BR112019014326A2 - Método para coprodução de dois ou mais isoprenóides, composição, ração animal, e, célula hospedeira - Google Patents

Abstract

são aqui providos composições e métodos para coprodução e recuperação de dois ou mais isoprenóides a partir de uma única célula recombinante.

Description

MÉTODO PARA COPRODUÇÃO DE DOIS OU MAIS ISOPRENÓIDES, COMPOSIÇÃO, RAÇÃO ANIMAL, E, CÉLULA HOSPEDEIRA [001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório

U.S. 62/450.492, depositado em 25 de janeiro de 2017, intitulado Coprodução de Isoprenóides, cujo conteúdo é aqui incorporado pela referência na sua íntegra.

1. CAMPO DA INVENÇÃO [002] São aqui providos composições e métodos usados para coprodução de dois ou mais isoprenóides de células microbianas durante a fermentação, e valorização de células microbianas usadas.

2. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [003] Isoprenóides são ubíquos na natureza. Estes compreendem uma família diversa de mais de 40.000 produtos individuais, muitos dos quais são vitais para organismos vivos. Isoprenóides funcionam para manter a fluidez celular, transporte de elétrons, e outras funções metabólicas. Um grande número de isoprenóides naturais e sintéticos apresenta muitas aplicações, tais como produtos farmacêuticos, cosméticos, perfumes, pigmentos e corantes, fungicidas, antissépticos, nutracêuticos e intermediários químicos finos.

[004] Em particular, carotenóides são distribuídos em peixe, animais e crustáceos. O carotenóide vermelho astaxantina tem sido usado como uma fonte de pigmentação na indústria, por exemplo, para a carne de salmonídeo na indústria de aquacultura. Ukibe et al., 2009, Appl. Environ. Microbiol. 75:7205-7211. Astaxantina constitui um dos maiores custos da alimentação de salmão, e é necessária para a cor vermelha da carne de salmão.

[005] Tradicionalmente, isoprenóides têm sido fabricados por extração de fontes naturais tais como plantas, micróbios e animais. Entretanto, o rendimento por meio da extração é geralmente muito baixo, em virtude de inúmeras limitações significativas. Primeiro, a maioria dos isoprenóides se

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2/105 acumula na natureza apenas em pequenas quantidades. Segundo, os organismos usados como fonte em geral não são receptivos ao cultivo em grande escala, que é necessário para produzir quantidades comercialmente viáveis de um isoprenóides desejado.

[006] Avanços têm sido realizados no campo de biologia sintética, e atualmente inúmeros isoprenóides estão sendo produzidos em uma escala industrial. Contudo, dada as quantidades muito elevadas de produtos de isoprenóide necessários para aplicação comercial, ainda permanece uma necessidade de melhorar sistemas e procedimentos de fermentação que podem produzir isoprenóides mais eficientemente do que os disponíveis com as tecnologias atuais. Igualmente, a produção eficiente de carotenóides, tal como astaxantina, a partir de fonte renovável é desejável.

[007] Modalidades da presente invenção encontram estas e outras necessidades.

3. SUMÁRIO [008] São aqui providos composições e métodos usados para coprodução de dois ou mais isoprenóides a partir de células hospedeiras geneticamente modificadas para produzir isoprenóides, e valorização de células hospedeiras usadas, em particular, células hospedeiras microbianas usadas.

[009] Em um aspecto, são aqui providas células hospedeiras geneticamente modificadas para produzir um primeiro isoprenóide e geneticamente modificadas de maneira adicional para produzir um segundo isoprenóide. Certas modalidades aqui descritas se referem em geral aos micro-organismos (por exemplo, micro-organismos de ocorrência não natural) que produzem pelo menos tanto um sesquiterpeno, tal como fameceno, quanto um carotenóide, por exemplo, astaxantina, uma xantofila, um cetocarotenóide, ou um outro carotenóide. Em certas modalidades, as células hospedeiras são capazes de produzir fameceno e um carotenóide, tal como

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3/105 astaxantina, uma xantofila, um cetocarotenóide, ou um outro carotenóide. Em certas modalidades, as células hospedeiras são capazes de produzir fameceno e astaxantina.

[0010] Em um outro aspecto, são aqui providas células hospedeiras capazes de produzir tanto um sesquiterpeno, tal como fameceno, quanto um carotenóide, por exemplo, astaxantina, uma xantofila, um cetocarotenóide, ou um outro carotenóide. Em certas modalidades, as células hospedeiras compreendem um ou mais ácidos nucleicos que codificam pelo menos uma de cada enzima da via do mevalonato, da maneira aqui descrita. Em certas modalidades, as células hospedeiras compreendem adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma terpeno sintase, da maneira aqui descrita. Em certas modalidades, a terpeno sintase é fameceno sintase. Em certas modalidades, as células hospedeiras compreendem adicionalmente um ou mais ácidos nucleicos que codificam enzimas de uma via capaz de produzir carotenóide, tal como astaxantina, uma xantofila, um cetocarotenóide, ou um outro carotenóide. Em certas modalidades, o carotenóide é astaxantina. Em certas modalidades, estas enzimas são selecionadas do grupo que consiste em fitoeno sintase/licopeno ciclase, fitoeno desaturase, astaxantina sintase citocromo-P450 hidroxilase/cetolase, citocromo-P450 redutase, β-caroteno cetolase, β-caroteno hidroxilase, β-caroteno hidroxilase, β-caroteno cetolase, β-caroteno hidroxilase, e combinações destas. Em certas modalidades, as várias enzimas destas modalidades são codificadas por uma pluralidade de ácidos nucleicos. Em certas modalidades, um único ácido nucleico codifica cada enzima destas modalidades. Em certas modalidades, as várias enzimas destas modalidades são codificadas por uma pluralidade de ácidos nucleicos heterólogos. Em certas modalidades, um único ácido nucleico heterólogo codifica cada enzima destas modalidades.

[0011] Em certas modalidades, uma quantidade substancial do sesquiterpeno é liberada das células onde este pode ser recuperado. Em certas

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4/105 modalidades, uma quantidade substancial do carotenóide permanece nas células (ou permanece associado com a biomassa celular), onde este pode ser recuperado, recuperando a massa celular. Em certas modalidades, a produção do sesquiterpeno e do carotenóide pode ocorrer por volta do mesmo período (primeira modalidade da FIG. 4). Em certas modalidades, pode existir uma alteração genética, de maneira tal que a biomassa e o sesquiterpeno sejam produzidos inicialmente, seguido pela produção do carotenóide na biomassa após a alteração genética ter sido ativada (segunda modalidade da FIG. 4). Em certas modalidades, o sesquiterpeno e biomassa podem ser separados por centrifugação diferencial com o sesquiterpeno em uma fase líquida de baixa densidade, e biomassa com material sólido precipitado. Em uma primeira modalidade, a biomassa precipitada contém o carotenóide. Em uma segunda modalidade, a biomassa pode ser novamente suspensa em meio e submetida a uma alteração genética de maneira a ativar a produção carotenóide. Na segunda modalidade, após incubação em condições adequadas por um período de tempo adequado, a biomassa pode ser novamente precipitada, e a biomassa precipitada contendo o carotenóide pode ser produzida.

[0012] Existem muitas vantagens providas pelas presentes modalidades. Uma vantagem de produzir dois ou mais isoprenóides (por exemplo, carotenóides tais como astaxantina nas mesmas células de levedura que produzem um sesquiterpeno tal como fameceno) é que múltiplos produtos de isoprenóide podem ser preparados em um único ensaio de fermentação após inoculação. Portanto, a mesma biomassa celular crescida durante a fase inicial de fermentação pode ser usada para produzir dois ou mais produtos de isoprenóide. Se fermentações separadas precisarem ensaiadas para dois ou mais isoprenóides, então mais unidades de operação devem ser duplicadas (por exemplo, inoculação, crescimento da cepa da semente, crescimento e operação dos fermentadores de produção), levando a um aumento concomitante no curto total de produção dos dois ou mais isoprenóides. Além

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5/105 disso, o custo das fontes de carbono para fermentação seria significativamente aumentado se duas fermentações separadas fossem ensaiadas. Isto é em decorrência do crescimento de biomassa ser um uso significativo de fonte de carbono, e a produção de biomassa seria exigida em ambas as fermentações, levando a um aumento múltiplo na exigência da fonte de carbono para produzir biomassa.

[0013] Existem vantagens adicionais. Por exemplo, em certas modalidades, múltiplos produtos de isoprenóide produzidos em células hospedeiras estão presentes predominantemente em diferentes fases. Por exemplo, um isoprenóide maior (por exemplo, um isoprenóide C40) está predominantemente associado às células, uma vez que seu tamanho não permite sua liberação das células em meio de fermentação, e um isoprenóide menor (por exemplo, isoprenóide Cl5) é predominantemente liberado no meio de fermentação. A presença de dois isoprenóides alvos em fases diferentes pode permitir separação fácil dos dois produtos de isoprenóide. Além disso, as células hospedeiras que resultam da produção do sesquiterpeno são, sem a produção de carotenóides, de valor baixo, sendo tanto um produto residual a ser eliminado quanto de valor mínimo, como um componente de ração animal. A produção de carotenóides, por exemplo astaxantina, nas células de levedura, aumenta acentuadamente o valor da levedura que resulta da produção de sesquiterpeno. A levedura contendo carotenóides apresenta valor significativamente maior. Por exemplo, levedura contendo astaxantina pode ser comercializada no mercado de ração de salmão para substituir o uso de astaxantina sintética, que constitui um dos maiores custos de ração de salmão, e é exigida para a cor vermelha da carne de salmão.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0014] Figura IA ilustra uma visão geral de uma via do mevalonato abreviada e uma divisão de fluxo de carbono para a biossíntese de fameceno e

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6/105 carotenóide. Estruturas de 3 carotenóides são mostradas: (a) licopeno, (b) βcaroteno, e (c) astaxantina.

[0015] Figura 1B ilustra a via do mevalonato e produção de isoprenóides de vários números de carbono.

[0016] Figura 2 ilustra a produção da via de β-caroteno na levedura carotogênica, Xanthophyllomyces dendrorhus, exibindo também GPS de Saccharomyces cerevisiae codificado por BTS1.

[0017] Figura 3A ilustra a via geneticamente modificada para biossíntese de astaxantina em S. cerevisiae usando genes de X. dendrorhous.

[0018] Figura 3B ilustra uma via exemplar para a produção de luteína e outros carotenóides.

[0019] Figura 4 ilustra duas modalidades diferentes de coprodução de fameceno e carotenóides.

[0020] Figura 5 ilustra a eluição de betacaroteno em 11,5 minutos a partir da coluna em uma HPLC.

[0021] Figura 6 ilustra que os padrões de calibração de betacaroteno mostram aumento na área do pico, com o aumento na concentração. E mostrado na figura 6 uma sobreposição de cromatogramas de HPLC bruto dos padrões de calibração em todos os níveis. Os picos foram separados e monitorados em 450 nm, da maneira relatada na seção de método.

[0022] Figura 7 ilustra a curva de calibração que mostra uma correlação muito boa de área do pico vs. concentração do analito (R² > 0,99).

[0023] Figura 8 ilustra que astaxantina elui em tomo de 1,4 minutos e mostra um aumento evidente na área do pico, com o aumento na concentração. As concentrações aqui relatadas são uma estimativa resultante de uma diluição seriada em acetona de um estoque de aproximadamente 1 mg/mL em DMSO. Contudo, essa figura mostra claramente que astaxantina e caroteno podem ser separados um do outro usando as condições atuais. Os picos foram monitorados em 480 nm e não foi observada nenhuma alteração

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7/105 significativa na resposta do pico, mesmo quando foi medido em 450 nm (tipicamente usado para betacaroteno).

[0024] Figura 9 mostra várias amostras de cepa extraídas e analisadas usando as condições mencionadas neste relatório. A) Cepa progenitora da cepa parental GGPPS sem nenhum gene à jusante, de maneira esperada, não exibindo nenhum sinal de betacaroteno ou astaxantina. B) Cepa parental contendo apenas genes que codificam betacaroteno mostra claramente a presença dos mesmos após extração e análise. A identidade do segundo pico em 13,3 minutos não é evidente até o momento. E provável que seja o análogo de di-hidro de betacaroteno, que é um subproduto conhecido do gene crtYB (ref: Verwaal et al., 2007). C) Cepa jovem mostra claramente a presença de astaxantina em 1,4 minutos, junto com betacaroteno e outros carotenóides potenciais. As identidades de outros picos menores não são conhecidas e podem ser potencialmente outros carotenóides à jusante (mais polar que betacaroteno, prováveis formas oxigenadas) ou também podem conter alguns análogos de degradação ou transformados de astaxantina.

[0025] Figura 10 ilustra placas representativas que mostram as colônias amarelas/laranjas. A, C. Colônias nesta placa parecem amarelo claro. B. Colônias nesta placa parecem laranja.

[0026] Figura 11 ilustra placas representativas que exibem as colônias de cepa de coprodução vermelhas. A esquerda, a placa de transformação com colônias individuais. A direita, re-estriamento dos clones selecionados. Colônias amarelas compreendem ácidos nucleicos que codificam a via biossintética para betacaroteno. Colônias vermelhas são as cepas que produzem astaxantina.

[0027] Figura 12 mostra a produção de fameceno por cepas geneticamente modificadas para produzir carotenóides (β-caroteno ou astaxantina). A cepa de produção de fameceno, geneticamente modificada, com via biossintética do carotenóide, produziu farenceno da maneira

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8/105 mostrada na FIG. 12. Estas cepas também produziram carotenóides (dados não mostrados).

[0028] Figuras 13A e 13B show fameceno produção (13A) e crescimento (densidade ótica: 13B) para várias cepas.

[0029] Figura 14A mostra a produção de fameceno para várias cepas. Figura 14B mostra o crescimento (densidade ótica) para várias cepas.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

5.1 DEFINIÇÕES [0030] Os termos “isoprenóide”, “composto de isoprenóide”, “terpeno”, “composto de terpeno”, “terpenóide” e “composto terpenóide” são aqui usados indiferentemente, e se referem a qualquer composto que é capaz de ser derivado de isopentenil pirofosfato (IPP). O número de átomos de C presente nos isoprenóides é de maneira típica dividido igualmente por cinco (por exemplo, C5, C10, Cl5, C20, C25, C30 e C40). Isoprenóides e politerpenos irregulares são relatados, e são também incluídos na definição de “isoprenóide.” Compostos de Isoprenóide incluem, mas sem limitação, monoterpenos, diterpenos, triterpenos, sesquiterpenos e politerpenos.

[0031] O termo “carotenóide” se refere a um composto constituído de uma parte principal de polieno que é condensada a partir de uma unidade de isopreno com cinco carbonos. Carotenóides podem ser acíclicos ou finalizados com um (monocíclicos) ou dois (bicíclicos) grupos de terminação cíclica. O termo “carotenóide” pode incluir tanto carotenos quanto xantofilas. Um “caroteno” se refere a um carotenóide hidrocarboneto. Derivados de caroteno que contêm um ou mais átomos de oxigênio, na forma de grupos funcionais hidróxi, metóxi, oxo, epóxi, carbóxi ou aldeídico, ou em glicosídeos, éteres de glicosídeo ou sulfatos, são coletivamente conhecidos como “xantofilas”. Carotenóides que são particularmente adequados na presente invenção são carotenóides monocíclicos e bicíclicos.

[0032] Da maneira aqui usada, o termo “prenil difosfato” é usado

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9/105 intercambiavelmente com “prenil pirofosfato”, e inclui monoprenil difosfatos com um grupo prenil único (por exemplo, IPP e DMAPP), bem como poliprenil difosfatos que incluem 2 ou mais grupos prenil. Monoprenil difosfatos incluem isopentenil pirofosfato (IPP) e seu isômero dimetilalil pirofosfato (DMAPP).

[0033] Da maneira aqui usada, o termo “terpeno sintase” se refere a qualquer enzima que modifica enzimaticamente IPP, DMAPP, ou um poliprenil pirofosfato, de maneira tal que um composto precursor de terpenóide seja produzido. O termo “terpeno sintase” inclui enzimas que catalisam a conversão de um prenil difosfato em um isoprenóide ou precursor de isoprenóide.

[0034] A palavra “pirofosfato” é aqui usada permutavelmente com “difosfato” e se refere a dois grupos fosfato covalentemente ligados. Assim, por exemplo, os termos “prenil difosfato” e “prenil pirofosfato” são permutáveis; os termos “isopentenil pirofosfato” e “isopentenil difosfato” são permutáveis; os termos famesil difosfato” e famesil pirofosfato” são permutáveis; etc.

[0035] O termo “via do mevalonato” ou “via do MEV” é aqui usado para se referir à via biossintética que converte acetil-CoA em IPP. A via do mevalonato compreende enzimas que catalisam a seguintes etapas: (a) condensar duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (por exemplo, pela ação de acetoacetil-CoA tiolase); (b) condensar acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar hidroximetilglutaril-CoenzimaA (HMG-CoA) (por exemplo, pela ação de HMG-CoA sintase (HMGS)); (c) converter HMG-CoA em mevalonato (por exemplo, pela ação de HMG-CoA redutase (HMGR)); (d) fosforilar mevalonato em mevalonato 5-fosfato (por exemplo, pela ação de mevalonato quinase (MK)); (e) converter mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato (por exemplo, pela ação de fosfomevalonato quinase (PMK)); e (f) converter mevalonato 5-pirofosfato em isopentenil

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10/105 pirofosfato (por exemplo, pela ação de mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPD)). A via do mevalonato é ilustrada esquematicamente na figura 1. A “metade superior” da via do mevalonato se refere às enzimas responsáveis pela conversão de acetil-CoA em mevalonato.

[0036] O termo “via do I-desóxi-D-xilulose 5-difosfato” ou “via do DXP” é aqui usado para se referir à via que converte gliceraldeído-3-fosfato e piruvato em IPP e DMAPP por meio de uma via do DXP intermediária, onde via do DXP compreende enzimas que catalisam a reação. Enzimas típicas da via do DXP incluem DXS, DXR, CMS, CMK, MCS, HDS e HDR. Dxs é 1desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase; Dxr é l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato reductoisomerase (também conhecida como IspC); IspD (CMS) é 4difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase; IspE (CMK) é 4-difosfocitidil-2Cmetil-D-eritritol sintase; IspF (MCS) é 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase; IspG (HDS) é l-hidroxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase; e IspH (HDR) é isopentenil/dimetilalil difosfato sintase.

[0037] Da maneira aqui usada, o termo “prenil transferase” é usado intercambiavelmente com os termos “isoprenil difosfato sintase” e “poliprenil sintase” (por exemplo, “GPP sintase,” “FPP sintase,” “OPP sintase,” etc.) para se referir a uma enzima que catalisa a condensação consecutiva Γ-4 de isopentenil difosfato com substratos de oligonucleotídeo inicial alílico, resultando na formação de prenil difosfatos de vários tamanhos de cadeia.

[0038] Da maneira aqui usada, o termo “composto(s) alvo(s)” se refere aos compostos a serem recuperados de uma célula hospedeira geneticamente modificada, com um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam enzimas de uma via biossintética para produzir o(s) composto(s) alvo(s), e não inclui metabólitos que podem ser incidentalmente produzidos durante a produção do(s) composto(s) alvo(s). Em modalidades particulares, dois ou mais compostos alvo são recuperados de uma cultura.

[0039] O termo “ensaio de fermentação” se refere a um ciclo

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11/105 completo de uma fermentação em lotes, semi-contínua ou contínua. Um ensaio de fermentação inicia preferivelmente quando o fermentador é inicialmente preenchido com materiais de partida, e é inoculado com os organismos apropriados. Um ensaio de fermentação preferivelmente termina quando os organismos fermentadores não são mais ativos, ou quando o fermentador é esvaziado.

[0040] O termo “inoculação” se refere à distribuição de células hospedeiras (por exemplo, células microbianas geneticamente modificada), que crescerão para formar a cultura microbiana distribuída em um meio de cultura, tal como um tanque de fermentação compreendendo meios a serem fermentados.

[0041] O termo “inóculo único” se refere ao material usado em uma inoculação, por exemplo, uma composição compreendendo células hospedeiras (por exemplo, células microbianas geneticamente modificadas) inseridas em um meio de cultura, tal como um tanque de fermentação compreendendo meios, em um ponto de tempo inicial para crescer a biomassa.

[0042] O termo “coprodução” se refere à produção de dois ou mais compostos alvo a partir de um inóculo único, isto é, a partir de células produzidas a partir de uma única célula hospedeira. Da maneira aqui usada, o termo, coprodução pode se referir à produção concorrente ou simultânea de dois ou mais compostos em um único ensaio de fermentação em um fermentador. O termo, coprodução, também pode se referir a uma produção sequencial de dois ou mais compostos alvo a partir de um inóculo único, em que pelo menos um composto alvo é produzido ativando a expressão de enzimas de uma via biossintética para o composto alvo em um primeiro ensaio de fermentação, seguido pela ativação da expressão de enzimas de uma outra via biossintética para um outro composto alvo. Em certas modalidades, uma produção sequencial pode ser atingida em dois ensaios de fermentação

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12/105 separados.

[0043] Da maneira aqui usada, o termo “carotenóide” se refere a uma classe de hidrocarbonetos com um esqueleto de carbono polieno conjugado, formalmente derivado de isopreno. Esta classe de moléculas é composta de triterpenos e tetraterpenos e seus derivados oxigenados; e estas moléculas apresentam tipicamente propriedades de absorver luz forte e fornecer cor.

[0044] O termo “carotenóide” pode incluir tanto carotenos quanto xantofilas. Um “caroteno” se refere a um hidrocarboneto carotenóide (por exemplo, β-caroteno e licopeno). Ao contrário, o termo “xantofila” se refere a um carotenóide C40 que contém um ou mais átomos de oxigênio na forma de grupos funcionais hidróxi, metóxi, oxo, epóxi, carbóxi ou aldeídico. Exemplos de xantofilas incluem, mas sem limitação anteraxantina, adonixantina, astaxantina (isto é, 3,3”-di-hidróxi-3,P-caroteno-4,4”-diona), cantaxantina (isto é, P,3-caroteno-4,4”-diona), β-criptoxantina, ceto-γcaroteno, equinenona, 3-hidroxiequinenona, 3’-hidroxiequinenona, zeaxantina, adonirubina, tetra-hidroxi^^’-caroten-4,4’-diona, tetra-hidroxiβ,β’-03Γθΐ6η-4-οικι, caloxantina, eritroxantina, nostoxantina, flexixantina, 3hidroxi-y-caroteno, 3-hidroxi-4-ceto-y-caroteno, bacteriorrubixantina, bacteriorrubixantinal e luteína.

[0045] Da maneira aqui usada, “um primeiro isoprenóide” e “um segundo isoprenóide” se referem aos compostos alvo que são produzidos por uma célula hospedeira que é geneticamente modificada com ácidos nucleicos heterólogos, os quais codificam uma via biossintética para produzir o primeiro isoprenóide e o segundo isoprenóide. Compostos alvo são compostos pretendidos para serem recuperados da célula hospedeira. Em geral, não são intermediários nas vias para preparar os compostos hospedeiros. Os versados na técnica reconhecem que os compostos alvo podem apresentar intermediários comuns.

[0046] Da maneira aqui usada, o termo “alteração genética” se refere

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13/105 a um ou mais elementos genéticos que permitem a expressão controlada de enzimas que produzem o primeiro composto de isoprenóide e enzimas que produzem o segundo composto de isoprenóide. Em uma primeira configuração, a alteração genética poderia promover a expressão de enzimas que produzem o primeiro composto de isoprenóide, e suprimir enzimas que produzem o segundo composto de isoprenóide. Em uma segunda configuração, a alteração genética pode suprimir a expressão de enzimas que produzem o primeiro composto de isoprenóide e promover enzimas que produzem o segundo composto de isoprenóide. Em uma terceira configuração, a alteração genética pode promover a expressão de enzimas que produzem o primeiro composto de isoprenóide e promover enzimas que produzem o segundo composto de isoprenóide. Em uma quarta configuração, a alteração genética pode suprimir a expressão de enzimas que produzem o primeiro composto de isoprenóide e suprimir as enzimas que produzem o segundo composto de isoprenóide. Por exemplo, uma alteração genética pode incluir um ou mais promotores operavelmente ligados a um ou mais genes que codificam uma enzima bios sintética, ou um ou mais promotores operavelmente ligados a um regulador transcricional que regula a expressão de uma ou mais enzimas biossintéticas.

[0047] Da maneira aqui usada, o termo “heterólogo” se refere ao que não é normalmente encontrado na natureza. O termo “sequência de nucleotídeo heterólogo” se refere a uma sequência de nucleotídeo não encontrada normalmente em uma dada célula na natureza. Como tal, uma sequência de nucleotídeo heterólogo pode ser: (a) estranha para sua célula hospedeira (isto é, é “exógena” para a célula); (b) naturalmente encontrada na célula hospedeira (isto é, “endógena”), mas presente em uma quantidade não natural na célula (isto é, maior ou menor quantidade do que naturalmente encontrada na célula hospedeira); ou (c) ser naturalmente encontrada na célula hospedeira, mas posicionada dentro de seu locus natural. O termo “enzima

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14/105 heteróloga” se refere a uma enzima que não é normalmente encontrada em uma dada célula na natureza. O termo inclui uma enzima que é: (a) exógena a uma dada célula (isto é, codificada por uma sequência de nucleotídeo que não está naturalmente presente na célula hospedeira, ou não está naturalmente presente em um dado contexto na célula hospedeira); e (b) naturalmente encontrada na célula hospedeira (por exemplo, a enzima é codificada por uma sequência de nucleotídeo que é endógena para a célula), mas que é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior ou menor que encontrada naturalmente) na célula hospedeira.

[0048] Por outro lado, o termo “natural” ou “endógena”, da maneira aqui usada com referência às moléculas, e em particular enzimas e ácidos nucleicos, indica moléculas que são expressas no organismo no qual são originados ou são encontrados na natureza, independentemente do nível de expressão que pode ser menor, igual ou maior que o nível de expressão da molécula no micro-organismo natural. Entende-se que a expressão de enzimas ou polinucleotídeos naturais pode ser modificada em micro-organismos recombinantes.

[0049] Da maneira aqui usada, o termo “produção” em geral se refere a uma quantidade de isoprenóide ou produzido por uma célula hospedeira geneticamente modificada aqui provida. Em algumas modalidades, a produção é expressa como um rendimento de isoprenóide pela célula hospedeira. Em outras modalidades, a produção é expressa como uma produtividade da célula hospedeira em produzir o isoprenóide.

[0050] Da maneira aqui usada, o termo “produtividade” se refere à produção de um isoprenóide por uma célula hospedeira, expresso como a quantidade de isoprenóide produzido (em peso) por quantidade de caldo de fermentação no qual a célula hospedeira é cultivada (em volume) ao longo do tempo (por hora).

[0051] Da maneira aqui usada, o termo “rendimento” se refere à

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 31/148 / 105 produção de um isoprenóide por uma célula hospedeira, expresso como a quantidade de isoprenóide produzido por quantidade de fonte de carbono consumido pela célula hospedeira, em peso.

[0052] Da maneira aqui usada, o termo “variação” se refere a um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo citado especificamente como “referência” (por exemplo, uma sequência tipo selvagem) por inserções, eliminações, mutações e substituições de aminoácido, mas mantém uma atividade que é substancialmente similar ao polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, a variação é criada por técnicas de DNA recombinante, tal como mutagênese. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de variação difere de seu polipeptídeo de referência pela substituição de um resíduo básico por um outro (isto é, Arg por Lys), a substituição de um resíduo hidrofóbico por um outro (isto é, Leu por Ile), ou a substituição de um resíduo aromático por um outro (isto é, Phe por Tyr), etc. Em algumas modalidades, variações incluem análogos nos quais substituições conservativas que resultam em uma analogia estrutural substancial da sequência de referência são obtidas. Exemplos de tais substituições conservativas, sem limitação, incluem ácido glutâmico por ácido aspártico e vice-versa; glutamina por asparagina e vice-versa; serina por treonina e vice-versa; lisina por arginina e vice-versa; ou qualquer de isoleucina, valina ou leucina para cada um.

[0053] Da maneira aqui usada, o termo “identidade de sequência” ou “identidade percentual”, no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou proteína, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou apresentam um percentual especificado de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos. Por exemplo, a sequência pode apresentar uma identidade percentual de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91% pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos

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98%, pelo menos 99% ou mais identidade, em relação a uma região específica, à uma sequência de referência quando comparada e alinhada para a correspondência máxima em relação a uma janela de comparação, ou região designada da maneira medida usando um algoritmo de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Por exemplo, percentual de identidade é determinado calculando a razão do número de nucleotídeos idênticos (ou resíduos de aminoácido) na sequência dividido pelo tamanho dos nucleotídeos totais (ou resíduos de aminoácido), menos os tamanhos de quaisquer intervalos.

[0054] Para conveniência, o grau de identidade entre duas sequências pode ser verificado usando programa de computador e algoritmos matemáticos conhecidos na técnica. Tais algoritmos que calculam a identidade percentual de sequência em geral levam em consideração intervalos de sequência e incompatibilidades em relação à região de comparação. Os programas que comparam e alinham sequências, como Clustal W (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680), ALIGN (Myers et al., (1988) CABIOS, 4: 11-17), FASTA (Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 6398) e BLAST com lacuna (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402) são usados para este propósito. O BLAST ou BLAST 2.0 (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biological Information (NCBI) e na Internet, para uso em conexão com os programas de análise de sequência BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN e TBLASTX. Informação adicional pode ser encontrada na página eletrônica do NCBI.

[0055] Em certas modalidades, os alinhamentos de sequência e cálculos do percentual de identidade podem ser determinados usando o programa BLAST, usando seus parâmetros predefinidos padrões. Para o alinhamento de sequência de nucleotídeo e cálculos de identidade de

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 33/148 / 105 sequência, o programa BLASTN é usado com seus parâmetros predefinidos (Penalidade de abertura de lacuna=5, penalidade de extensão de lacuna =2, compatibilidade nucleica =1, incompatibilidade nucleica =-3, valor previsto = 10,0, tamanho de letra= 11). Para o alinhamento de sequência de polipeptídeo e cálculos de identidade de sequência, o programa BLASTP é usado com seus parâmetros predefinidos (matriz de alinhamento = BLOSUM62; custos do lacuna: Existência=l I, Extensão=l; ajustes composicionais = pontuação composicional condicional, ajuste de matriz; valor previsto = 10,0; Tamanho da letra=6; compatibilidades máximas em uma faixa de pesquisa = 0). Altemativamente, o programa e os parâmetros a seguir são usados: software Align Plus de Clone Manager Suite, versão 5 (Software Sci-Ed); comparação de DNA: comparação Global, matriz de classificação linear padrão, penalidade de incompatibilidade =2, penalidade de lacuna aberto =4, penalidade de extensão de lacuna =1. Comparação de aminoácido: comparação global, matriz de classificação BLOSUM 62.

5.2 DESCRIÇÃO [0056] São aqui providos métodos e células hospedeiras para coprodução de dois ou mais isoprenóides em um meio de cultura. As células hospedeiras compreendem uma ou mais enzimas em uma primeira via biossintética para produzir um primeiro isoprenóide. As células hospedeiras compreendem adicionalmente um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas em uma segunda via biossintética para produzir um segundo isoprenóide. Nos métodos, o primeiro isoprenóide é recuperado, e o segundo isoprenóide é recuperado.

[0057] Carotenóides são pigmentos vermelhos, amarelos e laranjas que são amplamente distribuídos na natureza. Carotenóides C40 que pertencem à categoria de tetraterpenos (isto é, apresentam 40 átomos de carbono, sendo construídos a partir de quatro unidades de terpeno, cada qual contendo 10 átomos de carbono). Existem duas classes gerais de carotenóides:

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18/105 carotenos e xantofilas. Carotenos consistem apenas em átomos de carbono e hidrogênio. Xantofilas apresentam um ou mais átomos de oxigênio. Carotenóides hidrocarbonetos são classificados como carotenos, enquanto aqueles contendo oxigênio são conhecidos como xantofilas. Astaxantina é um carotenóide oxidado, conhecido como uma xantofila ou cetocarotenóide (isto é, um carotenóide com um grupo cetona).

[0058] Fameceno (ou outros sesquiterpenos) e todos os carotenóides, incluindo astaxantina, são isoprenóides que podem ser produzidos em levedura por meio da via do mevalonato. A divisão de fluxo de carbono em fameceno ou em carotenóides (incluindo astaxantina), é mostrada diagramaticamente na figura IA. Abreviações usadas na figura IA incluem HMG-CoA (3-Hidroxi 3-MetilGlutaril Coenzima A), IPP (isopentenil difosfato), GPP (geranil difosfato), e FPP (farnesil difosfato). As setas na figura IA representam conversões enzimáticas, e podem ser catalisadas por uma única enzima ou mais de uma enzima. A figura IA inclui uma versão abreviada da via do mevalonato, e a via completa do mevalonato e produção de outros terpenos são ilustrados na figura IB. As enzimas da via do mevalonato (de acetil-CoA para IPP) são descritas adicionalmente na seção 5.5. Enquanto as figuras IA e 1B ilustram a via do mevalonato para produzir precursores de isoprenóide tal como IPP, a via do DXP pode ser usada para produzir precursores de isoprenóide.

[0059] A superexpressão da via do mevalonato em levedura (Saccharomyces cerevisiae) foi descrita na literatura científica (por exemplo, Notman et al., J. Am. Chem. Soe., 128, 2006, 13982-13983; He et al., Mol. Membr. Biol. 3-4, 2012, 107-113). Em certas modalidades, uma ou mais enzimas da via do mevalonato são superexpressas da maneira previamente descrita.

[0060] Produção de β-caroteno em S. cerevisiae geneticamente modificada foi descrita. Kim et al., Food Sei. Biotechnol. 19, 2010, 263-266.

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A via biossintética do β-caroteno é reproduzida como na figura 2. Da maneira ilustrada na via biossintética do β-caroteno exemplar mostrada na FIG. 2, após IPP ser formada a partir da via do mevalonato, este pode ser convertido em dimetilalil pirofosfato (DMAPP) por uma IPP isomerase. IPP e DMAPP são condensados por geranil pirofosfato sintase (GPPS) para produzir geranil pirofosfato (GPP). GPP e IPP podem ser combinados por famesil pirofosfato sintase (FPPS) para produzir famesil pirofosfato (FPP). FPP e IPP podem ser combinados por uma geranil pirofosfato sintase (GGPP sintase) para produzir GGPP. Ácidos nucleicos exemplares que codificam GGPP sintases incluem gene BTS1 (S. cerevisiae) e gene CrtE (X. dendrohous). GGPP e GGPP podem ser combinados por fitoeno sintase (codificado por CrtB) para produzir fitoeno. Na via via biossintética de β-caroteno exemplar mostrada na FIG. 2, uma enzima bifuncional (fitoeno sintase/licopeno ciclase) codificada por CrtYB é mostrada para esta etapa de reação enzimática. Fitoeno pode ser convertido em neurosporeno pela ação enzimática de uma fitoeno desaturase, que pode ser codificada pelo gene CrtI. Neurosporeno pode ser convertido em 7,8-di-hidro^-caroteno pela ação enzimática de licopeno ciclase (codificada pelo gene CrtY) ou uma enzima bifuncional (codificada pelo gene CrtYB). Neurosporeno também pode ser convertido em licopeno pela ação enzimática de uma fitoeno desaturase (codificada pelo gene CrtI). Licopeno pode ser convertido em β-caroteno pela ação enzimática de uma licopeno ciclase (codificada pelo gene CrtB). Na via biossintética de β-caroteno exemplar mostrada na FIG. 2, uma enzima bifuncional (fitoeno sintase/licopeno ciclase) codificada pelo gene CrtYB é mostrada para esta etapa de reação enzimática. Observa-se que fitoeno mostrado na FIG. 2 não fornece nenhuma cor e, portanto, não é considerado um carotenóide, ao passo que neurosporeno, licopeno, β-caroteno, e 7,8-di-hidro^-caroteno são considerados carotenóides.

[0061] A produção de astaxantina que se inicia a partir de

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20/105 betacaroteno é mostarda na FIG. 3A. FIG. 3A ilustra uma via biossintética exemplar para astaxantina que inicia a partir de β-caroteno. As setas grossas preta, branca e cinza indicam as reações catalisadas pelas enzimas codificadas por crtW, crtZ, e crtS, respectivamente. Vide Ukibe et al., Applied and Environ. Microbiol. Nov. 2009, p.7025-7211. Betacaroteno é convertido em astaxantina em quatro etapas, nas quais dois grupos ceto e hidroxila são adicionados em cada anel por betacaroteno cetolase codificada por crtW, e betacaroteno hidroxilase codificada por crtZ, respectivamente. Da maneira mostrada na FIG. 3A, um único gene de X. dendrorhous, CrtYB, codifica uma enzima bifuncional fitoeno sintase/licopeno ciclase. Vide Verdoes et al., 1999, Mol. Gen. Genet. 262:453-461. CrtS codifica astaxantina sintase, que catalisa cetolação e hidroxilação de betacaroteno. Acredita-se que crtS é presumida codificar uma proteína citocromo p450. Ojima et al. (2006) Mol. Genet. Genomics 275: 148-158. Acredita-se que a introdução de crtR, que codifica a citocromo p450 redutase, é importante para a expressão funcional de CrtS e produção de astaxantina em células hospedeiras tal como S. cerevisiae. Vide Ukibe et al., Applied and Environ. Microbiol. Nov. 2009, p.7025-7211.

[0062] A FIG. 3B ilustra uma outra via biossintética exemplar para a produção de carotenóides. Em particular, FIG. 3B ilustra a produção de luteína a partir de licopeno. Licopeno pode ser convertido em δ-caroteno por uma licopeno ciclase (EC 5.5.1.18). δ-caroteno pode ser convertido em acaroteno por δ-caroteno β-ciclase (EC 5.5.1.19). α-caroteno pode ser convertido em zeinoxantina por β-anel hidroxilase (EC 1.14.99.-). Zeinoxantina pode ser convertida em luteína por caroteno ε-monooxigenase (EC 1.14.99.45). Exemplos destas enzimas são CitHYb, CitCYP97A, CitCYP97B, e CitCYP97C de frutas cítricas (Ma et al. 2016, BMC Plant Biology 16:148) Em certas modalidades, qualquer(s) ácido(s) nucleico(s) adequado(s) que codifica(m) enzimas na via biossintética de luteína pode(m)

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 37/148 / 105 ser usado(s) na produção de células hospedeiras geneticamente modificadas ou métodos para coprodução de luteína com um outro isoprenóide.

[0063] Em certas modalidades, qualquer(s) ácido(s) nucleico(s) adequado(s) que codifica(m) enzimas na via biossintética de βcaroteno/astaxantina pode(m) ser usado(s) na produção de células hospedeiras geneticamente modificadas, ou métodos para coprodução de um ou mais carotenóides com um outro isoprenóide. Os ácidos nucleicos exemplares que codificam tais enzimas usadas nas presentes modalidades são mostrados na tabela 1 a seguir. Ácidos nucleicos adicionais usados nas vias de produção de betacaroteno/astaxantina são descritos adicionalmente na seção 5.6 a seguir.

[0064] Tabela 1: Lista de ácidos nucleicos e enzimas codificadas adequadas para reações enzimáticas mostradas nas FIGS. 2 e 3A

Nome do	i Atividade da	] Organismo	ID GenBank	í UniProt	Referência
Gene	í enzima
CrtYB	] Fitoeno	j Xanthophyllom			Verwaal et al.
	] sintase/Licopen	yces		5	App. Environ.
	i o ciclase	j dendrorhous		5	Microbiol.
					73(13):4342-50
					(2007)
CrtI	i Fitoeno	] Xanthophyllom			Verwaal et al.
	i desaturase	yces			(2007)
		] dendrorhous
CrtS	5 astaxantina	Xanthophyllom	AAY20975.1	§ Q3HR17_PHA
	s Citocromo-	yces		ϊ RH
	i P450	j dendrorhous
	s Hidroxilase/
	s Cetolase
CrtR	i Citocromo-	] Xanthophyllom	AIP94032.1	[ A0A0C4MWF8
	i P450 Redutase	yces		[ _PHARH
		] dendrorhous
CrtW	i β-Caroteno	] Paracoccus sp.	BAE47465.1	[ CRTW_PARS	Ukibe et al.,
	5 Cetolase	] cepa N81106		ϊ N	Appl. Environ.
		] (Agrobacterium		5	Microbiol.
		] aurantiacum)			75(22): 7205-
					7211 (2009)
CrtZ	i β-Caroteno	] Paracoccus sp.	BAE47466.1	[ CRTZ_PARSN
	i Hidroxilase	] cepa N81106 ] (Agrobacterium
		] aurantiacum)
CrtZ	i β-Caroteno	] Pantoea	ADD79330.1	[ D4GFL0_PAN	Ukibe et al.
	i Hidroxilase	] ananatis		[ AM	(2009)
IIpBkt	i β-Caroteno	j Haematococcus	D45881.1	ϊ GenBank:
	] Cetolase	j pluvialis		§ BAA08300.1

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I HpCrtZ i β-Caroteno \ Haematococcus \ KP866868.1 [ GenBank: i i

I i Hidroxilase £ pluvialis ; 5 AKQ20654.1 i i [0065] Da maneira descrita anteriormente, a produção de carotenóides em micro-organismos geneticamente modificados foi previamente relatada. Por exemplo, astaxantina foi produzida por modificação genética da levedura oleaginosa, Yarrowia lipolitica (US 7.851.199). Modalidades da presente invenção diferem destes estudos prévios, em que nas presentes modalidades, uma célula hospedeira (por exemplo, células de levedura) pode coproduzir dois isoprenóides diferentes (que são substancialmente diferentes em peso molecular) durante um único ensaio de fermentação após inoculação, ou em dois ensaios de fermentação após inoculação. Por exemplo, os dois produtos, fameceno e um carotenóide, ou mistura de carotenóides (por exemplo, da maneira definida em US 7.851.199) tal como astaxantina, podem ser coproduzidos simultaneamente (modalidade 1 da FIG. 4), ou podem ser produzidos sequencialmente (modalidade 2 da FIG. 4), com fameceno sendo produzido durante o primeiro período de tempo, seguido por separação de células hospedeiras e produção do carotenóide geneticamente modificado durante um segundo período de incubação das células hospedeiras. A coprodução por fermentação foi descrita previamente para 1,4-butanodiol e gama-butirolactona (US 9,222,113), e igualmente a coprodução de um terpeno e vários produtos denominados (US 2015/0211024), mas não existem exemplos conhecidos de coprodução de isoprenóides, tais como sesquiterpenos e carotenóides.

5.3 Células hospedeiras [0066] São aqui providas células hospedeiras capazes de coproduzir dois ou mais isoprenóides. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucleicos heterólogos, os quais codificam uma ou mais enzimas em uma primeira via bios sintética para produzir um primeiro isoprenóide, e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas em uma segunda via bios sintética para

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 39/148 / 105 produzir um segundo isoprenóide, o qual apresenta um peso molecular que é diferente do primeiro isoprenóide. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas em uma terceira via biossintética para produzir um terceiro isoprenóide. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas em uma quarta via biossintética para produzir um quarto isoprenóide. Em certas modalidades, a célula hospedeira é modificada de maneira similar para produzir um quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono ou décimo isoprenóide, ou mais.

[0067] Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide não é um composto endógeno produzido por uma célula hospedeira parental, a qual não é geneticamente modificada. Em certas modalidades, o segundo isoprenóide não é um composto endógeno produzido por uma célula hospedeira parental que não é geneticamente modificada. Em certas modalidades, quando a célula hospedeira é modificada de maneira similar para produzir um terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono ou décimo isoprenóide, ou mais, estes isoprenóides adicionais não são produzidos de maneira endógena pela célula hospedeira parental.

[0068] Em certas modalidades, a célula hospedeira não é geneticamente modificada com para produzir um composto alvo para recuperação, sem ser um composto derivado de IPP. Nestas modalidades, a célula hospedeira é modificada para produzir apenas os compostos alvo de isoprenóide. Estes são os compostos que são pretendidos para ser, ou são, recuperados de uma cultura da célula hospedeira. As células hospedeiras não são modificadas para produzir outros compostos para recuperação.

[0069] Em certas modalidades, primeiro isoprenóide é um isoprenóide C5, C10, C15, ou C20, e o segundo isoprenóide é um carbono isoprenóide C30, C35, C40 ou maior. Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é

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24/105 um isoprenóide C15 e o segundo isoprenóide é um isoprenóide C40. Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é um sesquiterpeno, e o segundo isoprenóide é um tetraterpeno. Em modalidades particulares, o primeiro isoprenóide é fameceno, e o segundo isoprenóide é um carotenóide. Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é β-fameceno e o segundo carotenóide é um carotenóide C40. Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é um carotenóide ou uma mistura de carotenóides. Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é astaxantina, xantofila ou cetocarotenóide. Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, betacaroteno, licopeno, luteína, ou qualquer combinação destes. Em certas modalidades, qualquer combinação de primeiro isoprenóide e segundo isoprenóide, ou qualquer dos isoprenóides adicionais aqui descritos pode ser selecionado para a produção como compostos alvo de célula hospedeira geneticamente modificada.

[0070] Embora não pretenda ser limitado por nenhuma teoria particular de operação, durante o curso de coprodução de isoprenóide, descobriu-se que a coprodução de um ou mais segundos isoprenóides (por exemplo, carotenóides) com um primeiro isoprenóide (por exemplo, fameceno) pode reduzir o rendimento da biomassa (por exemplo, densidade celular) e a quantidade de produção do primeiro isoprenóide, comparada a uma célula hospedeira parental que é geneticamente modificada para produzir apenas o primeiro isoprenóide. Tais resultados foram observados com células hospedeiras que são geneticamente modificadas para fornecer um fluxo de carbono relativamente alto para a produção carotenóide. Sem querer ficar preso a nenhuma teoria, acredita-se que uma produção relativamente alta de carotenóides ou intermediários para carotenóides (por exemplo, GGPP) pode ser tóxica para as células hospedeiras ou pode retardar o crescimento celular. Foi descoberto adicionalmente pelos presentes inventores que o impacto negativo no acúmulo de biomassa pela coprodução de carotenóide com um

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 41/148 / 105 primeiro isoprenóide, como compostos alvo, pode ser superado ajustando o fluxo de carbono para a produção de carotenóides com relação ao fluxo de carbono para a produção do primeiro isoprenóide.

[0071] Assim, em certas modalidades, são aqui providas células hospedeiras que são geneticamente modificadas, de maneira tal que a coprodução de um segundo isoprenóide não afete substancialmente a produção de um primeiro isoprenóide ou o rendimento da biomassa durante a coprodução. Nestas modalidades, uma célula hospedeira pode ser primeiro geneticamente modificada introduzindo um ácido nucleico heterólogo, que codifica uma terpeno sintase, para produzir um primeiro isoprenóide em uma quantidade alvo desejada. Após a construção de uma célula hospedeira parental capaz de produzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade alvo, a célula hospedeira parental pode ser geneticamente modificada, de maneira adicional, introduzindo um ácido nucleico heterólogo que codifica uma terpeno sintase para produzir um segundo isoprenóide, em um nível que não afeta substancialmente a produção do primeiro isoprenóide ou o rendimento da biomassa durante a coprodução. Da maneira descrita na seção de Exemplo, quando o fluxo de carbono para a produção do segundo isoprenóide (por exemplo, um ou mais carotenóides) é reduzido, comparado ao fluxo de carbono para o primeiro isoprenóide (por exemplo, um sesquiterpeno), a coprodução do segundo isoprenóide não impacta substancialmente a quantidade de produção do primeiro isoprenóide ou o rendimento da biomassa. Em algumas modalidades, a razão relativa dos dois isoprenóides pode ser ajustada entre cerca de 0,001% a cerca de 2% em peso.

[0072] Assim, em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir um segundo isoprenóide e um primeiro isoprenóide, em uma razão de entre cerca de 0,001% e cerca de 2% em peso. Em certas modalidades, o método para coprodução de isoprenóides compreende produzir um segundo isoprenóide e

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 42/148 / 105 um primeiro isoprenóide, em uma razão de entre cerca de 0,001% e cerca de 1% em peso. Em certas modalidades, o método para coprodução de isoprenóides compreende produzir um segundo isoprenóide e um primeiro isoprenóide, em uma razão de entre cerca de 0,1% e cerca de 1% em peso. Em modalidades particulares, a razão baseia-se em % em peso. Em modalidades particulares, a razão baseia-se em massa dos compostos por volume de meios. Em modalidades particulares, a razão baseia-se em massa dos compostos por massa de peso de célula seca.

[0073] Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 2,5 g/L a cerca de 200 g/L. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg/L a cerca de 4000 mg/L. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 30 g/L a cerca de 170 g/L, cerca de 50 g/L a cerca de 160 g/L, ou qualquer número entre estas faixas. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg/L a cerca de 3000 mg/L, cerca de 1 mg/L a cerca de 2000 mg/L, cerca de 1 mg/L a cerca de 1000 mg/L, cerca de 1 mg/L a cerca de 800 mg/L, cerca de 1 mg/L a cerca de 500 mg/L, cerca de 1 mg/L a cerca de 400 mg/L, cerca de 1 mg/L a cerca de 300 mg/L, ou qualquer número entre estas faixas. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 2,5 g/L a cerca de 200 g/L e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg/L a cerca de 4000 mg/L. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 43/148 / 105 primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 2,5 g/L a cerca de 200 g/L e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg/L a cerca de 500 mg/L. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g/L a cerca de 120 g/L. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 20 mg/L a cerca de 1250 mg/L. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g/L a cerca de 120 g/L e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 20 mg/L a cerca de 1250 mg/L. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 75 mg/L. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g/L a cerca de 120 g/L e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 75 mg/L. Em certas modalidades, as células hospedeiras geneticamente modificadas de maneira tal que seja capaz de coproduzir qualquer combinação de quantidade do primeiro isoprenóide e do segundo isoprenóide aqui descrita.

[0074] Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g a 5 kg por quilo de massa de célula seca. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 100 g por quilo de massa de célula seca. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 44/148 / 105 primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g a 5 kg por quilo de massa de célula seca e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 50 g por quilo de massa de célula seca. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g a 5 kg por quilo de massa de célula seca e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 40 g por quilo de massa de célula seca. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g a 5 kg por quilo de massa de célula seca e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 30 g por quilo de massa de célula seca. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g a 5 kg por quilo de massa de célula seca e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 20 g por quilo de massa de célula seca. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide em uma quantidade de cerca de 100 g a 5 kg por quilo de massa de célula seca e o segundo isoprenóide em uma quantidade de cerca de 3 g por quilo de massa de célula seca. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira tal que seja capaz de coproduzir o primeiro isoprenóide e o segundo isoprenóide em qualquer combinação de faixas aqui descrita.

[0075] O primeiro isoprenóide pode ser qualquer isoprenóide conhecido pelos versados na técnica. Em modalidades particulares, o primeiro isoprenóide é um isoprenóide C15. Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é selecionado do grupo que consiste em fameceno, farnesol, famesil difosfato, nerolidol, bisaboleno, bisabolol, capsidiol, e patchoulol. Em

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 45/148 / 105 modalidades particulares, o primeiro isoprenóide é fameceno.

[0076] Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é um sesquiterpeno e o segundo isoprenóide é um ou mais carotenóides. Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é um sesquiterpeno e o segundo isoprenóide é um ou mais carotenóides C40. Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é um sesquiterpeno e o segundo isoprenóide é um ou mais de astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, betacaroteno, licopeno e luteína. Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é farneceno, e o segundo isoprenóide é um ou mais de astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, betacaroteno, licopeno e luteína. Em certas modalidades, a razão do segundo isoprenóide em relação ao primeiro isoprenóide baseia-se no peso de um único carotenóide. Em certas modalidades, a razão do segundo isoprenóide em relação ao primeiro isoprenóide baseia-se no peso da combinação de carotenóides produzidos pela célula hospedeira. Nestas modalidades, a razão de peso do primeiro isoprenóide e o segundo isoprenóide é medida com base no peso de célula seca, a partir da qual o primeiro isoprenóide e o segundo isoprenóides são produzidos.

[0077] Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é predominantemente liberado da célula hospedeira no meio de cultura. Em modalidades particulares, o primeiro isoprenóide é de um tamanho ou composição que possibilita sua liberação da célula. Isto pode ser previsto antecipadamente ou determinado empiricamente. Em modalidades particulares, quando as células hospedeiras são separadas do meio de cultura, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% do primeiro isoprenóide é encontrado no meio de cultura.

[0078] Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é predominantemente associado à célula hospedeira. Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é predominantemente mantido na célula hospedeira. Em modalidades particulares, o segundo isoprenóide é de um tamanho ou

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30/105 composição que reduz ou previne sua liberação da célula. Isto pode ser previsto antecipadamente ou determinado empiricamente. Em modalidades particulares, quando as células hospedeiras são separadas do meio de cultura, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% do segundo isoprenóide é encontrado com a massa celular.

[0079] Em certas modalidades, a célula hospedeira é capaz de produzir o primeiro isoprenóide durante coprodução com o segundo isoprenóide em uma quantidade de pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da quantidade do primeiro isoprenóide produzido por uma célula parental, que é geneticamente modificada para produzir o primeiro isoprenóide, mas não o segundo isoprenóide.

[0080] Em certas modalidades, uma densidade celular (ou rendimento da biomassa) da célula hospedeira durante coprodução do primeiro isoprenóide e o segundo isoprenóide é pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, ou 99% de uma densidade celular de uma célula parental, que é geneticamente modificada para produzir o primeiro isoprenóide, mas não o segundo isoprenóide.

[0081] Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada para produzir dois isoprenóides como compostos alvo, e não é geneticamente modificada para produzir um composto alvo que não é derivado de IPP. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada para produzir um sesquiterpeno e um ou mais carotenóides C40, e não é geneticamente modificada para produzir uma outra molécula alvo que não é derivada de IPP. Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada para produzir um isoprenóide C10, C15, ou C20 como o primeiro isoprenóide e um ou mais carotenóides C40 como um segundo isoprenóide, e não é geneticamente modificada para produzir uma outra molécula alvo que não é derivada de IPP. Modificar geneticamente uma molécula alvo, sem ser isoprenóides derivados de IPP, pode desviar o fluxo de

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31/105 carbono do IPP reduzindo, portanto, o fluxo de carbono para a produção de isoprenóides como compostos alvo.

[0082] Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira adicional para compreender: (a) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma primeira poliprenil sintase, e um ácido nucleico heterólogo para codificar uma primeira terpeno sintase para a produção do primeiro isoprenóide; e (b) um ácido nucleico que codifica uma segundo poliprenil sintase, e um ácido nucleico heterólogo que codifica uma segunda terpeno sintase para a produção do segundo isoprenóide.

[0083] Em certas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada de maneira adicional para compreender: (a) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma FPP sintase, e uma sesquiterpeno sintase para produzir um sesquiterpeno como o primeiro isoprenóide; e (b) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma GGPP sintase, e uma carotenóide sintase para produzir um carotenóide.

[0084] Em certas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada é geneticamente modificada para superexpressar uma ou mais enzimas da via do mevalonato. Em certas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada é geneticamente modificada para superexpressar, todas as enzimas da via do mevalonato.

[0085] Em certas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende adicionalmente um ácido nucleico heterólogo que codifica uma poliprenil sintase para produzir um poliprenil difosfato. Em certas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende adicionalmente um ácido nucleico heterólogo que codifica uma FPP sintase. Em certas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende adicionalmente um ácido nucleico heterólogo que codifica uma GGPP sintase. Em certas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende adicionalmente um ácido nucleico

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32/105 heterólogo que codifica uma FPP sintase e compreende um ácido nucleico endógeno que codifica uma GGPP sintase, mas não compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma GGPP sintase.

[0086] Qualquer combinação de ácidos nucleicos heterólogos aqui descrita pode ser introduzida na célula hospedeira, dependendo de qual carotenóide é dessejado para coprodução com um primeiro isoprenóide.

[0087] Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é licopeno, e a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase.

[0088] Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é β-caroteno, e a célula hospedeira compreende: (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional com fitoeno sintase e atividades de licopeno ciclase; e um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase.

[0089] Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é cantaxantina, e a célula hospedeira compreende (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional com fitoeno sintase e atividades de licopeno ciclase; um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase; e um ácido nucleico heterólogo que codifica uma β-caroteno cetolase.

[0090] Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é zeaxantina, e a célula hospedeira compreende: (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional com fitoeno sintase e atividades de licopeno ciclase; um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase; e um ácido

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 49/148 / 105 nucleico heterólogo que codifica β-caroteno hidroxilase.

[0091] Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é astaxantina, e a célula hospedeira compreende: (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional com fitoeno sintase e atividades de licopeno ciclase; um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase; (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma β-caroteno cetolase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma β-caroteno hidroxilase ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma citocromo p450 hidroxilase e cetolase capaz de converter β-caroteno em equinenona e em β-criptoxantina, e subsequentemente em astaxantina; e (iv) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma citocromo p450 redutase que interage com a citocromo p450 hidroxilase e cetolase.

[0092] Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é luteína, e a célula hospedeira compreende: um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase; um ácido nucleico heterólogo que codifica uma δcaroteno β-ciclase; um ácido nucleico heterólogo que codifica β-anel hidroxilase; e um ácido nucleico heterólogo que codifica uma caroteno εmonooxigenase.

5.4 Cepas de célula [0093] As células hospedeiras podem ser quaisquer das células consideradas utilizáveis pelos versados na técnica. Células hospedeiras usadas nas composições e métodos aqui providos incluem células de arqueas, procariotos ou eucariotos.

[0094] Hospedeiros procariotos adequados incluem, mas sem limitação, qualquer de uma variedade de bactérias gram-positivas, gramnegativas ou gram-variáveis. Exemplos incluem, mas sem limitação, células que pertencem aos gêneros: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena,

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Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus, e Zymomonas. Exemplos de cepas de procarioto incluem, mas sem limitação: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei e Staphylococcus aureus. Em uma modalidade particular, a célula hospedeira é uma célula de Escherichia coli.

[0095] Hospedeiros arqueas adequados incluem, mas sem limitação, células que pertencem aos gêneros: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobacterium, Pirococcus, Sulfolobus, e Thermoplasma. Exemplos de cepas de arqueas incluem, mas sem limitação: Archaeoglobus fulgidus, Halobacterium sp., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium, Pirococcus horikoshii, Pirococcus abyssi, e Aeropyrum pernix.

[0096] Hospedeiros eucariotos adequados incluem, mas sem limitação, células fúngicas, células e algas, células de insetos e células de plantas. Em algumas modalidades, leveduras usadas nos presentes métodos incluem leveduras que foram depositadas com depositários de microorganismos (por exemplo IFO, ATCC, etc.) e pertencem aos gêneros

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Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma, Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, Candida, Citeromyces, Clavispora, Criptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomycopsella, Eremascus, Eremothecium, Eritrobasidium, Fellomyces, Filobasidium, Galactomyces, Geotrichum, Guilliermondella, Hanseniaspora, Hansenula, Hasegawaea, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leucosporidium, Lipomyces, Lodderomyces, Malassezia, Metschnikowia, Mrakia, Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogataea, Oosporidium, Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Saccharomycopsis, Saitoella, Sakaguchia, Saturnospora, Schizoblastosporion, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Sporopachydermia, Stephanoascus, Sterigmatomyces, Sterigmatosporidium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torulaspora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Waltomyces, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis e Zygozyma, entre outros.

[0097] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis (previamente denominada Saccharomyces lactis), Kluveromyces marxianus, Arxula adeninivorans, ou Hansenula polimorpha (atualmente conhecida como Pichia angusta). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma cepa do gênero Candida, tal como Candida lipolitica, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, ou Candida utilis.

[0098] Em uma modalidade particular, a célula hospedeira é

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Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, o hospedeiro é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae selecionado do grupo que consiste em levedura de panificação, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1, CEN.PK, CEN.PK2 e AL-1. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae selecionada do grupo que consiste em PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1, e SA-1. Em uma modalidade particular, a cepa de Saccharomyces cerevisiae é PE-2. Em uma outra modalidade particular, a cepa de Saccharomyces cerevisiae é CAT-1. Em uma outra modalidade particular, a cepa de Saccharomyces cerevisiae é BG-1.

[0099] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é um micróbio que é adequado para fermentação industrial. Em modalidades particulares, o micróbio é condicionado a subsistir em alta concentração de solvente, alta temperatura, utilização de substrato expandido, limitação de nutriente, estresse osmótico em virtude de açúcar e sais, acidez, sulfito e contaminação bacteriana, ou combinações destas, as quais são condições de estresse reconhecidas do ambiente de fermentação industrial.

5.5 Via do mevalonato [00100] Em algumas modalidades, a célula aqui provida compreende uma ou mais enzimas da via do mevalonato (MEV). Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas da via do MEV compreendem uma enzima que condensa acetil-CoA com malonil-CoA para formar acetoacetilCoA. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas da via do MEV compreendem uma enzima que condensa duas moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas da via do MEV compreendem uma enzima que condensa acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas da via do MEV compreendem uma enzima que converte HMG-CoA

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 53/148 / 105 em mevalonato. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas da via do MEV compreendem uma enzima que fosforila mevalonato em mevalonato 5fosfato. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas da via do MEV compreendem uma enzima que converte mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas da via do MEV compreendem uma enzima que converte mevalonato 5-pirofosfato em isopentenil pirofosfato.

[00101] Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas da via do MEV são selecionadas do grupo que consiste em acetil-CoA tiolase, acetoacetil-CoA sintetase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase e mevalonato pirofosfato descarboxilase. Em algumas modalidades, com relação à enzima da via do MEV capaz de catalisar a formação de acetoacetil-CoA, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende tanto uma enzima que condensa duas moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, por exemplo, acetilCoA tiolase; quanto uma enzima que condensa acetil-CoA com malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA, por exemplo, acetoacetil-CoA sintase. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende tanto uma enzima que condensa duas moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, por exemplo, acetil-CoA tiolase; quanto uma enzima que condensa acetil-CoA com malonil-CoA para formar acetoacetilCoA, por exemplo, acetoacetil-CoA sintase.

[00102] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende mais de uma enzima da via do MEV. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende duas enzimas da via do MEV. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma enzima que pode converter HMG-CoA em mevalonato e uma enzima que pode converter mevalonato em mevalonato 5-fosfato. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende três enzimas da via do MEV. Em algumas modalidades, a célula

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 54/148 / 105 hospedeira compreende quatro enzimas da via do MEV. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende cinco enzimas da via do MEV. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende seis enzimas da via do MEV. Em algumas modalidades, a célula hospedeira sete enzimas da via do MEV. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende todas as enzimas da via do MEV.

[00103] Em algumas modalidades, a célula compreende adicionalmente uma enzima que pode converter isopentenil pirofosfato (IPP) em dimetilalil pirofosfato (DMAPP). Em algumas modalidades, a célula compreende adicionalmente uma enzima que pode condensar moléculas IPP e/ou DMAPP para formar um composto poliprenila. Em algumas modalidades, a célula compreende adicionalmente uma enzima que pode modificar IPP ou um poliprenil para formar um composto de isoprenóide.

5.5.1 Conversão de Acetil-CoA em Acetoacetil-CoA [00104] Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende uma enzima que pode condensar duas moléculas de acetil-coenzima A para formar acetoacetil-CoA, por exemplo, uma acetil-CoA tiolase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (REGIÃO NC_000913: 2324131.2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans), e (L20428; Saccharomyces cerevisiae). Acetil-CoA tiolase catalisa a condensação reversível de duas moléculas de acetil-CoA para render acetoacetil-CoA, mas esta reação é termodinamicamente desfavorável; acetoacetil-CoA tiolase é favorecida em relação a síntese de acetoacetil-CoA. Acetoacetil-CoA sintase (AACS) (altemativamente referida como acetilCoA:malonil-CoA aciltransferase; EC 2.3.1.194) condensa acetil-CoA com malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA. Ao contrário de acetil-CoA tiolase, a síntese de acetoacetil-CoA catalisada por AACS é essencialmente uma reação favorecida pela energia, em virtude da descarboxilação associada

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 55/148 / 105 de malonil-CoA. Além disso, AACS não exibe nenhuma atividade de tiólise contra acetoacetil-CoA, e assim a reação é irreversível. Assim, em outras modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada aqui provida utiliza uma acetoacetil-CoA sintase para formar acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA e malonil-CoA.

[00105] Em algumas modalidades, a AACS é de Streptomyces sp. cepa CL190 (Okamura et al., Proc Natl Acad Sei Estados Unidos 107(25):1126570 (2010). Sequências de nucleotídeo AACS representativas de Streptomyces sp. cepa CL190 incluem número de acesso AB540131.1, e SEQ ID NO: 19 de publicação de patente U.S. 2014/0273144. Sequências de proteína AACS representativas de Streptomyces sp. cepa CL 190 incluem números de acesso D7URV0, BAJ10048, e SEQ ID NO:20 da publicação de patente U.S. 2014/0273144. Outras acetoacetil-CoA sintases usadas para as composições e métodos aqui providos incluem, mas sem limitação, Streptomyces sp. (AB183750; KO-3988 BAD86806); 5. anulatus cepa 9663 (FN178498; CAX48662); Streptomyces sp. KO-3988 (AB212624; BAE78983); Actinoplanes sp. A40644 (AB113568; BAD07381); Streptomyces sp. C (NZ_ACEW010000640; ZP_05511702); Nocardiopsis dassonvillei DSM 43111 (NZ_ABUI01000023; ZP_04335288); Mycobacterium ulcerans Agy99 (NC_008611; YP_907152); Mycobacterium marinum M (NC_010612; YP-001851502); Streptomyces sp. Mgl (NZ.DS570501; ZP.05002626); Streptomyces sp. AA4 (NZ_ACEV01000037; ZP_05478992); S. roseosporus NRRL 15998 (NZ_ABYB01000295; ZP.04696763); Streptomyces sp. ACTE (NZ_ADFD01000030; ZP.06275834); 5. viridochromogenes DSM 40736 (NZ_ACEZ01000031; ZP_05529691); Frankia sp. CcI3 (NC.007777; YP_480101); Nocardia brasiliensis (NC_018681; YP_006812440.1); e Austwickia chelonae (NZ_BAGZ01000005; ZP_10950493.1). AcetoacetilCoA sintases adequadas adicionais incluem aquelas descritas nas publicações de pedido de patente U.S. 2010/0285549 e 2011/0281315, cujos conteúdos

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40/105 são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

[00106] Acetoacetil-CoA sintases também usadas nas composições e métodos aqui providos incluem aquelas moléculas que são consideradas “derivadas” de quaisquer das acetoacetil-CoA sintases aqui descritas. Um “derivado” apresenta as seguintes características: (1) compartilha homologia substancial com quaisquer das acetoacetil-CoA sintases aqui descritas; e (2) é capaz de catalisar a condensação irreversível de acetil-CoA com malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA. Considera-se que um derivado de uma acetoacetil-CoA sintase compartilha “homologia substancial” com acetoacetil-CoA sintase se as sequências de aminoácido do derivado forem pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 90%, e acima de tudo preferivelmente pelo menos 95%, as mesmas daquela de acetoacetil-CoA sintase.

5.5.2 Conversão de Acetoacetil-CoA em HMG-CoA [00107] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma enzima que pode condensar acetoacetil-CoA com uma outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA), por exemplo, uma HMG-CoA sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (NC_001145. complemento 19061.20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens), e (NC.002758, marcação de Locus SAV2546, GenelD 1122571; Staphylococcus aureus).

5.5.3 Conversão de HMG-CoA em mevalonato [00108] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma enzima que pode converter HMG-CoA em mevalonato, por exemplo, uma HMG-CoA redutase. Em algumas modalidades, HMG-CoA redutase é uma hidroximetilglutaril-CoA redutase-CoA redutase usando NADPH.

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Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma HMG-CoA redutase usando NADPH incluem, mas sem limitação: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, marcação de Locus SAV2545, GenelD 1122570; Staphylococcus aureus), (ABO 15627; Streptomyces sp. KO 3988), (AX128213, que provê a sequência que codifica uma HMG-CoA redutase truncada; Saccharomyces cerevisiae), e (NC_001145: complemento (115734.118898; Saccharomyces cerevisiae).

[00109] Em algumas modalidades, HMG-CoA redutase é uma hidroximetilglutaril-CoA redutase-CoA redutase que usa NADH. HMG-CoA redutases (EC 1.1.1.34; EC 1.1.1.88) catalisam a desacilação redutiva de (S)HMG-CoA em (R)-mevalonato, e pode ser categorizada em duas classes, HMGrs de classe I e classe II. Classe I inclui as enzimas de eucariotos e a maioria das arqueas, e classe II inclui as HMG-CoA redutases de certos procariotos e arqueas. Além da divergência nas sequências, as enzimas das duas classes também diferem com relação à sua especificidade de cofator. Ao contrário das enzimas de classe I, que utilizam NADPH exclusivamente, as redutases HMG-CoA de classe II variam na capacidade de diferenciar entre NADPH e NADH. Vide, por exemplo, Hedl et al., Journal of Bacteriology 186 (7): 1927-1932 (2004). As especificidades de cofator para selecionar HMG-CoA redutases de classe II são providas a seguir.

Tabela 2. Especificidades de cofator para selecionar HMG-CoA redutases de classe II

Fonte	Especificidade coenzima	A„vwm (pM)	Α?'ΛΙ)Η (pM)
P. mevalonii	NADH		80
A. fulgidus	NAD(P)H	500	160
S. aureus	NAD(P)H	70	100
E. faecalis	NADPH	30

[00110] HMG-CoA redutases usadas para as composições e métodos aqui providos incluem HMG-CoA redutases que são capazes de utilizar NADH como um cofator, por exemplo, HMG-CoA redutase de P. mevalonii, A. fulgidus ou S. aureus. Em modalidades particulares, a HMG-CoA redutase

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42/105 é capaz de utilizar apenas NADH como um cofator, por exemplo, HMG-CoA redutase de P. mevalonii, S. pomeroyi ou D. acidovorans.

[00111] Em algumas modalidades, a HMG-CoA redutase que usa NADH é de Pseudomonas mevalonii. A sequência do gene tipo selvagem mvaA de Pseudomonas mevalonii, que codifica HMG-CoA redutase (EC 1.1.1.88), foi previamente descrita. Vide Beach e Rodwell, J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989). Sequências de nucleotídeo mvaA representativas de Pseudomonas mevalonii incluem número de acesso M24015, e SEQ ID NO: 21 de publicação de patente U.S. 2014/0273144. Sequências de proteínas HMG-CoA redutase representativas de Pseudomonas mevalonii incluem números de acesso AAA25837, P13702, MVAA_PSEMV, e SEQ ID NO: 22 de publicação de patente U.S. 2014/0273144.

[00112] Em algumas modalidades, a HMG-CoA redutase que usa NADH é de Silicibacter pomeroyi. Sequências de nucleotídeo representativas de HMG-CoA redutase de Silicibacter pomeroyi incluem número de acesso NC_006569.1, e SEQ ID NO: 23 de publicação de patente U.S. 2014/0273144. Sequências representativas de proteína HMG-CoA redutase de Silicibacter pomeroyi incluem número de acesso YP_164994, e SEQ ID NO: 24 de publicação de patente U.S. 2014/0273144.

[00113] Em algumas modalidades, a HMG-CoA redutase que usa NADH é de Delftia acidovorans. Uma sequência de nucleotídeo representativa de HMG-CoA redutase de Delftia acidovorans inclui NC_010002 REGIÃO: complemento (319980.321269), e SEQ ID NO: 25 de publicação de patente U.S. 2014/0273144. Sequências de proteína representativas de HMG-CoA redutase de Delftia acidovorans incluem número de acesso YP_001561318, e SEQ ID NO: 26 de publicação de patente U.S. 2014/0273144.

[00114] Em algumas modalidades, a HMG-CoA redutases que usam NADH é de Solanum tuberosum (Crane et al., J. Plant Physiol. 159:1301Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 59/148 / 105

1307 (2002)).

[00115] HMG-CoA redutases que usam NADH também usadas nas composições e métodos aqui providos incluem aquelas moléculas que são referidas como “derivadas” de quaisquer das HMG-CoA redutases que usam NADH aqui descritas, por exemplo, de P. mevalonii, S. pomeroyi e D. acidovorans. Um “derivado” como este apresenta as seguintes características: (1) compartilha homologia substancial com quaisquer das HMG-CoA redutases que usam NADH aqui descritas; e (2) é capaz de catalisar a desacilação redutiva de (S)-HMG-CoA em (R)-mevalonato, usando preferencialmente NADH como um cofator. Um derivado de uma HMG-CoA redutase que usa NADH é referido por compartilhar “homologia substancial” com HMG-CoA redutase que usa NADH se as sequências de aminoácido do derivado for pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 90%, e acima de tudo preferivelmente pelo menos 95% da mesma que a HMG-CoA redutase que usa NADH.

[00116] Da maneira aqui usada, o termo “que usa NADH” significa que a HMG-CoA redutase que usa NADH é seletiva para NADH em relação à NADPH como um cofator, por exemplo, demonstrando uma maior atividade específica para NADH do que para NADPH. Em algumas modalidades, a seletividade para NADH como um cofator é expressa como uma razão W^NADH)/ kCat^(NADPH)- Em algumas modalidades, a HMG-CoA redutase que usa NADH apresenta uma razão kcat^(NADH)/ k_cat^(NADPH) de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25 ou mais de 25. Em algumas modalidades, a HMG-CoA redutase que usa NADH usa NADH exclusivamente. Por exemplo, uma HMG-CoA redutase que usa NADH, que usa NADH exclusivamente, exibe alguma atividade com NADH fornecida como único cofator in vitro, e não exibe nenhuma atividade detectável quando NADPH é fornecido como único cofator. Qualquer método para determinar especificidade de cofator conhecido na técnica pode ser utilizado para identificar HMG-CoA redutases, com uma preferência para

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NADH como cofator, incluindo aqueles descritos por Kim et al., Protein Science 9:1226-1234 (2000); e Wilding et al., J. Bacteriol. 182(18):5147-52 (2000), cujos conteúdos são aqui incorporados na sua íntegra.

[00117] Em algumas modalidades, a HMG-CoA redutase que usa NADH é geneticamente modificada para ser seletiva para NADH com relação à NAPDH, por exemplo, através da mutagênese sítio direcionada do bolso de ligação de cofator. Métodos para modificar geneticamente a seletividade de NADH são descritos em Watanabe et al., Microbiology 153:3044-3054 (2007), e métodos para determinar a especificidade do cofator de HMG-CoA redutases são descritos em Kim et al., Protein Sei. 9:1226-1234 (2000), cujos conteúdos são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

[00118] Em algumas modalidades, a HMG-CoA redutase que usa NADH é derivada de uma espécie hospedeira que compreende naturalmente uma via degradativa de mevalonato, por exemplo, uma espécie hospedeira que cataboliza o mevalonato como sua única fonte de carbono. Nestas modalidades, a HMG-CoA redutase que usa NADH, que normalmente catalisa a acilação oxidativa de (R)-mevalonato internalizado em (S)-HMGCoA na sua célula hospedeira natural, é utilizada para catalisar a reação reversa, isto é, a desacilação redutiva de (S)-HMG-CoA em (R)-mevalonato, em uma célula hospedeira geneticamente modificada compreendendo uma via biossintética do mevalonato. Procariotos capazes de crescer em mevalonato como sua única fonte de carbono foram descritos por: Anderson et al., J. Bacteriol, 171(12):6468-6472 (1989); Beach et al., J. Bacteriol. 171:29943001 (1989); Bensch et al., J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari et al., Biochemistry 4:2086-2090 (1965); Siddiqi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 8:110-113 (1962); Siddiqi et al., J. Bacteriol. 93:207-214 (1967); e Takatsuji et al., Biochem. Biophys. Res. Commwn. 110:187-193 (1983), cujos conteúdos são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

[00119] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 61/148 / 105 providos, a célula hospedeira compreende tanto uma HMGr que usa NADH quanto uma HMG-CoA redutase que usa NADPH.

5.5.4 Conversão de mevalonato em mevalonato-5-Fosfato [00120] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma enzima que pode converter mevalonato em mevalonato 5-fosfato, por exemplo, uma mevalonato quinase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (L77688; Arabidopsis thaliana), e (X55875; Saccharomyces cerevisiae).

5.5.5 Conversão de mevalonato-5-fosfato em mevalonato-5-pirofosfato [00121] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma enzima que pode converter mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5pirofosfato, por exemplo, uma fosfomevalonato quinase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), e (NC_001145. complemento 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae).

5.5.6 Conversão de mevalonato-5-pirofosfato em IPP [00122] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma enzima que pode converter mevalonato 5-pirofosfato em isopentenil difosfato (IPP), por exemplo, uma mevalonato pirofosfato descarboxilase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), e (U49260; Homo sapiens).

5.5.7 Conversão de IPP em DMAPP [00123] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma enzima que pode converter IPP gerado por meio da via do MEV em dimetilalil pirofosfato (DMAPP), por exemplo, uma IPP isomerase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 62/148 / 105 uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (NC_000913, 3031087.3031635; Escherichia coli), e (AF082326; Haematococcus pluvialis).

5.5.8 Poliprenil sintases [00124] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma poliprenil sintase que pode condensar moléculas IPP e/ou DMAPP para formar compostos de poliprenil contendo mais de cinco carbonos.

[00125] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma enzima que pode condensar uma molécula de IPP com uma molécula de DMAPP para formar uma molécula de geranil pirofosfato (“GPP”), por exemplo, uma GPP sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AE016877, Locus API 1092; Bacillus cereus', ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ips pini), (DQ286930; Lycopersicon esculentum), (AF182828; Mentha x piperita), (AF182827; Mentha x piperita), (MPI249453; Mentha x piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxantinaifaciens), (AY866498; Picrorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera), e (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).

[00126] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma enzima que pode condensar duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP, ou adicionar uma molécula de IPP à uma molécula de GPP, para formar uma molécula de famesil pirofosfato (“FPP”), por exemplo, uma FPP sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (ATU80605; Arabidopsis

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 63/148 / 105 thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxidans 621H), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes), (NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270), (NC_008023, Locus YP_600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS 10750), (MZEFPS; Zea mays), (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtilis), (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus), (NC_002940, Locus NP_873754; Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K), (NC_005823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz Ll130), (AB003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, Locus YP_208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae), (CP000031, Locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6), e (NC_004556, Locus NP 779706; Xilella fastidiosa Temeculal).

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 64/148 / 105 [00127] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma enzima que pode combinar IPP e DMAPP, ou IPP e FPP, para formar geranilgeranil pirofosfato (“GGPP”), também referida como GGPP sintase (EC 2,5.1.29). Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitação: (ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana), (BT005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sql563), (CRGGPPS; Catharanthus roseus), (NZ_AABF02000074, Locus ZP_00144509; Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321; Ginkgo biloba), (AB055496; Hevea brasiliensis), (AB017971; Homo sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus), (ABO16044; Mus musculus), (AABX01000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa), (NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae), (ABO 16095; Synechococcus elongates), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acidocaldarius), (NC_007759, Locus YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB), (NC.006840, Locus YP.204095; Vibrio fischeri ES114), (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis), (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus), (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides), (NC_004350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159), (NP_015256; Saccharomyces cerevisiae)', (AFC92798; Blakeslea trispora), (BAA14124; Pantoea ananatis), (AAM21639; Cistus creticus); (AAY33921; Xanthophyllomyces dendrorhous), (XP_019067954; Solanum lycopersicum).

5.5.9 Terpeno sintases [00128] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 65/148 / 105 adicionalmente uma enzima que pode modificar um poliprenil para formar um hemiterpeno, um monoterpeno, um sesquiterpeno, um diterpeno, um triterpeno, um tetraterpeno, um politerpeno, um composto esteróide, um carotenóide, ou um composto de isoprenóide modificado.

[00129] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma careno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, mas sem limitação: (AF461460, REGIÃO 43.1926; Picea abies) e (AF527416, REGIÃO: 78.1871; Salvia stenophylla).

[00130] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma geraniol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (AJ457070; Cinnamomum tenuipilum), (AY362553; Ocimum basilicum), (DQ234300; Perilla frutescens cepa 1864), (DQ234299; Perilla citriodora cepa 1861), (DQ234298; Perilla citriodora cepa 4935), e (DQ088667; Perilla citriodora). [00131] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma linalol sintase. Exemplos ilustrativos de uma sequência adequada de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (AF497485; Arabidopsis thaliana), (AC002294, Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana), (AY059757; Arabidopsis thaliana), (NM_104793; Arabidopsis thaliana), (AF154124; Artemisia annua), (AF067603; Clarkia breweri), (AF067602; Clarkia concinna), (AF067601; Clarkia breweri), (U58314; Clarkia breweri), (AY840091; Lycopersicon esculentum), (DQ263741; Lavandula angustifolia), (AY083653; Mentha citrate), (AY693647; Ocimum basilicum), (XM_463918; Oryza sativa), (AP004078, Locus BAD07605; Oryza sativa), (XM.4639I8, Locus XP.463918; Oryza sativa), (AY917193; Perilla citriodora), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473623; Picea abies), (DQ195274; Picea sitchensis), e (AF444798; Perilla frutescens var. crispa cultivar No. 79).

[00132] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende

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50/105 adicionalmente uma limoneno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (+)-limoneno sintases (AF514287, REGIÃO: 47.1867; Citrus limon) e (AY055214, REGIÃO: 48.1889; Agastache rugosd) e (-)-limoneno sintases (DQ195275, REGIÃO: 1.1905; Picea sitchensis), (AF006193, REGIÃO: 73.1986; Abies grandis), e (MHC4SLSP, REGIÃO: 29.1828; Mentha spicata).

[00133] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma mirceno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (U87908; Abies grandis), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10), (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473626; Picea abies), (AF369919; Picea abies), e (AJ304839; Quercus ilex).

[00134] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma ocimeno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (AY 195607; Antirrhinum majus), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (AK221024; Arabidopsis thaliana), (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_117775; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM.001036574; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10), (AB110642; Citrus unshiu CitMTSL4), e (AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus).

[00135] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma α-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (+) α-pineno sintase (AF543530, REGIÃO: 1.1887; Pinus taeda), (-)a-pineno sintase (AF543527, REGIÃO: 32.1921; Pinus taeda), e (+)/(-)a-pineno sintase (AGU87909,

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REGIÃO: 6111892; Abies grandis).

[00136] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma β-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (-) β-pineno sintases (AF276072, REGIÃO: 1.1749; Artemisia annua) e (AF514288, REGIÃO: 26.1834; Citrus limon).

[00137] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma sabineno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência adequada de nucleotídeo inclui, mas sem limitação, AF051901, REGIÃO: 26.1798 from Salvia officinalis.

[00138] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma γ-terpineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem: (AF514286, REGIÃO: 30.1832 de Citrus limon) e (AB110640, REGIÃO 1.1803 de Citrus unshiu).

[00139] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma terpinoleno sintase. Exemplos ilustrativos de uma sequência adequada de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (AY693650 de Oscimum basilicum) e (AY906866, REGIÃO: 10.1887 de Pseudotsuga menziesii).

[00140] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma amorfadieno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência adequada de nucleotídeo é SEQ ID NO. 37 de publicação de patente U.S. 2004/0005678.

[00141] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma α-fameceno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação DQ309034 de Pyrus communis cultivar d’Anjou (pera; nome do gene AFS1) e AY182241 de Malus domestica (maçã; gene AFS1). Pechouus et al., Planta 219(1):84-94 (2004).

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52/105 [00142] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma β-fameceno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação, número de acesso AF024615 de Mentha x piperita (hortelã-pimeta; gene Tspall), e AY835398 de Artemisia annua. Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005).

[00143] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma farnesol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação, número de acesso AF529266 de Zea mays e YDR481C de Saccharomyces cerevisiae (gene Pho8). Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006).

[00144] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma nerolidol sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência adequada de nucleotídeo inclui, mas sem limitação, AF529266 de Zea mays (maize; gene tpsl).

[00145] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma patchouliol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação, AY508730 REGIÃO: 1.1659 de Pogostemon cablin.

[00146] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma nootkatona sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação AF441124 REGIÃO: 1.1647 de Citrus sinensis e AY917195 REGIÃO: 1.1653 de Perilla frutescens.

[00147] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma abietadieno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo incluem, mas sem limitação: (U50768; Abies grandis) e (AY473621; Picea abies).

[00148] Em certas modalidades, a célula hospedeira produz um C5,

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CIO, C15, ou C20 como um primeiro isoprenóide, e C30, C35, C40 ou mais carbono isoprenóide como um segundo isoprenóide. Em certas modalidades, [00149] Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz um isoprenóide C5. Estes compostos são derivados de uma unidade de isopreno e são também denominados hemiterpenos. Um exemplo ilustrativo de um hemiterpeno é isopreno. Em outras modalidades, o isoprenóide é um isoprenóide Cio. Estes compostos são derivados de duas unidades de isopreno e são também denominados monoterpenos. Exemplos ilustrativos de monoterpenos são limoneno, citranelol, geraniol, mentol, álcool perílico, linalol, tujona e mirceno. Em outras modalidades, o isoprenóide é um isoprenóide C15. Estes compostos são derivados de três unidade de isoprenos e também são denominados sesquiterpenos. Exemplos ilustrativos de sesquiterpenos são periplanona B, gingkolídeo B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenceno, nootkatona, epi-cedrol, epi-aristoloqueno, famesol, gossipol, sanonina, periplanona, forscolina e patchoulol (que é também conhecido como álcool de patchouli). Em outras modalidades, o isoprenóide é um isoprenóide C20· Estes compostos são derivados de quatro unidade de isoprenos e são também denominados diterpenos. Exemplos ilustrativos de diterpenos são casbeno, eleuterobina, paclitaxel, prostratina, pseudopterosina e taxadieno. Em algumas modalidades, o isoprenóide é selecionado do grupo que consiste em abietadieno, amorfadieno, careno, afarneceno, β-fameceno, famesol, geraniol, geranilgeraniol, isopreno, linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, β-pineno, sabineno, γterpineno, terpinoleno e valenceno.

[00150] Ainda em outros exemplos, o isoprenóide é um isoprenóide C20+· Estes compostos são derivados de mais de quatro unidade de isoprenos e incluem: triterpenos (compostos de isoprenóide C30 derivados de 6 unidades de isopreno) tal como arbrusideE, bruceantina, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina e esqualeno; tetraterpenos (compostos de isoprenóide C40

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54/105 derivados de 8 isoprenóides) tal como β-caroteno; e politerpenos (compostos de isoprenóide C40+ derivados de mais de 8 unidade de isoprenos) tal como poli-isopreno. Compostos de isoprenóide também incluem, mas sem limitação, carotenóides (tais como licopeno, a- e β-caroteno, a- e βcriptoxantina, bixina, zeaxantina, astaxantina e luteína), compostos esteróides, e compostos que são compostos de isoprenóides modificados por outros grupos químicos, tais como terpeno-alcalóides mistos e coenzima Q-10.

5.6 Via de carotenóide [00151] Vias biossintéticas de carotenóides exemplares são mostradas nas FIGS. 2, 3A, e 3B. Em certas modalidades, além de um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam enzimas em uma via bios sintética para produzir um primeiro isoprenóide, a célula hospedeira pode compreender adicionalmente um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas da via biossintética de carotenóide para coproduzir um ou mais carotenóides. Em certas modalidades, a via biossintética de carotenóide produz um ou mais carotenóides C40.

[00152] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase que pode catalisar a conversão de geranilgeranil pirofosfato em fitoeno. Exemplos ilustrativos de sequências de polipeptideo adequadas ou polinucleotídeos que codificam uma fitoeno sintase incluem, mas sem limitação: CrtB (Lamprocystis purpurea; Proteína do GenBank Ace.: WP.020503292) (EC 2,5.1.99 ou EC 2,5.1.32).

[00153] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase que pode catalisar a conversão de licopeno em betacaroteno, e/ou a conversão de neurosporeno em 7,8-di-hidro-betacaroteno. Exemplos ilustrativos de sequências de polipeptideo adequadas ou polinucleotídeos que codificam uma licopeno ciclase incluem, mas sem limitação: CrtY (Pantoea ananatis; Proteína do GenBank Ace.: BAA14126) (EC 5.5.1.19).

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 71/148 / 105 [00154] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional que pode catalisar a conversão de geranilgeranil pirofosfato em fitoeno (fitoeno sintase), e a conversão de licopeno em β-caroteno (licopeno ciclase), e/ou a conversão de neurosporeno em 7,8-di-hidro-betacaroteno. Exemplos ilustrativos de sequências de polipeptídeo adequadas ou polinucleotídeos que codificam uma enzima como essa bifuncional incluem: CrtY/B (Xanthophyllomyces dendrohous; Verwaal et al. App. Environ. 733(13):434250 (2007); CrtY/B (Phycomyces blakesleeanus; Proteína do GenBank Acc.: XP_018294563), CrtY/B (Neurospora crassa; Proteína do GenBank Acc.: XP_965725), e CrtY/B (Blakeslea trispora; Proteína do GenBank Acc.: AAO46893).

[00155] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase que pode catalisar a conversão de fitoeno em neurosporeno, e/ou a conversão de neurosporeno em licopeno. Exemplos ilustrados de sequências de polipeptídeo adequadas ou polinucleotídeos que codificam uma fitoeno desaturase incluem, mas sem limitação: Crt I (Xanthophyllomyces dendrohous; Verwaal et al. App. Environ. Microbiol. 73(130:4342-50, 2007) CrtI (Xanthophyllomyces dendrorhous; Proteína do GenBank Acc.: CAA75240), CrtI (Mycobacterium goodie; Proteína do GenBank Acc.: WP_049747535), CrtI (Neurospora crassa; Proteína do GenBank Acc.: XP_964713), CrtI (Paenibacillus_sp; Proteína do GenBank Acc.: WP_042140268), e CrtI (Bradyrhizobium_sp; Proteína do GenBank Acc.: WP_0l 1924720) (EC 1.3.99.31 ou EC 1.3.5.5 ou EC 1.3.5.6 ou EC 1.3.99.28 ou EC 1.3.99.30).

[00156] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica betacaroteno cetolase que pode catalisar a conversão de betacaroteno em equinenona, a conversão de

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 72/148 / 105 equinenona em cantaxantina, a conversão de beta-criptoxantina em 3hidroxiequinenona/3’-hidroxiequinenona, a conversão de 3hidroxiequinenona/3’-hidroxiequinenona em fenicoxantina, a conversão de zeaxantina em adonixantina, e/ou a conversão de adonixantina em astaxantina. Exemplos ilustrados de sequências de polipeptídeo adequadas ou polinucleotídeos incluem, mas sem limitação: CrtW (Paracoccus_sp.; Proteína do GenBank Acc.: BAA09591), CrtW (Brevundimonas sp; Proteína do GenBank Ace.: BAD99406), CrtW (Haematococcus lacustris; Proteína do GenBank Ace.: ADN43075), CrtW (Chlamydomonas reinhardtii; XP_001698699), CrtW (Sphingomonas sp. 1PNM-20; Proteína do GenBank Acc.:WP_095996876); CrtW (Paracoccus sp. Cepa N81106 (Agrobacterium aurantiacum) GenBank ID: BAE47465.1; UniProt CRTW_PARSN; Ukibe et al., Appl. Environ. Microbiol. 75(22): 7205-7211 (2009)); HpBkt (Haematococcus pluvialis; GenBank ID D45881.1; BAA08300.1) (EC 1.14.11.B16 ou EC 1.3.5.B4).

[00157] Em certas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma betacaroteno hidroxilase que pode catalisar a conversão de betacaroteno em beta-criptoxantina, a conversão de beta-criptoxantina em zeaxantina, a conversão de equinenona em 3hidroxiequinenona/3’-hidroxiequinenona, a conversão de 3hidroxiequinenona/3’-hidroxiequinenona em adonixantina, a conversão de cantaxantina em fenicoxantina, e/ou a conversão de fenicoxantina em astaxantina. Exemplos ilustrados de sequências de polipeptídeo adequadas ou polinucleotídeos incluem, mas sem limitação: CrtZ (Escherichia vulneris; Proteína do GenBank Acc.: WP_042387980), CrtZ (Pantoea ananatis; Proteína do GenBank Acc.: WP_013027996), CrtZ (Paracoccus_sp.; Proteína do GenBank Acc.:Q44262), CrtZ (Haematococcus lacustris; Proteína do GenBank Acc.:AKQ20654); CrtZ (Paracoccus sp. Cepa N81106 (Agrobacterium aurantiacum) GenBank ID BAE47466.1; CRTZ_PARSN);

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CrtZ (Pantoea ananatis; GenBank ID ADD79330.1; UnitPro D4GFL0_PANAM; Ukibe et al. (2009); HpCrtZ (Haematococcus pluvialis; GenBank KP866868.1; AKQ20654.1) (EC 1.14.13.129).

[00158] Em certas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma citocromo p450 hidroxilase que pode catalisar a conversão de β-caroteno em equinenona, a conversão de equinenona em 3-hidroxiequinenona/3’-hidroxiequinenona, a conversão de 3hidroxiequinenona/3’-hidroxiequinenona em fenicoxantina, e/ou a conversão de fenicoxantina em astaxantina. Exemplos ilustrativos de sequências de polipeptídeo adequadas ou polinucleotídeos incluem, mas sem limitação: CrtS (Xanthophyllomyces dendrorhous; AAY20974; UniProt Q3HR17_PHARH).

[00159] Em certas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma citocromo-p450 redutase, a qual pode interagir com uma citocromo p450 hidroxilase (CrtS) em células hospedeiras na catalisação da conversão de β-caroteno em astaxantina na via de astaxantina, da maneira mostrada na FIG. 3A. Exemplos ilustrativos de sequências de polipeptídeo adequadas ou polinucleotídeos incluem, mas sem limitação: CrtR (Xanthophyllomyces dendrorhous; ACI43097); e (Xanthophyllomyces dendrohous; ID Gen Bank AIP94032.1; UniProt A0A0C4MWF8_PHARH) (EC 1.6.2.4).

[00160] Uma célula hospedeira pode compreender qualquer um ou a combinação de ácidos nucleicos heterólogos que codificam enzimas da via de carotenóide aqui descritas para produzir um composto de carotenóide alvo.

5.7 Modificações para aumentar os níveis de acetil-CoA [00161] Em certas modalidades, quaisquer das células anteriores que produzem compostos de acetil-CoA, compreendem modificações em suas vias de acetil-CoA, de acordo com U.S. 2014/0273144 Al. Em certas modalidades, as células compreendem uma fosfocetolase (PK; EC 4.1.2.9) e uma ruptura funcional de uma enzima endógena que converte acetil fosfato

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 74/148 / 105 em acetato. Em certas modalidades, as células compreendem uma fosfotransacetilase (PTA; EC 2.3.1.8); e uma interferência funcional de uma enzima endógena que converte acetil fosfato em acetato. Em algumas modalidades, a enzima que converte acetil fosfato em acetato é uma glicerol1-fosfatase (EC 3.1.3.21). Em algumas modalidades, a glicerol-1-fosfatase é selecionada do grupo que consiste em GPP1/RHR2, GPP2HOR2 e homólogos e variações destas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma interferência funcional de GPP1/RHR2. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma interferência funcional de GPP2/HOR2. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma interferência funcional tanto de GPP1/RHR2 quanto de GPP2/HOR2. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente um acetilaldeído desidrogenase acilante (ADA; EC 1.2.1.10). Em algumas modalidades, célula hospedeira compreende adicionalmente uma interferência funcional de uma ou mais enzimas do desvio de piruvato desidrogenase (PDH) natural. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas do desvio de PDH são selecionadas de acetil-CoA sintetase 1 (ACS1), acetil-CoA sintetase 2 (ACS2), e aldeído desidrogenase 6 (ALD6).

5.8 Métodos de produzir isoprenóides [00162] Em certas modalidades, é aqui provido um método para a produção de dois ou mais isoprenóides como compostos alvo. O método compreende: (a) cultivar, em um meio de cultura com uma fonte de carbono, uma célula hospedeira geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas em uma primeira via biossintética para produzir um primeiro isoprenóide, e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas em uma segunda via biossintética para produzir segundo isoprenóide, que apresenta um peso molecular que é diferente do primeiro isoprenóide; e (b) recuperar o primeiro isoprenóide, e (c) recuperar o segundo isoprenóide. Em certas modalidades, a

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 75/148 / 105 célula hospedeira não é geneticamente modificada para produzir um composto alvo que não é derivado de IPP. Em certas modalidades, a fermentação é realizada cultivando as células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono, em condições de cultura adequadas, por um período de tempo suficiente para produzir uma biomassa desejada das células hospedeiras, e/ou uma quantidade desejada de isoprenóides.

[00163] Em certas modalidades, o processo de fermentação é realizado em dois estágios - um estágio de construção e um estágio de produção. O estágio de construção é realizado por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade de biomassa celular que pode auxiliar a produção de isoprenóides alvo durante o estágio de produção. O estágio de construção é realizado por um período de tempo suficiente para a população presente no tempo de inoculação para submeter uma pluralidade de dobramentos, até que uma densidade celular desejada seja atingida. Em algumas modalidades, o estágio de construção é realizado por um período de tempo suficiente para a população de célula hospedeira para atingir uma densidade celular (ODôoo) entre 0,01 e 400 no vaso de fermentação ou recipiente, em que o estágio de construção deve ser realizado. Em algumas modalidades, o estágio de construção é realizado até uma ODôoo de pelo menos 0,01 ser atingida. Em algumas modalidades, o estágio de construção é realizado até uma ODôoo de pelo menos 0,1 ser atingida. Em algumas modalidades, o estágio de construção é realizado até uma ODôoo de pelo menos 1,0 ser atingida. Em algumas modalidades, o estágio de construção é realizado até uma ODôoo de pelo menos 10 ser atingida. Em algumas modalidades, o estágio de construção é realizado até uma ODôoo de pelo menos 100 ser atingida. Em algumas modalidades, o estágio de construção é realizado até uma ODôoo entre 0,01 e 100 ser atingida. Em algumas modalidades, o estágio de construção é realizado até uma ODôoo entre 0,1 e 10 ser atingida. Em algumas modalidades,

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60/105 o estágio de construção é realizado até uma ODôoo entre 1 e 100 seja atingida. Em outras modalidades, o estágio de construção é realizado por um período de pelo menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ou mais de 96 horas.

[00164] Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade desejada de isoprenóides alvo. Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de pelo menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ou mais de 96 horas. Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período entre 3 e 20 dias. Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais de 20 dias.

[00165] Em uma modalidade particular, o método de produzir isoprenóides alvo compreende conduzir fermentação da célula hospedeira geneticamente modificada em condições aeróbicas suficientes para permitir crescimento e manutenção da célula hospedeira geneticamente modificada; a seguir fornecer subsequentemente condições microaeróbicas de fermentação suficientes para induzir a produção de isoprenóides alvo, e manter as condições microaeróbicas em todo o ensaio de fermentação. Em certas modalidades, as condições microaeróbicas são usadas em todo o ensaio de fermentação. Em certas modalidades, as condições aeróbicas são usadas em todo o ensaio de fermentação.

[00166] Em certas modalidades, a produção do nível elevado de isoprenóides alvo pela célula hospedeira é indutível por um composto indutor. Uma célula hospedeira como esta pode ser manipulada com facilidade na ausência do composto indutor. O composto indutor é a seguir adicionado para induzir a produção do nível elevado de isoprenóide pela célula hospedeira. Em outras modalidades, a produção do nível elevado de isoprenóide pela célula hospedeira é induzida alterando condições de cultura tais como, por exemplo, a temperatura de crescimento, constituintes de meios, e similares.

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 77/148 / 105 [00167] Em certas modalidades, um agente indutor é adicionado durante o estágio de produção para ativar um promotor, ou alivar a repressão de um regulador transcricional associado a uma via biossintética para promover a produção de isoprenóides alvo. Em certas modalidades, um agente indutor é adicionado durante o estágio de construção para reprimir um promotor, ou para ativar um regulador transcricional associado a uma via biossintética para reprimir a produção de isoprenóides alvo, e um agente indutor é removido durante o estágio de produção para ativar um promotor para aliviar a repressão de um regulador transcricional que promove a produção de isoprenóides alvo. O termo “alteração genética” é aqui usado para se referir ao uso de um promotor ou outros elementos genéticos para controlar a ativação ou desativação da via biossintética para a produção de isoprenóide. Exemplos ilustrativos de agente indutor usado ou uma alteração genética para controlar produção alvo de isoprenóide são descritos em, por exemplo, publicações de pedido PCT WO2015/020649, WO2016/210343 e WO2016210350, que são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

[00168] Em uma outra modalidade, o método de produzir isoprenóides alvo compreende cultivar células hospedeiras em meios de cultura de construção e produção separados. Por exemplo, o método pode compreender cultivar a célula hospedeira geneticamente modificada em um estágio de construção, no qual a célula é cultivada em condições não produtivas (por exemplo, condições não indutoras) para produzir um inóculo, a seguir transferir o inóculo para um segundo meio de fermentação em condições adequadas para induzir produção de isoprenóide alvo (por exemplo, condições indutoras), e manter condições de estágio estacionário no segundo estágio de fermentação para produzir uma cultura de células contendo isoprenóides alvo. [00169] Da maneira ilustrada na FIG. 4, os dois ou mais isoprenóides alvo podem ser produzidos ao mesmo tempo ou sequencialmente. A modalidade 1 da FIG. 4 ilustra a coprodução de isoprenóides alvo (por

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62/105 exemplo, fameceno e carotenóides) simultaneamente ou ao mesmo tempo em um único ensaio de fermentação. Para a coprodução concorrente de isoprenóides alvo, em algumas modalidades, as vias biossintéticas para os isoprenóides alvo são constitutivamente ativas. Em outras modalidades, para coprodução concorrente de isoprenóides alvo, a via biossintética para os isoprenóides alvo pode estar no controle da mesma alteração genética ou um induto. Por exemplo, as vias biossintéticas para a produção de fameceno e carotenóides podem estar no controle de promotores pGal, que são regulados pelo regulon Gal. Exemplos do regulon Gal que são reprimidos ou induzidos adicionalmente por uma maltose são descritos em publicações de pedido PCT WO2015/020649, WO2016/210343 e W02016210350. Em certas modalidades, a produção de um primeiro isoprenóide pode ser induzida primeiro, seguido pela indução da produção do segundo isoprenóide em um único ensaio de fermentação.

[00170] A modalidade 2 da FIG. 4 ilustra uma produção sequencial de isoprenóides de dois ensaios de fermentação após inoculação. Nesta modalidade, o primeiro isoprenóide pode ser produzido durante o primeiro ensaio de fermentação, e o segundo isoprenóide pode ser produzido durante o segundo ensaio de fermentação. Em algumas modalidades, o primeiro isoprenóide pode ser produzido durante o primeiro ensaio de fermentação, e tanto primeiro quanto o segundo isoprenóides podem ser produzidos durante o segundo ensaio de fermentação.

[00171] Em certas modalidades, o cultivar e recuperar compreende: (a) cultivar um inóculo único compreendendo a célula hospedeira para construir uma população da célula hospedeira; (b) cultivar a população da célula hospedeira em condições para produzir o primeiro isoprenóide da população das células hospedeiras, em que as condições não ativam a produção do segundo isoprenóide; (c) separar e recuperar o primeiro isoprenóide da população; (d) após separar o primeiro isoprenóide, cultivar a população ou

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 79/148 / 105 uma subpopulação da célula hospedeira em condições para ativar a produção do segundo isoprenóide; e recuperar o segundo isoprenóide.

[00172] Em certas modalidades, o primeiro isoprenóide é predominantemente liberado da célula hospedeira no meio de cultura, e o segundo isoprenóide permanece predominantemente com a fração da célula (por exemplo, dentro da célula). Em certas modalidades, o segundo isoprenóide é recuperado junto com a célula hospedeira.

[00173] Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada produz uma maior quantidade de um isoprenóide comparada a uma célula parental que não compreende a uma ou mais modificações, ou uma célula parental compreendendo apenas um subconjunto da uma ou mais modificações da célula hospedeira geneticamente modificada, mas é de outra forma geneticamente idêntica. Em algumas modalidades, a maior quantidade é pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou maior que 100%, da maneira avaliada, por exemplo, em rendimento, produção, produtividade, em gramas por litro de cultura de células, miligramas por grama de peso de célula seca, em um volume por unidade de base de cultura de células, em um peso por unidade de base de célula seca, em um volume por unidade de cultura de células por base de unidade de tempo, ou em um peso por unidade de célula seca por base de unidade de tempo.

[00174] Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz um nível elevado de um primeiro isoprenóide que é maior que cerca de 10 gramas por litro de meio de fermentação. Em algumas tais modalidades, o isoprenóide é produzido em uma quantidade de cerca de 10 a cerca de 50 gramas, mais de cerca de 15 gramas, mais de cerca de 20 gramas, mais de cerca de 25 gramas, ou mais de cerca de 30 gramas por litro de cultura de células.

[00175] Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz um nível elevado de um primeiro isoprenóide que é maior que cerca de 50 miligramas

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64/105 por grama de peso de célula seca. Em algumas tais modalidades, o isoprenóide é produzido em uma quantidade de cerca de 50 a cerca de 1.500

miligramas,	mais	de	cerca	de	100	miligramas,	mais	de	cerca	de	150
miligramas,	mais	de	cerca	de	200	miligramas,	mais	de	cerca	de	250
miligramas,	mais	de	cerca	de	500	miligramas,	mais	de	cerca	de	750

miligramas, ou mais de cerca de 1.000 miligramas por grama de peso de célula seca.

[00176] Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz um nível elevado de um isoprenóide que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, superior ao nível de isoprenóide produzido por uma célula parental, em um volume por unidade de base de cultura de células.

[00177] Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz um nível elevado de um isoprenóide que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 81/148 / 105 cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, superior ao nível de isoprenóide produzido pela célula parental, em uma base de peso por unidade de célula seca.

[00178] Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz um nível elevado de um isoprenóide que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, superior ao nível de isoprenóide produzido pela célula parental, em um volume por unidade de cultura de células por base de unidade de tempo.

[00179] Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz um nível elevado de um isoprenóide que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de

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90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, superior ao nível de isoprenóide produzido pela célula parental, em um peso por unidade de célula seca por base de unidade de tempo.

[00180] Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada produz quantidade comparável do primeiro isoprenóide comparada a uma célula parental que não produz o segundo isoprenóide. Em algumas modalidades, a quantidade comparável é pelo menos 90%, 95%, 100% ou superior a 100% comparada a quantidade parental, da maneira avaliada, por exemplo, em rendimento, produção, produtividade, em gramas por litro de cultura de células, miligramas por grama de peso de célula seca, em um volume por unidade de base de cultura de célula, em um peso por unidade de base de célula seca, em um volume por unidade de cultura de células por base de unidade de tempo, ou em um peso por unidade de célula seca por base de unidade de tempo.

[00181] Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada produz quantidade comparável do segundo isoprenóide comparada a uma célula parental que não produz o primeiro isoprenóide. Em algumas modalidades, a quantidade comparável é pelo menos 90%, 95%, 100% ou superior a 100% comparada à quantidade parental, da maneira avaliada, por exemplo, em rendimento, produção, produtividade, em gramas por litro de cultura de células, miligramas por grama de peso de célula seca, em um volume por unidade de base de cultura de células, em um peso por unidade de base de célula seca, em um volume por unidade de cultura de

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 83/148 / 105 células por base de unidade de tempo, ou em um peso por unidade de célula seca por base de unidade de tempo.

5.9 Meios de cultura e condições [00182] Materiais e métodos para a manutenção e crescimento de culturas microbianas são bem conhecidos pelos versados na técnica de microbiologia ou ciência de fermentação (vide, por exemplo, Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, segunda edição, McGraw Hill, Nova Iorque, 1986). Devem ser levados em consideração meio de cultura adequado, pH, temperatura, e exigências para condições anaeróbicas, microaeróbicas ou aeróbicas, dependendo das exigências específicas da célula hospedeira, a fermentação e o processo.

[00183] Os métodos de produzir isoprenóides aqui providos podem ser realizados em um meio de cultura adequado (por exemplo, com ou sem suplementação de pantotenato) em um recipiente adequado incluindo, mas sem limitação, uma placa de cultura de células, um frasco, ou um fermentador. Adicionalmente, os métodos podem ser realizados em qualquer escala de fermentação conhecida na técnica para auxiliar a produção industrial de produtos microbianos. Qualquer fermentador adequado pode ser usado, incluindo um fermentador em tanque agitado, um fermentador airlift, um fermentador de bolha, ou qualquer combinação destes. Em modalidades particulares que utilizam Saccharomyces cerevisiae como a célula hospedeira, as cepas podem ser crescidas em um fermentador da maneira descrita em detalhes por Kosaric, et al., em Ullmann’s Enciclopédia of Industrial Chemistry, Sexta Edição, Volume 12, páginas 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Alemanha.

[00184] Em algumas modalidades, o meio de cultura é qualquer meio de cultura no qual um micro-organismo geneticamente modificado capaz de produzir um isoprenóide pode subsistir, isto é, manter o crescimento e viabilidade. Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio aquoso

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 84/148 / 105 compreendendo fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e fosfato. Um meio como este também pode incluir sais, minerais, metais e outros nutrientes assimiláveis. Em algumas modalidades, a fonte de carbono e cada um dos nutrientes celulares essenciais, são adicionados gradualmente ou continuamente aos meios de fermentação, e cada nutriente exigido é mantido no nível essencialmente mínimo, necessário para assimilação eficiente para células em crescimento, por exemplo, de acordo com uma curva de crescimento celular predeterminada, com base na função metabólica ou respiratória das células que convertem a fonte de carbono em uma biomassa. [00185] As condições adequadas e meios adequados para cultivar micro-organismos são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o meio adequado é suplementado com um ou mais agentes adicionais tal como, por exemplo, um indutor (por exemplo, quando uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam um produto de gene estão no controle de um promotor indutível), um repressor (por exemplo, quando uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam um produto de gene estão no controle de um promotor repressível), ou um agente de seleção (por exemplo, um antibiótico para selecionar micro-organismos compreendendo o as modificações genéticas).

[00186] Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um monossacarídeo (açúcar simples), um dissacarídeo, um polissacarideo, uma fonte de carbono não fermentável, ou uma ou mais combinações destas. Exemplos não limitantes de monossacarídeos adequados incluem glicose, galactose, manose, frutose, xilose, ribose e combinações destes. Exemplos não limitantes de dissacarídeos adequados incluem sacarose, lactose, maltose, trealose, celobiose e combinações destes. Exemplos não limitantes de polissacarídeos adequados incluem amido, glicogânio, celulose, quitina e combinações destes. Exemplos não limitantes de fonte de carbonos não fermentáveis adequados incluem acetato e glicerol.

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 85/148 / 105 [00187] A concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura pode promover o crescimento celular, mas não é tão elevada para reprimir o crescimento do micro-organismo usado. Tipicamente, culturas são ensaiadas com uma fonte de carbono, tal como glicose, sendo adicionadas em níveis para atingir o nível desejado de crescimento e biomassa, mas em níveis não detectáveis (com limites de detecção sendo cerca de <0,1 g/L). Em outras modalidades, a concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura é maior que cerca de 1 g/L, preferivelmente maior que cerca de 2 g/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 5 g/L. Além disso, a concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura é tipicamente menor que cerca de 100 g/L, preferivelmente menor que cerca de 50 g/L, e mais preferivelmente menor que cerca de 20 g/L. Pode-se observar que referências às concentrações de componente de cultura podem se referir tanto às concentrações de componente iniciais quanto contínuos. Em alguns casos, pode ser desejável permitir que o meio de cultura se tome exaurido de uma fonte de carbono durante o cultivo.

[00188] Fontes de nitrogênio assimilável que podem ser usadas em um meio de cultura adequado incluem, mas sem limitação, fontes de nitrogênio simples, fontes de nitrogênio orgânicas e fontes de nitrogênio complexas. Tais fontes de nitrogênio incluem amônia anidra, sais de amônio e substâncias de origem animal, vegetal e/ou microbiana. As fontes de nitrogênio adequadas incluem, mas sem limitação, hidrolisados de proteína, hidrolisados de biomassa microbiana, peptona, extrato de levedura, sulfato de amônio, ureia e aminoácidos. Tipicamente, a concentração das fontes de nitrogênio, no meio de cultura, é maior que cerca de 0,1 g/L, preferivelmente maior que cerca de 0,25 g/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 1,0 g/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de uma fonte de nitrogênio para o meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Em função disso, a concentração das fontes de nitrogênio no meio de cultura é menor que

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70/105 cerca de 20 g/L, preferivelmente menor que cerca de 10 g/L e mais preferivelmente menor que cerca de 5 g/L. Adicionalmente, em alguns exemplos, pode ser desejável permitir que o meio de cultura se torne exaurido das fontes de nitrogênio durante o cultivo.

[00189] O meio de cultura eficiente pode conter outros compostos, tais como sais inorgânicos, vitaminas, metais traço ou promotores de crescimento. Tais outros compostos também podem estar presentes em fontes de carbono, nitrogênio ou mineral no meio eficiente, ou podem ser adicionados especificamente ao meio.

[00190] O meio de cultura também pode conter uma fonte adequada de fosfato. Tais fontes de fosfato incluem tanto fontes de fosfato inorgânico quanto e fosfato orgânico. As fontes de fosfato preferidas incluem, mas sem limitação, sais de fosfato tais como fosfatos de sódio e potássio mono ou dibásico, fosfato de amônio e misturas destes. Tipicamente, a concentração de fosfato no meio de cultura é maior que cerca de 1,0 g/L, preferivelmente maior que cerca de 2,0 g/L e mais preferivelmente maior que cerca de 5,0 g/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de fosfato ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Dessa maneira, a concentração de fosfato no meio de cultura é tipicamente menor que cerca de 20 g/L, preferivelmente menor que cerca de 15 g/L e mais preferivelmente menor que cerca de 10 g/L.

[00191] Um meio de cultura adequado também pode incluir uma fonte de magnésio, preferivelmente na forma de um sal fisiologicamente aceitável, tal como sulfato de magnésio hepta-hidratado, embora outras fontes de magnésio em concentrações que contribuem em quantidades similares de magnésio possam ser usadas. Tipicamente, a concentração de magnésio no meio de cultura é maior que cerca de 0,5 g/L, preferivelmente maior que cerca de 1,0 g/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 2,0 g/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de magnésio ao meio de cultura não é

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71/105 vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Dessa maneira, a concentração de magnésio no meio de cultura é tipicamente menor que cerca de 10 g/L, preferivelmente menor que cerca de 5 g/L, e mais preferivelmente menor que cerca de 3 g/L. Adicionalmente, em alguns exemplos, pode ser desejável permitir que o meio de cultura se torne exaurido de uma fonte de magnésio durante o cultivo.

[00192] Em algumas modalidades, o meio de cultura também pode incluir um agente quelante biologicamente aceitável, tal como o di-hidrato de citrato de trissódio. Em cada exemplo, a concentração de um agente quelante no meio de cultura é maior que cerca de 0,2 g/L, preferivelmente maior que cerca de 0,5 g/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 1 g/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de um agente quelante ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Dessa maneira, a concentração de um agente quelante no meio de cultura é tipicamente menor que cerca de 10 g/L, preferivelmente menor que cerca de 5 g/L, e mais preferivelmente menor que cerca de 2 g/L.

[00193] O meio de cultura também pode incluir inicialmente um ácido ou base biologicamente aceitável para manter o pH do meio de cultura desejável. Ácidos biologicamente aceitáveis incluem, mas sem limitação, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e misturas destes. Bases biologicamente aceitáveis incluem, mas sem limitação, hidróxido de amônio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e misturas destes. Em algumas modalidades, a base usada é hidróxido de amônio.

[00194] O meio de cultura também pode incluir uma fonte de cálcio biologicamente aceitável incluindo, mas sem limitação, cloreto de cálcio. Tipicamente, a concentração da fonte de cálcio, tal como cloreto de cálcio, dihidrato, no meio de cultura, está na faixa de cerca de 5 mg/L a cerca de 2000 mg/L, preferivelmente na faixa de cerca de 20 mg/L a cerca de 1000 mg/L, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 50 mg/L a cerca de 500 mg/L.

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72/105 [00195] O meio de cultura também pode incluir cloreto de sódio. Tipicamente, a concentração de cloreto de sódio no meio de cultura está na faixa de cerca de 0,1 g/L a cerca de 5 g/L, preferivelmente na faixa de cerca de 1 g/L a cerca de 4 g/L, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 2 g/L a cerca de 4 g/L.

[00196] Em algumas modalidades, o meio de cultura também pode incluir metais traço. Tais metais traço podem ser adicionados ao meio de cultura como uma solução estoque que, por conveniência, podem ser preparados separadamente do restante do meio de cultura. Tipicamente, a quantidade de uma solução de metais traço como esta adicionada ao meio de cultura é maior que cerca de 1 ml/L, preferivelmente maior que cerca de 5 mL/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 10 mL/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de um metal traço ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Dessa maneira, a quantidade de uma solução de metais traço como esta adicionada ao meio de cultura é tipicamente menor que cerca de 100 mL/L, preferivelmente menor que cerca de 50 mL/L, e mais preferivelmente menor que cerca de 30 mL/L. Pode-se observar que, além de adicionar metais traço em uma solução estoque, os componentes individuais podem ser adicionados separadamente, cada um dos quais nas faixas que correspondem independentemente às quantidades dos componentes ditados pelas faixas anteriores da solução de metais traço.

[00197] Os meios de cultura podem incluir outras vitaminas, tais como pantotenato, biotina, cálcio, pantotenato, inositol, piridoxina-HCl e tiaminaHC1. Tais vitaminas podem ser adicionadas ao meio de cultura como uma solução estoque que, por conveniência, pode ser preparada separadamente do restante do meio de cultura. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de vitaminas ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos.

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 89/148 / 105 [00198] Os métodos de fermentação aqui descritos podem ser realizados em modos convencionais de cultivo que incluem, mas sem limitação, em lote, em lote alimentado, reciclo celular, contínuo e semicontínuo. Em algumas modalidades, a fermentação é realizada em modo de lote alimentado. Em um caso como este, alguns dos componentes do meio são exauridos durante o cultivo, incluindo pantotenato durante o estágio de produção da fermentação. Em algumas modalidades, a cultura pode ser suplementada com concentrações relativamente altas de tais componentes no início, por exemplo, do estágio de produção, de maneira tal que o crescimento e/ou produção de isoprenóide sejam auxiliados por um período de tempo antes das adições serem exigidas. As faixas preferidas destes componentes são mantidas em toda a cultura fazendo adições, uma vez que os níveis são exauridos pela cultura. Os níveis de componentes no meio de cultura podem ser monitorados, por exemplo, amostrando o meio de cultura periodicamente e ensaiando em relação às concentrações. Altemativamente, uma vez que um procedimento de cultura padrão é desenvolvido, adições podem ser realizadas em intervalos de tempo que correspondem aos níveis conhecidos em tempos particulares em toda a cultura. Como será reconhecido pelos versados na técnica, a taxa de consumo de nutriente aumenta durante o cultivo, uma vez que a densidade celular do meio aumenta. Além disso, para evitar a introdução de micro-organismos estranhos no meio de cultura, a adição é realizada usando métodos assépticos de adição, como são conhecidos na técnica. Além disso, uma pequena quantidade de agente anti-espuma pode ser adicionada durante a cultura.

[00199] A temperatura do meio de cultura pode ser qualquer temperatura adequada para o crescimento das células geneticamente modificadas e/ou produção de isoprenóide. Por exemplo, antes da inoculação do meio de cultura com um inóculo, o meio de cultura pode ser introduzido e mantido em uma temperatura na faixa de cerca de 20°C a cerca de 45°C,

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74/105 preferivelmente em uma temperatura na faixa de cerca de 25°C a cerca de 40°C, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 28°C a cerca de 32°C.

[00200] O pH do meio de cultura pode ser controlado pela adição de ácido ou base ao meio de cultura. Em tais casos, quando amônia é usada para controlar o pH, esta também funciona convenientemente como uma fonte de nitrogênio no meio de cultura. Preferivelmente, o pH é mantido de cerca de 3,0 a cerca de 8,0, mais preferivelmente de cerca de 3,5 a cerca de 7,0, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 4,0 a cerca de 6,5.

[00201] Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono, tal como a concentração de glicose, do meio de cultura é monitorada durante o cultivo. A concentração de glicose do meio de cultura pode ser monitorada usando técnicas conhecidas tais como, por exemplo, teste do uso da enzima glicose oxidase ou cromatografia líquida de alta pressão, que pode ser usada para monitorar a concentração de glicose no sobrenadante, por exemplo, um componente sem célula do meio de cultura. Da maneira previamente declarada, a concentração da fonte de carbono pode ser mantida abaixo do nível no qual a inibição do crescimento celular ocorre. Embora tal concentração possa variar de organismo para organismo, para a glicose como uma fonte de carbono, a inibição do crescimento celular ocorre em concentrações de glicose maiores que em cerca de 60 g/L, e pode ser determinada facilmente por teste. Dessa maneira, quando a glicose é usada como uma fonte de carbono, a glicose é preferivelmente inserida no fermentador e mantida abaixo dos limites de detecção. Alternativamente, a concentração de glicose no meio de cultura é mantida na faixa de cerca de 1 g/L a cerca de 100 g/L, mais preferivelmente na faixa de cerca de 2 g/L a cerca de 50 g/L, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 5 g/L a cerca de 20 g/L. Embora a concentração da fonte de carbono possa ser mantida em níveis desejados por adição de, por exemplo, uma solução de glicose substancialmente pura, que é aceitável e pode ser preferida para

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 91/148 / 105 manter a concentração da fonte de carbono do meio de cultura pode adição de alíquotas do meio de cultura original. O uso de alíquotas do meio de cultura original pode ser desejável, em decorrência das concentrações de outros nutrientes no meio (por exemplo, as fontes de nitrogênio e fosfato) poderem ser mantidas simultaneamente. Da mesma forma, as concentrações de metais traço podem ser mantidas no meio de cultura pela adição de alíquotas da solução de metais traço.

5.10 Recuperação de isoprenóides [00202] Uma vez que um isoprenóide é produzido pela célula hospedeira, este pode ser recuperado ou isolado para uso subsequente, usando quaisquer dos métodos adequados de separação e purificação conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, uma fase orgânica compreendendo o isoprenóide é separada da fermentação por centrifugação. Em outras modalidades, uma fase orgânica compreendendo o isoprenóide se separa da fermentação espontaneamente. Em outras modalidades, uma fase orgânica compreendendo o isoprenóide é separada da fermentação adicionando um desemulsificante e/ou um agente de nucleação na reação de fermentação. Exemplos ilustrativos de desemulsificantes incluem floculantes e coagulantes. Exemplos ilustrativos de agentes de nucleação incluem gotas do próprio isoprenóide e solventes orgânicos tais como dodecano, isopropil miristrato, e metil oleato.

[00203] O isoprenóide produzido nestas células pode estar presente no sobrenadante da cultura e/ou associado com as células hospedeiras. Em modalidades onde o isoprenóide está associado com a célula hospedeira, a recuperação do isoprenóide pode compreender um método de permeabilizar ou lisar as células. Altemativamente ou simultaneamente, o isoprenóide no meio de cultura pode ser recuperado usando um processo de recuperação incluindo, mas sem limitação, cromatografia, extração, extração de solvente, separação de membrana, eletrodiálise, osmose reversa, destilação,

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 92/148 / 105 derivatização química e cristalização.

[00204] Em algumas modalidades, o isoprenóide é separado de outros produtos que podem estar presentes na fase orgânica. Em algumas modalidades, a separação é atingida usando adsorção, destilação, extração gás-líquido (remoção), extração líquido- líquido (extração de solvente), ultrafiltração e técnicas cromatográficas padrão.

[00205] Em algumas modalidades, o primeiro isoprenóide produzido nestas células pode estar presente no sobrenadante da cultura, e o segundo isoprenóide produzido nestas células pode estar associado com as células hospedeiras. Nestas modalidades, uma vez que dois produtos de isoprenóide estão em fases diferentes, é mais fácil separar os mesmos e recuperar os dois produtos de isoprenóide. Os métodos para separar e recuperar os segundos isoprenóides, tais como carotenóides, são descritos na seção de Exemplo a seguir.

Métodos de preparar células geneticamente modificadas [00206] São aqui também providos métodos para produzir uma célula hospedeira que é geneticamente modificada para compreender uma ou mais do modificações descritas anteriormente, por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam enzimas da via biossintética, por exemplo, para a coprodução de compostos de Isoprenóide. A expressão de uma enzima heteróloga em uma célula hospedeira pode ser realizada introduzindo nas células hospedeiras um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo, a qual codifica a enzima no controle de elementos regulatórios que permitem a expressão na célula hospedeira. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um plasmídeo extracromossômico. Em outras modalidades, o ácido nucleico é um vetor de integração cromossomal que pode integrar a sequência de nucleotídeo no cromossomo da célula hospedeira.

[00207] Ácidos nucleicos que codificam estas proteínas podem ser

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 93/148 / 105 introduzidos na célula hospedeira por qualquer método conhecido pelos versados na técnica, sem limitação (vide, por exemplo, Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. Estados Unidos 75:1292-3; Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385; Goeddel et al. eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc. , CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression — A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning — A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; e Ausubel et al., eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, NY). Técnicas exemplares incluem, mas sem limitação, esferoplastia, eletroporação, transformação mediada por PEG 1000, e transformação mediada por acetato de lítio ou cloreto de lítio.

[00208] O número de cópia de uma enzima em uma célula hospedeira pode ser alterado modificando a transcrição do gene que codifica a enzima. Isto pode ser atingido, por exemplo, modificando o número de cópias do sequência de nucleotídeo que codifica a enzima (por exemplo, usando um vetor de expressão com número de cópias maior ou menor compreendendo a sequência de nucleotídeo, ou introduzindo cópias adicionais da sequência de nucleotídeo no genoma da célula hospedeira, ou eliminando ou interrompendo a sequência de nucleotídeo no genoma da célula hospedeira), alterando a ordem de sequências codificantes em um RNAm policistrônico de um operon, ou fragmentando um operon em genes individuais, cada qual com seus próprios elementos de controle, ou aumentando a resistência do promotor ou operador no qual a sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada. Altemativamente ou além disso, o número de cópia de uma enzima em uma célula hospedeira pode ser alterado modificando o nível de tradução de um RNAm que codifica a enzima. Isto pode ser atingido, por exemplo, modificando a estabilidade do RNAm, modificando a sequência do sítio de ligação do ribossomo, modificando a distância ou sequência entre o sítio de

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 94/148 / 105 ligação de ribossomo e o códon inicial da sequência que codifica enzima, modificando a região intercistrônica inteira, localizada “à montante de” ou adjacente à lateral 5’ do códon de partida da região que codifica enzima, estabilizando a extremidade 3 ’ da transcrição de RNAm usando sequências do tipo grampo e especializadas, modificando o uso do códon da enzima, alterando a expressão de RNAts de códon raro usados na biossíntese da enzima, e/ou aumentando a estabilidade da enzima, por exemplo, como mutação da via de sua sequência codificante.

[00209] A atividade de uma enzima em uma célula hospedeira pode ser alterada de inúmeras maneiras incluindo, mas sem limitação, expressar uma forma modificada da enzima que exibe maior ou menor solubilidade na célula hospedeira, expressar uma forma alterada da enzima que perde um domínio através do qual a atividade da enzima é inibida, expressar uma forma modificada da enzima que apresenta uma Kcat maior ou menor, ou uma Km menor ou maior para o substrato, ou expressar uma forma alterada da enzima que é mais ou menos afetada por regulação de retomo ou alimentação direta por uma outra molécula na via.

[00210] Em algumas modalidades, um ácido nucleico usado para modificar geneticamente uma célula hospedeira compreende um ou mais marcadores selecionáveis usados para a seleção de células hospedeiras transformadas, e para inserir pressão seletiva na célula hospedeira para manter o DNA estrangeiro.

[00211] Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um marcador de resistência a antibiótico. Exemplos ilustrativos de marcadores de resistência a antibiótico incluem, mas sem limitação, os produtos de gene BLA, NAT1, PAT, AUR1-C, PDR4, SMR1, CAT, dhfr de camundongo, HPH, DSDA, KAN^r e SH BLE. O produto de gene BLA de E. coli confere resistência a antibióticos beta-lactâmicos (por exemplo, cefalosporinas de espectro estreito, cefamicinas e carbapenens (ertapenem), cefamandol e cefoperazona)

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 95/148 / 105 e a todas penicilinas anti-bactéria gram-negativa, exceto temocilina; o produto de gene NAT1 de S. noursei confere resistência a nourseotricina; o produto de gene PAT de S. viridochromogenes Tu94 confere resistência a bialofos; o produto de gene AUR1-C de Saccharomyces cerevisiae confere resistência a Auerobasidina A (AbA); o produto de gene PDR4 confere resistência a cerulenina; o produto de gene SMR1 confere resistência a metil sulfometurona; o produto de gene CAT de transposon Tn9 confere resistência a cloranfenicol; o produto de gene dhfr de camundongo confere resistência a metotrexato; o produto de gene HPH de Klebsiella pneumonia confere resistência a higromicina B; o produto de gene DSDA de E. coli permite o crescimento de células em placas com D-serina como a única fonte de nitrogênio; o gene KAN^R do transposon Tn903 confere resistência a G418; e o produto de gene SH BLE de Streptoalloteichus hindustanus confere resistência a Zeocina (bleomicina). Em algumas modalidades, o marcador de resistência a antibiótico é eliminado após a célula hospedeira geneticamente modificada aqui descrita ser isolada.

[00212] Em algumas modalidades, o marcador selecionável resgata uma auxotrofia (por exemplo, uma auxotrofia nutricional) no microorganismo geneticamente modificada. Em tais modalidades, um microorganismo parental compreende uma interferência funcional em um ou mais produtos de gene que funcionam em uma via bios sintética de aminoácido ou nucleotídeo, e que quando não funcional torna uma célula parental incapaz de crescer em meios sem suplementação com um ou mais nutrientes. Tais produtos de gene incluem, mas sem limitação, os produtos de gene HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET15, TRP1, ADE2 e URA3 em levedura. O fenótipo auxotrófico pode ser então resgatado transformando a célula parental com um vetor de expressão, ou construção de integração cromossomal que codifica uma cópia funcional do produto de gene interrompido, e a célula hospedeira geneticamente modificada gerada pode ser selecionada com base na perda do

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80/105 fenótipo auxotrófico da célula parental. A utilização dos genes URA3, TRP1, e LYS2 como marcadores selecionáveis apresenta uma vantagem acentuada em decorrência de seleções tanto positivas quanto negativas serem possíveis. A seleção positiva é realizado por complementação auxotrófica das mutações URA3, TRP1 e LYS2, ao passo que a seleção negativa baseia-se em inibidores específicos, isto é, ácido 5-fluor-orótico (FOA), ácido 5-fluorantranílico, e ácido aminoadípico (aAA), respectivamente, que previnem o crescimento das cepas prototróficas, mas permitem o crescimento dos mutantes URA3, TRP1 e LYS2, respectivamente. Em outras modalidades, o marcador selecionável resgata outras deficiências não letais ou fenótipos que podem ser identificados por um método de seleção conhecido.

[00213] São aqui descritos os genes proteínas específicos usados nos métodos, composições e organismos da descrição; entretanto será reconhecido que a identidade absoluta para tais genes não é necessária. Por exemplo, alterações em um gene particular ou polinucleotídeo, compreendendo uma sequência que codifica um polipeptídeo ou enzima, podem ser realizadas e selecionadas em relação à atividade. Tipicamente, tais alterações compreendem mutações conservativas e mutações silenciosas. Tais polinucleotídeos e polipeptídeos modificados ou mutados podem ser selecionados para a expressão de uma enzima funcional, usando métodos conhecidos na técnica.

[00214] Em virtude da degeneração inerente do código genético, outros polinucleotídeos que codificam substancialmente os mesmos, ou funcionalmente equivalentes, polipeptídeos também podem ser usados para clonar e expressar os polinucleotídeos que codificam tais enzimas.

[00215] Como será entendido pelos versados na técnica, pode ser vantajoso modificar uma sequência codificante para melhorar sua expressão em um hospedeiro particular. O código genético é redundante, com 64 códons possíveis, mas a maioria dos organismos usa tipicamente um subconjunto

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81/105 destes códons. Os códons que são utilizados mais frequentemente em uma espécie são denominados códons ideais, e aqueles não utilizados muito frequentemente são classificados como códons raros ou pouco usados. Os códons podem ser substituídos para refletir o uso preferido do códon do hospedeiro, em um processo algumas vezes denominado “otimização de códon” ou “controle para tendência do códon da espécie”.

[00216] Sequências codificantes otimizadas contendo códons preferidos por um hospedeiros procarioto ou eucarioto particular (Murray et al., 1989, Nucl Acids Res. 17: 477-508) podem ser preparadas, por exemplo, para aumentar a taxa de tradução ou para produzir transcrições de DNA recombinante com propriedades desejáveis, tal como uma meia vida mais longa, da maneira comparada com transcrições produzidas de uma sequência não otimizada. Os códons de parada de tradução também podem ser modificados para refletir a preferência do hospedeiro. Por exemplo, códons de parada típicos para S. cerevisiae e mamíferos são UAA e UGA, respectivamente. O códon de parada típico para plantas monocotiledôneas é UGA, ao passo que insetos e E. coli usam comumente UAA como o códon de parada (Dalphin et al., 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8).

[00217] Os versados na técnica reconhecerão que, em virtude da natureza degenerada do código genético, uma variedade de moléculas de DNA que diferem em suas sequências de nucleotídeo pode ser usada para codificar uma dada enzima da descrição. A sequência de DNA natural que codifica as enzimas biossintéticas descritas anteriormente são aqui referenciadas apenas para ilustrar uma modalidade da descrição, e a descrição inclui moléculas de DNA de qualquer sequência que codificam as sequências de aminoácido dos polipeptídeos e proteínas das enzimas utilizadas nos métodos da descrição. De maneira similar, um polipeptídeo pode tolerar tipicamente uma ou mais substituições, eliminações e inserções de aminoácido em sua sequência de aminoácido sem perda ou perda significativa

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82/105 de uma atividade desejada. A descrição inclui tais polipeptídeos com diferentes sequências de aminoácido das proteínas específicas aqui descritas, contanto que os polipeptídeos modificados ou de variação apresentem a atividade enzimática anabólica ou catabólica do polipeptideo de referência. Além disso, as sequências de aminoácido codificadas pelas sequências de DNA aqui mostradas ilustram apenas modalidades da descrição.

[00218] Além disso, homólogos de enzimas usados para as composições e métodos aqui providos são incluídos pela descrição. Em algumas modalidades, duas proteínas (ou uma região das proteínas) são substancialmente homólogas quando as sequências de aminoácido apresentam pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade. Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácido, ou de duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas com propósitos de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em um ou ambos de um primeiro e um segundo aminoácido, ou sequência de ácido nucleico, para alinhamento ideal, e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para propósitos de comparação). Em uma modalidade, o tamanho de uma sequência de referência alinhada com propósitos de comparação é pelo menos 30%, tipicamente pelo menos 40%, mais tipicamente pelo menos 50%, ainda mais tipicamente pelo menos 60%, e ainda mais tipicamente pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do tamanho da sequência de referência. Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo, como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição (da maneira aqui usada, “identidade” de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente à “homologia” de aminoácido ou ácido nucleico). O

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 99/148 / 105 percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando-se em conta o número de lacunas e o tamanho de cada lacuna que precisa ser be introduzida para alinhamento ideal das duas sequências.

[00219] Quando “homólogo” é usado em referência às proteínas ou peptídeos, é reconhecido que as posições de resíduo que não são idênticas frequentemente diferem por substituições conservativas de aminoácido. Uma “substituição conservativa de aminoácido” é aquela na qual um resíduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservativa de aminoácido não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais sequências de aminoácido diferem uma da outra por substituições conservativas, a identidade percentual de sequência ou grau de homologia pode ser ajustado para cima, para corrigir a natureza conservativa da substituição. Meios para realizar este ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica (Vide, por exemplo, Pearson W. R., 1994, Methods in Mol Biol 25: 365-89).

[00220] Os seis grupos a seguir contêm cada qual aminoácidos que são substituições conservativas uma pela outra: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Alanina (a), Valina (V), e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

[00221] A homologia de sequência para polipeptídeos, que também é referida como identidade percentual de sequência, é tipicamente avaliada usando software de análise de sequência. Um algoritmo típico usado, que compara uma sequência de molécula em uma base de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos, é o programa de computador BLAST. Durante a pesquisa de uma base de dados contendo

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84/105 sequências de um grande número de diferentes organismos, é típico comparar sequências de aminoácido.

[00222] Além disso, quaisquer dos genes que codificam as enzimas precedentes (ou quaisquer outras aqui mencionadas (ou quaisquer doa elementos regulatórios que controlam ou modulam a expressão destas)) podem ser otimizados por técnicas de genética/proteína geneticamente modificadas, tal como mutagênese por evolução direcionada ou racional, que são conhecidas pelos versados na técnica. Tal ação permite que os versados na técnica otimizem as enzimas para expressão e atividade em levedura.

[00223] Além disso, genes que codificam estas enzimas podem ser identificados a parir de outras espécies fúngicas e bacterianas, e podem ser expressos pela modulação desta via. Uma variedade de organismos pode funcionar como fontes para estas enzimas incluindo, mas sem limitação, Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae e S. uvarum, Kluyveromyces spp., incluindo K. thermotolerans, K. lactis, e K. marxianus, Pichia spp., Hansenula spp., incluindo H. polimorpha, Candida spp., Trichosporon spp., Yamadazyma spp., incluindo Y. spp. stipitis, Torulaspora pretoriensis, Issatchenkia orientalis, Schizosaccharomyces spp., incluindo S. pombe, Criptococcus spp., Aspergillus spp., Neurospora spp., ou Ustilago spp. Fontes de genes de fungos anaeróbicos incluem, mas sem limitação, Piromyces spp., Orpinomyces spp., ou Neocallimastix spp. Fontes de enzimas procarióticas que são usadas incluem, mas sem limitação, Escherichia, coli, Zymomonas mobilis, Staphylococcus aureus, Bacillus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas spp., Lactococcus spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., ou X. dendrorhous [00224] Técnicas conhecidas pelos versados na técnica podem ser adequadas para identificar genes homólogos adicionais e enzimas homólogas. Em geral, genes análogos e/ou enzimas análogas podem ser identificadas por análise funcional e apresentarão similaridades funcionais. Técnicas

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 101/148 / 105 conhecidas pelos versados na tecnologia podem ser adequadas para identificar genes análogos e enzimas análogas. Por exemplo, para identificar genes PK, PTA, RHR2, HOR2 homológos ou análogos, ou carotenógicos, proteínas, ou enzimas, as técnicas podem incluir, mas sem limitação, clonar um gene por PCR usando oligonucleotídeo iniciadores com base em uma sequência publicada de um gene/enzima de interesse, ou por PCR degenerada usando oligonucleotídeos iniciadores degenerados, determinados para amplificar uma região conservada entre um gene de interesse. Adicionalmente, os versados na técnica podem usar tecnologias para identificar genes homólogos ou análogos, proteínas ou enzimas com homologia funcional ou similaridade. As técnicas incluem examinar uma célula ou cultura de células em relação à atividade catalítica de uma enzima, por meio de ensaios com enzima in vitro para a dita atividade (por exemplo, da maneira aqui descrita ou em Kiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970), a seguir isolar a enzima com a dita atividade por meio de purificação, determinar a sequência de proteína da enzima por meio de técnicas tais como degradação de Edman, desenho de oligonucleotídeos iniciadores de PCR para a provável sequência de ácido nucleico, amplificação da dita sequência de DNA por meio de PCR, e clonagem da dita sequência de ácido nucleico. Para identificar genes homólogos ou similares e/ou enzimas homólogas ou similares, genes análogos e/ou enzimas ou proteínas análogas, as técnicas também incluem comparação de dados em relação a um gene ou enzima candidato com base de dados tais como BRENDA, KEGG ou MetaCYC. O gene ou enzima candidato pode ser identificado nas bases de dados anteriormente mencionadas, de acordo com os preceitos aqui.

6. EXEMPLOS

6.1 Cepa de produção de farneceno parental [00225] Uma cepa de produção de farneceno “não permutável” foi derivada de uma cepa tipo selvagem de Saccharomyces cerevisiae

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 102/148 / 105 (CEN.PK2) e também compreende os seguintes genes da via do mevalonato cromossomicamente integrados de S. cerevisiae no controle de promotores GAL: acetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, e mevalonato pirofosfato descarboxilase; e seis cópias de fameceno sintase mutantes de Artemisia annua. A cepa de produção de farneceno não permutável apresenta o gene GAL80 eliminado e uma cópia adicional de GAL4 no promotor GAL4oc, em que a sequência codificante do gene GAL4 de Saccharomyces cerevisiae está em controle regulatório de uma versão “constitutiva operacional” de seu promotor natural (PGAL4oc; vide, por exemplo, Griggs & Johnston (1991) PAAS 88(19):8597-8601).

[00226] A produção de fameceno na cepa “não permutável” foi então tomada “permutável”, isto é, repressive! na presença de maltose. A cepa maltose permutável é constmída no topo da cepa não permutável integrando cromossomicamente uma cópia de GAL80 no controle do promotor responsivo à maltose, tal como pMAL32. A descrição adicional de cepas permutáveis que produzem farneceno permutável é descrita na publicação do pedido de patente U.S. US 2016/0177341 e publicação do pedido PCT WO 2016/210350, os quais são aqui incorporados pela referência.

[00227] Em certas cepas, as cepas de fameceno permutável foram geneticamente modificadas de maneira adicional, de acordo com Meadows et al. (2016), patente U.S. 8.603.800, patente U.S. 9.410.214, os quais são aqui incorporados pela referência.

6.2 Quantificação de farneceno à base de UV e medições de densidade celular [00228] A titulação de fameceno foi avaliada de acordo com métodos descritos em Meadows et al. (2016). 600 pL de 2-butoxietanol foram adicionados em 150 pL de caldo celular completo em três adições de 200 pL cada, com 90 s de agitação em 1.000 r.p.m. em um agitador de placa de 96

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 103/148 / 105 poços entre cada adição. As amostras foram então incubadas por 40 minutos. 8 pL do extrato de 2-butoxietanol foram misturados com 200 pL de álcool isopropílico em uma placa UV de 96 poços (Costar 3635), a seguir foram lidas em um leitor de placas para absorbância em 222 nM. A titulação de fameceno foi calculada com base na absorbância de uma série de diluição padrão.

[00229] ODôoo foi avaliada da maneira previamente descrita em Meadows et al. (2016) e Sandoval et al. (2015) Metabol. Eng. 25, 215-226 (2014).

6.3 Produção de β-Caroteno por cepa de produção de farneceno [00230] Para testar se carotenóides podem ser coproduzidos além do farneceno, como moléculas de valorização, cinco genes da via foram introduzidos na cepa de produção de fameceno em promotores pGAL. Os genes introduzidos incluem: GGPPS, Xd.CrtYB, Xd.CrtI, Hp.CrtZ, e Hp.Bkt (ou GGPPS, Xd.CrtYB, Xd.CrtI, Pa.CrtZ, e Ps.CrtW) na cepa de produção de farneceno permutável descrita anteriormente. Vinte e sete combinações de dosagem de gene diferente (por exemplo, diferentes cópias de genes da via) foram testadas. Em todas as vinte e sete placas de transformação, colônias amarelas ou laranja foram observadas (Figura 10), indicando o acúmulo de βcaroteno, mas nenhuma em vermelho, que é a cor de astaxantina. Notavelmente, a cor só começou a aparecer 6 dias após plaquear, provavelmente em virtude da baixa expressão de genes da via da biossíntese de carotenóide no controle da permuta de maltose. Análise genética por PCR de colônia mostrou que os genes de biossíntese de astaxantina não estavam integrados. As colônias que produzem β-caroteno representativas foram escolhidas subsequentemente para transformação com genes de biossíntese de astaxantina.

6.4 Produção de astaxantina por cepa de produção de farneceno [00231] Cepa de produção de astaxantina foi construída no topo da

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 104/148 / 105 cepa de produção de farneceno, que compreende pGAL 3 operavelmente ligado ao GGPPS, uma cópia de ácido nucleico que codifica CrtI e quatro cópias de ácidos nucleicos que codificam CrtYB. A via da astaxantina foi completada adicionando tanto gene Hp.CrtZ e Hp.Bkt quanto Pa.CrtZ e Ps.CrtW. Ambos os conjuntos de enzimas originaram colônias vermelhas, indicativo da produção de astaxantina (Figura 11). Este experimento ilustra que astaxantina podería permanecer dentro das células na presença de farneceno. Após produção e recuperação de farneceno, células microbianas usadas com astaxantina dentro das células podem ser valorizadas como uma ração animal (por exemplo, salmão de viveiro).

6.5 Produção simultânea de astaxantina e farneceno por cepas de levedura [00232] A figura 12 mostra a produção de farneceno por cepas geneticamente modificadas para produzir carotenóides (β-caroteno ou astaxantina). Cepa A (também referida como cepa Y021) é a cepa de produção de farneceno base descrita na seção 6.1, e cepa B é uma variação da cepa A usada para introdução de genes da via de carotenóide. A cepa C é derivada de cepa B compreendendo genes adicionais, da maneira mostrada na figura 12. Cepas adicionais mostradas na figura 12 são derivadas de cepa C. No “estado desligado” de produção, todas as cepas crescem (medidas por densidade celular em estado desligado ODôoo) e produzem farneceno (avaliado por titulação de farneceno em estado desligado, da maneira mostrada pelo ensaio à base de UV). Vide seção 6.2. No estado desligado, todas as cepas geneticamente alteradas para a produção de carotenóides também produzem carotenóides (dados não mostrados). Durante o estado ligado (quando a produção de isoprenóide é ativada), as culturas contendo os genes de carotenóide não crescem bem como no estado desligado (quando a produção de isoprenóide não é ativada). Vide FIG. 12. As cepas também produzem muito menos farneceno do que a cepa A, ou sua cepa parental B.

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Este resultado ilustra que fameceno pode ser produzido primeiro, e a seguir a produção carotenóide pode ser ativada.

[00233] Na figura 12, a densidade celular (ODôoo) foi avaliada da maneira a seguir. Uma amostra de 8 pL de uma cultura de células foi combinada com 92 pL de diluente Triton OD (20 g/L de Triton X-114, 200 mL/L de PEG 200, 200 mL/L de etanol 100%, água em repouso) em uma placa de 96 poços clara, a solução foi agitada em 1.000 RPM por 6 minutos, e a ODôoo foi determinada medindo absorbância em 600 nm, em um espectrofotômetro M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[00234] Na figura 12, a titulação de fameceno foi avaliada usando o caldo completo que usa o ensaio à base de UV aqui descrito. Vide seção 6.2. Outros métodos adequados, tal como cromatografia gasosa, pode ser usado para medir a titulação de fameceno.

[00235] Em geral, para precondições de cultura, as cepas cultivadas foram crescidas em placas de 96 poços estéreis (volume de trabalho de 1,1 mL; Axygen) contendo 360 pL de meois Bird Seed (BSM, originalmente descrito por van Hoek et al. (2000). Para as precondições de cultura, a fonte de carbono foi tipicamente uma mistura de 1,4% de sacarose e 0,7% de maltose, a menos que de outra forma indicada. Colônias únicas foram escolhidas em cada poço e incubadas por aproximadamente 72 horas a 33,5°C, 80% de umidade e 1.000 rpm (Infors Multitron; ATR Biotec).

[00236] Para experimentos de produção de fameceno, as culturas saturadas anteriormente mencionadas foram diluídas 1/25 em placas estéreis de 1,1 mL contendo 145 pL de BSM. Tipicamente, a fonte de carbono foi tanto 4% de sacarose quanto uma mistura de 2,3% de sacarose e 1,7% de maltose, a menos que de outra forma indicada. Após 72 horas de cultura, a extração de fameceno foi realizada adicionando 600 pL de álcool isopropílico (IPA) em cada poço. Após incubação de 30 minutos, 8 pL foram transferidos para uma placa de ensaio de fundo claro contendo 192 pL de IPA. A

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90/105 concentração de fameceno foi avaliada por absorbância de UV em 222 nm, em um leitor de placas SpectraMax.

6.6 Produção de β-Caroteno e astaxantina verificada por HPLC

6.6.1 Desenvolvimento do método de extração:

[00237] Vários métodos de extração foram experimentados para extrair betacaroteno e astaxantina das células. A ideia é precipitar as células e extrair os compostos dos precipitados, uma vez que carotenóides não parecem ser secretados das células, da maneira observada pela cor do sobrenadante. Inicialmente, os precipitados foram solubilizados em DMSO e os compostos foram extraídos usando vários solventes não polares, os quais foram adicionalmente diluídos em solução de metanol-THF antes de serem injetados na HPLC. As combinações de solvente testadas foram da maneira a seguir: a) 100% de heptano, b) 1:1 mistura de metanol-THF, c) 1:1 mistura de heptanoTHF, d) 1:1 mistura de metanol-acetona e d) 100% pentano. As extrações também foram comparadas com a condição “sem extração”, na qual o extrato de DMSO foi diretamente diluído em solução de metanol-THF e analisado por HPLC.

[00238] Protocolo de preparação de amostra: Em uma preparação de amostra típica, 120 pL do caldo celular total foram centrifugados em 13.000 rpm por 60 s. O sobrenadante claro foi descartado e o precipitado amarelo/laranja brilhante resultante foi então reconstituído em aproximadamente 400 pL de DMSO, e vortexado por 15 s para misturar os conteúdos. A mistura resultante foi centrifugada na mesma velocidade por 30 s e 100 pL deste extrato de DMSO foram então adicionados em 200 pL da solução 1:1 metanol-THF e analisados por HPLC-UV.

[00239] Resultados e discussão: Todas as extrações foram realizadas usando a mesma amostra. O tamanho da amostra e os volumes do solvente também permaneceram os mesmos. A melhor condição de extração possível foi escolhida comparando as áreas relativas do pico de diferentes extrações.

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Pode-se observar que nenhuma outra correção foi realizada para explicar as diferenças nas densidades dos solventes. Observou-se que as extrações usando um heptano ou pentano puro resultaram na área de pico máxima de betacaroteno, e isto foi comparável à condição “sem extração”. A condição apenas com DMSO foi escolhida, a fim de evitar uma etapa adicional no procedimento de extração. Além disso, relatou-se que DMSO rompe as membranas celulares, o que pode já desempenhar um papel em uma extração/dissociação eficiente de carotenóides das células. A etapa de extração única, entretanto, não está completa, uma vez que não resultou na completa descoloração do precipitado celular resultante (por inspeção visual). Tratar o extrato de DMSO a 70°C por cerca de 10 min também não levou a uma extração completa (carotenóides são estáveis até 80°C)³. Em um experimento em sequência, a extração pode ser repetida pelo menos três vezes para verificar as quantidades de material ainda deixados no precipitado

6.6.2 Preparação padrão [00240] Betacaroteno foi muito difícil de dissolver em solventes como etil acetato, metanol ou isopropanol, mesmo em nível 50 mg/L. Embora seja ideal usar solventes altamente não polares tais como heptano, hexano ou pentano, para dissolver o composto, a imiscibilidade dos solventes com a fase móvel de HPLC tomou-se uma escolha difícil. Neste exemplo, diclorometano foi usado para preparar uma solução estoque de betacaroteno, seguido por diluição adicional deste estoque em acetona para obter concentrações finais exigidas da solução de betacaroteno para os padrões de calibração. As soluções foram imediatamente transferidas para uma garrafa âmbar, purgada com nitrogênio (para remover qualquer ar no espaço vazio) e tampada. Os calibradores foram então aliquotados em frascos GC (~ 300 pL cada) e armazenados no congelador -80°C. Cada alíquota é retirada, descongelada em temperatura ambiente e analisada quando exigido. Os frascos foram descartados após um único uso.

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6.6.3 Desenvolvimento do método HPLC:

[00241] Tentativas iniciais para eluir padrões de betacaroteno usando uma coluna de HPLC de fase reversa C18 ou C8 com as combinações de solvente de fase móvel de metanol, acetonitrila e água não funcionaram.⁴ A maior da literatura sugere usar tanto solventes dorados não polares quanto um éter na fase móvel para eluir betacaroteno usando a coluna de fase reversa.^5,6 Uma vez que usar um clorofórmio ou diclorometano apresenta um risco para a saúde elevado, comparado ao uso de um éter, escolheu-se tetra-hidrofurano como um co-solvente na fase móvel. Os parâmetros de coluna e eluição são da maneira a seguir:____________________________________________________

Coluna	Zorbax-SB-C18
Especificação	100 mm x 3,5 u x 4,6 mm i.d.
Fase móvel A	100% de acetonitrila
Fase móvel B	Metanol com 25% THF (v/v)
Inclinação	60% A: 40% B
Vazão	1 mE/min - isocrático
Tempo	16 min
Volume de injeção	3 μΕ
Comprimento de onda do detector	450 nm, 480 nm e 210 nm

[00242] Tabela 3: Parâmetros de coluna de HPLC e eluição.

[00243] A figura 9 mostra várias amostras de cepa extraídas e analisadas usando as condições mencionadas neste relatório: A) A cepa parental GGPPS sem nenhum dos genes à jusante, como esperado, não exibe nenhum sinal de betacaroteno ou astaxantina; B) a cepa parental contendo apenas genes que codificam betacaroteno mostra claramente a presença do mesmo após extração e análise. A identidade do segundo pico em 13,3 minutos não é clara no momento. Suspeita-se que seja o análogo di-hidro de betacaroteno, que é um subproduto conhecido do gene crtYB (ref: Verwaal et al., 2007) C) a cepa descendente mostra claramente a presença de astaxantina em 1,4 min, junto com betacaroteno e outros carotenóides potenciais. Não é surpreendente encontrar betacaroteno na cepa descendente. As identidades de outros picos menores não são conhecidas e podem ser potencialmente outros carotenóides à jusante (mais polares que betacaroteno, provavelmente formas

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 109/148 / 105 oxigenadas), ou também podem conter alguns análogos de degradação ou transformados de astaxantina.

6.7 Método de extração de carotenóide final e resultados analíticos:

[00244] A tabela 4 ilustra várias cepas que foram construídas no topo de uma cepa isogênica compreendendo os genes da via do mevalonato cromossomicamente integrados de S. cerevisiae. Os genes adicionais (por exemplo, os genes da via biossintética de farneceno sintase, GGPP sintase, betacaroteno ou astaxantina) incorporados em diferentes cepas são mostrados na tabela 4.

[00245] As células foram crescidas em frascos por 48 horas, a seguir permutadas para 1,8% de glicose, 0,2% de galactose, por 48 horas antes da extração. Cepas a partir das quais os carotenóides foram extraídos são descritas na tabela 4.

[00246] extraídos.

farneceno,

Tabela 4: Cepas a partir das quais carotenóides foram

Estas cepas foram geradas a partir de uma cepa que produz derivada de Y337 (Westfall et al., 2012), em que amorfadieno sintase foi removida e substituída por farneceno sintase

Cepas

Descrição

Cepa progenitora da parental 1

Cepa progenitora da parental 2 (5X FS + GGPPS) (15X FS + GGPPS)

Cepa parental 1

Cepa parental 2

Cepa jovem 1

Cepa jovem 2 (5X FS + GGPPS) + (2 CrtI: 1 Crt YB) + Plasmídeo vazio (15X FS + GGPPS) + (2 CrtI: 1 Crt YB) + Plasmídeo vazio (5X FS + GGPPS) + (2 CrtI: 1 Crt YB) + (Ps.CrtW_3 + Ps.CrtZ_3) (15X FS + GGPPS) + (2 CrtI: 1 Crt YB) + (Ps.CrtW_3 + Ps.CrtZ_3) [00247]

As 6 etapas usadas para extração de amostra são da maneira a seguir:

1. 400 uL WCB adicionados em tubo de microcentrífuga de

2,2 mL.

[00248]

2. Precipitado permanece após as amostras serem giradas 45

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94/105 segundos em 13.000 rpm, em uma microcentrífuga de bancada.

[00249] 3. Sobrenadante sem cor removido por pipeta.

[00250] 4. 1.000 uL de DMSO foram adicionados ao precipitado, vortexado por 30 segundos duas vezes.

[00251] 5. Giro por 45 segundos em 13.000 rpm, em microcentrífuga de bancada.

[00252] 6. Precipitado verificado em relação à cor- 150 uL de sobrenadante adicionados em 150 uL de mistura 1:1 MeOH:THF em frasco de âmbar GC com inserção, pronto para HPLC.

[00253] Traços de HPLC da cepa progenitora da parental 1, cepa parental 1 e cepa jovem 1 mostram claramente que nenhum dos carotenóides está presente sem os genes de β -caroteno, que dois picos claros (β -caroteno em 11,6 minutos e um pico considerado hidroxil β -caroteno em 13,3 minutos), e que astaxantina (1,42 minuto) e inúmeros outros carotenóides, bem como algum β-caroteno, estão presentes nas colônias mais avermelhadas (Figura 9). Figura 9 demonstra que a cepa jovem 1 produz astaxantina.

6.8 Exemplo: Coprodução de carotenóides e um sesquiterpeno e seu impacto na produção de sesquiterpeno e densidade celular [00254] Este exemplo ilustra que um fluxo elevado da cepa de fameceno pode ser geneticamente modificada de maneira adicional para coproduzir carotenóides, sem reduzir substancialmente a produção de fameceno e o rendimento de biomassa celular.

6.8.1 Montagem de DNA e transformações [00255] As constmções de DNA multi-componente foram geradas usando métodos de montagem de DNA, da maneira previamente descrita (De Kok et al. (2014) ACS Synth. Biol. 21;3(2):97-106. doi: 10.1021/sb4001992; Serber et al., patente U.S. 8.221.982). Fragmentos lineares de cassetes de DNA doador são transformados em uma célula hospedeira para integração no genoma da célula hospedeira, de acordo com métodos descritos em Horwitz et

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 111/148 / 105 al. Cell Sy st. Jul 29; 1 (1):88-96 (2015) e DiCarlo et al. Nucleics Acids Res., 41 (2013), pp. 4336-4343). A transformação em um hospedeiro para integração genômica foi realizada usando os métodos otimizados de S. cerevisiae LiAc (Gietz e Woods, Methods Enzymol. 2002;350:87-96). Cada uma das integrações sem marcador foi confirmada usando uma PCR de colônia.

6.8.2 Meios e cultivo de cepa [00256] A coprodução de farneceno e carotenóides foi realizada em placa de microtitulação de 96 poços em 1.000 rpm, agitando com 80% de umidade relativa. As culturas usadas para a inoculação das placas de microtitulação foram mantidas em placas com ágar de meio sintético completo a 28°C com 2% de glicose, 1% de maltose, 2 g/L de lisina e 50 pg/mL de G418. As colônias foram escolhidas em poços, em placas de microtitulação de 96 poços estéreis (volume de trabalho de 1,1 mL; Axygen) contendo 360 mL de meios Bird Seed líquidos para crescimento definidos (BSM) com 2% de carbono total (1,4% de sacarose, 0,7% de maltose) e Ig/L de lisina. Esta placa de pré-cultura foi incubada por 72 horas a 28°C, 80% de umidade e 1000 rpm (Infors Multitron; ATR Biotec). A massa inicial construída foi diluída 1/25 em duas placas estéreis de 1,1 mL contendo (i) 360 mL de meios Bird Seed líquidos para crescimento definidos contendo 4% de sacarose como uma fonte de carbono, e esta placa foi usada para medir o rendimento da espécie de biomassa e carotenóide, e (ii) 150 uL de meios de crescimento definidos com 4% de sacarose como uma fonte de carbono. A primeira placa foi incubada por quatro dias antes de ser usada para medir o rendimento da biomassa e produção de carotenóides usando o ensaio UVUPLC. Farneceno foi avaliado após incubar a segunda placa por 3 dias e extrair todo o poço com isopropanol, e foi medido usando um ensaio à base de UV. Vide seção 6.2.

6.8.3 Resultados: Produção de cantaxantina e outros intermediários de carotenóide

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 112/148 / 105 [00257] Neste experimento, cepa YOU que produz farneceno foi usada como a cepa que produz farneceno base. A cepa YOU é uma outra cepa que produz farneceno permutável compreendendo elementos genéticos descritos no exemplo 6.1, e é uma variação de cepa Y021 descrita na seção 6.5. As sequências de códon otimizado de S. cerevisiae de fitoeno sintase/licopeno ciclase de Phycomyces blakesleeanus, fitoeno sintase/licopeno ciclase de Neurospora crassa, fitoeno desaturase Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) e β-caroteno cetolase de Paracoccus sp. Foram inicialmente integradas no genoma da célula hospedeira usando construções determinadas como cassetes de expressão divididos convergentes. Além disso, o BTS1 natural (geranilgeranil difosfato sintase), ERG8 (fosfomevalonato quinase) e MVD1 (mevalonato pirofosfato descarboxilase) de S. cerevisiae também foram superexpressos após integrar uma segunda construção dividida no genoma da célula hospedeira. Ambas as construções foram integradas no genoma de Y011, da maneira descrita anteriormente, e o gene expressão de cada construção foi direcionado usando o promotor bidirecional pGALl/10 forte natural forte. As cepas foram construídas da maneira descrita anteriormente (vide materiais e métodos) e os transformantes foram selecionados em placa de ágar contendo 50 pg/mL de G418. Integrações corretas foram verificadas por PCR de colônia. Cepas Y924 e Y925 são dois clones resultantes com integrações corrigidas.

[00258] Avaliou-se a produção de farneceno e carotenóide após crescimento das células em meios Bird Seed definidos com 4% de sacarose por 3 dias (farneceno), ou meios com 4% de sacarose apenas por 4 dias (carotenóide e biomassa).

[00259] Nossos dados indicam que cepas coprodutoras de carotenóide Y924 e Y925 (derivadas de YOU) podem preparar uma quantidade substancial de cada um de cantaxantina, licopeno, fitoeno e β-caroteno. Entretanto, o rendimento da biomassa foi significativamente menor que a

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 113/148 / 105 parental (que produz apenas fameceno). Em função disso, estas cepas produziram menos fameceno do que a parental em placa de 96 poços. Uma redução substancial tanto na produção de fameceno quanto no rendimento da biomassa é mostrada na FIG. 13. Os efeitos negativos de coproduzir um nível elevado de carotenóides na cepa que produz farnecenos leva à próxima hipótese de que a expressão de genes que codificam a via de carotenóide em menor nível será a direção para a geração cepas mais saudáveis.

6.9 Exemplo: Coprodução de carotenóides e sesquiterpeno sem reduzir o rendimento de sesquiterpeno e da biomassa [00260] Este exemplo ilustra que a via de carotenóide pode ser modificada, de maneira tal que o produto primário de isoprenóide, fameceno, possa ser coproduzido com um carotenóide sem sacrificar a quantidade de rendimento de fameceno ou da biomassa, comparada a uma célula hospedeira parental geneticamente modificada para produzir apenas fameceno. Neste exemplo, a via de carotenóide “superior”, mostrada na FIG. 2, foi expressa usando promotores de diferentes concentrações, cada promotor operavelmente ligado aos ácidos nucleicos que codificam as enzimas da via biossintética de carotenóide.

[00261] No exemplo 6.7, todos os genes que codificam a via de carotenóide, incluindo uma segunda cópia de BTS1 (os genes GGPS naturais), foram expressos usando seu promotor bidirecional mais forte, pGALl/10 (Tabela 5). A fim de testar a hipótese de que a expressão de genes que codificam a via de carotenóide em níveis inferiores levará à coprodução de cepas mais saudáveis, escolhe-se um promotor natural (pGAL3) e um promotor semis sintético (pGAL2_vlO) que apresentam diferente força do promotor com relação ao pGALl (Tabela 5). A força do promotor do promotor semissintético pGAL2_vlO é equivalente a cerca daquela do promotor endógeno pGAL7.

[00262] Tabela 5. Força relativa do promotor medida pela expressão

Petição 870190064942, de 10/07/2019, pág. 114/148 / 105 de GFP em cepa tipo selvagem CEN.PK2 usando galactose como uma fonte de açúcar___________________________________________________________

Promotor	Força do promotor com relação a pGALl
pGALl	1
pGAL2 vlO	0,36
pGAL3	0,11

[00263] Neste experimento, expressou-se apenas a via de carotenóide “superior”, levando à produção de β-caroteno (vide FIG. 2), e não foi superexpressa uma segunda cópia de BTS1. Na cepa que produz fameceno (YOU) anteriormente descrita, integrou-se no genoma as sequências otimizadas de códon de S. cerevisiae de fitoeno sintase/licopeno ciclase (CrtYB) e fitoeno desaturase (Crtl) de Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). A construção foi determinada como cassetes de expressão convergente. Testou-se diferentes combinações de promotores para expressar a via de carotenóide “superior”. Avaliou-se a produção de farneceno, biomassa e carotenóide após crescer as células por 3 dias em placas de microtitulação de 96 poços, da maneira descrita anteriormente. Os presentes dados indicam que estas novas cepas coprodutoras, Y854 (pGAL3> CrtYB; _PGAL2_vlO>CrtI) Y855 (pGAL3> CrtYB,pGAL3> Crtl), coproduziram pelo menos 1,0 mg/L de β-caroteno e 1,93 mg/L em placas de microtitulação, respectivamente, sem nenhum impacto na produção de farneceno e de biomassa. Vide FIG. 14A e 14B. Além disso, estas cepas produziram cerca de 1,1 a 1,4 mg/L de fitoeno, sugerindo que otimização adicional da via pode levar potencialmente à coprodução de maior nível de βcaroteno, sem afetar a produção de fameceno.

6.10 Exemplo: Coprodução / produção sequencial de sesquiterpeno e carotenóides, e sua razão de produção [00264] Este exemplo ilustra esta razão de sesquiterpeno e carotenóide que pode ser coproduzido ou sequencialmente produzido, sem impactar muito na produção do isoprenóide primário, sesquiterpeno, ou no rendimento da biomassa.

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6.10.1 Montagem e transformações de DNA [00265] As construções de DNA multi-componentes foram geradas usando métodos de montagem de DNA, da maneira previamente descrita (De Kok et al. (2014) ACS Synth. Biol. 21;3(2):97-106. doi: 10.1021/sb4001992; Serber et al., patente U.S. 8.221.982). Fragmentos lineares de cassetes de DNA doadores são transformados em uma célula hospedeira para integração no genoma da célula hospedeira, de acordo com métodos descritos em Horwitz et al. (2015) e DiCarlo et al. (2013). A transformação em um hospedeiro para integração genômica foi realizada usando os métodos otimizados LiAc de S. cerevisiae (Gietz e Woods, 2002). Cada uma das integrações sem marcador foi confirmada usando uma PCR de colônia.

[00266] Para a cepa construída usando os promotores responsivos ao estradiol, Y440, os genes que codificam o Blakeslea trispora GGPPS, Xanthophyllomyces dendrorhous CrtI, e Haematococcus pluvialis $-caroteno cetolase e fi-caroteno hidroxilase foram expressos usando o promotor responsivo ao estradiol mais forte descrito anteriormente (Mclssac et al. (2014) Nucleic Acids Res. 42:e48), enquanto o Xanthophyllomyces dendrorhous CrtYB usado foi expresso usando promotor semissintético (pGAL2_vlO).

6.10.2 Meios e cultivo de cepa com estradiol.

[00267] Coprodução de fameceno e carotenóides foi conduzida em placa de microtitulação de 96 poços, em agitação de 1.000 rpm, com 80% de umidade relativa. As culturas usadas para a inoculação doas placas de microtitulação foram mantidas em placas com ágar de meio sintético completo a 28°C com 2% de glicose, 1% de maltose, 2g/L de lisina e 50pg/mL de G418. As colônias foram escolhidas em poços, em placas de microtitulação de 96 poços estéreis (volume de trabalho de 1,1 mL; Axygen) contendo 360 mL de meios Bird Seed líquidos para crescimento definidos (BSM), com 2% de carbono total (1,4% de sacarose, 0,7% de maltose) e Ig/L

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100 / 105 de lisina. Esta placa de pré-cultura foi incubada por 72 horas a 28°C, 80% de umidade e 1000 rpm (Infors Multitron; ATR Biotec). A massa inicial construída foi diluída 1/25 em duas placas estéreis de 1,1 mL contendo (i) Placa 1: 360 mL de meios Bird Seed líquidos para crescimento definidos contendo 4% de sacarose como uma fonte de carbono, e esta placa foi usada para medir a concentração de biomassa (g de peso de célula seca por litro de cultura) e espécie de carotenóide na ausência ou presença de 15nM de estradiol (daqui por diante referida como “coprodução”), e (ii) Placa 2: 150 uL de meios de crescimento definidos com 4% de sacarose como uma fonte de carbono contendo uma emulsificação de agente tensoativo oleoso, na ausência ou presença de 15nM de estradiol, e foi usada a fim de medir a produção de fameceno. No segundo ciclo de inoculação, a biomassa da placa 1 (sem nenhum adição de estradiol) foi girada e 25% da biomassa fo inoculada tanto em (a) um volume total de 360 mL de meios Bird Seed líquidos para crescimento definidos contendo 4% de sacarose e estradiol 50mM, quanto (b) 150 uL de meios de crescimento definidos com 4% de sacarose e estradiol 50mM contendo um agente tensoativo oleoso (daqui por diante referido como “sequencial”). As placas inoculadas foram cada qual usadas para medir o rendimento da espécie de biomassa e carotenóide em um processo sequencial, ou foram usadas para medir a produção de fameceno respectivamente. A produção de biomassa, fameceno e carotenóide foi avaliada após 24-72 horas de incubação.

6.10.3 Protocolo de extração de carotenóide/xantofila:

[00268] Após cultivo, as células são centrifugadas em velocidade máxima por 5 minutos para precipitar. O sobrenadante é removido por pipetação. DMSO (dimetil sulfóxido) é adicionado ao precipitado adicionando 2 vezes o volume final da cultura. O vaso é tampado e incubado em temperatura ambiente, em um agitador a 1500 rpm por 30 minutos. Volume igual de n-heptano é a seguir adicionado à mistura de DMSO-célula.

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Esta é tampada e incubada novamente em RT, 1500 rpm, 30 minutos. Aproximadamente, 1/6 do volume da cultura de salina tamponada com fosfato, pH 7,0, é então adicionada à mistura DMSO-heptano-célula para aumentar a polaridade da camada de DMSO. Esta é agitada por mais 5 minutos. A mistura é então centrifugada em 5.000 x g por 5 minutos para assentar as camadas e precipitar qualquer resto celular. Uma alíquota da camada superior de heptano é transferida para um novo recipiente, que pode ser preenchida em um instrumento analítico para análise.

6.10.4 Protocolos de ensaio de carotenóide/xantofila:

6.10.4.1 Método UHPLC-DAD para detecção e quantificação de carotenóides e xantofilas:

[00269] Amostras extraídas e curvas de calibração são ensaiadas em um Thermo Scientific Vanquish série UHPLC, com detector de arranjo de diodos (DAD). 2uL de volume da amostra são injetados na coluna (Agilent Eclipse Plus C8 2,luM x lOOmM 1,8) usando um método de gradiente de 8,5 minutos de 60% de solvente B em 90% de B (Sovente A: 50% de MeOH/água Acetato de amônio 5mM, 0,1% de HOAc; Solvent B: 10%/80%/10% MeOH/IPA/água Acetato de amônio 5mM 0,1% de HOAc). O método usado apresenta uma vazão de 0,5 mL/min e uma temperatura de coluna de 45 Celcius. Os comprimentos de onda usados para detecção são 260nm (Fitoeno) 471 nm (Licopeno), 454nm (β-Caroteno, Cantaxantina e Astaxantina).

6.10.4.2 Medição de xantofilas nos extratos celulares completos por espectrometria de massa (MS):

[00270] As amostras extraídas junto com padrões de curva de calibração pré-misturados são submetidas à base de dados Themis para gerar lista de trabalho, e a seguir por sua vez ensaiar em Agilent 6545 QTOF usando fonte de ionização química com pressão atmosférica (APCI) e modo automático. Volume de 5 uL é injetado na coluna (50 x 2,lmm i.d. Poroshell 120 SB-C8, Part# 689775-906) usando método de gradiente de 3 minutos de

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40% de B em 100% de solvente B ( Fase móvel A: 50% de MeOH/água Acetato de amônio 5mM, 0,1% de HOAc; Fase móvel B: 10%/80%/10% de MeOH/IPA/água Acetato de amônio 5mM 0,1% de HOAc. O método usado apresenta uma vazão de 0,4 mL/min e a temperatura da coluna de 60 graus Celsius. Uma lista preferida dos analitos é criada para gerar padrão de fragmentação MS/MS para analitos de identificação adicionais produzidos. Os dados são então analisados e calculados usando Qual e Quant Masshunter para identificar o produto e gerar medição de titulação.

6.10.5 Resultados de coprodução [00271] Este resultado descreve os resultados do desenho de coprodução experimental descrito na seção 6.9.2.

[00272] A cepa parental (Y021), que é uma cepa que produz farneceno de fluxo elevado, produz farneceno tanto na ausência quanto na presença de estradiol (15 nM), mas não produz nenhum de carotenóides ou xantofilas em ambas as condições de crescimento.

[00273] Da maneira descrita anteriormente, cepa Y440 (descrita na seção 6.10.1) é geneticamente modificada para produzir tanto farneceno quanto carotenóides. Quando os genes que codificam a biossíntese de carotenóides são induzidos em um nível baixo (pela adição de estradiol 15 nM), então β-caroteno é produzido, bem como farneceno. A diferença na produção de farneceno na cepa parental Y021 versus cepa Y440 foi insignificante (por exemplo, menos de 5% em peso). A diferença na concentração de biomassa (g de peso de célula seca por litro de cultura) na cepa parental Y021 versus cepa Y440 também foi insignificante (por exemplo, menos de 5%). Estes resultados demonstram a produção e secreção de um produto (isto é, farneceno) no meio de cultura, e um carotenóide associado à célula (β-caroteno), sem impactar muito na quantidade de produção de farneceno ou rendimento da biomassa. Neste experimento, a razão de peso de β-caroteno para peso de farneceno produzido por placa foi

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103 / 105 determinada para ser cerca de 0,01%.

6.10.6 Resultados de produção sequencial [00274] Esta seção de resultado descreve o desenho experimental da produção sequencial descrito em 6.10.2. Na primeira cultura de produção (PC), quando os genes que codificam a produção carotenóide não estão incluídos, farneceno é produzido mas não o β-caroteno. Após transferência de 25% desta cultura para uma segunda fermentação, na qual os genes que codificam enzimas biossintéticas de carotenóide e xantofila são induzidos em alto nível pela presença de estradiol 50 nM, tanto um carotenóide (β-caroteno) quanto xantofilas (cantaxantina e luteína/zeaxantina) podem ser detectados, isto demonstra produção sequencial na qual fameceno é produzido na primeira cultura de produção, e carotenóides (e produção incidental de fameceno) são produzidos na segunda cultura de produção. Neste experimento, a razão de peso de β-caroteno para peso de farneceno produzido do peso de β-caroteno é cerca de 0,03%.

6.11 Exemplo: Coprodução de farneceno e carotenóides em uma cultura fermentadora [00275] Cepa Y440 foi cultivada em um fermentador de 0,5 L usando o protocolo descrito em Meadows et al. (2016), com a exceção de que a alimentação de açúcar foi xarope de cana de açúcar brasileira. Estradiol 15 nM foi adicionado ao meio no fermentador de 0,5 L, mediante inoculação com Y440, e em todas as adições subsequentes de meios, de maneira tal que a concentração de estradiol no fermentador fosse mantida a 15 nM. Após cultivo por mais de 48 horas, a cultura continha 4,8 g de farneceno por quilograma de caldo celular completo e 7 mg de carotenóides (licopeno e βcaroteno). Isto corresponde a uma razão de produção aproximada de 0,14% de carotenóides para fameceno em peso.

[00276] As referências a seguir são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra:

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104 / 105 [00277] 1. Westfall, P.J., et al., Production of amorphadiene in yeast, and its conversion to dihydroartemisinic acid, precursor to the antimalarial agent artemisinin. Proc Natl Acad Sei USA, 2012. 109(3): p. El 11-8.

[00278] 2. Meadows, A.L., et al., Rewriting yeast central carbon metabolism for industrial isoprenoid production. Nature, 2016. 537(7622): p. 694-697.

[00279] 3. Verwaal, R., et al., High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Appl Environ Microbiol, 2007. 73(13): p. 4342-50.

[00280] 4. Ukibe, K., et al., Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for astaxanthin production and oxidative stress tolerance. Appl Environ Microbiol, 2009. 75(22): p. 7205-11.

[00281] 5. Mclsaac, R.S., et al., Synthetic biology tools for programming gene expression without nutritional perturbations in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res, 2014. 42(6): p. e48.

[00282] 6. Bendjilali, N., et al., Time-Course Analysis of Gene

Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3: GenesIGenomesIGenetics, 2017. 7(1): p. 221-231.

[00283] 7. Notman et al. Molecular basis for dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes J. Am. Chem. Soc., 128, 2006, 1398213983.

[00284] 8. He et al. Ion transport through dimethyl sulfoxide (DMSO) induced transient water pores in cell membranes. Mol. Membr. Biol. 3-4, 2012, 107-113.

[00285] 9. Kim, J.K., Kim, J.I., Lee, N.K., Hahm, Y.T., Baik, M.Y.,

Kim, B.Y. Extraction of β-carotene produced from yeast Rhodosporidium sp. and its heat stability Food Sci. Biotechnol. 19, 2010, 263-266.

[00286] 10. Sol Maiam rivera Velez. Guide for carotenoid

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105 / 105 identification in biological samples J. Nat. Prod. Doi:10.1021/acs.jnatprod.5b00756 [00287] 11. O’Connor, K.C., Vella, G.J. Non-aqueous reverse phase purification of carotenes on a small particle preparative packing.

[00288] 12. Mclssac, R.S. et al. (2014) Nucleic Acids Res. 42: e48.

Doi: 10.1093/nar/gktl402 [00289] Uma ou mais características de quaisquer modalidades aqui descritas ou nas figuras podem ser combinadas com uma ou mais características de qualquer outra modalidade aqui descrita nas figuras, sem fugir do escopo da invenção.

[00290] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados nesta especificação são aqui incorporados pela referência, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado pela referência. Embora a invenção precedente tenha sido descrita no mesmo detalhe, a título de exemplo de ilustração, e exemplo com propósitos de esclarecer o entendimento, será facilmente evidente para os versados na técnica à luz dos preceitos desta invenção que certas alterações e modificações podem ser realizadas, sem fugir do espírito ou escopo das reivindicações em anexo.

Claims (44)

1. Método para coprodução de dois ou mais isoprenóides, caracterizado pelo fato de que o método compreende:

(a) cultivar, em um meio de cultura, uma célula hospedeira geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas em uma primeira via bios sintética para produzir um primeiro isoprenóide, e com um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas em uma segunda via biossintética para produzir um segundo isoprenóide, o qual apresenta um peso molecular que é diferente do primeiro isoprenóide; e (b) recuperar o primeiro isoprenóide; e (c) recuperar o segundo isoprenóide.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira não é geneticamente modificada para produzir um composto alvo para recuperação sem ser um composto derivado de IPP.

3. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro isoprenóide e segundo isoprenóide são produzidos ao mesmo tempo durante um ensaio de fermentação de um inóculo único.

4. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro isoprenóide e segundo isoprenóide são produzidos sequencialmente de um inóculo único compreendendo a célula hospedeira.

5. Método para coprodução de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro isoprenóide e o segundo isoprenóide são produzidos sequencialmente usando uma alteração genética.

6. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o

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2/9 cultivar e recuperar compreendem:

(a) cultivar o inóculo único compreendendo a célula hospedeira para construir uma população de células hospedeiras;

(b) cultivar a população de células hospedeiras em condições para produzir o primeiro isoprenóide da população de células hospedeiras, em que as condições não ativam a produção do segundo isoprenóide;

(c) recuperar o primeiro isoprenóide da população;

(d) após separar o primeiro isoprenóide, cultivar a população ou uma subpopulação das células hospedeiras em condições para ativar a produção do segundo isoprenóide; e (e) recuperar o segundo isoprenóide.

7. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro isoprenóide é predominantemente liberado da célula hospedeira no meio de cultura e o segundo isoprenóide permanece predominantemente intracelularmente.

8. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide permanece predominantemente intracelularmente e é recuperado junto com a massa de célula hospedeira.

9. Método para coprodução de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro isoprenóide é um isoprenóide C5, CIO, Cl5, ou C20, e em que o segundo isoprenóide é um carbono isoprenóide C30, C35, C40, ou maior.

10. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro isoprenóide é um isoprenóide C15 e o segundo isoprenóide é um isoprenóide C40.

11. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com

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3/9 qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro isoprenóide é fameceno e o segundo isoprenóide é um carotenóide.

12. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide é astaxantina, xantofila, ou cetocarotenóide.

13. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide é um ou mais de astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, β-caroteno, licopeno e luteína.

14. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a razão do um ou mais carotenóides para o sesquiterpeno é entre cerca de 0,001 a 2% em peso.

15. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a razão do um ou mais carotenóides para o sesquiterpeno é entre cerca de 0,1 a cerca de 1 % em peso.

16. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira coproduz cerca de 2,5 g/L a cerca de 200 g/L do primeiro composto de isoprenóide e cerca de 1 mg/L a cerca de 4000 mg/L do segundo composto de isoprenóide.

17. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira coproduz cerca de 100 g a cerca de 5000 g do primeiro isoprenóide e cerca de 1 g a cerca de 50 g do segundo isoprenóide, cada qual por quilogramas de massa celular seca.

18. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a

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4/9 quantidade do primeiro isoprenóide produzido durante a coprodução com o segundo isoprenóide é pelo menos cerca de 90% da quantidade do primeiro isoprenóide produzido por uma célula hospedeira parental, em que a dita célula hospedeira parental é geneticamente modificada para produzir o primeiro isoprenóide, mas não o segundo isoprenóide.

19. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a quantidade do primeiro isoprenóide produzido durante a coprodução com o segundo isoprenóide é pelo menos cerca de 95% da quantidade do primeiro isoprenóide produzido nas mesmas condições de cultura, mas sem coprodução do segundo isoprenóide.

20. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma densidade celular da célula hospedeira durante coprodução do primeiro isoprenóide e o segundo isoprenóide é pelo menos cerca de 90% de uma densidade celular de uma célula hospedeira parental que é geneticamente modificada para produzir o primeiro isoprenóide, mas não o segundo isoprenóide.

21. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma densidade celular da célula hospedeira durante coprodução do primeiro isoprenóide e o segundo isoprenóide é pelo menos cerca de 95% de uma densidade celular de uma célula hospedeira parental que é geneticamente modificada para produzir o primeiro isoprenóide, mas não o segundo isoprenóide.

22. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro isoprenóide é um sesquiterpeno o segundo isoprenóide é um carotenóide, em que um fluxo de carbono para a produção de carotenóide é

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5/9 reduzido, comparado a um fluxo de carbono para a produção de sesquiterpeno.

23. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide é licopeno, e a célula hospedeira compreende:

(a) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (b) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase.

24. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide é β-caroteno, e a célula hospedeira compreende:

(a) (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase; ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional com fitoeno sintase e atividades de licopeno ciclase; e (b) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase.

25. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide é cantaxantina, e a célula hospedeira compreende:

(a) (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase; ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional com fitoeno sintase e atividades de licopeno ciclase;

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6/9 (b) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase; e (c) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma β-caroteno cetolase.

26. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide é zeaxantina, e a célula hospedeira compreende:

(a) (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase; ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional com fitoeno sintase e atividades de licopeno ciclase;

(b) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase; e (c) um ácido nucleico heterólogo que codifica β-caroteno hidroxilase.

27. Método para coprodução de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide é astaxantina, e a célula hospedeira compreende:

(a) (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno sintase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase; ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima bifuncional com fitoeno sintase e atividades de licopeno ciclase;

(b) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma fitoeno desaturase;

(c) (i) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma β-

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7/9 caroteno cetolase; e (ii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma β-caroteno hidroxilase; ou (iii) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma citocromo p450 hidroxilase e cetolase capaz de converter β-caroteno em equinenona e subsequentemente em β-criptoxantina e em astaxantina; e (iv) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma citocromo p450 redutase que interage com a citocromo p450 hidroxilase e cetolase.

28. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo isoprenóide é luteína, e a célula hospedeira compreende:

(a) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma licopeno ciclase; e (b) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma δ-caroteno β-ciclase;

(c) um ácido nucleico heterólogo que codifica β-anel hidroxilase; e (d) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma caroteno εmono-oxigenase.

29. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende adicionalmente um ácido nucleico heterólogo que codifica uma poliprenil sintase para produzir um poliprenil difosfato.

30. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende adicionalmente um ácido nucleico heterólogo que codifica uma FPP sintase.

31. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira

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8/9 compreende adicionalmente um ácido nucleico heterólogo que codifica uma GGPP sintase.

32. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende adicionalmente um ácido nucleico heterólogo que codifica uma FPP sintase e compreende um ácido nucleico endógeno que codifica uma GGPP sintase, mas não compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica uma GGPP sintase.

33. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende adicionalmente um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas da via do mevalonate.

34. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende adicionalmente ácidos nucleicos heterólogos que codificam todas as enzimas da via do mevalonato.

35. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula microbiana.

36. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira microbiana é uma levedura.

37. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Saccharomyces cerevisiae.

38. Método para coprodução de isoprenóides de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente extrair e purificar os carotenóides.

39. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende

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9/9 carotenóides purificados produzidos pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.

40. Ração animal, caracterizada pelo fato de que compreende a célula microbiana e o segundo isoprenóide produzido a partir do método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.

41. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende:

(a) um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam enzimas de uma via do mevalonato;

(b) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima da via biossintética para a produção de sesquiterpeno; e (c) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima da via biossintética para a produção de um carotenóide.

42. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que a enzima da via biossintética para a produção de sesquiterpeno é uma sintase ou sintetase.

43. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam enzimas de uma via para a produção do carotenóide.

44. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que ser como descrita em qualquer uma das reivindicações anteriores de célula hospedeira ou a célula hospedeira como descrita em qualquer uma das reivindicações anteriores de método.