BRPI0716954B1

BRPI0716954B1 - Microrganismos geneticamente modificados capazes de produzir um isoprenóide

Info

Publication number: BRPI0716954B1
Application number: BRPI0716954-0A
Authority: BR
Inventors: Jay D. Keasling; Fernaz Nowroozi; Douglas J. Pitera; Jack D. Newman; Jennifer Anthony; Larry Anthony
Original assignee: The Regents Of The University Of California; Amyris Biotechnologies, Inc
Priority date: 2006-09-26
Filing date: 2007-09-25
Publication date: 2024-04-30
Also published as: WO2008039499A2; BRPI0716954A2; US20100112672A1; EP2066778B1; EP3020799A1; WO2008039499A3; US8257957B2; DK3020799T3; DK2066778T3; EP3020799B1; EP2066778A2; EP2066778A4

Abstract

CÉLULAS HOSPEDEIRAS CAPAZES DE PRODUZIR ISOPRENÓIDES. A presente invenção refere-se a células hospedeiras geneticamente modificadas e ao uso das mesmas para a produção de compostos isoprenóides.

Description

Referência Cruzada

[001] Este pedido de patente reivindica benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório norte-americano N° 60/826,970, depositado em 26 de setembro de 2006, cujo pedido é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Antecedentes

[002] Isoprenóides são abundantes na natureza. Eles compreen dem uma família diversa de mais de 40.000 produtos individuais, muitos dos quais são vitais para organismos vivos. Isoprenóides servem para manter a fluidez da célula, transportar elétrons e outras funções metabólicas. Um largo número de isoprenóides naturais e sintéticos é útil como farmacêuticos, cosméticos, perfumes, pigmentos e corantes, fungicidas, antissépticos, nutracêuticos e intermediários químicos finos.

[003] Um produto isoprenóide é tipicamente composto de unida des de difosfato de isopentenila (IPP) de cinco carbonos de repetição, embora isoprenóides e politerpenos irregulares tenham sido relatados. Na natureza, isoprenóides são sintetizados por condensações consecutivas de seu IPP precursor e seu isômero pirofosfato de dimetilalila (DMAPP). Dois caminhos para estes precursores são conhecidos. Eu- cariotos, com a exceção de plantas, geralmente usam a via dependente de mevalonato (MEV) para converter a acetil coenzima A (acetyl-CoA) em IPP, o qual é subsequentemente isomerizado a DMAPP. Procario- tos, com algumas exceções, empregam tipicamente apenas a via independente de mevalonato ou desoxixilulose-5-fosfato (DXP) para produzir IPP e DMAPP. As plantas usam tanto a via MEV como a via DXP.

[004] Tradicionalmente, isoprenóides têm sido fabricados através de extração de fontes naturais, tais como plantas, micróbios e animais. Entretanto, o rendimento por meio de extração é usualmente muito lento devido a certas limitações. Em primeiro lugar, a maioria dos isoprenói- des se acumulam na natureza apenas em pequenas quantidades. Em segundo lugar, os organismos de fonte em geral não são propícios para cultivo em larga escala, que é necessário para produzir quantidades comercialmente viáveis de um isoprenóide desejado. Em terceiro lugar, o requisito de certos solventes tóxicos para extração de isoprenóide de necessidade de manuseio especial e procedimentos de eliminação, desse modo complicando a produção comercial de isoprenóides.

[005] O esclarecimento dos caminhos metabólicos MEV e DXP tem tornado possível a produção biossintética de isoprenóides. Por exemplo, micróbios têm sido engenheirados para expressar em excesso uma parte ou todo a via do mevalonato para produção do isoprenóide amorfa-4,11-dieno. Outros esforços têm focado no equilíbrio do pool de gliceraldeído-3-fosfato e piruvato, ou aumento na expressão de 1-de- sóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (dsx) e IPP isomerase (idi).

[006] Apesar disso, dadas as quantidades muito altas de produtos isoprenóides necessários para muitas aplicações industriais, permanece uma necessidade por sistemas de expressão e procedimentos de fermentação que produzam ainda mais isoprenóides do que disponível com as tecnologias atuais.

Literatura

[007] Patentes US números 7.172.886 e 7.192.751; Farmer et al. (2001) Biotechnol. Prog. 17:57-61; Kajiwara et al. (1997) Biochem. J. 324:421-426; e Kim et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72:408-415; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7):796-802; Patente US número 7.183.089;

Sumário da Invenção

[008] A presente invenção proporciona células hospedeiras gene ticamente modificadas e uso das mesmas para a produção de compostos isoprenóides.

Breve Descrição dos Desenhos

[009] A figura 1 é uma representação esquemática da via do me- valonato (MEV) para a produção de difosfato de isopentenila (IPP).

[0010] A figura 2 é uma representação esquemática de caminhos metabólicos de isoprenóide que resultam na produção de poliprenil di- fosfatos geranil difosfato (GPP), difosfato de farnesila (FPP) e difosfato de geranilgeranila (GGPPP) como intermediários da via biossintético de isoprenóide a partir de IPP e DMAPP.

[0011] A figura 3 é um mapa de plasmídeo de expressão pAM39.

[0012] A figura 4 é um mapa de plasmídeo de expressão pAM40.

[0013] A figura 5 é um mapa de plasmídeo de expressão pAM45.

[0014] A figura 6 é um mapa de plasmídeo de expressão pTrc99A- ADS.

[0015] A figura 7 é um mapa de plasmídeo de expressão pAM94.

[0016] As figuras 8A e 8B mostram produção de amorfa-4,11-dieno em cepas hospedeiras, nas quais o MBIS óperon é expresso a partir de um plasmídeo com número de cópia mais alto e um promotor mais forte.

[0017] A figura 9 mostra produção de amorfa-4,11-dieno em cepas hospedeiras, nas quais a dosagem do gene de mevalonato quinase é aumentada.

[0018] A figura 10 mostra produção de amorfa-4,11-dieno em cepas hospedeiras, nas quais a dosagem do gene e a expressão de mevalo- nato quinase são aumentadas

Definições

[0019] As expressões "isoprenóide", "composto isoprenóide", "ter- peno", "composto de terpeno", "terpenóide" e "composto de terpenóide" são usadas aqui de modo permutável, e referem-se a qualquer composto que seja capaz de ser derivado de IPP. O número de átomos de C presentes nos isoprenóides é tipicamente igualmente divisível por cinco (por exemplo, C5, C10, C15, C20, C25, C30 e C40). Isoprenóides e politerpenos irregulares têm sido relatados e também estão incluídos na definição de "isoprenóide". Compostos isoprenóides incluem, porém não estão limitados a, monoterpenos, diterpenos, triterpenos, sesquiter- penos, e politerpenos.

[0020] Como usado aqui, a expressão "difosfato de prenila" é usada de modo permutável com "pirofosfato de prenila", e inclui difosfatos de monoprenila que têm um único grupo prenila (por exemplo, IPP e DMAPP), assim como difosfatos de poliprenila que incluem 2 ou mais grupos prenila. Difosfatos de monoprenila incluem pirofosfato de isopen- tenila (IPP) e seu isômero dimetilalil pirofosfato (DMAPP).

[0021] Como usado aqui, a expressão "terpeno sintase" (também referida como uma "terpeno ciclase") refere-se a qualquer enzima que enzimaticamente modifique IPP, DMAPP ou um pirofosfato de polipre- nila, de modo que um composto precursor de terpenóide seja produzido. A expressão "terpeno sintase" inclui enzimas que catalisam a conversão de um difosfato de prenila em um isoprenóide ou precursor de isopre- nóide.

[0022] O termo "pirofosfato" é aqui usado de modo permutável com "difosfato". Desse modo, por exemplo, as expressões "difosfato de prenila" e "pirofosfato de prenila" são permutáveis; as expressões "pirofos- fato de isopentenila" e "difosfato de isopentenila" são permutáveis; as expressões "difosfato de farnesila" e "pirofosfato de farnesila" são permutáveis; etc.

[0023] A expressão "caminho do mevalonato" ou "caminho MEV" é usada aqui para se referir aa via biossintético que converte acetil-CoA em IPP. A via do mevalonato compreende enzimas que catalisam as seguintes etapas: (a) condensação de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (por exemplo, através da ação da acetoacetil-CoA tio- lase); (b) condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar hidroximetilglutaril-Coenzima A (HMG-CoA) (por exemplo, através da ação da HMG-CoA sintase (HMGS)); (c) conversão da HMG-CoA em mevalonato (por exemplo, através da ação da HMG-CoA redutase (HMGR)); (d) fosforilação do mevalonato em mevalonato 5-fosfato (por exemplo, através da ação da mevalonato quinase (MK)); (e) conversão do mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato (por exemplo, através da ação da fosfomevalonato quinase (PMK)) e (f) conversão do mevalonato 5-pirofosfato em pirofosfato de isopentenila (por exemplo, através da ação da mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPD)). A via do mevalonato é ilustrado de modo esquemático na figura 1. A "metade superior" da via do mevalonato refere-se às enzimas responsáveis pela conversão de acetil-CoA em mevalonato.

[0024] A expressão "caminho de 1-desóxi-D-xilulose 5-difosfato" ou "caminho DXP" é usada aqui para se referir aa via que converte glice- raldeído-3-fosfato e piruvato em IPP e DMAPP através de um caminho DXP intermediário.

[0025] Como usado aqui, a expressão "prenil transferase" é usada de modo permutável com as expressões "difosfato de isoprenila sintase" e "sintase de poliprenila" (por exemplo, "GPP sintase", "FPP sintase", "GGPP sintase", etc.) para se referir a uma enzima que catalisa a condensação 1’-4 consecutiva de difosfato de isopentenila com substratos iniciador alílicos, resultando na formação de prenil difosfatos de vários comprimentos de cadeia.

[0026] As expressões "polinucleotídeo" e "ácido nucléico", usadas aqui de modo permutável, referem-se a uma forma polimérica de nucle- otídeos de qualquer comprimento, tanto ribonucleotídeos quanto deso- xirribonucleotídeos. Desse modo, esta expressão inclui, porém não está limitada a, DNA ou RNA de filamento único, duplo ou de multifilamentos, DNA genômico, cDNA, híbridos DNA-RNA ou um polímero que compreende bases purina e pirimidina ou outras bases naturais, quimicamente ou bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas de nucleotídeo.

[0027] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são aqui usados de modo permutável e referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, o qual pode incluir aminoácidos codificados e não-codificados, aminoácidos quimicamente ou bioquimi- camente modificados ou derivatizados, e polipeptídeos que têm estrutura de peptídeo modificado.

[0028] A expressão "de ocorrência natural", como usada aqui, como aplicada a um ácido nucléico, uma célula ou um organismo, refere-se a um ácido nucléico, uma célula ou um organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotí- deo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e o qual não tenha sido intencionalmente modificado por um ser humano em laboratório é de ocorrência natural.

[0029] Conforme usado aqui, o termo "isolado" destina-se a descre ver um polinucleotídeo ou uma célula que está em um ambiente diferente daquele no qual o polinucleotídeo, o polipeptídeo ou a célula ocorre naturalmente. Uma célula hospedeira geneticamente modificada isolada pode estar presente em uma população mista de células hospedeiras geneticamente modificadas.

[0030] Conforme usada aqui, a expressão "ácido nucléico exógeno" refere-se a um ácido nucléico que não é normalmente ou naturalmente encontrado em e/ou produzido por uma dada bactéria, organismo ou célula na natureza. Como usada aqui, a expressão "ácido nucléico endógeno" refere-se a um ácido nucléico que é normalmente encontrado em, e/ou produzido por uma dada bactéria, organismo ou célula na natureza. Um "ácido nucléico endógeno" também é referido como "ácido nucléico nativo" ou um ácido nucléico que é "nativo" para uma dada bactéria, organismo ou célula. Por exemplo, os ácidos nucléicos que codificam HMGS, mevalonato quinase e fosfomevalonato quinase na representação de ácidos nucléicos exógenos para E. coli.

[0031] A expressão "ácido nucléico heterólogo", como usado aqui, refere-se a um ácido nucléico em que pelo menos um dos seguintes é verdade: (a) o ácido nucléico é externo ("exógeno") a (isto é, não naturalmente encontrado em) um dado micro-organismo hospedeiro ou célula hospedeira; (b) o ácido nucléico compreende uma sequência de nu- cleotídeo que é naturalmente encontrada em (por exemplo, é "endógena a") um dado micro-organismo hospedeiro ou célula hospedeira (por exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeo que é endógena ao micro-organismo hospedeiro ou célula hospedeira), porém tanto é produzido na célula em uma quantidade não natural (por exemplo, mais do que esperado ou mais do que naturalmente encontrado) quanto difere em sequência da sequência de nucleotídeo endógena, de modo que a mesma proteína codificada (que tem a mesma ou substancialmente a mesma sequência de aminoácido), como encontrada endogenamente é produzida na célula em uma quantidade não natural (por exemplo, mais do que esperada ou mais do que naturalmente encontrada); (c) o ácido nucléico compreende duas ou mais sequências ou segmentos de nucleotídeo que não são encontrados na mesma relação entre si na natureza, por exemplo, o ácido nucléico é recombinante.

[0032] A expressão "polipeptídeo heterólogo", como usada aqui, refere-se a um polipeptídeo que não está naturalmente associado com um dado polipeptídeo. Por exemplo, uma enzima modificadora de precursor de isoprenóide que compreende um "domínio de transmembrana heterólogo" refere-se a uma enzima modificadora de precursor de isoprenóide que compreende um domínio de transmembrana que não está normalmente associado com (por exemplo, não normalmente contíguo a, não normalmente encontrado na mesma cadeia de polipeptídeo com) a enzima modificadora de precursor de isoprenóide na natureza.

[0033] "Recombinante", como usado aqui, significa que um ácido nucléico particular (DNA ou RNA) é o produto de várias recombinações de etapas de clonagem, restrição e/ou ligação, resultando em um construto que tem uma sequência estrutural de codificação ou não- codificação distinguível de ácidos nucléicos endógenos encontrados em sistemas naturais. Geralmente, sequências de DNA que codificam a sequência estrutural de codificação podem ser reunidas a partir de fragmentos de cDNA e ligadores curtos de oligonucleotídeos, ou a partir de uma série de oligonucleotídeos sintéticos para proporcionar um ácido nucléico sintético, o qual é capaz de ser expresso a partir de uma unidade transcripcional recombinante contida em uma célula ou em uma transcrição livre de célula e sistema de tradução. Tais sequências podem ser proporcionadas na forma de uma estrutura de leitura aberta ininterrupta por sequências internas não traduzidas ou íntrons, os quais estão tipicamente presentes em genes eucariotos. DNA genômico que compreende as sequências relevantes também podem ser usados na formulação de um gene recombinante ou unidade transcripcional. Sequências de DNA não traduzidas podem estar presentes em 5’ ou 3’ a partir da estrutura de leitura aberta, onde tais sequências não interferem com a manipulação ou expressão das regiões de codificação e podem, de fato, agir para modular a produção de um produto desejado através de vários mecanismos (vide "sequências regulatórias de DNA", abaixo).

[0034] Desse modo, por exemplo, o termo polinucleotídeo "recombinante" ou ácido nucléico "recombinante" refere-se a um que não ocorre naturalmente, por exemplo, é feito através de combinação artificial de outros dois segmentos separados de sequência através de intervenção humana. Esta combinação artificial é frequentemente realizada através de meios de síntese química ou através de manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética. Isto é usualmente feito para substituir um códon com um códom redundante que codifica o mesmo ou um aminoácido conservativo, enquanto tipicamente introduzindo ou removendo um sítio de recognição de sequência. De maneira alternativa, isto é efetuado para unir segmentos de ácido nucléico de funções desejadas para gerar uma combinação desejada de funções. Esta combinação artificial é frequentemente realizada através de meios de síntese química ou através de manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética.

[0035] De maneira similar, o termo polipeptídeo "recombinante" refere-se a um polipeptídeo que não é de ocorrência natural, por exemplo, é feito através de combinação artificial de outros dois segmentos separados de sequência de amino através de intervenção humana. Desse modo, um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido heterólogo é recombinante.

[0036] Por "construto" ou "vetor" deve ser entendido um ácido nucléico recombinante, geralmente DNA recombinante, o qual tem sido gerado com a finalidade da expressão e/ou propagação de uma(s) sequência(s) específica(s) de nucleotídeo, ou pode ser usado na contrução de outras sequências de nucleotídeo recombinante.

[0037] Como usadas aqui, as expressões "óperon" e "unidade de transcrição única" são usadas de modo permutável para se referir a duas ou mais regiões contíguas de codificação (sequências de nucleotídeo que codificam um produto de gene tal como um RNA ou uma proteína) que são coordenadamente reguladas através de um ou mais elementos de controle (por exemplo, um promotor). Como usada aqui, a expressão "produto de gene" refere-se a RNA codificado por DNA (ou vice-versa) ou proteína que é codificada por um RNA ou DNA, onde um gene irá tipicamente compreender uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam uma proteína, e pode também incluir íntrons e outras sequências de nucleotídeo de não-codificação.

[0038] A expressão "região de codificação", como usada aqui, refere-se a uma extensão contígua de nucleotídeos (uma sequência de nucleotídeo) que codifica um polipeptídeo. Por exemplo, uma "região de codificação que codifica MK" ou uma "região de codificação de MK" compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica mevalonato quinase.

[0039] As expressões "sequências regulatórias de DNA", "elementos de controle" e "elementos regulatórios", aqui usadas de modo permutável, referem-se a sequências de controle transcripcional e translacional, tais como promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores, sinais de degradação de proteína e similares, que providenciam e/ou regulam expresão de uma sequência de codificação e/ou produção de um polipeptídeo codificado em uma célula hospedeira.

[0040] O termo "transformação" é usado aqui de modo permutável com "modificação genética" e refere-se à mudança genética permanente ou transiente induzida em uma célula seguinte à intrudução de novo ácido nucléico (isto é, DNA exógeno à célula). Mudança genética ("modificação") pode ser realizada tanto por incorporação do novo DNA ao genoma da célula hospedeira, quanto por manutenção transiente ou estável do novo DNA como um elemento epissomal. Onde a célula é uma célula eucariótica, uma mudança genética permanente é geralmente alcançada por introdução do DNA no genoma da célula. Em células procarióticas, mudanças permanentes podem ser introduzidas nos cromossomos ou através de elementos extracromossomais, tais como plasmídeos e vetores de expressão, os quais podem conter um ou mais marcadores selecionáveis para auxiliar sua manutenção na célula hospedeira recombinante. Métodos adequados de modificação genética incluem infecção viral, transfecção, conjugação, fusão de protoplasma, eletroporação, tecnologia "particle gun", precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta e similares. A escolha de método é geralmente dependente do tipo de célula sendo transformada e das circunstâncias sob as quais a transformação ocorre (isto é, in vitro, ex vivo, ou in vivo). Uma discussão geral destes métodos pode ser encontrada em Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995.

[0041] "Operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão em uma relação que os permite funcionar em sua maneira pretendida. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afeta sua transcrição ou expressão. Como usado aqui, as expressões "promotor heterólogo" e "regiões de controle heterólogas" referem-se a promotores a outras regiões de controle que não estão normalmente associadas com um ácido nucléico particular na natureza. Por exemplo, uma "região de controle transcricional heteróloga a uma região de codificação" é uma região de controle transcricional que não está normalmente associada com a região de controle na natureza.

[0042] Uma "célula hospedeira", como usada aqui, denota uma célula eucariótica in vivo ou in vitro, uma célula procariótica ou uma célula de um organismo multicelular (por exemplo, uma linhagem de célula) cultivado como uma entidade unicelular, cujas células eucarióticas e procarióticas podem ser, ou terem sido, usadas como recipientes para um ácido nucléico (por exemplo, um vetor de expresão que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um ou mais produtos de gene de caminho biossintético, tais como produtos de gene da via do mevalonato), e incluem a progênie da célula original, que foi geneticamente modificada pelo ácido nucléico. Deve ser entendido que a progênie de uma única célula pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou DNA total como o progenitor devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma "célula hospedeira recombinante" (também referida como uma "célula hospedeira geneticamente modificada") é uma célula hospedeira na qual um ácido nucléico heterólogo foi introduzido, por exemplo, um vetor de expressão. Por exemplo, uma célula hospedeira procariótica geneticamente modificada em questão (por exemplo, uma bactéria) é uma célula hospedeira procariótica que, em virtude de introdução em uma célula hospedeira procariótica adequada de um ácido nucléico heterólogo, por exemplo, um ácido nucléico exógeno que é externo (normalmente não encontrado na natureza) à célula hospedeira procariótica, ou um ácido nucléico recombinante que não é normalmente encontrado na célula hospedeira procariótica; e uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada em questão é uma célula hospedeira eucariótica que, em virtude de entrodução em uma célula hospedeira eucariótica adequada de um ácido nucléico heterólogo, por exemplo, um ácido nucléico exógeno que é externo à célula hospedeira eucariótica, ou um ácido nucléico recombinante que não é normalmente encontrado na célula hospedeira eucariótica.

[0043] A expressão "substituição de aminoácido conservativo" refere-se à permutabilidade em proteínas de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais alifáticas consiste em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais hidroxil alifáticas consiste em serina e treonina, um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais contendo amida consiste em asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que têm cadeis laterais aromáticas consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que têm cadeis laterais básicas consiste em lisina, arginina e histidina e um grupo de aminoácidos que têm cadeis laterais contendo enxofre consiste em cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservativos exemplares são: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

[0044] "Ácidos nucléicos sintéticos" podem ser reunidos a partir de blocos de construção de oligonucleotídeos que são quimicamente sintetizados usando procedimentos conhecidos para aqueles versados na técnica. Estes blocos de contrução são ligados e enrijecidos para formar segmentos de gene que são então enzimaticamente reunidos para construir o gene inteiro. "Quimicamente sintetizado", como relacionado a uma sequência de DNA, significa que os nucleotídeos componentes foram reunidos in vitro. Síntese química manual de DNA pode ser realizada usando procedimentos bem estabelecidos, ou síntese química automatizada pode ser realizada usando um dentre um número de máquinas comercialmente disponíveis. A sequência de nucleotídeo dos ácidos nucléicos pode ser modificada por expressão ótima à base de otimização de sequência de nucleotídeo para refletir o viés de códon da célula hospedeira. O versado na técnica aprecia a possibilidade de expressão bem-sucedida se o uso do códon é enviesado em direção àqueles códons favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de códons preferidos pode ser baseada um uma pesquisa de genes derivados da célula hospedeira, onde a informação da sequência está disponível.

[0045] Um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem uma certa "identidade de sequência" percentual a outro polinucleotídeo ou polipeptídeo, significando que, quando alinhados, aquelas porcentagens de bases ou aminoácidos são as mesmas, e na mesma posição relativa, quando comparando as duas sequências. A similaridade de sequência pode ser determinada em um número de diferentes maneiras. Para determinar a identidade de sequência, sequências podem ser alinhadas usando os métodos e programas de computador, incluindo BLAST, disponível na rede mundial em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Vide, por exemplo, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Outro algoritmo de alinhamento é FASTA, disponível em Genetics Computing Group (GCG) package, de Madison, Wisconsin, USA, uma subsidiária integral de Oxford Molecular Group, Inc. Outras técnicas para alinhamento são descritas em Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., uma divisão de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. De particular interesse são programas de alinhamento que permitem lacunas na sequência. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permite lacunas em alinhamentos de sequência. Vide Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Ainda, o programa GAP que usa o método Needleman and Wunsch alignment pode ser utilizado para alinhar sequências. Vide J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).

[0046] Um ácido nucléico é "hibridizável" a outro ácido nucléico, tal como um cDNA, DNA ou RNA genômico, quando uma forma de filamento único de ácido nucléico pode enrijecer ao outro ácido nucléico sob condições apropriadas de temperatura e força iônica de solução. Condições de bibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente capítulo 11 e Tabela 11.1 na mesma; e Sambrook, J. and Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). As condições de temperatura e força iônica determinam a "estringência" da hibridização. Condições de estringência podem ser filtradas para fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas de organismos distancialmente relacionados, a fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismo intimamente relacionados. Condições de hibridização e lavagens pós-hibridização são úteis para obter as condições de estringência determinadas desejadas da hibridização. Um conjunto de lavagens ilustrativas pós-hibridização é uma série de lavagens começando com SSX 6 x (onde SSC é NaCl a 0,15 M e tampão citrato a 15 mM), SDS a 0,5% à temperatura ambiente por 15 minutos, então repetida com SSC 2x, SDS a 0,5% a 45°C por 30 minutos, e então reptida duas vezes com SSC 0,2 X, SDS a 0,5% a 50°C por 30 minutos. Outras condições estringentes são obtidas através de uso de altas temperaturas, em que as lavagens são idênticas àquelas acima, exceto pela temperatura das duas lavagens finais de 30 minutos em SSC 2 X, SDS a 0,5%, que é aumentada para 60°C. Outro conjunto de condições altamente estringentes utiliza duas lavagens finais em SSC 0,1 X, SDS a 0,1% a 65°C. Um outro exemplo de condições estringentes de hibridização é hibridização a 50°C ou mais e SSC 0,1 X (cloreto de sódio a 15 mM/citrato de sódio a 1,5 mM). Um outro exemplo de condições estringentes de hibridização é incubação de um dia para o outro a 42°C em uma solução: formamida a 50%, SSC 5 X (NaCl a 150 mM, citrato de trissódio a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5 X, sulfato de dextrano a 10% e 20 μg/ml de DNA de esperma de salmão "sheared", desnaturado, seguida por lavagem dos filtros em SSC 0,1 X a cerca de 65°C. Condições estringentes de hibridização e condições de lavagem pós-hibridização são condições de hibridização e condições de lavagem pós-hibridização que são pelo menos tão estringentes quanto as condições representativas acima.

[0047] Hibridização requer que os dois ácidos nucléicos contenham sequências complementares, embora, dependendo da estringência da hibridização, são possíveis não pareamentos entre bases. A estringência apropriada para hibridizar ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidos nucléicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências de nucleotídeos, tanto maior o valor da temperatura de fusão (Tm) para híbridos de ácidos nucléicos que contêm aquelas sequências. A estabilidade relativa (corespondente à Tm mais alta) de hibridizações de ácido nucléicos diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de mais do que 100 nucleotídeos de comprimento, equações para calcular a Tm têm sido derivadas (vide Sambrook et al., supra, 9,50-9,51). Para hibridizações com ácidos nucléicos mais curtos, isto é, oligonucleotídeos, a posição de não pareamentos se torna mais importante e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade (Vide Sambrook et al., supra, 11,7-11,8). Tipicamente, o comprimento para um ácido nucléico hibridizável é pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Comprimentos ilustrativos mínimos para um ácido nucléico hibridizável são: pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos e pelo menos cerca de 30 nucleotídeos. Além disso, o versado na técnica irá reconhecer que a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário, de acordo com fatores tal como o comprimento da sonda.

[0048] Antes que a presente invenção seja adicionalmente descrita, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a modalidades particulares descritas, como tal pode, certamente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui tem o propósito de apenas descrevar modalidades particulares e não se destina a ser limitativa, visto que o escopo da presente invenção será limitado apenas através des reivindicações anexas.

[0049] Onde uma faixa de valores é proporcionada, deve ser entendido que cada valor interveniente, até a décima unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente de outra forma, entre o limite superior e o inferior daquela faixa e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente, está abrangido pela invenção. Os limites superiores e inferiores destas faixas menores podem, de maneira independente, estar incluídos nas faixas menores, e também estão abrangidos pela invenção, submetidos a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, as faixas que excluem um ou ambos os limites incluídos também estão incluídas na invenção.

[0050] A menos que de outra forma definidos, todos os termos técnicos e científicos têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui também possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materias preferidos são agora descritos. Todas as publicações ora mencionadas são aqui incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materias, em conjunto com os quais as publicações são citadas.

[0051] Deve ser notado que, como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um, uma", "e" e "o, a" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramento o contrário. Desse modo, por exemplo, referência a "uma célula hospedeira geneticamente modificada" inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras e referência a "o composto isoprenóide" inclui referência a um ou mais compostos isoprenóides e equivalentes dos mesmos conhecidos na técnica, e assim por diante. Também deve ser adicionalmente notado que as reivindicações podem ser formuladas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para uso de tal terminologia exclusiva como "unicamente", "apenas" e similares em conjunto com a recitação de elementos de reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa".

[0052] As publicações discutidas aqui são proporcionadas unicamente por sua descrição anterior à data de depóstio do presente pedido de patente. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de anteceder tal publicação por força de invenção prévia. Adicionalmente, as datas de publicação proporcionadas podem ser diferentes das reais datas de publicação, o que pode precisar ser independentemente confirmado.

Descrição Detalhada

[0053] A presente invenção proporciona células hospedeiras geneticamente modificadas e o uso das mesmas para produzir isoprenóide e compostos precursores de isoprenóide.

[0054] Um método de fazer um isoprenóide ou um precursor de isoprenóide é cultivar uma célula hospedeira, onde a célula hospedeira é capaz de fazer o isoprenóide ou precursor de isoprenóide. Porque a via biossintético para fazer um isoprenóide ou um precursor de isoprenóide envolve múltiplas enzimas, o fluxo através de caminho pode não ser ótimo ou devidamente equilibrada. Um método para corrigir tal desequilíbrio é modular os níveis de atividade das enzimas da via em relação umas com as outras. Como descrito em maiores detalhes a seguir, aumentar o nível de mevalonato quinase, em relação ao nível de uma ou mais outras enzimas na via do mevalonato, proporciona um aumento em níveis de produção de compostos isoprenóides ou compostos precursores de isoprenóide.

[0055] Compostos isoprenóides são sintetizados a partir um precursor universal com cinco carbonos, pirofosfato de isopentenila (IPP). Existem dois caminhos principais para converter um substrato em IPP: 1) o "caminho do mevalonato", o qual converte acetil-CoA em IPP e o "caminho do 1-desóxi-D-xilulose 5-difosfato" (também referido como o "caminho DXP"), o qual converte D-gliceraldeído-3-fosfato e piruvato em IPP e DMAPP.

[0056] Enzimas da via do mevalonato estão representadas na figura 1. A via do mevalonato compreende as seguintes reações enzimáticas: (a) condensação de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG- CoA; (c) conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) fosforilação de mevalonato em mevalonato 5-fosfato; (e) conversão de mevalonato 5- fosfato em mevalonato 5-pirofosfato e (f) conversão de mevalonato 5- pirofosfato em pirofosfato de isopentenila. Enzimas que realizam estas reações incluem acetoacetil-CoA tiolase, hidroximetilglutaril-CoA sintase (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA redutase (HMGR), mevalonato quinase (MK), fosfomevalonato quinase (PMK) e mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPD).

[0057] Na via DXP, piruvato de D-gliceraldeído-3-fosfato são convertidos através de uma série de reações em IPP e DMAPP. A via envolve a ação das seguintes enzimas: 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (Dxs), 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato reductoisomerase (IspC), 4- difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (IspD), 4-difosfocitidil-2-C-metil- D-eritritol quinase (IspE), 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (IspF), 1-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase (IspG) e difosfato de isopentenila isomerase (IspH).

[0058] Células eucarióticas exceto células de planta usam a via do mevalonato exclusivamente para converter acetil-CoA em IPP, o qual é subsequentemente isomerizado em DMAPP. Plantas usam ambos os caminhos do mevalonato e DXP para síntese de isoprenóide. Procariotos, com algumas exceções, usam a via DXP para produzir IPP e DMAPP separadamente través de um ponto de ramificação.

[0059] O IPP produzido através de caminho do mevalonato pode ser isomerizado para produzir DMAPP. O IPP e/ou o DMAPP pode ser atuado através de preniltransferase para produzir polipirofosfato de prenila. Por exemplo, conforme mostrado na figura 2, IPP ou DMAPP pode ser modificado através de prenila transferase para gerar o poliprenil difosfatos geranil difosfato (GPP), difosfato de farnesila (FPP) e geranil geranil difosfato (GGPP). GPP e FPP são adicionalmente modificados através de terpeno sintases para gerar monoterpenos e sesquiterpenos, respectivamente; e GPP é adicionalmente modificado através de terpeno sistases para gerar diterpenos e carotenóides. IPP e DMAPP são gerados através de um ou dois caminhos: a via do mevalonato (MEV) e a via do 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato (DXP).

Células Hospedeiras Geneticamente Modificadas

[0060] A presente invenção proporciona células hospedeiras geneticamente modificadas e métodos de uso das mesmas para produzir compostos isoprenóides. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é modificada geneticamente de tal modo ela que produz mevalonato quinase em um nível que é maior do que o nível de pelo menos uma dentre acetoacetil- CoA tiolase, hidroximetilglutaril-CoA sintase (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA redutase (HMGR), fosfomevalonato quinase (PMK), e mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPD). Um método em questão, abaixo descrito em maiores detalhes, geralmente envolve cultura in vitro de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão em um meio adequado, de tal modo que a célula hospedeira geneticamente modificada converte um substrato em IPP e produz um composto isoprenóide.

[0061] Em algumas modalidades, o nível de MK produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais, mais alto do que o nível de uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK, e MPD.

[0062] Por exemplo, em algumas modalidades, o nível de MK produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais, mais alto do que o nível de HMGS na célula.

[0063] Em outras modalidades, o nível de MK produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais, mais alto do que o nível de HMGR na célula.

[0064] Em outras modalidades, o nível de MK produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais, mais alto do que o nível de ambos HGMS e HMGR na célula.

[0065] Em outras modalidades, o nível de MK produzido através de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes, ou mais, mais alto do que o nível de MK produzido através de uma célula hospedeira geneticamente modificada com pMBI ou com pMBIS. pMBI e pMBIS são descritos na patente US N° 7,192,751.

[0066] Desse modo, por exemplo, em algumas modalidades, onde uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é uma célula procariótica, o nível de MK produzido através de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes, ou mais, mais alto do que o nível de MK produzido através de mesma célula geneticamente modificada com pMBI ou com pMBIS.

[0067] Em algumas modalidades, a razão molar de polipeptídeo MK em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão em relação a uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e polipeptídeo MPD é a partir de cerca de 1,25 : 1 a cerca de 100 : 1 ou maior do que 100 : 1. Por exemplo, em algumas modalidades, a razão molar de MK em relação a uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD é a partir de cerca de 1,25 : 1 a cerca de 1,5 : 1, a partir de cerca de 1,5 : 1 a cerca de 2 : 1, a partir de cerca de 2 : 1 a cerca de 2,5 : 1, a partir de cerca de 2,5 : 1 a cerca de 3 : 1, a partir de cerca de 3 : 1 a cerca de 5 : 1, a partir de cerca de 5 : 1 a cerca de 10 : 1, a partir de cerca de 10 : 1 a cerca de 25 : 1, a partir de cerca de 25 : 1 a cerca de 50 : 1 ou a partir de cerca de 50 : 1 a cerca de 100 : 1.

[0068] O nível de MK produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão pode ser controlado de várias maneiras. Em algumas modalidades, o número de cópia de regiões de codificação que compreendem sequências de nucleotídeo que codificam MK é mais alto do que o número de cópia de regiões de codificação que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD. Em outras modalidades, uma sequência de nucleotídeo que codifica MK está sob controle transcripcional de (por exemplo, é operacionalmente ligada a) um promotor mais forte do que o promotor ao qual uma ou mais sequências de nucleotídeo, que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD, está operacionalmete ligada. Em outras modalidades, o nível de MK é aumentado em relação ao nível de uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD através de aumento tanto do número de cópia de regiões de codificação que codificam MK em relação ao número de cópia de regiões de codificação que compreendem sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD, quanto através de aumento da força do promotor de um promotor ao qual uma sequência que codifica MK está operacionalmente ligada, em relação à força do promotor de um promotor ao qual uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD está operacionalmente ligada.

[0069] Em outras modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica MK, onde a sequência de nucleotídeo que codifica MK está operacionalmente ligada a um promotor mais forte do que o promotor ao qual um óperon, que compreende sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil- CoA tiolase, HMGS e HMGR, está operacionalemente ligado. Em outras modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um primeiro ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica MK, onde o primeiro ácido nucléico é um vetor de expressão com alto número de cópia; e um segundo ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR, onde o segundo ácido nucléico é um vetor de expressão com baixo número de cópia.

Controle dos níveis de MK através de número de cópia de regiões de codificação que codificam MK

[0070] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma pluralidade de regiões de codificação que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica MK, um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da via do mevalonato exceto mevalonato quinase; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase. A pluralidade de (por exemplo, duas ou mais) regiões de codificação que codificam MK pode estar no mesmo ácido nucléico ou em ácidos nucléicos fisicamente separados. Por exemplo, as duas ou mais regiões de codificação que codificam MK estão, em algumas modalidades, todas presentes no DNA genômico da célula hospedeira. Como um outro exemplo, em algumas modalidades, uma primeira região de codificação que codifica MK está presente no DNA genômico da célula hospedeira; e uma segunda região de codificação que codifica MK está presente no vetor recombinate extracromossomal. Ainda como um outro exemplo, em algumas modalidades, as duas ou mais regiões de codificação que codificam MK estão incluídas em um ou mais vetor (es) recombinate (s) extracromossomal (ais).

[0071] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma única cópia de uma região de codificação que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD; duas ou mais regiões de codificação que codificam MK, cada uma das quais compreende sequências de nucleotídeo que codificam MK; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma única cópia de uma região de codificação de ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD, onde a região de codificação está integrada ao genoma da célula hospedeira; duas ou mais regiões de codificação que codificam MK, cada uma das quais compreende sequências de nucleotídeo que codificam MK, onde as duas ou mais regiões de codificação que codificam MK são extracromossomais, tais como vetores de expressão extracromossomais que não estão integrados ao genoma hospedeiro; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

[0072] Em outras modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um ácido nucléico que compreende duas ou mais regiões de codificação que codificam MK, uma região de codificação de ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase, onde a razão do número de cópia das regiões de codificação de MK para o número de cópia da região de codificação de ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD é a partir de cerca de 1,5 : 1 a cerca de 100 : 1, por exemplo, a razão do número de cópia das regiões de codificação que codificam MK para o número de cópia das regiões de codificação de ácido nucléico que compreendem sequências de nucleotídeo que codificam uma ou dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD é a partir de cerca de 1,5 : 1 a cerca de 2 : 1, a partir de cerca de 2 : 1 a cerca de 2,5 : 1, a partir de cerca de 2,5 : 1 a cerca de 3 : 1, a partir de cerca de 3 : 1 a cerca de 5 : 1, a partir de cerca de 5 : 1 a cerca de 10 : 1, a partir de cerca de 10 : 1 a cerca de 25 : 1, a partir de cerca de 25 : 1 a cerca de 50 : 1 ou a partir de cerca de 50 : 1 a cerca de 100 : 1.

[0073] Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende pelo menos duas regiões de codificação que codificam MK e uma única cópia de uma região de codificação que codifica uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende duas regiões de codificação que codificam MK e uma única cópia de uma região de codificação que codifica acetoacetil- CoA tiolase, HMGS, HMGR.

[0074] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma pluralidade de regiões de codificação que codificam MK, onde a uma região de codificação que codifica MK está presente em um vetor de expressão com alto número de cópia, tal como um plasmídeo com alto número de cópia; uma região de codificação de ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD, onde região de codificação que codifica uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD está presente em um vetor de expressão com baixo número de cópia, tal como um plasmídeo com baixo número de cópia; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

[0075] Em algumas modalidades, o número de cópia de uma região de codificação que codifica MK em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é mais alto do que o número de cópia de regiões de codificação que codificam MK em uma célula hospedeira de controle geneticamente modificada com pMBI. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma pluralidade de regiões de codificação que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica MK, onde as regiões de codificação que codificam MK estão presentes em um ácido nucléico que compreende uma origem p15A de replicação (para uma sequência de nucleotídeo p15A ori, vide, por exemplo, nucleotídeos 4525-5321 de pAM39 (SEQ ID N°: 3); e Selzer et al. (1983) Cell 32:119-129).

[0076] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma pluralidade de regiões de codificação que codificam MK, onde as regiões de codificação que codificam MK estão presentes em um plasmídeo com alto número de cópia; uma região de codificação de ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD, onde região de codificação que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD estão presente em um plasmídeo com médio número de cópia; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

[0077] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma pluralidade de regiões de codificação que codificam MK, onde as regiões de codificação que codificam MK estão presentes em um plasmídeo com médio número de cópia; uma região de codificação de ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD, onde região de codificação que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD está presente em uma plasmídeo com baixo número de cópia; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

[0078] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um primeiro ácido nucléico que compreende uma região de codificação que codifica MK, onde o primeiro ácido nucléico é um vetor de expressão com alto número de cópia; um segundo ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR, onde o segundo ácido nucléico é um vetor de expressão com baixo número de cópia e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

[0079] Plasmídeos com baixo número de cópia geralmente proporcionam menos do que cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula (por exemplo, a partir de cerca de 1 cópia de plasmídeo por célula a cerca de 5 cópias de plasmídeo por célula, a partir de cerca de 5 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 10 cópias de plasmídeo por célula, a partir de cerca de 10 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 15 cópias de plasmídeo por célula ou a partir de cerca de 15 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula); plasmídeos com médio número de cópia geralmente proporcionam a partir de cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 50 cópias de plasmídeo por célula, ou a partir de cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 80 cópias de plasmídeo por célula; e plasmídeos com alto número de cópia geralmente proporcionam a partir de cerca de 80 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 200 cópias de plasmídeo por célula, ou mais do que 200 cópias de plasmídeo por célula.

[0080] Vetores de expressão com baixo número de cópia adequados para células procarióticas (por exemplo, Escherichia coli) incluem, mas não estão limitados a, pACYC184, pBeloBac11, pBR332, pBAD33, pBBR1MCS e seus derivados, pSC101, SuperCos (cosmídeo) e pWE15 (cosmídeo). Vetores de expressão com médio número de cópia adequados para células procarióticas (por exemplo, E. coli) incluem, mas não estão limitados a, pTrc99A, pBAD24, e vetores de expressão que contêm uma origem ColE1 de replicação e seus derivados. Vetores de expressão com alto número de cópia adequados para células procarióticas (por exemplo, E. coli) incluem, mas não estão limitados a, vetores pUC, pBluescript, pGEM e pTZ.

[0081] Vetores de expressão com baixo número de cópia adequados (centroméricos) para células eucarióticas (por exemplo, células de levedura) incluem, mas não estão limitados a, pRS415 e pRS416 (Sikorski & Hieter (1989) Genetics 122:19-27). Vetores de expressão de 2 mícrons com alto número de cópia adequados para células eucarióticas (por exemplo, células de levedura) incluem, mas não estão limitados a, pRS425 e pRS426 (Christainson et al. (1992) Gene 110:119-122). Vetores de expressão de 2 mícrons alternativos incluem variantes não selecionáveis do vetor de 2 mícrons (Bruschi & Ludwig (1988) Curr. Genet. 15:83-90) ou plasmídeos de 2 mícrons intactos que sustentam um cassete de expressão (como exemplificado no Pedido de Patente US N° 20050084972).

Controle dos níveis de MK através de força do promotor

[0082] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma pluralidade de regiões de codificação de ácido nucléico que compreendem sequências de nucleotídeo que codificam MK, onde as regiões de codificação que codificam MK são, cada uma, operacionalmente ligadas a (por exemplo, sob controle transcricional de) um primeiro elemento de controle transcricional (por exemplo, um primeiro promotor); um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da via do mevalonato, exceto mevalonato quinase (por exemplo, que codifica uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD), onde a (s) sequência (s) de nucleotídeo que codifica (m) uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD estão operacionalmente ligados a (por exemplo, sob controle transcricional de) um segundo elemento de controle transcricional (por exemplo, um segundo promotor); e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase, onde o primeiro elemento de controle transcricional é mais forte do que o segundo elemento de controle transcricional.

[0083] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende uma pluralidade de regiões de codificação de ácido nucléico que codifica sequências de ácido nucléico que codificam MK, onde as regiões de codificação que codificam MK são, cada uma, operacionalmente ligadas a (por exemplo, sob controle transcricional de) um primeiro promotor, um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da caminho do mevalonato, exceto mevalonato quinase (por exemplo, que codifica uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD), onde a (s) sequência (s) de nucleotídeo que codifica (m) uma ou mais dentre acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, PMK e MPD estão operacionalmente ligados a (por exemplo, sob controle transcricional de) um segundo promotor, onde o primeiro promotor é mais forte do que o segundo promotor; e

[0084] um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

[0085] Em algumas modalidades, uma região de codificação está contida em um óperon. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um ácido nucléico que compreende um primeiro óperon que compreende sequências de nucleotídeo que codificam MK, PMK e MPD, onde o primeiro óperon está operacionalmente ligado a um primeiro promotor, um ácido nucléico que compreende um segundo óperon que compreende sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR, onde o segundo óperon está operacionalmente ligado a um segundo promotor, onde o primeiro promotor é mais forte do que o segundo promotor; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

[0086] Elementos regulatórios incluem, por exemplo, promotores e operadores. Um promotor é uma sequência de nucleotídeos que inicia e controla a transcrição de uma sequência de ácido nucléico através de uma enzima RNA polimerase. Um operador é uma sequência de nucleotídeos adjacente ao promotor, que funciona para controlar a transcrição da sequência de ácido nucléico desejada. O operador contém um domínio ligado a proteína, onde uma proteína repressora específica pode se ligar. Na ausência de uma proteína repressora adequada, a transcrição inicia através de promotor. Na presença de uma proteína repressora adequada, a proteína repressora se liga ao operador e, desse modo, inibe a transcrição a partir do promotor.

[0087] Em algumas modalidades da presente invenção, promotores usados em vetores de expressão são induzíveis. Em outras modalidades, os promotores usados em vetores de expressão são constitutivos. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências de ácido nucléico estão operacionalmente ligadas a um promotor induzível, e uma ou mais sequências de ácido nucléico estão operacionalmente ligadas a um promotor constitutivo.

[0088] Exemplos não-limitativos de promotores adequados para uso em células hospedeiras procarióticas incluem um promotor da RNA polimerase do bacteriófago T7; um promotor de trp; um promotor do óperon lac; um promotor híbrido, por exemplo, um promotor híbrido de lac/tac, um promotor híbrido de tac/trc, um promotor de trp/lac, um promotor de T7/lac; um promotor de trc, um promotor de tac e similares; um promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tal como um promotor ssaG ou um promotor relacionado (vide, por exemplo, a publicação da Patente US N° 20040131637), um promotor pagC (Pulkkinen e Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1):86-93; Alpuche-Aranda et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 89 (21) : 10079-83), um promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6 : 2805 - 2813), e similares (vide, por exemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67 : 5133 - 5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22 : 3243 - 3255; e Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10 : 888 - 892); um promotor sigma70, por examplo, um promotor sigma70 de consenso (vide, por exemplo, números de acesso no GenBank AX798980, Ax798961 e AX798183); um promotor de fase estacionária, por exemplo, um promotor dps, um promotor spv e similares; um promotor derivado da ilha de patogenicidade SPI-2 (vide, por exemplo, WO 96/17951); um promotor actA (vide, por exemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70 : 1087 - 1096); um promotor rpsM (vide, por exemplo, Valdivia e Falkow (1996) Mol. Microbiol. 22 : 367 378); um promotor tet (vide, por exemplo, Hillen et al. (1989) In Saenger W. and Heinemann U. (eds) Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143 - 162); um promotor SP6 (vide, por exemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12 : 7035 - 7056); e similares.

[0089] Em outra modalidade da presente invenção, a atividade total de uma mevalonato quinase heteróloga em relação a outras enzimas da via do mevalonato em um micro-organismo hospedeiro é aumentada através de expressão da enzima a partir de um promotor forte. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeo que codifica mevalonato quinase está operacionalmente ligada a um promotor que é mais forte do que o promotor PLAC ((SEQ ID N°: 21), por exemplo, a sequência de nucleotídeo que codifica MK está operacionalmente ligada a um promotor que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais, mais forte do que um promotor pLAC que tem uma sequência de nucleotídeo conforme mostrada em SEQ ID N°: 21.

[0090] Promotores fortes adequados para uso em células procarióticas (por exemplo, Escherichia coli) incluem, mas não estão limitados a, um promotor lac UV5 (vide, por exemplo, SEQ ID N°: 22), Trc, Tac, T5, T7 e PLambda. Em outra modalidade da presente invenção, a atividade total da mevalonato quinase em um organismo hospedeiro é aumentada através de expressão da enzima a partir de um promotor forte em um palsmídeo com alto número de cópia. Exemplos adequados para uso em células procarióticas (por exemplo, Escherichia coli) incluem, mas estão limitados ao uso de promotores Trc, Tac, T5, T7 e PLambda com vetores pBAD24, pBAD18, pGEM, pBluescript, pUC e pTZ.

[0091] Exemplos não-limitativos de promotores adequados para uso em células hospedeiras eucarióticas incluem, mas estão limitados a, um promotor precoce imediato de CMV, um promotor de timidina quinase HSV, um promotor precoce ou tardio de SV40, LTRs de retrovírus e um promotor da metalotioneína I de camundongo.

[0092] Exemplos não-limitativos de promotores constitutivos adequados para uso em células procarióticas incluem um promotor sigma70 (por exemplo, um promotor sigma70 de consenso). Exemplos não-limitativos de promotores induzíveis adequados para uso em células hospedeiras bacterianas incluem o pL do bacteriófago À; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac); um promotor induzível por isopropil-beta-D44 tiogalactopiranosídeo (IPTG), por exemplo, um promotor lacZ; um promotor induzível por tetraciclina; um promotor induzível por arabinose, por exemplo, PBAD (vide, por exemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177 : 4121 - 4130); um promotor induzível por xilose, por exemplo, Pxyl (vide, por exemplo, Kim et al. (1996) Gene 181 : 71 - 76); um promotor GAL1; um promotor de triptofano; um promotor lac; um promotor induzível por álcool, por exemplo, um promotor induzível por metanol, um promotor induzível por etanol; um promotor induzível por rafinose; um promotor induzível por calor, por exemplo, promotor PL lambda induzível por calor; um promotor controlado por um repressor sensível ao calor (por exemplo, vetores de expressão à base de lamba reprimidos por CI857; vide, por exemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177 (2) : 327 - 34); e similares.

[0093] Exemplos não-limitativos de promotores constitutivos adequados para uso em células hospedeiras de levedura incluem um promotor ADH1, um promotor ADH2, um promotor PGK ou um promotor LEU2. exemplos não-limitativos de promotores induzíveis adequados para uso em células hospedeiras de levedura incluem, mas não estão limitados a, um promotor divergente induzível por galactose, tal como um promotor GAL 1 ou um promotor GAL 10 (West at al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4(11):2467-2478) ou um promotor CUP1. Onde desejado, o promotor é mais forte do que o promotor Lac nativo de E. coli.

[0094] Exemplos não-limitativos de operadores para uso em células hospedeiras bacterianas incluem um operador promotor de lactose (proteína represora de LacI muda a conformação quando colocada em contato com lactose, desse modo impedindo a proteína repressora de LacI de se ligar ao operador), um operador promotor de triptofano (quando complexado com triptofano, a proteína repressora de TrpR tem uma conformação que se liga ao operador; na ausência de triptofano, a proteína repressora de TrpR tem uma conformação que não se liga ao operador, e um operador promotor de tac (vide, por exemplo, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25.).

Enzimas da via do mevalonato

[0095] A via do mevalonato compreende: (a) condensação de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) fosforilação de mevalonato em mevalonato 5-fosfato; (e) conversão de mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato; e (f) conversão de mevalonato 5-pirofosfato em pirofosfato de isopentenila. As enzimas da via do mevalonato necessárias para produção de IPP variam dependendo das condições de cultura.

[0096] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma mevalonato quinase, como descrito acima; em ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da via do mevalonato, exceto mevalonato quinase, e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

Sequências de nucleotídeo que codificam enzimas da via do mevalonato

[0097] Sequências de nucleotídeo que codificam produtos de gene da via do mevalonato (MEV) são conhecidas na técnica e qualquer sequência de nucleotídeo que codifica produto de gene da via MEV pode ser usada para gerar uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão. Por exemplo, sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD e IDI são conhecidas na técnica. O seguinte são exemplos de sequências de nucleotídeo conhecidas que codificam produto de gene da via MEV, com números de acesso no GenBank e organismo seguinte a cada enzima da via MEV, em parêntesis: acetoacetil-CoA tiolase: (REGIÃO NC_000913: 2324131..2325315; E. coli), (D49362; Paracoccus denitrificans), e (L20428; Saccharomyces cerevisiae); HMGS: (NC_001145. complement 19061..20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), e (BT007302; Homo sapiens); HMGR: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NM_204485; Gallus gallus), (AB015627; Streptomyces sp. KO-3988), (AF542543; Nicotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, que proporciona a sequência que codifica uma HMGR truncada; Saccharomyces cerevisiae), e (NC_001145: complement (115734..118898; Saccharomyces cerevisiae)); MK: (L77688; Arabidopsis thaliana), e (X55875; Saccharomyces cerevisiae); PMK: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), (NC_001145. complement 712315..713670; Saccharomyces cerevisiae); MPD: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), e (U49260; Homo sapiens); e IDI: (NC_000913, 3031087..3031635; E. coli), e (AF082326; Haematococcus pluvialis).

[0098] Um exemplo não-limitativo de sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR está ilustrado nas figuras 13A - C (SEQ ID N°: 1) da Patente US N° 7.183.089. Um exemplo não limitante de sequências de nucleotídeo codificando MK, PMK, MPD, e isomerase difosfato de isopentenila (IDI) é apresentado nas figuras 16A-D da patente americana US 7.183.089. Um exemplo não-limitante de sequências de nucleotídio codificando HK, PMK, MPD e isomerase isopentenil difosfato (IDI) é apresentado nas figuras 16 A- D da patente americana US 7.183.089.

[0099] Em algumas modalidades, a região de codificação da HMGR está ilustrada em SEQ ID N°: 13 da Patente US N° 7.183.089 (vide também as figuras 20A-C da Patente US N° 7.183.089), a qual codifica uma forma truncada de HMGR ("tHMGR), que carece do domínio de transmembrana de HMGR do tipo selvagem. O domínio de transmembrana de HMGR contém as porções regulatórias da enzima e não tem atividade catalítica.

[00100] A sequência de codificação de qualquer enzima da via MEV conhecida pode ser alterada de várias formas conhecidas na técnica para gerar mudanças direcionadas na sequência de aminoácido da enzima codificada. O aminoácido de uma enzima variante da via MEV será substancialmente similar à sequência de aminoácido de qualquer enzima da via MEV conhecida, isto é, irá diferir apenas por pelo menos um aminoácido, e pode diferir por pelo menos dois, pelo menos 5, pelo menos 10 ou pelo menos 20 aminoácidos, porém tipicamente não mais do que cerca de 50 aminoácidos. As mudanças da sequência podem ser substituições, inserções ou anulações. Por exemplo, como descrito abaixo, a sequência de nucleotídeo pode ser alterada para o viés de códon de uma célula hospedeira particular. Em adição, uma ou mais diferenças da sequência de nucleotídeo pode ser introduzida, que resulta em mudanças conservativas de aminoácido na proteína codificada.

Enzimas da via DXP

[00101] A via DXP compreende: 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (Dxs), 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato reductoisomerase (IspC), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (IspD), 4-difosfocitidil-2-C- metil-D-eritritol quinase (IspE), 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (IspF) e 1-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase (IspG).

[00102] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma mevalonato quinase, conforme descrito acima; um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da via do mevalonato, exceto mevalonato quinase; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase, onde um caminho DXP endógeno na célula hospedeira é funcionalmente deficiente.

Preniltransferases

[00103] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam uma mevalonato quinase, conforme descrito acima; um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da via do mevalonato, exceto mevalonato quinase; um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma preniltransferase; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase.

[00104] Preniltransferases constituem um grupo externo de enzimas que catalizam a condensação consecutiva de IPP, resultado na formação de difosfatos de prenila de vários comprimentos de cadeia. Preniltransferases adequadas incluem enzimas que catalizam a condensação de IPP com substratos iniciador alílicos para formar compostos isoprenóides com a partir de cerca de duas unidades de isopreno a cerca de 6000 unidades de isopreno ou mais, por exemplo, duas unidades de isopreno (pirofosfato de geranila sintase), 3 unidades de iso- preno (pirofosfato de farnesila sintase), 4 unidades de isopreno (pirofos- fato de geranilgeranila sintase), 5 unidades de isopreno, 6 unidades de isopreno (pirofosfato de hexadecila sintase), 7 unidades de isopreno, 8 unidades de isopreno (fitoeno sintase, pirofosfato de octaprenila de sin- tase), 9 unidades de isopreno (pirofosfato de nonaprenila sintase, 10 unidades de isopreno (pirofosfato de decaprenila sintase), a partir de cerca de 10 unidades de isopreno a cerca de 15 unidades de isopreno, a partir de cerca de 15 unidades de isopreno a cerca de 20 unidades de isopreno, a partir de cerca de 20 unidades de isopreno a cerca de 25 unidades de isopreno, a partir de cerca de 25 unidades de isopreno a cerca de 30 unidades de isopreno, a partir de cerca de 30 unidades de isopreno a cerca de 40 unidades de isopreno, a partir de cerca de 40 unidades de isopreno a cerca de 50 unidades de isopreno, a partir de cerca de 50 unidades de isopreno a cerca de 100 unidades de isopreno, a partir de cerca de 100 unidades de isopreno a cerca de 250 unidades de isopreno, a partir de cerca de 250 unidades de isopreno a cerca de 500 unidades de isopreno, a partir de cerca de 500 unidades de iso- preno a cerca de 1000 unidades de isopreno, a partir de cerca de 1000 unidades de isopreno a cerca de 2000 unidades de isopreno, a partir de cerca de 2000 unidades de isopreno a cerca de 3000 unidades de iso- preno, a partir de cerca de 3000 unidades de isopreno a cerca de 4000 unidades de isopreno, a partir de cerca de 4000 unidades de isopreno a cerca de 5000 unidades de isopreno ou a partir de cerca de 5000 unidades de isopreno a cerca de 6000 unidades de isopreno ou mais.

[00105] Preniltransferases adequadas incluem, mas não estão limitadas a, uma difosfato E-isoprenil sintase, incluindo, mas não limitada a, difosfato de geranila (GPP) sintase, difosfato de farnesila (FPP) sin- tase, difosfato de geranilgeranila (GGPP) sintase, difosfato de hexapre- nila (HexPP) sintase, difosfato de heptaprenila (HepPP) sintase, octa- prenil (OPP) difosfato sintase, difosfato de solanesila (SPP) sintase, di- fosfato de decaprenila (DPP) sintase, "chicle" sintase e guta-percha sintase; e uma Z-isoprenil difosfato sintase, incluindo, mas não limitada a, difosfato de nonaprenila (NPP) sintase, difosfato de undecaprenila (UPP) sintase, difosfato de deidrodolichila sintase, difosfato de eicosa- prenila sintase, borracha natural sintase e outras Z-isoprenil difosfato sintases.

[00106] As sequências de nucleotídeo de numerosas prenil transferases de uma variedade de espécies são conhecidas e podem ser usadas ou modificadas para uso na geração de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão. Sequências de nucleotídeo que codificam prenil transferases são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, pirofosfato de farnesila sintetase mRNA humana (N° de acesso no GenBank J05262; Homo sapiens); difosfato de farnesila sintetase (FPP) gene (N° de acesso no GenBank J05091; Saccharomyces cerevisiae); difosfato de isopentenila:dimetilalil difosfato isomerase gene (J05090; Saccharomyces cerevisiae); Wang e Ohnuma (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:33-48; Patente U.S. Patent N° 6.645.747; Arabidopsis thaliana pirofosfato de farnesila sintetase 2 (FPS2)/FPP sintetase 2/difosfato de farnesila sintase 2 (At4g17190) mRNA (N° de acesso no GenBank NM_202836); Ginkgo biloba difosfato de geranilgeranila sintase (ggpps) mRNA (N° de acesso no GenBank AY371321); Arabidopsis thaliana pirofosfato de geranilgeranila sintase (GGPS1)/GGPP sintetase/farnesiltranstransferase (At4g36810) mRNA (N° de acesso no GenBank NM_119845); Synechococcus elongatus gene para farnesila, geranilgeranila, geranilfarnesila, hexaprenila, difosfato de heptaprenila sintase (SelF-HepPS) (N° de acesso no GenBank AB016095); etc.

Terpeno Sintases

[00107] Um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica qualquer terpeno sintase conhecida pode ser usado. Terpeno sintases adequadas incluem, mas não estão limitadas a, amorfa-4,11-dieno sintase (ADS), beta-cariofileno sintase, germacreno A sintase, 8-epicedrol sintase, valenceno sintase, (+)-delta- cadineno sintase, germacreno C sintase, (E)-beta- farneseno sintase, Casbeno sintase, vetispiradieno sintase, 5-epi-aristoloqueno sintase, Aristolqueno sintase, beta-cariofileno, alfa-humuleno, (E,E)-alfa- farneseno sintase, (-)-beta-pineno sintase, Gama-terpineno sintase, limoneno ciclase, Linalool sintase, 1,8-cineolo sintase, (+)-sabineno sintase, E-alfa-bisaboleno sintase, (+)-difosfato de bornila sintase, levopimaradieno sintase, Abietadieno sintase, isopimaradieno sintase, (E)-gama-bisaboleno sintase, taxadieno sintase, pirofosfato de copalila sintase, kaureno sintase, longifoleno sintase, gama-humuleno sintase, Delta-selineno sintase, beta-felandreno sintase, limoneno sintase, mirceno sintase, terpinoleno sintase, (-)-canfeno sintase, (+)-3-careno sintase, difosfato de sin-copalila sintase, alfa-terpineol sintase, sin- pimara-7,15-dieno sintase, ent-sanda-aracopimaradieno sintase, estemer-13-eno sintase, E-beta-ocimeno, S-linalool sintase, geraniol sintase, gama-terpineno sintase, linalool sintase, E-beta-ocimeno sintase, epi-cedrol sintase, alfa-zingibereno sintase, guaiadieno sintase, cascariladieno sintase, cis-muroladieno sintase, afidicolina-16b-ol sintase, elizabetatrieno sintase, sandalol sintase, patchoulol sintase, Zinzanol sintase, cedrol sintase, escareol sintase, copalol sintase, manool sintase e similares .

[00108] Sequências de nucleotídeo que codificam terpeno sintases são conhecidas na técnica, e qualquer sequência de nucleotídeo que codifica terpeno sintase pode ser usada para modificar geneticamente uma célula hospedeira. Por exemplo, as seguintes sequências de nucleotídeo que codificam terpeno sintases, seguidas por seus números de acesso no Genbank e os organismos nos quais elas foram identificadas, são conhecidas e podem ser usadas: (-)-germacreno D sintase mRNA (AY438099; Populus balsamifera subsp. trichocarpa x Populus deltoids); E,E-alfa-farneseno sintase mRNA (AY640154; Cucumis sativus); 1,8-cineol sintase mRNA (AY691947; Arabidopsis thaliana); terpeno sintase 5 (TPS5) mRNA (AY518314; Zea mays); terpeno sintase 4 (TPS4) mRNA (AY518312; Zea mays); mirceno/ocimeno sintase (TPS10) (At2g24210) mRNA (NM_127982; Arabidopsis thaliana); geraniol sintase (GES) mRNA (AY362553; Ocimum basilicum); pineno sintase mRNA (AY237645; Picea sitchensis); mirceno sintase 1e20 mRNA (AY195609; Antirrhinum majus); (E)-β-ocimeno sintase (0e23) mRNA (AY195607; Antirrhinum majus); E-β-ocimeno sintase mRNA (AY151086; Antirrhinum majus); terpeno sintase mRNA (AF497492; Arabidopsis thaliana); (-)-canfeno sintase (AG6.5) mRNA (U87910; Abies grandis); (-)-4S-limoneno sintase gene (por exemplo, sequência genômica) (AF326518; Abies grandis); delta-selineno sintase gene (AF326513; Abies grandis); amorfa-4,11-dieno sintase mRNA (AJ251751; Artemisia annua); E-α- bisaboleno sintase mRNA (AF006195; Abies grandis); gama-humuleno sintase mRNA (U92267; Abies grandis); δ-selineno sintase mRNA (U92266; Abies grandis); pineno sintase (AG3.18) mRNA (U87909; Abies grandis); mirceno sintase (AG2.2) mRNA (U87908; Abies grandis); etc.

[00109] Sequências de aminoácido das seguintes terpeno sintases são encontradas com os números de acesso no GenBank mostrados em parênteses, junto com o organismo no qual cada uma foi identificada, seguinte a cada terpeno sintase: (-)-germacreno D sintase (AAR99061; Populus balsamifera subsp. trichocarpa x Populus deltoids); D-cadineno sintase (P93665; Gossypium hirsutum); 5-epi- aristoloqueno sintase (Q40577; Nicotiana tabacum); E,E-alfa-farneseno sintase (AAU05951; Cucumis sativus); 1,8-cineol sintase (AAU01970; Arabidopsis thaliana); (R)-limoneno sintase 1 (Q8L5K3; Citrus limon); difosfato de sin-copalila sintase (AAS98158; Oryza sativa); uma taxadieno sintase (Q9FT37; Taxus chinensis; Q93YA3; Taxus bacca; Q41594; Taxus brevifolia); uma D-cadineno sintase (Q43714; Gossypium arboretum); terpeno sintase 5 (AAS88575; Zea mays); terpeno sintase 4 (AAS88573; Zea mays); terpenóide sintase (AAS79352; Vitis vinifera); geraniol sintase (AAR11765; Ocimum basilicum); mirceno sintase 1e20 (AAO41727; Antirrhinum majus); 5- epi-aristoloqueno sintase 37 (AAP05762; Nicotiana attenuata); (+)-3- careno sintase (AAO73863; Picea abies); (-)-canfeno sintase (AAB70707; Abies grandis); abietadieno sintase (AAK83563; Abies grandis); amorfa-4,11-diene sintase (CAB94691; Artemisia annua); tricodieno sintase (AAC49957; Myrothecium roridum); gama-humuleno sintase (AAC05728; Abies grandis); δ-selineno sintase (AAC05727; Abies grandis); etc.

Otimização de Códon

[00110] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo que codifica uma enzima (por exemplo, MK; uma enzima da via do mevalonato, exceto MK, uma preniltransferase; uma terpeno sintase) é modificada para refletir a preferência do códon para a célula hospedeira particular. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo será, em algumas modalidades, modificada para preferência de códon de levedura. Vide, por exemplo, Bennetzen e Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031. Como outro exemplo não-limitativo, a sequência de nucleotídeo será, em algumas modalidades, modificada para preferência de códon de E. coli. Vide, por exemplo, Gouy e Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol. Evol. 13(6):864-872. Vide também Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292. Tal modificação de códon também é referida como "otimização de códon".

Construtos de Expressão

[00111] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam MK (como descrito acima); um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da via do mevalonato, exceto MK; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase; onde um ou mais dos ácidos nucléicos está presente em um vetor de expressão. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão que compreende um ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam MK (como descrito acima); um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da via do mevalonato, exceto MK; um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma terpeno sintase; e um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma preniltransferase; onde um ou mais dos ácidos nucléicos está presente em um vetor de expressão.

[00112] Vetores de expressão dequados incluem, mas não estão limitados a, vetores de baculovírus, vetores bacteriófagos, vetores de plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, fosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos, virais (por exemplo, vetores virais à base de vírus vaccinia, poliovírus, adenovírus, vírus associados a adeno, SV40, vírus herpes simplex e similares), cromossomos artificiais à base de P1, plasmídeos de levedura, cromossomos artificiais de levedura e quaisquer outros vetores específicos para específicos hospedeiros de interesse (tal como E. coli e levedura). Vetores adequados incluem sequências cromossomais, não-cromossomais e sintéticas de DNA.

[00113] Numerosos vetores de expressão adequados são conhecidos para aqueles versados na técnica e muitos estão comercialmente disponíveis. Os vetores a seguir são proporcionados a título de exemplo; para células hospedeiras bacterianas: vetores pQE (Qiagen), plasmídeos pBluescript, vetores pNH, vetores lambda-ZAP (Stratagene); pTrc99a, pKK223-3, pDR540, e pRIT2T (Pharmacia); para células hospedeiras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG e pSVLSV40 (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser usado desde que ele seja compatível com a célula hospedeira.

[00114] Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer dentre um número de elementos de controle de transcrição e tradução, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc, pode ser usado no vetor de expressão (vide, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153 : 516 - 544).

[00115] Promotores adequados para uso em células hospedeiras procarióticas incluem, mas não estão limitados a, um promotor da RNA polimerase do bacteriófago T7; um promotor de trp; um promotor do óperon lac; um promotor híbrido, por exemplo, um promotor híbrido de lac/tac, um promotor híbrido de tac/trc, um promotor de trp/lac, um promotor de T7/lac; um promotor de trc, um promotor de tac e similares; um promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tal como um promotor ssaG ou um promotor relacionado (vide, por exemplo, a publicação da Patente US N° 20040131637), um promotor pagC (Pulkkinen e Miller, J. Bacteriol. (1991) 173 (1) : 86 - 93; Alpuche-Aranda et al., PNAS 1992; 89 (21) : 10079 - 83), um promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6 : 2805 - 2813), e similares (vide, por exemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67 : 5133 - 5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22 : 3243 - 3255; e Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10 : 888 - 892); um promotor sigma70, por examplo, um promotor sigma70 de consenso (vide, por exemplo, números de acesso no GenBank AX798980, Ax798961 e AX798183); um promotor de fase estacionária, por exemplo, um promotor dps, um promotor spv e similares; um promotor derivado da ilha de patogenicidade SPI-2 (vide, por exemplo, WO 96/17951); um promotor actA (vide, por exemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70 : 1087 - 1096); um promotor rpsM (vide, por exemplo, Valdivia e Falkow (1996) Mol. Microbiol. 22 : 367 378); um promotor tet (vide, por exemplo, Hillen, W. e Wissmann, A. (1989) In Saenger W. and Heinemann U. (eds) Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143 - 162); um promotor SP6 (vide, por exemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12 : 7035 - 7056); e similares.

[00116] Exemplos não-limitativos de promotores eucarióticos adequados incluem um promotor precoce imedaito de CMV, promotor de timidina quinase HSV, promotor precoce ou tardio de SV40, LTRs de retrovírus e metalotioneína I de camundongo. Promotores adequados para expressão em levedura incluem, mas não estão limitados a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO e TP1; e, por exemplo, AOX1 (por exemplo, para uso em Pichia). A seleção do vetor e promotor adequados está dentro do nível de conhecimento do versado na técnica. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação ao ribossomo para início de tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão também pode incluir sequências apropriadas para expressão por amplificação.

[00117] Em adição, os vetores de expressão incluem um ou mais genes marcadores selecionáveis para proporcionar uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas, tal como resistência a dihidrofolato redutase ou neomicina para cultura de célula eucariótica, ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina em células hospedeiras procarióticas, tal como E. coli.

[00118] Geralmente, um vetor de expressão irá incluir origens de replicação e marcadores selecionáveis que permitem a transformação da célula hospedeira, por exemplo, o gene de resistência à ampicilina de E. coli, o gene TRP1 de S. cerevisiae, etc; e um promotor derivado de um gene altamente expresso para direcionar a transcrição da sequência de codificação. Tais promotores podem ser derivados de operons que codificam enzimas glicolíticas, tal como 3-fosfoglicerato quinase (PGK), fator-α, fosfatase ácida ou proteínas de choque térmico, entre outras.

[00119] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo que codifica uma enzima (por exemplo, uma enzima da via do mevalonato; uma terpeno sintase; uma preniltransferase) está operacionalmente ligada a um promotor induzível, Promotores induzíveis são bem conhecidos na técnica. Promotores induzíveis adequados incluem, mas não estão limitados a, o pL do bacteriófago À; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac); um promotor induzível por isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), por exemplo, um promotor lacZ; um promotor induzível por tetraciclina; um promotor induzível por arabinose, por exemplo, PBAD (vide, por exemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177 : 4121 - 4130); um promotor induzível por xilose, por exemplo, Pxyl (vide, por exemplo, Kim et al. (1996) Gene 181 : 71 - 76); um promotor GAL1; um promotor de triptofano; um promotor lac; um promotor induzível por álcool, por exemplo, um promotor induzível por metanol, um promotor induzível por etanol; um promotor induzível por rafinose; um promotor induzível por calor, por exemplo, promotor PL lambda induzível por calor; um promotor controlado por um repressor sensível ao calor (por exemplo, vetores de expressão à base de lambda reprimidos por CI857; vide, por exemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177 (2) : 327 - 34); e similares.

[00120] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo que codifica uma enzima (por exemplo, uma enzima da via do mevalonat; uma preniltransferase) está operacionalmente ligada um promotor constitutivo. Promotores constitutivos adequados pra uso em células procarióticas são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, um promotor sigma70, por exemplo, um promotor sigma70 de consenso.

[00121] Em levedura, um número de vetores contendo promotores constitutivos e induzíveis pode ser usado. Para uma revisão, vide Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant, et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516 - 544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; e Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673 - 684; e The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I e II. Um promotor de levedura constitutivo, tal como ADH ou LEU2 ou um promotor induzível, tal como GAL, pode ser usado (Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D.C.). De modo alternativo, vetores podem ser usados, os quais promovem a integração de sequências de DNA externas com cromossomos de levedura.

[00122] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende um ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam enzimas (por exemplo, uma enzima da via do mevalonato; uma terpeno sintase; uma preniltransferase), como descrito acima, onde cada um dos ácidos nucléicos está contido nos vetores de expressão em separado. Em outras modalidades, dois ou mais ácidos nucléicos estão contidos em um único vetor de expressão. Onde dois ou mais ácidos nucléicos estão contidos em um único vetor de expressão, em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeo serão operacionalmente ligadas a um elemento de controle comum (por exemplo, um promotor). Onde dois ou mais ácidos nucléicos estão contidos em um único vetor de expressão, em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeo serão operacionalmente ligadas a elementos de controle diferentes (por exemplo, promotores), por exemplo, elementos de controle diferentes são operacionalmente ligados a sequências de nucleotídeo que codificam enzima separadamente em um único vetor de expressão. Por exemplo, como notado acima, em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo que codifica MK está operacionalmente ligada a um primeiro promotor; e uma sequência de nucleotídeo que codifica acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR está operacionalmente ligada a um segundo promotor.

Células Hospedeiras

[00123] Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada é uma célula eucariótica. Células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células de fungo, de alga, de inseto e de planta. Células hospedeiras de fungo adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycetes, Fungi imperfecti, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia sp., Pichia angusta, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium graminearum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa. Células hospedeiras de alga adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Chlamydomonas reinhardtii e Phormidium sp. ATCC29409.

[00124] Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Células procarióticas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, qualquer de uma variedade de cepas laboratoriais de Escherichia coli, Lactobacillus sp., Salmonella sp., Shigella sp., e similares. Vide, por exemplo, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148 : 1176 - 1181; Patente US N° 6.447.784; e Sizemore et al. (1995) Science 270 : 299 - 302. Exemplos de cepas de salmonela, que podem ser empregadas na presente invenção, incluem, mas não estão limitadas à, Salmonella typhi e S. typhimurium. Cepas de Shigella adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Shigella flexneri, Shigella sonnei e Shigella disenteriae. Tipicamente, a cepa de laboratório é uma não patogênica. Exemplos não-limitativos de outras bactérias adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus subtilis, Pseudomonas pudita, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodococcus sp. e similares. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é Escherichia coli.

[00125] Em outras modalidades, a célula hospedeira empregada no método de produção é uma célula bacteriana. Hospedeiros bacterianos adequados incluem, mas não estão limitados a, qualquer de uma variedade de bactérias gram-positivas, gram-negativas ou gram- variáveis, tais como micro-organismos que pertencem aos gêneros Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobac- terium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Scenedes- mun, Strepromyces, Synnecoccus e Zymomonas. Exemplos de microorganismos hospedeiros adequados usados aqui incluem Escherichia coli, Lactobacillus sp., Lactococcus lactis, Salmonella sp., Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sp., Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Enterobacter saka- zakii, Pseudomonas sp. D-0110, Pseudomonas pudica, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Rhodobacter sphaeroides, Rho- dobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexi- gens, Rhodospirillum salinarum, Rhodococcus sp., Mesorhizobium loti, Clostridium acetobutylicum, Clostridium tetani E88, Clostridium litusebu- rense, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium perfringens, Clostridium beijerinckii, Fusobacterium nucleatum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Butyrivibrio fibrisolvens, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus amylo- liquefacines, LactoBacillus johnsonii, Acinetobacter, Roseburia sp., Fa- ecalibacterium prausnitzii, and Coprococcus sp., Staphylococcus epi- dermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus aureus, Brevi- bacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebac- terium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Serratia ficaria, Serratia fonti- cola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Agrobacterium ra- diobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Anabaena cylindrica, Anabaena doliolum, Anbaena flos-aquae, Arthrobacter aures- cens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globformis, Arthrobacter hydro-carboglutamicus, Arthrobacter mysorens, Arthrobacter nicotianae, Ar- throbacter paraffineus, Arthrobacter protophonniae, Arthrobacter roseo- paraffinus, Arthrobacter sulfureus, Arthrobacter ureafaciens, Chroma- tium buderi, Chromatium tepidum, Chromatium vinosum, Chromatium warmingii, Chromatium fluviatile, Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwnia ananas, Erwinia herbicola, Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methylobacterium rhodesianum, Methylobacterium extorquens, Rho- dopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marina, Rhodopseudo- monas palustris, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Streptomyces fungicidicus, Strep- tomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces livi- dans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus, Zymomonas mobilis e similares (vide, por exemplo, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148 : 1176 - 1181; Patente US N° 6.447.784; e Sizemore et al. (1995) Science 270 : 299 - 302).

[00126] Em ainda outras modalidades, a cepa hospedeira bacteriana é não patogênica para seres humanos. Exemplos de cepas de Escherichia coli que podem ser empregadas incluem cepas de clonagem comuns, tais como DH1, B, MG1655, W3110, BL21, DH10B, JM109, DH5alfa, XL1-Blue, XL2-Blue, MC1000, KY3276, W1485, HB101, N°49, NY49, MP347, NM522 e derivadas das mesmas. Em uma modalidade, uma cepa RecA de Escherichia coli é empregada nos métodos da invenção. Em algumas modalidades, a cepa de Escherichia coli também produz IPP através de caminho DXP. Em outras modalidades, a cepa de Escherichia coli compreende um caminho DXP que é funcionalmente deficiente.

[00127] Em outras modalidades da presente invenção, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é geneticamente modificada, de modo que uma enzima da via endógeno é funcionalmente deficiente. Enzimas que podem ser inativadas em um micro-organismo hospedeiro para aumentar a produção de IPP e compostos derivados do mesmo incluem, mas não estão limitadas a piruvato sintase, que, quando ativa, usa acetil-CoA (e dióxido de carbono e ferrodoxina reduzida) para produzir piruvato e, desse modo, reduz o fornecimento de acetil-CoA disponível para a produção de IPP e compostos derivados do mesmo; acetil-CoA sintetase, que, quando ativa, usa coenzima A (e propionato e ATP) para produzir propionil-CoA e, desse modo, reduz o fornecimento de coenzima A disponível para a produção de acetil-CoA; e piruvato formato liase, que, quando ativa, usa coenzima A (e 2-oxobuta-noato) para produzir propionil-CoA e, desse modo, reduz o fornecimento de coenzima A disponível para a produção de acetil-CoA.

[00128] Métodos para desativar genes que codificam essas enzimas são bem-conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados à, inserção de um elemento genético móvel (por exemplo, em transposon), supressão de todo ou parte do gene, de modo que o produto de gene não é feito, ou é truncado e é não funcional (isto é, enzimaticamente inativo); mutação do gene de modo que o produto de gene não é feito, ou é truncado e é não funcional; deleção ou mutação de um ou mais elementos de controle que controlam a expressão do gene, de modo que o produto do gene não é feito, e similar.

Métodos de Produção de um Composto Isoprenóide

[00129] A presente invenção proporciona métodos de produção de um composto isoprenóide, os métodos geralmente envolvem cultivo de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão em um meio adequado, sob condições que providenciam a produção das enzimas da via do mevalonato e da terpeno sintase (e opcionalmente também uma preniltransferase heteróloga, como descrito acima), de modo que um composto isoprenóide é produzido pela célula em uma quantidade recuperável. Em algumas modalidades, um método em questão adicionalmente compreende recuperação do composto isoprenóide, por exemplo, da célula, do meio de cultura da célula ou tanto da célula quanto do meio de cultura da célula.

[00130] A produção de um isoprenóide ou um precursor de isoprenóide é aumentada em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão, em comparação à célula-mãe de controle, que não é assim geneticamente modificada. Desse modo, por exemplo, a produção de um isoprenóide ou um precursor de isoprenóide é aumentada em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, ou mais, na célula hospedeira geneticamente modificada, em comparação com a célula hospedeira de controle.

[00131] Por exemplo, a produção de um composto isoprenóide em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, ou mais, mais alta do que o nível de produção do composto isoprenóide em uma célula hospedeira geneticamente modificada com pMevT, pMBIS, e um ácido nucléico heterólogo que codifica uma terpeno sintase. As sequências de nucleotídeo de pMevT e pMBIS podem ser encontradas na Patente US N°s 7.192.751 e 7.183.089; vide, por exemplo, SEQ ID N°: 3 da Patente US N° 7.183.089; óperon MecT, SEQ ID N°: 8 da Patente US N° 7.192.751; pMBIS, SEQ ID N°: 4 da Patente US N° 7.183.089; e óperon MBIS, SEQ ID N°: 13 da Patente US N° 7.192.751).

[00132] Como outro exemplo, em algumas modalidades, o nível de um composto isoprenóide produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 500 mg/L, pelo menos cerca de 600 mg/L, pelo menos cerca de 700 mg/L, pelo menos cerca de 800 mg/L, pelo menos cerca de 900 mg/L, pelo menos cerca de 1000 mg/L, pelo menos cerca de 1200 mg/L, pelo menos cerca de 1400 mg/L, pelo menos cerca de 1600 mg/L, pelo menos cerca de 1800 mg/L ou pelo menos cerca de 2000 mg/L, após cerca de 10 horas a cerca de 20 horas, cerca de 20 horas a cerca de 30 horas, cerca de 30 horas a cerca de 40 horas, ou cerca de 40 horas a cerca de 50 horas, em cultura. Por exemplo, em algumas modalidades, o nível de um composto isoprenóide produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é a partir de cerca de 500 mg/L a cerca de 600 mg/L, a partir de cerca de 600 mg/L a cerca de 700 mg/L, a partir de cerca de 700 mg/L a cerca de 800 mg/L, a partir de cerca de 800 mg/L a cerca de 1000 mg/L, a partir de cerca de 1000 mg/L a cerca de 1200 mg/L, a partir de cerca de 1200 mg/L a cerca de 1400 mg/L, a partir de cerca de 1400 mg/L a cerca de 1600 mg/L, a partir de cerca de 1600 mg/L a cerca de 1800 mg/L, ou a partir de cerca de 1800 mg/L a cerca de 2000 mg/L, ou maior do que 2000 mg/L, após cerca de 10 horas a cerca de 20 horas, cerca de 20 horas a cerca de 30 horas, cerca de 30 horas a cerca de 40 horas, ou cerca de 40 horas a cerca de 50 horas, em cultura. Em algumas modalidades, o nível de um composto isoprenóide produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é pelo menos cerca de 500 mg/L, pelo menos cerca de 600 mg/L, pelo menos cerca de 700 mg/L, pelo menos cerca de 800 mg/L, pelo menos cerca de 900 mg/L, pelo menos cerca de 1000 mg/L, pelo menos cerca de 1200 mg/L, pelo menos cerca de 1400 mg/L, pelo menos cerca de 1600 mg/L, pelo menos cerca de 1800 mg/L, ou pelo menos cerca de 2000 mg/L, onde o nível é após cerca de 10 horas a cerca de 20 horas, cerca de 20 horas a cerca de 30 horas, cerca de 30 horas a cerca de 40 horas, ou cerca de 40 horas a cerca de 50 horas, após indução (por exemplo, onde uma ou mais das sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima (por exemplo, enzima de mevalonato, exceto MK, preniltransferase, terpeno sintase) está operacionalmente ligada a um promotor induzível).

[00133] Em algumas modalidades, a taxa de crescimento de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é maior do que a taxa de crescimento de uma célula de controle. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão cresce a uma taxa que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100% ou 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais, mais alta do que a txa de crescimento de uma célula de controle.O crescimento da célula o é prontamente determinado usando métodos bem conhecidos, por exemplo, medição de densidade ótica (OD) a cerca de 600 nm (OD600) de culturas líquidas de bactérias; tamanho de colônia; taxa de crescimento e similares.

[00134] Isoprenóides que podem ser produzidos usando o método da invenção incluem, mas não estão limitados a, monoterpenos, incluindo, mas não limitados a, limoneno, citranelol, geraniol, mentol, perilil álcool, linalol, thujone, sesquiterpenos, incluindo, mas não limitados a, periplanona B, ginkgolide B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenceno, nootkatona, epi-cedrol, epi- aristoloqueno, farnesol, gossipol, santonina, periplanona e froskolina; diterpenos, incluindo, mas não limitados a, casbeno, eleuterobina, paclitaxel, prostatina e pseudopterosina; triterpenos, incluindo, mas não limitados a, arbrusideE, bruceantina, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina. Isoprenóides também incluem, mas não estão limitados a, carotenóides, tal como licopeno, caroteno α e β, criptoxantina α e β, bixina, zeaxantina, astaxantina e luteína. Isoprenóides também incluem, mas não estão limitados a, triterpenos, compostos esteróides e compostos que são compostos de isoprenóides modificados por outros grupos químicos, tais como alcalóides misturados com terpeno, menaquinonas (por exemplo, vitamina K-2) e coenzima Q-10.

[00135] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é cultivada em um meio adequado (por exemplo, caldo Luria-Bertoni, opcionalmente suplementado com um ou mais agentes adicionais, tal como um indutor (por exemplo, onde uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam enzimas (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo que codifica MK, uma (s) enzima (s) da via do mevalonato, exceto MK, uma preniltransferase, uma terpeno sintase) estão sob controle d eum promotor induzível), etc.); e o meio de cultura é sobreposto com um solvente orgânico, por exemplo, dodecano, formando uma camada orgânica. O composto isoprenóide produzido pela célula hospedeira geneticamente modificada em questão é se divide na camada orgânica, a partir da qual ele pode ser purificado. Em algumas modalidades, onde a sequência de nucleotídeo que codifica enzima que modifica isoprenóide está operacionalmente ligada a um promotor induzível, um indutor é adicionado ao meio de cultura; e, após um tempo adequado, o composto isoprenóide é isolado da camada orgânica sobreposta no meio de cultura.

[00136] Em algumas modalidades, o composto isoprenóide produzido por uma célula hospedeira geneticamente modificada será separado de outros produtos que podem estar presentes na camada orgânica. A separação do composto isoprenóide de outros produtos que podem estar presentes na camada orgânica é prontamente alcançada usando, por exemplo, técnicas cromatográficas padrão.

[00137] Em algumas modalidades, um composto isoprenóide sintetizado por um método em questão é adicionalmente quimicamente modificado em uma reação livre de célula. Por exemplo, em algumas modalidades, ácido artemisínico é isolado do meio de cultura e/ou um lisato de célula, e o ácido artemisínico é adicionalmente quimicamente modificado em uma reação livre de célula para gerar artemisinina.

[00138] Em algumas modalidades, o composto isoprenóide é puro, por exemplo, pelo menos cerca de 40% puro, pelo menos cerca de 50% puro, pelo menos cerca de 60% puro, pelo menos cerca de 70% puro, pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, pelo menos cerca de 98% ou mais do que 98% puro, onde "puro", no contexto de um composto isoprenóide, refere-se a um composto isoprenóide que é livre de outros compostos isoprenóides, macromoléculas, contaminantes, etc.

Exemplos

[00139] Os exemplos a seguir são utilizados para proporcionar àqueles versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como realizar e usar a presente invenção, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção, nem se destinam a simbolizar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Foram feitos esforços para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), porém alguns erros e desvios experimentais devem ser levados em conta. A menos que indicado de outra forma, partes são partes por peso, peso molecular é peso molecular médio, a temperatura é em graus Celsius e a pressão é a pressão atmosférica ou próxima da mesma. Abreviações-padrão podem ser usadas, por exemplo, bp, par (es) de base; kb, kilobase (s); pl, picolitro (s); s ou sec, segundo (s); min, minuto (s); h hora (s); aa, aminoácido (s); kb, kilobase (s), bp par (es) de base; nt, nucleotídeo (s); i.m., intramuscular (mente); i.p., intraperitoneal (mente); s.c., subcutanea (mente); e similares.

Exemplo 1: Gerando plasmídeos de expresão que codificam enzimas da via do mevalonato

[00140] Plasmídeo de expressão pMevT foi gerado por inserção do óperon MevT no vetor pBAD33. O óperon MevT codifica o conjunto de enzimas da via MEV que juntas transformam a acetil-CoA precursora ubíqua em (R)-mevalonato, a saber, acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase e HMG-CoA redutase. O óperon MevT foi gerado através de amplificação por PCR a partir da sequência de codificação do DNA genômico de Escherichia coli do gene atoB (número de acesso no GenBank NC_000913 REGIÃO: 2324131..2325315) (codifica uma acetocetil-CoA tiolase), a partir da sequência de codificação do DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae do gene ERG13 (número de acesso no GenBank X96617, REGIÃO: 220..1695) (codifica uma HMG- CoA sintase) e a partir de um segmento do DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae da região de codificação do gene HMG1 (número de acesso no GenBank M22002, REGIÃO: 1660..3165) (codifica uma HMG-CoA redutase truncada (tHMGR)). O iniciador de PCR a montante usado para a amplificação do fragmento do gene HMG1 incluiu um gene de iniciação artificial. Os fragmentos amplificados foram unidos usando extensões de sobreposição (SOEing), sendo que, durante este processo, sítios de ligação ao ribossomo foram introduzidos após as sequências de codificação do atoB e do ERG13. Após a adição de protuberâncias 3’ A, o óperon MevT foi ligado ao vetor de clonagem pCR4 TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). O óperon MevT foi subsequentemente ligado ao sítio de restrição para XmaI PstI do vetor pBAD33 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177(14): 4121-4130). Para colocar o óperon sob o controle do promotor PLac, o fragmento araC-PBAD NsiI-XmaI do pBAD33 foi substituído pelo fragmento NsiI-XmaI do pBBR1MCS, produzindo o plasmídeo de expressão pMevT (vide Patente US número 7.192.751).

[00141] O plasmídeo de expressão pAM36-MevT66 foi gerado através de inserção do óperon MevT66 no vetor pAM36. O vetor pAM36 foi gerado através de inserção de um cassete de oligonucleotídeo contendo sítios de restrição para AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsIl-PmeI no vetor pACYC184 (número de aceso no GenBank XO6403) e através de remoção do gene que confere resistência à tetramicina em pACYC184. O óperon MevT66 foi sinteticamente gerado usando SEQ ID N°: 1 como um modelo, o qual compreende o gene atoB de Escherichia coli (número de acesso no GenBank NC_000913 REGIÃO: 2324131..2325315), o gene ERG13 de Saccharomyces cerevisiae (número de aceso no GenBank X96617, REGIÃO: 220..1695), e uma versão truncada do gene HMG1 de Saccharomyces cerevisiae (número de aceso no GenBank M22002, REGIÃO: 1777..3285), todas as três sequências sendo códon-otimizadas para expressão em Escherichia coli. O óperon MevT66 sinteticamente gerado foi flanqueado através de um sítio de restrição para EcoRI em 5’ e um sítio de restrição para Hind III em 3’, e poderia, assim, ser clonado em sítios de restrição compatíveis de um vetor de clonagem, tal como um vetor de origem pUC ou pACYA padrão. A partir deste construto, o óperon MevT66 foi amplificado por PCR com sítios de restrição para SfiI e AsiSI de flanqueamento, o fragmento de DNA amplificado foi totalmente digerido usando enzimas de restrição SfiI e AsiSI, a mistura da reação foi resolvida através de eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb foi extraído por gel usando um kit de purificação de gel (Qiagen, Valencia, CA), e o fragmento de DNA isolado foi ligado ao sítio de restrição para SfiI AsiSI do vetor pAM36, produzindo o plasmídeo de expressão pMevT66.

[00142] O plasmídeo de expressão pAM25 foi gerado através de inserção do óperon MevT66 no vetor pAM29. O vetor pAM29 foi criado através de montagem da origem p15A de replicação e do gene que confere resistência à kanamicina do pZS24-MCS1 (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210) com um promotor lacUV5 gerado por oligonucleotídeo. A sequência de nucleotídeo de pAM29 é dada como SEQ ID N°: 2. O construto de síntese de DNA que compreende o óperon MevT66 (vide descrição para pAM36-MevT66 acima) foi totalmente digerigo usando enzimas de restrição EcoRI and Hind III, a mistura da reação foi resolvida através de eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb foi extraído por gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado ao sítio de restrição para EcoRI HindIII do pAM29, produzindo o plasmídeo de expressão pAM25.

[00143] O plasmídeo de expressão pMevB-Cm foi gerado através de inserção do óperon MevB no vetor pBBR1MCS-1. O óperon MevB codifica o conjunto de enzimas que juntas convertem (R)-mevalonato em IPP, a saber, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase e mevalonato pirofosfato descarboxilase. O óperon MevB foi gerado através de amplificação por PCR a partir das sequências de codificação do DNA genômico de Sacchromyces cerevisiae do gene ERG12 (número de aceso no GenBank X55875, REGIÃO: 580..1911) (codifica uma mevalonato quinase), o gene ERG8 (número de aceso no GenBank Z49939, REGIÃO: 3363..4718) (codifica uma fosfomevalonato quinase), e o gene MVD1 (número de aceso no GenBank X97557, REGIÃO: 544..1734) (codifica uma mevalonato pirofosfato descarboxilase), e através de união de fragmentos de PCR usando estensões de sobreposição (SOEing). Através de escolha apropriada de iniciador, os códons de parada de ERG12 e ERG8 foram mudados de TAA para TAG durante amplificação para introduzir sítios de ligação ao ribossomo. Após a adição de protuberâncias 3’ A, o óperon MevB foi ligado ao vetor de clonagem pCR4 TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). O óperon MevB foi extirpado por digestão total do construto de clonagem usando enzima de restrição PstI, resolvendo a mistura da reação através de eletroforese em gel, extraindo por gel o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb e ligando o fragmento de DNA isolado ao sítio de restrição para PstI do vetor pBBR1MCS-1 (Kovach et al., Gene 166(1): 175-176 (1995)), produzindo o plasmídeo de expressão pMevB-Cm.

[00144] O plasmídeo de expressão pMBI foi gerado através de inserção do óperon MBI no vetor pBBR1MCS-3. Além das enzimas do óperon MevB, o óperon MBI também codifica uma isopentenil pirofosfatase isomerase, a qual cataliza o conversão de IPP em DMAPP. O óperon MBI foi gerado através de amplificação por PCR a partir da sequência de codificação do DNA genômico de Escherichia coli do gene idi (número de aceso no GenBank AF119715) usando iniciadores que continham um sítio de restrição para XmaI nas extremidades 5’, digerindo o fragmento de DNA amplificado por completo usando enzima de restrição XmaI, resolvendo a mistura da reação através de eletroforese em gel, extraindo por gel o fragmento de DNA de aproximadamente 0,5 kb e ligando o fragmento de DNA isolado ao sítio de restrição para XmaI do plasmídeo de expressão pMevB-Cm, desse modo colocando idi na extremidade 3’ do óperon MevB. O óperon MBI foi subclonado no sítio de restrição para SalI SacI do vetor pBBR1MCS-3 (Kovach et al., Gene 166(1): 175-176 (1995)), produzindo o plasmídeo pMBI (vide patente US número 7.192.751).

[00145] O plasmídeo de expressão pMBIS foi gerado através de inserção do gene ispA no pMBI. O gene ispA codifica uma pirofosfato de farnesila sintase, que cataliza a condensação de duas moléculas de IPP com uma molécula impermeável de DMAPP para fazer pirofosfato de farnesila (FPP). A sequência de codificação do gene ispA (número de aceso no GenBank D00694, REGIÃO: 484..1383) foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico de Escherichia coli usando um iniciador para diante com um sítio de restrição para SacII e um iniciador reverso com um sítio de restrição para SacI. O produto amplificado por PCR foi digerido por completo usando enzimas de restrição SacII e SacI, a mistura da reação foi resolvido através de eletroforese em gel e o fragmento de DNA de aproximadamente 0,9 kb foi extraído por gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado ao sítio de restrição para SacII SacI do pMBI, desse modo colocando o gene ispA em 3’ de idi e do óperon MevB, produzindo o plasmídeo de expressão pMBIS (vide patente US número 7.192.751).

[00146] O plasmídeo de expressão pAM47 foi gerado através de inserção do óperon MBIS no vetor pAM37. O vetor pAM37 foi gerado através de montagem da origem p15A de replicação e do gene que confere resistência ao cloranfenicol do vetor do pZA31luc (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25 : 1203-1210) com um promotor constitutivo forte sintaticamente gerado através de ligação de oligonucleotídeos. O óperon MBIS foi amplificado por PCR a partir de pMBIS usando iniciadores 9-38A (SEQ ID N°: 7) e 9-38B (SEQ ID N°: 8), o produto PCR de aproximadamente 5,5 kb foi purificado e digerido por completo usando enzimas de restrição ApaI e MluI, e o fragmento de DNA foi ligado ao sítio de enzima de restrição para ApaI e MluI do pAM37, produzindo o plasmídeo de expressão pAM47.

[00147] Plasmídeos de expressão pAM39 e pAM40 foram gerados através de combinação dos plasmídeos de expressão pAM47 e pAM25. Os plasmídeos de expressão pAM47 e pAM25 foram digeridos usando enzima de restrição SacI, e ligados entre si em duas orientações, produzindo os plasmídeos de expressão pAM39 e pAM40. As sequências de nucleotídeo dos plasmídeos de expressão pAM39 e pAM40 são dadas como SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4, respectivamente, e mapas de plasmídeos são mostrados nas figuras 3 e 4, respectivamente.

[00148] O plasmídeo de expressão pAM45 foi gerado através de inserção do óperon MBIS em pAM36-MevT66 e adição de promotores lacUV5 na frente dos operons MBIS e MevT66. O óperon MBIS foi amplificado por PCR a partir de pMBIS usando iniciadores que compreendem um sítio de restrição para XhoI em 5’ e um sítio de restrição para PacI em 3’, o produto amplificado por PCR foi digerido por completo usando enzimas de restrição XhoI e PacI, a mistura da reação foi resolvida através de eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 5,4 kb foi extraído por gel e o fragmento de DNA foi ligado ao sítio de restrição para XhoI PacI do pAM36-MevT66, produzindo o plasmídeo de expressão pAM43. Um fragmento de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o promotor lacUV5 foi sintetizado a partir de oligonucleotídeos e ligado aos sítios de restrição para AscI SfiI e AsiSI XhoI do pAM43, produzindo o plasmídeo de expressão pAM45. A sequência de nucleotídeo do pAM45 é dada como SEQ ID N°: 5 e um mapa de plasmídeo é mostrado na figura 5.

[00149] O plasmídeo de expressão pAM29-MK foi gerado através de enserção de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma mevalonato quinase ("MK") no vetor pAM29. Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma mevalonato quinase foi amplificada por PCR a partir de pMBIS usando iniciador MK-SR (SEQ ID N°: 9) e MK- HR (SEQ ID N°: 10). O produto PCR foi purificado, digerido por completo usando enzimas de restrição SalI e HindIII, e ligado ao sítio de enzima de restrição para SalI HindIII do pAM29, produzindo o plasmídeo de expressão pAM29-MK.

[00150] O plasmídeo de expressão pAM29-PMK foi gerado através de inserção de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma fosfomevalonato quinase ("PMK") no vetor pAM29. Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma fosfomevalonato quinase foi amplificada por PCR a partir de pMBIS usando iniciadores PMK-SR (SEQ ID N°: 11) ePMK-HR (SEQ ID N°: 12). O produto PCR foi purificado, digerido por completo usando enzimas de restrição SalI e HindIII e ligado ao sítio de enzima de restrição para SalI HindIII do pAM29, produzindo o plasmídeo de expressão pAM29-PMK.

[00151] O plasmídeo de expressão pAM29-MPD foi gerado através de inserção de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma mevalonato pirofosfato descarboxilase ("MPD") no vetor pAM29. Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma mevalonato pirofosfato descarboxilase foi amplificada por PCR a partir de pMBIS usando iniciadores MPD-ER (SEQ ID N°: 13) e MPD-SR (SEQ ID N°: 14). O produto PCR foi purificado, digerido por completo usando enzimas de restrição SalI e HindIII e ligado ao sítio de enzima de restrição para EcoRI SalI do pAM29, produzindo o plasmídeo de expressão pAM29- MPD.

[00152] O plasmídeo de expressão pAM29-idi foi gerado através de inserção de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma pirofosfato de isopentenila isomerase ("idi") no vetor pAM29. Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma pirofosfato de isopentenila isomerase foi amplificada por PCR a partir de pMBIS usando iniciadores idi-EF (SEQ ID N°: 15) e idi-SR (SEQ ID N°: 16). O produto PCR foi purificado, digerido por completo usando enzimas de restrição SalI e HindIII e ligado ao sítio de enzima de restrição para EcoRI SalI do pAM29, produzindo o plasmídeo de expressão pAM29-idi.

[00153] O plasmídeo de expressão pAM29-ispA foi gerado através da inserção de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma pirofosfato de farnesila sintase ("ispA") no vetor pAM29. Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma pirofosfato de farnesila sintase foi amplificada por PCR a partir de pMBIS usando iniciadores ispA-EF (SEQ ID N°: 17) e ispA-SR (SEQ ID N°: 18). O produto PCR foi purificado, digerido por completo usando enzimas de restrição SalI e HindIII e ligado ao sítio de enzima de restrição para EcoRI SalI do pAM29, produzindo o plasmídeo de expressão pAM29-ispA.

Exemplo 2: Geração de plasmídeos de expressão que codificam enzimas que convertem FPP.

[00154] O plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS foi gerado através de inserção de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma amorfa- 4,11-dieno sintase ("ADS") no vetor pTrc99A. A sequência de amorfa- 4,11-dieno sintase foi gerada sinteticamente, de modo que, após a tradução, a sequência de aminoácido seria idêntica àquela descrita por Merke et al. (2000) Ach. Biochem. Biophys. 381:173-180, de modo que a sequência de nucleotídeo que codifica a amorfa-4,11-dieno sintase foi otimizada para expressão em Escherichia coli, de modo que a sequência de nucleotídeo foi flanqueada através do sítio de enzima de restrição para NcoI em 5’ e para XmaI em 3’ (vide patente US número 7,192,751). A sequência de nucleotídeo foi digerida por completo usndo enzimas de restrição NcoI e XmaI, a mistura da reação foi resolvida através de eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,6 kb foi extraído por gel e o fragmento de DNA isolado foi inserido no sítio de enzima de restrição para NcoI XmaI do vetor pTrc99A (Amman et al. (1985) Gene 40:183-190), produzindo o plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS (vide figura 6 para um mapa de plasmídeo).

[00155] O plasmídeo de expressão pAM94 foi gerado através da inserção de uma sequência de nucleotídeo que codifica a Saccharomyces cerevisiae melavonato quinase (MK), códon-otimizado para expressão em Escherichia coli, no vetor pTrc99A. O sequência de nucleotídeo códon-otimizada foi amplificada por PCR a partir de pMBISopt usando iniciadores 9-153C (SEQ ID N°: 19) e 9-153D (SEQ ID N°: 20). O produto PCR foi digerido por completo usando enzimas de restrição BamHI e HindIII e ligado ao sítio de restrição para BamHI HindIII do plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS, produzindo o plasmídeo de expressão pAM94. A sequência de nucleotídeo do pAM94 é dada como SEQ ID N°: 6 e um mapa de plasmídeo é mostrado na figura 7. Exemplo 3: Geração de cepas hospedeiras de Escherichia coli

[00156] Transformantes de célula hospedeira foram selecionados em ágar Luria Bertoni (LB) contendo antibióticos, como detalhado na Tabela 1. Colônias simples de cepas B59 e B60 foram transferidas de ágar LB para tubos de cultura contendo 5 mL de meio líquido LB e antibióticos. Colônias simples de cepas B32, B125 1 até 6, e B177 foram transferidas de ágar LB para tubos de cultura contendo 5 mL de M9- MOPS (Tabela 2) contendo 8 - 10 g/L de D-glicose. As culturas foram incubadas a 30°C em um agitador rotatório a 250 rpm por 30 horas, neste ponto o crescimento celular foi atrasado por arrefecimento das culturas em gelo. As células foram armazenadas a -80°C em frascos do tipo "cryo" em 1 mL de alíquotas estoque feitas de 400 μL de glicerol estéril a 50% e 600 μL de cultura líquida.

Exemplo 4: Produção de amorfa-4,11-dieno em cepas hospedeiras de Escherichia coli

[00157] Culturas de produção de cepas hospedeiras de B32, B59, B60 e B125 foram estabelecidas através da adição de uma alíquota estoque de cada cepa para separar frascos de 250 mL contendo 40 mL de meio (meio TB-1% de glicerol para cepas B32, B59 e B60; meio M9- MOPS contendo 20 g/L de D-glicose para cepas B32 e B125) e antibióticos, conforme detalhado na Tabela 1. As culturas foram incubadas a 30°C em um agitador rotatório a 250 rpm até que eles alcançassem um OD600 de aproximadamente 0,2 a 0,3, neste ponto a produção de amorfa-4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida pela adição de 40 μL de IPTG a 1 M ao meio de cultura. No momento da indução, as culturas foram cobertas com 8 mL de dodecano para capturar a amorpa-4,11-dieno. Amostras foram tomadas em vários pontos de tempo através da adição da camada de dodecano a 990 μL de acetato de etila em um frasco GC de vidro claro e formação de vórtice por 30 segundos.

[00158] Os extratos de cultura de acetato de etila foram analisados em um cromatógrafo a gás/espectômetro de massa (GC/MS) Hewlett- Packard 6890, conforme descrito em Martin et al. ((2001) Biotechnol. Bioeng. 75:497-503), através de varredura para o íon molecular (204 m/z) e o íon 189 m/z. Para acelerar os tempos de execução, o programa de temperatura e matriz de coluna foram modificados para alcançar uma resolução de pico ótima e o menor tempo de execução total. Compostos em uma maostra de 1 μL foram separados usando uma coluna DB-XLB (disponível por Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) e gás veículo hélio. O ciclo de forno para cada amostra era ou 80°C mantidos por 2 minutos, aumentando a temperatura a 30°C/minuto até uma temperatura de 160°C, aumentando a temperatura a 3oC/minuto até uma temperatura de 170°C, aumentando a temperatura a 50°C/minuto até 300°C, e mantendo a 300°C por 2 minutos (protocolo GC 1), ou 100°C mantidos por 0,75 minuto, aumentando a temperatura a 60°C/minuto até uma temperatura de 300°C, e mantendo a 300°C por 0,5 minuto (protocolo GC 2). As amostras resolvidas foram analisadas por um detector seletivo de massa Hewlett-Packard, modelo 5973. Espectros de massa anteriores demonstraram que o produto da amorfa- 4,11-dieno sintase foi amorfa-4,11-dieno, e que amorfa-4,11-dieno teve um tempo de retenção de 7,9 minutos usando protocolo GC 1. Beta- ou trans-cariofileno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi usado como um padrão interno para quantificação. Titragem de amorfa-4,11-dieno foi calculada com base em uma curva de calibração quantitativa do amorfa- 4,11-dieno purificado em acetato de etila "embebido" com cariofileno.

[00159] As figuras 8A e 8B mostram que cepas hospedeiras, em que o óperon MBIS é expresso a partir de um plasmídeo com número de cópia mais alto e um promotor mais forte, produzem níveis mais altos de amorfa-4,11-dieno.

Exemplo 5: Produção de amorfa-4,11-dieno em cepas hospedeiras de Escherichia coli que abrigam uma pluralidade de cópias de sequências de nucleotídeo que codificam mevalonato quinase.

[00160] Custuras de produção de cepas hospedeiras e até 6 foram estabelecidas através da adição de uma alíquota estoque de cada cepa para separar frascos de 250 mL contendo 50 mL de meio M9-MOPS contendo 10 g/L de D-glicose e antibióticos, conforme detalhado na Tabela 1, a um OD600 de início de aproximadamente 0,5. As culturas foram incubadas a 30°C em um agitador rotatório a 250 rpm até que elas alcançassem um OD600 de aproximadamente 0,2 a 0,3, neste ponto a produção de amorfa-4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida através da adição de 40 μL de IPTG a 1 M ao meio de cultura. No momento da indução, as culturas foram também suplementadas com 20 mM de D,L-mevalonato e foram cobertas com 8 mL de dodecano para capturar o amorfa-4,11-dieno. Amostras foram tomadas em vários pontos de tempo através da transferência de 10 μL do dodecano coberto para 990 μL de acetato de etila, e analisadas usando protocolo GC 1, conforme descrito no Exemplo 4.

[00161] A figura 9 mostra que cepas hospedeiras em que a dosagem de gene de mevalonato quinase é aumentada produz níveis mais altos de amorfa-4,11-dieno.

Exemplo 6: Produção de amorfa-4,11-dieno em cepas hospedeiras de Escherichia coli que abrigam uma pluralidade de cópias de sequências de nucleotídeo que codificam mevalonato quinase.

[00162] Cepas hospedeiras B32 e B177 foram cultivadas e a produção de amorfa-4,11-dieno analisada, conforme descrito no Exemplo 4.

[00163] A figura 10 mostra que cepas hospedeiras em que a dosagem de gene e expressão de mevalonato quinase é aumentada produzem níveis mais altos de amorfa-4,11-dieno.

[00164] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades específicas da mesma, deve ser entendido pelos versados na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem se afastar do verdadeira espírito e escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação particular, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas de proceso ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção. Todas estas modificações devem estar dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Microrganismo geneticamente modificado capaz de produzir um isoprenóide, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) (i) uma região que codifica uma sequência de nucleotídeos de codifica uma mevalonato quinase (MK), em que a região de codificação compreende a SEQ ID NO:23 ou uma sequência nucleotídica degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos; um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais enzimas da via da mevalonato, diferente de MK, em que o número de cópias das regiões codificantes que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam MK é maior que o número de cópias de regiões codificantes que codificam uma ou mais enzimas da via da mevalonato; e (11) uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma terpeno sintase, em que a região de codificação compreende a SEQ ID NO:24 ou uma sequência nucleotídica degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos; ou (b) (i) uma região codificante que codifica uma MK, em que a região de codificação compreende a SEQ ID NO:23 ou uma sequência nucleotídica degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos, em que a região codificante de MK está sob controle de um primeiro promotor; (c) ) um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais enzimas da via da mevalonato, diferente de mevalonato quinase (MK), sob o controle de um segundo promotor, em que o segundo promotor é mais fraco que o primeiro promotor no referido microrganismo geneticamente modificado; e (d) i) uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma terpeno sintase, em que a região de codificação compreende a SEQ ID NO:24 ou uma sequência nucleotídica degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos; em que, no caso de (a) ou (b) acima, o nível de MK produzida no referido microrganismo geneticamente modificado é pelo menos 50% maior do que o nível de uma ou mais enzimas da via da mevalonato, diferente de MK, e a referida enzima da via da mevalonato diferente de MK é selecionada dentre acetoacetil-CoA tiolase, hidroximetilglutaril- Coenzima A (HMG-CoA) sintase (HMGS), HMG-CoA redutase (HMGR), fosfomevalonato quinase (PMK) e mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPD), em que a região de codificação de acetoacetil- CoA tiolase compreende SEQ ID NO:25 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos, em que a região de codificação de HMGS compreende SEQ ID NO:26, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência aminoácidos, em que a região de codificação de HMGR compreende nucleotídeos de SEQ ID NO:27 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos, em que a região de codificação de PMK compreende SEQ ID NO:28 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos, em que a região de codificação MPD de mevalonato compreende SEQ ID NO:29 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.

2. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as regiões codificantes de MK está sob controle de um primeiro promotor e a sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais enzimas da via da mevalonato, diferente de MK, está sob controle de um segundo promotor, em que o segundo promotor é mais fraco do que o primeiro promotor no referido microrganismo geneticamente modificado.

3. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor é um promotor constitutivamente ativo.

4. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor é um promotor induzível.

5. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor é mais forte do que um promotor Lac nativo de Escherichia coli ou um promotor PLac.

6. Microrganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor é um promotor lacUV5 ou um promotor trc.

7. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos duas regiões codificantes compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam uma MK.

8. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o número de cópias de regiões codificantes que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam uma MK é maior do que o número de cópias de regiões codificantes que codificam uma ou mais enzimas da via da mevalonato quinase, diferente de MK.

9. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma pirofosfato de isopentenila (IPP) isomerase.

10. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende um ácido nucléico heterólogo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma preniltransferase selecionada a partir de uma farnesil difosfato sintase, uma geranil difosfato sintase, e uma geranilgeranil difosfato sintase.

11. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o isoprenóide é um diterpeno, um triterpeno, ou um sesquiterpeno.

12. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das sequências de nucleotídeos que codificam a MK ou enzimas da via de mevalonato é códon-otimizada para expressão no referido microrganismo geneticamente modificado.

13. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é uma célula procariótica.

14. Microrganismo geneticamente modificado,de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é uma célula eucariótica.

15. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é uma célula de levedura.

16. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é Saccharomyces cerevisiae.

17. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é uma célula de Escherichia coli geneticamente modificada, em que compreende: um primeiro plasmídeo de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica uma mevalonato quinase; um segundo plasmídeo de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais enzimas da via de mevalonato, exceto mevalonato quinase (MK), em que a referida enzima da via de mevalonato diferente de MK é selecionada dentre acetoacetil- CoA tiolase, hidroximetilglutaril-Coenzima A (HMG-Co) sintase (HMGS), HMG-CoA redutase (HMGR), fosfomevalonato quinase (PMK) e mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPD), em que o número de cópias do segundo plasmídeo de expressão é menor do que aquele do primeiro plasmídeo de expressão; e uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma terpeno sintase.