JP2018519850A - 癌治療の標的のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

癌治療の標的のスクリーニングのためのインビトロ及びインビボ方法を本明細書で提供する。方法は、腫瘍細胞に対する免疫抑制的環境に寄与する標的、特に放射線治療に関連する標的をスクリーニングすることを企図するものである。従って、本明細書で提供する方法は、単独で、又は放射線療法との組合わせで使用することができる癌治療薬を提供するのに有用な、潜在的標的を同定するのに有用である。【選択図】図１

Description

（1. 分野）
本明細書では、癌治療の潜在的標的を同定するための方法を提供する。

（2. 背景）
腫瘍微小環境は、腫瘍に浸潤し、免疫反応を抑制する機能を果たす骨髄系由来サプレッサー細胞（「MDSC」）及び制御性T細胞（「T-reg」）が存在するために、本質的に抑制的である。さらに、T細胞及び抗原提示細胞（APC）上にある種の抑制性分子が発現することにより、効果的な免疫反応が制限される場合がある。放射線は、腫瘍細胞のアポトーシス、老化、オートファジーの誘導を通じ、抗腫瘍効果を仲介する。放射線は、癌治療の標的としての役割を果たし得る因子を通じ、腫瘍微小環境を調節し得る。従って、これらの因子をスクリーニングし、これらの因子を標的とすることにより癌を治療する方法は、未検討ではあるが必要なことである。本件開示に関して提供される方法は、これらの必要を満たし、かつ他の関連する利点を提供する。

（3. 概要）
本明細書では、放射線処置と組合わせたT細胞抑制アッセイを用い、癌治療の標的を同定するインビトロハイスループットスクリーニング方法を提供する。

また、本明細書では、放射線処置と組合わせたT細胞抑制アッセイを用い、癌治療の標的を同定するインビトロスクリーニング方法であって、細胞培養において発現させた標的プールを用いてアッセイを実施する、前記方法を提供する。

また、本明細書では、腫瘍を移植した対象における放射線処置と組合わせたT細胞抑制アッセイを用い、癌治療の標的を同定するインビボスクリーニング方法を提供する。

ある実施態様において、本明細書で提供するインビトロ及びインビボスクリーニング方法は、組合わせで使用することができ、例えば、本明細書で提供するインビトロ方法に続き、該インビトロ方法から同定された候補遺伝子を用いて、本明細書で提供するインビボ方法を順次実施することができる。

（3.1. 定義）
本明細書で使用される冠詞「1つの（a）」、「1つの（an）」、及び「該（the）」は、別途明記されない限り、1又は複数のその冠詞の文法上の目的を指す。例として、T細胞とは、1つのT細胞又は複数のT細胞を指す。

本明細書で使用される用語「癌」又は「癌の」は、別途明記されない限り、通常対象における調節の効かなくなった細胞成長を特徴とする生理的状態を指す。癌の例には、これらに限定はされないが、血液癌及び固形腫瘍がある。

本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、別途明記されない限り、癌患者に関して使用されるときは、癌の重症度を低下させるか、又は癌の進行を遅延若しくは減速させる行為を指し、(a) 癌の成長を阻害する又は癌の発達を停止させること、及び(b) 癌を退行させる又は癌の存在に関連する1以上の症状を遅滞させ若しくは最小限にとどめることを含む。癌治療には、1つの治療又は2以上の異なる種類の治療の組合わせを含めることができ、それには外科手術、化学療法、放射線療法、標的化療法、及び免疫療法などがある。

放射線療法は、癌細胞を損傷させ、又は殺傷するために強力なエネルギーのビームを使用する、癌治療の一種である。放射線療法では、X線、陽子、又は他の種類のエネルギーを使用することができる。多くの場合、放射線療法とは、外部照射療法のことをいう。この種の放射の間、患者の体外の装置によって高エネルギーのビームが生成され、該装置により該ビームは腫瘍を目指して正確な位置に狙い撃たれる。他の種類の放射線療法、例えば密封小線源療法においては、放射線の供給源は患者の体内にも設置することができる。

本明細書で使用される用語「対象」又は「患者」は、別途明記されない限り、治療、観察、及び/又は実験の目的となる動物を指す。「動物」には、脊椎動物及び無脊椎動物、例えば魚類、甲殻類、爬虫類、鳥類、及び特に、哺乳動物がある。「哺乳動物」には、これらに限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、並びに霊長類、例えばサル、チンパンジー、類人猿、及びヒトがある。対象とは、インビボの試験又は実験に使用するための動物のことを指してもよい。また、試験又は実験の対象とは、「試験対象」を指すことができる。

本明細書で使用される用語「腫瘍を有する対象」は、別途明記されない限り、その体内に腫瘍又は腫瘍細胞を有する対象を指す。これらの腫瘍細胞は対象にとって外的なものとし、実験目的で対象に接種することができる。腫瘍を有する対象は、複数の腫瘍を有することができる。本明細書で使用される用語「二腫瘍モデル」は、別途明記されない限り、腫瘍を有する動物が少なくとも2つの腫瘍を有する動物モデルを指し、ここで2つの腫瘍は離れた位置にある。2つの腫瘍は互いに体の反対側にあってもよい。離れた位置にある2つの腫瘍は同程度のサイズ、又は同じサイズであってもよい。該二腫瘍モデルは例えば、放射線に関する研究で使用することができる。

本明細書で使用される用語「放射線照射を受けた対象」は、別途明記されない限り、放射線を受けた対象を指す。放射線は、腫瘍を標的とした放射線とすることができる。二腫瘍モデルにおいて、放射線照射を受けた対象とは、2つの離れた腫瘍の一方にのみ放射線を受けた対象のことを指してもよい。本明細書で使用される用語「放射線照射を受けていない対象」は、別途明記されない限り、放射線を受けていない対象を指す。「放射線照射を受けていない対象」及び「放射線照射を受けた対象」は、放射線照射の前後の同じ対象のことを指してもよい。また、「放射線照射を受けていない対象」及び「放射線照射を受けた対象」は、放射線の効果を調べるための並行試験で使用された2体の試験対象のことを指してもよい。並行試験におけるそのような試験対象は、同じ遺伝学的背景を有し、かつ/又は放射線以外については同じ処置を受けた対象とすることができる。

本明細書で使用される用語「遺伝子」は、別途明記されない限り、適切な調節又は制御配列の制御下におかれた際にインビトロ又はインビボで転写され（DNAの場合）、ポリペプチドへと翻訳される（mRNAの場合）核酸分子を指す。遺伝子の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドン及び3'（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子には、これらに限定はされないが、原核生物又は真核生物のmRNAに由来するcDNA、原核生物又は真核生物のDNAに由来するゲノムDNA配列、及び実に合成DNA配列さえも含み得る。転写終結配列は通常、遺伝子配列に対し3'側の位置にある。

本明細書で使用される用語「候補遺伝子」は、別途明記されない限り、本明細書で提供するスクリーニング方法に付される遺伝子を指す。候補遺伝子は、放射線処置との組合わせにおけるT細胞の免疫反応の調節へのその遺伝子の関与を評価するためにノックアウト又はノックダウンすることができる。スクリーニングの結果に応じ、「候補遺伝子」又は「候補遺伝子」にコードされるタンパク質を癌治療の適当な潜在的標的として同定する。

本明細書で使用される用語「標的遺伝子」は、別途明記されない限り、癌治療の標的としての役割を果たし得る遺伝子を指す。「標的遺伝子」は、本明細書で開示する方法により、候補遺伝子から同定できる。

本明細書で使用される用語「ノックアウト」は、別途明記されない限り、遺伝子に関して使用される場合、示された遺伝子の発現が、完全に又はほぼ完全に消滅することを意味する。細胞又は組織でノックアウトされた示された遺伝子の発現は、その細胞又は組織における通常の発現レベルと比較して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％低下し得る。幾つかの実施態様において、細胞中でノックアウトされた遺伝子の発現レベルは、当技術分野で公知の遺伝子発現検出についての通常の手段を用いては検出不可能である。

本明細書で使用される用語「ノックダウン」は、別途明記されない限り、遺伝子に関して使用される場合、示された遺伝子の発現が顕著に減少することを意味する。細胞又は組織でノックダウンされた示された遺伝子の発現は、その細胞又は組織における通常の発現レベルと比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、又は少なくとも90％低下する。幾つかの実施態様において、細胞又は組織でノックダウンされた遺伝子の発現レベルは、細胞又は組織における遺伝子の通常の発現レベルと比較して、少なくとも50％低下する。

本明細書で使用される用語「単離する」は、別途明記されない限り、示された目的物が通常存在する天然の設定中に存在する少なくとも1つの構成要素から該目的物を分離する過程を指す。用語「単離する」は、細胞又は細胞集団に関して使用される場合、対象の体から該細胞又は細胞集団を含む試料を取得する過程、及び/あるいは他の細胞から、又は該細胞若しくは細胞集団を含む試料中の他の内容物から、細胞又は細胞集団を分離する過程を指し得る。

本明細書で使用される用語「接触する」は、別途明記されない限り、細胞に関して使用される場合、細胞が示された物質と相互作用し得、かつ/又はそのような物質の存在によって影響を受け得るように、該細胞を該物質のごく近傍に置く過程を指す。接触は一時的又は一過性とすることができる。また、接触はある期間、又は永続的に持続させることができる。例えば、T細胞をサプレッサー細胞と接触させることは、T細胞及びサプレッサー細胞が、インビトロ容器中で一緒に培養され、ここで該細胞はそれらの表面上の受容体分子が互いに相互作用することができるほど十分にごく近傍にある過程を指し得る。接触は、インビトロ培養を継続する限り持続し得る。また、T細胞をサプレッサー細胞と接触させることは、該T細胞を、注射されるT細胞と相互作用するであろうサプレッサー細胞を有する対象に、注射する過程を指し得る。そのような接触は、一過性とすることができる。

本明細書で使用される用語「ベクター」は、別途明記されない限り、DNA又はRNA配列（例えば、外来遺伝子）を、それによって宿主細胞に導入することができ、その結果導入された配列の発現（例えば、転写及び/又は翻訳）が促進され、又は組換え若しくは他のメカニズムにより標的遺伝子がノックダウン若しくはノックアウトされる媒体を指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス、及びシュードウイルスなどがある。

本明細書で使用される用語「トランスフェクション」には、別途明記されない限り、外因的核酸分子を宿主細胞に導入するための任意の手段、例えばこれらに限定はされないが、吸着、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及びリポフェクションなどを含むことを意図している。

本明細書で使用される用語「T細胞」は、別途明記されない限り、胸腺で成熟を完了させ、免疫系において体内の特定の異物抗原の識別、並びに他の免疫細胞の活性化及び活性解除を含む、様々な役割を有する種類の白血球を指す。T細胞は機能に基づいて細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞（Th）、及び制御性T細胞（Treg）を含む、いくつかのサブタイプを有する。細胞表面上のマーカーの差別化された発現は、T細胞の多様な性質及び機能の有益な手がかりを提供し、T細胞又は特定のサブタイプのT細胞の単離に有用なツールとしての役割を果たし得る。例えば、T細胞はフローサイトメトリーによりCD3⁺細胞を選択することによって単離することができる。表面マーカーに加え、異なるサブタイプのT細胞は、大きく異なる機能及びサイトカイン分泌プロファイルも有し得る。例えば、CD8⁺細胞傷害性T細胞は、感染した標的細胞をパーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシンの放出を通じて破壊し、対してCD4⁺ヘルパーT細胞は、細胞傷害性活性をほとんど有さず、他の白血球、例えばB細胞、マクロファージ、好酸球、又は好中球に作用するサイトカインを分泌する。トレグ(Treg)は、エフェクターT細胞のサブセットに結合してそのサイトカイン分泌を妨げることを含む、いくつかのメカニズムによってT細胞機能を抑制する。

別途明記されない限り、T細胞は任意の種類のT細胞とすることができ、かつ任意の発達段階のものとすることができ、これには、これらに限定はされないが、CD4⁺/CD8⁺二重陽性T細胞、CD4⁺ヘルパーT細胞（例えば、Th1及びTh2細胞）、CD8⁺ T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）、末梢血単核球（PBMC）、末梢血白血球（PBL）、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、制御性T細胞（regulator T cells）、及びガンマデルタT細胞（γδT細胞）などが含まれる。ヘルパーT細胞の追加の種類には、Th3、Th17、Th9、又はTfh細胞などの細胞がある。メモリーT細胞の追加の種類には、セントラルメモリーT細胞（TCM細胞）及びエフェクターメモリーT細胞（TEM細胞及びTEMRA細胞）などの細胞がある。

本明細書で使用される用語「非改変T細胞」は、別途明記されない限り、試験又はスクリーニング中の候補遺伝子に関して遺伝学的に改変されていないT細胞を指す。非改変T細胞は、野生型T細胞とすることができる。また、非改変T細胞は、対照遺伝子が遺伝学的に改変された参照T細胞とすることができる。例えば、参照T細胞は、対照遺伝子、例としてLacZに対するshRNAを担持するウイルスベクターに感染したT細胞とすることができる。非改変T細胞は、動物対象由来の血液試料などの天然の供給源から直接単離し、又はT細胞株をインビトロ培養することによって取得することができる。また、非改変T細胞は、分化を誘導することによりインビトロで多能性細胞から分化させることもできる。

本明細書で使用される用語「改変T細胞」は、別途明記されない限り、遺伝子操作されたT細胞を指す。改変T細胞は、野生型T細胞と比較して、遺伝子を過剰発現又は過小発現することができる。改変T細胞は、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされ得る。改変T細胞集団は、異なる遺伝学的な改変を有するT細胞集団とすることができる。例えば、改変T細胞集団は、野生型T細胞と比較して、多くとも1つの遺伝子がノックダウン又はノックアウトされた、それぞれ異なる遺伝学的特徴を有し得る。

本明細書で使用される用語「活性」は、別途明記されない限り、T細胞の細胞活動を指す。該活性は、増殖活性とすることができ、該増殖活性は、細胞周期活性化の増進、細胞死の抑制、（例えば、アポトーシスの抑制）、及び/又は細胞増殖を促進する任意の他の活性とすることができる。また、該活性は、細胞傷害性活性又はサイトカイン産生活性などを含むエフェクターT細胞の免疫とすることができる。また、活性は一般に抗腫瘍活性とすることができ、該抗腫瘍活性は、例えば、腫瘍サイズの低下又は腫瘍を有する対象の生存率の増加によって測定することができる。

本明細書で使用される用語「サプレッサー細胞」は、別途明記されない限り、T細胞活性を抑制する細胞集団を指す。例えば、サプレッサー細胞は、T細胞集団を抑制することができる。また、サプレッサー細胞は、T細胞によって誘発される自然免疫反応を阻害し又はこれに拮抗することができる。「サプレッサー細胞」には、これらに限定はされないが、制御性T細胞（Treg）及び骨髄系由来サプレッサー細胞（MDSC）がある。

（4. 図面の簡単な説明）
以下の図面は本明細書の一部を形成し、かつ本発明の特定の態様をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書で提示する具体的な実施態様の詳細な説明と組合わせて、これらの図面の1以上を参照することにより、よりよく理解することができる。

図1は、放射線による免疫調節因子のためのshRNAスクリーニングの例示的なワークフローを示している。示されているように、このワークフローは、陰性対照を有するshRNAライブラリを調製すること；0日目にB6マウスのそれぞれ脚及び脇腹に1.5×10⁵個のB16-Ova細胞を皮内注射すること；6日目にOT-1 T細胞を単離すること；8日目にOT-1 T細胞をThy1.1をコードするshRNAライブラリに感染させること；10日目に12 Gyで脚の腫瘍（5 mm）に放射線照射すること；11日目にOT-1 T細胞（5×10⁶個）を感染させるという養子移入を実施すること；18日目に脾臓、リンパ節、及び流出領域リンパ節由来の腫瘍からT細胞を採取すること；FACSでThy 1.1⁺ T細胞を選別すること；並びにPCR、NGS、及びデータデコンボリューションによりThy 1.1⁺ T細胞についてゲノムDNAをアッセイすること、を含む。また、腫瘍サイズは2日ごとに測定する。

図2は、組み込まれたshRNAのPCR増幅のための例示的なネステッドプライマーセットを示している。示されているように、第1のPCRプライマー（294 bp）は、

とすることができ、第2のPCRプライマー（124 bp）は、

とすることができる。

（5. 詳細な説明）
本明細書では、癌治療の遺伝子標的を同定するためのインビトロ及びインビボスクリーニング方法を提供する。特定の理論に制限されることなく、いくつかの因子が腫瘍細胞の免疫抑制的微小環境に寄与し、そのような因子は、これに限定はされないが、腫瘍を標的とした放射線を含む放射線によって調節され得ると考えられている。従って、本明細書では、単独で、又は放射線療法との組合わせで癌治療において使用するための遺伝子標的としての役割を果たすそのような因子のインビトロ及びインビボスクリーニング方法を提供する。幾つかの実施態様において、本明細書では、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することによる癌治療のための標的遺伝子を同定する方法を提供し；ここで非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれ放射線照射を受けた腫瘍を有する対象由来のサプレッサー細胞と接触させ；かつ改変T細胞は候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている。続いて、改変T細胞を非改変T細胞と比較した際に、活性が増加している場合、候補遺伝子を癌治療のための標的遺伝子として同定する。

幾つかの例において、放射線により、腫瘍細胞は免疫抑制的因子のさらなる活性化及び/又は上方調節をもたらし得る「ストレス」状態に置かれ得る。従って、本明細書では、放射線処置によって活性化され、かつ/又は上方調節される免疫抑制因子である標的遺伝子のスクリーニング方法も提供する。放射線は腫瘍微小環境に明確に限定され得るため、放射線が、T細胞と相互作用してT細胞の抑制を誘導する、対象となる標的の上方調節を引き起こすことに起因する、腫瘍内のあらゆる混乱が、本明細書に記載のスクリーニングアプローチを使用して明らかにされ得る。該方法は、免疫抑制の仲介における同定された標的遺伝子の機能の検証を、さらに含むことができる。

幾つかの例において、放射線は、アブスコパル効果、すなわち原発性腫瘍への標的化された放射線が、それによって放射線の範囲外の離れた部位で抗腫瘍反応を誘導する生理的プロセスをもたらすことができる。アブスコパル効果は少なくとも部分的に、腫瘍抗原のT細胞への提示の増進、並びに局所及び全身性免疫反応を刺激するサイトカイン及び他の炎症誘発性因子の放出を伴い得る。従って、本明細書ではまた、アブスコパル効果に関与する遺伝子標的のスクリーニング方法を提供する。本明細書で開示する方法によって同定される遺伝子標的は、腫瘍微小環境の免疫抑制的性質に寄与する因子となり得る。

癌細胞を破壊するために免疫系を活性化する免疫療法は一般に、幾つかの例において免疫系に対する通常のチェックを遮断することに起因する全身毒性をもたらし得る。また、本明細書では、単独で標的化された場合には全身性の免疫活性化をもたらさないが、放射線療法と組合わせて使用した場合に顕著な抗腫瘍免疫を誘発することができる因子のスクリーニング方法を提供する。従って、これらの遺伝子因子を標的化する薬剤は、アブスコパル効果を模倣し、又は増進し、放射線療法の治療効果を向上させ、かつ潜在的な免疫関連副作用の低下を有し得る。

腫瘍を有する対象における抗腫瘍反応のための免疫調節剤は、少なくとも部分的に、T細胞の活動を抑制し得る標的遺伝子を阻害することにより、免疫系を活性化することができる。

（5.1 スクリーニング方法）
本明細書では、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することによって癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれ腫瘍微小環境と接触させ；かつ改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞を非改変T細胞と比較した場合に活性が増加するならば、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。

本明細書では、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することにより、癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれサプレッサー細胞と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞を非改変T細胞と比較した場合に活性が増加するならば、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。

幾つかの実施態様において、本明細書で開示する方法において測定される活性は、増殖活性とすることができる。幾つかの実施態様において、増殖活性は、細胞周期の活性化により測定され、ここで細胞周期活性化の増進は、細胞増殖活性の増加を示す。幾つかの実施態様において、増殖活性は細胞死阻害によって測定され、ここで細胞死の低下は細胞増殖活性の増加を示す。幾つかの実施態様において、増殖活性はアポトーシスの阻害によって測定され、ここでアポトーシスの低下は、細胞増殖活性の増加を示す。

従って、本明細書では、非改変T細胞の増殖活性及び改変T細胞の増殖活性を測定することによって癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高い増殖活性を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。

幾つかの実施態様において、本明細書で開示する方法において測定される活性は、エフェクターT細胞の免疫とすることができる。幾つかの実施態様において、本明細書で開示する方法において測定される活性は、細胞傷害性活性である。幾つかの実施態様において、本明細書で開示する方法において測定される活性は、サイトカイン産生活性である。幾つかの実施態様において、本明細書で開示する方法において測定される活性は、抗腫瘍活性である。

従って、本明細書では、非改変T細胞の免疫及び改変T細胞の免疫性を測定することによって癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高い免疫性を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。

本明細書では、非改変T細胞の細胞傷害性活性及び改変T細胞の細胞傷害性活性を測定することにより癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高い細胞傷害性活性を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。

また、本明細書では、非改変T細胞のサイトカイン産生活性及び改変T細胞のサイトカイン産生活性を測定することによって癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高いサイトカイン産生活性を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。

また、本明細書では、非改変T細胞の抗腫瘍活性及び改変T細胞の抗腫瘍活性を測定することによって癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高い抗腫瘍活性を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法は、供給源からT細胞を取得することをさらに含む。本明細書で提供する方法は、非改変T細胞及び改変T細胞を調製することをさらに含み得る。幾つかの実施態様において、供給源は対象由来の試料である。幾つかの実施態様において、供給源は、インビトロで培養された細胞株である。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法は、それぞれ放射線照射を受けた腫瘍を有する対象及び放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象の両方に由来する腫瘍微小環境と接触させた非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することを含み；ここでT細胞を放射線照射を受けた腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境と接触させた際に、T細胞を放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境と接触させた場合よりも、改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加がより顕著である場合に、候補遺伝子を標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様において、それぞれ放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境と接触させた、非改変T細胞及び改変T細胞の活性は、実質的に同じである。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法は、放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象由来のサプレッサー細胞の第1の集団と、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象由来のサプレッサー細胞の第2の集団を使用することを含む。該方法は、それぞれサプレッサー細胞の第1の集団と接触させた改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定すること、及び／または、それぞれサプレッサー細胞の第2の集団と接触させた改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定することを含み得；ここでT細胞をサプレッサー細胞の第2の集団と接触させた際に、T細胞をサプレッサー細胞の第1の集団と接触させた際よりも増加が顕著である場合、候補遺伝子を標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様において、T細胞をサプレッサー細胞の第1の集団と接触させた場合、改変T細胞及び非改変T細胞を比較した際の活性は実質的に同じであるが、T細胞をサプレッサー細胞の第2の集団と接触させた場合、活性は改変T細胞においてより高くなる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、動物対象から直接取得した試料から単離する。試料は、血液試料とすることができる。血液試料は、全血試料、部分精製血液試料、又は末梢血試料とすることができる。また、試料は骨髄試料とすることができる。T細胞は、その表面マーカーによって試料から単離することができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるT細胞は、CD3⁺細胞である。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるT細胞は、CD8⁺細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、CD4⁺細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブT細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブCD8⁺ T細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブCD4⁺ T細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、CD4⁺/CD8⁺二重陽性T細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、PBMCである。幾つかの実施態様において、T細胞は、PBLである。幾つかの実施態様において、T細胞は、TILである。幾つかの実施態様において、T細胞は、メモリーT細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ガンマデルタT細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、Th3、Th17、Th9、又はTfh細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、TCM細胞、TEM細胞、又はTEMRA細胞である。また、T細胞は本明細書で言及された、又はそうでなければ当技術分野で公知の特定の種類のT細胞の任意の組合わせとすることができる。

幾つかの実施態様において、T細胞は、対象から単離する。対象は、哺乳動物とすることができる。幾つかの実施態様において、T細胞は、マウスから単離する。マウスは、野生型マウス又は遺伝子操作されたマウスとすることができる。幾つかの実施態様において、マウスをT細胞受容体を発現するように遺伝子操作する。T細胞受容体は、マウスにおいて天然には存在しない抗原に特異的なものとすることができる。幾つかの実施態様において、抗原は、オボアルブミンとすることができる。幾つかの実施態様において、対象は、オボアルブミンに特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたマウスとすることができる。

幾つかの実施態様において、本明細書では、非改変CD8⁺ T細胞の活性及び改変CD8⁺ T細胞の活性を測定することによって、癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変CD8⁺ T細胞及び改変CD8⁺ T細胞を、それぞれサプレッサー細胞と接触させ；改変CD8⁺ T細胞は、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変CD8⁺ T細胞において、非改変CD8⁺ T細胞と比較して活性が増加している場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。

幾つかの実施態様において、T細胞を、幹細胞又は前駆細胞からの分化の誘導によって産生する。幹細胞又は前駆細胞は、造血幹細胞又は造血前駆細胞とすることができる。また、幹細胞又は前駆細胞は、誘導された多能性幹細胞とすることができる。

非改変T細胞は、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知の方法を用いて遺伝学的に改変して、改変T細胞を産生することができる。幾つかの実施態様において、T細胞は、shRNAを含むウイルスベクターへの感染によって、候補遺伝子をノックアウト又はノックダウンされるように改変されている。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、対照遺伝子をノックアウト又はノックダウンされた参照T細胞である。一実施態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルス由来のベクターである。幾つかの実施態様において、ウイルスベクターは、SMARTベクター、GIPZ、TRIPZ、又はTRCレンチウイルスshRNAベクター（GE Dharmacon）である。幾つかの実施態様において、単離T細胞における遺伝子を、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることにより、ノックアウト又はノックダウンする。幾つかの実施態様において、単離T細胞における遺伝子を、CAS9（CRISPR）を用いることによりノックアウト又はノックダウンする。当業者であれば理解するように、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知のT細胞の遺伝学的調節のための任意の方法を、本明細書に記載のスクリーニング方法において使用することができる。

幾つかの実施態様において、非改変T細胞をインビトロで増殖させてから、本明細書に記載の遺伝学的改変又はスクリーニング方法に付する。幾つかの実施態様において、改変T細胞をインビトロで増殖させてから、本明細書に記載のスクリーニング方法に付する。

一実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は蛍光物質により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの粒子により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの酸化鉄粒子（MPIO）により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、磁性ナノ粒子により標識される。T細胞を標識するための様々な方法が、当技術分野で周知されている。

候補遺伝子は、T細胞のゲノム中に天然に存在する任意の遺伝子とすることができる。該候補遺伝子は、ヒト遺伝子とすることができる。また、該候補遺伝子は、モデル動物由来の遺伝子とすることができる。また、例えば候補遺伝子は、マウスT細胞の遺伝子とすることができる。

幾つかの実施態様において、本明細書で提供するスクリーニング方法は、T細胞の初期集団を調製することであって、shRNAライブラリに非改変T細胞を感染させることを含む、前記調製することを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリはT細胞ゲノムの全遺伝子をスクリーニングすることができるゲノムライブラリであり、これはウイルスベクターを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリはサブゲノムライブラリであり、これはT細胞ゲノムの遺伝子の選択を含む。幾つかの実施態様において、特定の構造的/機能的特徴を有するあるタンパク質をコードする遺伝子を標的とするshRNAライブラリは、ウイルスベクターを含む。例示的なライブラリには、これらに限定はされないが、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）ライブラリ、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリーライブラリ、免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ライブラリ、転写調節因子ライブラリ、キナーゼライブラリ、ホスファターゼライブラリ、血管形成ライブラリ、細胞周期ライブラリ、アポトーシスライブラリ、及び/又はユビキチンリガーゼライブラリがある。また、例示的なライブラリは、機能不全のT細胞で過剰発現又は過小発現することが公知の遺伝子に重点を置いてもよい。例えば、候補遺伝子のライブラリは、T細胞のアネルギー又は疲弊において過剰発現する遺伝子のライブラリとすることができる。また、本明細書で開示する方法で使用するライブラリは、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知のライブラリの任意の組合わせとすることができる。

幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞には、Treg細胞がある。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞には、MDSCがある。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞には、Treg細胞及びMSDCの両方がある。幾つかの実施態様において、スクリーニング方法はインビトロで実施され、サプレッサー細胞は、対象から単離することができる。動物は、哺乳動物とすることができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、マウスから単離することができる。幾つかの実施態様において、対象は、放射線照射を受けた対象とすることができる。幾つかの実施態様において、対象は、放射線照射を受けていない対象とすることができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、放射線照射を受けたマウスに由来する。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、放射線照射を受けていないマウスに由来する。幾つかの実施態様において、マウスは腫瘍を有するマウスとすることができる。マウスは放射線照射を受けていない腫瘍を有するマウスとすることができる。マウスは放射線照射を受けた腫瘍を有するマウスとすることができる。幾つかの実施態様において、対象は、少なくとも2つの腫瘍を有するマウスであり、ここで一方の腫瘍のみが除去線量の放射線を受けている。

幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、血液試料から単離する。血液試料は、全血試料、部分精製血試料、又は末梢血試料とすることができる。T細胞抑制アッセイのための試料から単離サプレッサー細胞を取得する方法は、当技術分野で周知されている。幾つかの実施態様において、スクリーニング方法はインビボで実施され、サプレッサー細胞は試験対象に天然に存在するサプレッサー細胞とすることができ、該サプレッサー細胞には、Treg、MSDC、又はこれら両方も含み得る。対象は、放射線照射を受けた対象又は放射線照射を受けていない対象とすることができる。

幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象に由来する。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由来する。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象は、腫瘍を標的とした放射線を受けている。幾つかの実施態様において、放射線は、除去線量で施される。幾つかの実施態様において、放射線は、1 Gy〜45 Gy、5 Gy〜35 Gy、10 Gy〜25 Gy、1 Gy〜25 Gy、1 Gy〜20 Gy、又は5 Gy〜15 Gyの線量で施される。幾つかの実施態様において、放射線は1 Gy〜20 Gyの線量で施される。幾つかの実施態様において、放射線は1 Gy、2 Gy、3 Gy、4 Gy、5 Gy、6 Gy、7 Gy、8 Gy、9 Gy、10 Gy、11 Gy、12 Gy、13 Gy、14 Gy、15 Gy、16 Gy、17 Gy、18 Gy、19 Gy、20 Gy、25 Gy、30 Gy、35 Gy、40 Gy、又は45 Gyの線量で施される。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、その原発性腫瘍を標的とした除去線量の放射線を受けた、腫瘍を有する対象に由来する。

幾つかの実施態様において、腫瘍を有する対象は、1つの腫瘍を有する。幾つかの実施態様において、腫瘍を有する対象は、2以上の腫瘍を有する。幾つかの実施態様において、腫瘍を有する対象は二腫瘍モデルである。幾つかの実施態様において、2以上の腫瘍を有する放射線照射を受けた腫瘍を有する対象は、その腫瘍の一方のみに標的化された放射線を受けている。放射線を受ける腫瘍は、腫瘍を有する対象の原発性腫瘍とすることができる。

幾つかの実施態様において、対象は、マウスとすることができる。マウスは、野生型マウス又は遺伝子操作されたマウスとすることができる。幾つかの実施態様において、マウスはT細胞受容体を発現するように遺伝子操作される。T細胞受容体は、マウスにおいて天然には存在しない抗原に対して特異的なものとすることができる。幾つかの実施態様において、抗原は、オボアルブミンとすることができる。幾つかの実施態様において、対象はオボアルブミンに特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたマウスとすることができる。マウスは、腫瘍を有するマウスとすることができる。マウスは、放射線照射を受けていない腫瘍を有するマウスとすることができる。マウスは、放射線照射を受けた腫瘍を有するマウスとすることができる。幾つかの実施態様において、対象は少なくとも2つの腫瘍を有するマウスであり、ここで1つの腫瘍が除去線量の放射線を受けている。

本明細書で提供するスクリーニング方法には、インビトロ方法及びインビボ方法がある。当業者であれば、本明細書に記載の異なるインビトロ及びインビボ方法を、別個に又は組合わせて使用することができることを理解するであろう。複数の方法の組合わせにより同定した遺伝子標的は、より完全かつより正確である可能性を有し得る。さらに、本明細書に記載の方法は、ハイスループット形式でのプールスクリーニングアッセイとすることができる。例えば、本明細書で提供するインビトロスクリーニング試験を実施して、まず癌治療の標的としての役割を果たす候補遺伝子群を認定し、続いてそれらの有用性をさらに裏付けるためのインビボ機能試験を実施することができる。

（5.1.3 インビボアッセイ）
幾つかの実施態様において、本明細書には、癌治療の標的遺伝子をスクリーニングするインビボ方法を記載する。インビボアッセイは、試験対象について実施することができる。試験対象は、動物モデルとすることができる。動物モデルは、二腫瘍モデルとすることができる。幾つかの実施態様において、動物モデルはマウスである。幾つかの実施態様において、動物モデルは腫瘍を有する動物モデルである。動物モデルは、腫瘍を有するマウスとすることができる。腫瘍を有するマウスは、放射線照射を受けていても、放射線照射を受けていなくてもよい。幾つかの実施態様において、動物モデルは反対側に位置する2つの腫瘍を有するマウスであり、該腫瘍のうちの一方にのみ除去線量の放射線を受けている。

従って、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 試験対象に非改変T細胞又は改変T細胞を注射することであって、改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及び(ii) 試験対象における非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することを含み、ここで改変T細胞を非改変T細胞と比較した際に活性が増加する場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。試験対象は、放射線照射を受けた試験対象とすることができる。試験対象は、放射線照射を受けていない試験対象とすることができる。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の前に放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射後であるが、活性を測定する前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、非改変T細胞及び改変T細胞は同じ試験対象に注射される。幾つかの実施態様において、非改変T細胞及び改変T細胞は、別個の試験対象に注射される。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、標識される。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は参照T細胞である。

幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象は、腫瘍を標的とした放射線を受けている。幾つかの実施態様において、放射線は、除去線量で施す。幾つかの実施態様において、放射線は、1 Gy〜45 Gy、5 Gy〜35 Gy、10 Gy〜25 Gy、1 Gy〜25 Gy、1 Gy〜20 Gy、又は5 Gy〜15 Gyの線量で施す。幾つかの実施態様において、放射線は、1 Gy〜20 Gyの線量で施す。幾つかの実施態様において、放射線は、1 Gy、2 Gy、3 Gy、4 Gy、5 Gy、6 Gy、7 Gy、8 Gy、9 Gy、10 Gy、11 Gy、12 Gy、13 Gy、14 Gy、15 Gy、16 Gy、17 Gy、18 Gy、19 Gy、20 Gy、25 Gy、30 Gy、35 Gy、40 Gy、又は45 Gyの線量で施す。幾つかの実施態様において、腫瘍を有する対象は、その腫瘍の一方のみに標的化された除去線量の放射線を受けている二腫瘍モデルである。

本明細書で開示するインビボスクリーニング方法において使用されるT細胞は、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知の方法で使用される任意の特定の種類のT細胞とすることができる。例えば、幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるT細胞は、CD3⁺細胞である。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるT細胞は、CD8⁺細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、CD4⁺細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブT細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブCD8⁺ T細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブCD4⁺ T細胞である。

幾つかの実施態様において、測定する工程は、試料を試験対象から取得することを含む。試料は、腫瘍試料、組織試料、又は血液試料とすることができる。組織試料は、リンパ節試料、脾臓試料、肝臓試料、又は腎臓試料とすることができる。リンパ節試料は、流入領域リンパ節又は非流入領域リンパ節とすることができる。腫瘍試料は、放射線照射を受けた腫瘍由来の試料とすることができる。また、腫瘍試料は、放射線照射を受けていない腫瘍由来の試料とすることができる。放射線照射を受けていない腫瘍は、放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象に由来してもよい。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビボスクリーニング方法は、放射線照射を受けていない対象及び放射線照射を受けた対象を用いることを含む。該方法は、放射線照射を受けていない対象に注射された改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定すること、及び／または、放射線照射を受けた対象に注射された改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定することを含み得；ここでT細胞を放射線照射を受けた対象に注射した場合に、T細胞を放射線照射を受けていない対象に注射した場合よりも増加が顕著であるならば、候補遺伝子を標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様において、T細胞を放射線照射を受けていない対象に注射する場合の改変T細胞及び非改変T細胞を比較した際に、T細胞の活性が実質的に同じであるが、T細胞を放射線照射を受けた対象に注射した場合に非改変T細胞と比較して、改変T細胞において活性がより高くなる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビボ方法によって測定される活性は、T細胞の増殖活性とすることができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビボ方法によって測定される活性は、T細胞の抗腫瘍活性とすることができる。T細胞の増殖活性は、注射後の試験対象に注射されたT細胞の蓄積によって測定することができる。T細胞の蓄積は、注射から24時間後、注射から2日後、注射から3日後、注射から4日後、注射から5日後、注射から6日後、注射から7日後、注射から8日後、注射から9日後、注射から10日後、注射から11日後、注射から12日後、注射から13日後、注射から14日後、注射から2.5週間後、注射から3週間後、注射から3.5週間後、注射から4週間後、注射から5週間後、注射から6週間後、注射から7週間後、注射から2カ月後、注射から3カ月後、又はそれより長い期間の経過後に測定することができる。

対象におけるT細胞の蓄積は、当技術分野で公知の様々なアプローチによって測定することができる。幾つかの実施態様において、注射されたT細胞の試験対象における蓄積は、細胞サイトメトリー（cell cytometry）によって測定することができる。幾つかの実施態様において、試験対象におけるT細胞の蓄積は、蓄積されたT細胞由来のゲノムDNAの次世代配列決定法（NGS）によって測定することができる。

従って、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 非改変T細胞及び改変T細胞を試験対象に注射することであって、改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及び(ii) 試験対象における非改変T細胞の蓄積及び改変T細胞の蓄積を測定することを含み、ここで非改変T細胞と比較して、より多くの改変T細胞が蓄積されている場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細胞である。試験対象は、マウスとすることができる。試験対象は、腫瘍を有するものとすることができる。試験対象は、放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象とすることができる。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の後であるが、活性を測定する前に放射線を受ける。幾つかの実施態様において、非改変T細胞及び改変T細胞を、同じ試験対象に注射する。

幾つかの実施態様において、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 非改変T細胞及び改変T細胞を試験対象に注射することであって、改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及び(ii) 試験対象における腫瘍浸潤性非改変T細胞の数及び腫瘍浸潤性改変T細胞の数を測定することを含み、ここで腫瘍浸潤性改変T細胞の数が腫瘍浸潤性非改変T細胞の数と比較してより高い場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細胞である。試験対象は、腫瘍を有するマウスとすることができる。試験対象は、放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象とすることができる。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の後であるが、活性を測定する前に放射線を受ける。幾つかの実施態様において、非改変T細胞及び改変T細胞を、同じ試験対象に注射する。

幾つかの実施態様において、本明細書で提供する方法は、注射された試験対象由来のT細胞から蓄積させた/増殖させた単離T細胞をさらに含む。この単離の工程は、試験対象から試料を取得することを含み得る。試料は、腫瘍試料、血液試料、又は組織試料とすることができる。腫瘍試料は、放射線照射を受けた腫瘍又は放射線照射を受けていない腫瘍由来の試料とすることができる。放射線照射を受けていない腫瘍は、放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象由来のものとすることができる。血液試料は末梢血、全血、又は部分精製血の試料とすることができる。組織試料は、脾臓試料、又はリンパ節試料とすることができる。リンパ節試料は、流入領域リンパ節試料又は非流入領域リンパ節試料とすることができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビボ方法によって測定される活性は、注射されたT細胞の抗腫瘍活性とすることができる。抗腫瘍活性は、ある期間にわたる腫瘍サイズの低下によって測定することができる。該期間は、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、2.5週間、3週間、3.5週間、4週間、5週間、6週間、7週間、2カ月、3カ月、又はそれより長期とすることができる。

また、抗腫瘍活性は、試験対象集団の生存率によって測定することができる。従って、本明細書では癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 非改変T細胞及び改変T細胞を別個の試験対象に注射することであって、改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及び(ii) 非改変T細胞を注射された対象の腫瘍サイズ及び改変T細胞を注射された対象の腫瘍サイズを測定することを含み、ここで改変T細胞を注射された試験対象において、非改変T細胞を注射された試験対象と比較して腫瘍サイズの低下がより大きい場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細胞である。試験対象は、腫瘍を有するマウスとすることができる。試験対象は、放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象とすることができる。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射後であるが、腫瘍サイズを測定する前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、試験対象は二腫瘍モデルであり、ここで一方の腫瘍のみが標的化された放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた腫瘍のサイズを測定する。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けていない腫瘍のサイズを測定する。

また、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 非改変T細胞及び改変T細胞を腫瘍を有する試験対象の集団に別個に注射することであって、改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及び(ii) 非改変T細胞を注射された腫瘍を有する対象の集団の生存率及び改変T細胞を注射された腫瘍を有する対象の集団の生存率を測定することを含み、ここで改変T細胞を注射された対象の集団において得られた生存率が、非改変T細胞を注射された対象の集団と比較して高い場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細胞である。試験対象は、放射線照射を受けた試験対象とすることができる。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の前に放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の後に放射線を受ける。幾つかの実施態様において、試験対象は二腫瘍モデルであり、ここで一方の腫瘍のみが標的化された放射線を受ける。幾つかの実施態様において、試験対象は、マウスである。

幾つかの実施態様において、本明細書では、癌治療の標的を同定する方法であって：
(1) T細胞を対象から単離すること；
(2) 1組のT細胞を調製することであって、単離されたT細胞において候補遺伝子が選択的にノックアウト又はノックダウンされている、前記調製すること；
(3) 試験対象の群のそれぞれに2つの腫瘍を移植することであって、2つの腫瘍を遠位に移植する、前記移植すること；
(4) 第1群の試験対象（ここで、腫瘍は放射線によって処置されていない）、及び第2群の試験対象（ここで、一方の腫瘍のみが放射線によって処置されている）を準備すること；
(5) T細胞を第1群からの対象に移入し、腫瘍の低下を評価すること；並びに
(6) T細胞を第2群からの対象に移入し、放射線によって処置されていない腫瘍の低下を評価すること、を含み、

ここで、工程(6)において観察された腫瘍の低下が、工程(5)において観察された低下よりも大きい場合、T細胞においてノックアウト若しくはノックダウンされた遺伝子、又はそれによってコードされたタンパク質を、癌治療の標的として同定する、前記方法を提供する。

一実施態様において、対象はマウスである。別の実施態様において、マウスはトランスジェニックマウスである。別の実施態様において、マウスは、抗原特異的T細胞のモノクローナル集団を産生することにより、T細胞免疫反応を増強するように操作されたトランスジェニックマウスである。

一実施態様において、試験対象の第2群における腫瘍は、1 Gy〜45 Gy、5 Gy〜35 Gy、10 Gy〜25 Gy、1 Gy〜25 Gy、1 Gy〜20 Gy、又は5 Gy〜15 Gyの線量の放射線によって処置されている。一実施態様において、線量は、1 Gy〜20 Gyである。

一実施態様において、単離されたT細胞における遺伝子は、shRNAを含むウイルスベクターにT細胞を感染させることにより、ノックアウト又はノックダウンされている。一実施態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスに由来するベクターである。別の実施態様において、単離されたT細胞における遺伝子は、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることによってノックアウト又はノックダウンされている。別の実施態様において、単離されたT細胞における遺伝子は、CAS9（CRISPR）を用いることによってノックアウト又はノックダウンされている。

（5.1.2 インビトロアッセイ）
幾つかの実施態様において、本明細書には、癌治療の標的遺伝子のスクリーニングのためのインビトロ方法を記載する。インビトロアッセイは、T細胞抑制アッセイとすることができる。インビトロアッセイには、サプレッサー細胞と共にT細胞を培養することを含み得る。幾つかの実施態様において、本明細書で提供する方法は、サプレッサー細胞を対象から単離することをさらに含む。対象は、放射線照射を受けた対象又は放射線照射を受けていない対象とすることができる。

従って、幾つかの実施態様において、本明細書では癌治療の標的遺伝子をスクリーニングするためのインビトロ方法であって、(a) 非改変T細胞及びサプレッサー細胞；並びに(b) 改変T細胞及びサプレッサー細胞を別個に培養することであって；改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記培養すること；並びに非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することを含み、ここで改変T細胞を非改変T細胞と比較した際に活性が増加している場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細胞である。該方法には、単離サプレッサー細胞を準備することを含み得る。サプレッサー細胞は、対象由来の試料から単離することができる。対象は、マウスとすることができる。試料は、血液試料とすることができる。サプレッサー細胞は、その表面マーカーに基づいて単離することができる。

T細胞及びサプレッサー細胞は、ある期間にわたって培養することができる。該期間は、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、12時間、14時間、16時間、18時間、20時間、22時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、又はそれより長期とすることができる。

幾つかの実施態様において、T細胞は、種々のT細胞対サプレッサー細胞比のサプレッサー細胞の存在下、抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される。幾つかの実施態様において、T細胞は、抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される。幾つかの実施態様において、該方法は、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、又は1:5の比でT細胞及びサプレッサー細胞を培養することを含む。幾つかの実施態様において、該方法は、約1:1の比でT細胞及びサプレッサー細胞を培養することを含む。

一実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、蛍光物質により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの粒子により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの酸化鉄粒子（MPIO）により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、磁性ナノ粒子により標識される。T細胞を標識するための様々な方法が、当技術分野で周知されている。

インビトロスクリーニング方法では、これらに限定はされないが、増殖、細胞周期の活性化、細胞死、サイトカイン産生、及び/又は細胞傷害性活性を含む活性を測定することができる。

本明細書で提供するサプレッサー細胞（例えば、Treg及びMDSC）によるT細胞の抑制は、当技術分野で周知されている様々な方法を用いてアッセイすることができる。そのような方法には、これらに限定はされないが、それぞれ全体が引用により本明細書に組み込まれている、Dolcettiらの文献、Current Protocols of Immunology, 14.17.1-14.17.25 (2010); Bayneらの文献、Cold Spring Harb Protoc, doi: 10.1101/pdb.prot077214 (2013); Kruisbeekらの文献、Current Protocols in Immunology, 3.12.1-3.12.20 (2004); 及びCollisonらの文献、Methods Mol Biol. 707: 21-37 (2011)に記載の方法がある。

幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞には、Treg細胞を含む。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞には、MDSCを含む。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞には、Treg細胞及びMSDCの両方を含む。幾つかの実施態様において、スクリーニング方法はインビトロで実施され、サプレッサー細胞は、対象から単離することができる。動物は、哺乳動物とすることができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、マウスから単離することができる。幾つかの実施態様において、対象は、放射線照射を受けた対象とすることができる。幾つかの実施態様において、対象は、放射線照射を受けていない対象とすることができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、放射線照射を受けたマウスに由来する。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、放射線照射を受けていないマウスに由来する。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビトロスクリーニング方法は、放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象から単離した、サプレッサー細胞の第1の集団、及び放射線照射を受けた腫瘍を有する対象から単離した、サプレッサー細胞の第2の集団を使用することを含む。該方法は、それぞれサプレッサー細胞の第1の集団と共に培養した改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定すること、及び／または、それぞれサプレッサー細胞の第2の集団と共に培養した改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定することを含み得；ここでT細胞をサプレッサー細胞の第2の集団と共に培養した場合に、T細胞をサプレッサー細胞の第1の集団と共に培養した場合よりも増加が顕著であるならば、候補遺伝子を標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様において、T細胞をサプレッサー細胞の第1の集団と共に培養した場合、改変T細胞及び非改変T細胞を比較した際にT細胞の活性は実質的に同じであるが、T細胞をサプレッサー細胞の第2の集団と共に培養した場合、非改変T細胞と比較して、改変T細胞においてT細胞の活性はより高くなる。

幾つかの実施態様において、本明細書では、T細胞の細胞周期の活性化を試験することにより、癌治療の標的遺伝子をスクリーニングするインビトロ方法を提供する。該方法は、(a) 非改変T細胞及びサプレッサー細胞；並びに(b) 改変T細胞及びサプレッサー細胞を別個に培養することであって；改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記培養すること；並びに非改変T細胞の細胞周期の活性化、及び改変T細胞の細胞周期の活性化を測定することを含み得、ここで非改変T細胞と比較して、改変T細胞において細胞周期の活性化が増進される場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様において、細胞周期の活性化は、T細胞のDNAへの³[H]-チミジンの取り込みによって測定する。幾つかの実施態様によって、非改変T細胞は、参照T細胞である。幾つかの実施態様において、該方法は、T細胞を抗CD3及び抗CD28を用いて活性化させることを含む。

幾つかの実施態様において、本明細書では、T細胞の細胞死を試験することにより、癌治療の標的遺伝子をスクリーニングするインビトロ方法を提供する。幾つかの実施態様において、該方法は、T細胞を抗CD3及び抗CD28を用いて活性化させることを含む。該方法は、(a) 非改変T細胞及びサプレッサー細胞；並びに (b) 改変T細胞及びサプレッサー細胞を別個に培養することであって；改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記培養すること；並びに非改変T細胞の細胞死、及び改変T細胞の細胞死を測定することを含み得、ここで非改変T細胞と比較して、改変T細胞において細胞死が低下する場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様によって、非改変T細胞は、参照T細胞である。

細胞死は、アポトーシス、有糸分裂細胞死、及び壊死であり得る。幾つかの実施態様において、本明細書で提供する方法では、アポトーシスを測定する。幾つかの実施態様において、本明細書で提供する方法では、アポトーシス有糸分裂細胞死（apoptosis mitotic cell death）を測定する。幾つかの実施態様において、本明細書で提供する方法では、壊死を測定する。市販のキットを用いた細胞死を測定するための様々なアッセイが、当技術分野で公知である。幾つかの実施態様において、細胞死は、カスパーゼアッセイによって測定する。幾つかの実施態様において、細胞死は、DNA断片化又は鎖切断によって測定する。幾つかの実施態様において、細胞死は、細胞サイトメトリーによって測定する。幾つかの実施態様において、細胞死は、ELISAによって測定する。

他の実施態様において、本明細書では、抗原特異的な活性化に反応するT細胞エフェクター機能の発達を評価する方法を提供する。インビトロでの抗原特異的刺激によって誘発されるT細胞の細胞傷害性活性を評価することにより、エフェクター細胞の機能的細胞溶解能を評価することが可能となる。幾つかの実施態様において、小さな改変を入れるだけで同種異系抗原刺激又は抗原特異的誘発のいずれかを評価することができる。ある実施態様において、⁵¹Cr放出による細胞溶解活性の評価を使用して、アッセイの簡便性を保ち、かつ研究者が多くの変形及び希少な細胞集団を用いて研究することを可能にしながら、T細胞特異的なエフェクター機能及び免疫調節細胞によるその調節/阻害を調べることができる。クロム放出アッセイにより、より詳細な機能的情報が提供され得る。

ある実施態様において、溶解単位（lytic unit）変換は、抑制性細胞不在時の内部対照に対して正規化された抑制の程度を測定するものであり、結果のより有用な表現を提供し、異なる実験からの結果を比較し、平均化することを可能とする。L.U.の評価は、増殖アッセイ又は単一エフェクター対標的比細胞傷害値よりも有効な測定であるが、それは該評価が機能的活性（培養物の細胞溶解性活性）及び細胞増殖（それぞれの培養物において回収される細胞数）の両方の推定を含むためである。

幾つかの実施態様において、抗原は、標的細胞に天然には存在しないタンパク質である。一実施態様において、抗原は、オボアルブミンである。

幾つかの実施態様において、本明細書では、T細胞のサイトカイン産生を試験することにより、癌治療の標的遺伝子をスクリーニングするためのインビトロ方法を提供する。幾つかの実施態様において、該方法は、T細胞を抗CD3及び抗CD28を用いて活性化することを含む。該方法は、(a) 非改変T細胞及びサプレッサー細胞； 並びに(b) 改変T細胞及びサプレッサー細胞を別個に培養することであって；改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記培養すること；並びに非改変T細胞のサイトカインの産生、及び改変T細胞のサイトカインの産生を測定することを含み得、ここで非改変T細胞と比較して、改変T細胞においてサイトカインの産生が増進される場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で測定されるサイトカインには、インターフェロン（IFN）-γ、腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターロイキン（IL）-2、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、又はこれらの任意の組合わせがある。サイトカインの産生を試験するための様々な方法が、当技術分野で公知である。例えば、サイトカインは、免疫ブロッティング（IB）アッセイ、免疫蛍光（IF）アッセイ、FACS、ELISA、又は細胞内サイトカイン染色法（ICS）によって測定することができる。サイトカインの産生を試験するためのキットも、市販されている。

一実施態様において、本明細書では、癌治療の標的を同定する方法であって：
(1) T細胞を対象から単離すること；
(2) 第1組のT細胞（ここで、単離されたT細胞には改変を加えない）及び第2組のT細胞（ここで、単離されたT細胞において候補遺伝子が選択的にノックアウト又はノックダウンされている）を準備すること；
(3) 第1組のT細胞を腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させ（ここで、腫瘍は放射線によって処置されていない）、かつ試料におけるT細胞抑制の程度を決定すること；
(4) 第1組のT細胞を腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させ（ここで、腫瘍は放射線によって処置されている）、かつ試料におけるT細胞抑制の程度を決定すること；
(5) 第2組のT細胞を腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させ（ここで、腫瘍は放射線によって処置されている）、かつ試料におけるT細胞抑制の程度を決定すること；
(6) 工程(3)と比較した、工程(4)におけるT細胞抑制の低下を決定すること；
(7) 工程(3)と比較した、工程(5)におけるT細胞抑制の低下を決定すること；並びに
(8) 工程(6)において決定された低下の差を、工程(7)において決定された低下の差と比較すること、を含み、
ここで、工程(7)で決定したT細胞抑制の低下の差が、工程(6)において決定した低下よりも大きい場合、T細胞においてノックアウト若しくはノックダウンされた遺伝子、又はそれによってコードされたタンパク質を、癌治療の標的として同定する、前記方法を提供する。

一実施態様において、対象は、マウスである。

別の実施態様において、マウスは特定の抗原特異性を有するT細胞受容体を有するように遺伝子操作されている。別の実施態様において、抗原は、マウスにおいて天然には存在しないタンパク質である。別の実施態様において、抗原は、オボアルブミンである。

一実施態様において、T細胞は標識される。別の実施態様において、T細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識される。

一実施態様において、腫瘍は、除去線量の放射線で処置されている。別の実施態様において、腫瘍は、1 Gy〜45 Gy、5 Gy〜35 Gy、10 Gy〜25 Gy、1 Gy〜25 Gy、1 Gy〜20 Gy、又は5 Gy〜15 Gyの線量の放射線で処置されている。一実施態様において、腫瘍は、1 Gy〜20 Gyの線量の放射線で処置されている。

一実施態様において、単離されたT細胞において候補遺伝子を、shRNAを含むウイルスベクターにT細胞を感染させることによってノックアウト又はノックダウンさせる。一実施態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルス由来のベクターである。幾つかの実施態様において、ウイルスベクターは、SMARTベクター、GIPZ、TRIPZ、又はTRCレンチウイルスshRNAベクター（GE Dharmacon）である。別の実施態様において、単離されたT細胞において遺伝子を、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることによってノックアウト又はノックダウンさせる。別の実施態様において、単離されたT細胞において遺伝子を、CAS9（CRISPR）を用いることによってノックアウト又はノックダウンさせる。

一実施態様において、T細胞抑制は、T細胞の増殖をモニタリングすることによって評価する。一実施態様において、T細胞の増殖は、抗CD3＋抗CD28の存在下で評価する。一実施態様において、T細胞の増殖は、³[H]-チミジンの取り込みによって決定する。別の実施態様において、増殖は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識されたT細胞のフローサイトメトリー分析によって決定する。

一実施態様において、T細胞抑制は、T細胞の細胞傷害性活性の測定によって評価する。一実施態様において、細胞傷害性活性は、抗原特異的刺激によって誘発される。一実施態様において、抗原は、オボアルブミンである。

一実施態様において、該方法はアレイ化形式のハイスループット設定で実施される。

ある実施態様において、本明細書で提供するのは、癌治療の標的を同定する方法であって：
(1) T細胞を対象から単離すること；
(2) T細胞を、第1の細胞培養物において腫瘍を有する対象から単離したサプレッサー細胞と共培養することであって、腫瘍が放射線で処置されていない、前記共培養すること；
(3) T細胞を、第2の細胞培養物において腫瘍を有する対象由来のサプレッサー細胞と共培養することであって、腫瘍が放射線で処置されている、前記共培養すること；
(4) 一連の候補遺伝子のノックダウン又はノックアウトを導入するように設計されたウイルスベクターに、第1及び第2の培養物を感染させ、かつさらに細胞を培養すること；並びに
(5) 培養物中の特定の遺伝子コンストラクトの相対レベルを決定すること、を含み、
ここで、第1の培養物と比較して第2の培養物において高レベルであると決定される遺伝子コンストラクト、又はそれによってコードされたタンパク質を、標的であると同定する、前記方法である。

一実施態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

別の実施態様において、特定の遺伝子コンストラクトの相対レベルは、ベクターを配列決定することにより決定する。一実施態様において、配列決定法は、次世代配列決定法である。

当業者であれば、本明細書で提供するスクリーニング方法が、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知のインビトロアッセイと任意に組合わせて、1種以上のT細胞活性を測定することを含み得ることを理解するであろう。

（5.1.3 プールアッセイ）
また、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するためのハイスループットプールスクリーニング方法を提供する。該プールスクリーニング方法は、i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び(ii) T細胞の初期集団をある期間にわたり腫瘍微小環境と接触させて、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み得るものであり、ここでT細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する。幾つかの実施態様において、初期集団中のそれぞれのT細胞は、多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている。

また、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するためのハイスループットプールスクリーニング方法を提供する。プールスクリーニング方法は、i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び(ii) T細胞の初期集団をある期間にわたりサプレッサー細胞と接触させて、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み得、ここでT細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する。幾つかの実施態様において、初期集団中のそれぞれのT細胞は、多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている。

本明細書で開示するプールスクリーニング方法において使用されるT細胞は、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知の方法で使用される任意の特定の種類のT細胞とすることができる。例えば、幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるT細胞は、CD3⁺細胞である。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるT細胞は、CD8⁺細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、CD4⁺細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブT細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブCD8⁺ T細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブCD4⁺ T細胞である。

幾つかの実施態様において、T細胞は、対象から単離する。該対象は、哺乳動物とすることができる。幾つかの実施態様において、該T細胞は、マウスから単離する。マウスは、野生型マウス又は遺伝子操作されたマウスとすることができる。幾つかの実施態様において、マウスをT細胞受容体を発現するように遺伝子操作する。T細胞受容体は、マウスにおいて天然には存在しない抗原に特異的なものとすることができる。幾つかの実施態様において、抗原は、オボアルブミンとすることができる。幾つかの実施態様において、対象は、オボアルブミンに特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたマウスとすることができる。

一実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は蛍光物質により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの粒子により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの酸化鉄粒子（MPIO）により標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、磁性ナノ粒子により標識される。T細胞を標識するための様々な方法が、当技術分野で周知されている。

T細胞の選択された集団は、T細胞の初期集団の増殖によって生じる。T細胞の増殖を増加させる遺伝学的改変を有するT細胞は、T細胞の選択された集団中に蓄積される。従って、T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされた候補遺伝子は、これらの遺伝子を標的化することにより、腫瘍を有する対象におけるT細胞の増殖を増進することができることを示す。幾つかの実施態様において、腫瘍を有する対象は、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象とすることができる。

幾つかの実施態様において、T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされた候補遺伝子は、T細胞の選択された集団から単離されたゲノムDNAのNGSによって同定する。

幾つかの実施態様において、T細胞の初期集団を調製することは、shRNAライブラリで非改変T細胞を感染させることを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリはT細胞ゲノムの全遺伝子をスクリーニングすることができるゲノムライブラリであり、これはウイルスベクターを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリはサブゲノムライブラリであり、これはT細胞ゲノムの遺伝子の選択を含む。幾つかの実施態様において、特定の構造的/機能的特徴を有するあるタンパク質をコードする遺伝子を標的とするshRNAライブラリは、ウイルスベクターを含む。例示的なライブラリには、これらに限定はされないが、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）ライブラリ、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリーライブラリ、免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ライブラリ、転写調節因子ライブラリ、キナーゼライブラリ、ホスファターゼライブラリ、血管形成ライブラリ、細胞周期ライブラリ、アポトーシスライブラリ、及び/又はユビキチンリガーゼライブラリがある。また、例示的なライブラリは、機能不全のT細胞で過剰発現又は過小発現することが公知の遺伝子に重点を置いてもよい。例えば、候補遺伝子のライブラリは、T細胞のアネルギー又は疲弊において過剰発現する遺伝子のライブラリとすることができる。また、本明細書で開示する方法で使用するライブラリは、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知のライブラリの任意の組合わせとすることができる。

幾つかの実施態様において、shRNAライブラリは、対照shRNA、例えばLacZ shRNAを含み得る。

幾つかの実施態様において、T細胞の初期集団の調製は、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることを含む。幾つかの実施態様において、T細胞の初期集団を調製することは、CAS9（CRISPR）を用いることを含む。幾つかの実施態様において、T細胞の初期集団を調製することは、shRNAライブラリにT細胞を感染させることを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリは、レンチウイルスベクターライブラリである。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載のプールスクリーニング方法は、インビトロ方法とすることができ、ここで接触させる工程は、初期T細胞集団をサプレッサー細胞と共にインビトロ培養することを含む。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象から単離することができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象から単離することができる。

幾つかの実施態様において、T細胞は、種々のT細胞対サプレッサー細胞比のサプレッサー細胞の存在下、抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される。幾つかの実施態様において、T細胞は、抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される。幾つかの実施態様において、該方法は、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、又は1:5の比でT細胞及びサプレッサー細胞を培養することを含む。幾つかの実施態様において、該方法は、1:1の比でT細胞及びサプレッサー細胞を培養することを含む。

幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由来する。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象に由来する。

従って、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するためのインビトロハイスループットプールスクリーニング方法を提供する。該インビトロプールスクリーニング方法は、i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び(ii) T細胞の初期集団をある期間にわたりサプレッサー細胞と共に培養して、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み得るものであり、ここでT細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている候補遺伝子を、癌治療の標的遺伝子であると同定する。幾つかの実施態様において、初期集団中のそれぞれのT細胞は、多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている。幾つかの実施態様において、該方法は、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象から、サプレッサー細胞を単離することをさらに含む。幾つかの実施態様において、該方法は、放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象から、サプレッサー細胞を単離することをさらに含む。

幾つかの実施態様において、T細胞及びサプレッサー細胞を培養するための期間は、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、2.5週間、3週間、3.5週間、4週間、5週間、6週間、7週間、2カ月、3カ月、又はそれより長期とすることができる。

当業者であれば理解するように、上記の節に記載のインビトロスクリーニング方法の任意の変形も、これらのインビトロプールスクリーニング方法に適用される。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載のプールスクリーニング方法は、インビボ方法とすることができ、ここで接触させる工程は、腫瘍を有する試験対象にT細胞の初期集団を注射することを含む。従って、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するためのインビボハイスループットプールスクリーニング方法を提供する。該インビボプールスクリーニング方法は、i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び(ii) T細胞の初期集団をサプレッサー細胞と共に腫瘍を有する試験対象に注射して、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み得、ここでT細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている候補遺伝子を、癌治療の標的遺伝子であると同定する。

試験対象は、動物モデルとすることができる。動物モデルは、二腫瘍モデルとすることができる。幾つかの実施態様において、該動物モデルは、マウスである。腫瘍を有するマウスは、放射線照射を受けていても、放射線照射を受けていなくてもよい。幾つかの実施態様において、動物モデルは、二腫瘍モデルである。幾つかの実施態様において、動物モデルは、2つの腫瘍を体の反対側の位置に有するマウスであり、該腫瘍の一方のみが除去線量の放射線を受けている。

また、該方法は、T細胞の選択されたプールを注射後に対象から単離することを含み得る。T細胞の選択されたプールは、試験対象の試料から単離することができる。該試料は、腫瘍試料、血液試料、又は組織試料とすることができる。腫瘍試料は、放射線照射を受けた腫瘍又は放射線照射を受けていない腫瘍からの試料とすることができる。血液試料は、末梢血、全血、又は部分精製血の試料とすることができる。組織試料は、脾臓試料、又はリンパ節試料とすることができる。リンパ節試料は、流入領域リンパ節試料又は非流入領域リンパ節試料とすることができる。

幾つかの実施態様において、該方法は、試験対象からT細胞の選択された集団を、注射から24時間後、注射から2日後、注射から3日後、注射から4日後、注射から5日後、注射から6日後、注射から7日後、注射から8日後、注射から9日後、注射から10日後、注射から11日後、注射から12日後、注射から13日後、注射から14日後、注射から2.5週間後、注射から3週間後、注射から3.5週間後、注射から4週間後、注射から5週間後、注射から6週間後、注射から7週間後、注射から2カ月後、注射から3カ月後又はそれより長い期間の経過後に単離することを含む。

対象におけるT細胞の選択された集団は、当技術分野で公知の様々なアプローチによって測定することができる。幾つかの実施態様において、試験対象における注射されたT細胞の蓄積は、細胞サイトメトリーによって測定することができる。幾つかの実施態様において、試験対象におけるT細胞の蓄積は、蓄積されたT細胞由来のゲノムDNAの次世代配列決定法（NGS）によって測定することができる。

幾つかの実施態様において、初期集団のそれぞれのT細胞は多くとも1つの候補遺伝子に対するshRNAを有し、T細胞の初期集団と比較してT細胞の選択された集団において候補遺伝子に対するshRNAが富化する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同定する。これらの標的遺伝子がノックダウン又はノックアウトされているT細胞は、TCRによる腫瘍抗原の認識とは無関係に増殖が増進され得る。幾つかの実施態様において、候補遺伝子は、T細胞の初期集団と比較して、T細胞の選択された集団において約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍、又は約50倍富化される。幾つかの実施態様において、候補遺伝子は、T細胞の初期集団と比較して、T細胞の選択された集団において少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも12倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも30倍、少なくとも35倍、少なくとも40倍、少なくとも45倍、少なくとも50倍、又はそれ以上に富化される。

腫瘍中でのT細胞の増殖を復帰させるshRNAは、腫瘍中で富化させ得るが、他の組織、例えば二次リンパ性器官（例えば、脾臓）では富化させ得ない。従って、幾つかの実施態様において、非腫瘍組織試料と比較して、腫瘍試料から取得したT細胞の選択された集団において候補遺伝子に対するshRNAが富化する場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同定する。腫瘍試料は、放射線照射を受けた腫瘍、又は放射線照射を受けていない腫瘍に由来する試料とすることができる。組織試料は、二次リンパ性器官試料、例えば、脾臓試料又はリンパ節試料とすることができる。リンパ節試料は、流入領域リンパ節試料又は非流入領域リンパ節試料とすることができる。

幾つかの実施態様において、候補遺伝子は、非腫瘍組織試料と比較して、腫瘍試料において約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍、又は約50倍富化される。幾つかの実施態様において、候補遺伝子は、T細胞の初期集団と比較して、T細胞の選択された集団において少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも12倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも30倍、少なくとも35倍、少なくとも40倍、少なくとも45倍、少なくとも50倍、又はそれ以上に富化される。

幾つかの実施態様において、T細胞の選択された集団におけるshRNAの定量化は、NGSの使用を含み得る。

当業者であれば理解するように、上記の節に記載のインビボスクリーニング方法の任意の変形はまた、これらのインビボプールスクリーニング方法に適用される。

当業者であれば理解するように、本明細書に記載のプールスクリーニング方法はまた、そこで同定される標的遺伝子を裏付ける機能的試験をさらに含むことができる。

（5.2 T細胞における候補遺伝子のノックアウト又はノックダウン）
幾つかの実施態様において、T細胞機能の調節における特定のタンパク質の不存在を、放射線と組合わせた際の効果を評価するために、候補遺伝子をT細胞においてノックアウト又はノックダウンさせる。遺伝子編集のための当技術分野で公知の任意の従来法を、本明細書で提供する方法と関連させて利用することができる。

（5.2.1 RNAiベースのノックアウト又はノックダウン）
候補遺伝子のノックアウト又はノックダウン（「サイレンシング」と総称される）は、様々な細胞系において、化学合成された、又はインビトロ転写された低分子干渉RNA（siRNA）、並びにPCRベース又はDNAベクターベースの低分子ヘアピン型RNA（shRNA）を用いて達成することができる。細胞においてshRNAの発現を駆動するいくつかのプロモーターが報告されており、これにはRNAポリメラーゼIIIベースのプロモーターであるU6及びH1、並びにRNAポリメラーゼIIプロモーターであるCMVがある。さらに、本明細書で提供するshRNA分子をT細胞特異的プロモーターに作用可能に連結させて、T細胞特異的なshRNA分子のターゲティングを実現し、それによって候補遺伝子のサイレンシングを達成することができる。

ある実施態様において、本明細書では、候補遺伝子のRNA干渉による遺伝子サイレンシング方法を提供する。該方法は、そのコンストラクトの送達を予定している細胞種（例えば、T細胞）において活性なプロモーターを用いてshRNAの発現を駆動する、干渉（サイレンシング）RNAをコードするコンストラクトの作製を含む。

本明細書で提供する方法で使用するshRNAコンストラクトには、候補遺伝子を対象とし、候補遺伝子をコードする核酸分子の発現の調節に使用するための短いヌクレオチド区間が存在する。候補遺伝子の阻害は、候補遺伝子をコードする1以上の標的核酸分子とハイブリッド形成するオリゴマー化合物を提供することによって実現される。

アンチセンス技術の背景にある原理は、標的核酸とハイブリッド形成するアンチセンス化合物が、転写又は翻訳などの遺伝子発現活動を調節することである。この配列特異性により、アンチセンス化合物は、標的の確認及び遺伝子機能決定のツールとしてきわめて魅力的なものとなる。

特定の理論に制限されることなく、候補遺伝子のサイレンシングの作用メカニズムには、shRNA化合物と標的核酸とのハイブリッド形成が関与する。ここで、ハイブリッド形成の結果又は効果は、標的の分解又は標的の占有であり、例えば候補遺伝子の転写又はスプライシングを含む細胞機構の停止がこれに付随する。

アンチセンス化合物がハイブリッド形成してもなお標的の切断が誘発されない、占有ベースのアンチセンスメカニズムの例には、これらに限定はされないが、翻訳の阻害、スプライシングの調節、ポリA部位の選択の調節、及び調節性RNA構造の崩壊がある。細胞を非切断的事象を介して作用するアンチセンス化合物と接触させることによる、mRNA標的のプロセシングの調節を通じて、細胞の挙動を制御する方法は、例えば米国特許第6,210,892号及び米国公開第20020049173号に記載されている。

一般に、shRNAのセンス配列は約19〜約22ヌクレオチドの長さ（例えば、約19、20、21、又は22ヌクレオチド）であり、アンチセンス配列は約19〜約22ヌクレオチドの長さ（例えば、約19、20、21、又は22ヌクレオチド）であり、かつループ領域は約3〜約19ヌクレオチドの長さ（例えば、約3〜約19ヌクレオチド）である。幾つかの実施態様において、センス及びアンチセンス配列は同じ長さであり、すなわちshRNAは対称なヘアピンを形成する。他の実施態様において、センス又はアンチセンス鎖はその相補的な鎖よりも短くてもよく、非対称のヘアピンを形成してもよい。幾つかの実施態様において、センス及びアンチセンス配列間の塩基対形成は厳密である。他の実施態様において、配列間のいくぶんのミスマッチは許容される場合があり、又は例えば2つの鎖の間の水素結合強度を減少させるのに望ましい場合がある。また、幾つかの実施態様において、shRNA分子は化学的に修飾され得る5'末端リン酸基を含むことができる。さらに、shRNA分子のループ部分には、例えば、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、及びコンジュゲート分子などを含むことができる。

任意の適当なベクターを候補遺伝子のRNAiサイレンシングに関して使用することができる。例としては、これらに限定はされないが：ウイルスベースのベクター、例えばアデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレトロウイルスベクター；並びにプラスミドベースのベクター及び他のベクター、例えばバキュロウイルス、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド（phosmids）、細菌人工染色体、P1ベースの人工染色体、酵母プラスミド、及び酵母人工染色体がある。

一実施態様において、ベクターはウイルスベクターである。別の実施態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。

shRNA発現ベクターの送達は、標的細胞への投与によるものでも、所望の標的細胞（複数可）又は組織への導入を可能にする任意の他の手段、例えばトランスフェクション又は形質導入によるものでもよい。

（5.2.2 TALENベースのノックアウト又はノックダウン）
他の実施態様において、候補遺伝子は、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）ベースの系を用いてサイレンシングすることができる。転写活性化様（TAL）エフェクター配列を集合させて、反復可変二残基（repeat variable-diresidue）（RVD）配列を組み付けることにより、DNA標的に特異的に結合させることができる。TALエフェクター及びヌクレアーゼの融合タンパク質（TALEN）は、細胞DNAに標的化された二本鎖切断を加えることができ、該二本鎖切断は、細胞に特異的な遺伝学的改変を加えるために使用することができる。TALENは、安定に改変された細胞を作出するのに有用であると報告されている。

標的DNA内部の特異的なヌクレオチド配列に結合するTALエフェクタードメインは、10以上のDNA結合リピート、又は15以上のDNA結合リピートを含み得る。それぞれのDNA結合リピートは標的DNA配列中の塩基対の認識を決定するRVDを含み得、ここでそれぞれのDNA結合リピートは標的DNA配列中の1つの塩基対の認識に寄与し、かつここでRVDは：Cを認識するHD; Tを認識するNG; Aを認識するNI; G又はAを認識するNN; A又はC又はG又はTを認識するNS; C又はTを認識するN*（ここで、*はRVDの第2位のギャップを表す）; Tを認識するHG; Tを認識するH*（ここで、*はRVDの第2位のギャップを表す）; Tを認識するIG; Gを認識するNK; Cを認識するHA; Cを認識するND; Cを認識するHI; Gを認識するHN; Gを認識するNA; G又はAを認識するSN; 及びTを認識するYGの1以上を含む。

幾つかの実施態様において、TALENはエンドヌクレアーゼドメイン及び標的DNAに特異的なTALエフェクターDNA結合ドメインを含み得、ここでDNA結合ドメインは複数のDNA結合リピートを含み、それぞれのリピートは標的DNA中の塩基対の認識を決定するRVDを含み、ここでそれぞれのDNA結合リピートは標的DNA中の1つの塩基対の認識に寄与し、かつここで、TALENは以下のRVD：Cを認識するHD; Tを認識するNG; Aを認識するNI; G又はAを認識するNN; A又はC又はG又はTを認識するNS; C又はTを認識するN*; Tを認識するHG; Tを認識するH*; Tを認識するIG; Gを認識するNK; Cを認識するHA; Cを認識するND; Cを認識するHI; Gを認識するHN; Gを認識するNA; G又はAを認識するSN; 及びTを認識するYGの1以上を含む。TALENは、以下のRVD：Cを認識するHA; Cを認識するND; Cを認識するHI; Gを認識するHN; Gを認識するNA; G又はAを認識するSN; Tを認識するYG; 及びGを認識するNKの1以上、並びに: Cを認識するHD; Tを認識するNG; Aを認識するNI; G又はAを認識するNN; A又はC又はG又はTを認識するNS; C又はTを認識するN*; Tを認識するHG; Tを認識するH*; 及びTを認識するIGの1以上を含み得る。エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、FokI）に由来し得る。

幾つかの実施態様において、細胞は、コンストラクトがそのゲノムに組み込まれないようにして、一過的に形質転換させることができる。例えば、TALENのコード配列を含むプラスミドベクターは、TALENのコード配列を発現するが、ベクターはゲノム中に安定に組み込まれないようにして、細胞に導入することができる。一過的に形質転換された細胞は通常、細胞分裂ごとに導入された核酸コンストラクトの一部又は全てを失い、その結果、導入された核酸は十分な回数の細胞分裂の後に、娘細胞において検出できなくなる。しかしながら、TALENのコード配列の発現は、ドナー配列及び内在の標的配列の間の相同組換えを達成するのに十分であり得る。一過的に形質転換された細胞及び安定に形質転換された細胞の両方とも、本明細書で提供する方法において有用であり得る。

ポリヌクレオチド及び/又は組換えベクターは、これらに限定はされないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及び微粒子銃（biolistic）法を含む、当技術分野で公知の任意の従来法を用いて宿主ゲノム中に導入することができる。さらに、本明細書で提供する方法に関して、当技術分野で従来公知の任意の他の遺伝子導入及び形質転換技術を使用することができる。そのような技術には、これらに限定はされないが、カルシウム又はPEGによるプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーションによって仲介されるネイキッドDNAの取り込み、リポソームによって仲介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルスベクターによって仲介される形質転換、及び微粒子銃（microprojectile bombardment）がある（それらの全てが引用により本明細書に組み込まれている米国特許第5,538,880号、第5,204,253号、第5,591,616号、及び第6,329,571号を参照されたい）。幾つかの実施態様において、DNA修飾酵素（例えば、TALEN）は、細胞に直接的に導入することができる。例えば、ポリペプチドは、機械的注入により、細菌III型分泌装置を介する送達により、又はエレクトロポレーションにより、細胞に導入することができる。

幾つかの実施態様において、核酸結合（nucleic acid binding）は例えば、これらに限定はされないが、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、インベルターゼ、プロテアーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写リプレッサー、転写アクチベーター、転写調節因子動員、タンパク質核局在化シグナル、又は細胞取り込みシグナルを含むエフェクタードメインと連結される。

幾つかの実施態様において、エフェクタードメインは、これらに限定はされないが、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、リゾルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、DNAメチルトランスフェラーゼ活性、DNAデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、核局在化シグナル活性、転写リプレッサー活性、転写アクチベーター活性、転写調節因子動員活性、又は細胞取り込みシグナル伝達活性を含む活性を示すタンパク質ドメインである。他の実施態様は、本明細書に記載の活性の任意の組合わせを含み得る。

本明細書で提供する方法に関して、クローニングベクター及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組み込みベクターを含む、任意の適当なベクターを使用することができる。「発現ベクター」は、1以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」は、もう1つのDNA配列の転写及び/又は翻訳を制御及び調節するDNA配列である。適当な発現ベクターには、これらに限定はされないが、プラスミド及び、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターがある。多くのベクター及び発現系が市販されている。例として、組換えDNA技術で使用される一部のベクターにより、実体、例えばDNAセグメント（例えば異種DNAセグメント、例として異種cDNAセグメント）を、標的細胞内に導入することが可能となる。

ベクターは、核酸断片の複製及びクローニングをもたらすために、1以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（I型、II型、II型のいずれでもよい）を有し得る。該認識部位は、ベクターの必須の生物学的機能を損することなく、配列をそこで確定可能に切断することができ、かつ核酸断片をそこに結合させ、又は挿入することができる。また、ベクターは2つの核酸分子間での核酸配列の交換を可能にする、1以上の組換え部位を含み得る。ベクターは、例えばPCR用のプライマー部位、転写及び/又は翻訳の開始及び/又は調節部位、組換えシグナル、レプリコン、並びに選択可能マーカーをさらに提供し得る。ベクターは、ベクターにより形質転換された細胞の識別における使用に適当な、1以上の選択可能マーカーをさらに含み得る。

幾つかの実施態様において、所望の核酸配列、例えばTALEポリペプチドをコードするmRNAの翻訳が要求される場合、ベクターはヌクレオチド配列の適切な翻訳に要求される配列を含むこともできる。

幾つかの実施態様において、発現ベクターは、「プラスミド」の形態であることが多く、これは、ベクターの形態では染色体と結合しない環状二本鎖DNAループを指す。幾つかの実施態様において、所与のTALEポリペプチドの全ての構成要素は、単一のベクターにコードされ得る。例えば、幾つかの実施態様において、機能性のTALEポリペプチドに必要な全ての構成要素を含む、又は含み得るベクターを、構築することができる。幾つかの実施態様において、個々の構成要素（例えば、1以上のモノマーユニット及び1以上のエフェクタードメイン）は、異なるベクターに別個にコードさせることができ、1以上の細胞に別個に導入することができる。さらに、本明細書に記載の任意のベクターは、任意の位置又は位置の組合わせに、構成要素配列、例えばエフェクタードメイン及び/又はTALEモノマーユニットをコードする所定のTALEポリペプチドをそれ自体含むことができる。

ベクターの例には、これらに限定はされないが、プラスミド、エピソーム、バクテリオファージ、又はウイルスベクターがあり、そのようなベクターは、宿主細胞のゲノムへと組み込まれるか、又は使用される特定の細胞系において自律的に複製することができる。幾つかの実施態様において、使用するベクターはエピソームベクター、すなわち染色体外で複製することのできる核酸であり、細菌、ウイルス、又はファージ由来の配列を含み得る。他の実施態様において、ベクターは細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、及びウイルス、これらの組合わせに由来するベクター、例えばプラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント、コスミド及びファージミドに由来するベクターに由来する。幾つかの実施態様において、ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（BAC）、又は酵母人工染色体（YAC）とすることができる。ベクターは、一本鎖又は二本鎖DNA、RNA、又はファージベクターとすることができる。

ウイルスベクターには、これらに限定はされないが、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター又はガンマレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターがある。例えば、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス粒子の形態で使用することができる。また、同等の機能を果たす当業者に公知の他の形態の発現ベクターを使用することができる。発現ベクターは、発現させる核酸配列にコードされるポリペプチドの安定な又は一過性の発現に使用することができる。ベクターは、自己複製する染色体外ベクター又は宿主ゲノムへと組み込まれるベクターとすることができる。一実施態様において、ベクターはゲノム組み込みベクター、すなわち「組み込みベクター」であり、宿主細胞、細胞系、又は非細胞系の染色体DNA又はRNAへと組み込まれ得る。幾つかの実施態様において、TALEポリペプチド又は構成要素配列をコードする核酸配列は、ベクター配列の構成要素と一緒に宿主細胞、細胞系、又は非細胞系の染色体DNA又はRNAに組み込まれる。

本明細書で提供する組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適当な形態のTALE核酸を含むことができ、このことは、組み換え発現ベクター（複数可）が、発現に使用する宿主細胞（複数可）に基づいて選択される、発現させるべき核酸配列に作用可能に連結された1以上の調節配列を含むことを示唆する。

（5.2.3 CRISPR/CAS9ベースのノックアウト又はノックダウン）
幾つかの実施態様において、候補遺伝子を、例えばその全体が引用により本明細書に組み込まれているWiedenheftらの文献、Nature 482 (7385): 331-8 (2012)に記載の、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）（CRISPR）/CAS9システムを用いてサイレンシングする。

簡潔に説明すると、Cas9タンパク質及び真核細胞の1以上の遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位を標的とする1以上のガイドRNAを含む、操作された、プログラム可能な、天然に存在しないCRISPR-Casシステムを準備し、Cas9タンパク質が1以上の遺伝子産物をコードするDNA分子のゲノム座位を切断し、その結果、1以上の遺伝子産物の発現が変化する（その全体が引用により本明細書に組み込まれている米国特許第8,697,359号を参照されたい）。

ベクターを、原核細胞又は真核細胞においてCRISPR転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）を発現するように設計することができる。例えば、CRISPR転写物は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞において発現させることができる。適当な宿主細胞は、Goeddelの文献、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY）」 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)でさらに論じられている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳することができる。

ベクターは、原核生物において導入し、増殖させることができる。幾つかの実施態様において、原核生物を使用して、真核細胞に導入すべきベクター、又は真核細胞に導入すべきベクターの作製における中間体ベクターとしてのベクターのコピーを増幅させる（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部であるプラスミドの増幅）。幾つかの実施態様において、原核生物を使用して、ベクターのコピーを増幅させ、1以上の核酸を発現させて、例えば宿主細胞又は宿主生物に送達するための1以上のタンパク質の供給源を準備する。

幾つかの実施態様において、ベクターは、融合型発現ベクターである。そのようなベクターの例には、これらに限定はされないが、市販のベクター、例えば標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、又はタンパク質Aを融合させるpGEX（Pharmacia Biotech社）、pMAL（New England Biolabs）、及びpRIT5（Pharmacia, Piscataway, N.J.）がある。適当な誘導性非融合型大腸菌（E. coli）発現ベクターの例には、これらに限定はされないが、pTrc（Amrannらの文献、Gene 69:301-315 (1988)）及びpET 11d（Studierらの文献、「遺伝子発現技術；酵素学における方法（GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY）」 185, Academic Press, San Diego, Calif. 60-89 (1990)）がある。

幾つかの実施態様において、ベクターは、酵母発現ベクターである。そのようなベクターの例には、これらに限定はされないが、pYepSec1（Baldariらの文献、EMBO J. 6: 229-234 (1987)）、pMFa（Kuijan及びHerskowitzの文献、1982. Cell 30: 933-943）、pJRY88（Schultzらの文献、Gene 54: 113-123 (1987)）、pYES2（Invitrogen社, San Diego, Calif.）、及びpicZ（Invitrogen社, San Diego, Calif.）がある。

幾つかの実施態様において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。そのようなベクターの例には、これらに限定はされないが、pCDM8（Seedの文献、Nature 329: 840 (1987)）及びpMT2PC（Kaufmanらの文献、EMBO J. 6: 187-195 (1987)）がある。哺乳動物細胞において使用する場合、発現ベクターの制御機能は、通常1以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス40、及び当技術分野で公知の他のものに由来する。

幾つかの実施態様において、調節エレメントは、CRISPRシステムの1以上のエレメントの発現を駆動するように、CRISPRシステムの1以上のエレメントに作用可能に連結される。CRISPR座位は、これらに限定はされないが、アエロピルム（Aeropyrum）、ピロバキュラム（Pyrobaculum）、スルホロブス（Sulfolobus）、アーケオグロブス（Archaeoglobus）、ハロアーキュラ（Halocarcula）、メタノバクテリウム（Methanobacteriumn）、メタノコッカス（Methanococcus）、メタノサルシナ（Methanosarcina）、メタノピュルス（Methanopyrus）、パイロコッカス（Pyrococcus）、ピクロフィルス（Picrophilus）、テルモプラズマ（Thernioplasnia）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、アクウィフェクス（Aquifrx）、ポルフィロモナス（Porphvromonas）、緑色硫黄細菌（Chlorobium）、サーマス（Thermus）、バチルス（Bacillus）、リステリア（Listeria）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、紡錘菌（Fusobacterium）、アゾアルカス（Azarcus）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、ナイセリア（Neisseria）、硝化細菌（Nitrosomonas）、硫酸還元細菌（Desulfovibrio）、ジオバクター（Geobacter）、マイクロコッカス（Myrococcus）、カンピロバクター（Campylobacter）、ウォリネラ（Wolinella）、アシネトバクター（Acinetobacter）、エルウィニア（Erwinia）、大腸菌類（Escherichia）、レジオネラ（Legionella）、メチロコッカス（Methylococcus）、パスツレラ（Pasteurella）、フォトバクテリウム（Photobacterium）、サルモネラ（Salmonella）、ザントモナス（Xanthomonas）、エルシニア（Yersinia）、トレポネーマ（Treponema）、及びサーモトガ（Thermotoga）を含む40を超える原核生物において確認されている。

幾つかの実施態様において、CRISPRシステムの1以上のエレメントは、第I種、第II種、又は第III種のCRISPRシステムに由来する。幾つかの実施態様において、CRISPRシステムの1以上のエレメントは、内在のCRISPRシステムを含む特定の生物、例えば化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）に由来する。

通常、CRISPRシステムは、標的配列部位でのCRISPR複合体の形成を促進するエレメント（内在性CRISPRシステムとの関連でプロトスペーサーとも呼ばれる）を特徴とする。用語「標的配列」は、CRISPRシステムと関連して使用される場合、ガイド配列がそれと相補性を有するように設計された配列を指し、この場合、標的配列及びガイド配列間のハイブリッド形成により、CRISPR複合体の形成が促進される。幾つかの実施態様において、完全な相補性は必要でない場合があるが、それにはハイブリッド形成を起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在することが条件となる。

標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばDNA又はRNAポリヌクレオチドを含み得る。幾つかの実施態様において、標的配列は細胞の核又は細胞質中に位置する。幾つかの実施態様において、標的配列は真核細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア又はクロロプラストの内部に位置する。

幾つかの実施態様において、ベクターは、1以上の挿入部位、例えば制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）を含む。幾つかの実施態様において、1以上の挿入部位（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれ以上又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれ以上超の挿入部位）は、1以上のベクターの1以上の配列エレメントの上流及び/下流に位置する。幾つかの実施態様において、ベクターはtracr mate配列の上流、及び任意にtracr mate配列に作用可能に連結された調節エレメントの下流に挿入部位を含み、その結果、ガイド配列の挿入部位への挿入後、発現に際し、ガイド配列により真核細胞におけるCRISPR複合体の標的配列への配列特異的な結合が導かれる。幾つかの実施態様において、ベクターは、2以上の挿入部位を含み、それぞれの挿入部位は、それぞれの部位でガイド配列の挿入が可能となるように、2つのtracr mate配列の間に位置している。そのような配置において、2以上のガイド配列は、単一のガイド配列、2以上の異なるガイド配列、又はこれらの組合わせの2以上のコピーを含み得る。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一の発現コンストラクトを使用して、細胞内部でCRISPR活性を、複数の異なる対応する標的配列に差し向けることができる。例えば、単一のベクターは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20若しくはそれ以上又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20若しくはそれ以上超のガイド配列を含むことができる。幾つかの実施態様において、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれ以上又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれ以上超のそのようなガイド配列含有ベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。

幾つかの実施態様において、ベクターは、CRISPR酵素、例えばCasタンパク質をコードする酵素コード配列に作用可能に連結された調節エレメントを含む。Casタンパク質の例には、これらに限定はされないが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1及びCsx12としても公知である)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、及びこれらの類似体又は誘導体がある。

幾つかの実施態様において、CRISPR酵素はCas9であり、かつCas9とすることができる。幾つかの実施態様において、CRISPR酵素は標的配列の位置で、例えば標的配列内及び/又は標的配列の相補物内で一方又は両方の鎖の切断を導く。幾つかの実施態様において、CRISPR酵素は標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、又はそれ以上の塩基対以内で、一方又は両方の鎖の切断を導く。幾つかの実施態様において、ベクターは対応する野生型酵素と比較して突然変異の入ったCRISPR酵素をコードしており、その結果突然変異したCRISPR酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠く。

幾つかの実施態様において、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば真核細胞における発現のためにコドンを最適化されている。真核細胞は、特定の生物、例えばこれらに限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、又は非ヒト霊長類を含む哺乳動物の細胞とすることができ、又はそれに由来することができる。コドン最適化とは、対象とする宿主細胞における発現を増進するために、天然のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで天然の配列の少なくとも1つのコドンを置換することにより、核酸配列を改変する過程を指す。

様々な種が、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間のコドンの使い方の相違）は、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳効率と相関することが多く、該翻訳効率は、とりわけ翻訳されるコドンの特性及び特定の転移RNA（tRNA）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞中で選択されたtRNAが優勢であることは、一般にペプチド合成においてそのコドンが最も高頻度に使用されていることを反映する。従って、コドン最適化に基づいて遺伝子を、所与の生物における最適な遺伝子発現という目的に合わせることができる。

ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。幾つかの実施態様において、標的配列は細胞のゲノム内部の配列である。例示的な標的配列には、標的ゲノムに特有の配列がある。例えば、化膿性レンサ球菌（S. pyogenes）のCas9については、ゲノム中の特有の標的配列は、形態

（ここで、

（Nは、A、G、T、又はCであり；かつXは、何でもよい）は、ゲノム中に1回出現する）のCas9標的部位を含み得る。

遺伝子編集のためのいくつかの市販のCRISPR/Cas9システムが、当技術分野で利用可能である。任意のそのようなシステム、及びその任意の変形を、本明細書で提供する方法と関連して使用することができる。

（5.3 使用方法）
また、本明細書では、本明細書に記載のスクリーニング方法を用いて同定した遺伝子標的の使用方法を提供する。例えば、本明細書では、本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定した標的遺伝子を阻害することにより、T細胞を活性化させる方法を提供する。幾つかの実施態様において、T細胞は腫瘍を有する対象において存在する。腫瘍を有する対象は、本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定した標的遺伝子を阻害する処置の前、それと同時に、又はその後に、腫瘍に標的化された放射線を受けることができる。

また、幾つかの実施態様において、本明細書では、本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定された標的遺伝子を阻害することにより、それを必要とする対象において癌を治療する方法を提供する。また、幾つかの実施態様において、本明細書では、本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定された、標的遺伝子をノックダウン又はノックアウトされたT細胞を用いたT細胞療法を施すことにより、それを必要とする対象において癌を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様において、該方法は、腫瘍を標的とした放射線療法を施すことをさらに含むことができる。

（6. 実施例）
本明細書で提供する実施態様は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解することができる。これらの実施例は本明細書で提供する医薬組成物及び剤形の例証を意図するものであるが、いかなるようにも限定を意図するものではない。

（6.1 実施例1：ハイスループットインビトロスクリーニング）
癌治療の標的、すなわちサプレッサー細胞の阻害メカニズムの調節に関与する分子を同定するために、ナイーブT細胞を腫瘍を有さない遺伝子操作された、又は遺伝子操作されていないマウスから単離し、96ウェルプレートに入れる。ナイーブT細胞を、先に記載された、対象とするshRNAを含むレンチウイルスベクターを用いてT細胞を感染させることにより、又はやはり先に記載の対象とする遺伝子をノックアウトすることができるシステム、例えばTALEN若しくはCRISPR/CAS9システムを用いることにより、ノックダウン又はノックアウトされた対象とする特定の遺伝子を含むように、操作する。特定の候補遺伝子のノックダウン又はノックアウトは、1つのウェルで一回行う。

安定な表現形を獲得させた後、2組のサプレッサー細胞：(1) 放射線照射を受けた動物から単離したサプレッサー細胞；及び(2) 放射線照射を受けていない動物から単離したサプレッサー細胞を用いて、shRNAで処理したT細胞を抗原又は抗CD3＋抗CD28の存在下、サプレッサー細胞と共にインキュベートする。続いて、引用により本明細書に組み込まれているDolcettiらの文献、Current Protocols in Immunlogy, 14.17.1-14.17.25 (2010)に記載の手順と実質的に同様の手順を用いて、³[H]-チミジンの取り込みをモニタリングすることにより、T細胞の増殖を個々のウェル中で評価する。

非標的対照shRNAで処理したT細胞においては、増殖が抑制されるのに対し、免疫反応を負に調節する（阻害する）標的遺伝子の不活性化は、反応の増進（抑制の低下）をもたらすことが期待される。さらに、T細胞及び/又は放射線照射を受けた動物から単離したサプレッサー細胞の反応を、T細胞及び/又は放射線照射を受けていない動物から単離したサプレッサー細胞の反応と対比させ、同じインビトロ抑制アッセイで比較する。放射線照射を受けた動物から単離したサプレッサー細胞と組合わせた場合、T細胞反応の阻害に関与する遺伝子のノックアウト又はノックダウンを含む試料において、有意により良好なT細胞の増殖（すなわち、T細胞の抑制の低下）が観察されると期待される。そのような遺伝子を、癌治療の標的として、特に、それを阻害することにより潜在的にアブスコパル効果を誘導することができる標的として同定する。

（6.2 実施例2：プール内インビトロスクリーニング）
別のインビトロアプローチでは、96ウェルプレート中のアレイ化形式で行うのではなく、サプレッサー細胞との共培養であるT細胞のプールとして行う点を除いて、先に記載されたものと本質的に同じ方法を使用することができる。T細胞を候補遺伝子のノックダウン又はノックアウトを仲介することができるベクターを有するレンチウイルスに感染させ、厳密にただ一つの細胞がただ1つの弱められた遺伝子を有するものとする。それぞれの遺伝子は、少なくとも500〜1000個の細胞を代表として有する。T細胞抑制アッセイを、抑制的微小環境中で抑制を免れ、かつ増殖することができる任意の細胞が富化するように、プールとして実施する。対象となるベクターを有する細胞はゲノム中に組み込んでおり、従ってベクターの配列決定により、プール中のそれぞれのベクターの相対的表現が決定され、特定のベクターが少しでも多くの比率を占める（又は少ない比率を占める）ならば、T細胞免疫への阻害効果における候補遺伝子の関与を評価することに決定する。

（6.3 実施例3：アブスコパル効果を誘導するための標的のインビボスクリーニング）
候補遺伝子の機能、一部の例では、先に記載のインビトロアッセイからアブスコパル効果の仲介因子として同定された候補遺伝子を、2つの腫瘍が動物において遠位に移植され、一方の腫瘍のみが放射線照射を受けるインビボ系において試験する。放射線照射を受けていない腫瘍への抗腫瘍効果を測定する。遺伝子が放射線照射による免疫抑制反応を仲介するのに重要であるならば、それをT細胞においてノックダウン又はノックアウトすることにより、未処置の腫瘍の抗腫瘍効果が大きく増進する。

ナイーブT細胞を野生型マウス又はTCRを操作されたマウスから単離し、先に記載のインビトロプール内スクリーニングアプローチと同様の、プール化レンチウイルスアプローチを用いて対象となるレンチウイルスベクターで形質導入する。T細胞に対象となるベクターを安定形質導入した後、それぞれの遺伝子について500〜1000個を代表として、これらの細胞を二つの腫瘍を有するマウスに注射して戻す。

1組の動物について、2つの腫瘍の一方のみを、1〜20 Gyの単一の線量の放射線で放射線照射する。第2の組の動物について、腫瘍に放射線照射を行わない。放射線照射に続く7〜20日の期間の後、形質導入されたT細胞（これは、腫瘍を有する動物に由来する内在のT細胞には発現しないか、又は細胞に導入されたベクターによって共発現される、細胞表面上の特定のコンジェニックマーカーの発現によって識別することができる）を、流出領域リンパ節、非流出領域リンパ節、脾臓、及び放射線照射を受けていない腫瘍から単離する。

T細胞からゲノムDNAを抽出し、特定のベクターを増幅し、次世代配列決定法を用いて配列決定する。アブスコパル効果の誘導に関与する候補遺伝子を含むT細胞は、増殖の増進を示すと期待される。対象となる遺伝子がノックダウン又はノックアウトされ、かつ原発性腫瘍が除去放射線照射の存在下にある場合にのみ、T細胞の活性化及び増殖が起こると期待される。従って、反対側の腫瘍が放射線照射を受け、対象となる遺伝子がノックダウンされた場合に、この活性化は未処置の腫瘍に浸潤するT細胞において、及び／または、未処置の腫瘍の縮小において明白となるはずである。対照的に、放射線照射を受けていないマウスにおいては、T細胞の活性化は低く、又は無視できる程度であると予想される。

（6.4 実施例4：インビボshRNAスクリーニング）
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（TNFRSF）、及び免疫グロブリンスーパーファミリーライブラリ（IgSF）を標的とする、二腫瘍マウスモデルにおけるインビボスクリーニングを実施した。650個のshRNAの結果によって代表される、全部で134個の候補遺伝子をスクリーニングした。ここで、これらのファミリーのそれぞれの候補遺伝子につき4〜5個のshRNAを代表とした。いくつかの遺伝子について、shRNAは初期T細胞集団と比較して、試験組織において多くの比率を占めていた。このことは、試験対象の一方の腫瘍が標的化された放射線を受けた場合、TCRによる腫瘍抗原との認識とは無関係に、shRNAを組み込んでいるT細胞クローンの増殖が増進し、かつ該T細胞クローンが蓄積することを示していた。従って、これらの遺伝子は、単独で又は放射線との組合わせで、癌治療の標的として同定された。これらの同定された標的の妥当性は、追加の試験によってさらに裏付けることができる。反対に、試験組織におけるshRNAの選択的欠落を伴う遺伝子は、これらの遺伝子がT細胞の活性化及び阻害において重要な役割を担う可能性が高いことを示唆する。

（プール化shRNAライブラリの構築）
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（TNFRSF）、及び免疫グロブリンスーパーファミリーライブラリ（IgSF）を標的とする3つのshRNAプールを、それぞれの標的遺伝子に対してサブクローニングされた4〜5個のshRNAによって作製した。全てのshRNAコンストラクトを設計し、pLKO.3-Thy1.1にアニーリングされたオリゴヌクレオチドを連結することにより、構築した。pLKO.3-Thy1.1は、マウスナイーブCD8⁺ T細胞において、レンチウイルス形質導入によりThy1.1及びshRNAを共発現するものである。それぞれのshRNAのプールには、21個の緑色蛍光タンパク質（GFP）、16個の赤色蛍光タンパク質（RFP）、25個のルシフェラーゼ、及び20個のLacZを含む、82個の陰性対照shRNAを含めた。

（初代マウスナイーブCD8⁺ T細胞のレンチウイルス形質導入）
初代マウスナイーブCD8⁺ T細胞をマウスナイーブCD8⁺ T細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用いることによって、OT-1トランスジェニックマウス（C57BL/6-Tg（TcraTcrb）1100Mjb/J, The Jackson laboratory）から単離し、低感染多重度（MOI）のレンチウイルスのプールで形質導入した。レンチウイルスの形質導入の前に、単離されたナイーブCD8⁺ T細胞を完全RPMI培地（RPMI 1640、10％ FBS、20 mM HEPES、1 mM ピルビン酸ナトリウム、0.05 mM 2-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン、100 μg/mlストレプトマイシン及び100 μg/mlペニシリン）中のIL-7（5 ng/ml）及びIL 15（100 ng/ml）と共に48時間培養した。CD8⁺ T細胞（ウェル当たり8×10⁶細胞）を硫酸プロタミン（5 μg/ml）を補充したレンチウイルスプールと共に、レトロネクチン試薬（5 μg/ml）でプレコートした6ウェルプレートに播種し、25〜50のMOIで遠心接種により感染させた。OT-I CD8⁺ T細胞をIL-7（2.5 ng/ml）、IL-15（50 ng/ml）、及びIL-2（2 ng/ml）を含む完全RPMI培地中でさらに培養し、その後レンチウイルス感染を行った。感染から48時間後、ウイルスの感染性をThy1.1の発現によって調べた。Thy1.1の発現は、抗Thy1.1-PE抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した。

（CD8⁺ T細胞の腫瘍を有するマウスへの養子移入による腫瘍の治療）
B16-Ova細胞（50 μl中1.5×10⁵細胞）を雄性C57BL/6マウス（10週齢）への表皮注射により接種し、接種後3日ごとに腫瘍サイズを測定し、長さ×幅として計算した。9日目に、脚及び脇腹に同程度のサイズの腫瘍を有する30頭の腫瘍を有するマウスを、非放射線照射（非IR）及び放射線照射（IR）として2群に分けた。放射線照射群は、9日目にshepherdセシウム照射装置を用いてIRの右脚の腫瘍に12 Gyで処置した。11日目に、shRNAプールに感染させたThy1.1陽性CD8⁺ T細胞を、感染後72時間にThy1.1を選択マーカーとして用いてPEポジティブ選択（EasySep（商標）PEポジティブ選択キット, Stem Cells Technologies）により単離した。Thy1.1陽性度90％の単離されたCD8⁺ T細胞（200 ul中5×10⁶細胞）を後眼窩注射によってB16-Ova腫瘍を有するC57BL/6マウスに注射した。腫瘍サイズを移入後2日ごとに測定し、長さ×幅として計算した。最長軸上に20 mm以上の腫瘍を有するマウスは安楽死させた。

（腫瘍を有する養子移入されたC57BL/6からThy1.1陽性のCD8⁺ T細胞を単離する）
リンパ球を、非IR及びIRマウスの脾臓、流入領域リンパ節、非流入領域リンパ節から単離した。腫瘍に浸潤したリンパ球（TIL）を脚及び脇腹の腫瘍から精製し、B16-Ova腫瘍をマウスから採取し、2％ FBSを含むPBSで洗浄した。腫瘍を2％ FBS、50 U/ml IV型コラゲナーゼ（Invitrogen）、及び20 U/ml DNaseI（Roche）を含む15 ml RPMI中に再懸濁し、37℃で2時間インキュベートした。TILをLympholyte-M（Cedarlane Laboratories）を用いることによりさらに単離した。精製されたリンパ球を、抗Vα2-FITC抗体、抗Thy1.1-PE抗体、抗β5V-PerCP抗体、抗CD45-APC抗体、及び抗CD8-eFlour450抗体を用いて蛍光標識した。shRNA発現Thy1.1陽性CD8⁺ T細胞（CD8⁺Vα2⁺Vβ5⁺Thy1.1⁺）をそれぞれの試料から、FACSAria（BD Biosciences）を用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）によって選別した。

（Illumina MiSeq遺伝子分析装置を用いたディープシークエンシング）
収集した試料のゲノムDNAを単離し（DNeasy血液＆組織キット, QIAGEN）、該ゲノムDNAは、ディープシークエンシングアッセイ用のshRNAカセット由来のPCRアンプリコンを生成するための鋳型としての機能を果たした。それぞれのプール中のshRNAの代表を、Illumina製MiSeqを用いたディープシークエンシングによって分析した。データを、それぞれのプールにおける対照shRNAの平均リードを用いて正規化した。

（ディープシークエンシングデータの統計解析）
リードを、Bowtie2を用いて、プールshRNAライブラリのFASTAファイルにマッピングした。倍数変化の計算においてゼロで割ることを避けるため、1単位をそれぞれのクローンの生のカウントに加えた。続いて、それぞれの試料について、カウントデータをその試料の総リード数に対して正規化した。それぞれのクローンに対する正規化したリードカウントを、100万リード当たりのリード（「RPM」）として表した。正規化したリードカウントは、倍数変化の計算に使用した。

以下の表1〜3に示されるように、134遺伝子（650個のshRNAクローン）を対象としたこのスクリーニングの間に、いくつかの遺伝子標的が同定された。例えば、2つの関連するshRNAクローンの発現レベルが、脚の腫瘍から取得したThy1.1陽性CD8⁺ T細胞において、その脚の腫瘍に放射線照射を受けたマウス由来の脾臓から取得した細胞と比較して、2倍超高かった22個の標的遺伝子を同定した。
表1：T細胞由来のshRNA発現の倍数差：非放射線照射脚腫瘍対非放射線照射脾臓

NR: 非放射線照射
NR-脚: 放射線照射を受けていない脚由来の腫瘍
NR-脾臓: 放射線照射を受けていないマウス由来の脾臓
*脚の腫瘍のみが放射線照射を受け、脇腹の腫瘍は放射線照射を受けていない
表2：T細胞由来のshRNA発現の倍数差：非放射線照射脇腹腫瘍対非放射線照射脾臓

NR: 非放射線照射
NR-脚: 放射線照射を受けていない脚由来の腫瘍
NR-脾臓: 放射線照射を受けていないマウス由来の脾臓
*脚の腫瘍のみが放射線照射を受け、脇腹の腫瘍は放射線照射を受けていない
表3：T細胞由来のshRNA発現の倍数差：放射線照射脚腫瘍対脚腫瘍に放射線照射を受けた脾臓

R-脚: 放射線照射を受けた脚の腫瘍由来の腫瘍
R-脾臓: 脚の腫瘍に放射線照射を受けたマウス由来の脾臓
*脚の腫瘍のみが放射線照射を受け、脇腹の腫瘍は放射線照射を受けていない

ある特定の実施態様の例が本明細書で提供されるが、当業者には、様々な変更及び改変を加えることができることが明らかであろう。また、そのような改変は、本件開示の範囲内にあるものとする。

Claims (58)

1. 癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することであって；該非改変T細胞及び該改変T細胞が、それぞれ放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触しており；該改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記測定することを含み、ここで該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法。
2. 前記対象が、1 Gy〜20 Gyの線量で、腫瘍を標的とした放射線を受けている、請求項1記載の方法。
3. 前記活性が、増殖、細胞周期の活性化、細胞死の阻害、サイトカイン産生、及び細胞傷害性活性からなる群から選択される、請求項1又は2記載の方法。
4. それぞれ放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触した、前記非改変T細胞の活性及び前記改変T細胞の活性を測定することをさらに含み；ここで該非改変T細胞及び該改変T細胞における活性が実質的に同じである、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
5. 癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、
   (i) 非改変T細胞及び改変T細胞を放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象に注射することであって；該改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること、並びに
   (ii) 該試験対象における該非改変T細胞の活性及び該改変T細胞の活性を測定することであって、該活性が、増殖活性又は抗腫瘍活性である、前記測定すること、を含み、
   ここで、該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法。
6. 前記改変T細胞が参照T細胞である、請求項5記載の方法。
7. 前記対象が、1 Gy〜20 Gyの線量で、腫瘍を標的とした放射線を受けている、請求項5記載の方法。
8. 前記非改変T細胞及び前記改変T細胞を、放射線照射を受けていない試験対象に注射することをさらに含み、ここで該放射線照射を受けていない試験対象において該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、前記活性が実質的に同じである、請求項5記載の方法。
9. 前記活性が、注射されたT細胞の蓄積により測定される増殖活性である、請求項5〜8のいずれか1項記載の方法。
10. 前記活性が、腫瘍細胞の死又は腫瘍サイズの低下により測定される抗腫瘍活性である、請求項5〜8のいずれか１項記載の方法。
11. 前記活性が、試験対象の生存の増加により測定される抗腫瘍活性である、請求項5〜8のいずれか1項記載の方法。
12. 前記試験対象がマウスである、請求項5〜11のいずれか1項記載の方法。
13. 前記マウスが二腫瘍マウスであり、一方の腫瘍のみが標的化された放射線を受けている、請求項12記載の方法。
14. 前記活性が、放射線照射を受けていない腫瘍のサイズの低下により測定される抗腫瘍活性である、請求項13記載の方法。
15. 前記T細胞がナイーブT細胞である、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
16. 前記T細胞がCD8⁺ T細胞である、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
17. 前記T細胞がマウスから単離されたものである、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
18. 前記マウスが野生型である、請求項17記載の方法。
19. 前記マウスが、マウスにおいて天然には存在しない抗原に対して特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されている、請求項17記載の方法。
20. 前記抗原がオボアルブミンである、請求項19記載の方法。
21. 前記T細胞が標識されている、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
22. 前記標識がカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）である、請求項21記載の方法。
23. 前記候補遺伝子が、shRNAによってノックダウン又はノックアウトされている、請求項1〜22のいずれか1項記載の方法。
24. ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項23記載の方法。
25. 前記候補遺伝子が、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることにより、前記改変T細胞においてノックダウン又はノックアウトされている、請求項1〜22のいずれか1項記載の方法。
26. 前記候補遺伝子が、CAS9（CRISPR）を用いることにより、前記改変T細胞においてノックダウン又はノックアウトされている、請求項1〜22のいずれか1項記載の方法。
27. 癌治療の標的遺伝子を同定するプールスクリーニング方法であって、
    (i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び
    (ii) 該T細胞の初期集団をある期間にわたり放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触させて、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み、
    ここで、該T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている該候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する、前記プールスクリーニング方法。
28. 癌治療の標的遺伝子を同定するインビボプールスクリーニング方法であって、
    (i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び
    (ii) 該T細胞の初期集団を放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に注射することであって、該T細胞の初期集団が該対象においてT細胞の選択された集団を産生する、前記注射すること、を含み、
    ここで、該T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている該候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する、前記プールスクリーニング方法。
29. T細胞の初期集団を調製することが、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることを含む、請求項27又は28記載のプールスクリーニング方法。
30. T細胞の初期集団を調製することが、CAS9（CRISPR）を用いることを含む、請求項27又は28記載のプールスクリーニング方法。
31. T細胞の初期集団を調製することが、shRNAライブラリにT細胞を感染させることを含む、請求項27又は28記載のプールスクリーニング方法。
32. 前記shRNAライブラリがレンチウイルスベクターライブラリである、請求項31記載のプールスクリーニング方法。
33. 前記初期集団のT細胞がナイーブT細胞である、請求項27〜32のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
34. 前記初期集団のT細胞がCD8⁺ T細胞である、請求項27〜33のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
35. 前記初期集団のT細胞がマウスから単離されたものである、請求項27〜34のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
36. 前記マウスが野生型である、請求項35記載のプールスクリーニング方法。
37. 前記マウスが、マウスにおいて天然には存在しない抗原に対して特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されている、請求項35記載のプールスクリーニング方法。
38. 前記抗原がオボアルブミンである、請求項37記載のプールスクリーニング方法。
39. 前記T細胞の初期集団が標識されている、請求項27〜38のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
40. 前記標識がカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）である、請求項39記載のプールスクリーニング方法。
41. 前記T細胞の選択された集団を前記試験対象の試料から単離することを含む、請求項27〜40のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
42. 前記試料が腫瘍試料である、請求項41記載のプールスクリーニング方法。
43. 前記腫瘍試料が標的化された放射線を受けたものである、請求項42記載のプールスクリーニング方法。
44. 前記試験対象が二腫瘍モデルであり、かつ前記腫瘍試料が標的化された放射線を受けたものでない、請求項42記載のプールスクリーニング方法。
45. 前記試料が非腫瘍試料である、請求項41記載のプールスクリーニング方法。
46. 前記非腫瘍組織試料が脾臓試料又はリンパ節試料である、請求項45記載のプールスクリーニング方法。
47. 前記T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている候補遺伝子を、該T細胞の選択された集団から単離されたゲノムDNAのNGSにより同定する、請求項27〜46のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
48. 前記初期集団のそれぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子に対するshRNAを有し、かつ前記T細胞の初期集団と比較して、前記T細胞の選択された集団において該候補遺伝子に対する該shRNAが富化されている場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同定する、請求項31〜46のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
49. 非腫瘍組織試料と比較して、腫瘍試料から取得した前記T細胞の選択された集団において、候補遺伝子に対する前記shRNAが富化されている場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同定する、請求項48記載のプールスクリーニング方法。
50. 前記非腫瘍組織試料と比較して、前記腫瘍試料において候補遺伝子に対する前記shRNAが2倍超富化されている場合に、該候補遺伝子を標的遺伝子として同定する、請求項48記載のプールスクリーニング方法。
51. 前記非腫瘍組織試料と比較して、前記腫瘍試料において候補遺伝子に対する前記shRNAが3倍超、4倍超、5倍超、10倍超、15倍超、又は20倍超富化されている場合に、該候補遺伝子を標的遺伝子として同定する、請求項48記載のプールスクリーニング方法。
52. 前記T細胞の選択された集団におけるshRNAをNGSにより定量化することを含む、請求項48〜51のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
53. T細胞の、請求項1〜52のいずれか1項において同定された前記標的遺伝子を阻害することにより、該T細胞を活性化させる方法。
54. 前記T細胞が腫瘍を有する対象において存在する、請求項53記載の方法。
55. 前記腫瘍を有する対象が放射線照射を受けている、請求項54記載の方法。
56. それを必要とする対象において癌を治療するための方法であって、請求項1〜52のいずれか1項において同定された前記標的遺伝子を阻害することを含む、前記方法。
57. それを必要とする対象において癌を治療するための方法であって、請求項1〜52のいずれか1項において同定された前記標的遺伝子が、ノックダウン又はノックアウトされているT細胞を用いて、前記対象にT細胞療法を施すことを含む、前記方法。
58. 前記対象に、腫瘍を標的とした放射線を施すことをさらに含む、請求項56又は57記載の方法。

Images