KR102562733B1 - 암 치료용 표적에 대한 스크리닝 방법 - Google Patents

암 치료용 표적에 대한 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

암 치료용 표적에 대해 스크리닝하는 시험관내 및 생체내 방법이 본원에 제시된다. 방법은 종양 세포에 대한 면역억제 환경에 기여하는 표적, 특히 방사선 치료와 관련된 상기 표적에 대한 스크리닝을 고려한다. 따라서, 본원에 제시된 방법은 단독으로 또는 방사선 요법과 조합되어 사용될 수 있는 암 치료제를 제공하는데 유용한 잠재적 표적을 확인하는데 유용하다.

Description

암 치료용 표적에 대한 스크리닝 방법
1. 분야
본원은 암 치료용 잠재적 표적을 확인하는 방법을 제시한다.
2. 배경
종양 미세환경은 종양에 침윤하고 면역 반응을 억제하는 기능을 하는 골수 유래 서프레서 세포(myeloid-derived suppressor cell)("MDSC") 및 조절 T 세포(regulatory T cell)("T-reg")의 존재로 인해 본질적으로 억제성이다. 또한, T 세포 및 항원 제시 세포(antigen presenting cell)(APC)에 대한 특정 억제성 분자의 발현은 효과적인 면역 반응을 제한할 수 있다. 방사선은 종양 세포 아폽토시스(apoptosis), 노쇠, 자가소화작용(autophagy)의 유도를 통해 항-종양 효과를 중개한다. 방사선은 암 치료용 표적으로서 제공될 수 있는 인자를 통해 종양 미세환경을 조절할 수 있다. 따라서, 이들 인자를 스크리닝하고 이들 인자를 표적화함으로써 암을 치료하는 방법에는 아직 충족되지 못한 수요가 남아있다. 본 발명이 제시하는 방법은 이러한 수요를 충족하고 다른 관련 이점을 제시한다.
3. 요약
본원은 방사선 치료와 조합된 T 세포 억제 에세이(assay)를 사용하여 암 치료용 표적을 확인하는 시험관내(in vitro), 고 처리량 스크리닝(high throughput screening) 방법을 제시한다.
또한, 본원은 방사선 치료와 조합된 T 세포 억제 에세이를 사용하여 암 치료용 표적을 확인하는 시험관내 스크리닝 방법을 제시하며, 여기서 에세이는 세포 배양에서 발현되는 표적 풀(pool)을 사용하여 수행된다.
또한, 본원은 종양 이식 대상체에서 방사선 치료와 조합된 T 세포 억제 에세이를 사용하여 암 치료용 표적을 확인하는 생체내(in vivo) 스크리닝 방법을 제시한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제시된 시험관내 및 생체내 스크리닝 방법은, 예를 들어 본원에 제시된 시험관내 방법, 이어서 상기 시험관내 방법에서 확인된 후보 표적을 사용하는 본원에 제시된 생체내 방법을 순차적으로 수행하여 조합적으로 사용될 수 있다.
3.1 정의
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 관사(article) "하나", "한", 및 "상기"("a", "an", 및 "the")는 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상을 지칭한다. 예로서, T 세포는 하나의 T 세포 또는 하나 이상의 T 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "암" 또는 "암의"는 전형적으로 대상체에서 조절되지 않은 세포 성장이 특징인 생리학적 병태를 지칭한다. 암의 예는 혈액암 및 고형 종양을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료"는 암 환자에 대한 언급에서 사용될 때, (a) 암 성장을 억제하거나, 암의 발전을 저지하는 단계, 및 (b) 암의 퇴행을 야기하거나, 암의 존재와 연관된 1종 이상의 증상을 지연 또는 최소화시키는 단계를 포함하여, 암의 중증도를 감소시키거나, 암의 진행을 지연 또는 늦추는 활동을 지칭한다. 암의 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 표적 치료, 면역 요법 등을 포함한 치료 중 하나 또는 2종 이상의 상이한 유형의 조합을 수반할 수 있다.
방사선 요법은 강한 에너지의 빔을 사용하여 암 세포를 해치거나 사멸시키는 암 치료의 유형이다. 방사선 요법은 X-선, 양성자 또는 다른 유형의 에너지를 사용할 수 있다. 많은 사례에서 방사선 요법은 외부 빔 방사선 요법을 지칭한다. 이 유형의 방사선 동안, 고에너지 빔은 종양의 정확한 지점에 빔을 겨냥하는 환자의 신체 외부의 기계에 의해 생성된다. 브래키테라피(brachytherapy)와 같은 다른 유형의 방사선 요법에서, 방사선의 공급원은 또한 환자의 신체 내부에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 치료, 관찰 및/또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. "동물"은 척추동물 및 무척추동물, 예컨대 생선, 갑각류, 파충류, 조류, 및 상세하게는 포유동물을 포함한다. "포유동물"은 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지, 유인원, 및 인간을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대상체는 생체내 검사 또는 실험에 사용하기 위한 동물을 지칭할 수 있다. 검사 또는 실험의 대상체는 또한 "검사 대상체"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "종양-보유 대상체"는 그것의 신체에 종양 또는 종양 세포를 가진 대상체를 지칭한다. 이들 종양 세포는 대상체의 외부에 있고, 실험 목적을 위해 대상체 내로 접종될 수 있다. 종양-보유 대상체는 1종 이상의 종양을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "2종 종양 모델"은 종양 보유 동물이 적어도 2종의 종양을 갖고 있고, 2종의 종양이 떨어진 위치에 있는 동물 모델을 지칭한다. 2종의 종양은 서로 반대측에 있을 수 있다. 떨어진 위치의 2종의 종양은 유사하거나 동일한 크기일 수 있다. 2종 종양 모델은, 예를 들어 방사선과 관련된 연구에서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "조사(irradiated)된 대상체"는 방사선을 조사받은 대상체를 지칭한다. 방사선은 종양-표적 방사선일 수 있다. 2종 종양 모델에서, 조사된 대상체는 2종의 떨어져 있는 종양 중 1종만이 방사선을 조사받은 대상체를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "조사되지 않은 대상체"는 방사선을 조사받지 않은 대상체를 지칭한다. "조사되지 않은 대상체" 및 "조사된 대상체"는 조사 전후의 동일한 대상체를 지칭할 수 있다. "조사되지 않은 대상체" 및 "조사된 대상체"는 또한 방사선의 효과를 연구하기 위한 병행 실험(parallel experiment)에서 사용되는 2종의 검사 대상체를 지칭할 수 있다. 상기 검사 대상체는 병행 실험에서 동일한 유전적 배경을 갖고/갖거나 방사선을 제외하고 동일한 치료를 받았을 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "유전자"는 적절한 조절 또는 제어 서열의 제어 하에 위치될 때, 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드 내로 전사(DNA의 경우) 및 번역(mRNA의 경우)되는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 원핵성 또는 진핵성 mRNA로부터의 cDNA, 원핵성 또는 진핵성 DNA로부터의 게놈(genomic) DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 일반적으로 유전자 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "후보 유전자"는 본원에 제공된 스크리닝 방법을 받는 유전자를 지칭한다. 후보 유전자는 방사선 치료와 조합되어 T 세포 면역 반응을 조절시, 유전자의 관여를 평가하기 위해 녹-아웃(knock-out)되거나 녹-다운(knock-down)될 수 있다. 스크리닝의 결과에 따라, "후보 유전자" 또는 "후보 유전자"에 의해 코딩된 단백질은 암 치료에 적합한 잠재적 표적으로서 확인된다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "표적 유전자"는 암 치료용 표적으로서 제공될 수 있는 유전자를 지칭한다. "표적 유전자"는 본원에 개시된 방법에 의해 후보 유전자로부터 확인될 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "녹-아웃"은 유전자와 관련하여 사용될 때, 지시된 유전자의 발현이 완전히 또는 거의 완전히 폐지된 것을 의미한다. 세포 또는 조직에서 녹-아웃된 지시된 유전자의 발현은 세포 또는 조직에서 그것의 정상적인 발현에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포에서 녹-아웃된 유전자의 발현 수준은 유전자 발현 검출을 위해 당업계에 공지된 일상적 수단을 사용하여서는 검출이 불가능할 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "녹-다운"은 유전자와 관련하여 사용될 때, 지시된 유전자의 발현이 유의미하게 감소된 것을 의미한다. 세포 또는 조직에서 녹-다운된 지시된 유전자의 발현은 세포 또는 조직에서 그것의 정상적인 발현에 비해 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직에서 녹-다운된 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직에서 유전자의 정상적인 발현 수준에 비해 적어도 50% 만큼 감소된다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "단리"는 대상이 정상적으로 존재하는 천연 환경에 존재하는 적어도 1종의 성분으로부터 지시된 대상이 분리되는 동안의 과정을 지칭한다. 용어 "단리"는 세포 또는 세포 집단과 관련하여 사용될 때, 대상체의 신체로부터 세포 또는 세포 집단을 함유하는 샘플을 얻는 과정, 및/또는 다른 세포로부터 또는 세포 또는 세포 집단을 함유하는 샘플에서의 다른 성분으로부터 세포 또는 세포 집단을 분리하는 과정을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "접촉"은 세포와 관련하여 사용될 때, 세포가 물질과 상호작용하고/하거나 상기 물질의 존재에 의해 영향을 받을 수 있도록, 세포가 지시된 물질과 가까운 근접에 위치하는 과정을 지칭한다. 접촉은 임시적이거나 일시적일 수 있다. 접촉은 또한 일정 기간 동안 지속되거나 영구적일 수 있다. 예를 들어, T 세포와 서프레서 세포를 접촉시키는 단계는 T 세포와 서프레서 세포가 시험관내 용기에서 함께 배양되고, 세포는 그것들의 표면 상의 수용체 분자가 서로 상호작용할 수 있는 매우 가까운 근접에 있는 과정을 지칭할 수 있다. 접촉은 시험관내 배양의 과정만큼 오래 지속될 수 있다. T 세포와 서프레서 세포를 접촉시키는 단계는 또한 주사된 T 세포와 상호작용 할 서프레서 세포를 가진 대상체에 T 세포가 주사되는 과정을 지칭할 수 있다. 상기 접촉은 일시적일 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "벡터"는 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)를 숙주 세포 내로 도입시켜, 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및/또는 번역)을 촉진시키거나 재조합 또는 다른 메커니즘에 의해 표적 유전자를 녹-다운 또는 녹-아웃시킬 수 있는 비히클(vehicle)을 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 슈도바이러스(pseudovirus) 등을 포함한다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 수단, 예컨대 흡착, 미량주사법, 전기천공법, 리포펙션(lipofection) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "T 세포"는 흉선에서 성숙이 완료되고 신체에서 특정 외래 항원의 확인 및 다른 면역 세포의 활성화 및 불활성화를 포함하여 면역 체계에서 다양한 역할을 갖는 백혈구의 유형을 지칭한다. T 세포는 기능을 기본으로 하여 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포(helper T cell)(Th), 및 조절 T 세포(Treg)를 포함한 수많은 아형(subtype)을 갖는다. 세포 표면에 대한 마커(marker)의 차등 발현은 T 세포의 다양한 성질 및 기능에 대한 가치있는 단서를 제시하고, T 세포 또는 T 세포의 특정 아형의 단리를 위해 유용한 도구로서 제공될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 유동세포계수법(flow cytometry)에 의해 CD3+ 세포를 선택함으로써 단리될 수 있다. 표면 마커 이외에, 상이한 아형의 T 세포는 또한 별개의 기능 및 사이토카인 분비 프로파일을 가질 수 있다. 예를 들어, CD8+ 세포독성 T 세포는 퍼포린(perforin), 그란자임(granzym), 및 그래뉼리신(granulysin)의 배출을 통해 감염된 표적 세포를 파괴하는 반면에, CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 독성 활성을 거의 갖지 않으며 다른 백혈구, 예컨대 B 세포, 대식세포, 호산구, 또는 호중구에 작용하는 사이토카인을 분비한다. Treg는 이펙터 T 세포(effector T-cell) 일부에 결합하는 단계 및 그것들의 사이토카인의 분비를 예방하는 단계를 포함한 여러 메커니즘에 의해 T 세포 기능을 억제한다.
달리 명시되지 않는 경우, T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있으며, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell)(PBMC), 말초 혈액 백혈구(peripheral blood leukocyte)(PBL), 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte)(TIL), 메모리 T 세포, 나이브() T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포(γδ T 세포) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 발달 단계일 수 있다. 헬퍼 T 세포의 추가 유형은 Th3, Th17, Th9, 또는 Tfh 세포와 같은 세포를 포함한다. 메모리 T 세포의 추가 유형은 중앙 메모리 T 세포(central memory T cell)(TCM 세포), 이펙터 메모리 T 세포(effector memory T cell)(TEM 세포 및 TEMRA 세포)와 같은 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "비변형 T 세포"는 검사되거나 스크리닝되는 후보 유전자에 관하여 유전적으로 변형되지 않은 T 세포를 지칭한다. 비변형 T 세포는 야생형 T 세포일 수 있다. 비변형 T 세포는 또한 대조 유전자로 유전적으로 변형된 기준 T 세포일 수 있다. 예를 들어, 기준 T 세포는 LacZ와 같은 대조 유전자에 대한 shRNA를 수반하는 바이러스 벡터로 감염된 T 세포일 수 있다. 비변형 T 세포는 동물 대상체로부터의 혈액 샘플과 같이 천연 공급원으로부터 직접 단리되거나, T 세포주의 시험관내 배양에 의해 얻을 수 있다. 비변형 T 세포는 또한 유도 분화에 의해 시험관내 만능 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "변형 T 세포"는 유전적으로 조작된 T 세포를 지칭한다. 변형 T 세포는 야생형 T 세포에 비해 유전자를 과발현하거나 과소발현할 수 있다. 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가질 수 있다. 변형 T 세포의 집단은 상이한 유전자 변형을 갖는 T 세포의 집단일 수 있다. 예를 들어, 변형 T 세포의 집단은 각각 야생형 T 세포에 비해 녹-다운되거나 녹-아웃되는 최대 1종의 유전자를 갖는 상이한 유전적 특징을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "활성"은 T 세포의 세포 활성을 지칭한다. 활성은 이는 세포 주기 활성화 향상, 세포 사멸(예를 들어, 억제된 아폽토시스) 억제할 수 있는 증식 활성, 및/또는 세포 증식을 촉진하는 임의의 다른 활성일 수 있다. 활성은 또한, 예컨대 세포독성 활성 또는 사이토카인 생성 활성을 포함한 이펙터 T 세포의 면역성일 수 있다. 활성은 또한 일반적으로 항-종양 활성일 수 있으며, 이는 예를 들어, 종양 크기 감소 또는 종양 보유 대상체의 생존율 증가에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "서프레서 세포(supressor cell)"는 T 세포 활성을 억제하는 세포의 집단을 지칭한다. 예를 들어, 서프레서 세포는 T 세포 증식을 억제할 수 있다. 서프레서 세포는 또한 T 세포에 의해 유도된 천연 면역 반응을 억제하거나 길항할 수 있다. "서프레서 세포"는 조절 T 세포(Treg) 및 골수 유래 서프레서 세포(MDSC)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
4. 도면의 간단한 설명
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 양태를 더 나타내기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 나타낸 구체적 실시양태의 상세한 설명과 조합되어 이들 도면 중 하나 이상을 참고함으로써 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1 - 도 1은 방사선을 이용한 면역조절제에 대한 shRNA 스크리닝을 위한 예시적 작업 흐름을 도시한 것이다. 도시된 바와 같이, 작업 흐름은 음성 제어를 이용한 shRNA 라이브러리의 제조; 0일차에 B6 마우스의 다리 및 옆구리 각각에 1.5x105 B16-Ova 세포의 피내 주사(intradermal injection); 6일차에 OT-1 T 세포를 단리시키는 단계; 8일차에 shRNA 라이브러리를 코딩하는 Thy1.1을 이용하여 OT-1 T 세포를 감염시키는 단계; 10일차에 12 Gy로 다리 종양(5mm)을 조사하는 단계; 11일차에 감염성 OT-1 T 세포(5x106)의 양자 전이(adoptive transfer)를 수행하는 단계; 18일차에 비장, 림프절, 및 배수(draining) 림프절로부터의 종양으로부터 T 세포를 채취하는 단계; Thy 1.1+ T 세포에 대한 FACS 분류; PCR, NGS, 및 데이터 디콘볼루션(deconvoluntion)에 의해 Thy 1.1+ T 세포에 대한 게놈 DNA를 에세이하는 단계를 포함한다. 종양 크기는 또한 2일마다 측정된다.
도 2 - 도 2는 통합 shRNA의 PCR 증폭을 위한 예시적 내재 프라이머 세트를 도시한 것이다. 나타낸 바와 같이, 주요 PCR 프라이머(294 bp)는

일 수 있고, 부차적 PCR 프라이머(124 bp)는

일 수 있다.
5. 상세한 설명
본원은 암 치료용 유전자 표적을 확인하는 시험관내 및 생체내 스크리닝 방법을 제시한다. 특정 이론에 구애됨 없이, 수많은 인자가 종양 세포의 면역억제 미세환경에 기여하며, 상기 인자는 종양-표적 방사선을 포함하나, 이에 제한되는 방사선에 의해 조절될 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 본원은 단독으로 또는 방사선 요법과의 조합으로 암 치료에 사용하기 위한 유전자 표적으로 제공되는 상기 인자에 대한 시험관내 및 생체내 스크리닝 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 본원은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 활성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 여기서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각은 조사된 종양-보유 대상체로부터의 서프레서 세포와 접촉되고; 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는다. 이어서, 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교하여 활성이 증가된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
일부 사례에서, 방사선은 종양 세포를 "스트레스 받은(stressed)" 상태로 위치시켜서 이는 면역억제 인자의 추가 활성화 및/또는 상향조절을 야기할 수 있다. 따라서, 본원은 또한 방사선 치료에 의해 활성화되고/되거나 상향조절된 면역억제 인자인 표적 유전자에 대한 스크리닝 방법을 제시한다. 방사선은 종양 미세환경에 특이적으로 국한될 수 있기 때문에, T 세포와 상호작용하여 T 세포 억제를 유도하는 관심있는 표적의 상향조절을 야기하는 방사선으로 인한 종양 내의 임의의 동요(perturbation)는 본원에 개시된 스크리닝 접근법을 사용하여 가려지지 않을 수 있다. 상기 방법은 면역억제를 중개하는데 있어서 확인된 표적 유전자의 기능 검증을 더 포함할 수 있다.
일부 사례에서, 방사선은 주요 종양의 표적 방사선이 방사선 장(field) 외부의 떨어진 부위에 항-종양 반응을 유도하는 생리학적 과정인 업스코팔 효과(abscopal effect)를 야기할 수 있다. 업스코팔 효과는 적어도 부분적으로 T 세포에 대한 종양 항원의 향상된 제시뿐 아니라 사이토카인과 국부적 및 전신적 면역 반응을 자극하는 다른 염증유발(pro-inflammatory) 인자의 방출을 수반할 수 있다. 따라서, 본원은 또한 업스코팔 효과와 관련된 유전자 표적에 대한 스크리닝 방법을 제시한다. 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 유전자 표적은 종양 미세환경의 면역억제 성질에 기여하는 인자일 수 있다.
면역 체계를 활성화시켜, 일반적으로 암 세포를 파괴하는 면역요법은 일부 사례에서 면역 체계에 대한 규칙적 체크의 차단으로 인해 전신적 독성을 야기할 수 있다. 본원은 또한 단독으로 표적화되었을 때, 전신적 면역 활성을 야기하지 않으나, 방사선 요법과 조합되어 사용될 때, 유의미한 항-종양 면역성을 유도할 수 있는 인자에 대한 스크리닝 방법을 제시한다. 따라서, 이들 유전자 인자를 표적화하는 약제는 업소코팔 효과를 모방하거나 향상시켜, 방사선 요법의 치료 효과를 개선하고, 잠재적 면역 관련 부작용을 감소시킬 수 있다.
종양-보유 대상체에서 항-종양 반응을 위한 면역조절제는 적어도 부분적으로 T 세포 활성을 억제할 수 있는 표적 유전자를 억제함으로써 면역 체계를 활성화시킬 수 있다.
5.1 스크리닝 방법
본원은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 활성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 여기서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각은 종양 미세환경과 접촉되었고; 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가지며; 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교하여 활성이 증가된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
본원은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 활성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 여기서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각은 서프레서 세포와 접촉되었고; 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가지며; 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교하여 활성이 증가된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 측정되는 활성은 증식 활성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 증식 활성은 세포 주기 활성화에 의해 측정되고, 향상된 세포 주기 활성화는 세포 증식 활성에서의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 증식 활성은 세포 사멸 억제에 의해 측정되고, 세포 사멸에서의 감소는 세포 증식 활성에서의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 증식 활성은 아폽토시스 억제에 의해 측정되고, 아폽토시스에서의 감소는 세포 증식 활성에서의 증가를 나타낸다.
따라서, 본원은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 증식 활성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 여기서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각은 서프레서 세포 또는 종양 미세환경과 접촉되었고; 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가지며; 변형 T 세포가 비변형 T 세포에 비해 더 높은 증식 활성을 갖는 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 측정되는 활성은 이펙터 T 세포의 면역성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 측정되는 활성은 세포독성 활성이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 측정되는 활성은 사이토카인 생성 활성이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 측정되는 활성은 항-종양 활성이다.
따라서, 본원은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 면역성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 여기서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각은 서프레서 세포 또는 종양 미세환경과 접촉되었고; 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가지며; 변형 T 세포가 비변형 T 세포에 비해 더 높은 면역성을 갖는 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
본원은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 세포독성 활성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 여기서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각은 서프레서 세포 또는 종양 미세환경과 접촉되었고; 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가지며; 변형 T 세포가 비변형 T 세포에 비해 더 높은 세포독성 활성을 갖는 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
또한, 본원은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 사이토카인 생성 활성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 여기서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각은 서프레서 세포 또는 종양 미세환경과 접촉되었고; 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가지며; 변형 T 세포가 비변형 T 세포에 비해 더 높은 사이토카인 생성 활성을 갖는 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
또한, 본원은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 항-종양 활성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 여기서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각은 서프레서 세포 또는 종양 미세환경과 접촉되었고; 변형 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가지며; 변형 T 세포가 비변형 T 세포에 비해 더 높은 항-종양 활성을 갖는 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 공급원으로부터 T 세포를 얻는 단계를 더 포함한다. 본원에 제시된 방법은 비변형 T 세포 및 변형 T 세포를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공급원은 대상체로부터의 샘플이다. 일부 실시양태에서, 공급원은 시험관내에서 배양된 세포주이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 조사된 종양-보유 대상체 및 조사되지 않은 종양-보유 대상체 둘 다로부터의 종양 미세환경과 각각 접촉되었던 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 활성을 측정하는 단계를 포함하고; 여기서, T 세포가 조사되지 않은 종양-보유 대상체의 종양 미세환경과 있었을 때에 비해 T 세포가 조사된 종양-보유 대상체의 종양 미세환경과 접촉하였을 때, 변형 T 세포를 비변형된 T세포와 비교한 활성의 증가가 더욱 상당한 경우, 후보 유전자가 표적 유전자로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 조사되지 않은 종양-보유 대상체의 종양 미세환경과 접촉되었던 비변형 T 세포 및 변형 T 세포 각각의 활성은 실질적으로 동일하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 조사되지 않은 종양-보유 대상체로부터의 서프레서 세포의 제1 집단, 및 조사된 종양-보유 대상체로부터의 서프레서 세포의 제2 집단을 사용하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 각각 서프레서 세포의 제1 집단과 접촉된 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교한 활성에서의 증가를 측정하는 단계, 및 각각 서프레서 세포의 제2 집단과 접촉된 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교한 활성에서의 증가를 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 여기서, T 세포가 서프레서 세포의 제1 집단과 접촉되었을 때에 비해 T 세포가 서프레서 세포의 제2 집단과 접촉되었을 때 상기 증가가 더욱 상당한 경우, 후보 유전자가 표적 유전자로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 변형 T 세포와 비변형 T 세포를 비교시 상기 활성은 T 세포가 서프레서 세포의 제1 집단과 접촉되었을 때에는 동일하지만, T 세포가 서프레서 세포의 제2 집단과 접촉되었을 때에는 변형 T 세포에서 더 높다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 동물 대상체로부터 직접 얻은 샘플로부터 단리된다. 샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 혈액 샘플은 전혈 샘플, 부분적으로 정제된 혈액 샘플, 또는 말초 혈액 샘플일 수 있다. 샘플은 또한 골수 샘플일 수 있다. T 세포는 그것의 표면 마커에 의해 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 CD3+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 CD8+ 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 PBMC이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 PBL이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 TIL이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 메모리 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 감마 델타 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 Th3, Th17, Th9, 또는 Tfh 세포와 같다. 일부 실시양태에서, T 세포는 TCM 세포, TEM 세포 또는 TEMRA 세포이다. T 세포는 또한 본원에 언급되거나 이와 달리 당업계에 공지된 T 세포 중 특정 유형의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체로부터 단리된다. 대상체는 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 마우스로부터 단리된다. 마우스는 야생형 마우스 또는 유전적으로 조작된 마우스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스는 유전적으로 조작되어 T 세포 수용체를 발현한다. T 세포 수용체는 마우스에 천연적으로 존재하지 않는 항원에 대해 특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 난백알부민일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전적으로 조작되어 난백알부민에 특이적인 T 세포 수용체를 발현하는 마우스일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 비변형 CD8+ T 세포 및 변형 CD8+ T 세포의 활성을 측정함으로써 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법을 제시하며; 상기 비변형 CD8+ T 세포 및 변형 CD8+ T 세포 각각은 서프레서 세포와 접촉되었고; 변형 CD8+ T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 가지며; 비변형 CD8+ T 세포에 비해 변형 CD8+ T 세포에서 활성이 증가된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 유도 분화에 의해 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 생성된다. 줄기 세포 또는 전구 세포는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포일 수 있다. 줄기 세포 또는 전구 세포는 또한 유도 만능 줄기 세포일 수 있다.
비변형 T 세포는 본원에 개시되거나 이와 달리 당업계에 공지된 방법을 사용하여 유전적으로 변형되어, 변형 T 세포를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 shRNA를 함유하는 바이러스 벡터를 이용한 감염에 의해 녹-아웃되거나 녹-다운되는 후보 유전자를 갖도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 녹-아웃되거나 녹-다운되는 제어 유전자를 갖는 기준 T 세포이다. 일 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터의 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 SMART벡터, GIPZ, TRIPZ 또는 TRC 렌티바이러스 shRNA 벡터(GE Dharmacon)이다. 일부 실시양태에서, 단리 T 세포 내의 유전자는 전사 액티베이터 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)를 사용함으로써 녹-아웃되거나 녹-다운된다. 일부 실시양태에서, 단리 T 세포 내의 유전자는 CAS9(CRISPR)를 사용함으로써 녹-아웃되거나 녹-다운된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 개시되거나 이와 달리 당업계에 공지된 T 세포의 유전자 변형을 위한 임의의 방법이 본원에 개시된 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 본원에 개시된 유전자 변형(genetic modification) 또는 스크리닝 방법을 거치기 전에 시험관내에서 증식된다. 일부 실시양태에서, 변형 T 세포는 본원에 개시된 스크리닝 방법을 거치기 전에 시험관내에서 증식된다.
일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 형광제(fluorescent agent)를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 마이크론 크기 입자를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester)(CFSE)를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 마이크론 크기의 산화철 입자(micron-sized iron oxide particles)(MPIO)를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 표지된 자성 나노입자이다. T 세포를 표지하는 다양한 방법이 당업계에 잘 알려져 있다.
후보 유전자는 T 세포의 게놈에 천연적으로 존재하는 임의의 유전자일 수 있다. 후보 유전자는 인간 유전자일 수 있다. 후보 유전자는 또한 모델 동물로부터의 유전자일 수 있다. 예를 들어, 후보 유전자는 또한 마우스 T 세포의 유전자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제시된 스크리닝 방법은 shRNA 라이브러리를 이용하여 감염성 비변형 T 세포를 포함하는 T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, shRNA 라이브러리는 게놈 라이브러리이고, 이는 T 세포 게놈의 모든 유전자를 스크리닝할 수 있는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, shRNA 라이브러리는 서브게놈(subgenomic) 라이브러리이고, 이는 T 세포 게놈의 유전자 선택을 포함한다. 일부 실시양태에서, shRNA 라이브러리는 특정 구조적/기능적 특징을 갖는 특정 단백질을 코딩하는 유전자를 표적화하는 바이러스 벡터를 포함한다. 예시적 라이브러리는 G-단백질 연결 수용체(G-protein coupled receptor)(GPCR) 라이브러리, 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor)(TNFR) 수퍼패밀리(superfamily) 라이브러리, 면역글로불린 수퍼패밀리(immunoglobulin superfamily)(IgSF) 라이브러리, 전사 인자 라이브러리, 키나아제 라이브러리, 포스파타아제 라이브러리, 혈관형성 라이브러리, 세포 주기 라이브러리, 아폽토시스 라이브러리, 및/또는 유비퀴틴-리가아제 라이브러리를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적 라이브러리는 또한 기능장애 T 세포에서 과발현되거나 과소발현되는 것으로 알려진 유전자에 집중될 수 있다. 예를 들어, 후보 유전자의 라이브러리는 T 세포 아네르기(anergy) 또는 고갈에서 과발현되는 유전자의 라이브러리일 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용되는 라이브러리는 또한 본원에 개시되거나 이와 달리 당업계에 공지된 라이브러리의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 MDSC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 Treg 세포 및 MSDC 둘 다를 포함한다. 스크리닝 방법이 시험관내에서 수행되는 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 대상체로부터 단리될 수 있다. 동물은 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 마우스로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조사된 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조사되지 않은 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사된 마우스로부터 얻는다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사되지 않은 마우스로부터 얻는다. 일부 실시양태에서, 마우스는 종양-보유 마우스일 수 있다. 마우스는 조사되지 않은 종양-보유 마우스일 수 있다. 마우스는 조사된 종양-보유 마우스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 2종의 종양을 가진 마우스이고, 1종의 종양만이 제거 선량(ablative dose)의 방사선을 조사받았다.
일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 혈액 샘플로부터 단리된다. 혈액 샘플은 전혈 샘플, 부분적으로 정제된 혈액 샘플, 또는 말초 혈액 샘플일 수 있다. T 세포 억제 에세이를 위해 샘플로부터 단리된 서프레서 세포를 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 스크리닝 방법이 생체내에서 수행되는 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 검사 대상체에 천연적으로 존재할 수 있고, 이는 또한 Treg, MSDC, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 대상체는 조사된 대상체 또는 조사되지 않은 대상체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사되지 않은 종양-보유 대상체로부터 얻는다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사된 종양-보유 대상체로부터 얻는다. 일부 실시양태에서, 조사된 종양-보유 대상체는 종양-표적 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 방사선은 제거 선량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 방사선은 1 Gy 내지 45 Gy, 5 Gy 내지 35 Gy, 10 Gy 내지 25 Gy, 1 Gy 내지 25 Gy, 1 Gy 내지 20 Gy, 또는 5 Gy 내지 15 Gy의 선량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 방사선은 1 Gy 내지 20 Gy의 선량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 방사선은 1 Gy, 2 Gy, 3 Gy, 4 Gy, 5 Gy, 6 Gy, 7 Gy, 8 Gy, 9 Gy, 10 Gy, 11 Gy, 12 Gy, 13 Gy, 14 Gy, 15 Gy, 16 Gy, 17 Gy, 18 Gy, 19 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 또는 45 Gy의 선량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 주요 종양에 표적화된 제거 선량의 방사선을 조사받는 종양-보유 대상체로부터 얻어진다.
일부 실시양태에서, 종양-보유 대상체는 1종의 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양-보유 대상체는 2종 이상의 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양-보유 대상체는 2종 종양 모델이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 종양을 갖는 조사된 종양-보유 대상체는 상기 종양 중 1종만을 표적화한 방사선을 조사받았다. 방사선을 조사받는 대상체는 종양-보유 대상체의 주요 종양일 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 마우스일 수 있다. 마우스는 야생형 마우스 또는 유전적으로 조작된 마우스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스는 유전적으로 조작되어 T 세포 수용체를 발현한다. T 세포 수용체는 마우스에 천연적으로 존재하지 않는 항원에 대해 특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 난백알부민일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전적으로 조작되어 난백알부민에 특이적인 T 세포 수용체를 발현하는 마우스일 수 있다. 마우스는 종양-보유 마우스일 수 있다. 마우스는 조사되지 않은 종양-보유 마우스일 수 있다. 마우스는 조사된 종양-보유 마우스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1종의 종양이 제거 선량의 방사선을 조사받은 적어도 2종의 종양을 가진 마우스일 수 있다.
본원에 제시된 스크리닝 방법은 시험관내 방법 및 생체내 방법을 포함한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 개시된 상이한 시험관내 및 생체내 방법은 별도로 또는 조합적으로 사용될 수 있다. 1종 이상의 방법의 조합에 의해 확인된 유전자 표적은 잠재적으로 더욱 완벽하고 더욱 정확할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 방법은 고 처리량 형식의 풀 스크리닝 에세이일 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 시험관내 스크리닝 검사는 우선 암 치료용 표적으로서 제공될 후보 유전자의 그룹을 확인하고, 이어서 생체내 기능적 검사에 의해 그것들의 유용성을 더 입증하도록 수행될 수 있다.
5.1.1 생체내 에세이
일부 실시양태에서, 본원은 암 치료용 표적 유전자를 스크리닝하는 생체내 방법을 개시한다. 생체내 에세이는 검사 대상체에 대해 수행될 수 있다. 검사 대상체는 동물 모델일 수 있다. 동물 모델은 2종 종양 모델일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 마우스이다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 종양-보유 동물 모델이다. 동물 모델은 종양-보유 마우스일 수 있다. 종양-보유 마우스는 조사되거나 조사되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 반대측 위치에 2종의 종양을 갖는 마우스이며, 이중 1종만이 제거 선량의 방사선을 조사받았다.
따라서, 본원은 (i) 비변형 T 세포 및 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포를 검사 대상체에 주사하는 단계; 및 (ii) 검사 대상체에서 비변형 T 세포 및 상기 변형 T 세포의 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교하여 활성이 증가된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인되는, 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 생체내 방법을 제시한다. 검사 대상체는 조사된 검사 대상체일 수 있다. 검사 대상체는 조사되지 않은 검사 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이후, 활성이 측정되기 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포 및 변형 T 세포는 동일한 검사 대상체 내로 주사된다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포 및 변형 T 세포는 별개의 검사 대상체 내로 주사된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 표지된다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 기준 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조사된 종양-보유 대상체는 종양-표적 방사선을 조사받았다. 일부 실시양태에서, 방사선은 제거 선량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 방사선은 1 Gy 내지 45 Gy, 5 Gy 내지 35 Gy, 10 Gy 내지 25 Gy, 1 Gy 내지 25 Gy, 1 Gy 내지 20 Gy, 또는 5 Gy 내지 15 Gy의 선량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 방사선은 1 Gy 내지 20 Gy의 선량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 방사선은 1 Gy, 2 Gy, 3 Gy, 4 Gy, 5 Gy, 6 Gy, 7 Gy, 8 Gy, 9 Gy, 10 Gy, 11 Gy, 12 Gy, 13 Gy, 14 Gy, 15 Gy, 16 Gy, 17 Gy, 18 Gy, 19 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 또는 45 Gy의 선량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 종양-보유 대상체는 그것의 종양 중 1종에만 표적화된 제거 선량의 방사선을 조사받은 2종 종양 모델이다.
본원에 개시된 생체내 스크리닝 방법에서 사용되는 T 세포는 본원에 개시되거나 이와 달리 당업계에 공지된 T 세포 방법 중 임의의 특정 유형일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 CD3+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 CD8+ 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 CD4+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 측정 단계는 검사 대상체로부터 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 상기 샘플은 종양 샘플, 조직 샘플, 또는 혈액 샘플일 수 있다. 조직 샘플은 림프절 샘플, 비장 샘플, 간 샘플, 또는 신장 샘플일 수 있다. 림프절 샘플은 배수 림프절 또는 비-배수 림프절일 수 있다. 종양 샘플은 조사된 종양으로부터의 샘플일 수 있다. 종양 샘플은 또한 조사되지 않은 종양으로부터의 샘플일 수 있다. 조사되지 않은 종양은 조사된 종양을 가진 검사 대상체로부터 얻을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 생체내 스크리닝 방법은 조사되지 않은 대상체 및 조사된 대상체 사용을 포함한다. 상기 방법은 조사되지 않은 대상체에 주사된 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교한 활성에서의 증가를 측정하는 단계, 및 조사된 대상체에 주사된 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교한 활성에서의 증가를 측정하는 단계를 포함하고; 여기서, T 세포가 조사되지 않은 대상체에 주사되었을 때에 비해 T 세포가 조사된 대상체에 주사되었을 때, 상기 증가가 더욱 상당한 경우, 후보 유전자가 표적 유전자로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 변형 T 세포와 비변형 T 세포를 비교시 T 세포의 활성은 T 세포가 조사되지 않은 대상체에 주사되었을 때에는 실질적으로 동일하지만, T 세포가 조사된 대상체에 주사되었을 때에는 비변형 T 세포에 비해 변형 T 세포에서 더 높다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 생체내 방법에 의해 측정된 활성은 T 세포의 증식 활성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 생체내 방법에 의해 측정된 활성은 T 세포의 항-종양 활성일 수 있다. T 세포의 증식 활성은 주사후 검사 대상체 내로 주사된 T 세포의 축적에 의해 측정될 수 있다. T 세포의 축적은 주사후 24시간, 주사후 2일, 주사후 3일, 주사후 4일, 주사후 5일, 주사후 6일, 주사후 7일, 주사후 8일, 주사후 9일, 주사후 10일, 주사후 11일, 주사후 12일, 주사후 13일, 주사후 14일, 주사후 2.5주, 주사후 3주, 주사후 3.5주, 주사후 4주, 주사후 5주, 주사후 6주, 주사후 7주, 주사후 2개월, 3개월, 또는 그 이상에 측정될 수 있다.
대상체에서 T 세포의 축적은 당업계에 공지된 다양한 접근법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검사 대상체 내의 주사된 T 세포의 축적은 세포계수법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검사 대상체 내의 T 세포의 축적은 축적된 T 세포로부터의 게놈 DNA의 차세대 염기서열분석(next generation sequencing)(NGS)에 의해 측정될 수 있다.
따라서, 본원은 (i) 비변형 T 세포 및 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포를 검사 대상체에 주사하는 단계; 및 (ii) 검사 대상체에서 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 축적을 측정하는 단계를 포함하고, 비변형 T 세포에 비해 더 많은 수의 변형 T 세포가 축적되는 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인되는, 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 생체내 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 기준 T 세포이다. 검사 대상체는 마우스일 수 있다. 검사 대상체는 종양을 보유하고 있을 수 있다. 검사 대상체는 조사된 종양-보유 검사 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이후, 활성이 측정되기 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포 및 변형 T 세포는 동일한 검사 대상체 내로 주사된다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 비변형 T 세포 및 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포를 검사 대상체에 주사하는 단계; 및 (ii) 검사 대상체에서 종양-침윤 비변형 T 세포 및 종양-침윤 변형 T 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하고, 종양-침윤 비변형 T 세포의 수에 비해 종양-침윤 변형 T 세포의 수가 더 큰 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인되는, 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 생체내 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 기준 T 세포이다. 검사 대상체는 종양-보유 마우스일 수 있다. 검사 대상체는 조사된 종양-보유 검사 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이후, 활성이 측정되기 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포 및 변형 T 세포는 동일한 검사 대상체 내로 주사된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제시된 방법은 검사 대상체로부터의 주사 T 세포로부터 축적/증식된 단리 T 세포를 더 포함한다. 이 단리 단계는 검사 대상체로부터 샘플을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 상기 샘플은 종양 샘플, 혈액 샘플, 또는 조직 샘플일 수 있다. 종양 샘플은 조사된 종양 또는 조사되지 않은 종양으로부터의 샘플일 수 있다. 조사되지 않은 종양은 조사된 종양을 갖는 검사 대상체로부터 얻을 수 있다. 혈액 샘플은 말초 혈액, 전혈, 또는 부분적으로 정제된 혈액의 샘플일 수 있다. 조직 샘플은 비장 샘플, 또는 림프절 샘플일 수 있다. 림프절 샘플은 배수 림프절 샘플 또는 비-배수 림프절 샘플일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 생체내 방법에 의해 측정된 활성은 주사된 T 세포의 항-종양 활성일 수 있다. 항-종양 활성은 일정 기간에 걸친 종양 크기의 감소에 의해 측정될 수 있다. 상기 일정 기간은 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 2.5주, 3주, 3.5주, 4주, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 또는 그 이상일 수 있다.
항-종양 활성은 또한 검사 대상체 집단의 생존율에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 본원은 (i) 비변형 T 세포 및 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포를 별개의 검사 대상체에 주사하는 단계; 및 (ii) 비변형 T 세포로 주사된 대상체 및 변형 T 세포로 주사된 대상체의 종양 크기를 측정하는 단계를 포함하고, 비변형 T 세포로 주사된 검사 대상체에 비해 변형 T 세포로 주사된 검사 대상체에서 종양 크기의 감소가 더 큰 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인되는, 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 생체내 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 기준 T 세포이다. 검사 대상체는 종양-보유 마우스일 수 있다. 검사 대상체는 조사된 종양-보유 검사 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이후, 종양 크기가 측정되기 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 검사 대상체는 2종 종양 모델이고, 1종의 종양만이 표적 방사선을 조사받았다. 일부 실시양태에서, 조사된 종양의 크기가 측정된다. 일부 실시양태에서, 조사되지 않은 종양의 크기가 측정된다.
또한, 본원은 (i) 비변형 T 세포 및 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포를 종양-보유 검사 대상체의 집단에 별도로 주사하는 단계; 및 (ii) 비변형 T 세포로 주사된 종양-보유 대상체 집단의 생존율 및 변형 T 세포로 주사된 종양-보유 대상체 집단의 생존율을 측정하는 단계를 포함하고, 비변형 T 세포로 주사된 대상체의 집단에 비해 변형 T 세포로 주사된 대상체의 집단에서 더 큰 생존율이 달성되는 경우, 후보 유전자는 표적 유전자로서 확인되는, 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 생체내 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 기준 T 세포이다. 검사 대상체는 조사된 검사 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이전에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 조사된 검사 대상체는 T 세포 주사 이후에 방사선을 조사받는다. 일부 실시양태에서, 검사 대상체는 2종 종양 모델이고, 1종의 종양만이 표적 방사선을 조사받았다. 일부 실시양태에서, 검사 대상체는 마우스이다.
일부 실시양태에서, 본원은
(1) 대상체로부터 T 세포를 단리시키는 단계;
(2) 단리 T 세포에서 후보 유전자가 선택적으로 녹-아웃되거나 녹-다운되는 T 세포 세트를 제조하는 단계;
(3) 검사 대상체 그룹의 각각으로 2종의 종양을 이식하는 단계-여기서 2종의 종양은 떨여져서 이식된다-;
(4) 종양이 방사선으로 처리되지 않은 검사 대상체의 제1 그룹, 및 1종의 종양만이 방사선으로 처리된 검사 대상체의 제2 그룹을 제공하는 단계;
(5) 제1 그룹으로부터 대상체 내로 T 세포를 전달하고, 종양의 감소를 평가하는 단계; 및
(6) 제2 그룹으로부터 대상체 내로 T 세포를 전달하고, 방사선으로 처리되지 않은 종양의 감소를 평가하는 단계
를 포함하고, 단계 (6)에서 관찰된 종양의 감소가 단계 (5)에서 관찰된 감소에 비해 큰 경우, T 세포에서 녹-아웃되거나 녹-다운된 유전자, 또는 이에 의해 코딩된 단백질이 암 치료용 표적으로서 확인되는, 암 치료용 표적을 확인하는 방법을 제시한다.
일 실시양태에서, 대상체는 마우스이다. 다른 실시양태에서, 마우스는 트랜스제닉(transgenic) 마우스이다. 다른 실시양태에서, 마우스는 항-특이적 T 세포의 단일클론성 집단을 생성함으로써 T 세포 면역 반응을 증폭시키도록 조작된 트랜스제닉 마우스이다.
일 실시양태에서, 검사 대상체의 제2 그룹에서 종양은 1 Gy 내지 45 Gy, 5 Gy 내지 35 Gy, 10 Gy 내지 25 Gy, 1 Gy 내지 25 Gy, 1 Gy 내지 20 Gy, 또는 5 Gy 내지 15 Gy의 선량의 방사선에 의해 처리되었다. 일 실시양태에서, 선량은 1 Gy 내지 20 Gy이다.
일 실시양태에서, 단리 T 세포 내의 유전자는 shRNA를 함유하는 바이러스 벡터로 T 세포를 감염시킴으로써 녹-아웃되거나 녹-다운된다. 일 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터의 벡터이다. 다른 실시양태에서, 단리 T 세포 내의 유전자는 전사 액티베이터 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 사용함으로써 녹-아웃되거나 녹-다운된다. 다른 실시양태에서, 단리 T 세포 내의 유전자는 CAS9(CRISPR)를 사용함으로써 녹-아웃되거나 녹-다운된다.
5.1.2 시험관내 에세이
일부 실시양태에서, 본원은 암 치료용 표적 유전자를 스크리닝하는 시험관내 방법을 개시한다. 상기 시험관내 에세이는 T 세포 억제 에세이일 수 있다. 시험관내 에세이는 서프레서 세포를 이용하여 T 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 방법은 대상체로부터 서프레서 세포를 단리시키는 단계를 더 포함한다. 상기 대상체는 조사된 대상체 또는 조사되지 않은 대상체일 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원은 (a) 비변형 T 세포와 서프레서 세포; 및 (b) 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포와 서프레서 세포를 별도로 배양하는 단계; 및 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교하여 활성이 증가된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인되는, 암 치료용 표적 유전자를 스크리닝하는 시험관내 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 기준 T 세포이다. 상기 방법은 단리된 서프레서 세포를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 서프레서 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 단리될 수 있다. 대상체는 마우스일수 있다. 샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 서프레서 세포는 그것의 표면 마커를 기본으로 하여 단리될 수 있다.
T 세포 및 서프레서 세포는 일정 기간 동안 배양될 수 있다. 상기 일정 기간은 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포는 서프레서 세포의 존재 하에 다양한 T 세포 대 서프레서 세포 비율로 항-CD3 및 항-CD28을 이용하여 활성화된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 항-CD3 및 항-CD28을 이용하여 활성화된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포 및 서프레서 세포를 약 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 또는 1:5 비율로 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포 및 서프레서 세포를 약 1:1 비율로 배양하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 형광제를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 마이크론 크기 입자를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 마이크론 크기의 산화철 입자(MPIO)를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 표지된 자성 나노입자이다. T 세포를 표지하는 다양한 방법이 당업계에 잘 알려져 있다.
시험관내 스크리닝 방법은 증식, 세포 주기 활성화, 세포 사멸, 사이토카인 생성, 및/또는 세포독성 활성을 포함하나 이에 제한되지 않는 활성을 측정할 수 있다.
본원에서 제시된 서프레서 세포(예를 들어, Treg 및 MDSC)에 의한 T 세포의 억제는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 사용하여 에세이될 수 있다. 상기 방법은 각각의 전체가 본원에 참고로 포함되는 Dolcetti et al., Current Protocols of Immunology, 14.17.1-14.17.25 (2010); Bayne et al., Cold Spring Harb Protoc, doi: 10.1101/pdb.prot077214 (2013); Kruisbeek et al, Current Protocols in Immunology, 3.12.1-3.12.20 (2004); 및 Collison et al., Methods Mol Biol. 707: 21-37 (2011)에 개시된 것들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 MDSC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 Treg 세포 및 MSDC 둘 다를 포함한다. 스크리닝 방법이 시험관내에서 수행되는 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 대상체로부터 단리될 수 있다. 동물은 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 마우스로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조사된 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조사되지 않은 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사된 마우스로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사되지 않은 마우스로부터 얻어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시험관내 스크리닝 방법은 조사되지 않은 종양-보유 대상체로부터 단리된 서프레서 세포의 제1 집단, 및 조사된 종양-보유 대상체로부터 단리된 서프레서 세포의 제2 집단 사용을 포함한다. 상기 방법은 각각 서프레서 세포의 제1 집단을 이용하여 배양된 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교하여 활성에서의 증가를 측정하는 단계, 및 각각 서프레서 세포의 제2 집단을 이용하여 배양된 변형 T 세포를 비변형 T 세포와 비교하여 활성에서의 증가를 측정하는 단계를 포함하고; T 세포가 서프레서 세포의 제1 집단을 이용하여 배양되었을 때에 비해 T 세포가 서프레서 세포의 제2 집단을 이용하여 배양되었을 때 상기 증가가 더욱 상당한 경우, 후보 유전자가 표적 유전자로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 변형 T 세포와 비변형 T 세포를 비교시 T 세포의 활성은 T 세포가 서프레서 세포의 제1 집단을 이용하여 배양되었을 때에는 실질적으로 동일하나, T 세포가 서프레서 세포의 제2 집단을 이용하여 배양되었을 때에는 비변형 T 세포에 비해 변형 T 세포에서 더 높다.
일부 실시양태에서, 본원은 T 세포의 세포 주기 활성화를 검사함으로써 암 치료용 표적 유전자를 스크리닝하는 시험관내 방법을 제시한다. 상기 방법은 (a) 비변형 T 세포와 서프레서 세포; 및 (b) 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포와 서프레서 세포를 별도로 배양하는 단계; 및 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 세포 주기 활성화를 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 비변형 T 세포에 비해 변형 T 세포에서 세포 주기 활성화가 향상된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 세포 주기 활성화는 T 세포의 DNA 내로 3[H]-티미딘의 결합에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 기준 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 항-CD3 및 항-CD28을 이용하여 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 T 세포의 세포 사멸을 검사함으로써 암 치료용 표적 유전자를 스크리닝하는 시험관내 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 항-CD3 및 항-CD28을 이용하여 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 (a) 비변형 T 세포 및 서프레서 세포; 및 (b) 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포 및 서프레서 세포를 별도로 배양하는 단계; 및 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 세포 사멸을 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 비변형 T 세포에 비해 변형 T 세포에서 세포 사멸이 감소된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 비변형 T 세포는 기준 T 세포이다.
세포 사멸은 아폽토시스, 유사분열 세포 사멸, 및 괴사일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 방법은 아폽토시스를 측정한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 방법은 아폽토시스 유사분열 세포 사멸을 측정한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 방법은 괴사를 측정한다. 세포 사멸을 측정하기 위한 다양한 에세이가 상업적으로 이용 가능한 키트(kit)와 함께 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸은 카스파제 에세이에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸은 DNA 단편화 또는 가닥 파손(strand break)에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸은 세포계수법에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸은 ELISA에 의해 측정된다.
다른 실시양태에서, 본원은 항원-특이적 활성화에 반응한 T 세포 이펙터 기능의 발생을 평가하는 방법을 제시한다. 시험관내에서 항원-특이적 자극에 의해 유도된 T 세포의 세포독성 활성을 평가하는 단계는 당업자가 이펙터 세포의 기능적 세포용해 가능성을 평가하게 한다. 일부 실시양태에서, 당업자는 작은 변형을 이용하여 동종항원 자극 또는 항원-특이적 촉발을 평가할 수 있다. 특정 실시양태에서, 51Cr 배출에 의한 세포용해 활성의 평가는 에세이의 단순성을 예방하고, 조사관이 수많은 다양하고 드문 세포 집단을 이용하여 작업하게 하면서, T 세포-특이적 이펙터 기능 및 면역조절 세포에 의한 그것의 조절/억제를 조사하기 위해 사용될 수 있다. 크롬 배출 에세이는 더욱 구체적인 기능적 해독을 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 서프레서 세포 없이 내부 통제로 정규화된 억제의 정도를 측정하는 용혈 단위 형질전환(lytic unit transformation)은 결과의 더욱 유용한 발현을 제공하고, 상이한 실험으로부터의 결과의 비교 및 평균화를 허용한다. L.U.의 평가는 증식 에세이 또는 단일 이펙터 대 표적 비율 세포독성 값에 비해 더욱 효과적인 측정을 나타내며, 이는 그것이 기능적 활성(배양액의 세포용해 활성) 및 세포 증식(각각의 배양액에서 회복된 세포의 수) 둘 다의 추정을 포함하기 때문이다.
일부 실시양태에서, 항원은 표적 세포에서 천연적으로 존재하지 않는 단백질이다. 일 실시양태에서, 항원은 난백알부민이다.
일부 실시양태에서, 본원은 T 세포의 사이토카인 생성을 검사함으로써 암 치료용 표적 유전자를 스크리닝하는 시험관내 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 항-CD3 및 항-CD28을 이용하여 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 (a) 비변형 T 세포와 서프레서 세포; 및 (b) 녹-아웃되거나 녹-다운되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포와 서프레서 세포를 별도로 배양하는 단계; 및 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 사이토카인 생성을 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 비변형 T 세포에 비해 변형 T 세포에서 사이토카인 생성이 향상된 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 측정되는 사이토카인은 인터페론(interferon)(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터류킨(interleukin)(IL)-2, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)(GM-CSF), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 사이토카인 생성을 검사하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 사이토카인은 면역블로팅(immunoblotting)(IB) 에세이, 면역형광(immunofluorescent)(IF) 에세이, FACS, ELISA, 또는 세포내 사이토카인 착색(Intracellular cytokine staining)(ICS)에 의해 측정될 수 있다. 사이토카인 생성을 검사하는 키트가 또한 상업적으로 이용 가능하다.
일 실시양태에서, 본원은
(1) 대상체로부터 T 세포를 단리시키는 단계;
(2) 단리 T 세포에서 변형이 이루어지지 않는 T 세포의 제1 집단, 및 후보 유전자가 단리 T 세포에서 선택적으로 녹-아웃되거나 녹-다운되는 T 세포의 제2 집단을 제공하는 단계;
(3) T 세포의 제1 집단과 종양이 방사선에 의해 처리되지 않은 종양-보유 대상체로부터 단리된 서프레서 세포를 접촉시키고, 샘플에서 T 세포 억제의 정도를 결정하는 단계;
(4) T 세포의 제1 집단을 종양이 방사선에 의해 처리된 종양-보유 대상체로부터 단리된 서프레서 세포와 접촉시키고, 샘플에서 T 세포 억제의 정도를 결정하는 단계;
(5) T 세포의 제2 집단을 종양이 방사선에 의해 처리된 종양-보유 대상체로부터 단리된 서프레서 세포와 접촉시키고, 샘플에서 T 세포 억제의 정도를 결정하는 단계;
(6) 단계 (3)과 비교하여 단계 (4)에서 T 세포 억제의 감소를 결정하는 단계;
(7) 단계 (3)과 비교하여 단계 (5)에서 T 세포 억제의 감소를 결정하는 단계; 및
(8) 단계 (6)에서 결정된 바와 같은 감소의 차이를 단계 (7)에서 결정된 바와 같은 감소의 차이와 비교하는 단계
를 포함하고, 단계 (7)에서 결정된 바와 같은 T 세포 억제의 감소의 차이가 단계 (6)에서 결정된 바와 같은 감소에 비해 큰 경우, T 세포에서 녹-아웃되거나 녹-다운된 유전자, 또는 이에 의해 코딩된 단백질이 암 치료용 표적으로서 확인되는, 암 치료용 표적을 확인하는 방법을 제시한다.
일 실시양태에서, 상기 대상체는 마우스이다.
다른 실시양태에서, 마우스는 유전적으로 조작되어, 특정 항원 특이성을 가진 T 세포 수용체를 갖는다. 다른 실시양태에서, 항원은 마우스에 천연적으로 존재하지 않는 단백질이다. 다른 실시양태에서, 항원은 난백알부민이다.
일 실시양태에서, T 세포는 표지된다. 다른 실시양태에서, T 세포는 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)를 이용하여 표지된다.
일 실시양태에서, 종양은 제거 선량의 방사선으로 처리되었다. 다른 실시양태에서, 종양은 1 Gy 내지 45 Gy, 5 Gy 내지 35 Gy, 10 Gy 내지 25 Gy, 1 Gy 내지 25 Gy, 1 Gy 내지 20 Gy, 또는 5 Gy 내지 15 Gy의 선량의 방사선에 의해 처리되었다. 일 실시양태에서, 종양은 1 Gy 내지 20 Gy의 선량의 방사선에 의해 처리되었다.
일 실시양태에서, 단리 T 세포 내의 후보 유전자는 shRNA를 함유하는 바이러스 벡터로 T 세포를 감염시킴으로써 녹-아웃되거나 녹-다운된다. 일 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터의 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 SMART벡터, GIPZ, TRIPZ 또는 TRC 렌티바이러스 shRNA 벡터(GE Dharmacon)이다. 다른 실시양태에서, 단리 T 세포 내의 유전자는 전사 액티베이터 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 사용함으로써 녹-아웃되거나 녹-다운된다. 다른 실시양태에서, 단리 T 세포 내의 유전자는 CAS9(CRISPR)를 사용함으로써 녹-아웃되거나 녹-다운된다.
일 실시양태에서, T 세포 억제는 T 세포의 증식을 모니터링함으로써 평가된다. 일 실시양태에서, T 세포의 증식은 항-CD3 + 항-CD28의 존재 하에 평가된다. 일 실시양태에서, T 세포의 증식은 3[H]-티미딘의 결합에 의해 결정된다. 다른 실시양태에서, 증식은 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)를 이용하여 표지된 T 세포의 유동세포계수 분석에 의해 결정된다.
일 실시양태에서, T 세포 억제는 T 세포의 세포독성 활성을 측정함으로써 평가된다. 일 실시양태에서, 세포독성 활성은 항원-특이적 자극에 의해 유도된다. 일 실시양태에서, 항원은 난백알부민이다.
일 실시양태에서, 상기 방법은 고 처리량 환경에서의 배열 형식으로 수행된다.
특정 실시양태에서, 본원은
(1) 대상체로부터 T 세포를 단리시키는 단계;
(2) T 세포를 종양이 방사선에 의해 처리되지 않은 종양-보유 대상체로부터 단리된 서프레서 세포와 제1 세포 배양액에서 공동-배양하는 단계;
(3) T 세포를 종양이 방사선에 의해 처리된 종양-보유 대상체로부터의 서프레서 세포와 제2 세포 배양액에서 공동-배양하는 단계;
(4) 후보 유전자의 일련의 녹아웃 또는 녹다운을 유도하도록 설계된 바이러스 벡터를 이용하여 제1 및 제2 배양액을 감염시키고, 세포를 더 배양하는 단계; 및
(5) 상기 배양액에서 특정 유전자 구축물의 상대적 수준을 결정하는 단계
를 포함하고, 제1 배양액에 비해 제2 배양액에서 더 높은 수준으로 나타나는 것으로 결정된 유전자 구축물, 또는 이에 의해 코딩된 단백질이 표적인 것으로 확인되는, 암 치료용 표적을 확인하는 방법을 제시한다.
일 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
다른 실시양태에서, 특정 유전자 구축물의 상대적 수준은 벡터를 염기서열분석함으로써 결정된다. 일 실시양태에서, 상기 염기서열분석은 차세대 염기서열분석이다.
당업자는 본원에 제시된 스크리닝 방법이 본원에 개시되거나 이와 달리 당업계에 공지된 시험관내 에세이의 임의의 조합을 이용하여 1종 이상 유형의 T 세포 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
5.1.3 풀 에세이
본원은 또한 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 고 처리량 풀 스크리닝 방법을 제시한다. 풀 스크리닝 방법은 i) 각각의 T 세포가 녹-다운되거나 녹-아웃되는 1종의 후보 유전자를 갖는, 상이한 유전자 변형을 갖는 T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계; 및 (ii) T 세포의 개시 집단을 종양 미세환경과 일정 기간 동안 접촉시켜 T 세포의 선택 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며; T 세포의 선택 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 개시 집단에서 각각의 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 최대 1종의 후보 유전자를 갖는다.
본원은 또한 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 고 처리량 풀 스크리닝 방법을 제시한다. 풀 스크리닝 방법은 i) 각각의 T 세포가 녹-다운되거나 녹-아웃되는 1종의 후보 유전자를 갖는, 상이한 유전자 변형을 갖는 T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계; 및 (ii) T 세포의 개시 집단을 서프레서 세포와 일정 기간 동안 접촉시켜 T 세포의 선택 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며; T 세포의 선택 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 개시 집단에서 각각의 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 최대 1종의 후보 유전자를 갖는다.
본원에 개시된 풀 스크리닝 방법에서 사용되는 T 세포는 본원에 개시되거나 이와 달리 당업계에 공지된 T 세포 방법 중 임의의 특정 유형일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 CD3+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 CD8+ 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 CD4+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체로부터 단리된다. 상기 대상체는 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 마우스로부터 단리된다. 상기 마우스는 야생형 마우스 또는 유전적으로 조작된 마우스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스는 유전적으로 조작되어 T 세포 수용체를 발현한다. T 세포 수용체는 마우스에 천연적으로 존재하지 않는 항원에 대해 특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 항원은 난백알부민일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전적으로 조작되어, 난백알부민에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 발현하는 마우스일 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 T 세포는 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 형광제를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 마이크론 크기 입자를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 마이크론 크기의 산화철 입자(MPIO)를 이용하여 표지된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 표지된 자성 나노입자이다. T 세포를 표지하는 다양한 방법이 당업계에 잘 알려져 있다.
T 세포의 선택 집단은 T 세포의 개시 집단 증식으로부터 야기된다. T 세포의 증식을 증가시키는 유전자 변형을 가진 T 세포는 T 세포의 선택 집단에서 축적된다. 따라서, T 세포의 선택 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자는 이들 유전자를 표적화하는 단계가 종양-보유 대상체에서 T 세포 증식을 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 종양-보유 대상체는 조사된 종양-보유 대상체일 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포의 선택 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자는 T 세포의 선택 집단으로부터 단리된 게놈 DNA의 NGS에 의해 확인된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계는 비변형 T 세포를 shRNA 라이브러리로 감염시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, shRNA 라이브러리는 T 세포 게놈의 모든 유전자를 스크리닝할 수 있는 바이러스 벡터를 포함하는 게놈 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, shRNA 라이브러리는 T 세포 게놈의 유전자 선택을 포함하는 서브게놈(subgenomic) 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, shRNA 라이브러리는 특정 구조적/기능적 특징을 갖는 특정 단백질을 코딩하는 유전자를 표적화하는 바이러스 벡터를 포함한다. 예시적 라이브러리는 G-단백질 연결 수용체(GPCR) 라이브러리, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 라이브러리, 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 라이브러리, 전사 인자 라이브러리, 키나아제 라이브러리, 포스파타아제 라이브러리, 혈관형성 라이브러리, 세포 주기 라이브러리, 아폽토시스 라이브러리, 및/또는 유비퀴틴-리가아제 라이브러리를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적 라이브러리는 또한 기능장애 T 세포에서 과발현되거나 과소발현되는 것으로 알려진 유전자에 집중될 수 있다. 예를 들어, 후보 유전자의 라이브러리는 T 세포 아네르기 또는 고갈에서 과발현되는 유전자의 라이브러리일 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용되는 라이브러리는 또한 본원에 개시되거나 이와 달리 당업계에 공지된 라이브러리의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, shRNA 라이브러리는 LacZ shRNA와 같은 대조 shRNA를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계는 전사 액티베이터 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계는 CAS9(CRISPR) 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계는 T 세포를 shRNA 라이브러리로 감염시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, shRNA 라이브러리는 렌티바이러스 벡터 라이브러리이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 풀 스크리닝 방법은 접촉 단계가 개시 T 세포 집단을 서프레서 세포와 시험관내에서 배양하는 단계를 포함하는 시험관내 방법일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사된 종양-보유 대상체로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사되지 않은 종양-보유 대상체로부터 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포는 서프레서 세포의 존재 하에 다양한 T 세포 대 서프레서 세포 비율로 항-CD3 및 항-CD28을 이용하여 활성화된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 항-CD3 및 항-CD28을 이용하여 활성화된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포 및 서프레서 세포를 약 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 또는 1:5 비율로 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포 및 서프레서 세포를 약 1:1 비율로 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사된 종양-보유 대상체로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 서프레서 세포는 조사되지 않은 종양-보유 대상체로부터 얻어진다.
따라서, 본원은 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 시험관내 고 처리량 풀 스크리닝 방법을 제시한다. 시험관내 풀 스크리닝 방법은 i) 각각의 T 세포가 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는, 상이한 유전자 변형을 갖는 T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계; 및 (ii) 일정 기간 동안 서프레서 세포를 갖는 T 세포의 개시 집단을 배양하여, T 세포의 선택 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며; 여기서, T 세포의 선택 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 개시 집단에서 각각의 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃되는 최대 1종의 후보 유전자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 조사된 종양-보유 대상체로부터 서프레서 세포를 단리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 조사되지 않은 종양-보유 대상체로부터 서프레서 세포를 단리시키는 단계를 더 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 및 서프레서 세포를 배양하기 위한 기간은 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 2.5주, 3주, 3.5주, 4주, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 또는 그 이상일 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 상기 섹션에 개시된 시험관내 스크리닝 방법의 임의의 변형(permutation)이 또한 이들 시험관내 풀 스크리닝 방법에 적용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 풀 스크리닝 방법은 접촉 단계가 종양-보유 검사 대상체 내로 개시 T 세포 집단을 주사하는 단계를 포함하는 생체내 스크리닝 방법일 수 있다. 따라서, 본원은 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 생체내 고 처리량 풀 스크리닝 방법을 제시한다. 상기 생체내 풀 스크리닝 방법은 i) 각각의 T 세포가 녹-다운되거나 녹-아웃되는 최대 1종의 후보 유전자를 갖는, 상이한 유전자 변형을 갖는 T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계; 및 (ii) 종양-보유 검사 대상체로 T 세포의 개시 집단과 서프레서 세포를 주사하여, T 세포의 선택 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있고; 여기서, T 세포의 선택 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인된다.
검사 대상체는 동물 모델일 수 있다. 동물 모델은 2종 종양 모델일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 마우스이다. 종양-보유 마우스는 조사되거나 조사되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 2종 종양 모델이다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 반대측 자리에 2종의 종양을 갖고, 이중 1종만이 제거 선량의 방사선을 조사받은 마우스이다.
상기 방법은 또한 주사후 대상체로부터 T 세포의 선택 풀을 단리시키는 단계를 포함할 수 있다. T 세포의 선택 풀은 검사 대상체의 샘플로부터 단리될 수 있다. 샘플은 종양 샘플, 혈액 샘플, 또는 조직 샘플일 수 있다. 종양 샘플은 조사된 종양 또는 조사되지 않은 종양으로부터의 샘플일 수 있다. 혈액 샘플은 말초 혈액, 전혈, 또는 부분적으로 정제된 혈액의 샘플일 수 있다. 조직 샘플은 비장 샘플, 또는 림프절 샘플일 수 있다. 림프절 샘플은 배수 림프절 샘플 또는 비-배수 림프절 샘플일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 주사후 24시간, 주사후 2일, 주사후 3일, 주사후 4일, 주사후 5일, 주사후 6일, 주사후 7일, 주사후 8일, 주사후 9일, 주사후 10일, 주사후 11일, 주사후 12일, 주사후 13일, 주사후 14일, 주사후 2.5주, 주사후 3주, 주사후 3.5주, 주사후 4주, 주사후 5주, 주사후 6주, 주사후 7주, 주사후 2개월, 주사후 3개월, 또는 그 이상에 검사 대상체로부터 T 세포의 선택 집단을 단리시키는 단계를 포함한다.
대상체에서 T 세포의 선택 집단은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검사 대상체에서 주사된 T 세포의 축적은 세포계수법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검사 대상체에서 T 세포의 축적은 축적된 T 세포로부터의 게놈 DNA의 차세대 염기서열분석(NGS)에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시 집단의 각각의 T 세포는 후보 유전자용 최대 shRNA를 갖고, 후보 유전자용 shRNA가 T 세포의 개시 집단에 비해 T 세포의 선택 집단에서 풍부한 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인된다. 녹-다운되거나 녹-아웃되는 이들 표적 유전자를 갖는 T 세포는 종양 항원의 TCR 인식의 향상된 증식 독립성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 후보 유전자는 T 세포의 개시 집단에 비해 T 세포의 선택 집단에서 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 12배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 또는 약 50배만큼 풍부해진다. 일부 실시양태에서, 후보 유전자는 T 세포의 개시 집단에 비해 T 세포의 선택 집단에서 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 12배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 또는 그 이상 만큼 풍부해진다.
종양에서 T 세포를 회복시키는 shRNA는 종양에서 풍부해질 수 있으나, 2차 림프 기관(예를 들어, 비장)과 같은 다른 조직에서는 그렇지 않다. 따라서, 일부 실시양태에서, 후보 유전자용 shRNA가 비-종양 조직 샘플에 비해 종양 샘플로부터 얻은 T 세포의 선택 집단에서 풍부해지는 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인된다. 종양 샘플은 조사된 종양 또는 조사되지 않은 종양으로부터의 샘플일 수 있다. 조직 샘플은 2차 림프 기간 샘플, 예컨대 비장 샘플, 또는 림프절 샘플일 수 있다. 림프절 샘플은 배수 림프절 샘플 또는 비-배수 림프절 샘플일 수 있다.
일부 실시양태에서, 후보 유전자는 비-종양 조직 샘플에 비해 종양 샘플에서 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 12배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 또는 약 50배만큼 풍부해진다. 일부 실시양태에서, 후보 유전자는 T 세포의 개시 집단에 비해 T 세포의 선택 집단에서 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 12배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 또는 그 이상 만큼 풍부해진다.
일부 실시양태에서, T 세포의 선택 집단에서 shRNA를 정량화하는 단계는 NGS 사용을 포함할 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 상기 섹션에 개시된 생체내 스크리닝 방법의 임의의 치환이 또한 이들 생체내 풀 스크리닝 방법에 적용된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 개시된 풀 스크리닝 방법은 또한 확인된 표적 유전자를 입증하기 위한 기능적 검사를 더 포함할 수 있다.
5.2 T 세포에서 후보 유전자의 녹-아웃 또는 녹-다운
일부 실시양태에서, 후보 유전자는 방사능과 조합하여 T 세포 기능을 조절하는데 있어서 특정 단백질 부재의 효과를 평가하기 위해 T 세포에서 녹-아웃되거나 녹-다운된다. 유전자 편집을 위한 당업계에 공지된 임의의 통상적 방법이 본원에 제시된 방법과 관련하여 사용될 수 있다.
5.2.1 RNAi계 녹-아웃 또는 녹-다운
후보 유전자의 녹-아웃 또는 녹-다운(집합적으로 "침묵")은 화학적으로 합성되거나 시험관내에서 전사된 소간섭(small interfering) RNA(siRNA)뿐 아니라 PCR 또는 DNA 벡터-계의 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA(shRNA)을 사용하여 다양한 세포계에서 달성될 수 있다. RNA 폴리머라아제 III-계 프로모터, U6 및 H1, 및 RNA 폴리머라아제 II 프로모터, CMV를 포함하여, 일부 프로모터가 세포에서 shRNA 발현을 유도하는 것으로 보고되었다. 또한, 본원에 제시된 shRNA 분자는 T 세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어, 후보 유전자의 침묵을 달성하도록 shRNA 분자의 T 세포 특이적 표적화를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원은 후보 유전자를 이용한 RNA 간섭에 의한 유전자 침묵의 방법을 제시한다. 상기 방법은 간섭(침묵) RNA를 코딩하는 구축물을 형성하는 단계를 수반하고, 구축물이 전달될 세포 유형(예를 들어, T 세포)에서 활성인 프로모터는 shRNA의 발현을 유도하는데 사용된다.
본원에 제시된 방법에서 사용되는 shRNA 구축물에는, 후보 유전자를 겨냥하며, 후보 유전자를 코딩하는 핵산 분자의 발현을 조절하는데 사용되기 위한 뉴클레오티드의 작은 스트레치(stretch)가 있다. 후보 유전자의 억제는 후보 유전자를 코딩하는 1종 이상의 표적 핵산 분자와 혼성화되는 올리고머 화합물을 제공함으로써 달성된다.
안티센스(antisense) 기술 뒤의 원리는 표적 핵산에 혼성화되는 안티센스 화합물이 전사 또는 번역과 같은 유전자 발현 활성을 조절하는 것이다. 이 서열 특이성은 안티센스 화합물을 표적 검증 및 유전자 기능화를 위한 도구로서 극히 매력적이게 한다.
특정 이론에 구애됨 없이, 후보 유전자의 침묵을 위한 작용의 메커니즘은 shRNA 화합물과 표적 핵산의 혼성화를 수반하며, 혼성화의 결과 또는 효과는, 예를 들어 후보 유전자의 전사 또는 스플라이싱(splicing)을 비롯한 세포 기구(cellular machinery)의 동시 스톨링(concomitant stalling)에 의한 표적 분해 또는 표적 점유이다.
안티센스 화합물이 혼성화되지만 표적의 분해를 유도하지는 않는 점유-계 안티센스 메커니즘의 예는 번역의 억제, 스플라이싱의 조절, 폴리(A) 부위 선택의 조절 및 조절 RNA의 파괴를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포를 비-분해 적으로 작용하는 안티센스 화합물과 접촉시킴으로써 mRNA 표적의 과정 조절을 통해 세포의 거동을 제어하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제6,210,892호 및 미국 공개 제20020049173호에 개시되어 있다.
일반적으로, shRNA의 센스 서열은 약 19개 내지 약 22개 길이의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 19개, 20개, 21개 또는 22개 뉴클레오티드)일 것이며, 안티센스 서열은 약 19개 내지 약 22개 길이의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 19개, 20개, 21개 또는 22개 뉴클레오티드)일 것이고, 루프 영역(loop region)은 약 3개 내지 약 19개 길이의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 3개 내지 최대 약 19개)일 것이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 서열은 동일한 길이이며, 즉 shRNA는 대칭적 헤어핀을 형성할 것이다. 다른 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 그것의 상보적 가닥에 비해 더 짧을 수 있고, 비대칭적 헤어핀이 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 서열 사이의 염기쌍은 정확하다. 다른 실시양태에서, 서열 사이의 일부 미스매치(mismatch)는, 예를 들어 2개의 가닥 사이의 수소 결합의 강도를 감소시키기 위해 용인되거나, 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, shRNA 분자는 또한 화학적으로 변형될 수 있는 5'-말단 포스페이트기를 포함할 수 있다. 또한, shRNA 분자의 루프 부분은, 예를 들어 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 링커(linker) 분자, 접합체(conjugate) 분자 등을 포함할 수 있다.
임의의 적합한 벡터가 후보 유전자의 RNAi 침묵과 관련하여 사용될 수 있다. 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 바이러스-계 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 레트로바이러스 벡터; 및 플라스미드-계 벡터 및 다른 벡터, 예컨대 바큘로바이러스, 파지, 파지미드(phagemid), 코스미드, 포스미드(phosmid), 세균 인공 염색체(bacterial artificial chromosome), P1-계 인공 염색체, 효모 플라스미드, 및 효모 인공 염색체.
일 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
shRNA 발현 벡터의 전달은 표적 세포에 대한 투여에 의하거나 소망하는 표적 세포(들) 또는 조직 내로의 도입을 허용할 임의의 다른 수단, 예를 들어 형질감염 또는 형질도입에 의한 것일 수 있다.
5.2.2 TALEN을 이용한 녹-아웃 또는 녹-다운
다른 실시양태에서, 후보 유전자는 전사 액티베이터 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 이용 시스템을 사용하여 침묵될 수 있다. 전사 액티베이터 유사(TAL) 이펙터 서열은 반복 가변-이중잔기(repeat variable-diresidue)(RVD)의 서열을 조립함으로써 특이성을 갖는 DNA 표적을 결합하도록 조립될 수 있다. TAL 이펙터 및 뉴클레아제(TALEN)의 융합 단백질은 세포에 대한 특이적 유전자 변형을 만드는데 사용될 수 있는 세포 DNA에서 표적화된 이중 가닥 파손을 만들 수 있다. TALEN은 안정적으로 변형된 세포를 생성하기에 유용한 것으로 보고되었다.
표적 DNA 내에서 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합하는 TAL 이펙터 도메인은 10개 이상의 DNA 결합 반복(DNA binding repeat), 또는 15개 이상의 DNA 결합 반복을 포함할 수 있다. 각각의 DNA 결합 반복은 표적 DNA 서열 내의 염기쌍의 인식을 결정하는 RVD를 포함할 수 있고, 각각의 DNA 결합 반복은 표적 DNA 서열 내의 1종의 염기쌍 인식을 맡으며, RVD는 다음 중 1종 이상을 포함한다: C 인식용 HD; T 인식용 NG; A 인식용 NI; G 또는 A 인식용 NN; A 또는 C 또는 G 또는 T 인식용 NS; C 또는 T 인식용 N*, 여기서 *은 RVD의 제2 자리에서의 갭(gap)을 나타낸다; T 인식용 HG; T 인식용 H*, 여기서 *은 RVD의 제2 자리에서의 갭을 나타낸다; T 인식용 IG; G 인식용 NK; C 인식용 HA; C 인식용 ND; C 인식용 HI; G 인식용 HN; G 인식용 NA; G 또는 A 인식용 SN; 및 T 인식용 YG.
일부 실시양태에서, TALEN은 엔도뉴클레아제 도메인 및 표적 DNA에 대해 특이적인 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있으며, DNA 결합 도메인은 복수의 DNA 결합 반복을 포함하고, 각각의 반복은 표적 DNA 내의 염기쌍의 인식을 결정하는 RVD를 포함하며, DNA 결합 반복은 표적 DNA 내의 1종의 염기쌍 인식을 맡고, TALEN은 다음 RVD 중 1종 이상을 포함한다: C 인식용 HD; T 인식용 NG; A 인식용 NI; G 또는 A 인식용 NN; A 또는 C 또는 G 또는 T 인식용 NS; C 또는 T 인식용 N*; T 인식용 HG; T 인식용 H*; T 인식용 IG; G 인식용 NK; C 인식용 HA; C 인식용 ND; C 인식용 HI; G 인식용 HN; G 인식용 NA; G 또는 A 인식용 SN; 및 T 인식용 YG. TALEN은 다음 RVD 중 1종 이상을 포함할 수 있다: C 인식용 HA; C 인식용 ND; C 인식용 HI; G 인식용 HN; G 인식용 NA; G 또는 A 인식용 SN; T 인식용 YG; 및 G 인식용 NK, 및 다음 중 1종 이상: C 인식용 HD; T 인식용 NG; A 인식용 NI; G 또는 A 인식용 NN; A 또는 C 또는 G 또는 T 인식용 NS; C 또는 T 인식용 N*; T 인식용 HG; T 인식용 H*; 및 T 인식용 IG. 엔도뉴클레아제 도메인은 II형 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, FokI)로부터 얻을 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 일시적으로 형질전환되어, 구축물이 그것의 게놈으로 통합되지 않을 수 있다. 예를 들어, TALEN 코딩 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 세포 내로 도입되어, TALEN 코딩 서열이 발현되나, 벡터는 게놈으로 안정적으로 통합되지 않을 수 있다. 일시적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 각각의 세포 분열과 함께 도입된 핵산 구축물의 일부 또는 전부가 감소되어, 충분한 수의 세포 분열 이후에 도입된 핵산이 딸세포에서 검출되지 않을 수 있다. 그러나, TALEN 코딩 서열의 발현은 도너(donor) 서열과 내생 표적 서열 사이의 상동성 재조합을 달성하기에 충분할 수 있다. 일시적으로 형질전환된 세포 및 안정적으로 형질전환된 세포 둘 다는 본원에 제시된 방법에서 유용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및/또는 재조합 벡터는 전기천공법, 미량주입법, 및 바이오리스틱 방법(biolistic method)을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 통상적 방법을 사용하여 숙주의 게놈 내로 도입될 수 있다. 또한, 당업계에 통상적으로 알려진 임의의 다른 유전자 전환 및 형질전환 기법이 본원에 제시된 방법과 관련하여 사용될 수 있다. 상기 기법은 칼슘 또는 PEG를 통한 프로토플라스트(protoplast) 형질전환, 네이키드(naked) DNA의 전기천공법-중개 흡수(uptake), 리포솜-중개 형질감염, 전기천공법, 바이러스 벡터-중개 형질전환, 및 미세투사물 충격(microprojectile bombardment)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다(미국 특허 제5,538,880호, 제5,204,253호, 제5,591,616호, 및 제6,329,571호 참조하며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다). 일부 실시양태에서, DNA 변형 효소(예를 들어, TALEN)는 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 기계식 주사(mechanical injection), 세균 III형 분비 시스템, 또는 전기천공법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 결합은, 예를 들어 트랜스포사제(transposase), 인테그라아제(integrase), 리콤비나아제(recombinase), 레졸바아제(resolvase), 인베르타아제(invertase), 프로테아제, DNA 메틸트랜스퍼라아제, DNA 데메틸라아제(demethylase), 히스톤 아세틸라아제, 히스톤 데아세틸라아제, 뉴클레아제, 전사 억제인자(repressor), 전사 액티베이터, 전사 인자 리크루팅(recruiting), 단백질 핵 국재 신호 또는 세포 흡수 신호를 포함하나, 이에 제한되지 않는 이펙터 도메인과 연결된다.
일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 트랜스포사제 활성, 인테그라아제 활성, 리콤비나아제 활성, 레졸바아제 활성, 인베르타아제 활성, 프로테아제 활성, DNA 메틸트랜스퍼라아제 활성, DNA 데메틸라아제 활성, 히스톤 아세틸라아제 활성, 히스톤 데아세틸라아제 활성, 뉴클레아제 활성, 핵 국재 신호전달 활성, 전사 억제인자 활성, 전사 액티베이터 활성, 전사 인자 리크루팅 활성, 또는 세포 흡수 신호전달 활성을 포함하나, 이에 제한되지 않는 활성을 나타내는 단백질 도메인이다. 다른 실시양태는 본원에 개시된 활성의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
클로닝(cloning) 및 발현 벡터뿐 아니라 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한 임의의 적합한 벡터가 본원에 제시된 방법과 관련하여 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 1종 이상의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터이고, "발현 제어 서열"은 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 제어 및 조절하는 DNA 서열이다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드 및, 예를 들어 박테리오파지, 바큘로바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 헤르페스 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 수많은 벡터 및 발현 시스템이 상업적으로 이용 가능하다. 예로서, 재조합 DNA 기법에 사용되는 일부 벡터는 DNA의 세그먼트(예컨대 이종 cDNA 세그먼트와 같은 이종 DNA 세그먼트)와 같은 독립체가 표적 세포로 전달되도록 한다.
벡터는 서열이 벡터의 필수 생물학적 기능의 손실 없이 결정 가능한 방식으로 절단될 수 있고, 핵산 단편이 그것의 복제 및 클로닝을 유발하기 위해 스플라이싱되거나 삽입될 수 있는 1종 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(I형, II형 또는 II형들)를 가질 수 있다. 벡터는 또한 2종의 핵산 분자 사이의 핵산 서열의 교환을 허용하는 1종 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 벡터는, 예를 들어 PCR, 전사 및/또는 번역 개시 및/또는 조절 부위, 재조합 신호, 레플리콘(replicon), 및 선택 가능한 마커에 대한 프라이머 부위를 더 제공할 수 있다. 벡터는 벡터를 이용하여 형질전환되는 세포의 확인 용도에 적합한 1종 이상의 선택 가능한 마커를 더 함유할 수 있다.
소망하는 핵산 서열의 번역이 필요한 일부 실시양태, 예를 들어 TALE 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA에서, 벡터는 또한 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위해 필요한 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 흔히 "플라스미드"의 형태로 존재하며, 이는 그것들의 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않는 환형 이중-가닥 DNA 루프를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 주어진 TALE 폴리펩티드의 모든 성분은 단일 벡터에서 코딩될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 벡터는 기능적 TALE 폴리펩티드에 필요한 모든 성분을 함유하거나 포함할 수 있도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개별 성분(예를 들어, 1종 이상의 모노머 단위 및 1종 이상의 이펙터 도메인)은 상이한 벡터에서 별도로 코딩되고 1종 이상의 세포 내로 별도로 도입될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 임의의 벡터는 그 자체가 임의의 위치 또는 위치의 조합에서, 이펙터 도메인 및/또는 TALE 모노머 단위와 같은 소정의 TALE 폴리펩티드를 코딩하는 성분 서열을 포함할 수 있다.
벡터의 예는 플라스미드, 에피솜, 박테리오파지, 또는 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되거나 사용되는 특정 세포계에서 자체적으로 복제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용되는 벡터는 에피솜 벡터, 즉 염색체외 복제가 가능한 핵산이고, 세균, 바이러스 또는 파지로부터의 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 벡터는 세균 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 요소, 및 바이러스, 이의 조합으로부터 유래된 벡터, 예컨대 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 요소, 코스미드 및 파지미드로부터 유래된 것들로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 세균 인공 염색체(BAC) 또는 효모 인공 염색체(YAC)일 수 있다. 벡터는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, RNA, 또는 파지 벡터일 수 있다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 입자의 형태로 사용될 수 있다. 동등한 기능을 제공하는 당업자에게 알려진 발현 벡터의 다른 형태가 또한 사용될 수 있다. 발현 벡터는 발현될 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 안정적이거나 일시적인 발현을 위해 사용될 수 있다. 벡터는 자기-복제성 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다. 일 실시양태에서, 벡터는 게놈 통합 벡터, 또는 숙주 세포, 세포계, 또는 비-세포계의 염색체 DNA 또는 RNA 내로 통합될 수 있는 "통합 벡터"이다. 일부 실시양태에서, TALE 폴리펩티드 또는 성분 서열을 코딩하는 핵산 서열은 벡터 서열의 성분과 마찬가지로 숙주 세포, 세포계, 또는 비-세포계의 염색체 DNA 또는 RNA 내로 통합된다.
본원에 제시된 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내의 핵산의 발현에 적합한 형태로 TALE 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터(들)가 발현에 사용될 숙주 세포(들)를 기본으로 하여 선택되는 1종 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 나타내고, 이는 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.
5.2.3 CRISPR / CAS9 이용 녹-아웃 또는 녹-다운
일부 실시양태에서, 후보 유전자는, 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Wiedenheft et al., Nature 482 (7385): 331-8 (2012)에 개시된 군집화된 규칙적으로 이격된 짧은 재발성 반복(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)(CRISPR)/CAS9 시스템을 사용하여 침묵된다.
간략하게는, Cas9 단백질 및 진핵 세포 내의 1종 이상의 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 분자의 게놈 좌위(loci)를 표적화하는 1종 이상의 안내 RNA를 포함하는 조작되고 프로그램화할 수 있는, 비-천연 산출 CRISPR-Cas 시스템이 제시되며, Cas9 단백질은 1종 이상의 유전자 생성물을 코딩하고, 1종 이상의 유전자 생성물의 발현을 변경시키는 DNA 분자의 게놈 좌위를 분해한다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제8,697,359호를 참조).
벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 CRISPR 전사물(예를 들어, 핵산 전사물, 단백질, 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사물은 세균 세포, 예컨대 대장균(Escherichia coli), 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터를 사용함), 효모 세포, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에서 더 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 시험관내에서, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라아제를 사용하여 전사 및 번역될 수 있다.
벡터는 원핵생물에 도입되어 증식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 원핵생물은 진핵 세포 내로 도입될 벡터 또는 진핵 세포 내로 도입될 벡터의 생성시 중간 벡터와 같은 벡터의 복제물을 증폭시키기 위해 사용된다(예를 들어, 바이러스 벡터 패키징(packaging) 시스템의 일부로서 플라스미드를 증폭시킴). 일부 실시양태에서, 원핵생물은 벡터의 복제물을 증폭시키고 1종 이상의 핵산을 발현시키기 위해 사용되어, 숙주 세포 또는 숙주 유기체로의 전달을 위한 1종 이상의 단백질의 공급원을 제공한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 융합 발현 벡터이다. 상기 벡터의 예는 상업적으로 이용 가능한 벡터, 예컨대 표적 재조합 단백질로 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)(GST), 말토오스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 융합시키는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc), pMAL (New England Biolabs) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 유도성 비-융합 대장균 발현 벡터의 예는 pTrc (Amrann et al., Gene 69:301-315 (1988)) 및 pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. 60-89 (1990))를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 상기 벡터의 예는 pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. 6: 229-234 (1987)), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113-123 (1987)), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), 및 picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 벡터는 포유류 발현 벡터이다. 상기 벡터의 예는 pCDM8 (Seed, Nature 329: 840 (1987)) 및 pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6: 187-195 (1987))를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 포유류 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 전형적으로 1종 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 거대세포바이러스, 유인원바이러스 40, 및 당업계에 공지된 다른 것들로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 제어 요소는 CRISPR 시스템의 1종 이상의 요소에 작동 가능하게 연결되어, CRISPR 시스템의 1종 이상의 요소의 발현을 유도한다. CRISPR 좌위는 에로피룸(Aeropyrum), 피로바쿨룸(Pyrobaculum), 술포로부스(Sulfolobus), 아키오글로부스(Archaeoglobus), 할로카르쿨라(Halocarcula), 메타노박테리움(Methanobacteriumn), 메타노코쿠스(Methanococcus), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노피루스(Methanopyrus), 피로코쿠스(Pyrococcus), 피크로필루스(Picrophilus), 테르니오플라스니아(Thernioplasnia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 미코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아퀴프륵스(Aquifrx), 포르프브로모나스(Porphvromonas), 클로로비움(Chlorobium), 테르무스(Thermus), 바실루스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 포도상구균(Staphylococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 테르모아네로박터(Thermoanaerobacter), 마이코플라스마(Mycoplasma), 푸소박테리움(Fusobacterium), 아자르쿠스(Azarcus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 나이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 디설포비브리오(Desulfovibrio), 게오박터(Geobacter), 마이로코쿠스(Myrococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 울리넬라(Wolinella), 아시네토박터(Acinetobacter), 에르위니아(Erwinia), 에세리키아(Escherichia), 레지오넬라(Legionella), 메틸로코쿠스(Methylococcus), 파스퇴렐라(Pasteurella), 포토박테리움(Photobacterium), 살모넬라(Salmonella), 크산토모나스(Xanthomonas), 예르시니아(Yersinia), 트레포네마(Treponema), 및 테르모토가(Thermotoga)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 40개 이상의 원핵생물에서 확인되었다.
일부 실시양태에서, CRISPR 시스템의 1종 이상의 요소는 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, CRISPR 시스템의 1종 이상의 요소는 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)과 같은 내생 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다.
전형적으로, CRISPR는 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소(내생 CRISPR 시스템의 문맥에서 프로토스페이서(protospacer)로도 지칭됨)에 의해 특징지어진다. 용어 "표적 서열"은 CRISPR 시스템과 관련하여 사용될 때, 표적 서열과 가이드(guide) 서열 사이의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 상보성을 갖도록 가이드 서열이 설계된 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 혼성화를 야기하고, CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 제공되는 한, 완전 상보성은 필요하지 않을 수 있다.
표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 진핵 세포의 세포소기관, 예를 들어 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열과 같은 1종 이상의 삽입 부위("클로닝 부위"로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 삽입 부위(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 삽입 부위)는 1종 이상의 벡터의 1종 이상의 서열 요소의 상부스트림(upstream) 및/또는 하부스트림(downstream)에 위치한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 tracr 메이트(mate) 서열의 상부스트림과, 임의로 tracr 메이트 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소의 하부스트림에 삽입 부위를 포함하여, 삽입 부위 내로 가이드 서열의 삽입 이후, 발현시 가이드 서열이 진핵 세포에서 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 2종 이상의 삽입 부위를 포함하고, 각각의 삽입 부위는 2개의 tracr 메이트 서열 사이에 위치하여, 각각의 부위에 가이드 서열이 삽입되게 한다. 상기 배열에서, 2종 이상의 가이드 서열은 단일 가이드 서열의 2종 이상의 복제물, 2종 이상의 상이한 가이드 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 단일 발현 구축물은 세포 내의 다수의 상이한 대응 표적 서열에 대한 CRISPR 활성을 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개, 또는 그 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 상기 가이드 서열 함유 벡터가 제공되고, 임의로 세포로 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. Cas 단백질의 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 이의 동족체 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, CRISPR 효소는 Cas9이고, Cas9일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 효소는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내와 같은 표적 서열의 위치에서 일측 또는 양측 가닥의 분해를 유도한다. 일부 실시양태에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 최초 또는 최종 뉴클레오티드로부터의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개, 또는 그 이상의 염기쌍 내의 일측 또는 양측 가닥의 분해를 유도한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 대응 야생형 효소에 대하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 코딩하여, 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 일측 또는 양측 가닥을 분해하는 능력이 결여된다.
일부 실시양태에서, CRISPR 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 진핵 세포는 특정 유기체, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 비-인간 영장류를 포함하나, 이에 제한되지 않는 포유동물의 것이거나 이로부터 유래된 것일 수 있다. 코돈 최적화는 천연 아미노산 서열은 유지하면서, 천연 서열의 적어도 1종의 코돈을 상기 숙주 세포의 유전자에서 더 자주 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심있는 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다.
다양한 종이 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 바이어스(bias)를 나타낸다. 코돈 바이어스(유기체 사이에서 코돈 용도에서 상이함)는 흔히 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율성과 관련 있으며, 이는 결과적으로 다른 것들 중에서, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존하는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택되는 tRNA의 우위는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 자주 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기본으로 하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤될 수 있다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적 표적 서열은 표적 게놈에서 고유한 것들을 포함한다. 예를 들어, 화농연쇄상구균(S. pyogenes) Cas9에 대해, 게놈에서 고유한 표적 서열은 NNNNNNNNNNNNXGG(N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있다)가 게놈에서 단일 발생을 갖는 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있다.
유전자 편집을 위해 일부 상업적으로 이용 가능한 CRISPR/Cas9 시스템이 당업계에서 이용 가능하다. 임의의 상기 시스템, 및 이의 임의의 변형이 본원에 제시된 방법과 관련되어 사용될 수 있다.
5.3 사용 방법
또한, 본원은 본원에 개시된 스크리닝 방법을 이용하여 확인된 유전자 표적의 사용 방법을 제시한다. 예를 들어, 본원은 본원에 개시된 스크리닝 방법에 의해 확인된 표적 유전자를 억제함으로써 T 세포를 활성화시키는 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 종양-보유 대상체에 존재한다. 종양-보유 대상체는 본원에 개시된 스크리닝 방법에 의해 확인된 표적 유전자를 억제하는 처리 이전, 그와 동시, 또는 그 이후에 종양 표적 방사선을 조사받을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 또한 본원에 개시된 스크리닝 방법에 의해 확인된 표적 유전자를 억제함으로써 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 본원은 또한 본원에 개시된 스크리닝 방법에 의해 녹-다운되거나 녹-아웃되는 것으로 확인된 표적 유전자를 가진 T 세포를 사용하는 T 세포 요법을 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 종양-표적 방사선 요법을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
6. 실시예
본원에 제시된 실시양태는 다음 실시예들을 참고함으로써 보다 완전히 이해될 수 있다. 이들 실시예는 본원에 제시된 약제학적 조성물 및 투여 형태를 예시하기 위한 것이지만, 임의의 방식으로 제한되는 것은 아니다.
6.1 실시예 1: 고 처리량 시험관내 스크리닝
암 치료용 표적, 즉 서프레서 세포의 억제 메커니즘 조절에 관여하는 분자를 확인하기 위해, 나이브 T 세포를 유전적으로 또는 비-유전적으로 조작된 비-종양 보유 마우스로부터 단리시키고 96개의 웰 플레이트(well plate)에 위치시킨다. 상기 개시된 바와 같은 관심있는 shRNA를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포를 감염시키거나 또는 상기 개시된 TALEN 또는 CRISPR/CAS9 시스템과 같은 관심있는 유전자를 녹아웃시킬 수 있는 시스템을 사용함으로써, 상기 나이브 T 세포는 녹-다운되거나 녹-아웃된 관심있는 특정 유전자를 함유하도록 조작된다. 특정 후보 유전자의 녹-다운 또는 녹-아웃은 한번에 하나의 웰에서 수행된다.
안정적인 표현형을 얻은 후, 2 세트의 서프레서 세포((1) 조사된 동물로부터 단리된 서프레서 세포; 및 (2) 조사되지 않은 동물로부터 단리된 서프레서 세포)를 사용하여, shRNA 처리된 T 세포를 항원 또는 항-CD3 + 항-CD28의 존재 하에 서프레서 세포와 함께 배양한다. 이어서, 본원에 참고로 포함되는 Dolcetti et al., Current Protocols in Immunlogy, 14.17.1-14.17.25 (2010)에 개시된 것들과 실질적으로 유사한 과정을 사용하는 3[H]-티미딘 결합을 모니터링함으로써, 개별 웰에서 T 세포 증식을 평가할 것이다.
증식은 비-표적 제어 shRNA로 처리된 T 세포에서 억제되는 반면, 면역 반응을 음성적으로 조절하는(억제하는) 표적 유전자의 비활성화는 향상된 반응(감소된 억제)를 야기할 것으로 예상된다. 또한, 조사 대 비조사 동물로부터 단리된 T 세포 및/또는 서프레서 세포의 반응을 동일한 시험관내 억제 에세이에서 비교한다. 조사된 동물로부터 단리된 서프레서 세포와 결합되었을 때, T 세포 반응의 억제와 관련된 유전자의 녹-아웃 또는 녹-다운을 함유하는 샘플에서 상당히 우수한 T 세포 증식(즉, 감소된 T 세포 억제)이 관찰될 것이 예상된다. 상기 유전자는 암 치료용 표적으로서, 특히 억제가 잠재적으로 업스코팔 효과를 유도할 수 있는 표적으로서 확인된다.
6.2 실시예 2: 풀링된 (Pooled) 시험관내 스크리닝
96개의 웰 플레이트에서 배열된 형식으로 수행되지는 않았으나 T 세포의 풀로서 서프레서 세포와의 공동-배양으로 수행된 것을 제외하고, 다른 시험관내 접근법이 상기 기재된 바와 동일한 방법을 기본적으로 사용할 수 있다. 후보 유전자의 녹-다운 또는 녹-아웃을 중개할 수 있는 렌티바이러스 보유 벡터를 이용하여 T 세포를 감염시키고, 정확하게는 1종의 세포만이 약화된 1종의 유전자만을 가질 것이다. 각각의 유전자는 적어도 500-1000개 세포의 발현을 가질 것이다. T 세포 억제 에세이를 풀로서 수행하여, 억제 미세환경에서 억제 및 증식을 회피할 수 있는 임의의 세포가 풍부해질 것이다. 관심있는 벡터를 보유한 세포는 게놈 내로 통합될 것이며, 따라서 벡터를 염기서열분석하는 것은 풀에서 각각의 벡터의 상대적 발현을 결정할 것이고, 특정 벡터의 임의의 과잉발현(또는 과소발현)은 T 세포 면역성에 대한 억제 효과에서 후보 유전자의 관여를 평가하기 위해 결정된다.
6.3 실시예 3: 업소코팔 효과를 유도하기 위한 표적에 대한 생체내 스크리닝
일부 사례에서, 업소코팔 효과의 중개요소로서, 상기 개시된 시험관내 에세이로부터 확인된 후보 유전자의 기능을 2종의 종양이 동물에서 떨어져 이식되고 1종의 종양만이 조사될 생체내 에세이에서 검사한다. 비조사된 종양에 대한 항-종양 효과를 측정할 것이다. 유전자가 조사를 이용한 면역억제 반응을 중개하는데 중요한 경우, T 세포에서 그것을 녹-다운시키거나 녹-아웃시키는 것은 미처리된 종양의 항-종양 효과를 크게 향상시킬 것이다.
나이브 T 세포는 야생형 또는 TCR 조작된 마우스로부터 단리되고, 상기 개시된 바와 같은 시험관내 풀링된 스크리닝 접근법과 유사한 풀링된 렌티바이러스 접근법을 사용하여 관심있는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. T 세포 내로의 관심있는 벡터의 안정적인 형질도입 이후에, 각각의 유전자에 대한 500-1000개의 발현시, 이들 세포를 2중-종양 보유 마우스 내로 다시 주사한다.
1 세트의 동물에 대해, 2종 종양 중 1종에만 1 내지 20 Gy의 단일 선량의 방사선을 조사한다. 제2 세트의 동물에 대해서는, 종양은 조사되지 않는다. 조사 후 7-20일의 기간 이후에, 배수 림프절, 비-배수 림프절, 비장, 및 비조사된 종양으로부터 형질도입된 T 세포(종양 보유 동물로부터의 내생 T 세포에 의해 발현되지 않거나, 세포 내로 도입되는 벡터에 의해 공동-발현되는 세포 표면 상의 특이적 유사유전자형 마커의 발현에 의해 확인될 수 있음)를 단리시킨다.
T 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고, 차세대 염기서열분석을 사용하여 특정 벡터를 증폭 및 염기서열분석한다. 업스코팔 효과의 도입에 관여하는 후보 유전자를 함유한 T 세포는 향상된 증식을 나타낼 것으로 예상된다. T 세포 활성화 및 증식은 관심있는 유전자가 녹 다운되거나 녹 아웃되고, 주요 종양의 제거 조사가 존재할 때에만 발생하는 것으로 예상된다. 따라서, 이 활성화는 반대측 종양이 조사되고 관심있는 유전자가 녹 다운되었을 때, 미처리된 종양에 침윤하는 T 세포 및 미처리된 종양의 수축에서 분명해야 한다. 이와 반대로, T 세포 활성화는 비조사된 마우스에서 낮거나 무시가능할 것으로 예상된다.
6.4 실시예 4: 생체내 shRNA 스크리닝
G 단백질-연결 수용체(GPCR), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF), 및 면역글로불린 수퍼패밀리 라이브러리(IgSF)를 표적화하여 2종 종양 마우스 모델에서의 생체내 스크리닝을 수행하였다. 총 134개의 후보 유전자를 스크리닝하고, 이들 패밀리의 각각의 후보 유전자를 4 내지 5개의 shRNA로 나타내어, 거의 650개의 shRNA로 나타내었다. 수많은 유전자에 대해, 종양 항원의 TCR 인식과 별도로, 검사 대상체의 1종의 종양이 표적 방사선을 조사받았을 때, shRNA는 개시 T 세포 집단에 비해 검사 조직에서 과발현되어, shRNA를 포함하는 T 세포 클론의 향상된 증식 및 축적을 나타내었다. 따라서, 이들 유전자를 단독으로 또는 방사선과 조합된 암 치료용 표적으로서 확인하였다. 이들 확인된 표적의 타당성은 추가 검사를 이용해 더 입증될 수 있다. 반면에, 검사 조직에서 shRNA의 선택적 손실을 갖는 유전자는 이들 유전자가 T 세포 활성화 및 억제에서 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다.
풀링된 shRNA 라이브러리의 구축. 각각의 표적 유전자에 대해 서브클로닝된 4 내지 5개의 shRNA에 의해 G 단백질-연결 수용체(GPCR), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF), 및 면역글로불린 수퍼패밀리 라이브러리(IgSF)를 표적화하는 3개의 shRNA 풀을 생성하였다. 마우스 나이브 CD8+ T 세포에서의 렌티바이러스 형질도입에 의해 Thy1.1 및 shRNA를 공동발현하는 pLKO.3-Thy1.1 내로 아닐링된 올리고뉴클레오티드를 결찰시킴으로써 shRNA 구축물 모두를 설계 및 구축하였다. 각각의 shRNA 풀은 21개의 녹색 형광 단백질(GFP), 16개의 적색 형광 단백질(red fluorescent protein)(RFP), 25개의 루시페라아제 및 20개의 LacZ를 포함하여, 82개의 음성-제어 shRNA를 함유한다.
주요 마우스 나이브 CD8+ T 세포의 렌티바이러스 형질도입. 마우스 나이브 CD8+ T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용함으로써 OT-1 트랜스제닉 마우스(C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J, The Jackson laboratory)로부터 주요 마우스 나이브 CD8+ T 세포를 단리하였으며, 낮은 감염 다중도(multiplicity of infection)(MOI)의 렌티바이러스 풀로 형질도입하였다. 렌티바이러스 형질도입 이전에, IL-7(5 ng/ml) 및 IL 15(100 ng/ml)를 이용하여 단리된 나이브 CD8+ T 세포를 완전 RPMI 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 20 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트, 0.05 mM 2-메르캅토- 에탄올, 2 mM L-글루타민, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 ㎍/ml 페니실린)에서 48시간 동안 배양하였다. 레트로넥틴(RetroNectin) 시약이 예비코팅된 6개의 웰 플레이트(5 ㎍/ml)로 프로타민 설페이트(protamine sulphate)(5 ㎍/ml)가 보충된 렌티바이러스 풀을 갖는 CD8+ T 세포(웰 당 8 x 106개 세포)를 씨딩(seeding)하고, 25 내지 50의 MOI에서 스피노큘레이션(spinoculation)에 의해 감염시켰다. IL-7(2.5 ng/ml), IL-15(50 ng/ml) 및 IL-2(2 ng/ml)를 함유하는 완전 RPMI 배지에서 OT-I CD8+ T 세포를 더 배양한 후 렌티바이러스로 감염시켰다. 감염후 48시간에, 바이러스 감염성을 Thy1.1 발현에 의해 시험하였으며, 이는 항-Thy1.1-PE 항체를 사용한 유동세포계수법에 의해 분석되었다.
종양 보유 마우스로의 CD8+ T 세포의 양자 전이에 의한 종양의 치료. B16-Ova 세포(50 ㎕ 중 1.5 x 105개 세포)를 상피 주사에 의해 수컷 C57BL/6 마우스(10주령)로 접종하였으며, 접종 이후 3일마다 종양 크기를 측정하고, 길이 x 폭으로서 계산하였다. 9일차에, 다리 및 옆구리에 유사한 종양 크기를 갖는 30마리의 종양 보유 마우스를 비-조사(비-IR) 및 조사(IR)와 같은 2개의 그룹으로 분류하였다. 9일차에 셰퍼드 세슘 조사기(shepherd Cesium irradiator)를 사용하여 조사 그룹을 우측 다리 종양 상에 12Gy IR으로 처리하였다. 11일차에, shRNA 풀 감염된 Thy1.1 양성 CD8+ T 세포를 감염후 72시간에 선택 마커로서 Thy1.1을 사용하는 PE-양성 선택(EasySepTM PE 양성 선택 키트, Stem Cells Technologies)에 의해 단리시켰다. 90% Thy1.1 양성을 갖는 단리된 CD8+ T 세포(200 ul 중 5 x 106개 세포)를 레트로-오비탈(retro-orbital) 주사에 의해 B16-Ova 종양 보유 C57BL/6 마우스로 주사하였다. 전달 이후 2일마다 종양 크기를 측정하고, 길이 x 폭으로서 계산하였다. 가장 긴 축에 대해 ≥ 20 mm인 종양을 갖는 마우스를 안락사시켰다.
양자 전이 종양 보유 C57BL /6 마우스로부터 Thy1 .1 양성 CD8+ T 세포 단리. 비- IR 및 IR 마우스의 비장, 배수 림프절, 비-배수 림프절로부터 림프구를 단리시켰다. 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrated lymphocyte)(TIL)를 다리 및 옆구리 종양으로부터 정제하였으며, B16-Ova 종양을 마우스로부터 얻고, 2% FBS를 가진 PBS로 세척하였다. 2% FBS, 50 U/ml 콜라게나아제 IV형(Invitrogen) 및 20 U/ml DNaseI(Roche)을 함유한 15 ml RPMI에서 종양을 발현탁하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 림폴라이트(Lympholyte)-M (Cedarlane Laboratories)을 사용함으로써 TIL을 추가로 단리시켰다. 정제된 림프구를 항-Vα2-FITC, 항-Thy1.1-PE, 항-β5V-PerCP, 항-CD45-APC 및 항-CD8-eFlour450 항체를 사용하여 형광 표지하였다. FACSAria(BD Biosciences)를 사용하여 각각의 샘플로부터 형광 활성 세포 분류(fluorescence activated cell sorting)(FACS)에 의해 shRNA-발현 Thy1.1 양성 CD8+ T 세포(CD8+Vα2+Vβ5+Thy1.1+)를 분류하였다.
일루미나 MiSeq 유전자 분석기( Illumina MiSeq genetic Analyzer)를 사용한 심층 염기서열분석. 수집된 샘플의 게놈 DNA를 단리시키고(DNeasy 혈액 & 조직 키트, QIAGEN), 심층 염기서열분석 에세이용 shRNA 카세트(cassette)로부터 PCR 앰플리콘(amplicon)을 생성하기 위한 주형(template)으로 제공하였다. 각각의 풀에서 shRNA의 발현을 일루미나로부터의 MiSeq를 사용한 심층 염기서열분석에 의해 분석하였다. 각각의 풀에서 제어 shRNA의 평균 판독값을 사용하여 데이터를 정규화하였다.
심층 염기서열분석 데이터의 통계 분석. Bowtie2를 사용하여 상기 판독값을 풀 shRNA 라이브러리의 FASTA 파일에 맵핑(mapping)하였다. 배수 변화의 계산에서 0으로 나누는 것을 회피하기 위해, 각각의 클론에 대한 원 수치에 1 단위를 추가하였다. 이어서, 각각의 샘플에 대해, 수치 데이터를 상기 샘플의 판독값의 총 수로 정규화하였다. 각각의 클론에 대한 정규화된 판독 수치를 100만분의 1 판독값(Reads-per-Million)("RPM")으로 나타내었다. 정규화된 판독 수치를 배수 변화를 계산하는데 사용하였다.
하기 표 1-3에 나타낸 바와 같이, 134개의 유전자(650개의 shRNA 클론)에 걸친 상기 스크리닝 동안, 수많은 유전자 표적을 확인하였다. 예를 들어, 22개 표적 유전자가, 2개의 연관 shRNA 클론의 발현 수준이 다리 종양으로부터 얻은 Thy1.1 양성 CD8+ T 세포에서 그것들의 다리 종양에 조사받은 마우스로부터의 비장으로부터 얻은 것들에 비해 2배를 초과하는 것으로 확인되었다.
차이의 배수 확인된 4개 shRNA 클론을 갖는 표적의 # 확인된 3개 shRNA 클론을 갖는 표적의 # 확인된 2개 shRNA 클론을 갖는 표적의 #
4배 초과
(NR-다리/NR-비장) 		3 5 22
약 2 내지 4배
(NR-다리/NR-비장)		 1 5 10
약 2배
(NR-다리/NR-비장)		 4 11 28
표 1: T 세포로부터의 shRNA의 발현에서 배수 차이: 조사되지 않은 다리 종양 대 조사되지 않은 종양
NR: 비-조사(Non-Irradiated)
NR-다리: 조사되지 않은 다리로부터의 종양
NR-비장: 조사되지 않은 마우스로부터의 비장
*다리 종양만이 조사되고, 옆구리 종양은 그렇지 않음
차이의 배수 확인된 4개 shRNA 클론을 갖는 표적의 # 확인된 3개 shRNA 클론을 갖는 표적의 # 확인된 2개 shRNA 클론을 갖는 표적의 #
4배 초과
(NR-옆구리/NR-비장)		 0 1 7
약 2 내지 4배
(NR-다리/NR-비장)		 1 3 12
약 2배
(NR-다리/NR-비장)		 0 7 16
표 2: T 세포로부터의 shRNA의 발현에서 배수 차이: 조사되지 않은 옆구리 종양 대 조사되지 않은 비장
NR: 비-조사
NR-다리: 조사되지 않은 다리로부터의 종양
NR-비장: 조사되지 않은 마우스로부터의 비장
*다리 종양만이 조사되고, 옆구리 종양은 그렇지 않음
차이의 배수 확인된 4개 shRNA 클론을 갖는 표적의 # 확인된 3개 shRNA 클론을 갖는 표적의 # 확인된 2개 shRNA 클론을 갖는 표적의 #
4배 초과
(R-다리/R-비장) 		0 0 6
약 2 내지 4배
(R-다리/R-비장)		 0 0 5
약 2배
(R-다리/R-비장)		 0 3 22
표 3: T 세포로부터의 shRNA의 발현에서 배수 차이: 조사된 다리 종양 대 조사된 다리 종양을 갖는 비장
R-다리: 다리 종양에 조사된 것으로부터의 종양
R-비장: 다리 종양에 조사된 마우스로부터의 비장
*다리 종양만이 조사되고, 옆구리 종양은 그렇지 않음
특정 구체적 실시양태가 본원에 제시되지만, 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 상기 변형은 또한 본 발명의 범위에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> STCUBE & CO., INC. BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> SCREENING METHODS FOR TARGETS FOR CANCER THERAPY <130> 13532-006-228 <140> PCT/US2016/033651 <141> 2016-05-20 <150> 62/165,784 <151> 2015-05-22 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc g 41 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 ctttagtttg tatgtctgtt gctattatgt ctactattct ttccc 45 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 cgaaacaccg gtccgcaggt atgc 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 4 ccatttgtct cgaggtcgaa aactgg 26 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 5 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 6 nnnnnnnnnn nnngg 15

Claims (58)

  1. 비변형 T 세포 및 변형 T 세포의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법으로서,
    상기 비변형 T 세포 및 상기 변형 T 세포 각각이 방사선 조사된(irradiated) 종양-보유 대상체로부터의 종양 미세환경과 접촉되며; 상기 변형 T 세포가 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖고; 상기 변형 T 세포를 상기 비변형 T 세포와 비교하여 상기 활성이 증가된 경우, 상기 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인되는 것이고, 상기 활성이 증식, 세포 주기 활성화, 세포사 억제, 사이토카인 생성, 및 세포독성 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    암 치료용 표적 유전자를 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    각각 방사선 조사되지 않은 종양-보유 대상체로부터의 종양 미세환경과 접촉된 상기 비변형 T 세포 및 상기 변형 T 세포의 상기 활성을 측정하는 단계를 더 포함하고; 상기 비변형 T 세포 및 상기 변형 T 세포의 상기 활성이 실질적으로 동일한 것인 방법.
  3. (i) 비변형 T 세포 및 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자를 갖는 변형 T 세포를, 방사선 조사된 종양-보유 검사 대상체에 주사하는 단계; 및
    (ii) 상기 검사 대상체에서 상기 비변형 T 세포 및 상기 변형 T 세포의 활성을 측정하는 단계;
    를 포함하고,
    여기서, 상기 활성이 증식 활성 또는 항-종양 활성이고,
    인간이 검사 대상체에서 제외되고; 상기 변형 T 세포를 상기 비변형 T 세포와 비교하여 상기 활성이 증가된 경우, 상기 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자로서 확인되는,
    암 치료용 표적 유전자를 확인하는 생체내(in vivo) 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 변형 T 세포가 기준 T 세포인 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 비변형 T 세포 및 상기 변형 T 세포를, 방사선 조사되지 않은 검사 대상체에 주사하는 단계를 더 포함하고, 상기 변형 T 세포를 상기 방사선 조사되지 않은 검사 대상체에서 상기 비변형 T 세포와 비교하여 상기 활성이 실질적으로 동일한 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방사선 조사된 종양-보유 대상체가 1 Gy 내지 20 Gy의 선량으로 종양-표적 방사선을 조사받는 것인 방법.
  7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 활성이
    (i) 주사된 T 세포의 축적에 의해 측정되는 증식 활성;
    (ii) 종양 세포의 사멸 또는 종양 크기의 감소에 의해 측정되는 항-종양 활성; 또는
    (iii) 검사된 대상체의 증가된 생존에 의해 측정되는 항-종양 활성인
    방법.
  8. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검사 대상체가 마우스인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 마우스가 2종 종양 마우스이고, 1종의 종양만이 표적화된 방사선을 조사받는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 활성이 방사선 조사되지 않은 종양의 크기 감소에 의해 측정되는 항-종양 활성인 방법.
  11. (i) 각각의 T 세포가 녹-다운되거나 녹-아웃되는 최대 1종의 후보 유전자를 갖는, 상이한 유전자 변형을 갖는 T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 T 세포의 개시 집단을 일정 기간 동안 방사선 조사된 종양-보유 대상체로부터의 종양 미세환경과 접촉시켜, T 세포의 선택된 집단을 생성하는 단계;
    를 포함하고,
    T 세포의 선택된 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인되는 것인,
    암 치료용 표적 유전자를 확인하는 풀 스크리닝(pool screen) 방법.
  12. (i) 각각의 T 세포가 녹-다운되거나 녹-아웃되는 최대 1종의 후보 유전자를 갖는, 상이한 유전자 변형을 갖는 T 세포의 개시 집단을 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 T 세포의 개시 집단을 방사선 조사된 종양-보유 대상체에 투여하여, 상기 T 세포의 개시 집단이 T 세포의 선택된 집단을 생성하는 단계;
    를 포함하고,
    인간이 대상체에서 제외되고;
    T 세포의 선택된 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인되는 것인,
    암 치료용 표적 유전자를 확인하는 생체내 풀 스크리닝 방법.
  13. 제1항 내지 제5항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 후보 유전자가
    (i) 전사 액티베이터 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)를 사용하는 단계;
    (ii) CAS9(CRISPR)를 사용하는 단계; 또는
    (iii) T 세포를 shRNA 라이브러리 또는 렌티바이러스 벡터 라이브러리로 감염시키는 단계
    에 의해 상기 변형 T 세포, 또는 상기 T 세포의 개시 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제5항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포 또는 상기 T 세포의 개시 집단이
    (i) 나이브 T 세포이거나;
    (ii) CD8+ T 세포이거나;
    (iii) 마우스로부터 단리된 것인,
    방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 마우스가 야생형이거나, 마우스에 천연적으로 존재하지 않는 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 항원이 난백알부민인 방법.
  17. 제1항 내지 제5항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포가 표지된 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 표지가 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)인 방법.
  19. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 종양-보유 대상체의 샘플로부터 상기 T 세포의 선택된 집단을 단리시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 샘플이 종양 샘플인 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 종양 샘플이 표적화된 방사선을 조사받거나 종양-보유 대상체가 2종 종양 모델이고 상기 종양 샘플이 표적화된 방사선을 조사받지 않은 방법.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 샘플이 비-종양 샘플인 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 비-종양 샘플이 비장 샘플 또는 림프절 샘플인 방법.
  24. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    T 세포의 선택된 집단에서 녹-다운되거나 녹-아웃되는 후보 유전자가 T 세포의 선택된 집단으로부터 단리된 게놈(genomic) DNA의 NGS에 의해 확인되는 것인 방법.
  25. 제13항에 있어서,
    (iii)에서, 개시 집단의 각각의 T 세포가 후보 유전자에 대한 최대 shRNA를 가지며, T 세포의 개시 집단에 비해 T 세포의 선택된 집단에서 후보 유전자에 대한 shRNA가 풍부한 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인되는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    (i) 비-종양 조직 샘플에 비해 종양 샘플로부터 얻은 T 세포의 선택된 집단에서 후보 유전자에 대한 shRNA가 풍부한 경우, 후보 유전자가 암 치료용 표적 유전자인 것으로 확인되거나;
    (ii) 비-종양 조직 샘플에 비해 종양 샘플에서 상기 후보 유전자에 대한 shRNA가 2배를 초과하여 풍부한 경우, 후보 유전자가 표적 유전자로서 확인되거나;
    (iii) 비-종양 조직 샘플에 비해 종양 샘플에서 상기 후보 유전자에 대한 shRNA가 3배를 초과, 4배를 초과, 5배를 초과, 10배를 초과, 15배를 초과, 또는 20배를 초과하여 풍부한 경우, 후보 유전자가 표적 유전자로서 확인되는
    방법.
  27. 제26항에 있어서,
    NGS에 의해 T 세포의 선택된 집단에서 shRNA를 정량화하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제1항 내지 제5항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에서 확인된 T 세포의 표적 유전자를 억제함으로써 T 세포를 활성화시키는 방법으로서, T 세포가 인간 대상체에서 존재하지 않는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 T 세포가 종양-보유 대상체에서 존재하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 종양-보유 대상체가 방사선 조사되는 것인 방법.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
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