の方法。
項44
前記微生物細胞が、otsA(トレハロース-6-リン酸シンターゼ)もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、項40に記載の方法。
項45
前記微生物細胞が、ugd(UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ)もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、項40に記載の方法。
項46
前記微生物細胞が、waaG、waaO、waaJ、yfdG、yfdI、及び/またはwcaJ、またはそのオーソログ(複数可)の欠失、不活性化、または減少した発現を有する、項40に記載の方法。
項47
前記微生物細胞が、pgi(グルコース-6リン酸イソメラーゼ)もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、項40に記載の方法。
項48
前記微生物細胞が、任意選択的に、pgm(ホスホグルコムターゼ)及び/またはgalU(UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ)、またはそのオーソログもしくはその誘導体である、グルコース-6-リン酸をUDP-グルコースに変換することに関与する酵素をコードする1つ以上の遺伝子の過剰発現または増加した活性を有する、項40に記載の方法。
項49
前記微生物細胞が、ycjU(β-ホスホグルコムターゼ)及びBifidobacterium bifidum ugpA、またはそのオーソログもしくはその誘導体の過剰発現または増加した活性もしくは発現を有する、項40に記載の方法。
項50
前記微生物細胞が、任意選択的に、E. coli zwfまたはその相同体もしくは操作された誘導体の過剰発現または活性である、ペントースリン酸経路(PPP)への流動を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項40に記載の方法。
項51
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli galP及びE.coli glk(グルコキナーゼ)、または代替的に、Zymomonas mobilis glf及びE.coli glk、またはその相同体、オーソログ、もしくは操作された誘導体の増加した発現もしくは活性を含む、グルコース輸送を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項40に記載の方法。
項52
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli pyrH(UMPキナーゼ)、E.coli cmk(シチジル酸キナーゼ)、E.coli adk(アデニル酸キナーゼ)、もしくはE.coli ndk(ヌクレオシド二リン酸キナーゼ)、またはこれらの酵素の相同体、オーソログ、もしくは操作された誘導体の増加した発現または活性を含む、UTP産生及びリサイクルを増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項40に記載の方法。
項53
前記微生物細胞が、任意選択的に、upp(ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ)、pyrH(UMPキナーゼ)、及びcmk(シチジルレートキナーゼ)、またはその相同体もしくは操作された誘導体の過剰発現もしくは増加した活性、または、dctA(C4ジカルボキシレート/オロレート:H+シンポーター)、pyrE(オロレートホスホリボシルトランスフェラーゼ)、pyrH(UMPキナーゼ)、及びcmk(シチジルレートキナーゼ)、またはその相同体もしくは操作された誘導体の過剰発現もしくは増加した活性を含む、UDP産生を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項40に記載の方法。
項54
前記微生物細胞が、任意選択的に、sgrS小制御RNAの欠失、不活性化、または減少した発現を含む、グルコース取り込みの除去または調節を減少させるための1つ以上の遺伝子修飾を有する、項40に記載の方法。
項55
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli agp(グルコース-1-ホスファターゼ)、E.coli yihX(α-D-グルコース-1-リン酸ホスファターゼ)、E.coli ybiV(糖ホスファターゼ)、E.coli yidA(糖ホスファターゼ)、E.coli yigL(リン糖ホスファターゼ)、及びE.coli phoA(アルカリホスファターゼ)、またはそのオーソログのうちの1つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現または活性を含む、グルコース-1-リン酸の脱リン酸化を減少させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項40に記載の方法。
項56
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli rffH(dTDP-グルコースピロホスホリラーゼ)及びE.coli rfbA(dTDPグルコースピロホスホリラーゼ)、またはそのオーソログのうちの1つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース-1-リン酸のTDP-グルコースへの変換を減少させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項40に記載の方法。
項57
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli gigC(グルコース-1-リン酸アデニルトランスフェラーゼ)またはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース-1-リン酸のADP-グルコースへの変換を減少させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項40に記載の方法。
項58
前記微生物細胞が、以下の前記遺伝子修飾:ushA及びgalETKMが、欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、pgiが、欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、pgm及びgalUが過剰発現すること、を含む細菌細胞である、項40に記載の方法。
項59
前記微生物細胞が、前記グリコシド中間体(複数可)を前記細胞内に輸送する内因性輸送タンパク質を発現する、項1~58のいずれか1項に記載の方法。
項60
前記微生物細胞が、前記グリコシド中間体(複数可)を前記細胞内に輸送する組換え輸送タンパク質を過剰発現する、項1~58のいずれか1項に記載の方法。
項61
前記微生物株が、E.coli acrAD、xylE、ascF、bglF、chbA、ptsG/crr、wzxE、rfbX、またはそのオーソログもしくはその誘導体から選択される輸送タンパク質を発現する、項59または60のいずれか1項に記載の方法。
項62
前記微生物細胞が、前記細胞の外にグリコシル化産物を輸送する内因性のまたは組換えトランスポーターを発現する、項1~61のいずれか1項に記載の方法。
項63
前記方法が、グリコシド中間体からグリコシル化産物への少なくとも40重量%の変換をもたらす、項1~62のいずれか1項に記載の方法。
項64
前記方法が、グリコシド中間体からグリコシル化産物への少なくとも50重量%の変換をもたらす、項63に記載の方法。
項65
前記方法が、グリコシド中間体からグリコシル化産物への少なくとも75重量%の変換をもたらす、項64に記載の方法。
項66
少なくとも5:1のRebM対RebDの比が、前記グリコシル化産物として回収される、項1~65のいずれか1項に記載の方法。
項67
前記方法が、バッチ発酵、連続発酵、または半連続発酵によって行われる、項1~66のいずれか1項に記載の方法。
項68
前記方法が、フィードバッチ発酵によって行われる、項67に記載の方法。
項69
前記グリコシド中間体が、前記細胞で約72時間以下インキュベートされる、項68に記載の方法。
項70
微生物細胞であって、
細胞内発現のためのUDP依存性グリコシルトランスフェラーゼ(UGT)酵素(複数可)をコードする1つ以上の組換え遺伝子と、
UDP-グルコースの利用性を増加させる1つ以上の遺伝子修飾と、を含む、前記微生物細胞。
項71
前記微生物細胞が、供給されたグリコシド中間体をグリコシル化産物に変換する、項70に記載の微生物細胞。
項72
前記微生物細胞が細菌細胞である、項71に記載の微生物細胞。
項73
前記細菌細胞が、Escherichia属、Bacillus属、Rhodobacter属、Zymomonas属、またはPseudomonas属である、項72に記載の微生物細胞。
項74
前記細菌細胞が、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Zymomonas mobilis、またはPseudomonas putidaから選択される、項73に記載の微生物細胞。
項75
前記細菌細胞がE.coliである、項74に記載の微生物細胞。
項76
前記細菌細胞が、以下の前記遺伝子修飾:ushA及びgalETKMが、欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、pgiが、欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ならびにpgm及びgalUが過剰発現すること、を含む、項75に記載の微生物細胞。
項77
前記微生物細胞が酵母細胞である、項70に記載の微生物細胞。
項78
前記酵母が、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Pichia属、Phaffia属、Kluyveromyces属、Candida属、Talaromyces属、Brettanomyces属、Pachysolen属、Debaryomyce属、またはYarrowia属である、項77に記載の方法。
項79
前記酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastori、及びYarrowia lipolyticaから選択される、項78に記載の微生物細胞。
項80
前記微生物細胞が、グリコシド中間体を産生する植物生合成経路を発現しない、項70~79のいずれか1項に記載の微生物細胞。
項81
前記微生物細胞が、前記細胞にグリコシド中間体を輸送する内因性のまたは組換え輸送タンパク質を発現する、項70~80のいずれか1項に記載の微生物細胞。
項82
前記微生物細胞が、任意選択的に、SrUGT76G1、MbUGT1-3、MbUGT1-3_1、MbUGT1-3_1.5、MbUGT1-3_2、またはそれらの誘導体から選択される、1-3’グリコシル化UGT酵素を発現する、項70~81のいずれか1項に記載の微生物細胞。
項83
前記微生物細胞が、任意選択的に、SrUGT91D2、SrUGT91D1、SrUGT91D2e、OsUGT1-2、MbUGT1,2、MbUGT1,2.2、及びその誘導体から選択される、1-2’グリコシル化UGT酵素を発現する、項82に記載の微生物細胞。
項84
前記微生物細胞が、任意選択的に、SrUGT85C2及びその誘導体から選択されるC13 O-グリコシル化UGT酵素を発現する、項83のいずれか1項に記載の微生物細胞。
項85
前記微生物細胞が、任意選択的に、SrUGT74G1、MbUGTc19、及びその誘導体から選択されるC19 O-グリコシル化UGT酵素を発現する、項84に記載の微生物細胞。
項86
前記微生物細胞が、1-3’グリコシル化UGT酵素、1-2’グリコシル化UGT酵素、C19 O-グリコシル化UGT酵素、及びC13 O-グリコシル化UGT酵素を発現する、項82に記載の微生物細胞。
項87
前記微生物細胞が、SrUGT85C2またはその誘導体、MbUGT1,2またはその誘導体、SrUGT74G1またはその誘導体、及びSrUGT76G1またはその誘導体を発現する、項86に記載の微生物細胞。
項88
前記UGT酵素が、前記微生物細胞の染色体に組み込まれる、項86または87に記載の微生物細胞。
項89
前記UGT酵素が染色体外で発現される、項86または87に記載の微生物細胞。
項90
前記微生物細胞が、UDP-グルコースを消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、項70に記載の微生物細胞。
項91
前記微生物細胞が、ushAもしくはそのオーソログ、及び/またはgalE、galT、galK、及びgalMのうちの1つ以上もしくはオーソログの欠失、不活性化、もしくは減少した活性を有する、項90に記載の方法。
項92
galETKM遺伝子が、不活性化される、欠失する、または発現において減少する、項91に記載の方法。
項93
前記微生物細胞が、otsA(トレハロース-6-リン酸シンターゼ)もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、項70に記載の方法。
項94
前記微生物細胞が、ugd(UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ)もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、項70に記載の方法。
項95
前記微生物細胞が、waaG、waaO、waaJ、yfdG、yfdI、及び/またはwcaJ、またはそのオトログ(複数可)の欠失、不活性化、または減少した発現を有する、項70に記載の方法。
項96
前記微生物細胞が、pgi(グルコース-6リン酸イソメラーゼ)もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、項70に記載の方法。
項97
前記微生物細胞が、任意選択的に、pgm(ホスホグルコムターゼ)及び/またはgalU(UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ)、またはそのオーソログもしくは誘導体である、グルコース-6-リン酸をUDP-グルコースに変換することに関与する酵素をコードする1つ以上の遺伝子の過剰発現または増加した活性を有する、項70に記載の方法。
項98
前記微生物細胞が、ycjU(β-ホスホグルコムターゼ)及びBifidobacterium bifidum ugpA、またはそのオーソログもしくは誘導体の過剰発現もしくは増加した活性もしくは発現を有する、項70に記載の方法。
項99
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli zwfまたはその相同体もしくはその操作された誘導体の過剰発現または増加した活性である、ペントースリン酸経路(PPP)への流動を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項70に記載の方法。
項100
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli galP及びE.coli glk(グルコキナーゼ)、または代替的に、Zymomonas mobilis glf及びE.coli glk、またはこれらの遺伝子の相同体、オーソログ、もしくは操作された誘導体の増加した発現もしくは活性を含む、グルコース輸送を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項70に記載の方法。
項101
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli pyrH(UMPキナーゼ)、E.coli cmk(シチジル酸キナーゼ)、E.coli adk(アデニル酸キナーゼ)、もしくはE.coli ndk(ヌクレオシド二リン酸キナーゼ)、またはこれらの酵素の相同体、オーソログ、もしくは操作された誘導体の増加した発現または活性を含む、UTP産生及びリサイクルを増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項70に記載の方法。
項102
前記微生物細胞が、任意選択的に、upp(ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ)、pyrH(UMPキナーゼ)、及びcmk(シチジルレートキナーゼ)、またはその相同体もしくはその操作された誘導体の過剰発現もしくは増加した活性、または、dctA(C4ジカルボキシレート/オロレート:H+シンポーター)、pyrE(オロレートホスホリボシルトランスフェラーゼ)、pyrH(UMPキナーゼ)及びcmk(シチジルレートキナーゼ)、またはその相同体もしくはその操作された誘導体の過剰発現もしくは増加した活性を含む、UDP産生を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項70に記載の方法。
項103
前記微生物細胞が、任意選択的に、sgrS小制御RNAの欠失、不活性化、または減少した発現を含む、グルコース取り込みの除去または調節を減少させるための1つ以上の遺伝子修飾を有する、項70に記載の方法。
項104
前記微生物細胞が、任意選択的に、前記微生物細胞におけるE.coli agp(グルコース-1-ホスファターゼ)、E.coli yihX(α-D-グルコース-1-リン酸ホスファターゼ)、E.coli ybiV(糖ホスファターゼ)、E.coli yidA(糖ホスファターゼ)、E.coli yigL(リン糖ホスファターゼ)、及びE.coli phoA(アルカリホスファターゼ)、またはそのオーソログのうちの1つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース-1-リン酸の脱リン酸化を減少させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項70に記載の方法。
項105
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli rffH(dTDP-グルコースピロホスホリラーゼ)及びE.coli rfbA(dTDPグルコースピロホスホリラーゼ)、またはそのオーソログのうちの1つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース-1-リン酸のTDP-グルコースへの変換を減少させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項70に記載の方法。
項106
前記微生物細胞が、任意選択的に、E.coli gigC(グルコース-1-リン酸アデニルトランスフェラーゼ)またはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース-1-リン酸のADP-グルコースへの変換を減少させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、項70に記載の方法。
ascFは、Hall BG及びXu L,Nucleotide sequence,function,activation,and evolution of the cryptic asc operon of Escherichia coli K12,Mol.Biol.Evol.1992;9(4):688-706によって記載される。ascオペロンは、E.coliにおけるセロビオース代謝において役割を果たすことが考えられる。
配列
>SrUGT85C2[Stevia rebaudiana]
(配列番号1)
>SrUGT74G1[Stevia rebaudiana]
(配列番号2)
>SrUGT76G1[Stevia rebaudiana]
(配列番号3)
>SrUGT91D1[Stevia rebaudiana]
(配列番号4)
>SrUGT91D2[Stevia rebaudiana]
(配列番号5)
>SrUGT91D2e[Stevia rebaudiana]
(配列番号6)
>OsUGT1-2[Oryza sativa]
(配列番号7)
>MbUGTC19[円形変異体]
(配列番号8)
>MbUGT1,2[円形変異体]
(配列番号9)
>MbUGT1-3[円形変異体]
(配列番号10)
>MbUGT1,2.2[円形変異体]
(配列番号11)
>MbUGTC19-2[円形変異体]
(配列番号12)
>MbUGTC13(Stevia rebaudiana UGT85C2,P215T)
(配列番号13)
>76G1_L200A[Stevia rebaudiana,L200A]
(配列番号14)
>MbUGT1-3_1[円形変異体]
(配列番号15)
>MbUGT1-3_1.5[円形変異体]
(配列番号16)
>MbUGT1-3_2[円形変異体]
(配列番号17)
>SgUGT720-269-1(Siraitia grosvenorii)
(配列番号18)
>SgUGT94-289-3(Siraitia grosvenorii)
(配列番号19)
>SgUGT74-345-2(Siraitia grosvenorii)
(配列番号20)
>SgUGT75-281-2(Siraitia grosvenorii)
(配列番号21)
>SgUGT720-269-4(Siraitia grosvenorii)
(配列番号22)
>SgUGT94-289-2(Siraitia grosvenorii)
(配列番号23)
>SgUGT94-289-1(Siraitia grosvenorii)
(配列番号24)
>XP_022151474.1 7-デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ様[Momordica charantia]
(配列番号25)
>XP_022151546.1 7-デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラー様[Momordica charantia]
(配列番号26)
>XP_022151514.1 7-デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ様[Momordica charantia]
(配列番号27)
>XP_004147933.2予測:7-デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ様[キュウミスサチブス]
(配列番号28)
>XP_022978164.1 7-デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ様[Cucurbita maxima]
(配列番号29)
>XP_022950128.1 7-デオキシログラン酸グルコシルトランスフェラーゼ様[Cucurbita moschata]
(配列番号30)
>XP_020422423.1 7-デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ[Prunus persica]
(配列番号31)
>EOY07351.1 UDP-グルコシルトランスフェラーゼ85A3、推定[Theobroma cacao]
(配列番号32)
>XP_022155979.1 ベータ-D-グルコシルクロセチン ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[モモルディカシャランチア]
(配列番号33)
>XP_022986080.1 ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[Cucurbita maxima]
(配列番号34)
>XP_022156002.1 ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[Momordica charantia]
(配列番号35)
>XP_022943327.1 ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[Cucurbita moschata]
(配列番号36)
>XP_022996307.1 ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[Cucurbita maxima]
(配列番号37)
>XP_022957664.1 ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[Cucurbita moschata]
(配列番号38)
>OMO57892.1 UDP-グルクロノシル/UDP-グルコシルトランスフェラーゼ[Corchorus capsularis]
(配列番号39)
>XP_015886141.1予測:ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様アイソフォームX1[Ziziphus jujuba]
(配列番号40)
>XP_002271587.3予測:ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[Vitis vinifera]
(配列番号41)
>XP_018840205.1予測:ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[Juglans regia]
(配列番号42)
>XP_021652171.1 ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[Hevea brasiliensis]
(配列番号43)
>XP_021619073.1ベータ-D-グルコシルクロセチン-ベータ-1,6-グルコシルトランスフェラーゼ様[マニホットエスクレンタ]
(配列番号44)
>GAV83746.1 UDPGTドメイン含有タンパク質[Cephalotus follicularis]
(配列番号45)
>コーヒーアラビカUGT_1,6
(配列番号46)
>環状変異体リンカー配列
(配列番号47)
>環状変異体リンカー配列
(配列番号48)
Claims (32)
- ステビオールグリコシド中間体からステビオールグリコシド産物を産生するための方法であって、
1つ以上のUDP依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素(UGT酵素)を細胞内で発現するE.coliである細菌細胞を提供することと、
前記細菌細胞をステビオールグリコシド中間体を含むステビア葉抽出物又はその画分とインキュベートし、UDP-グルコース補因子からの一つ以上のグリコシル基の酵素転移によって、前記ステビオールグリコシド中間体をステビオールグリコシド産物にグリコシル化することと、
前記ステビオールグリコシド産物を回収することと、
を含み、
前記UGT酵素は、ステビオール及びステビオールグリコシド基質をグリコシル化し、
前記細菌細胞は、次の遺伝子変異:
UDP-糖ヒドロラーゼ(ushA)及びUDP-ガラクトース生合成酵素galETKMの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現;
グルコース-6-リン酸イソメラーゼの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現;及び
ホスホグルコムターゼ(pgm)およびUTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼgalUの過剰発現;
を含む、
方法。 - 前記ステビオールグリコシド基質が、ステビオシド、ステビオ-ルビオシド、レバウジオシドA、ズルコシドA、ズルコシドB、レバウジオシドC、及びレバウジオシドFのうちの1つ以上を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抽出物が、ステビオシド、ステビオ-ルビオシド、及びレバウジオシドAを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ステビオールグリコシド産物がRebMを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ステビオールグリコシド産物が、RebK、RebC+1、及び/またはRebC+2を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、1-3’グリコシル化UGT酵素を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記1-3’グリコシル化UGT酵素が、配列番号15、配列番号16、または配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、1-2’グリコシル化UGT酵素を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、ステビオール又はステビオールグリコシド基質のC13 ヒドロキシルをグリコシル化するUGT酵素を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、ステビオール又はステビオールグリコシド基質のC19ヒドロキシルをグリコシル化するUGT酵素を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、1-3’グリコシル化UGT酵素及び1-2’グリコシル化UGT酵素を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、1-3’グリコシル化UGT酵素、1-2’グリコシル化UGT酵素、C19 O-グリコシル化UGT酵素、及びC13 O-グリコシル化UGT酵素を発現する、請求項11に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、SrUGT85C2(配列番号1)またはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するその誘導体;MbUGT1,2(配列番号9)またはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するその誘導体;SrUGT74G1(配列番号2)またはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するその誘導体;ならびにSrUGT76G1(配列番号3)またはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するその誘導体、MbUGT1-3_1(配列番号15)またはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するその誘導体、MbUGT1-3_1.5(配列番号16)またはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するその誘導体、及びMbUGT1-3_2(配列番号17)またはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するその誘導体から選択される酵素を発現する、請求項12に記載の方法。
- 前記UGT酵素が、前記細菌細胞の染色体に組み込まれている、または染色体外で発現されている、請求項1に記載の方法。
- galETKM遺伝子が、不活性化される、欠失する、または発現において減少する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、トレハロース-6-リン酸シンターゼの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、ycjU(β-ホスホグルコムターゼ)及びBifidobacterium bifidum ugpAの過剰発現または増加した活性もしくは発現を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、E. coli zwfの過剰発現である、ペントースリン酸経路(PPP)への流動を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、E.coli pyrH(UMPキナーゼ)、E.coli cmk(シチジル酸キナーゼ)、E.coli adk(アデニル酸キナーゼ)、及びE.coli ndk(ヌクレオシド二リン酸キナーゼ)の増加した発現または活性から選択される、UTP産生及びリサイクルを増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、upp(ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ)、pyrH(UMPキナーゼ)、及びcmk(シチジルレートキナーゼ);dctA(C4ジカルボキシレート/オロレート:H+シンポーター)、pyrE(オロレートホスホリボシルトランスフェラーゼ)、pyrH(UMPキナーゼ)、及びcmk(シチジルレートキナーゼ)の過剰発現もしくは増加した活性から選択される、UDP産生を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、sgrS小制御RNAの欠失、不活性化、または減少した発現を含む、グルコース取り込みの除去または調節を減少させるための1つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、dTDP-グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子の1つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース-1-リン酸のTDP-グルコースへの変換を減少させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、グルコース-1-リン酸アデニルトランスフェラーゼの欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース-1-リン酸のADP-グルコースへの変換を減少させる1つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、ステビオールグリコシド中間体からステビオールグリコシド産物への少なくとも40重量%の変換をもたらす、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、ステビオールグリコシド中間体からステビオールグリコシド産物への少なくとも50重量%の変換をもたらす、請求項25に記載の方法。
- 前記方法が、ステビオールグリコシド中間体からステビオールグリコシド産物への少なくとも75重量%の変換をもたらす、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも5:1のRebM対RebDの比が、前記グリコシル化産物として回収される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、バッチ発酵、連続発酵、または半連続発酵によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、フィードバッチ発酵によって行われる、請求項29に記載の方法。
- 前記ステビオールグリコシド中間体が、前記細菌細胞と72時間以下インキュベートされる、請求項30に記載の方法。
- 前記ステビオールグリコシド産物がRebD、RebE、RebI又はRebBを含む、請求項2に記載の方法。
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