ES2880004T3 - Coproducción de un sesquiterpeno y un carotenoide - Google Patents

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Abstract

Un método para la coproducción de dos o más isoprenoides, el método comprende: a. cultivar, en un medio de cultivo, una célula hospedera modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una primera vía biosintética para producir un primer isoprenoide y con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una segunda vía biosintética para producir un segundo isoprenoide, que tiene un peso molecular diferente del primer isoprenoide; y b. recuperar el primer isoprenoide; y c. recuperar el segundo isoprenoide, en donde el primer isoprenoide es un sesquiterpeno y el segundo isoprenoide es un carotenoide, en donde un flujo de carbono hacia la producción de carotenoide se reduce en comparación con un flujo de carbono hacia la producción de sesquiterpeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Coproducción de un sesquiterpeno y un carotenoide
1. Campo de la invención
En la presente descripción se proporcionan métodos útiles para la coproducción de dos o más isoprenoides a partir de células microbianas durante la fermentación y el aprovechamiento de células microbianas agotadas.
2. Antecedentes de la invención
Los isoprenoides son de naturaleza ubicua. Comprenden una familia diversa de más de 40 000 productos individuales, muchos de los cuales son vitales para los organismos vivos. Los isoprenoides sirven para mantener la fluidez celular, el transporte de electrones y otras funciones metabólicas. Un amplio número de isoprenoides naturales y sintéticos tienen muchas aplicaciones, tales como productos farmacéuticos, cosméticos, perfumes, pigmentos y colorantes, fungicidas, antisépticos, nutracéuticos e intermediarios químicos finos.
En particular, los carotenoides se encuentran en peces, animales y crustáceos. El carotenoide rojo astaxantina se ha usado como una fuente de pigmentación en la industria, por ejemplo, para la carne de salmónidos en la industria acuícola. Ukibe y otros, 2009, Appl. Environ. Microbiol. 75:7205-7211. La astaxantina constituye uno de los mayores costos de la alimentación del salmón y es necesaria para el color rojo de la carne del salmón.
Tradicionalmente, los isoprenoides se producían por la extracción de fuentes naturales como las plantas, microbios y animales. Sin embargo, el rendimiento por extracción suele ser muy bajo debido a una serie de limitaciones significativas. Primero, la mayoría de los isoprenoides se acumulan en la naturaleza solo en pequeñas cantidades. En segundo lugar, los organismos que las producen en general no son aptos para el cultivo a gran escala, el cual es necesario para producir cantidades comercialmente viables de los isoprenoides deseados.
Se han realizado avances en el campo de la biología sintética y actualmente se están produciendo varios isoprenoides a escala industrial. Sin embargo, dadas las cantidades muy grandes de productos isoprenoides necesarios para muchas aplicaciones comerciales, sigue existiendo la necesidad de mejorar los sistemas y los procedimientos de fermentación que pueden producir isoprenoides de manera más eficiente que la disponible con las tecnologías actuales. Además, es conveniente la producción eficiente de carotenoides, como la astaxantina, a partir de una fuente renovable.
Las modalidades de la presente invención satisfacen estas y otras necesidades. El documento US 2009/142322 describe cepas de levadura oleaginosas recombinantes que pueden producir coenzima Q10. El documento WO 2008/073367 describe cepas de levadura oleaginosas recombinantes que pueden usarse en la producción de carotenoides. El documento WO 2009/126890 describe sistemas para producir levaduras oleaginosas recombinantes u hongos que pueden expresar carotenoides.
3. Resumen
En la presente descripción se proporcionan métodos útiles para la coproducción de dos o más isoprenoides a partir de células hospederas modificadas genéticamente para producir isoprenoides, y el aprovechamiento de células hospederas agotadas, en particular, células hospederas microbianas agotadas.
En la presente descripción se describen células hospederas modificadas genéticamente para producir un primer isoprenoide y además modificadas genéticamente para producir un segundo isoprenoide. Determinadas modalidades descritas en la presente descripción se refieren generalmente a microorganismos (por ejemplo, microorganismos no naturales) que producen al menos tanto un sesquiterpeno tal como farneseno, como un carotenoide, por ejemplo astaxantina, una xantofila, un cetocarotenoide u otro carotenoide. En determinadas modalidades, las células hospederas son capaces de producir farneseno y un carotenoide, tal como astaxantina, una xantofila, un cetocarotenoide u otro carotenoide. En determinadas modalidades, las células hospederas son capaces de producir farneseno y astaxantina.
En la presente descripción también se describen células hospederas capaces de producir tanto un sesquiterpeno tal como farneseno y un carotenoide, por ejemplo astaxantina, una xantofila, un cetocarotenoide u otro carotenoide. En determinadas modalidades, las células hospederas comprenden uno o más ácidos nucleicos que codifican al menos una de cada enzima de la vía del mevalonato, descrita en la presente descripción. En determinadas modalidades, las células hospederas comprenden además un ácido nucleico que codifica una terpeno sintasa, como se describe en la presente descripción. En determinadas modalidades, la terpeno sintasa es farneseno sintasa. En determinadas modalidades, las células hospederas comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican enzimas de una vía capaz de producir carotenoides, como astaxantina, una xantofila, un cetocarotenoide u otro carotenoide. En determinadas modalidades, el carotenoide es astaxantina. En determinadas modalidades, estas enzimas se seleccionan del grupo que consiste en fitoeno sintasa/licopeno ciclasa, fitoeno desaturasa, astaxantina sintasa citocromo P450 hidroxilasa/cetolasa, citocromo P450 reductasa, p-caroteno cetolasa, p-caroteno hidroxilasa, pcaroteno cetolasa, p-caroteno hidroxilasa y sus combinaciones. En determinadas modalidades, las diversas enzimas de estas modalidades están codificadas por una pluralidad de ácidos nucleicos. En determinadas modalidades, un único ácido nucleico codifica cada enzima de estas modalidades. En determinadas modalidades, las diversas enzimas de estas modalidades están codificadas por una pluralidad de ácidos nucleicos heterólogos. En determinadas modalidades, un único ácido nucleico heterólogo codifica cada enzima de estas modalidades.
En determinadas modalidades, se libera una cantidad sustancial de sesquiterpeno de las células de donde puede recuperarse. En determinadas modalidades, una cantidad sustancial del carotenoide permanece en las células (o permanece asociado con la biomasa celular) de donde puede recuperarse al recuperar la masa celular. La producción del sesquiterpeno y el carotenoide se produce al mismo tiempo o aproximadamente (primera modalidad de la Figura 4). En determinados ejemplos, puede haber un interruptor genético tal que la biomasa y el sesquiterpeno se produzcan inicialmente seguido de la producción del carotenoide en la biomasa después de que se haya activado el interruptor genético (segundo ejemplo de la Figura 4). En determinadas modalidades, el sesquiterpeno y la biomasa pueden separarse mediante centrifugación diferencial, con el sesquiterpeno en una fase líquida de baja densidad y la biomasa con material sólido precipitado. En una primera modalidad, la biomasa precipitada contiene el carotenoide. En un segundo ejemplo, la biomasa puede resuspenderse en medio y someterse a un interruptor genético para activar la producción de carotenoides. En el segundo ejemplo, después de la incubación en condiciones adecuadas durante un período de tiempo adecuado, la biomasa puede precipitarse de nuevo y puede producirse la biomasa precipitada que contiene el carotenoide.
Las presentes modalidades proporcionan varias ventajas. Una ventaja de producir dos o más isoprenoides (por ejemplo, Carotenoides tal como la astaxantina en las mismas células de levadura que producen un sesquiterpeno tal como el farneseno) es que pueden producirse múltiples productos isoprenoides en una sola fermentación después de la inoculación. Por lo tanto, la misma biomasa celular cultivada durante la fase inicial de fermentación puede usarse para producir dos o más productos isoprenoides. Si se realizaran fermentaciones separadas para dos o más isoprenoides, entonces la mayoría de las unidades de operación deben duplicarse (por ejemplo, inoculación, crecimiento de la cepa madre, crecimiento y operación de los fermentadores de producción), lo que lleva a un aumento concomitante en el costo total de producción de los dos o más isoprenoides. Además, el costo de las fuentes de carbono para la fermentación aumentaría significativamente si se realizaran dos fermentaciones separadas. Esto se debe a que el crecimiento de la biomasa es un uso significativo de la fuente de carbono, y la producción de biomasa sería necesaria en ambas fermentaciones, lo que llevaría a un aumento múltiple en el requisito de fuente de carbono para producir la biomasa.
Hay ventajas adicionales. Por ejemplo, en determinadas modalidades, los múltiples productos isoprenoides producidos en células hospederas están presentes predominantemente en diferentes fases. Por ejemplo, un isoprenoide más grande (por ejemplo, un isoprenoide C40) se asocia predominantemente con las células, ya que su tamaño no permite su liberación de las células al medio de fermentación, y un isoprenoide más pequeño (por ejemplo, Isoprenoide C15) se libera predominantemente en el medio de fermentación. La presencia de dos isoprenoides objetivo en diferentes fases puede permitir una separación fácil de los dos productos isoprenoides. Además, las células hospederas resultantes de la producción del sesquiterpeno, sin la producción de carotenoides, son de bajo valor, y se convierten ya sea en un producto desecho a eliminar, o de valor mínimo como componente de alimento para animales. La producción de carotenoides, por ejemplo astaxantina, en las células de levadura, aumenta drásticamente el valor de la levadura que resulta de la producción de sesquiterpeno. La levadura que contiene carotenoides tiene un valor significativamente mayor. Por ejemplo, la levadura que contiene astaxantina podría venderse en el mercado de alimentos para el salmón para reemplazar el uso de astaxantina sintética, que constituye uno de los mayores costos de los alimentos para el salmón y es necesaria para el color rojo de la carne del salmón. La presente invención se refiere a un método para la coproducción de dos o más isoprenoides, el método comprende:
a. cultivar, en un medio de cultivo, una célula hospedera modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una primera vía biosintética, para producir un primer isoprenoide, y con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una segunda vía biosintética, para producir un segundo isoprenoide, que tiene un peso molecular que es diferente del primer isoprenoide, y
b. recuperar el primer isoprenoide, y
c. recuperar el segundo isoprenoide,
en donde el primer isoprenoide es un sesquiterpeno y el segundo isoprenoide es un carotenoide,
en donde se reduce un flujo de carbono hacia la producción de carotenoide en comparación con un flujo de carbono hacia la producción de sesquiterpeno.
La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
4. Breve descripción de las figuras
La Figura 1A ilustra una descripción general de una vía del mevalonato abreviada y una división del flujo de carbono para la biosíntesis de farneseno y carotenoides. Se muestran las estructuras de 3 carotenoides: (a) licopeno, (b) pcaroteno y (c) astaxantina.
La Figura 1B ilustra la vía del mevalonato y la producción de isoprenoides de varios números de carbonos.
La Figura 2 ilustra la vía de producción de p-caroteno en la levadura carotogénica, Xanthophyllomyces dendrorhus, mostrando también GGPS de Saccharomyces cerevisiae codificado por BTS1.
La Figura 3A ilustra la vía manipulada genéticamente para la biosíntesis de astaxantina en S. cerevisiae usando genes de X. dendrorhous.
La Figura 3B ilustra una vía ilustrativa para la producción de luteína y otros carotenoides.
La Figura 4 ilustra dos ejemplos diferentes de coproducción de farneseno y carotenoides.
La Figura 5 ilustra la elución de betacaroteno de la columna en una HPLC a los 11,5 min.
La Figura 6 ilustra que los estándares de calibración de betacaroteno muestran un aumento en el área del pico con el aumento de la concentración. En la Figura 6 se muestra una superposición de los cromatogramas de HPLC sin procesar de los estándares de calibración en todos los niveles. Los picos se separaron y monitorizaron a 450 nm como se informa en la sección de métodos.
La Figura 7 ilustra la curva de calibración que muestra una muy buena correlación entre el área del pico y la concentración del analito (R2 > 0,99).
La Figura 8 ilustra que la astaxantina eluye aproximadamente de los 1,4 min y muestra un claro aumento en el área del pico con el aumento de la concentración. Las concentraciones informadas aquí son una estimación resultante de una dilución en serie en acetona de aproximadamente 1 mg/ml de la solución concentrada en DMSO. Sin embargo, esta figura muestra claramente que la astaxantina y el caroteno pueden separarse usando las condiciones actuales. Los picos se monitorizaron a 480 nm y no observamos ningún cambio significativo en la respuesta de los picos incluso cuando se midió a 450 nm (se usa típicamente para el betacaroteno).
La Figura 9 muestra varias muestras de cepas extraídas y analizadas usando las condiciones mencionadas en este informe. A) Cepa de origen de la GGPPS sin genes aguas abajo, de acuerdo a lo esperado, no muestra signos de betacaroteno o astaxantina. B) La cepa parental que contiene solo genes que codifican betacaroteno muestra claramente la presencia del mismo después de la extracción y el análisis. Por el momento, la identidad del segundo pico a los 13,3 minutos no es clara. Es probable que sea el análogo dihidro del betacaroteno, que es un subproducto conocido del gen crtYB (ref.: Verwaal y otros 2007). C) La cepa hija muestra claramente la presencia de astaxantina junto con betacaroteno y otros carotenoides potenciales a los 1,4 min. Se desconocen las identidades de otros picos más pequeños y podrían ser otros carotenoides aguas abajo (más polares que el betacaroteno, probablemente formas oxigenadas) o también pueden contener alguna degradación o análogos transformados de la astaxantina. La Figura 10 ilustra placas representativas que muestran las colonias de color amarillo/naranja. A, C. Las colonias en esta placa se ven de color amarillo claro. B. Las colonias en esta placa se ven anaranjadas.
La Figura 11 ilustra placas representativas que muestran las colonias de cepas rojas de coproducción. Izquierda, placa de transformación con colonias individuales. Derecha, reactivación de los clones seleccionados. Las colonias amarillas comprenden ácidos nucleicos que codifican la vía biosintética del betacaroteno. Las colonias rojas son las cepas que producen astaxantina.
La Figura 12 muestra la producción de farneseno por cepas manipuladas genéticamente para producir carotenoides (P-caroteno o astaxantina). La cepa de producción de farneseno manipulada genéticamente con la vía biosintética de carotenoides produjo farenseno, como se muestra en la Figura 12. Estas cepas también produjeron carotenoides (datos no mostrados).
Las Figuras 13A y 13B muestran la producción de farneseno (13A) y el crecimiento (densidad óptica: 13B) para varias cepas.
La Figura 14A muestra la producción de farneseno para varias cepas. La Figura 14B muestra el crecimiento (densidad óptica) de varias cepas.
5. Descripción detallada de las modalidades
5.1. Definiciones
Los términos "isoprenoide", "compuesto isoprenoide", "terpeno", "compuesto terpénico", "terpenoide" y "compuesto terpenoide" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a cualquier compuesto que pueda derivarse de pirofosfato de isopentenilo (IPP). El número de átomos de C presentes en los isoprenoides es típicamente divisible por cinco (por ejemplo, C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40). Se han informado isoprenoides y politerpenos irregulares, que también se incluyen en la definición de "isoprenoide". Los compuestos isoprenoides incluyen, pero no se limitan a, monoterpenos, diterpenos, triterpenos, sesquiterpenos y politerpenos.
El término "carotenoide" se refiere a un compuesto que se compone de una cadena principal de polieno que se condensa a partir de una unidad de isopreno de cinco carbonos. Los carotenoides pueden ser acíclicos o terminados con uno (monocíclico) o dos (bicíclicos) grupos cíclicos de los extremos. El término "carotenoide" puede incluir tanto carotenos como xantofilas. Un "caroteno" se refiere a un carotenoide hidrocarburo. Los derivados de caroteno que contienen uno o más átomos de oxígeno, en forma de grupos funcionales hidroxi, metoxi, oxo, epoxi, carboxi o aldehídicos, o dentro de glucósidos, ésteres de glucósidos o sulfatos, se conocen colectivamente como "xantofilas ". Los carotenoides que son particularmente adecuados en la presente invención son los carotenoides monocíclicos y bicíclicos.
Como se usa en la presente descripción, el término "difosfato de prenilo" se usa indistintamente con "pirofosfato de prenilo" e incluye difosfatos de monoprenilo que tienen un solo grupo prenilo (por ejemplo, IPP y DMAPp ), así como difosfatos de poliprenilo que incluyen 2 o más grupos prenilo. Los difosfatos de monoprenilo incluyen pirofosfato de isopentenilo (IPP) y su isómero pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP).
Como se usa en la presente descripción, el término "terpeno sintasa" se refiere a cualquier enzima que modifica enzimáticamente IPP, DMAPP o un poliprenil pirofosfato, de manera que se produce un compuesto precursor terpenoide. El término "terpeno sintasa" incluye enzimas que catalizan la conversión de un difosfato de prenilo en un precursor isoprenoide o isoprenoide.
La palabra "pirofosfato" se usa indistintamente en la presente descripción con "difosfato" y se refiere a dos grupos fosfato unidos covalentemente. Así, por ejemplo, los términos "difosfato de prenilo" y "pirofosfato de prenilo" son intercambiables; los términos "pirofosfato de isopentenilo" y "difosfato de isopentenilo" son intercambiables; los términos difosfato de farnesilo "y pirofosfato de farnesilo" son intercambiables; etc.
El término "vía del mevalonato" o "vía MEV" se usa en la presente descripción para referirse a la vía biosintética que convierte acetil-CoA en IPP. La vía del mevalonato comprende enzimas que catalizan las siguientes etapas: (a) condensar dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA (por ejemplo, por acción de acetoacetil-CoA tiolasa); (b) condensar acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar hidroximetilglutaril-coenzimaA (HMG-CoA) (por ejemplo, mediante la acción de HMG-CoA sintasa (HMGS)); (c) convertir HMG-CoA en mevalonato (por ejemplo, mediante la acción de la HMG-CoA reductasa (HMGR)); (d) fosforilar mevalonato a mevalonato 5-fosfato (por ejemplo, por acción de la mevalonato quinasa (MK)); (e) convertir mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato (por ejemplo, por acción de fosfomevalonato quinasa (PMK)); y (f) convertir mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato (por ejemplo, mediante la acción de la mevalonato pirofosfato descarboxilasa (MPD)). La vía del mevalonato se ilustra esquemáticamente en la Figura 1. La "mitad superior" de la vía del mevalonato se refiere a las enzimas responsables de la conversión de acetil-CoA en mevalonato.
El término "vía de I-desoxi-D-xilulosa 5-difosfato" o "vía de DXP" se usa en la presente descripción para referirse a la vía que convierte gliceraldehído-3-fosfato y piruvato en IPP y DMAPP a través de un intermediario de la vía de DXP, donde la vía de DXP comprende enzimas que catalizan la reacción. Las enzimas típicas de la vía DXP incluyen DXS, DXR, CMS, CMK, m Cs , HDS y HDR. Dxs es 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa; Dxr es 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (también conocida como IspC); IspD (CMS) es 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa; IspE (CMK) es 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa; IspF (m Cs ) es 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa; IspG (HDS) es 1-hidroxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintasa; e IspH (HDR) es isopentenil/dimetilalil difosfato sintasa.
Como se usa en la presente descripción, el término "prenil transferasa" se usa indistintamente con los términos "isoprenil difosfato sintasa" y "poliprenil sintasa" (por ejemplo, "GPP sintasa", "FPP sintasa", "OPP sintasa", etc.) para referirse a una enzima que cataliza la condensación consecutiva 1'-4 de isopentenil difosfato con sustratos de imprimación alílica, lo que da como resultado la formación de prenil difosfatos de varias longitudes de cadena. Como se usa en la presente descripción, el término "compuesto (s) objetivo" se refiere a compuestos que van a recuperarse de una célula hospedera modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican enzimas de una vía biosintética para producir el (los) compuesto (s) objetivo, y no incluyen metabolitos que pueden producirse accidentalmente durante la producción del compuesto o compuestos objetivo. En modalidades particulares, se recuperan dos o más compuestos objetivo de un cultivo.
El término "ciclo de fermentación" se refiere a un ciclo completo de una fermentación discontinua, semicontinua o continua. Preferentemente, un ciclo de fermentación comienza cuando el fermentador se llena inicialmente con materiales de partida y se inocula con los organismos adecuados. Un ciclo de fermentación termina preferentemente cuando los organismos fermentadores ya no están activos, o cuando se vacía el fermentador.
El término "inoculación" se refiere a la colocación de células hospederas (por ejemplo, células microbianas modificadas genéticamente) que crecerán para formar el cultivo microbiano colocado en un medio de cultivo, tal como un tanque de fermentación que comprende el medio a fermentar.
El término "inóculo individual" se refiere al material que se usa en una inoculación, por ejemplo, una composición que comprende células hospederas (por ejemplo, células microbianas modificadas genéticamente) que se colocan en un medio de cultivo, tal como un tanque de fermentación que comprende medios, en un momento inicial para cultivar la biomasa.
El término "coproducción" se refiere a producir dos o más compuestos objetivo a partir de un inóculo individual, es decir, a partir de células que se produjeron a partir de una única célula hospedera. Como se usa en la presente descripción, el término coproducción puede referirse a la producción concurrente o simultánea de dos o más compuestos en un solo ciclo de fermentación en un fermentador. El término coproducción también puede referirse a una producción secuencial de dos o más compuestos objetivo a partir de un inóculo individual, en donde al menos un compuesto objetivo se produce activando la expresión de enzimas de una vía biosintética para el compuesto objetivo en un primer ciclo de fermentación, seguido de la activación de la expresión de enzimas de otra vía biosintética para otro compuesto objetivo. En determinadas modalidades, puede conseguirse una producción secuencial en dos ciclos de fermentación separados.
Como se usa en la presente descripción, el término "carotenoide" se refiere a una clase de hidrocarburos que tienen un esqueleto de polienocarbonado conjugado derivado formalmente de isopreno. Esta clase de moléculas está compuesta por triterpenos y tetraterpenos y sus derivados oxigenados; y típicamente estas moléculas tienen fuertes propiedades de absorción de luz e imparten color.
El término "carotenoide" puede incluir tanto carotenos como xantofilas. Un "caroteno" se refiere a un carotenoide hidrocarburo (por ejemplo, p-caroteno y licopeno). Por el contrario, el término "xantofila" se refiere a un carotenoide C40 que contiene uno o más átomos de oxígeno en forma de grupos funcionales hidroxi, metoxi, oxo, epoxi, carboxi o aldehídicos. Los ejemplos de xantofilas incluyen, pero no se limitan a, anteraxantina, adonixantina, astaxantina (es decir, 3,3"-dihidroxi-p, p-caroteno-4,4"-diona), cantaxantina (es decir, p,p-caroteno-4,4"-diona), p-criptoxantina, ceto-Y-caroteno, equinenona, 3-hidroxiequinenona, 3'-hidroxiequinenona, zeaxantina, adonirrubina, tetrahidroxi-p, p'-caroten-4,4'-diona, tetrahidroxi- p,P'-caroten-4-ona, caloxantina, eritroxantina, nostoxantina, flexixantina, 3-hidroxi-Y-caroteno, 3-hidroxi-4-ceto-Y-caroteno, bacteriorrubixantina, bacteriorrubixantinal y luteína.
Como se usa en la presente descripción, "un primer isoprenoide" y "un segundo isoprenoide" se refieren a compuestos objetivo que son producidos por una célula hospedera modificada genéticamente con ácidos nucleicos heterólogos que codifican una vía biosintética para producir el primer isoprenoide y el segundo isoprenoide. Los compuestos objetivo son compuestos que se prevén para recuperarse de la célula hospedera. Generalmente, no son intermediarios en las vías para producir los compuestos del hospedero. Los expertos reconocerán que los compuestos objetivo pueden tener intermediarios comunes.
Como se usa en la presente descripción, el término "interruptor genético" se refiere a uno o más elementos genéticos que permiten la expresión controlada de enzimas que producen el primer compuesto isoprenoide y enzimas que producen el segundo compuesto isoprenoide. En una primera configuración, el interruptor genético podría promover la expresión de enzimas que producen el primer compuesto isoprenoide y suprimir las enzimas que producen el segundo compuesto isoprenoide. En una segunda configuración, el interruptor genético podría suprimir la expresión de enzimas que producen el primer compuesto isoprenoide y promover las enzimas que producen el segundo compuesto isoprenoide. En una tercera configuración, el interruptor genético podría promover la expresión de enzimas que producen el primer compuesto isoprenoide y promover las enzimas que producen el segundo compuesto isoprenoide. En una cuarta configuración, el interruptor genético podría suprimir la expresión de las enzimas que producen el primer compuesto isoprenoide y suprimir las enzimas que producen el segundo compuesto isoprenoide. Por ejemplo, un interruptor genético puede incluir uno o más promotores unidos operativamente a uno o más genes que codifican una enzima biosintética o uno o más promotores unidos operativamente a un regulador transcripcional que regula la expresión de una o más enzimas biosintéticas.
Como se usa en la presente descripción, el término "heterólogo" se refiere a lo que normalmente no se encuentra en la naturaleza. El término "secuencia de nucleótidos heteróloga" se refiere a una secuencia de nucleótidos que normalmente no se encuentra en la naturaleza en una célula dada. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos heteróloga puede: (a) ser externa a su célula hospedera (es decir, es "exógena" a la célula); (b) encontrarse naturalmente en la célula hospedera (es decir, "endógena") pero estar presente en una cantidad no natural en la célula (es decir, mayor o menor cantidad que la que se encuentra naturalmente en la célula hospedera); o (c) encontrarse de forma natural en la célula hospedera pero situada fuera de su lugar natural. El término "enzima heteróloga" se refiere a una enzima que normalmente no se encuentra en la naturaleza en una célula determinada. El término abarca una enzima que es: (a) exógena a una célula dada (es decir, está codificada por una secuencia de nucleótidos que no está presente naturalmente en la célula hospedera o no está presente naturalmente en un contexto dado en la célula hospedera); y (b) que se encuentra naturalmente en la célula hospedera (por ejemplo, la enzima está codificada por una secuencia de nucleótidos que es endógena en la célula) pero que se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor o menor que la que se encuentra naturalmente) en la célula hospedera. Por otro lado, el término "nativo" o "endógeno" como se usa en la presente descripción con referencia a moléculas, y en particular enzimas y ácidos nucleicos, indica moléculas que se expresan en el organismo en el que se originaron o se encuentran en la naturaleza, independientemente del nivel de expresión que puede ser menor, igual o mayor que el nivel de expresión de la molécula en el microorganismo nativo. Se entiende que la expresión de enzimas o polinucleótidos nativos puede modificarse en microorganismos recombinantes.
Como se usa en la presente descripción, el término "producción" generalmente se refiere a una cantidad de isoprenoide o que se produce por una célula hospedera modificada genéticamente que se proporciona en la presente descripción. En algunas modalidades, la producción se expresa como un rendimiento de isoprenoide por la célula hospedera. En otras modalidades, la producción se expresa como la productividad de la célula hospedera en la producción del isoprenoide.
Como se usa en la presente descripción, el término "productividad" se refiere a la producción de un isoprenoide por una célula hospedera, expresada como la cantidad de isoprenoide producido (en peso) por cantidad de caldo de fermentación en el que se cultiva la célula hospedera (en volumen) a lo largo del tiempo (por hora).
Como se usa en la presente descripción, el término "rendimiento" se refiere a la producción de un isoprenoide por una célula hospedera, expresada como la cantidad de isoprenoide producido por cantidad de fuente de carbono consumida por la célula hospedera, en peso.
Como se usa en la presente descripción, el término "variante" se refiere a un polipéptido que se diferencia de un polipéptido de "referencia" que se menciona específicamente (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre) por inserciones, deleciones, mutaciones y sustituciones de aminoácidos, pero que conserva una actividad que es sustancialmente similar al polipéptido de referencia. En algunas modalidades, la variante se crea mediante técnicas de ADN recombinante, como mutagénesis. En algunas modalidades, un polipéptido variante se diferencia de su polipéptido de referencia por la sustitución de un residuo básico por otro (es decir, Arg por Lys), la sustitución de un residuo hidrófobo por otro (es decir, Leu por Ile) o la sustitución de un residuo aromático para otro (es decir, Phe por Tyr), etc. En algunas modalidades, las variantes incluyen análogos en los que se obtienen sustituciones conservadoras que dan como resultado una analogía estructural sustancial de la secuencia de referencia. Ejemplos de tales sustituciones conservadoras, sin limitación, incluyen ácido glutámico por ácido aspártico y viceversa; glutamina por asparagina y viceversa; serina por treonina y viceversa; lisina por arginina y viceversa; o cualquiera de isoleucina, valina o leucina entre sí.
Como se usa en la presente descripción, el término "identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o proteínas, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales. Por ejemplo, la secuencia puede tener un porcentaje de identidad de al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91, % al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o mayor identidad a una referencia secuencia en una región específica, cuando se compara y alinea para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o una región designada, como se mide mediante el uso de un algoritmo de comparación de secuencia o por alineamiento manual e inspección visual. Por ejemplo, el porcentaje de identidad se determina calculando la proporción del número de nucleótidos idénticos (o residuos de aminoácidos) en la secuencia, dividida por la longitud de los nucleótidos totales (o residuos de aminoácidos), menos las longitudes de cualquier espacio.
Por conveniencia, el grado de identidad entre dos secuencias puede determinarse mediante el uso de un programa informático y algoritmos matemáticos que se conocen en la técnica. Dichos algoritmos que calculan el porcentaje de identidad de secuencia generalmente tienen en cuenta los huecos y desapareamientos de secuencia en la región de comparación. Los programas que comparan y alinean secuencias, como Clustal W (Thompson y otros, (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680), ALIGN (Myers y otros, (1988) CABIOS, 4: 11-17), FASTA (Pearson y otros, (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183:63-98) y BLAST con huecos (Altschul y otros, (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402) son útiles para este propósito. El programa BLAST o BLAST 2.0 (Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990) está disponible en varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional para la Información Biológica (NCBI) e Internet, para su uso en conexión con los programas de análisis de secuencias BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN y TBLASTX. Se puede encontrar información adicional en el sitio web de NCBI.
En determinadas modalidades, los alineamientos de secuencia y los cálculos del porcentaje de identidad pueden determinarse mediante el programa BLAST usando sus parámetros estándares por defecto. Para el alineamiento de la secuencia de nucleótidos y los cálculos de identidad de secuencia, el programa BLASTN se usa con sus parámetros predeterminados (penalización de apertura de brecha = 5, penalización de extensión de brecha = 2, coincidencia nucleica = 1, discordancia nucleica = -3, valor de expectativa = 10,0, tamaño de palabra = 11). Para el alineamiento de la secuencia de polipéptidos y los cálculos de identidad de secuencia, el programa BLASTP se usa con sus parámetros predeterminados (Matriz de alineamiento = BLOSUM62; Penalización por huecos: Existencia = 11, Extensión = 1; Ajustes de composición = Puntaje de composición condicional, ajuste de matriz; Valor esperado = 10,0; tamaño = 6; coincidencias máximas en un intervalo de la secuencia problema = 0). Alternativamente, se usan el siguiente programa y parámetros: programa Align Plus de Clone Manager Suite, versión 5 (programa Sci-Ed); Comparación de ADN: comparación global, matriz de puntuación lineal estándar, penalización por desapareamiento = 2, penalización por hueco abierto = 4, penalización por hueco extendido = 1. Comparación de aminoácidos: comparación global, matriz de puntuación BLOSUM 62.
5.2. Descripción
En la presente descripción se proporcionan métodos para la coproducción de dos o más isoprenoides en un medio de cultivo. Las células hospederas comprenden una o más enzimas en una primera vía biosintética para producir un primer isoprenoide. Las células hospederas comprenden además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una segunda vía biosintética para producir un segundo isoprenoide. En los métodos, se recupera el primer isoprenoide y se recupera el segundo isoprenoide.
Los carotenoides son pigmentos rojos, amarillos y anaranjados que se distribuyen ampliamente en la naturaleza. Los carotenoides C40 pertenecen a la categoría de tetraterpenos (es decir, tienen 40 átomos de carbono y se generan a partir de cuatro unidades de terpeno que contiene, cada una, 10 átomos de carbono). Hay dos clases generales de carotenoides: carotenos y xantofilas. Los carotenos comprenden solo átomos de carbono e hidrógeno. Las xantopilas tienen uno o más átomos de oxígeno. Los carotenoides de hidrocarburos se clasifican como carotenos, mientras que los que contienen oxígeno se conocen como xantopilas. La astaxantina es un carotenoide oxidado conocido como xantofila o cetocarotenoide (es decir, un carotenoide con un grupo cetona).
El farneseno (u otros sesquiterpenos) y todos los carotenoides, incluida la astaxantina, son isoprenoides que pueden producirse en la levadura a través de la vía del mevalonato. En la Figura 1A se muestra esquemáticamente la división del flujo de carbono a farneseno o carotenoides (incluida la astaxantina). Las abreviaturas usadas en la Figura 1A incluyen HMG-CoA (3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A), IPP (difosfato de isopentenilo), GPP (difosfato de geranilo) y FPP (difosfato de farnesilo). Las flechas en la Figura 1A representan conversiones enzimáticas y pueden ser catalizadas por una sola enzima o más de una enzima. La Figura 1A incluye una versión abreviada de la vía del mevalonato, y la vía completa del mevalonato y la producción de otros terpenos se ilustran en la Figura 1B. En la Sección 5.5 se describen con más detalle las enzimas de la vía del mevalonato (desde acetil-CoA hasta IPP). Mientras que las Figuras 1A y 1B ilustran la vía del mevalonato para producir precursores isoprenoides como IPP, la vía DXP puede usarse para producir precursores isoprenoides.
La sobreexpresión de la vía del mevalonato en la levadura (Saccharomyces cerevisiae) se describió en la literatura científica (por ejemplo, Notman y otros, J. Am. Chem. Soc., 128, 2006, 13982-13983; He y otros, Mol. Membr. Biol.
3-4, 2012, 107-113). En determinadas modalidades, una o más enzimas de la vía del mevalonato se sobreexpresan, como se describió previamente.
Se ha descrito la producción de p-caroteno en S. cerevisiae manipulada genéticamente. Kim y otros, Food Sci. Biotechnol. 19 de Octubre de 2010, 263-266. La vía biosintética del p-caroteno se reproduce en la Figura 2. Como se ilustra en la vía biosintética de p-caroteno ilustrativo mostrada en la Figura 2, una vez que se forma IPP a partir de la vía del mevalonato, puede convertirse en pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP) mediante una isomerasa de IPP. IPP y DMAPP se condensan mediante la geranil pirofosfato sintasa (GPPS) para producir geranil pirofosfato (GPP). GPP e IPP pueden combinarse mediante farnesil pirofosfato sintasa (FPPS) para producir farnesil pirofosfato (FPP). FPP e IPP pueden combinarse mediante una geranil pirofosfato sintasa (GGPp sintasa) para producir GGPP. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican las GGPP sintasas incluyen el gen BTS1 (S. cerevisiae) y el gen CrtE (X. dendrohous). La fitoeno sintasa (codificada por CrtB) puede combinar GGPP y GGPP para producir fitoeno. En la vía biosintética de p-caroteno ilustrativa que se muestra en la Figura 2, se muestra una enzima bifuncional (fitoeno sintasa/licopeno ciclasa) para este paso de reacción enzimática que está codificada por CrtYB. El fitoeno puede convertirse en neurosporeno mediante la acción enzimática de una fitoeno desaturasa que puede estar codificada por el gen CrtI. El neuroesporeno puede convertirse en 7,8-dihidro-p-caroteno mediante la acción enzimática de licopeno ciclasa (codificada por el gen CrtY) o una enzima bifuncional (codificada por el gen CrtYB). El neurosporeno también puede convertirse en licopeno por la acción enzimática de una fitoeno desaturasa (codificada por el gen CrtI). El licopeno puede convertirse en p-caroteno mediante la acción enzimática de una licopeno ciclasa (codificada por el gen CrtB). En la vía biosintética de p-caroteno ilustrativa que se muestra en la Figura 2, se muestra una enzima bifuncional (fitoeno sintasa/licopeno ciclasa) para este paso de reacción enzimática que está codificada por el gen CrtYB. Se observa que el fitoeno mostrado en la Figura 2 no imparte ningún color y, por lo tanto, no se considera un carotenoide, mientras que el neurosporeno, el licopeno, el p-caroteno y el 7,8-dihidro-p-caroteno se consideran carotenoides.
La producción de astaxantina a partir de betacaroteno se muestra en la Figura 3A. Figura 3A ilustra una vía biosintética ilustrativa para la astaxantina a partir de p-caroteno. Las flechas gruesas negras, blancas y grises indican las reacciones catalizadas por las enzimas codificadas por crtW, crtZ y crtS, respectivamente. Ver Ukibe y otros, Applied y Environ. Microbiol. Noviembre de 2009, página 7025-7211. El betacaroteno se convierte en astaxantina en cuatro pasos en los que se añaden dos grupos ceto e hidroxilo a cada anillo mediante betacaroteno cetolasa codificada por crtW y betacaroteno hidroxilasa codificada por crtZ, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3A, un solo gen de X. dendrorhous, CrtYB, codifica una enzima bifuncional fitoeno sintasa/licopeno ciclasa. Ver Verdoes y otros, 1999, Mol. Gen. Genet. 262:453-461. CrtS codifica la astaxantina sintasa, que cataliza la cetolación y la hidroxilación del betacaroteno. Se cree que se supone que crtS codifica una proteína del citocromo p450. Ojima y otros (2006) Mol. Gineta. Genómica 275:148-158. Se cree que la introducción de crtR, que codifica la citocromo p450 reductasa, es importante para la expresión funcional de CrtS y la producción de astaxantina en células hospederas como S. cerevisiae. Ver Ukibe y otros, Applied y Environ. Microbiol. Noviembre de 2009, página 7025-7211.
Figura 3B ilustra otra vía biosintética ilustrativa para la producción de carotenoides. En particular, la Figura 3B ilustra la producción de luteína a partir de licopeno. El licopeno puede convertirse en 5-caroteno mediante una licopeno ciclasa (EC 5.5.1.18). El 5-caroteno puede convertirse en a-caroteno mediante 5-caroteno p-ciclasa (EC 5.5.1.19). El a-caroteno puede convertirse en zeinoxantina mediante la hidroxilasa de anillo p (EC 1.14.99.-). La zeinoxantina puede convertirse en luteína mediante la caroteno £-monooxigenasa (EC 1.14.99.45). Ejemplos de estas enzimas son CitHYb, CitCYP97A, CitCYP97B y CitCYP97C de vías cítricas (Ma y otros 2016, BMC Plant Biology 16:148). En determinadas modalidades, cualquier ácido nucleico adecuado que codifique enzimas en la vía biosintética de la luteína puede usarse para producir células hospederas modificadas genéticamente o métodos para la coproducción de luteína con otro isoprenoide.
En determinadas modalidades, cualquier ácido nucleico adecuado que codifique enzimas en la vía biosintética de pcaroteno/astaxantina puede usarse para producir células hospederas modificadas genéticamente o métodos para la coproducción de uno o más carotenoides con otro isoprenoide. Los ácidos nucleicos ilustrativos que codifican tales enzimas útiles en las presentes modalidades se muestran en la Tabla 1 a continuación. Los ácidos nucleicos adicionales útiles en la producción de las vías de betacaroteno/astaxantina se describen con más detalle en la Sección 5.6 a continuación.
Tabla 1: Lista de ácidos nucleicos y enzimas codificadas adecuadas para las reacciones enzimáticas que se muestran en las Figuras 2 y 3A
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Como se describió anteriormente, la producción de carotenoides en microorganismos modificados genéticamente se informó anteriormente. Por ejemplo, la astaxantina se ha producido mediante ingeniería genética de la levadura oleaginosa, Yarrowia lipolytica (documento US 7,851,199). Las modalidades de la presente invención difieren de estos estudios previos en que, en las presentes modalidades, una célula hospedera (por ejemplo, célula de levadura) puede coproducir dos isoprenoides diferentes (que son sustancialmente diferentes en peso molecular) durante un solo ciclo de fermentación después de la inoculación o en dos ciclos de fermentación después de la inoculación. Por ejemplo, los dos productos, farneseno y un carotenoide o mezcla de carotenoides (por ejemplo, como se define en el documento US 7,851,199) tales como astaxantina, pueden coproducirse simultáneamente (modalidad 1 de la Figura 4), o pueden producirse secuencialmente (ejemplo 2 de la Figura 4), se produce farneseno durante el primer período de tiempo, seguido de la separación de las células hospederas y producción del carotenoide manipulado por ingeniería genética durante un segundo período de incubación de las células hospederas. La coproducción por fermentación se describió previamente para 1,4-butanodiol y gamma-butirolactona (documento US 9,222,113), y también la coproducción de un terpeno y varios productos nombrados (documento US 2015/0211024), pero no hay ejemplos conocidos de la coproducción de isoprenoides, tal como sesquiterpenos y carotenoides.
5.3. Células Hospederas
En la presente descripción se describen células hospederas capaces de coproducir dos o más isoprenoides. Por ejemplo, la célula hospedera se modifica genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una primera vía biosintética para producir un primer isoprenoide y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una segunda vía biosintética para producir un segundo isoprenoide, que tiene un peso molecular diferente del primer isoprenoide. Por ejemplo, la célula hospedera se modifica genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una tercera vía biosintética para producir un tercer isoprenoide. Por ejemplo, la célula hospedera se modifica genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una cuarta vía biosintética para producir un cuarto isoprenoide. Por ejemplo, la célula hospedera se modifica de manera similar para producir un quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno o décimo isoprenoide, o más.
Por ejemplo, el primer isoprenoide no es un compuesto endógeno producido por una célula hospedera parental que no está modificada genéticamente. Por ejemplo, el segundo isoprenoide no es un compuesto endógeno producido por una célula hospedera parental que no está modificada genéticamente. Por ejemplo, cuando la célula hospedera se modifica de manera similar para producir un tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno o décimo isoprenoide, o más, estos isoprenoides adicionales no son producidos endógenamente por la célula hospedera original.
Por ejemplo, la célula hospedera no se modifica genéticamente para producir un compuesto objetivo a recuperar que no sea un compuesto derivado de IPP. En estos ejemplos, la célula hospedera se modifica para producir solo los compuestos isoprenoides objetivo. Estos son los compuestos que se pretende que se recuperen o se recuperen de un cultivo de la célula hospedera. Las células hospederas no se modifican para producir otros compuestos para la recuperación.
Por ejemplo, el primer isoprenoide es un isoprenoide C5, C10, C15 o C20, y el segundo isoprenoide es de C30, C35, C40 o un isoprenoide de mayor contenido de carbono. Por ejemplo, el primer isoprenoide es un isoprenoide C15 y el segundo isoprenoide es un isoprenoide C40. Por ejemplo, el primer isoprenoide es un sesquiterpeno y el segundo isoprenoide es un tetraterpeno. El primer isoprenoide es el farneseno y el segundo isoprenoide es un carotenoide. En determinadas modalidades, el primer isoprenoide es p-farneseno y el segundo carotenoide es un carotenoide C40. En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es un carotenoide o una mezcla de carotenoides. En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es astaxantina, xantofila o cetocarotenoide. En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, betacaroteno, licopeno, luteína o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, cualquier combinación del primer isoprenoide y el segundo isoprenoide, o cualquier isoprenoide adicional descrito en la presente descripción, puede seleccionarse para la producción como compuestos objetivo a partir de una célula hospedera modificada genéticamente.
Sin pretender estar ligado a ninguna teoría de funcionamiento particular, durante el curso de la coproducción de isoprenoides, se descubrió que la coproducción de uno o más segundos isoprenoides (por ejemplo, carotenoides) con un primer isoprenoide (por ejemplo, farneseno) puede reducir el rendimiento de biomasa (por ejemplo, la densidad celular) y la primera cantidad de producción de isoprenoides, en comparación con una célula hospedera parental modificada genéticamente para producir solo el primer isoprenoide. Estos resultados se observaron con células hospederas que están modificadas genéticamente para proporcionar un flujo de carbono relativamente alto hacia la producción de carotenoides. Sin desear estar ligado a una teoría, se cree que una producción relativamente alta de carotenoides o intermediarios de carotenoides (por ejemplo, GGPP) puede ser tóxica para las células hospederas o puede ralentizar el crecimiento celular. Los presentes inventores descubrieron además que el impacto negativo de la coproducción de carotenoide con un primer isoprenoide como compuestos objetivo en la acumulación de biomasa, puede superarse ajustando el flujo de carbono hacia la producción de carotenoides en relación con el flujo de carbono hacia la producción del primer isoprenoide.
Por tanto, en la presente descripción se describen células hospederas que se modifican genéticamente de manera que la coproducción de un segundo isoprenoide no afecte sustancialmente la producción de un primer isoprenoide o el rendimiento de biomasa durante la coproducción. En estas modalidades, una célula hospedera se puede modificar genéticamente en primer lugar mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo que codifica una terpeno sintasa para producir un primer isoprenoide en una cantidad objetivo deseada. Después de generar una célula hospedera parental capaz de producir el primer isoprenoide en una cantidad objetivo, la célula hospedera parental puede modificarse genéticamente mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo que codifica una terpeno sintasa para producir un segundo isoprenoide a un nivel que no afecte sustancialmente la producción de la primera producción de isoprenoides o el rendimiento de biomasa durante la coproducción. Como se describe en la sección de Ejemplos, cuando el flujo de carbono hacia la producción del segundo isoprenoide (es decir, uno o más carotenoides) se reduce en comparación con el flujo de carbono hacia el primer isoprenoide (es decir, un sesquiterpeno), la coproducción del segundo isoprenoide no afecta sustancialmente a la primera cantidad de producción de isoprenoides ni al rendimiento de biomasa. En algunas modalidades, la relación relativa de los dos isoprenoides se puede ajustar entre aproximadamente 0,001 % y aproximadamente 2 % en peso.
Por tanto, en determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir un segundo isoprenoide y un primer isoprenoide en una relación de entre aproximadamente 0,001 % y aproximadamente 2 % en peso. En determinadas modalidades, el método para la coproducción de isoprenoides comprende producir un segundo isoprenoide y un primer isoprenoide en una relación de entre aproximadamente 0,001 % y aproximadamente 1 % en peso. En determinadas modalidades, el método para la coproducción de isoprenoides comprende producir un segundo isoprenoide y un primer isoprenoide en una relación de entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 1 % en peso. En modalidades particulares, la relación se basa en el % en peso. En modalidades particulares, la relación se basa en la masa de los compuestos por volumen de medio. En modalidades particulares, la relación se basa en la masa de los compuestos por masa del peso seco celular.
En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 2,5 g/L a aproximadamente 200 g/L. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 4000 mg/L. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 30 g/L a aproximadamente 170 g/L, aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 160 g/L, o cualquier número entre estos intervalos. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 3000 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 2000 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 1000 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 800 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 500 mg/L, aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 400 mg/L, aproximadamente 1 mg/L hasta aproximadamente 300 mg/L, o cualquier número entre estos intervalos. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 2,5 g/L a aproximadamente 200 g/L y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg/L hasta aproximadamente 4000 mg/L. En determinadas modalidades, la célula hospedera está modificada genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 2,5 g/L a aproximadamente 200 g/L y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg/L hasta aproximadamente 500 mg/L. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g/L a aproximadamente 120 g/L. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 1250 mg/L. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g/L a aproximadamente 120 g/L y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 20 mg/L hasta aproximadamente 1250 mg/L. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 75 mg/L. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g/L a aproximadamente 120 g/L y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 75 mg/L. En determinadas modalidades, las células hospederas se modifican genéticamente de manera que son capaces de coproducir cualquier combinación de cantidades del primer isoprenoide y el segundo isoprenoide descritos en la presente descripción.
En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g a 5 kg por kg de masa seca celular. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 g por kg de masa seca celular. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g a 5 kg por kg de masa seca celular y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 g por kg de masa seca celular. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g a 5 kg por kg de masa seca celular y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 40 g por kg de masa seca celular. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g a 5 kg por kg de masa seca celular y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente de 30 g por kg de masa seca celular. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g a 5 kg por kg de masa seca celular y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente de 20 g por kg de masa seca celular. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 100 g a 5 kg por kg de masa seca celular y el segundo isoprenoide en una cantidad de aproximadamente 3 g por kg de masa seca celular. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera que es capaz de coproducir el primer isoprenoide y el segundo isoprenoide en cualquier combinación de intervalos descritos en la presente descripción.
El primer isoprenoide es un isoprenoide C15. En determinadas modalidades, el primer isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en farneseno, famesol, difosfato de farnesilo, nerolidol, bisaboleno, bisabolol, capsidiol y pachulol. En modalidades particulares, el primer isoprenoide es farneseno.
El primer isoprenoide es un sesquiterpeno y el segundo isoprenoide es uno o más carotenoides. En determinadas modalidades, el primer isoprenoide es un sesquiterpeno y el segundo isoprenoide es uno o más carotenoides C40. En determinadas modalidades, el primer isoprenoide es un sesquiterpeno y el segundo isoprenoide es uno o más de astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, betacaroteno, licopeno y luteína. En determinadas modalidades, el primer isoprenoide es farneseno y el segundo isoprenoide es uno o más de astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, betacaroteno, licopeno y luteína. En determinadas modalidades, la proporción del segundo isoprenoide en relación con el primer isoprenoide se basa en el peso de un único carotenoide. En determinadas modalidades, la proporción del segundo isoprenoide en relación con el primer isoprenoide se basa en el peso de la combinación de carotenoides producida por la célula hospedera. En estas modalidades, la relación en peso del primer isoprenoide y el segundo isoprenoide se mide con base en el peso seco celular a partir del cual se producen el primer isoprenoide y el segundo isoprenoide.
En determinadas modalidades, el primer isoprenoide se libera predominantemente de la célula hospedera al medio de cultivo. En modalidades particulares, el primer isoprenoide es de un tamaño o composición que permite su liberación de la célula. Esto puede predecirse de antemano o determinarse de manera empírica. En modalidades particulares, cuando las células hospederas se separan del medio de cultivo, al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % del primer isoprenoide se encuentra en el medio de cultivo.
En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide se asocia predominantemente con la célula hospedera. En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide se retiene predominantemente dentro de la célula hospedera. En modalidades particulares, el segundo isoprenoide es de un tamaño o composición que reduce o evita su liberación de la célula. Esto puede predecirse de antemano o determinarse de manera empírica. En modalidades particulares, cuando las células hospederas se separan del medio de cultivo, al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % del segundo isoprenoide se encuentra con la masa celular.
En determinadas modalidades, la célula hospedera es capaz de producir el primer isoprenoide durante la coproducción con el segundo isoprenoide en una cantidad de al menos aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la cantidad del primer isoprenoide producido por una célula parental que modificada genéticamente para producir el primer isoprenoide pero no el segundo isoprenoide.
En determinadas modalidades, una densidad celular (o rendimiento de biomasa) de la célula hospedera durante la coproducción del primer isoprenoide y el segundo isoprenoide es al menos aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 98 % o 99 % de una densidad celular de una célula parental modificada genéticamente para producir el primer isoprenoide pero no el segundo isoprenoide.
En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente para producir dos isoprenoides como compuestos objetivo y no se modifica genéticamente para producir un compuesto objetivo que no se deriva de IPP. En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente para producir un sesquiterpeno y uno o más carotenoides C40, y no se modifica genéticamente para producir otra molécula objetivo que no se deriva de IPP. Por ejemplo, la célula hospedera se modifica genéticamente para producir un isoprenoide C10, C15 o C20 como primer isoprenoide y uno o más carotenoides C40 como segundo isoprenoide, y no se modifica genéticamente para producir otra molécula objetivo que no se deriva de IPP. La modificación genética de una molécula objetivo distinta de los isoprenoides derivados de IPP puede desviar el flujo de carbono lejos del IPP y, por lo tanto, reducir el flujo de carbono hacia la producción de isoprenoides como compuestos objetivo.
En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera adicional para comprender: (a) un ácido nucleico heterólogo que codifica una primera poliprenil sintasa y un ácido nucleico heterólogo que codifica una primera terpeno sintasa para la producción del primer isoprenoide; y (b) un ácido nucleico que codifica una segunda poliprenil sintasa y un ácido nucleico heterólogo que codifica una segunda terpeno sintasa para la producción del segundo isoprenoide.
En determinadas modalidades, la célula hospedera se modifica genéticamente de manera adicional para comprender: (a) un ácido nucleico heterólogo que codifica una FPP sintasa y una sesquiterpeno sintasa para producir un sesquiterpeno como primer isoprenoide; y (b) un ácido nucleico heterólogo que codifica una GGPP sintasa y una carotenoide sintasa para producir un carotenoide.
En determinadas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente se modifica genéticamente para sobreexpresar una o más enzimas de la vía del mevalonato. En determinadas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente se modifica genéticamente para sobreexpresar todas las enzimas de la vía del mevalonato.
En determinadas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica una poliprenil sintasa para producir un poliprenil difosfato. En determinadas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica una FPP sintasa. En determinadas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica una GGPP sintasa. En determinadas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica una FPP sintasa y comprende un ácido nucleico endógeno que codifica una GGPP sintasa pero no comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una GGPP sintasa.
Cualquier combinación de ácidos nucleicos heterólogos descritos en la presente descripción puede introducirse en la célula hospedera en dependencia de qué carotenoide se desea para la coproducción con un primer isoprenoide. En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es licopeno y la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa.
En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es p-caroteno y la célula hospedera comprende: (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa o (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que tiene actividades de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa; y un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa.
En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es cantaxantina y la célula hospedera comprende (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa o (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que tiene actividades de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa; un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa; y un ácido nucleico heterólogo que codifica una p-caroteno cetolasa.
En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es zeaxantina y la célula hospedera comprende: (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa o (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que tiene actividades de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa; un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa; y un ácido nucleico heterólogo que codifica la p-caroteno hidroxilasa.
En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es astaxantina y la célula hospedera comprende: (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa o (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que tiene actividades de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa; un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa; (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una p-caroteno cetolasa; y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una p-caroteno hidroxilasa o (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una citocromo p450 hidroxilasa y cetolasa capaz de convertir p-caroteno en equinenona y p-criptoxantina y posteriormente en astaxantina; y (iv) un ácido nucleico heterólogo que codifica una citocromo p450 reductasa que interactúa con la citocromo p450 hidroxilasa y cetolasa. En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide es luteína y la célula hospedera comprende: un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa; un ácido nucleico heterólogo que codifica una 5-caroteno pciclasa; un ácido nucleico heterólogo que codifica la hidroxilasa de anillo p; y un ácido nucleico heterólogo que codifica una caroteno £-monooxigenasa.
5.4. Cepas de Células
Las células hospederas pueden ser cualquier célula que los expertos consideren útil. Las células hospederas útiles en las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción incluyen arqueas, procariotas o eucariotas.
Los hospederos procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de una variedad de bacterias grampositivas, gramnegativas o gramvariables. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, células que pertenecen a los géneros: Agrobacterium, Alicydobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillium, Lactohlocillium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus y Zymomonas. Los ejemplos de cepas procariotas incluyen, pero no se limitan a: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactium, Pvalonasseudonas, Pudomonasseudonas, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei y Staphylococcus aureus. En una modalidad particular, la célula hospedera es una célula de Escherichia coli.
Los huéspedes arqueas adecuados incluyen, pero no se limitan a, células que pertenecen a los géneros: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobacterium, Pyrococcus, Sulfolobus y Thermoplasma. Los ejemplos de cepas de archae incluyen, pero no se limitan a: Archaeoglobus fulgidus, Halobacterium sp., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abysrumnix y Aeroespacio.
Los huéspedes eucariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, células de hongos, células de algas, células de insectos y células de plantas. En algunas modalidades, las levaduras útiles en los presentes métodos incluyen levaduras depositadas en bancos de microorganismos (por ejemplo, IFO, ATCC, etc.) y pertenecen a los géneros Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma., Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, Candida, Citeromyces, Clavispora, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomycopsella, Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium, Haeaaaaa, Fellomynsen, Fellrobasidium, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leucosporidium, Lipomyces. Lodderomyces, Malassezia, Metschnikowia, Mrakia, Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogataea, Oosporidium, Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Esquicaromiasis, Esquicaromiasis, Saccharomyces. Sporidiobolus, Sporobolomyces, Sporopachydermia, Stephanoascus, Sterigmatomyces, Sterigmatosporidium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torulaspora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Waltomyces, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis, y Zygozyma, entre otros.
En algunas modalidades, la célula hospedera es Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis (anteriormente llamada Saccharomyces lactis), Kluveromyces marxianus, Arxula adeninivorans o Hansenula polymorpha (ahora conocida como Pichusta polymorpha). En algunas modalidades, la célula hospedera es una cepa del género Candida, tal como Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis o Candida utilis.
En una modalidad particular, la célula hospedera es Saccharomyces cerevisiae. En algunas modalidades, el hospedero es una cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada del grupo que consiste en levadura del pan, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR -1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1, CEN.PK, CEN.PK2 y AL-1. En algunas modalidades, la célula hospedera es una cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada del grupo que consiste en PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1 y SA-1. En una modalidad particular, la cepa de Saccharomyces cerevisiae es PE-2. En otra modalidad particular, la cepa de Saccharomyces cerevisiae es CAT-1. En otra modalidad particular, la cepa de Saccharomyces cerevisiae es bG-1.
En algunas modalidades, la célula hospedera es un microbio que es adecuado para la fermentación industrial. En modalidades particulares, el microbio se condiciona para subsistir bajo alta concentración de solvente, alta temperatura, uso de sustrato ampliado, limitación de nutrientes, estrés osmótico debido al azúcar y sales, acidez, contaminación por sulfitos y bacterias, o sus combinaciones, que son condiciones de estrés reconocidas para el entorno de fermentación industrial.
5.5. Vía del Mevalonato
En algunas modalidades, la célula proporcionada en la presente descripción comprende una o más enzimas de la vía del mevalonato (MEV). En algunas modalidades, una o más enzimas de la vía del MEV comprenden una enzima que condensa acetil-CoA con malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA. En algunas modalidades, una o más enzimas de la vía del MEV comprenden una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA. En algunas modalidades, una o más enzimas de la vía del MEV comprenden una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA. En algunas modalidades, una o más enzimas de la vía del MEV comprenden una enzima que convierte HMG-CoA en mevalonato. En algunas modalidades, una o más enzimas de la vía del MEV comprenden una enzima que fosforila el mevalonato para obtener mevalonato 5-fosfato. En algunas modalidades, una o más enzimas de la vía del MEV comprenden una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato. En algunas modalidades, una o más enzimas de la vía del MEV comprenden una enzima que convierte 5-pirofosfato de mevalonato en pirofosfato de isopentenilo.
En algunas modalidades, la una o más enzimas de la vía del MEV se seleccionan del grupo que consiste en acetil-CoA tiolasa, acetoacetil-CoA sintetasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y mevalonato pirofosfato descarboxilasa. En algunas modalidades, con respecto a la enzima de la vía del MEV capaz de catalizar la formación de acetoacetil-CoA, la célula hospedera modificada genéticamente comprende una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, por ejemplo, acetil-CoA tiolasa; o una enzima que condensa acetil-CoA con malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA, por ejemplo, acetoacetil-CoA sintasa. En algunas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente comprende tanto una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, por ejemplo, acetil-CoA tiolasa; y una enzima que condensa acetil-CoA con malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA, por ejemplo, acetoacetil-CoA sintasa.
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende más de una enzima de la vía del MEV. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende dos enzimas de la vía del MEV. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una enzima que puede convertir HMG-CoA en mevalonato y una enzima que puede convertir mevalonato en mevalonato 5-fosfato. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende tres enzimas de la vía del MEV. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende cuatro enzimas de la vía del MEV. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende cinco enzimas de la vía del MEV. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende seis enzimas de la vía del MEV. En algunas modalidades, la célula hospedante tiene siete enzimas de la vía del MEV. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende todas las enzimas de la vía del MEV.
En algunas modalidades, la célula comprende además una enzima que puede convertir pirofosfato de isopentenilo (IPP) en pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP). En algunas modalidades, la célula comprende además una enzima que puede condensar moléculas de IPP y/o DMAPP para formar un compuesto de poliprenilo. En algunas modalidades, la célula comprende además una enzima que puede modificar IPP o un poliprenilo para formar un compuesto isoprenoide.
5.5.1. Conversión de Acetil-CoA en Acetoacetil-CoA
En algunas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente comprende una enzima que puede condensar dos moléculas de acetil-coenzima A para formar acetoacetil-CoA, por ejemplo, una acetil-CoA tiolasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican dicha enzima incluyen, pero no se limitan a: (NC_000913 REGIÓN: 2324131.2325315; Escherichia colí), (D49362; Paracoccus denitrificans) y (L20428; Saccharomyces cerevisiae). La tiolasa de acetil-CoA cataliza la condensación reversible de dos moléculas de acetil-CoA para producir acetoacetil-CoA, pero esta reacción es desfavorable termodinámicamente; la tiolisis de acetoacetil-CoA se favorece sobre la síntesis de acetoacetil-CoA. La acetoacetil-CoA sintasa (AACS) (también denominada acetil-CoA:malonil-CoA aciltransferasa; EC 2.3.1.194) condensa acetil-CoA con malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA. A diferencia de la acetil-CoA tiolasa, la síntesis de acetoacetil-CoA catalizada por AACS es una reacción esencialmente favorecida a nivel energético, debido a la descarboxilación de malonil-CoA asociada. Además, AACS no presenta actividad de tiolisis para el acetoacetil-CoA y, por tanto, la reacción es irreversible. Por tanto, en otras modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente proporcionada en la presente descripción usa una acetoacetil-CoA sintasa para formar acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA y malonil-CoA. En algunas modalidades, el AACS es de Streptomyces sp. cepa CL190 (Okamura y otros, Proc Natl Acad Sci USA 107 (25):11265-70 (2010). Las secuencias de nucleótidos AACS representativas de Streptomyces sp. cepa CL190, incluyen el número de acceso AB540131.1 y la SEQ ID NO: 19 de la publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2014/0273144. Las secuencias de proteína AACS representativas de Streptomyces sp. cepa CL190 incluyen los números de acceso D7URV0, BAJ10048 y SEQ ID NO: 20 de publicación de Patente de Estados Unidos Núm.
2014/0273144. Otras acetoacetil-CoA sintasas útiles para las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, Streptomyces sp. (AB183750; KO-3988 BAD86806); Cepa de S. anulatus 9663 (FN178498; CAX48662); Streptomyces sp. KO-3988 (AB212624; BAE78983); Actinoplanes sp. A40644 (AB113568; BAD07381); Streptomyces sp. C (NZ_ACEW010000640; ZP_05511702); Nocardiopsis dassonvillei DSM 43111 (NZ_ABUI01000023; ZP_04335288); Mycobacterium ulcerans Agy99 (NC_008611; YP_907152); Mycobacterium marinum M (NC _010612; YP_001851502); Streptomyces sp. Mg1 (NZ_DS570501; ZP_05002626); Streptomyces sp. AA4 (NZ_ACEV01000037; ZP_05478992); S. roseosporus NRRL 15998 (NZ_ABYB01000295; ZP_04696763); Streptomyces sp. ACTE (NZ_ADFD01000030; ZP_06275834); S. viridochromogenes DSM 40736 (NZ_ACEZ01000031; ZP_05529691); Frankia sp. CcI3 (NC_007777; YP _480101); Nocardia brasiliensis (NC_018681; YP_006812440.1); y Austwickia chelonae (NZ_BAGZ01000005; ZP_10950493.1). Las acetoacetil-CoA sintasas adicionales adecuadas incluyen las que se describen en Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2010/0285549 y 2011/0281315.
Las acetoacetil-CoA sintasas también útiles en las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción incluyen aquellas moléculas que se dice que son "derivados" de cualquiera de las acetoacetil-CoA sintasas que se describen en la presente descripción. Dicho "derivado" tiene las siguientes características: (1) comparte una homología sustancial con cualquiera de las acetoacetil-CoA sintasas descritas en la presente descripción; y (2) es capaz de catalizar la condensación irreversible de acetil-CoA con malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA. Se dice que un derivado de una acetoacetil-CoA sintasa comparte una "homología sustancial" con la acetoacetil-CoA sintasa si las secuencias de aminoácidos del derivado son al menos 80 %, y con mayor preferencia al menos 90 %, y con la máxima preferencia al menos 95 %, el mismo que el de la acetoacetil-CoA sintasa.
5.5.2. Conversión de Acetoacetil-CoA en HMG-CoA
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una enzima que puede condensar acetoacetil-CoA con otra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA), por ejemplo, una HMG-CoA sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican dicha enzima incluyen, pero no se limitan a: (NC_001145. Complemento 19061.20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302); Homo sapiens) y (NC _002758, etiqueta de locus sAv 2546, ID del gen 1122571; Staphylococcus aureus).
5.5.3. Conversión de HMG-CoA en Mevalonato
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una enzima que puede convertir HMG-CoA en mevalonato, por ejemplo, una HMG-CoA reductasa. En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa es una hidroximetilglutaril-CoA reductasa-CoA reductasa que usa NADPH. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican una HMG-CoA reductasa que usa NADPH incluyen, pero no se limitan a: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, etiqueta del Locus SAV2545, ID del gen 1122570; Staphylococcus aureus), (AB015627; Streptomyces sp. 3988), (AX128213, que proporciona la secuencia que codifica una HMG-CoA reductasa truncada; Saccharomyces cerevisiae) y (Nc_001145: complemento (115734.118898; Saccharomyces cerevisiae).
En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa es una hidroximetilglutaril-CoA reductasa-CoA reductasa que usa NADH. Las reductasas de HMG-CoA (EC 1.1.1.34; EC 1.1.1.88) catalizan la desacilación reductora de (S)-HMG-CoA a (R)-mevalonato, y se pueden clasificar en dos clases, HMG de clase I y clase II. La clase I incluye las enzimas de eucariotas y la mayoría de las arqueas, y la clase II incluye las reductasas de HMG-CoA determinados procariotas y arqueas. Además de la divergencia en las secuencias, las enzimas de las dos clases también difieren con respecto a su especificidad por el cofactor. A diferencia de las enzimas de clase I, que usan exclusivamente NADPH, las reductasas de HMG-CoA de clase II varían en la capacidad de discriminar entre NADPH y NADH. Ver, por ejemplo, Hedl y otros, Revista de Bacteriología 186 (7):1927-1932 (2004). A continuación, se proporcionan las especificidades para el cofactor de las reductasas de HMG-CoA de clase II seleccionadas.
Tabla 2. Especificidades para el cofactor de reductasas de HMG-CoA de clase II seleccionadas
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Las HMG-CoA reductasas útiles para las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción incluyen HMG-CoA reductasas que son capaces de usar NADH como cofactor, por ejemplo, HMG-CoA reductasa de P. mevalonii, A. fulgidus o S. aureus. En modalidades particulares, la HMG-CoA reductasa es capaz de usar como cofactor solo NADH, por ejemplo, HMG-CoA reductasa de P. mevalonii, S. pomeroyi o D. acidovorans.
En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa que usa NADH es de Pseudomonas mevalonii. La secuencia del gen mvaA de tipo silvestre de Pseudomonas mevalonii, que codifica la HMG-CoA reductasa (EC 1.1.1.88), se describió previamente. Ver Beach y Rodwell, J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989)). Las secuencias de nucleótidos de mvaA representativas de Pseudomonas mevalonii incluyen el número de acceso M24015 y la SEQ ID NO: 21 de la publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2014/0273144. Las secuencias representativas de la proteína HMG-CoA reductasa de Pseudomonas mevalonii incluyen los números de acceso AAA25837, P13702, MVAA_PSEMV y SEQ ID NO: 22 de la publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2014/0273144.
En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa que usa NADH es de Silicibacter pomeroyi. Las secuencias de nucleótidos representativas de HMG-CoA reductasa de Silicibacter pomeroyi incluyen el número de acceso NC_006569.1 y la SEC ID NO: 23 de la publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2014/0273144. Las secuencias representativas de la proteína HMG-CoA reductasa de Silicibacter pomeroyi incluyen el número de acceso YP_164994 y la SEC ID NO: 24 de la publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2014/0273144.
En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa que usa NADH es Delftia acidovorans. Una secuencia de nucleótidos representativa de la HMG-CoA reductasa Delftia acidovorans incluye NC_010002 REGIÓN: complemento (319980.321269) y SEQ ID NO: 25 de la publicación de Patente de Estados Unidos Núm.
2014/0273144. Las secuencias representativas de la proteína HMG-CoA reductasa Delftia acidovorans incluyen el número de acceso YP_001561318 y la SEQ ID NO: 26 de la publicación de Patente de Estados Unidos Núm.
2014/0273144.
En algunas modalidades, las reductasas de HMG-CoA que usan NADH son de Solanum tuberosum (Crane y otros, J. Plant Physiol. 159: 1301-1307 (2002)).
Las reductasas de HMG-CoA que usan NADH también son útiles en las composiciones y métodos que se proporcionan en la presente descripción incluyen aquellas moléculas que se dice que son "derivados" de cualquiera de las reductasas de HMG-CoA que usan NADH que se describen en la presente descripción, por ejemplo, de P. mevalonii, S. pomeroyi y D. acidovorans. Dicho "derivado" tiene las siguientes características: (1) comparte una homología sustancial con cualquiera de las reductasas de HMG-CoA que usan NADH que se describen en la presente descripción; y (2) es capaz de catalizar la desacilación reductora de (S)-HMG-CoA a (R)-mevalonato utilizando como cofactor preferentemente NADH. Se dice que un derivado de una HMG-CoA reductasa que usa NADH comparte una "homología sustancial" con la HMG-CoA reductasa que usa NADH si la secuencia de aminoácidos del derivado es al menos 80 %, y con mayor preferencia al menos 90 %, y con la máxima preferencia al menos el 95 %, igual a las de la HMG-CoA reductasa que usa NADH.
Como se usa en la presente descripción, la frase "que usa NADH" significa que la HMG-CoA reductasa que usa NADH es selectiva para NADH como cofactor sobre NADPH, por ejemplo, al demostrar una actividad específica más alta para NADH que para NADPH. En algunas modalidades, la selectividad por NADH como cofactor se expresa como una relación feat(NADH)/feat(NADPH). En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa que usa NADH tiene una relación kcat(NADH)/kcat(NADPH) de al menos 5, 10, 15, 20, 25 o superior a 25. En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa que usa NADH usa exclusivamente NADH. Por ejemplo, una HMG-CoA reductasa que usa NADH que usa exclusivamente NADH muestra alguna actividad con NADh que se suministra como único cofactor in vitro, y no muestra actividad detectable cuando se suministra NADPH como único cofactor. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para determinar la especificidad de cofactor, para identificar reductasas de HMG-CoA que tengan preferencia por NADH como cofactor, incluidas las que se describen por Kim y otros, Protein Science 9:1226-1234 (2000); y Wilding y otros, J. Bacteriol. 182(18):5147-52 (2000),
En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa que usa NADH se manipula genéticamente para que sea selectiva para NADH sobre NAPDH, por ejemplo, mediante mutagénesis sitio dirigida del bolsillo de unión al cofactor. Los métodos para manipular por ingeniería genética la selectividad hacia NADH se describen en Watanabe y otros, Microbiology 153:3044-3054 (2007), y los métodos para determinar la especificidad del cofactor de las reductasas de HMG-CoA se describen en Kim y otros, Protein Sci. 9:1226-1234 (2000).
En algunas modalidades, la HMG-CoA reductasa que usa NADH se deriva de una especie hospedera que comprende forma nativa una vía degradativa del mevalonato, por ejemplo, una especie hospedera que cataboliza el mevalonato como su única fuente de carbono. Dentro de estas modalidades, la HMG-CoA reductasa que usa NADH, que normalmente cataliza la acilación oxidativa de (R)-mevalonato internalizado a (S)-HMG-CoA dentro de su célula hospedera nativa, se usa para catalizar la reacción inversa, es decir, la desacilación reductora de (S)-HMG-CoA a (R)-mevalonato, en una célula hospedera modificada genéticamente que comprende una vía biosintética del mevalonato. Los procariotas capaces de crecer en mevalonato como su única fuente de carbono se han descrito por: Anderson y otros, J. Bacteriol, 171(12):6468-6472 (1989); Beach y otros, J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989)); Bensch y otros, J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari y otros, Biochemistry 4:2086-2090 (1965); Siddiqi y otros, Biochem. Biophys. Res. Comun. 8:110-113 (1962)); Siddiqi y otros, J. Bacteriol. 93:207-214 (1967); y Takatsuji y otros, Biochem. Biophys. Res. Comun. 110:187-193 (1983)).
En algunas modalidades de las composiciones y métodos que se proporcionan en la presente descripción, la célula hospedera comprende tanto una HMGr que usa NADH como una Hm G-CoA reductasa que usa NADPH.
5.5.4. Conversión de Mevalonato en Mevalonato-5-fosfato
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una enzima que puede convertir mevalonato en mevalonato 5-fosfato, por ejemplo, una mevalonato quinasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos que codifican una enzima tal incluyen, pero no se limitan a: (L77688; Arabidopsis thaliana), y (X55875; Saccharomyces cerevisiae).
5.5.5. Conversión de Mevalonato-5-fosfato en Mevalonato-5-Pirofosfato
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una enzima que puede convertir mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato, por ejemplo, una fosfomevalonato quinasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos que codifican una enzima tal incluyen, pero no se limitan a: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), y (NC_001145. complementan 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae.).
5.5.6. Conversión de Mevalonato-5-pirofosfato en IPP
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una enzima que puede convertir mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil difosfato (IPP), por ejemplo, una mevalonato pirofosfato descarboxilasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican dicha enzima incluyen, pero no se limitan a: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium) y (U49260; Homo sapiens).
5.5.7. Conversión de IPP a DMAPP
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una enzima que puede convertir IPP generado por la vía del MEV en pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP), por ejemplo, una IPP isomerasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican dicha enzima incluyen, pero no se limitan a: (NC_000913, 3031087.3031635; Escherichia coli) y (AF082326; Haematococcus pluvialis).
5.5.8. Poliprenil Sintasas
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una poliprenil sintasa que puede condensar moléculas de IPP y/o DMAPP para formar compuestos de poliprenilo que contienen más de cinco carbonos.
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una enzima que puede condensar una molécula de IPP con una molécula de DMAPP para formar una molécula de pirofosfato de geranilo ("GPP"), por ejemplo, una GPP sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican dicha enzima incluyen, pero no se limitan a: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AE016877, Locus AP11092; Bacillus cereus; At CC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ips pini), (DQ286930; Lycopersicon esculentum), (AF182828; Mentha x piperita), (AF182827; Mentha piperita x), (MPI249453; Mentha piperita x), (PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxanthinifaciens), (AY866498; Picrorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera), y (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una enzima que puede condensar dos moléculas de IPP con una molécula de DMAPP, o añadir una molécula de IPP a una molécula de GPP, para formar una molécula de pirofosfato de farnesilo ("FPP"), por ejemplo, una FPP sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican dicha enzima incluyen, pero no se limitan a: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Locus a Al95523; Fusobacterium nucleatum subsp ATCC nucleatum 25586), (GFFPPSGEN;. Gibberella fujikuroi), (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMfApS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPpSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes), (NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270), (NC_008023, Locus YP_600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS10750), (m Ze FPS; Zea mays), (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (Nm_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtilis), (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus), (NC_002940, Locus NP_873754; Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillus sakei subsp. Sakei 23K), (NC_)05823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130), (AB003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, Locus YP_208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; CP Saccharomyces cerevisae), (CP000031, Locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6) y (NC_004556, Locus NP 779706; Xylella fastidiosa Temeculal).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una enzima que puede combinar IPP y DMAPP o IPP y FPP para formar pirofosfato de geranilgeranilo ("GGPP"), también denominada GGPP sintasa (EC 2.5.1.29). Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican dicha enzima incluyen, pero no se limitan a: (AThGe RpYRS; Arabidopsis thaliana), (BT005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; Bacillus th ATCC 35646 sq1563), (CRGGPPS; Catharanthus roseus), (nZ_AABF02000074, Locus ZP_00144509; Fusobacterium nucleatum subsp vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321; Ginkgo biloba), (AB055496; Hevea brasiliensis), (AB017971; Homo sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloidesf lusitanicus), (AB016044; Mus musculus), (Aa Bx 01000298, Locus nCu0M27; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa), (NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae), (AB016095; Synechococcus se alarga), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acidocaldarius), (n C_007759, Locus YP_461832; Synt rophus aciditrophicus SB), (NC_006840, Locus YP_204095; Vibrio fischeri ES114), (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis), (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus), (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides), (NC_004350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159), (NP_015256; Saccharomyces cerevisiae); (AfC92798; Blakeslea trispora), (BAA14124; Pantoea ananatis), (AAM21639; Cistus creticus); (AAY33921; Xanthophyllomyces dendrorhous), (XP_019067954; Solanum lycopersicum).
5.5.9. Terpeno Sintasas
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una enzima que puede modificar un poliprenilo para formar un hemiterpeno, un monoterpeno, un sesquiterpeno, un diterpeno, un triterpeno, un tetraterpeno, un politerpeno, un compuesto esteroide, un carotenoide o un isoprenoide modificado. compuesto.
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una careno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (AF461460, REGIÓN 43.1926; Picea abies) y (AF527416, REGIÓN: 78.1871; Salvia stenophylla).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una geraniol sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (AJ457070; Cinnamomum tenuipilum), (AY362553; Ocimum basilicum), (DQ234300; Perilla frutescens cepa 1864), (DQ234299; Perilla citriodora cepa 1861), (DQ234298; Perilla citriodora cepa 4935) y (DQ088667; Perilla citriodora).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una linalol sintasa. Los ejemplos ilustrativos de una secuencia de nucleótidos adecuada incluyen, pero no se limitan a: (AF497485; Arabidopsis thaliana), (AC002294, Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana), (AY059757; Arabidopsis thaliana), (NM_104793; Arabidopsis thaliana), (AF154124; Artemisia annua), (AF067603; Clarkia breweri), (a F067602; Clarkia concinna), (AF067601; Clarkia breweri), (U58314; Clarkia breweri), (AY840091; Lycopersicon esculentum), (DQ263741; Lavandula angustifolia), (AY083653; Mentha citrate), (AY693647; Ocimum basilicum), (XM_463918; Oryza sativa), (AP004078, Locus BAD07605; Oryza sativa), (XM _463918, Locus XP_463918; Oryza sativa), (AY917193; Perilla citriodora), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473623; Picea abies), (DQ195274; Picea sitchensis) y (AF444798; Perilla frutescens var. crispa cultivar Núm. 79).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una limoneno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (+)-limoneno sintasas (AF514287, REGIÓN: 47.1867; Citrus limon) y (AY055214, REGIÓN: 48.1889; Agastache rugosa) y (-)-limoneno sintasas (DQ195275, REGIÓN: 1.1905; Picea sitchensis), (AF006193, REGIÓN: 73.1986; Abies grandis) y (MHC4SLSP, REGIÓN: 29.1828; Mentha spicata).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una mirceno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuados incluyen, pero no se limitan a: (U87908; Abies grandis), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10), (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS- CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana attps-CIN), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473626; Picea abies), (AF369919; Picea abies), y (AJ304839; Quercus ilex).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una ocimeno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (AY195607; Antirrhinum majus), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (AK221024; Arabidopsis thaliana), (NMT113485; Arabidopsis thaliana), (NM_113483; Arabidopsis thaliana attps-CIN), (NM_117775; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM_001036574; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10), (AB110642; Citrus unshiu CitMTSL4), y (AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una a-pineno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (+)a-pineno sintasa (AF543530, REGIÓN: 1.1887; Pinus taeda), (-)a-pineno sintasa (AF543527, REGIÓN: 32.1921; Pinus taeda), y (+)/(-)a-pineno sintasa (AGU87909, REGIÓN: 6111892; Abies grandis).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una p-pineno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (-) p-pineno sintasas (AF276072, REGIÓN: 1.1749; Artemisia annua) y (AF514288, REGIÓN: 26.1834; Citrus limon).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una sabineno sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada incluye, pero no se limita a AF051901, REGIÓN: 26.1798 de Salvia officinalis.
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una y-terpineno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen: (AF514286, REGIÓN: 30.1832 de Citrus limon) y (AB110640, REGIÓN 1.1803, de Citrus unshiu).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una terpinoleno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de una secuencia de nucleótidos adecuada incluyen, pero no se limitan a: (AY693650 de Oscimum basilicum) y (AY906866, REGION: 10.1887, de Pseudotsuga menziesii).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una amorfadieno sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada es la SEQ ID NO. 37 de la publicación de patente de Estados Unidos Núm. 2004/0005678.
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una a-farneseno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, DQ309034 de Pyrus communis cultivar dAnjou (pera; nombre del gen AFS1) y AY182241 de Malus domestica (manzana; gen AFS1). Pechouus y otros Planta 219(1):84-94 (2004).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una p-farneseno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, número de acceso AF024615 de Mentha x piperita (menta; gen Tspa11) y AY835398 de Artemisia annua. Picaud y otros, Phytochemistry 66(9):961-967 (2005). En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una farnesol sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, número de acceso AF529266 de Zea mays y YDR481C de Saccharomyces cerevisiae (gen Pho8). Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una nerolidol sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada incluye, pero no se limita a AF529266 de Zea mays (maíz; gen tps1).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una pachulol sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, AY508730 REGIÓN: 1.1659 de Pogostemon cablin.
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una nootkatona sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, AF441124 REGIÓN: 1.1647 de Citrus sinensis y AY917195 REGIÓN: 1.1653 de Perilla frutescens.
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una abietadieno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (U50768; Abies grandis) y (AY473621; Picea abies).
Por ejemplo, la célula hospedera produce un C5, C10, C15 o C20 como primer isoprenoide, y C30, C35, C40 o un isoprenoide carbono superior como segundo isoprenoide. En determinadas modalidades,
Por ejemplo, la célula hospedera produce un isoprenoide C5. Estos compuestos se derivan de una unidad de isopreno y también se denominan hemiterpenos. Un ejemplo ilustrativo de hemiterpeno es el isopreno. Por ejemplo, el isoprenoide es un isoprenoide C10. Estos compuestos se derivan de dos unidades de isopreno y también se denominan monoterpenos. Ejemplos ilustrativos de monoterpenos son limoneno, citranelol, geraniol, mentol, alcohol perilílico, linalol, tuyona y mirceno. El primer isoprenoide es un isoprenoide C15. Estos compuestos se derivan de tres unidades de isopreno y también se denominan sesquiterpenos. Ejemplos ilustrativos de sesquiterpenos son periplanona B, gingkólido B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenciano, nootkatona, epi-cedrol, epiaristolochene, farnesol, gosipol, sanonina, periplanona, forskolina y pachulol (que también se conoce como alcohol de pachulí). Por ejemplo, el isoprenoide es un isoprenoide C20. Estos compuestos se derivan de cuatro unidades de isopreno y también se denominan diterpenos. Ejemplos ilustrativos de diterpenos son casbeno, eleuterobina, paclitaxel, prostratina, pseudopterosina y taxadieno. En algunas modalidades, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-farneseno, p-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, isopreno, linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, pachulol, p-pineno, sabineno, Y-terpineno, terpinoleno y valenciano.
En otros ejemplos más, el isoprenoide es un isoprenoide C20+. Estos compuestos se derivan de más de cuatro unidades de isopreno e incluyen: triterpenos (compuestos isoprenoides C30 derivados de 6 unidades de isopreno) tales como arbrusideE, bruceantina, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina y escualeno; tetraterpenos (compuestos isoprenoides C40 derivados de 8 isoprenoides) tales como p-caroteno; y politerpenos (compuestos isoprenoides C40+ derivados de más de 8 unidades de isopreno) tales como poliisopreno. Los compuestos isoprenoides también incluyen, pero no se limitan a, carotenoides (como licopeno, a- y p-caroteno, a- y pcriptoxantina, bixina, zeaxantina, astaxantina y luteína), compuestos esteroides y compuestos de isoprenoides modificados por otros grupos químicos, como terpeno-alcaloides mixtos y coenzima Q-10.
5.6. Vía de los Carotenoides
Las vías biosintéticas de carotenoides ilustrativas se muestran en las Figuras 2, 3A y 3B. En determinadas modalidades, además de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican enzimas en una vía biosintética para producir un primer isoprenoide, la célula hospedera puede comprender además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas de la vía biosintética de carotenoides para coproducir uno o más carotenoides. En determinadas modalidades, la vía biosintética de carotenoides produce uno o más carotenoides C40.
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa que puede catalizar la conversión de pirofosfato de geranilgeranilo en fitoeno. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de polipéptidos o polinucleótidos adecuados que codifican una fitoeno sintasa incluyen, pero no se limitan a: CrtB (Lamprocystispurpurea; GenBank Protein Acc.: WP_020503292) (EC 2.5.1.99 o EC 2.5.1.32).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa que puede catalizar la conversión de licopeno en betacaroteno y/o la conversión de neurosporeno en 7,8-dihidro-betacaroteno. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de polipéptidos o polinucleótidos adecuados que codifican una licopeno ciclasa incluyen, pero no se limitan a: CrtY (Pantoea ananatis; GenBank Protein Acc.: BAA14126) (EC 5.5.1.19).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que puede catalizar la conversión de pirofosfato de geranilgeranilo en fitoeno (fitoeno sintasa) y la conversión de licopeno en p-caroteno (licopeno ciclasa) y/o la conversión de neurosporeno a 7,8-dihidro-betacaroteno. Ejemplos ilustrativos de secuencias de polipéptidos o polinucleótidos adecuados que codifican dicha enzima bifuncional incluyen: CrtY/B (Xanthophyllomyces dendrohous; Verwaal y otros App. Environ. 733(13):4342-50 (2007); CrtY/B (Phycomyces blakesleeanus; GenBank Protein Acc.: XP_018294563), CrtY/B (Neurospora crassa; GenBank Protein Acc.: XP_965725) y CrtY/B (Blakeslea trispora; GenBank Protein Acc.: AAO46893).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa que puede catalizar la conversión de fitoeno en neurosporeno y/o la conversión de neurosporeno en licopeno. Los ejemplos ilustrados de secuencias de polipéptidos o polinucleótidos adecuados que codifican una fitoeno desaturasa incluyen, pero no se limitan a: Crt I (Xanthophyllomyces dendrohous; Verwaal y otros App. Environ. Microbiol. 73(130:4342-50, 2007)) CrtI (Xanthophyllomyces dendrorhous; GenBank Protein Acc.: CAA75240), CrtI (Mycobacterium goodie; GenBank Protein Acc.: WP_049747535), CrtI (Neurospora crassa; GenBank Protein Acc.: XP_964713), CrtI (GenBank Protein sp.: Paenibacillus sp; WP_042140268) y CrtI (Bradyrhizobium_sp; GenBank Protein Acc.: WP_011924720) (eC 1.3.99.31 o EC 1.3.5.5 o EC 1.3.5.6 o EC 1.3.99.28 o EC 1.3.99.30).
En algunas modalidades, la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica la cetolasa de betacaroteno que puede catalizar la conversión de betacaroteno en equinenona, la conversión de equinenona en cantaxantina, la conversión de beta-criptoxantina en 3-hidroxiequinenona/3'-hidroxiequinenona, la conversión de 3-hidroxiequinenona/3'-hidroxiequinenona en fenicoxantina, la conversión de zeaxantina en adonixantina y/o la conversión de adonixantina en astaxantina. Los ejemplos ilustrados de secuencias de polipéptidos o polinucleótidos adecuados incluyen, pero no se limitan a: CrtW (Paracoccus_sp.; GenBank Protein Acc.: BAA09591), CrtW (Brevundimonas sp; GenBank Protein Acc.: BAD99406), CrtW (Haematococcus lacustris; GenBank Protein Acc.: ADN43075), CrtW (Chlamydomonas reinhardtii; XP_001698699), CrtW (Sphingomonas sp. 1PNM-20; GenBank Protein Acc.:WP_095996876); CrtW (Paracoccus sp. Cepa N81106 (Agrobacterium aurantiacum) GenBank ID: BAE47465.1; UniProt CRTW_PARSN; Ukibe y otros, Appl. Environ. Microbiol. 75(22):7205-7211 (2009)); HpBkt (Haematococcus pluvialis; GenBank ID D45881.1; BAA08300.1) (EC 1.14.11.B16 o EC 1.3.5.B4).
En determinadas modalidades, la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una betacaroteno hidroxilasa que puede catalizar la conversión de beta-caroteno en beta-criptoxantina, la conversión de beta-criptoxantina en zeaxantina, la conversión de equinenona en 3-hidroxiequinenona/3'-hidroxiequinenona, la conversión de 3-hidroxiequinenona/3'-hidroxiequinenona en adonixantina, la conversión de cantaxantina en fenicoxantina y/o la conversión de fenicoxantina en astaxantina. Los ejemplos ilustrados de secuencias de polipéptidos o polinucleótidos adecuados incluyen, pero no se limitan a: CrtZ (Escherichia vulneris; GenBank Protein Acc.: WP_042387980), CrtZ (Pantoea ananatis; GenBank Protein Acc.: WP_013027996), CrtZ (Paracoccus_sp. GenBank Protein Acc.: Q44262), CrtZ (Haematococcus lacustris; GenBank Protein Acc.: AKQ20654); CrtZ (Paracoccus sp. Cepa N81106 (Agrobacterium aurantiacum) GenBank ID BAE47466.1; CRTZ_PARSN); CrtZ (Pantoea ananatis; GenBank iD ADD79330.1; UnitPro D4GFL0_PANAM; Ukibe y otros (2009); HpCrtZ (Haematococcus pluvialis; GenBank KP866868.1; AKQ20654.1) (EC 1.14.13.129).
En determinadas modalidades, la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una hidroxilasa del citocromo p450 que puede catalizar la conversión de p-caroteno en equinenona, la conversión de equinenona en 3-hidroxiequineno/3'-hidroxiequinenona, la conversión de 3-hidroxiequinenona/3'-hidroxiequinenona en fenicoxantina y/o la conversión de fenicoxantina en astaxantina. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de polipéptidos o polinucleótidos adecuados incluyen, pero no se limitan a: CrtS (Xanthophyllomyces dendrorhous; AAY20974; UniProt Q3HR17_PHARH).
En determinadas modalidades, la célula hospedera comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una reductasa de citocromo p450 que puede interactuar con una hidroxilasa de citocromo p450 (CrtS) en células hospederas para catalizar la conversión de p-caroteno en astaxantina en la vía de la astaxantina como se muestra en la Figura 3A. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de polipéptidos o polinucleótidos adecuados incluyen, pero no se limitan a: CrtR (Xanthophyllomyces dendrorhous; ACI43097); y (Xanthophyllomyces dendrohous; Gen Bank ID AIP94032.1; UniProt A0A0C4MWF8_PHARH) (EC 1.6.2.4).
Una célula hospedera puede comprender uno cualquiera o una combinación de ácidos nucleicos heterólogos que codifican enzimas de la vía de los carotenoides descrita en la presente descripción para producir un compuesto carotenoide objetivo.
5.7. Modificaciones para Aumentar los Niveles de Acetil-CoA
En determinadas modalidades, cualquiera de las células anteriores que producen compuestos a partir de acetil-CoA, comprende modificaciones en sus vías de acetil-CoA de acuerdo con el documento US 2014/0273144 A1. En determinadas modalidades, las células comprenden una fosfocetolasa (PK; EC 4.1.2.9) y una alteración funcional de una enzima endógena que convierte el acetilfosfato en acetato. En determinadas modalidades, las células comprenden una fosfotransacetilasa (PTA; EC 2.3.1.8); y una alteración funcional de una enzima endógena que convierte el acetilfosfato en acetato. En algunas modalidades, la enzima que convierte el acetilfosfato en acetato es una glicerol-1-fosfatasa (EC 3.1.3.21). En algunas modalidades, la glicerol-1-fosfatasa se selecciona del grupo que consiste en GPP1/RHR2, GPP2HOR2 y sus homólogos y variantes. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una alteración funcional de GPP1/RHR2. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una alteración funcional de GPP2/HOR2. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende una alteración funcional tanto de GPP1/RHR2 como de GPP2/HOR2. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una acetaldehído deshidrogenasa acilante (ADA; EC 1.2.1.10). En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una alteración funcional de una o más enzimas de la vía alternativa de la piruvato deshidrogenasa (PDH) nativa. En algunas modalidades, la una o más enzimas de la vía alternativa de la PDH se seleccionan de acetil-CoA sintetasa 1 (ACS1), acetil-CoA sintetasa 2 (ACS2) y aldehído deshidrogenasa 6 (ALD6).
5.8. Métodos de Producción de Isoprenoides
En la presente descripción se proporciona un método para la producción de dos o más isoprenoides como compuestos objetivo. El método comprende: (a) cultivar, en un medio de cultivo con una fuente de carbono, una célula hospedera modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una primera vía biosintética para producir un primer isoprenoide y uno o más ácido nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una segunda vía biosintética para producir un segundo isoprenoide, que tiene un peso molecular que es diferente del primer isoprenoide; y (b) recuperar el primer isoprenoide y (c) recuperar el segundo isoprenoide. En determinadas modalidades, la célula hospedera no se modifica genéticamente para producir un compuesto objetivo que no se deriva de IPP. En determinadas modalidades, la fermentación se realiza cultivando las células hospederas modificadas genéticamente en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono en condiciones de cultivo adecuadas durante un período de tiempo suficiente para producir una biomasa deseada de células hospederas y/o una cantidad deseada de isoprenoides. En determinadas modalidades, el proceso de fermentación se realiza en dos etapas: una etapa de generación y una etapa de producción. La etapa de generación se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para producir una cantidad de biomasa celular que permita la producción de isoprenoides objetivo durante la etapa de producción. La etapa de generación se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para que la población presente en el momento de la inoculación experimente una pluralidad de duplicaciones hasta alcanzar la densidad celular deseada. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para que la población de células hospederas alcance una densidad celular (DO600) de entre 0,01 y 400 en el vaso o recipiente de fermentación en el que se realiza la etapa de generación. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo hasta que se alcanza una DO600 de al menos 0,01. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo hasta que se alcanza una DO600 de al menos 0,1. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo hasta que se alcanza una DO600 de al menos 1,0. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo hasta que se alcanza una DO600 de al menos 10. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo hasta que se alcanza una DO600 de al menos 100. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo hasta que se alcanza una DO600 de entre 0,01 y 100. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo hasta que se alcanza una DO600 de entre 0,1 y 10. En algunas modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo hasta que se alcanza una DO600 de entre 1 y 100. En otras modalidades, la etapa de generación se lleva a cabo durante un período de al menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 o más de 96 horas.
En algunas modalidades, la etapa de producción se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para producir una cantidad deseada de isoprenoides objetivo. En algunas modalidades, la etapa de producción se lleva a cabo durante un período de al menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 o más de 96 horas. En algunas modalidades, la etapa de producción se lleva a cabo por un período de entre 3 y 20 días. En algunas modalidades, la etapa de producción se lleva a cabo durante un período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19., 20 o más de 20 días.
En una modalidad particular, el método de producción de isoprenoides objetivo comprende realizar la fermentación de la célula hospedera modificada genéticamente en condiciones aeróbicas suficientes para permitir el crecimiento y mantenimiento de la célula hospedera modificada genéticamente; después, subsecuentemente, se proporcionan condiciones de fermentación microaeróbicas suficientes para inducir la producción de isoprenoides objetivo y se mantienen las condiciones microaeróbicas durante todo el ciclo de fermentación. En determinadas modalidades, las condiciones microaeróbicas se usan durante todo el ciclo de fermentación. En determinadas modalidades, las condiciones aeróbicas se usan durante todo el ciclo de fermentación.
En determinadas modalidades, la producción del nivel elevado de isoprenoides objetivo por la célula hospedera es inducible por un compuesto inductor. Tal célula hospedera puede manipularse con facilidad en ausencia del compuesto inductor. A continuación, se añade el compuesto inductor para inducir la producción del nivel elevado de isoprenoide por la célula hospedera. En otras modalidades, la producción del nivel elevado de isoprenoide por la célula hospedera puede inducirse cambiando las condiciones de cultivo, tales como, por ejemplo, la temperatura de crecimiento, los constituyentes del medio y similares.
En determinadas modalidades, se añade un agente inductor durante la etapa de producción para activar un promotor o para eliminar la represión de un regulador transcripcional asociado con una vía biosintética, para promover la producción de isoprenoides objetivo. En determinadas modalidades, se agrega un agente inductor durante la etapa de generación para reprimir un promotor o para activar un regulador transcripcional asociado con una vía biosintética, para reprimir la producción de isoprenoides objetivo, y se elimina un agente inductor durante la etapa de producción para activar un promotor, para aliviar la represión de un regulador transcripcional, para promover la producción de isoprenoides objetivo. El término "interruptor genético" se usa en la presente descripción para referirse al uso de un promotor u otros elementos genéticos para controlar la activación o desactivación de la vía biosintética para la producción de isoprenoides. Ejemplos ilustrativos de un agente inductor útil o un interruptor genético para controlar la producción de isoprenoides objetivo se describen en, por ejemplo, Publicaciones de Solicitud PCT WO2015/020649, WO2016/210343 y WO2016210350
En otra modalidad, el método para producir isoprenoides objetivo comprende cultivar células hospederas en medios de cultivo de generación y de producción separados. Por ejemplo, el método puede comprender cultivar la célula hospedera modificada genéticamente en una etapa de generación en la que la célula se cultiva en condiciones no productivas (por ejemplo, condiciones no inductoras) para producir un inóculo, luego transferir el inóculo a un segundo medio de fermentación en condiciones adecuadas para inducir la producción de isoprenoides objetivo (por ejemplo, condiciones inductoras) y mantener las condiciones de estado estacionario en la segunda etapa de fermentación para producir un cultivo celular que contenga isoprenoides objetivo.
Como se ilustra en la Figura 4, los dos o más isoprenoides objetivo pueden producirse de forma simultánea o secuencial. La modalidad 1 de la Figura 4 ilustra la coproducción de isoprenoides objetivo (es decir, farneseno y carotenoides) de forma simultánea o concurrente en un solo ciclo de fermentación. Para la coproducción concurrente de isoprenoides objetivo, en algunas modalidades, las vías biosintéticas para los isoprenoides objetivo están activas de manera constitutiva. En otras modalidades, para la coproducción concurrente de isoprenoides objetivo, la vía biosintética de los isoprenoides objetivo puede estar bajo el control del mismo interruptor genético o de un inductor. Por ejemplo, las vías biosintéticas para la producción de farneseno y carotenoides pueden estar bajo el control de los promotores pGal, que están regulados por el regulón Gal. Ejemplos del regulón Gal que son reprimidos o inducidos adicionalmente por una maltosa se describen en las Publicaciones de Solicitud PCT WO2015/020649, WO2016/210343, y WO2016210350. En determinadas modalidades, la producción de un primer isoprenoide se puede inducir primero, seguido de la inducción de la producción del segundo isoprenoide, en un solo ciclo de fermentación.
El ejemplo 2 de la Figura 4 ilustra una producción secuencial de isoprenoides en dos ciclos de fermentación después de la inoculación. En este ejemplo, el primer isoprenoide puede producirse durante el primer ciclo de fermentación y el segundo isoprenoide puede producirse durante el segundo ciclo de fermentación. Por ejemplo, el primer isoprenoide puede producirse durante el primer ciclo de fermentación, y tanto el primer como el segundo isoprenoide pueden producirse durante el segundo ciclo de fermentación.
En determinadas modalidades, el cultivo y la recuperación comprenden: (a) cultivar un inóculo individual que comprende la célula hospedera para construir una población de la célula hospedera; (b) cultivar la población de la célula hospedera en condiciones para producir el primer isoprenoide a partir de la población de células hospederas, en donde las condiciones no activan la producción del segundo isoprenoide; (c) separar y recuperar el primer isoprenoide la población; (d) después de separar el primer isoprenoide, cultivar la población o una subpoblación de la célula hospedera en condiciones para activar la producción del segundo isoprenoide; y recuperar el segundo isoprenoide.
En determinadas modalidades, el primer isoprenoide se libera predominantemente de la célula hospedera al medio de cultivo y el segundo isoprenoide permanece predominantemente con la fracción celular (por ejemplo, dentro de la célula). En determinadas modalidades, el segundo isoprenoide se recupera junto con la célula hospedera.
En algunas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente produce una cantidad mayor de un isoprenoide en comparación con una célula parental que no comprende una o más modificaciones, o una célula parental que comprende solo un subconjunto de una o más modificaciones de la célula hospedera modificada genéticamente, pero por lo demás es genéticamente idéntico. En algunas modalidades, la cantidad aumentada es al menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % o mayor del 100 %, como se mide, por ejemplo, en rendimiento, producción, productividad, en gramos por litro de cultivo celular, miligramos por gramo de peso seco celular, por unidad de volumen de cultivo celular, por unidad de peso seco celular, por unidad de volumen de cultivo celular por unidad de tiempo, por unidad de peso seco celular por unidad de tiempo.
En algunas modalidades, la célula hospedera produce un nivel elevado de un primer isoprenoide que es mayor de aproximadamente 10 gramos por litro de medio de fermentación. En algunas de dichas modalidades, el isoprenoide se produce en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 gramos, más de aproximadamente 15 gramos, más de aproximadamente 20 gramos, más de aproximadamente 25 gramos o más de aproximadamente 30 gramos por litro de cultivo celular.
En algunas modalidades, la célula hospedera produce un nivel elevado de un primer isoprenoide que es superior a aproximadamente 50 miligramos por gramo de peso seco celular. En algunas de tales modalidades, el isoprenoide se produce en una cantidad de aproximadamente 50 a aproximadamente 1500 miligramos, más de aproximadamente 100 miligramos, más de aproximadamente 150 miligramos, más de aproximadamente 200 miligramos, más de aproximadamente 250 miligramos, más de aproximadamente 500 miligramos, más de aproximadamente 750 miligramos, o más de aproximadamente 1000 miligramos por gramo de peso seco celular.
En algunas modalidades, la célula hospedera produce un nivel elevado de un isoprenoide que es al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2. 5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 -veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces o más, mayor que el nivel de isoprenoide producido por una célula parental, por unidad de volumen de cultivo celular.
En algunas modalidades, la célula hospedera produce un nivel elevado de un isoprenoide que es al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2. 5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 -veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces o más, mayor que el nivel de isoprenoide producido por la célula parental, por unidad de peso seco celular.
En algunas modalidades, la célula hospedera produce un nivel elevado de un isoprenoide que es al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2. 5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 -veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces o más, mayor que el nivel de isoprenoide producido por la célula parental, por unidad de volumen de cultivo celular por unidad de tiempo.
En algunas modalidades, la célula hospedera produce un nivel elevado de un isoprenoide que es al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2. 5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 -veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces o más, mayor que el nivel de isoprenoide producido por la célula parental, por unidad de peso seco celular por unidad de tiempo.
En algunas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente produce una cantidad comparable del primer isoprenoide en comparación con una célula parental que no produce el segundo isoprenoide. En algunas modalidades, la cantidad comparable es al menos 90 %, 95 %, 100 % o más del 100 % en comparación con la cantidad original, como se mide, por ejemplo, en rendimiento, producción, productividad, en gramos por litro de cultivo celular, miligramos por gramo de peso seco celular, por unidad de volumen de cultivo celular, por unidad de peso seco celular, por unidad de volumen de cultivo celular por unidad de tiempo, o por unidad de peso seco celular por unidad base de tiempo.
En algunas modalidades, la célula hospedera modificada genéticamente produce una cantidad comparable del segundo isoprenoide en comparación con una célula parental que no produce el primer isoprenoide. En algunas modalidades, la cantidad comparable es al menos 90 %, 95 %, 100 % o más del 100 % en comparación con la cantidad original, como se mide, por ejemplo, en rendimiento, producción, productividad, en gramos por litro de cultivo celular, miligramos por gramo de peso seco celular, por unidad de volumen de cultivo celular, por unidad de peso seco celular, por unidad de volumen de cultivo celular por unidad de tiempo, o por unidad de peso seco celular por unidad base de tiempo.
5.9. Condiciones y Medios de Cultivo
Los materiales y métodos para el mantenimiento y crecimiento de cultivos microbianos son bien conocidos por los expertos en la técnica de la microbiología o la ciencia de la fermentación (ver, por ejemplo, Bailey y otros, Biochemical Engineering Fundamentals, segunda edición, McGraw Hill, Nueva York, 1986). Se deben tener en cuenta el medio de cultivo, el pH, la temperatura y los requisitos adecuados para las condiciones aeróbicas, microaeróbicas o anaeróbicas, en dependencia de los requisitos específicos de la célula hospedera, la fermentación y el proceso.
Los métodos de producción de isoprenoides que se proporcionan en la presente descripción pueden realizarse en un medio de cultivo adecuado (por ejemplo, con o sin suplemento de pantotenato) en un recipiente adecuado, que incluye, pero no se limitan a, una placa de cultivo celular, un matraz o un fermentador. Además, los métodos pueden realizarse a cualquier escala de fermentación conocida en la técnica para permitir la producción industrial de productos microbianos. Puede usarse cualquier fermentador adecuado, incluido un fermentador de tanque agitado, un fermentador de agitación por aire, un fermentador de burbujas o cualquier combinación de los mismos. En modalidades particulares que usan Saccharomyces cerevisiae como célula hospedera, las cepas pueden cultivarse en un fermentador como se describe en detalle por Kosaric, y otros, en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sexta Edición, Volumen 12, páginas 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Alemania.
En algunas modalidades, el medio de cultivo es cualquier medio de cultivo en el que pueda subsistir un microorganismo modificado genéticamente capaz de producir un isoprenoide, es decir, mantener el crecimiento y la viabilidad. En algunas modalidades, el medio de cultivo es un medio acuoso que comprende fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato. Dicho medio también puede incluir sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados. En algunas modalidades, la fuente de carbono y cada uno de los nutrientes celulares esenciales se agregan de forma gradual o continua al medio de fermentación, y cada nutriente requerido se mantiene esencialmente en el nivel mínimo necesario para una asimilación eficiente por parte de las células en crecimiento, por ejemplo, de acuerdo con una curva de crecimiento celular predeterminada con base en la función metabólica o respiratoria de las células que convierten la fuente de carbono en una biomasa.
Las condiciones adecuadas y los medios adecuados para cultivar microorganismos son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, el medio adecuado se complementa con uno o más agentes adicionales, como, por ejemplo, un inductor (por ejemplo, cuando una o más secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico están bajo el control de un promotor inducible), un represor (por ejemplo, cuando una o más secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico están bajo el control de un promotor reprimible), o un agente de selección (por ejemplo, un antibiótico para seleccionar microorganismos que comprenden las modificaciones genéticas).
En algunas modalidades, la fuente de carbono es un monosacárido (azúcar simple), un disacárido, un polisacárido, una fuente de carbono no fermentable o una o más combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de monosacáridos adecuados incluyen glucosa, galactosa, manosa, fructosa, xilosa, ribosa y sus combinaciones. Los ejemplos no limitantes de disacáridos adecuados incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa y sus combinaciones. Los ejemplos no limitantes de polisacáridos adecuados incluyen almidón, glucógeno, celulosa, quitina y sus combinaciones. Los ejemplos no limitantes de fuentes de carbono no fermentables adecuadas incluyen acetato y glicerol.
La concentración de una fuente de carbono, como glucosa, en el medio de cultivo, debería promover el crecimiento celular, pero no ser tan alta como para reprimir el crecimiento del microorganismo que se usa. Típicamente, los cultivos se procesan con una fuente de carbono, como glucosa, que se agrega a niveles para alcanzar el nivel deseado de crecimiento y biomasa, pero a niveles indetectables (con límites detección de aproximadamente <0,1 g/l). En otras modalidades, la concentración de una fuente de carbono, como glucosa, en el medio de cultivo es mayor que aproximadamente 1 g/L, preferentemente mayor que aproximadamente 2 g/L, y con mayor preferencia mayor que aproximadamente 5 g/L. Además, la concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa, en el medio de cultivo es típicamente menos de aproximadamente 100 g/L, preferentemente menos de aproximadamente 50 g/L, y con mayor preferencia menos de aproximadamente 20 g/L. Se debe señalar que las referencias a las concentraciones de los componentes del cultivo pueden referirse a las concentraciones iniciales y/o continuas de los componentes. En algunos casos, puede ser conveniente permitir que el medio de cultivo se agote de una fuente de carbono durante el cultivo.
Las fuentes de nitrógeno asimilable que pueden usarse en un medio de cultivo adecuado incluyen, pero no se limitan a, fuentes de nitrógeno simples, fuentes de nitrógeno orgánico y fuentes de nitrógeno complejas. Dichas fuentes de nitrógeno incluyen amoníaco anhidro, sales de amonio y sustancias de origen animal, vegetal y/o microbiano. Las fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hidrolizados de proteínas, hidrolizados de biomasa microbiana, peptona, extracto de levadura, sulfato de amonio, urea y aminoácidos. Típicamente, la concentración de las fuentes de nitrógeno en el medio de cultivo es superior a aproximadamente 0,1 g/L, preferentemente superior a aproximadamente 0,25 g/L y con mayor preferencia superior a aproximadamente 1,0 g/L. Sin embargo, más allá determinadas concentraciones, la adición de una fuente de nitrógeno al medio de cultivo no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. Como resultado, la concentración de las fuentes de nitrógeno en el medio de cultivo es menos de aproximadamente 20 g/L, preferentemente menos de aproximadamente 10 g/L y con mayor preferencia menos de aproximadamente 5 g/L. Además, en algunos casos puede ser conveniente permitir que el medio de cultivo se agote de las fuentes de nitrógeno durante el cultivo.
El medio de cultivo efectivo puede contener otros compuestos como sales inorgánicas, vitaminas, metales traza o promotores del crecimiento. Tales otros compuestos también pueden estar presentes en fuentes de carbono, nitrógeno o minerales en el medio efectivo o pueden añadirse específicamente al medio.
El medio de cultivo también puede contener una fuente de fosfato adecuada. Dichas fuentes de fosfato incluyen fuentes de fosfato tanto inorgánicas como orgánicas. Las fuentes de fosfato preferidas incluyen, pero no se limitan a, sales de fosfato tales como fosfatos de sodio y potasio mono o dibásicos, fosfato de amonio y mezclas de los mismos. Típicamente, la concentración de fosfato en el medio de cultivo es superior a aproximadamente 1,0 g/L, preferentemente superior a aproximadamente 2,0 g/L y con mayor preferencia superior a aproximadamente 5,0 g/L. Sin embargo, más allá determinadas concentraciones, la adición de fosfato al medio de cultivo no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. Por consiguiente, la concentración de fosfato en el medio de cultivo es típicamente menos de aproximadamente 20 g/L, preferentemente menos de aproximadamente 15 g/L y con mayor preferencia menos de aproximadamente 10 g/L.
Un medio de cultivo adecuado también puede incluir una fuente de magnesio, preferentemente en forma de una sal aceptable fisiológicamente, tal como sulfato de magnesio heptahidratado, aunque se pueden usar otras fuentes de magnesio en concentraciones que aporten cantidades similares de magnesio. Típicamente, la concentración de magnesio en el medio de cultivo es superior a aproximadamente 0,5 g/L, preferentemente superior a aproximadamente 1,0 g/L y con mayor preferencia superior a aproximadamente 2,0 g/L. Sin embargo, más allá determinadas concentraciones, la adición de magnesio al medio de cultivo no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. Por consiguiente, la concentración de magnesio en el medio de cultivo es típicamente menos de aproximadamente 10 g/L, preferentemente menos de aproximadamente 5 g/L y con mayor preferencia menos de aproximadamente 3 g/L. Además, en algunos casos puede ser conveniente permitir que el medio de cultivo se agote de una fuente de magnesio durante el cultivo.
En algunas modalidades, el medio de cultivo también puede incluir un agente quelante aceptable biológicamente, como el dihidrato de citrato trisódico. En tal caso, la concentración de un agente quelante en el medio de cultivo es superior a aproximadamente 0,2 g/L, preferentemente superior a aproximadamente 0,5 g/L y con mayor preferencia superior a aproximadamente 1 g/L. Sin embargo, más allá determinadas concentraciones, la adición de un agente quelante al medio de cultivo no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. Por consiguiente, la concentración de un agente quelante en el medio de cultivo es típicamente menos de aproximadamente 10 g/L, preferentemente menos de aproximadamente 5 g/L y con mayor preferencia menos de aproximadamente 2 g/L. El medio de cultivo también puede incluir inicialmente un ácido o una base aceptable biológicamente, para mantener el pH deseado del medio de cultivo. Los ácidos biológicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y sus mezclas. Las bases aceptables biológicamente incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de amonio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y sus mezclas. En algunas modalidades, la base que se usa es hidróxido de amonio.
El medio de cultivo también puede incluir una fuente de calcio aceptable biológicamente, que incluye, pero no se limita a, cloruro de calcio. Típicamente, la concentración de la fuente de calcio en el medio de cultivo, tal como cloruro de calcio, dihidrato, está dentro del intervalo de aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 2000 mg/L, preferentemente dentro del intervalo de aproximadamente 20 mg/L aproximadamente 1000 mg/L, y con mayor preferencia en el intervalo de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 500 mg/L.
El medio de cultivo también puede incluir cloruro de sodio. Típicamente, la concentración de cloruro de sodio en el medio de cultivo está dentro del intervalo de aproximadamente 0,1 g/L a aproximadamente 5 g/L, preferentemente dentro del intervalo de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 4 g/L, y con mayor preferencia en el intervalo de aproximadamente 2 g/L a aproximadamente 4 g/L.
En algunas modalidades, el medio de cultivo también puede incluir metales traza. Estos metales traza se pueden añadir al medio de cultivo como una solución concentrada que, por conveniencia, se puede preparar por separado del resto del medio de cultivo. Típicamente, la cantidad de tal solución de metales traza añadida al medio de cultivo es mayor de aproximadamente 1 ml/L, preferentemente mayor de aproximadamente 5 ml/L, y con mayor preferencia mayor de aproximadamente 10 ml/L. Sin embargo, más allá determinadas concentraciones, la adición de metales traza al medio de cultivo no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos. Por consiguiente, la cantidad de tal solución de metales traza añadida al medio de cultivo es típicamente menos de aproximadamente 100 ml/L, preferentemente menos de aproximadamente 50 ml/L y con mayor preferencia menos de aproximadamente 30 ml/L. Se debe señalar que, además de añadir metales traza en una solución concentrada, los componentes individuales se pueden añadir por separado, cada uno dentro de los intervalos correspondientes independientemente a las cantidades de los componentes dictadas por los intervalos anteriores de la solución de metales traza.
Los medios de cultivo pueden incluir otras vitaminas, tales como pantotenato, biotina, calcio, pantotenato, inositol, piridoxina-HCl y tiamina-HCl. Dichas vitaminas se pueden añadir al medio de cultivo como una solución concentrada que, por conveniencia, se puede preparar por separado del resto del medio de cultivo. Sin embargo, más allá determinadas concentraciones, la adición de vitaminas al medio de cultivo no es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos.
Los métodos de fermentación descritos en la presente descripción pueden realizarse en modos de cultivo convencionales, que incluyen, pero no se limitan a, cultivo discontinuo, cultivo discontinuo alimentado, reciclado de células, cultivo continuo y semicontinuo. En algunas modalidades, la fermentación se lleva a cabo en modo discontinuo alimentado. En tal caso, algunos de los componentes del medio se agotan durante el cultivo, incluido el pantotenato durante la etapa de producción de la fermentación. En algunas modalidades, el cultivo puede complementarse con concentraciones relativamente altas de tales componentes al principio, por ejemplo, de la etapa de producción, de modo que permita el crecimiento y/o la producción de isoprenoides durante un período de tiempo antes de que se requieran adiciones. Los intervalos preferidos de estos componentes se mantienen en todo el cultivo al realizar adiciones a medida que los niveles se agotan durante el cultivo. Los niveles de componentes en el medio de cultivo pueden monitorizarse, por ejemplo, tomando muestras del medio de cultivo periódicamente y analizando las concentraciones. Alternativamente, una vez que se desarrolla un procedimiento de cultivo estándar, se pueden realizar adiciones a intervalos cronometrados correspondientes a niveles conocidos en momentos particulares a lo largo del cultivo. Como reconocerán los expertos en la técnica, la velocidad de consumo de los nutrientes aumenta durante el cultivo a medida que aumenta la densidad celular del medio. Además, para evitar la introducción de microorganismos extraños en el medio de cultivo, la adición se realiza usando métodos asépticos de adición, como se conoce en la técnica. Además, durante el cultivo se puede añadir una cantidad pequeña de agente antiespumante.
La temperatura del medio de cultivo puede ser cualquier temperatura adecuada para el crecimiento de las células modificadas genéticamente y/o la producción de isoprenoides. Por ejemplo, antes de la inoculación del medio de cultivo con un inóculo, el medio de cultivo se puede llevar y mantener a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C, preferentemente a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, y con mayor preferencia en el intervalo de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 32 °C.
El pH del medio de cultivo se puede controlar mediante la adición de ácido o base al medio de cultivo. En tales casos, cuando se usa amoníaco para controlar el pH, sirve también convenientemente como fuente de nitrógeno en el medio de cultivo. Preferentemente, el pH se mantiene de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 8,0, con mayor preferencia de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,0 y con la máxima preferencia de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5.
En algunas modalidades, la concentración de la fuente de carbono, tal como la concentración de glucosa, del medio de cultivo se monitoriza durante el cultivo. La concentración de glucosa del medio de cultivo puede monitorizarse mediante el uso de técnicas conocidas, como, por ejemplo, el uso de la prueba de la enzima glucosa oxidasa o la cromatografía líquida de alta presión, que puede usarse para monitorizar la concentración de glucosa en el sobrenadante, por ejemplo, un componente del medio de cultivo libre de células. Como se indicó anteriormente, la concentración de la fuente de carbono debe mantenerse por debajo del nivel en el que se produce la inhibición del crecimiento celular. Aunque dicha concentración puede variar de un organismo a otro, para la glucosa como fuente de carbono, la inhibición del crecimiento celular se produce a concentraciones de glucosa superiores a aproximadamente 60 g/L, y puede determinarse fácilmente mediante ensayo. Por consiguiente, cuando se usa glucosa como fuente de carbono, la glucosa preferentemente se introduce al fermentador y se mantiene por debajo de los límites detección. Alternativamente, la concentración de glucosa en el medio de cultivo se mantiene en el intervalo de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 100 g/L, con mayor preferencia en el intervalo de aproximadamente 2 g/L a aproximadamente 50 g/L, y aún con mayor preferencia en el intervalo de aproximadamente 5 g/L a aproximadamente 20 g/L. Aunque la concentración de la fuente de carbono se puede mantener dentro de los niveles deseados mediante la adición de, por ejemplo, una solución de glucosa sustancialmente pura, es aceptable, y puede ser preferido, mantener la concentración de la fuente de carbono del medio de cultivo mediante la adición de alícuotas del medio de cultivo original. El uso de alícuotas del medio de cultivo original puede ser conveniente porque pueden mantenerse de manera simultánea las concentraciones de otros nutrientes en el medio (por ejemplo, las fuentes de nitrógeno y fosfato). Asimismo, las concentraciones de metales traza se pueden mantener en el medio de cultivo mediante la adición de alícuotas de la solución de metales traza.
5.10. Recuperación de Isoprenoides
Una vez que la célula hospedera produce un isoprenoide, puede recuperarse o aislarse para uso posterior usando cualquier método adecuado de separación y purificación conocido en la técnica. En algunas modalidades, una fase orgánica que comprende el isoprenoide se separa de la fermentación por centrifugación. En otras modalidades, una fase orgánica que comprende el isoprenoide se separa de la fermentación de forma espontánea. En otras modalidades, una fase orgánica que comprende el isoprenoide se separa de la fermentación añadiendo un desemulsionante y/o un agente nucleante en la reacción de fermentación. Los ejemplos ilustrativos de desemulsionantes incluyen floculantes y coagulantes. Los ejemplos ilustrativos de agentes nucleantes incluyen gotitas del propio isoprenoide y solventes orgánicos tales como dodecano, miristrato de isopropilo y oleato de metilo. El isoprenoide producido en estas células puede estar presente en el sobrenadante del cultivo y/o asociado con las células hospederas. En modalidades en las que el isoprenoide está asociado con la célula hospedera, la recuperación del isoprenoide puede comprender un método de permeabilización o lisis de las células. Alternativa o simultáneamente, el isoprenoide en el medio de cultivo se puede recuperar usando un proceso de recuperación que incluye, pero no se limita a, cromatografía, extracción, extracción con solvente, separación por membrana, electrodiálisis, ósmosis inversa, destilación, derivatización química y cristalización.
En algunas modalidades, el isoprenoide se separa de otros productos que pueden estar presentes en la fase orgánica. En algunas modalidades, la separación se logra usando adsorción, destilación, extracción gas-líquido (lavado), extracción líquido-líquido (extracción con solvente), ultrafiltración y técnicas cromatográficas estándar. En algunas modalidades, el primer isoprenoide producido en estas células puede estar presente en el sobrenadante del cultivo y el segundo isoprenoide producido en estas células puede estar asociado con las células hospederas. En estas modalidades, ya que dos productos isoprenoides están en fases diferentes, es más fácil separar y recuperar los dos productos isoprenoides. Los métodos para separar y recuperar los segundos isoprenoides, como los carotenoides, se describen en la sección de Ejemplos a continuación.
Métodos para Producir Células Modificadas Genéticamente
También se describen en la presente descripción métodos para producir una célula hospedera que se manipula genéticamente de modo que comprenda una o más de las modificaciones descritas anteriormente, por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican enzimas de la vía biosintética, por ejemplo, para la coproducción de compuestos isoprenoides. La expresión de una enzima heteróloga en una célula hospedera se puede lograr introduciendo en las células hospederas un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima bajo el control de elementos reguladores que permiten la expresión en la célula hospedera. En algunas modalidades, el ácido nucleico es un plásmido extracromosómico. En otras modalidades, el ácido nucleico es un vector de integración cromosómica que puede integrar la secuencia de nucleótidos en el cromosoma de la célula hospedera.
Los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas se pueden introducir en la célula hospedera mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, sin limitación (ver, por ejemplo, Hinnen y otros (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75:1292-3; Cregg y otros (1985) Mol. Célula. Biol. 5: 3376-3385; Goeddel y otros eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -­ A Laboratory Manual, Stockton Press, NY ; Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; y Ausubel y otros, eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, NY). Las técnicas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, esferoplastos, electroporación, transformación mediada por PEG 1000 y transformación mediada por acetato de litio o cloruro de litio.
El número de copias de una enzima en una célula hospedera se puede alterar modificando la transcripción del gen que codifica la enzima. Esto se puede lograr, por ejemplo, modificando el número de copias de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima (por ejemplo, mediante el uso de un vector de expresión de menor o mayor número de copias que comprende la secuencia de nucleótidos, o introduciendo copias adicionales de la secuencia de nucleótidos en el genoma del célula hospedera o eliminando o interrumpiendo la secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula hospedera), cambiando el orden de las secuencias codificantes en un ARNm policistrónico de un operón o dividiendo un operón en sus genes individuales, cada uno con sus propios elementos de control, o aumentando la fuerza del promotor u operador al que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente. Alternativamente o además, el número de copias de una enzima en una célula hospedera se puede alterar modificando el nivel de traducción de un ARNm que codifica la enzima. Esto puede lograrse, por ejemplo, modificando la estabilidad del ARNm, modificando la secuencia del sitio de unión del ribosoma, modificando la distancia o secuencia entre el sitio de unión del ribosoma y el codón de inicio de la secuencia codificante de la enzima, modificando toda la región intercistrónica localizada "aguas arriba de" o adyacente al lado 5' del codón de inicio de la región codificante de la enzima, estabilizar el extremo 3' del transcrito de ARNm mediante el uso de horquillas y secuencias especializadas, modificar el uso de codones de la enzima, alterar la expresión de los ARNt de codones raros que se usan en la biosíntesis de la enzima y/o aumentando la estabilidad de la enzima, como, por ejemplo, mediante la mutación de su secuencia codificante.
La actividad de una enzima en una célula hospedera se puede alterar de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, la expresión de una forma modificada de la enzima que exhibe una solubilidad aumentada o disminuida en la célula hospedera, expresando una forma alterada de la enzima que carece de un dominio a través del cual se inhibe la actividad de la enzima, expresando una forma modificada de la enzima que tiene una Kcat mayor o menor o una Km menor o mayor para el sustrato, o expresando una forma alterada de la enzima que es más o menos afectado por la regulación de entrada o retroalimentación por parte de otra molécula en la vía.
En algunas modalidades, un ácido nucleico que se usa para modificar genéticamente una célula hospedera comprende uno o más marcadores seleccionables útiles para la selección de células hospederas transformadas y para ejercer presión selectiva sobre la célula hospedera para mantener el ADN extraño.
En algunas modalidades, el marcador seleccionable es un marcador de resistencia a antibióticos. Los ejemplos ilustrativos de marcadores de resistencia a antibióticos incluyen, pero no se limitan a, los productos génicos BLA, NATI, PAT, AUR1-C, PDR4, SMR1, CAT, dhfr de ratón, HPH, DSDA, KANR y SH BLE. El producto del gen BLA de E. coli confiere resistencia a los antibióticos betalactámicos (por ejemplo, Cefalosporinas de espectro estrecho, cefamicinas y carbapenémicos (ertapenem), cefamandol y cefoperazona) y a todas las penicilinas antibacterias gramnegativas excepto temocilina; el producto del gen NATI de S. nourseiconfiere resistencia a la nourseotricina; el producto del gen PAT de S. viridochromogenes Tu94 confiere resistencia a bialofos; el producto del gen AUR1-C de Saccharomyces cerevisiae confiere resistencia a Auerobasidin A (AbA); el producto del gen PDR4 confiere resistencia a la cerulenina; el producto del gen SMR1 confiere resistencia al sulfometuron metilo; el producto del gen CAT del transposón Tn9 confiere resistencia al cloranfenicol; el producto del gen dhfr de ratón confiere resistencia al metotrexato; el producto del gen HPH de Klebsiella pneumonia confiere resistencia a la higromicina B; el producto del gen DSDA de E. coli permite que las células crezcan en placas con D-serina como única fuente de nitrógeno; el gen KAN R del transposón Tn903 confiere resistencia a G418; y el producto del gen SH BLE de Streptoalloteichus hindustanus confiere resistencia a la zeocina (bleomicina). En algunas modalidades, el marcador de resistencia a antibióticos se elimina después de aislar la célula hospedera modificada genéticamente descrita en la presente descripción.
En algunas modalidades, el marcador seleccionable rescata una auxotrofia (por ejemplo, una auxotrofia nutricional) en el microorganismo modificado genéticamente. En tales modalidades, un microorganismo parental comprende una alteración funcional en uno o más productos génicos que funcionan en una vía biosintética de aminoácidos o nucleótidos y que, cuando no es funcional, hace que una célula parental sea incapaz de crecer en medios sin suplementación con uno o más nutrientes. Dichos productos génicos incluyen, pero no se limitan a, los productos génicos HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET15, TRP1, ADE2 y URA3 en levadura. El fenotipo auxotrófico se puede rescatar transformando la célula parental con un vector de expresión o construcción de integración cromosómica que codifica una copia funcional del producto génico alterado, y la célula hospedera modificada genéticamente que se genera se puede seleccionar con base en la pérdida del fenotipo auxotrófico de la célula parental. La utilización de los genes URA3, TRP1 y LYS2 como marcadores seleccionables tiene una marcada ventaja porque son posibles tanto selecciones positivas como negativas. La selección positiva se lleva a cabo mediante la complementación auxotrófica de las mutaciones URA3, TRP1 y LYS2, mientras que la selección negativa se basa en inhibidores específicos, es decir, ácido 5-fluoroorótico (FOA), ácido 5-fluoroantranílico y ácido aminoadípico (aAA), respectivamente, que previenen el crecimiento de las cepas prototróficas pero permiten el crecimiento de los mutantes URA3, TRP1 y LYS2, respectivamente. En otras modalidades, el marcador seleccionable rescata otras deficiencias o fenotipos no letales que pueden identificarse mediante un método de selección conocido.
En la presente descripción se describen genes y proteínas específicos útiles en los métodos, composiciones y organismos de la descripción; sin embargo, se reconocerá que no es necesaria la identidad absoluta con respecto a tales genes. Por ejemplo, se pueden realizar y seleccionar cambios en un gen o polinucleótido particular que comprende una secuencia que codifica un polipéptido o enzima, para determinar su actividad. Típicamente, tales cambios comprenden mutaciones conservadoras y mutaciones silenciosas. Dichos polinucleótidos y polipéptidos modificados o mutados pueden seleccionarse para la expresión de una enzima funcional mediante el uso de métodos conocidos en la técnica.
Debido a la degeneración inherente del código genético, también pueden usarse otros polinucleótidos que codifican sustancialmente los mismos o polipéptidos funcionalmente equivalentes, para clonar y expresar los polinucleótidos que codifican tales enzimas.
Como entenderán los expertos en la técnica, puede resultar ventajoso modificar una secuencia codificante para potenciar su expresión en un hospedero particular. El código genético es redundante con 64 posibles codones, pero la mayoría de los organismos típicamente usan un subconjunto de estos codones. Los codones que se usan con mayor frecuencia en una especie se denominan codones óptimos, y los que no se usan con mucha frecuencia se clasifican como codones raros o de bajo uso. Los codones pueden sustituirse para reflejar el uso de codones preferido del hospedero, en un proceso que denominado a veces "optimización de codones" o "control del sesgo de codones por especies".
Las secuencias codificantes optimizadas que contienen codones preferidos por un hospedero procariota o eucariota particular (Murray y otros, 1989, Nucl Acids Res. 17:477-508) pueden prepararse, por ejemplo, para aumentar la velocidad de traducción o para producir transcritos de ARN recombinantes que tengan propiedades convenientes, tales como una vida media más larga, en comparación con los transcritos producidos a partir de una secuencia no optimizada. Los codones de paro de la traducción también pueden modificarse para reflejar la preferencia del hospedero. Por ejemplo, los codones de paro típicos para S. cerevisiae y mamíferos son UAA y UGA, respectivamente. El codón de paro típico de las plantas monocotiledóneas es UGA, mientras que los insectos y E. coli suelen usar UAA como codón de paro (Dalphin y otros, 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8).
Los expertos en la técnica reconocerán que, debido a la naturaleza degenerada del código genético, para codificar una enzima dada de la descripción puede usarse una variedad de moléculas de ADN que difieren en sus secuencias de nucleótidos. En la presente descripción se hace referencia a la secuencia de ADN nativa que codifica las enzimas biosintéticas descritas anteriormente, simplemente para ilustrar una modalidad de la descripción, y la descripción incluye moléculas de ADN de cualquier secuencia que codifique las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos y proteínas de las enzimas que se usan en los métodos de la descripción. De manera similar, un polipéptido puede tolerar típicamente una o más sustituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos en su secuencia de aminoácidos sin pérdida o sin pérdida significativa de una actividad deseada. La descripción incluye tales polipéptidos con secuencias de aminoácidos diferentes a las de las proteínas específicas descritas en la presente descripción, siempre que los polipéptidos modificados o variantes tengan la actividad enzimática anabólica o catabólica del polipéptido de referencia. Además, las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ADN mostradas en la presente descripción simplemente ilustran modalidades de la descripción.
Además, los homólogos de enzimas útiles para las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción están incluidos en la descripción. En algunas modalidades, dos proteínas (o una región de las proteínas) son sustancialmente homólogas cuando las secuencias de aminoácidos tienen al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para su comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para lograr el alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden descartarse para la comparación). En una modalidad, la longitud de una secuencia de referencia alineada para la comparación es al menos 30 %, típicamente al menos 40%, más típicamente al menos 50 %, incluso más típicamente al menos 60 % e incluso más típicamente al menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en la presente descripción, la "identidad" de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que deben introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.
Cuando se usa "homólogo" en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de homología puede ajustarse hacia un aumento, para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica (Ver, por ejemplo, Pearson WR, 1994, Methods in Mol Biol 25: 365-89).
Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Alanina (A), Valina (V) y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
La homología de secuencia para polipéptidos, a la que también se hace referencia como porcentaje de identidad de secuencia, se mide típicamente mediante el uso de un programa de análisis de secuencia. Un algoritmo típico que se usa para comparar la secuencia de una molécula con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST. Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es habitual comparar secuencias de aminoácidos.
Además, cualquiera de los genes que codifican las enzimas anteriores (o cualquier otro mencionado en la presente descripción (o cualquiera de los elementos reguladores que controlan o modulan la expresión de los mismos)) puede optimizarse mediante técnicas de ingeniería genética/de proteínas, como la evolución dirigida o la mutagénesis racional, que son conocidos por los expertos en la técnica. Tal acción permite a los expertos en la técnica optimizar las enzimas para la expresión y actividad en levaduras.
Además, los genes que codifican estas enzimas pueden identificarse a partir de otras especies de hongos y bacterias y pueden expresarse para la modulación de esta vía. Una variedad de organismos podría servir como fuentes para estas enzimas, incluyendo, pero no se limitan a, Saccharomyces spp., incluyendo S. cerevisiae y S. uvarum, Kluyveromyces spp., Incluyendo K. thermotolerans, K. lactis y K. marxianus, Pichia spp., Hansenula spp., Incluidas H. polymorpha, Candida spp., Trichosporon spp., Yamadazyma spp., Incluidas Y. spp. stipitis, Torulaspora pretoriensis, Issatchenkia orientalis, Schizosaccharomyces spp., incluidas S. pombe, Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Neurospora spp. o Ustilago spp. Las fuentes de genes de hongos anaerobios incluyen, pero no se limitan a, Piromyces spp., Orpinomyces spp. O Neocallimastix spp. Las fuentes de enzimas procariotas que son útiles incluyen, pero no se limitan a, Escherichia. coli, Zymomonas mobilis, Staphylococcus aureus, Bacillus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas spp., Lactococcus spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., o X. dendrorhous
Las técnicas conocidas por los expertos en la técnica pueden ser adecuadas para identificar genes homólogos y enzimas homólogas adicionales. Generalmente, genes análogos y/o enzimas análogas pueden identificarse mediante análisis funcional y tendrán similitudes funcionales. Las técnicas conocidas por los expertos en la técnica pueden ser adecuadas para identificar genes análogos y enzimas análogas. Por ejemplo, para identificar PK, PTA, RHR2, HOR2 homólogos o análogos, o genes, proteínas o enzimas carotenogénicas, las técnicas pueden incluir, pero no se limitan a, la clonación de un gen mediante PCR usando cebadores que se basan en una secuencia publicada de un gen/enzima de interés, o mediante PCR degenerada usando cebadores degenerados diseñados para amplificar una región conservada entre un gen de interés. Además, un experto en la técnica puede usar técnicas para identificar genes, proteínas o enzimas homólogos o análogos con homología funcional o similitud. Las técnicas incluyen analizar una célula o cultivo celular para determinar la actividad catalítica de una enzima a través de ensayos enzimáticos in vitro para dicha actividad (por ejemplo, como se describe en la presente descripción o en Kiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970), después aislar la enzima con dicha actividad mediante purificación, y determinar la secuencia proteica de la enzima mediante técnicas como degradación de Edman, diseño de cebadores de PCR para la secuencia probable de ácido nucleico, amplificación de dicha secuencia de ADN mediante PCR y clonación de dicha secuencia de ácido nucleico. Las técnicas para identificar genes homólogos o similares y/o enzimas homólogas o similares, genes análogos y/o enzimas o proteínas análogas, también incluyen la comparación de datos relacionados con un gen o enzima candidato con bases de datos como BRENDA, KEGG o MetaCYC. El gen o enzima candidato puede identificarse dentro de las bases de datos mencionadas anteriormente de acuerdo con las enseñanzas de la presente descripción.
6. Ejemplos
6.1. Cepa Parental de producción de farneseno
Una cepa de producción de farneseno "no regulable" se derivó de una cepa de Saccharomyces cerevisiae de tipo silvestre (CEN.PK2) y también comprende los siguientes genes de la vía del mevalonato de S. cerevisiae integrados cromosómicamente bajo el control de los promotores GAL: acetil-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y mevalonato pirofosfato descarboxilasa; y seis copias de mutantes de farneseno sintasa de Artemisia annua. La cepa no regulable de producción de farneseno tiene el gen GAL80 eliminado y una copia adicional de GAL4 bajo el promotor GAL4oc, en donde la secuencia codificante del gen GAL4 de Saccharomyces cerevisiae está bajo el control regulador de una versión "constitutiva operativa" de su promotor nativo (PGAL4oc; ver, por ejemplo, Griggs y Johnston (1991) PNAS 88 (19):8597-8601).
La producción de farneseno en la cepa "no regulable" se hizo entonces "regulable", es decir, reprimible en presencia de maltosa. La cepa regulable por maltosa se genera a partir de la cepa no intercambiable integrando cromosómicamente una copia de GAL80 bajo el control de un promotor sensible a maltosa como pMAL32. Una descripción adicional de las cepas regulables que producen farneseno regulable se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. uS 2016/0177341 y la Publicación de Solicitud PCT Núm. WO 2016/210350.
En determinadas cepas, las cepas regulables de farneseno se manipularon genéticamente de acuerdo con Meadows y otros (2016), Patente de Estados Unidos Núm. 8,603,800, Patente de Estados Unidos 9,410,21.
6.2. Mediciones de Densidad Celular y Cuantificación de Farneseno basada en UV
El título de farneseno se midió de acuerdo con los métodos descritos en Meadows y otros (2016). Se añadieron 600 l_il de 2-butoxietanol a 150 |_il de caldo de células completas en tres adiciones de 200 |_il cada una, con 90 s de agitación a 1000 rpm en un agitador de placas de 96 pocillos entre cada adición. A continuación, las muestras se incubaron durante 40 min. Se mezclaron 8 |_il del extracto de 2-butoxietanol con 200 |_il de alcohol isopropílico en una placa para UV de 96 pocillos (Costar 3635), luego se leyó la absorbancia a 222 nM en un lector de placas. El título de farneseno se calculó con base en la absorbancia de una serie de diluciones estándar.
La DO600 se midió como se describió previamente en Meadows y otros (2016) y Sandoval y otros (2015) Metabol. Ing. 25, 215-226 (2014).
6.3. Producción de p-caroteno por la Cepa de Producción de Farneseno
Para probar si se pueden coproducir carotenoides además del farneseno, como moléculas de aprovechamiento, se introdujeron cinco genes de la vía en la cepa de producción de farneseno, bajo los promotores pGAL. Los genes que se introdujeron incluyen: GGPPS, Xd.CrtYB, Xd.CrtI, Hp.CrtZ y Hp.Bkt (o GGPpS, Xd.CrtYB, Xd.CrtI, Pa.CrtZ y Ps.CrtW) en la cepa regulable de producción de farneseno descrita anteriormente. Se probaron veintisiete combinaciones de diferentes dosis de genes (por ejemplo, diferentes copias de genes de la vía). En todas las veintisiete placas de transformación, se observaron colonias amarillas o anaranjadas (Figura 10), lo que indica la acumulación de p-caroteno, pero ninguna en rojo, que es el color de la astaxantina. Notablemente, el color solo comenzó a aparecer 6 días después de la siembra en placa, probablemente debido a la baja expresión de los genes de la vía de biosíntesis de carotenoides bajo el control del interruptor de maltosa. El análisis genético por PCR de colonias mostró que no se habían integrado los genes de la biosíntesis de astaxantina. Posteriormente se eligieron colonias representativas productoras de p-caroteno para la transformación con genes de la biosíntesis de astaxantina.
6.4. Producción de Astaxantina por la Cepa de Producción de Farneseno
La cepa de producción de astaxantina se generó a partir de la cepa de producción de farneseno que comprende pGAL 3 unido operativamente a GGPPS, una copia del ácido nucleico que codifica Crtl y cuatro copias de ácidos nucleicos que codifican CrtYB. La vía de la astaxantina se completó añadiendo ya sea los genes Hp.CrtZ y Hp.Bkt o Pa.CrtZ y Ps.CrtW. Ambos conjuntos de enzimas dieron lugar a colonias rojas indicativas de la producción de astaxantina (Figura 11). Este experimento ilustra que la astaxantina podría permanecer dentro de las células en presencia de farneseno. Después de la producción y recuperación de farneseno, las células microbianas agotadas con astaxantina dentro de las células, pueden aprovecharse como alimento para animales (por ejemplo, salmón de piscifactoría).
6.5. Producción Concurrente de Astaxantina y Farneseno por Cepas de Levadura
La Figura 12 muestra la producción de farneseno por cepas manipuladas genéticamente para producir carotenoides (P-caroteno o astaxantina). La cepa A (también denominada cepa Y021) es la cepa de producción de farneseno base descrita en la sección 6.1, y la cepa B es una variante de la cepa A usada para la introducción de los genes de la vía de los carotenoides. La cepa C se deriva de la cepa B que comprende genes adicionales como se muestra en la Figura 12. Las cepas adicionales que se muestran en la Figura 12 se derivan de la cepa C. En el "estado inactivo" de producción, todas las cepas crecen (como se mide de acuerdo con la densidad celular en estado inactivo DO600) y producen farneseno (medido por el título de farneseno en estado inactivo como se muestra por el ensayo basado en UV). Ver la Sección 6.2. En el estado inactivo, todas las cepas manipuladas genéticamente para la producción de carotenoides también producen carotenoides (datos no mostrados). Durante el estado activo (cuando se activa la producción de isoprenoides), los cultivos que contienen los genes de carotenoides no crecen tan bien como en el estado inactivo (cuando no está activa la producción de isoprenoides). Ver la Figura 12. Las cepas también producen mucho menos farneseno que la cepa A, o su cepa parental B. Este resultado ilustra que puede producirse farneseno primero, y luego se puede activar la producción de carotenoides.
En la Figura 12, la densidad celular (DO600) se midió como sigue. Una muestra de 8 pL de un cultivo celular se combinó con 92 pL de Diluyente Triton OD (20 g/L Triton X-114, 200 ml/L PEG 200, 200 ml/L 100 % etanol, agua en reposo) en una placa de 96 pocillos, la solución se agitó a 1000 RPM durante 6 minutos y se determinó la DO600 midiendo la absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
En la Figura 12, el título de farneseno se midió mediante el uso del caldo completo usando el ensayo basado en UV descrito en la presente descripción. Ver la Sección 6.2. Para medir el título de farneseno pueden usarse otros métodos adecuados, tal como la cromatografía de gases.
En general, para condiciones de precultivo, las cepas se cultivaron y se colocaron en placas de 96 pocillos estériles (1,1 ml de volumen de trabajo; Axygen) que contenían 360 pl de medio semilla para muestras de aves (BSM, originalmente descrito por van Hoek y otros (2000). Para las condiciones de precultivo, la fuente de carbono fue típicamente una mezcla de sacarosa al 1,4 % y maltosa al 0,7 %, a menos que se indique de cualquier otra manera. Las colonias individuales se colocaron en cada pocillo y se incubaron durante aproximadamente 72 horas a 33,5 °C, 80 % de humedad y 1000 rpm (Infors Multitron; At R Biotec).
Para los experimentos de producción de farneseno, los cultivos saturados mencionados anteriormente se diluyeron 1/25 en placas estériles de 1,1 ml que contenían 145 pl de BSM. Típicamente, la fuente de carbono fue sacarosa al 4 % o una mezcla de sacarosa al 2,3 % y maltosa al 1,7 %, a menos que se indique de cualquier otra manera. Después de 72 horas de cultivo, se realizó la extracción de farneseno añadiendo a cada pocillo 600 pl de alcohol isopropílico (IPA). Después de 30 minutos de incubación, se transfirieron 8 pl a una placa de ensayo de fondo transparente que contenía 192 |_il de IPA. La concentración de farneseno se midió mediante absorbancia UV a 222 nm en un lector de placas SpectraMax.
6.6. Producción de p-Caroteno y Astaxantina verificada por HPLC
6.6.1. Desarrollo del método de extracción:
Se probaron varios métodos de extracción para extraer betacaroteno y astaxantina de las células. La idea es precipitar las células y extraer los compuestos del precipitado, ya que los carotenoides no parecen secretarse fuera de las células, a juzgar por el color del sobrenadante. Inicialmente, los precipitados se solubilizaron en DMSO y los compuestos se extrajeron mediante el uso de varios solventes no polares que se diluyeron adicionalmente en una solución de metanol-THF antes de inyectarse en la HPLC. Las combinaciones de solventes que se probaron fueron las siguientes: a) heptano 100 % b) mezcla 1:1 de metanol-THF c) mezcla 1:1 de heptano-THF d) mezcla 1:1 de metanol-acetona y d) pentano 100 %. Las extracciones también se compararon con la condición "sin extracción", en la que el extracto de DMSO se diluyó directamente en una solución de metanol-THF y se analizó por HPLC.
Protocolo de preparación de muestras: en una preparación de muestras típica, se centrifugaron 120 pl del caldo de células completas a 13000 rpm durante 60 s. Se descartó el sobrenadante transparente y después el precipitado de color amarillo brillante/naranja resultante se reconstituyó en aproximadamente 400 pl de DMSO y se agitó en vórtex durante 15 s para mezclar los contenidos. La mezcla resultante se centrifugó a la misma velocidad durante 30 s y luego se añadieron 100 pL de este extracto DMSO a 200 pL de la solución 1:1 de metanol-THF y se analizaron por HPLC-UV.
Resultados y discusión: Todas las extracciones se realizaron con la misma muestra. El tamaño de la muestra y los volúmenes de solvente también permanecieron iguales en todo momento. Se eligió la mejor condición de extracción posible comparando las áreas relativas de los picos de diferentes extracciones. Se debe señalar que no se realizaron otras correcciones para tener en cuenta las diferencias en las densidades de los solventes. Notamos que las extracciones en las que se usó un heptano o pentano puro dieron como resultado el área máxima del pico de betacaroteno y esto fue comparable a la condición de "no extracción". Se eligió la condición de solo DMSO para evitar una etapa adicional en el procedimiento de extracción. Además, se ha informado que el DMSO rompe las membranas celulares que ya pueden desempeñar un papel en una extracción/disociación eficiente de los carotenoides de las células. Sin embargo, la única etapa de extracción no está completa ya que no produjo la decoloración completa del precipitado celular resultante (mediante inspección visual). El tratamiento del extracto de DMSO a 70 °C durante aproximadamente 10 min tampoco condujo a una extracción completa (los carotenoides son estables hasta 80 °C)3. En un experimento de seguimiento, la extracción se puede repetir al menos tres veces para verificar las cantidades de material que aún quedan en el precipitado.
6.6.2. Preparación de Estándares
El betacaroteno era muy difícil de disolver en solventes como acetato de etilo, metanol o isopropanol, incluso a un nivel de 50 mg/L. Si bien sería ideal usar solventes altamente no polares como heptano, hexano o pentano para disolver el compuesto, la inmiscibilidad de los solventes con la fase móvil de HPLC hizo que fuera una elección difícil. En este ejemplo, se usó diclorometano para preparar una solución concentrada de betacaroteno seguido de una dilución adicional de esa solución concentrada en acetona para obtener las concentraciones finales de la solución de betacaroteno requeridas para los estándares de calibración. Las soluciones se transfirieron inmediatamente a la botella ámbar, se purgaron con nitrógeno (para eliminar el aire del espacio superior) y se taparon. Luego, los calibradores se dividieron en alícuotas en viales GC (~ 300 pL cada uno) y se almacenan en el congelador a -80 °C. Se extrae cada alícuota, se descongela a temperatura ambiente y se analiza cuando es necesario. Los viales se descartaron después de un solo uso.
6.6.3. Desarrollo del método HPLC:
Los intentos iniciales de eluir los estándares de betacaroteno mediante el uso de una columna de HPLC de fase reversa C18 o C8 con las combinaciones de solventes de la fase móvil de metanol, acetonitrilo y agua no funcionaron.4 La mayor parte de la literatura sugiere el uso en la fase móvil de solventes clorados no polares o un éter para eluir el betacaroteno, mediante el uso de la columna de fase inversa.56 Dado que el uso de cloroformo o diclorometano presenta un riesgo elevado para la salud en comparación con el uso de éter, elegimos tetrahidrofurano como cosolvente en la fase móvil. Los parámetros de columna y elución son los siguientes: Tabla 3: Columna de HPLC y parámetros de elución.
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La Figura 9 muestra varias muestras de cepas extraídas y analizadas usando las condiciones mencionadas en este informe: A) la cepa de origen de la GGPPS sin genes aguas abajo, de acuerdo a lo esperado, no muestra signos de betacaroteno o astaxantina; B) la cepa parental que contiene solo genes que codifican betacaroteno muestra claramente la presencia de los mismos después de la extracción y el análisis. Por el momento, la identidad del segundo pico a los 13,3 minutos no es clara. Sospechamos que este es el análogo dihidro del betacaroteno que es un subproducto conocido del gen crtYB (ref: Verwaal y otros, 2007) C) la cepa hija muestra claramente la presencia de astaxantina a 1,4 min junto con betacaroteno y otros carotenoides potenciales. No es sorprendente encontrar betacaroteno en la cepa hija. Se desconocen las identidades de otros picos más pequeños y podrían ser otros carotenoides aguas abajo (más polares que el betacaroteno, probablemente formas oxigenadas) o también pueden contener alguna degradación o análogos transformados de la astaxantina.
6.7. Método final de extracción de carotenoides y resultados analíticos:
La Tabla 4 ilustra varias cepas que se generaron a partir de una cepa isogénica que comprende los genes de la vía del mevalonato de S. cerevisiae integrados cromosómicamente. Los genes adicionales (por ejemplo, farneseno sintasa, GGPP sintasa, betacaroteno o genes de la vía biosintética de astaxantina) incorporados en diferentes cepas, se muestran en la Tabla 4.
Las células se cultivaron en matraces durante 48 horas y luego se cambiaron a glucosa al 1,8 % y galactosa al 0,2 % durante 48 horas antes de la extracción. Las cepas de las que se extrajeron los carotenoides se describen en la Tabla 4.
Tabla 4: Cepas de las que se extrajeron los carotenoides. Estas cepas se generaron a partir de una cepa productora de fameseno derivada de Y337 (Westfall y otros, 2012) en la que se eliminó la amorfadieno sintasa y se reemplazó con farneseno sintasa,
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Las 6 etapas usadas para la extracción de muestras son las siguientes:
1. Se añaden 400 uL de WCB a un tubo de microcentrífuga de 2,2 ml.
2. El precipitado se forma después de que las muestras se centrifugan durante 45 segundos a 13000 rpm en una microcentrífuga de mesa.
3. El sobrenadante incoloro se elimina con pipeta.
4. Se agregaron 1000 uL de DMSO al precipitado, se agitó en vórtex durante 30 segundos dos veces.
5. Se centrifugó 45 segundos a 13000 rpm en una microcentrífuga de mesa.
6. El precipitado se revisó para el color restante- se agregó 150 ul de sobrenadante a 150 ul de mezcla de MeOH:THF 1:1 en un vial de color ámbar con inserto, listo para HPLC.
Los rastros de HPLC de la cepa de origen 1, la cepa parental 1 y la cepa progenie 1 que muestran claramente que no hay carotenoides presentes en ausencia de los genes de p-caroteno, que en las colonias más rojas están presentes dos picos claros (p-caroteno a los 11,6 minutos y un pico que se cree que es hidroxil p-caroteno a los 13,3 minutos), y astaxantina (1,42 minutos) y varios otros carotenoides, así como algo de p-caroteno (Figura 9). La Figura 9 demuestra que la cepa progenie 1 produce astaxantina.
6.8. Ejemplo: Coproducción de Carotenoides y un Sesquiterpeno y su Impacto en la Producción de Sesquiterpeno y en la Densidad Celular
Este ejemplo ilustra que una cepa de alto flujo de farneseno puede manipularse genéticamente de manera adicional para coproducir carotenoides sin reducir sustancialmente la producción de farneseno y el rendimiento de biomasa celular.
6.8.1. Ensamblaje de ADN y transformaciones
Las construcciones de ADN multicomponente se generaron mediante el uso de métodos de ensamblaje de ADN como se describió anteriormente (De Kok y otros (2014) ACS Synth. Biol. 21;3(2):97-106. doi: 10.1021/sb4001992; Serber y otros, Patente de Estados Unidos Núm. 8,221,982). Los fragmentos lineales de casetes de ADN del donador se transforman en una célula hospedera para su integración en el genoma de la célula hospedera de acuerdo con los métodos descritos en Horwitz y otros Cell Syst. 29 de julio;1(1):88-96 (2015) y DiCarlo y otros Nucleic Acids Res., 41 (2013), páginas 4336-4343). La transformación en un hospedero para la integración genómica se realizó mediante el uso de métodos de LiAc optimizados para S. cerevisiae (Gietz y Woods, Methods Enzymol. 2002; 350:87-96). Cada una de las integraciones sin marcador se confirmó mediante el uso de una PCR de colonias.
6.8.2. Cultivo de cepas y medios.
La coproducción de farneseno y carotenoides se llevó a cabo en una placa de microtitulación de 96 pocillos en agitación a 1000 rpm con 80 % de humedad relativa. Los cultivos que se usaron para la inoculación de las placas de microvaloración se mantuvieron en placas de agar de medio completo sintético a 28 °C con glucosa al 2 %, maltosa al 1 %, lisina 2 g/L y G418 50 pg/mL. Las colonias se colocaron en pocillos en placas de microtitulación de 96 pocillos estériles (volumen de trabajo de 1,1 ml; oxígeno) que contenían 360 ml de medio de crecimiento líquido definido semilla para muestras de aves (BSM) con 2 % de carbono total (1,4 % de sacarosa, 0,7 % de maltosa) y lisina 1 g/L. Esta placa de precultivo se incubó durante 72 h a 28 °C, 80 % de humedad y 1000 rpm (Infors Multitron; ATR Biotec). La biomasa generada inicial se diluyó 1/25 en dos placas estériles de 1,1 ml que contenían (i) 360 ml de medio de crecimiento líquido definido semilla para muestras de aves que contenía sacarosa al 4 % como fuente de carbono y esta placa se usó para medir el rendimiento de biomasa y las especies de carotenoides y ii) 150 ul de medio de crecimiento definido con sacarosa al 4 % como fuente de carbono. La primera placa se incubó durante cuatro días antes de usarse para medir el rendimiento de biomasa y la producción de carotenoides mediante el uso del ensayo UV-UPLC. Después de incubar la segunda placa durante 3 días se midió el farneseno, se extrajo el pocillo completo con isopropanol y se midió mediante el uso de un ensayo basado en UV. Ver la Sección 6.2.
6.8.3. Resultados: Producción de cantaxantina y otros carotenoides intermediarios
En este experimento, la cepa Y011 productora de farneseno se usó como cepa base de producción de farneseno. La cepa Y011 es otra cepa regulable que produce farneseno que comprende los elementos genéticos descritos en el Ejemplo 6.1, y es una variante de la cepa Y021 descrita en la Sección 6.5. Las secuencias de fitoeno sintasa/licopeno ciclasa de Phycomyces blakesleeanus, fitoeno sintasa/licopeno ciclasa de Neurospora crassa, fitoeno desaturase de Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) y p-caroteno cetolasa de Paracoccus sp. optimizadas por codones para S. cerevisiae. se integraron inicialmente en el genoma de la célula hospedera usando construcciones diseñadas como casetes de expresión divididos convergentes. Además, también se sobreexpresaron la BTS1 (geranilgeranil difosfato sintasa), ERG8 (fosfomevalonato quinasa) y MVD1 (mevalonato pirofosfato descarboxilasa) nativas de S. cerevisiae, después de integrar una segunda construcción dividida en el genoma de la célula hospedera. Ambas construcciones se integraron en el genoma de Y011 como se describió anteriormente y la expresión génica de cada construcción se indujo mediante el uso del promotor fuerte bidireccional pGAL1/10 nativo fuerte. Las cepas se construyeron como se describió anteriormente (ver Materiales y Métodos) y los transformantes se seleccionaron en una placa de agar que contenía 50 pg/ml de G418. Las integraciones correctas se verificaron mediante PCR de colonias. Las cepas Y924 e Y925 son dos clones resultantes con integraciones correctas.
Evaluamos la producción de farneseno y carotenoides después de cultivar las células en un medio semilla para muestras de aves definido con sacarosa al 4 % durante 3 días (farneseno) o medio con sacarosa al 4 % solo durante 4 días (carotenoide y biomasa).
Nuestros datos indican que las cepas coproductoras de carotenoides Y924 e Y925 (derivadas de Y011) pueden producir una cantidad sustancial de cantaxantina, licopeno, fitoeno y p-caroteno. Sin embargo, el rendimiento de biomasa fue significativamente más bajo que el de la cepa parental (que produce solo farneseno). Como resultado, estas cepas produjeron menos farneseno que la parental en la placa de 96 pocillos. En la Figura 13 se muestra una reducción sustancial tanto de la producción de farneseno como del rendimiento de biomasa. Los efectos negativos de la coproducción de un alto nivel de carotenoides en cepas productoras de farneseno nos llevaron a nuestra próxima hipótesis de que la expresión de genes que codifican la vía de los carotenoides a un nivel más bajo nos dirigirá a la generación de cepas más saludables.
6.9. Ejemplo: Coproducción de Carotenoides y Sesquiterpeno sin Reducir el Rendimiento de Sesquiterpeno y la Biomasa
Este ejemplo ilustra que la vía de los carotenoides se puede modificar de manera que el producto isoprenoide primario, farneseno, se pueda coproducir con un carotenoide sin sacrificar la cantidad de farneseno o el rendimiento de biomasa, en comparación con una célula hospedera parental manipulada genéticamente para producir solo farneseno. En este ejemplo, la vía "superior" de carotenoides mostrada en la Figura 2 se expresó usando promotores de diferentes potencias, cada promotor unido operativamente a los ácidos nucleicos que codifican las enzimas de la vía biosintética de carotenoides.
En el Ejemplo 6.7, todos los genes que codifican la vía de los carotenoides, incluida una segunda copia de BTS1 (los genes GGPS nativos), se expresaron usando nuestro promotor bidireccional más fuerte, pGAL1/10 (Tabla 5). Para probar la hipótesis de que la expresión de genes que codifican la vía de los carotenoides a un nivel más bajo nos conducirá a cepas coproductoras más saludables, elegimos un promotor nativo (pGAL3) y un promotor semisintético (pGAL2_v10) que tienen una fuerza de promotor diferente en relación con pGAL1 (Tabla 5). La fuerza de promotor del promotor pGAL2_v10 semisintético es aproximadamente equivalente a la del promotor pGAL7 endógeno.
Tabla 5. Fuerza de promotor relativa como se mide de acuerdo con la expresión de GFP en la cepa CEN.PK2 de tipo silvestre mediante el uso de galactosa como fuente de azúcar
Figure imgf000037_0001
En este experimento, expresamos solo la vía "superior" de carotenoides que conduce a la producción de p-caroteno (ver Figura 2), y no sobreexpresamos una segunda copia de BTS1. En la cepa productora de farneseno (Y011) descrita anteriormente, integramos en el genoma las secuencias optimizadas por codones para S. cerevisiae de la fitoeno sintasa/licopeno ciclasa (CrtYB) y la fitoeno desaturasa (CrtI) de Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). Las construcciones se diseñaron como casetes de expresión convergentes. Probamos diferentes combinaciones de promotores para expresar la vía "superior" de carotenoides. Evaluamos las producciones de farneseno, biomasa y carotenoides después de cultivar las células durante 3 días en placas de microtitulación de 96 pocillos, como se describe anteriormente. Nuestros datos indican que estas nuevas cepas coproductoras, Y854 (pGAL3> CrtYB; pGAL2 _ v10> CrtI) Y855 (pGAL3> CrtYB; pGAL3 > CrtI) coprodujeron al menos 1,0 mg/L de pcaroteno y 1,93 mg/L en placas de microtitulación, respectivamente, sin impacto en la producción de farneseno y biomasa. Ver la Figura 14A y 14B. Además, estas cepas produjeron aproximadamente de 1,1 a 1,4 mg/L de fitoeno, lo que sugiere que una mayor optimización de la vía puede conducir potencialmente a la coproducción de niveles más altos de p-caroteno sin afectar la producción de farneseno.
6.10. Ejemplo: Coproducción/Producción Secuencial de Sesquiterpeno y Carotenoides y su Proporción de Producción
Este ejemplo ilustra la proporción de sesquiterpeno y carotenoide que pueden coproducirse o producirse secuencialmente sin afectar en gran medida la producción del isoprenoide primario, el sesquiterpeno o el rendimiento de biomasa.
6.10.1. Ensamblaje de ADN y Transformaciones
Las construcciones de ADN multicomponente se generaron mediante el uso de métodos de ensamblaje de ADN como se describió anteriormente (De Kok y otros (2014) ACS Synth. Biol. 21;3 (2):97-106. doi: 10.1021/sb4001992; Serber y otros, Patente de Estados Unidos Núm. 8.221.982). Los fragmentos lineales de casetes de ADN del donador se transforman en una célula hospedera para su integración en el genoma de la célula hospedera de acuerdo con los métodos descritos en Horwitz y otros (2015) y DiCarlo y otros (2013). La transformación en un huésped para la integración genómica se ejecutó usando los métodos de LiAc optimizados para S. cerevisiae (Gietz y Woods, 2002). Cada una de las integraciones sin marcador se confirmó mediante el uso de una PCR de colonias. Para la cepa construida usando los promotores sensibles al estradiol, Y440, los genes que codifican GGPPS de Blakeslea trispora, CrtI de Xanthophyllomyces dendrorhous y fi- caroteno cetolasa y fi- caroteno hidroxilasa de Haematococcus pluvialis se expresaron usando el promotor sensible a estradiol más fuerte descrito anteriormente (Mclssac y otros (2014) Nucleic Acids Res. 42:e48) mientras que se usó CrtYB de Xanthophyllomyces dendrorhous que se expresó usando un promotor semisintético (pGAL2_v10).
6.10.2. Medios y cultivo de cepas con Estradiol.
La coproducción de farneseno y carotenoides se llevó a cabo en una placa de microtitulación de 96 pocillos en agitación a 1000 rpm con 80 % de humedad relativa. Los cultivos que se usaron para la inoculación de las placas de microvaloración se mantuvieron en placas de agar de medio completo sintético a 28 °C con glucosa al 2 %, maltosa al 1 %, lisina 2 g/L y G418 50 jg/mL. Las colonias se colocaron en pocillos en placas de microtitulación de 96 pocillos estériles (volumen de trabajo de 1,1 ml; oxígeno) que contenían 360 ml de medio de crecimiento líquido definido semilla para muestras de aves (BSM) con 2 % de carbono total (1,4 % de sacarosa, 0,7 % de maltosa) y lisina 1 g/L. Esta placa de precultivo se incubó durante 72 h a 28 °C, 80 % de humedad y 1000 rpm (Infors Multitron; ATR Biotec). La acumulación de biomasa inicial se diluyó 1/25 en dos placas estériles de 1,1 ml que contenían (i) Placa 1: 360 ml de medio de crecimiento líquido definido semilla para muestras de aves que contenía como fuente de carbono sacarosa al 4 % y esta placa se usó para medir la concentración de biomasa (g peso seco celular por litro de cultivo) y especies de carotenoides en ausencia o presencia de 15 nM de estradiol (en lo sucesivo, "coproducción") y (ii) Placa 2: 150 ul de medio de crecimiento definido con 4 % de sacarosa como fuente de carbono que contiene una emulsificación oleosa de surfactante, en ausencia o presencia de 15 nM de estradiol y se usó para medir la producción de farneseno. En la segunda ronda de inoculación, la biomasa de la Placa 1 (sin adición de estradiol) se centrifugó y el 25 % de la biomasa se inoculó en (a) un volumen total de 360 ml de medio de crecimiento líquido definido semilla para muestras de aves que contenía 4 % de sacarosa y estradiol 50 mM o (b) 150 ul de medio de crecimiento definido con sacarosa al 4% y estradiol 50 mM que contiene un tensioactivo oleoso (en lo sucesivo denominado "secuencial"). Las placas inoculadas se usaron para medir el rendimiento de biomasa y las especies de carotenoides en un proceso secuencial o se usaron para medir la producción de farneseno, respectivamente. Después de 24 a 72 horas de incubación se midió la producción de biomasa, farneseno y carotenoides.
6.10.3. Protocolo de extracción de carotenoides/xantofilas:
Después del cultivo, las células se centrifugan a velocidad máxima durante 5 min para precipitarlas. El sobrenadante se elimina por pipeteo. Se agrega DMSO (dimetilsulfóxido) al precipitado, añadiendo 2 veces el volumen final del cultivo. El recipiente se sella y se incuba a temperatura ambiente en un agitador a 1500 rpm durante 30 min. A continuación, se añade n-heptano de igual volumen a la mezcla de células DMSO. Este se sella y se incuba de nuevo a TA, 1500 rpm, 30 min. A continuación, a la mezcla de células DMSO-heptano se le añade solución salina tamponada con fosfato pH 7,0, aproximadamente 1/6 del volumen de cultivo, para aumentar la polaridad de la capa de DMSO. Esto se agita durante 5 minutos más. A continuación, la mezcla se centrifuga a 5000 x g durante 5 min para formar las capas y precipitar el debris celular. Se transfiere a un nuevo recipiente una alícuota de la capa superior de heptano que se puede cargar en un instrumento analítico para su análisis.
6.10.4. Protocolos de ensayo de Carotenoides/Xantofilas:
6.10.4.1. Método UHPLC-DAD para la detección y cuantificación de Carotenoides y Xantofilas:
Las muestras extraídas y las curvas de calibración se procesan en un UHPLC de la serie Thermo Scientific Vanquish con detector de matriz de diodos (DAD). Se inyecta en la columna un volumen de muestra de 2 ul (Agilent Eclipse Plus C82,1 uM x 100 mM 1,8) usando un método de gradiente de 8,5 minutos desde el 60 % de solvente B al 90 % B (Solvente A: 50 % MeOH/agua 5 mM acetato de amonio, 0,1 % HOAc; Solvente B: 10 %/80%/10% MeOH/Agua IPA 5 mM Acetato de amonio 0,1 % HOAc). El método que se usa tiene una velocidad de flujo de 0,5 ml/min y una temperatura de columna de 45 grados Celsius. Las longitudes de onda que se usaron para la detección son 260 nm (fitoeno) 471 nm (licopeno), 454 nm (P-caroteno, cantaxantina y astaxantina).
6.10.4.2. Medición de Xantofilas en extractos de células enteras por espectrometría de masas (MS):
Las muestras extraídas junto con los estándares de la curva de calibración premezclados se envían a la base de datos Themis para generar una lista de trabajo y luego, a su vez, se procesan en Agilent 6545 QTOF usando la fuente de ionización química a presión atmosférica (APCI) y el modo automsms. Se inyecta un volumen de 5 ul en la columna (50 x 2,1 mm de d.i. Poroshell 120 SB-C8, pieza núm. 689775-906) usando un método de gradiente de 3 minutos desde un 40 % de B hasta un 100 % de solvente B (fase móvil A: 50 % MeOH/agua 5 mM Acetato de Amonio, 0,1 % HOAc; fase móvil B: 10%/80%/10% MeOH/IPA/Agua 5 mM Acetato de amonio 0,1 % HOAc. El método que se usó tiene una velocidad de flujo de 0,4 ml/min y una temperatura de la columna de 60 grados Celsius. Se crea una lista preferida de analitos para generar un patrón de fragmentación MS/MS para la posterior identificación de analitos producidos. Luego, los datos se analizan y calculan mediante el uso de Qual y Quant Masshunter para identificar el producto y generar la medición del título.
6.10.5. Resultados de Coproducción
Este resultado describe los resultados del diseño experimental de la coproducción descrito en la Sección 6.9.2. La cepa parental (Y021), que es una cepa que produce farneseno de alto flujo, produce farneseno tanto en ausencia como en presencia de estradiol (15 nM), pero no produce carotenoides ni xantofilas en ninguna de las condiciones de crecimiento.
Como se describió anteriormente, la cepa Y440 (descrita en la Sección 6.10.1) está modificada genéticamente para producir farneseno y carotenoides. Cuando los genes que codifican la biosíntesis de carotenoides se inducen a un nivel bajo (mediante la adición de estradiol 15 nM), entonces se produce p-caroteno, así como farneseno. La diferencia en la producción de farneseno en la cepa parental Y021 frente a la cepa Y440 fue insignificante (por ejemplo, menos del 5 % en peso). La diferencia en la concentración de biomasa (g de peso seco celular por litro de cultivo) en la cepa parental Y021 frente a la cepa Y440 también fue insignificante (por ejemplo, menos del 5 %). Estos resultados demuestran la producción y secreción de un producto (es decir, farneseno) en el medio de cultivo y un carotenoide asociado a las células (p-caroteno), sin afectar en gran medida la cantidad de la producción de farneseno o el rendimiento de biomasa. En este experimento, se determinó que la relación entre el peso de pcaroteno y el peso de farneseno producido por placa fue de aproximadamente 0,01 %.
6.10.6. Resultados de la Producción Secuencial
Esta sección de resultados describe el diseño experimental de la producción secuencial que se describe en 6.10.2. En el primer cultivo de producción (PC), cuando no se inducen los genes que codifican la producción de carotenoides, se produce farneseno, pero no p-caroteno. Después de la transferencia del 25 % de este cultivo a una segunda fermentación en la que los genes que codifican las enzimas biosintéticas de carotenoides y xantofilas, tanto un carotenoide (p-caroteno) como las xantofilas (cantaxantina y luteína/zeaxantina), se inducen a un nivel alto debido a la presencia de estradiol 50 nM. Esto demuestra la producción secuencial en la que se produce el farneseno en el primer cultivo de producción y los carotenoides (y la producción incidental de farneseno) se producen en el segundo cultivo de producción. En este experimento, la relación entre el peso de p-caroteno y el peso de farneseno producido a partir del peso de p-caroteno es de aproximadamente 0,03 %.
6.11. Ejemplo: Coproducción de farneseno y carotenoides en un cultivo en fermentador
La cepa Y440 se cultivó en un fermentador de 0,5 L mediante el uso del protocolo descrito en Meadows y otros (2016), excepto que el nutrimento de azúcar fue jarabe de caña de Brasil. Después de la inoculación con Y440 se añadió estradiol 15 nM al medio en el fermentador de 0,5 L, y en todas las adiciones de medio posteriores, de modo que la concentración de estradiol en el fermentador se mantuvo a 15 nM. Después de cultivar durante más de 48 horas, el cultivo contenía 4,8 g de farneseno por kg de caldo de células completas y 7 mg de carotenoides (licopeno más p-caroteno). Esto corresponde a una relación de producción aproximada de 0,14 % de carotenoides a farneseno en peso.
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2. Meadows, AL, y otros, Rewriting yeast central carbon metabolism for industrial isoprenoid production. Nature, 2016. 537(7622): pág. 694-697.
3. Verwaal, R., y otros, High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Appl Environ Microbiol, 2007.
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Ċ
12. McIssac, RS y otros (2014) Nucleic Acids Res.42: e48. Doi: 10.1093/nar/gkt1402

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un método para la coproducción de dos o más isoprenoides, el método comprende:
    a. cultivar, en un medio de cultivo, una célula hospedera modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una primera vía biosintética para producir un primer isoprenoide y con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas en una segunda vía biosintética para producir un segundo isoprenoide, que tiene un peso molecular diferente del primer isoprenoide; y
    b. recuperar el primer isoprenoide; y
    c. recuperar el segundo isoprenoide,
    en donde el primer isoprenoide es un sesquiterpeno y el segundo isoprenoide es un carotenoide, en donde un flujo de carbono hacia la producción de carotenoide se reduce en comparación con un flujo de carbono hacia la producción de sesquiterpeno.
  2. 2. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cultivo y la recuperación comprenden:
    a. cultivar el inóculo individual que comprende la célula hospedera para generar una población de células hospederas;
    b. cultivar la población de células hospederas bajo condiciones para producir el primer isoprenoide a partir de la población de células hospederas, en donde las condiciones no activan la producción del segundo isoprenoide;
    c. recuperar el primer isoprenoide de la población;
    d. después de separar el primer isoprenoide, cultivar la población o una subpoblación de las células hospederas bajo condiciones para activar la producción del segundo isoprenoide; y
    e. recuperar el segundo isoprenoide.
  3. 3. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer isoprenoide se libera predominantemente de la célula hospedera al medio de cultivo y el segundo isoprenoide permanece predominantemente dentro de la célula.
  4. 4. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo isoprenoide es uno o más de astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, p-caroteno, licopeno y luteína.
  5. 5. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cantidad del primer isoprenoide producido durante la coproducción con el segundo isoprenoide es al menos aproximadamente el 90 % de la cantidad del primer isoprenoide producido por una célula hospedera parental, en donde dicha célula hospedera parental se modifica genéticamente para producir el primer isoprenoide pero no el segundo isoprenoide.
  6. 6. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo isoprenoide es licopeno y la célula hospedera comprende:
    a. un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y
    b. un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa.
  7. 7. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo isoprenoide es P-caroteno y la célula hospedera comprende:
    a.
    (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y
    (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa; o
    (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que tiene actividades de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa; y
    b. un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa.
  8. 8. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo isoprenoide es cantaxantina y la célula hospedera comprende:
    a.
    (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y
    (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa; o
    (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que tiene actividades de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa;
    b. un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa; y
    c. un ácido nucleico heterólogo que codifica una p-caroteno cetolasa.
  9. 9. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo isoprenoide es zeaxantina y la célula hospedera comprende:
    a.
    (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y
    (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa; o
    (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que tiene actividades de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa;
    b. un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa; y
    c. un ácido nucleico heterólogo que codifica la p-caroteno hidroxilasa.
  10. 10. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo isoprenoide es astaxantina y la célula hospedera comprende:
    a.
    (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno sintasa; y
    (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa; o
    (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima bifuncional que tiene actividades de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa;
    b. un ácido nucleico heterólogo que codifica una fitoeno desaturasa;
    c.
    (i) un ácido nucleico heterólogo que codifica una p-caroteno cetolasa; y
    (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una p-caroteno hidroxilasa; o
    (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica una citocromo p450 hidroxilasa y una cetolasa capaces de convertir p-caroteno en equinenona y posteriormente en p-criptoxantina y astaxantina; y (iv) un ácido nucleico heterólogo que codifica una citocromo p450 reductasa que interactúa con la citocromo p450 hidroxilasa y la cetolasa.
  11. 11. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo isoprenoide es luteína y la célula hospedera comprende:
    a. un ácido nucleico heterólogo que codifica una licopeno ciclasa; y
    b. un ácido nucleico heterólogo que codifica una 5-caroteno p-ciclasa;
    c. un ácido nucleico heterólogo que codifica la hidroxilasa de anillo p; y
    d. un ácido nucleico heterólogo que codifica una caroteno £-monooxigenasa.
  12. 12. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula hospedera comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica una poliprenil sintasa para producir un poliprenil difosfato.
  13. 13. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula hospedera comprende además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas de la vía del mevalonato.
  14. 14. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula hospedera comprende además ácidos nucleicos heterólogos que codifican todas las enzimas de la vía del mevalonato.
  15. 15. El método para la coproducción de dos o más isoprenoides de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula hospedera es Saccharomyces cerevisiae.
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