JPH04222527A - トマトの形質転換方法 - Google Patents
トマトの形質転換方法Info
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- JPH04222527A JPH04222527A JP41168190A JP41168190A JPH04222527A JP H04222527 A JPH04222527 A JP H04222527A JP 41168190 A JP41168190 A JP 41168190A JP 41168190 A JP41168190 A JP 41168190A JP H04222527 A JPH04222527 A JP H04222527A
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Links
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はトマトの形質転換方法に
係り、特に、細菌のAgrobacterium tu
mefaciens を用いたトマトの形質転換方法に
関する。
係り、特に、細菌のAgrobacterium tu
mefaciens を用いたトマトの形質転換方法に
関する。
【0002】
【従来の技術】トマトは主要作物の1つであり、その品
種改良は重要である。トマトの品種改良を形質転換法に
より行うことが従来より研究されている。従来より、ト
マトの形質転換方法として、細菌のAgrobacte
rium tumefaciens を用いた方法がい
くつか報告されている(マコーミックら著、Plant
Cell Report 5:81−84 、198
7年、チイ及びフィリップス著、Plant Cell
Report 6:105−108 、1987年、
デ・ブロックら著、EMBO J. 6:2513−2
518 、1987年)。このAgrobacteri
um tumefaciens は植物細胞を形質転換
し、腫瘍化する能力を有する土壌細菌であり、この細菌
には腫瘍誘導性プラスミド(Tiプラスミド)が含まれ
ている。Tiプラスミドにおいて重要な部位は形質転換
に関与する領域であるヴィルレンス領域と、植物細胞に
転移される腫瘍化遺伝子が含まれているT領域である。 そして、T領域においては、腫瘍化遺伝子の転移に必須
の部分はT領域においてその両端に位置する境界配列と
呼ばれる領域のみである。Agrobacterium
tumefaciens としては、これまで多くの
菌種が単離されており、その中でLBA4404という
菌種はT領域が除去されたTiプラスミドを有する非腫
瘍誘導性菌系であり、形質転換に用いるのに都合がよい
。 また、A281という菌種は、特に強病原性であるとが
知られており、形質転換効率が極めて高い。この性質は
、A281に含まれるTiプラスミドpTiBo542
のヴィルレンス領域の能力が高いことによる(フッドら
、Bio/Technol 、2:702−709 、
1984年、フッドら、J. Bacteriol.
、168:1283−1209 、1986年、コマリ
ら、J. Bacteriol. 、166:88−9
4 、1986年、ジンら、J. Bacteriol
. 、169:4417−4425 、1987年、コ
マリ、Plant Science 、60:223−
229、1989年)。従って、このA281という菌
種を植物の形質転換実験に使用することも可能である。
種改良は重要である。トマトの品種改良を形質転換法に
より行うことが従来より研究されている。従来より、ト
マトの形質転換方法として、細菌のAgrobacte
rium tumefaciens を用いた方法がい
くつか報告されている(マコーミックら著、Plant
Cell Report 5:81−84 、198
7年、チイ及びフィリップス著、Plant Cell
Report 6:105−108 、1987年、
デ・ブロックら著、EMBO J. 6:2513−2
518 、1987年)。このAgrobacteri
um tumefaciens は植物細胞を形質転換
し、腫瘍化する能力を有する土壌細菌であり、この細菌
には腫瘍誘導性プラスミド(Tiプラスミド)が含まれ
ている。Tiプラスミドにおいて重要な部位は形質転換
に関与する領域であるヴィルレンス領域と、植物細胞に
転移される腫瘍化遺伝子が含まれているT領域である。 そして、T領域においては、腫瘍化遺伝子の転移に必須
の部分はT領域においてその両端に位置する境界配列と
呼ばれる領域のみである。Agrobacterium
tumefaciens としては、これまで多くの
菌種が単離されており、その中でLBA4404という
菌種はT領域が除去されたTiプラスミドを有する非腫
瘍誘導性菌系であり、形質転換に用いるのに都合がよい
。 また、A281という菌種は、特に強病原性であるとが
知られており、形質転換効率が極めて高い。この性質は
、A281に含まれるTiプラスミドpTiBo542
のヴィルレンス領域の能力が高いことによる(フッドら
、Bio/Technol 、2:702−709 、
1984年、フッドら、J. Bacteriol.
、168:1283−1209 、1986年、コマリ
ら、J. Bacteriol. 、166:88−9
4 、1986年、ジンら、J. Bacteriol
. 、169:4417−4425 、1987年、コ
マリ、Plant Science 、60:223−
229、1989年)。従って、このA281という菌
種を植物の形質転換実験に使用することも可能である。
【0003】一般に、Agrobacterium t
umefaciens を用いたトマトの形質転換方法
において、トマトに導入しようとするDNA断片はTi
プラスミドのT領域の2つの境界配列の間に配置される
。このDNA断片はAgrobacterium tu
mefaciens 中においてTiプラスミド又は他
のプラスミド上に配置され、この細菌中のTiプラスミ
ドのヴィルレンス領域中の遺伝子の機能により植物細胞
に転移されるものである。そして、従来の技術において
は、ヴィルレンス領域の遺伝子としては、Agroba
cterium tumefaciens に内在する
Tiプラスミドのみが利用されていた。
umefaciens を用いたトマトの形質転換方法
において、トマトに導入しようとするDNA断片はTi
プラスミドのT領域の2つの境界配列の間に配置される
。このDNA断片はAgrobacterium tu
mefaciens 中においてTiプラスミド又は他
のプラスミド上に配置され、この細菌中のTiプラスミ
ドのヴィルレンス領域中の遺伝子の機能により植物細胞
に転移されるものである。そして、従来の技術において
は、ヴィルレンス領域の遺伝子としては、Agroba
cterium tumefaciens に内在する
Tiプラスミドのみが利用されていた。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、LBA
4404 を用いたトマトの形質転換方法においては、
形質転換の効率が極めて低い場合があり、また、品種に
よっては形質転換が著しく困難である。また、A281
を用いた形質転換方法においては、LBA4404 を
用いた形質転換方法よりも形質転換効率は高いが、奇形
植物が出現する例もあった。本発明は上述した点に鑑み
て創案されたものであり、形質転換の効率の高いトマト
の形質転換方法を提供することを目的とする。
4404 を用いたトマトの形質転換方法においては、
形質転換の効率が極めて低い場合があり、また、品種に
よっては形質転換が著しく困難である。また、A281
を用いた形質転換方法においては、LBA4404 を
用いた形質転換方法よりも形質転換効率は高いが、奇形
植物が出現する例もあった。本発明は上述した点に鑑み
て創案されたものであり、形質転換の効率の高いトマト
の形質転換方法を提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】本願発明者は効率の高い
トマトの形質転換方法について鋭意研究を行った結果、
pTiBo542のヴィルレンス領域由来のDNA断片
を含有するプラスミドを導入したAgrobacter
ium tumefaciens を用いることにより
高効率でトマトの形質転換を行うことができることを見
い出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、A
grobacterium tumefaciensの
TiプラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域由
来のDNA領域を含むプラスミドを導入したAgrob
acterium tumefaciens でトマト
を形質転換することから成るトマトの形質転換方法を提
供する。
トマトの形質転換方法について鋭意研究を行った結果、
pTiBo542のヴィルレンス領域由来のDNA断片
を含有するプラスミドを導入したAgrobacter
ium tumefaciens を用いることにより
高効率でトマトの形質転換を行うことができることを見
い出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、A
grobacterium tumefaciensの
TiプラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域由
来のDNA領域を含むプラスミドを導入したAgrob
acterium tumefaciens でトマト
を形質転換することから成るトマトの形質転換方法を提
供する。
【0006】以下、本発明について詳細に説明する。上
述のように、本発明の方法においては、Tiプラスミド
pTiBo542のヴィルレンス領域由来のDNA領域
を含有するプラスミドを用いる。pTiBo542は、
上記したように、フッドら、ジンら及びコマリらの各文
献に記載された公知のプラスミドであり、Americ
an Type Culture Collectio
n(受託番号 37349)から入手可能なものである
。pTiBo542のヴィルレンス領域にはvirB、
virC、virGなどの遺伝子が存在するが、pT
iBo542を制限酵素Kpn I で切断すると、v
irB、 virC及びvirG遺伝子を含む15.2
kb の断片が得られ、これをpTiBo542のヴ
ィルレンス領域由来のDNA領域として利用することが
できる。
述のように、本発明の方法においては、Tiプラスミド
pTiBo542のヴィルレンス領域由来のDNA領域
を含有するプラスミドを用いる。pTiBo542は、
上記したように、フッドら、ジンら及びコマリらの各文
献に記載された公知のプラスミドであり、Americ
an Type Culture Collectio
n(受託番号 37349)から入手可能なものである
。pTiBo542のヴィルレンス領域にはvirB、
virC、virGなどの遺伝子が存在するが、pT
iBo542を制限酵素Kpn I で切断すると、v
irB、 virC及びvirG遺伝子を含む15.2
kb の断片が得られ、これをpTiBo542のヴ
ィルレンス領域由来のDNA領域として利用することが
できる。
【0007】一方、本発明の方法において、Agrob
acteriumtumefaciens に導入され
るプラスミドは、TiプラスミドのT領域を有するDN
A領域を含む。T領域は、Tiプラスミドまたはそれか
ら誘導された公知の各種プラスミド中に含まれており、
また、このようなT領域中に適当な制限酵素部位を有す
るものも知られているので、このようなプラスミドに上
記ヴィルレンス領域由来DNA領域を組み込むことによ
り、Agrobacterium tumefacie
ns に導入すべきプラスミドを構築することができる
。
acteriumtumefaciens に導入され
るプラスミドは、TiプラスミドのT領域を有するDN
A領域を含む。T領域は、Tiプラスミドまたはそれか
ら誘導された公知の各種プラスミド中に含まれており、
また、このようなT領域中に適当な制限酵素部位を有す
るものも知られているので、このようなプラスミドに上
記ヴィルレンス領域由来DNA領域を組み込むことによ
り、Agrobacterium tumefacie
ns に導入すべきプラスミドを構築することができる
。
【0008】下記実施例においては、pTiBo542
のヴィルレンス領域由来のクローン化されたDNA断片
を含有するプラスミドの一例として、pTOK162
を構築した。その構造を図1に示す。このプラスミドは
、大腸菌及びAgrobacterium tumef
aciens 中で増殖可能であるpTOK154 と
呼ばれるプラスミド(Tiプラスミドから誘導された公
知のpGA472プラスミドとpVCK101 と呼ば
れる公知の広宿主域プラスミドから後述の方法により構
築された、T領域を含むプラスミド)にpTiBo54
2のヴィルレンス領域由来の既にクローン化されていた
上記15.2キロベースのKpnl断片(virB、v
irG、virC各遺伝子を含む)を組み込んだもので
ある。このpTOK154 には、T領域の2つの境界
配列とその間にトマトに導入しようとする遺伝子として
カナマイシン耐性遺伝子が配列されており、本実施例は
、トマトに導入しようとする遺伝子がpTiBo542
のヴィルレンス領域由来のクローン化されたDNA断片
を含有するプラスミド上に配置されている例である。
のヴィルレンス領域由来のクローン化されたDNA断片
を含有するプラスミドの一例として、pTOK162
を構築した。その構造を図1に示す。このプラスミドは
、大腸菌及びAgrobacterium tumef
aciens 中で増殖可能であるpTOK154 と
呼ばれるプラスミド(Tiプラスミドから誘導された公
知のpGA472プラスミドとpVCK101 と呼ば
れる公知の広宿主域プラスミドから後述の方法により構
築された、T領域を含むプラスミド)にpTiBo54
2のヴィルレンス領域由来の既にクローン化されていた
上記15.2キロベースのKpnl断片(virB、v
irG、virC各遺伝子を含む)を組み込んだもので
ある。このpTOK154 には、T領域の2つの境界
配列とその間にトマトに導入しようとする遺伝子として
カナマイシン耐性遺伝子が配列されており、本実施例は
、トマトに導入しようとする遺伝子がpTiBo542
のヴィルレンス領域由来のクローン化されたDNA断片
を含有するプラスミド上に配置されている例である。
【0009】トマトに組み込もうとする所望の遺伝子は
、上記プラスミドのT領域中の制限酵素部位に常法によ
り組み込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等
の適当な選択マーカーに基づいて選択することができる
。もっとも、第1図に示すpTOK162 のように、
大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクロー
ニングの手法では所望のDNAをT領域内に導入するこ
とが必ずしも容易ではないことがある。このような場合
には、Agrobacterium tumefaci
ens 細胞内のin vivo 系での相同組換え(
ヘレラ−エステレラら、EMBO J.2:987−9
95、1983年、ホーチら、Science、223
:496ー498、1984年)を利用することにより
、目的のDNAをpTOK162 に導入することが可
能になる。すなわち、例えば、先ず、pTOK162
をAgrobacterium tumefacien
sに導入しておいて、この菌にさらに所望DNAを導入
したpBR322と呼ばれるプラスミド(類似のプラス
ミドを含む)を導入する。pTOK162のDNAには
pBR322と相同な部分があるので、pBR322誘
導体は相同配列を介した組み換えによりpTOK612
に組み込まれることになる。pBR322はpTOK
162 と異なりAgrobacterium tum
efaciens 中では複製できないので、このよう
な組み込まれた状態(pTOK162::pBR322
誘導体という)でなければAgrobacteriu
m tumefaciens 中で生存することができ
ない。そして、pTOK162 とpBR322誘導体
のそれぞれに特異的な特性(薬剤耐性等)について選抜
すれば、pTOK162::pBR322 誘導体を有
するAgrobacterium tumefacie
ns を得ることができる。さらに、pTOK162
を有するAgrobacterium tumefac
iens に各種のプラスミドを導入して研究したとこ
ろ、pBR322誘導体の選抜マーカーとしては、トラ
ンスポゾンTn7(デグリーブら、Plasmid 6
:235−248、1981)由来のスペクチノマシ
ン耐性遺伝子(streptomycin/spect
inomycin phosphotransfera
se, SPT) が優れていることが判明した。従っ
て、すでに所望の遺伝子がpBR322にクローン化さ
れている場合には、SPT遺伝子をそのプラスミドに挿
入すれば、Agrobacterium tumefa
ciens 内の相同組替えにより、pTOK162
のT領域に所望の遺伝子を導入することができる。また
その他の場合には、pBR322由来のDNAとSPT
遺伝子から構成されるプラスミドを用意しておいて、こ
れに所望の遺伝子を挿入する方法も考えられる。この際
、T領域の境界配列を活用すれば、最終的に、pTOK
162 上において、カナマイシン耐性遺伝子と所望の
遺伝子を別々のT領域中に配置することも可能である。 カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形質転換した
場合、両T領域とも導入される場合も相当の比率で生じ
るわけであるので、目的遺伝子の導入は十分達成できる
。また、両T領域が別々の染色体に組み込まれる場合も
あり得るので、後に目的の遺伝子をカナマイシン耐性遺
伝子から分離することも可能となる。
、上記プラスミドのT領域中の制限酵素部位に常法によ
り組み込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等
の適当な選択マーカーに基づいて選択することができる
。もっとも、第1図に示すpTOK162 のように、
大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクロー
ニングの手法では所望のDNAをT領域内に導入するこ
とが必ずしも容易ではないことがある。このような場合
には、Agrobacterium tumefaci
ens 細胞内のin vivo 系での相同組換え(
ヘレラ−エステレラら、EMBO J.2:987−9
95、1983年、ホーチら、Science、223
:496ー498、1984年)を利用することにより
、目的のDNAをpTOK162 に導入することが可
能になる。すなわち、例えば、先ず、pTOK162
をAgrobacterium tumefacien
sに導入しておいて、この菌にさらに所望DNAを導入
したpBR322と呼ばれるプラスミド(類似のプラス
ミドを含む)を導入する。pTOK162のDNAには
pBR322と相同な部分があるので、pBR322誘
導体は相同配列を介した組み換えによりpTOK612
に組み込まれることになる。pBR322はpTOK
162 と異なりAgrobacterium tum
efaciens 中では複製できないので、このよう
な組み込まれた状態(pTOK162::pBR322
誘導体という)でなければAgrobacteriu
m tumefaciens 中で生存することができ
ない。そして、pTOK162 とpBR322誘導体
のそれぞれに特異的な特性(薬剤耐性等)について選抜
すれば、pTOK162::pBR322 誘導体を有
するAgrobacterium tumefacie
ns を得ることができる。さらに、pTOK162
を有するAgrobacterium tumefac
iens に各種のプラスミドを導入して研究したとこ
ろ、pBR322誘導体の選抜マーカーとしては、トラ
ンスポゾンTn7(デグリーブら、Plasmid 6
:235−248、1981)由来のスペクチノマシ
ン耐性遺伝子(streptomycin/spect
inomycin phosphotransfera
se, SPT) が優れていることが判明した。従っ
て、すでに所望の遺伝子がpBR322にクローン化さ
れている場合には、SPT遺伝子をそのプラスミドに挿
入すれば、Agrobacterium tumefa
ciens 内の相同組替えにより、pTOK162
のT領域に所望の遺伝子を導入することができる。また
その他の場合には、pBR322由来のDNAとSPT
遺伝子から構成されるプラスミドを用意しておいて、こ
れに所望の遺伝子を挿入する方法も考えられる。この際
、T領域の境界配列を活用すれば、最終的に、pTOK
162 上において、カナマイシン耐性遺伝子と所望の
遺伝子を別々のT領域中に配置することも可能である。 カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形質転換した
場合、両T領域とも導入される場合も相当の比率で生じ
るわけであるので、目的遺伝子の導入は十分達成できる
。また、両T領域が別々の染色体に組み込まれる場合も
あり得るので、後に目的の遺伝子をカナマイシン耐性遺
伝子から分離することも可能となる。
【0010】プラスミドをAgrobacterium
tumefaciens に導入する操作は従来法に
より行うことができ、例えば、細菌の三系交雑手法(デ
ィッタら、Pro.Natl.Acad.Sci.US
A、77:7347−7351、1980年)により行
うことができる。
tumefaciens に導入する操作は従来法に
より行うことができ、例えば、細菌の三系交雑手法(デ
ィッタら、Pro.Natl.Acad.Sci.US
A、77:7347−7351、1980年)により行
うことができる。
【0011】このようにして調製されるAgrobac
teriumtumefaciens には、pTOK
162 由来のヴィルレンス能力の高いDNAが含まれ
るので、高い効率でトマトの形質転換を行うことが可能
である。また、本発明においては病原性の高いA281
のような菌種を直接的に用いるものではないので、奇形
等が生じるおそれが小さい。
teriumtumefaciens には、pTOK
162 由来のヴィルレンス能力の高いDNAが含まれ
るので、高い効率でトマトの形質転換を行うことが可能
である。また、本発明においては病原性の高いA281
のような菌種を直接的に用いるものではないので、奇形
等が生じるおそれが小さい。
【0012】尚、本発明においては、トマトに導入しよ
うとする遺伝子は、従来の技術と同様にT領域の境界配
列の間に配置されるものであるが、Agrobacte
rium tumefaciens 中で、Tiプラス
ミド上に配置されてもよく又は他のプラスミド上に配置
されてもよい。
うとする遺伝子は、従来の技術と同様にT領域の境界配
列の間に配置されるものであるが、Agrobacte
rium tumefaciens 中で、Tiプラス
ミド上に配置されてもよく又は他のプラスミド上に配置
されてもよい。
【0013】本発明において、トマトの形質転換は、従
来法と同様に行うことができる。例えば、上記プラスミ
ドを導入したAgrobacterium tumef
aciens とトマトの子葉断片を液体培地中で共存
培養すること等により行われる。
来法と同様に行うことができる。例えば、上記プラスミ
ドを導入したAgrobacterium tumef
aciens とトマトの子葉断片を液体培地中で共存
培養すること等により行われる。
【0014】
【発明の効果】以上のように構成した本発明によれば、
Agrobacterium tumefaciens
pにTiBo542 由来のヴィルレンス能力が高いD
NAが導入されているので、高効率でトマトの形質転換
を行うことが可能になるという効果が奏される。また、
直接的に病原性の高い菌種を用いるものではないので、
トマトの形質転換を行う際、奇形等が生じるおそれが小
さいという効果が奏される。
Agrobacterium tumefaciens
pにTiBo542 由来のヴィルレンス能力が高いD
NAが導入されているので、高効率でトマトの形質転換
を行うことが可能になるという効果が奏される。また、
直接的に病原性の高い菌種を用いるものではないので、
トマトの形質転換を行う際、奇形等が生じるおそれが小
さいという効果が奏される。
【0015】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。なお、下記実施例に
おいて、各操作は、特に断りがない限り、ティー・マニ
アティスら、Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor, 1982
に記載の方法により行った。
はこれに限定されるものではない。なお、下記実施例に
おいて、各操作は、特に断りがない限り、ティー・マニ
アティスら、Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor, 1982
に記載の方法により行った。
【0016】(1) pTOK162 の調製広宿主域
プラスミドであるpVCK101 (ナウフとネスター
、Plasmid 8:45−54、1982年、ネス
ターより入手可能)からEco RI部位を取り除くた
め、これをEco RIで切断し、クレノウ酵素処理に
より末端を平滑末端とした後、再び環状化した。また、
バイナリーベクターであるpGA472(アンら、EM
BO J.4:277−284、1985年に記載、ア
ンより入手可能)をHindIIIとBgl IIで切
断し、クレノウ酵素処理後再び環状化することによって
、T領域からHindIII、BamHI 、Sal
I 、BglIIの各認識部位を除去した。この分子か
ら、T領域を含むSal I 断片を取り出し、クレノ
ウ酵素処理後、HindIII、Sal I 、Xba
I 、BamHI 、Kpn I 、Sac I の
各認識部位を有する合成リンカーDNAを結合させ環状
化した。さらに、これをSal I により開環し、上
記のpVCK101 誘導体のXho I 部位とHi
ndIII部位の間に挿入しpTOK154 を作製し
た。この操作を図2に示す。上記の記載からわかるよう
に、pTOK154 は、T領域外にSst I 、K
pn I 、XbaI 、Bgl II及びHindI
II、Sal I の唯一の認識部位を持っている。 また、pVCK101のEco RI部位を除去したの
で、T領域内に唯一のEco RI部位が存在する。こ
の部位に外来DNA断片を挿入し、植物ゲノムに導入す
ることができるので、他の実験にも応用可能である。一
方、pTiBo542をKpn I で消化し、ヴィル
レンス領域内のvirB、virG及びvirC遺伝子
を含む15.2 kb の断片を切り出し、これをpU
C19のKpn I 部位に挿入し、クローニングした
。これを、上記pTOK154 のKpn I 部位に
挿入し、図1に示すpTOK162 を作製した。
プラスミドであるpVCK101 (ナウフとネスター
、Plasmid 8:45−54、1982年、ネス
ターより入手可能)からEco RI部位を取り除くた
め、これをEco RIで切断し、クレノウ酵素処理に
より末端を平滑末端とした後、再び環状化した。また、
バイナリーベクターであるpGA472(アンら、EM
BO J.4:277−284、1985年に記載、ア
ンより入手可能)をHindIIIとBgl IIで切
断し、クレノウ酵素処理後再び環状化することによって
、T領域からHindIII、BamHI 、Sal
I 、BglIIの各認識部位を除去した。この分子か
ら、T領域を含むSal I 断片を取り出し、クレノ
ウ酵素処理後、HindIII、Sal I 、Xba
I 、BamHI 、Kpn I 、Sac I の
各認識部位を有する合成リンカーDNAを結合させ環状
化した。さらに、これをSal I により開環し、上
記のpVCK101 誘導体のXho I 部位とHi
ndIII部位の間に挿入しpTOK154 を作製し
た。この操作を図2に示す。上記の記載からわかるよう
に、pTOK154 は、T領域外にSst I 、K
pn I 、XbaI 、Bgl II及びHindI
II、Sal I の唯一の認識部位を持っている。 また、pVCK101のEco RI部位を除去したの
で、T領域内に唯一のEco RI部位が存在する。こ
の部位に外来DNA断片を挿入し、植物ゲノムに導入す
ることができるので、他の実験にも応用可能である。一
方、pTiBo542をKpn I で消化し、ヴィル
レンス領域内のvirB、virG及びvirC遺伝子
を含む15.2 kb の断片を切り出し、これをpU
C19のKpn I 部位に挿入し、クローニングした
。これを、上記pTOK154 のKpn I 部位に
挿入し、図1に示すpTOK162 を作製した。
【0017】(2) pTOK162 のAgroba
cterium tumefaciens 内への導入 このようにして得られたpTOK162 をAgrob
acterium tumefaciens の菌種L
BA4404 (文献:ホエケマら、Nature、3
03:179−180、1983年)に導入し、LBA
4404(pTOK162)を得た。導入は、上記の三
系交雑手法により行った。
cterium tumefaciens 内への導入 このようにして得られたpTOK162 をAgrob
acterium tumefaciens の菌種L
BA4404 (文献:ホエケマら、Nature、3
03:179−180、1983年)に導入し、LBA
4404(pTOK162)を得た。導入は、上記の三
系交雑手法により行った。
【0018】(3) トマトの形質転換LBA4404
(pTOK162 )を得て、トマトの形質転換実験
を行い、LBA4404 (pGA482)と比較した
。尚、このpGA482というプラスミドはpTiBo
542由来のDNAを含まないプラスミドである。形質
転換は、トマト品種モモタロウの種子を滅菌し、無菌的
に発芽させた植物の子葉を材料として行った。すなわち
、LinsmaierandSkoog (1965年
)の無機塩類と30g/lのグルコースより成る液体培
地中でこの子葉の断片約1gと、Agrobacter
iumtumefaciens 約108 細胞とを4
8時間共存培養した。そして、子葉断片を洗浄し、細菌
を洗い落とした後、子葉断片をカナマイシン100mg
/l、セフォタキシム250mg/l、インドール酢酸
0.3mg/l、イソペンテニルアデニン10mg/l
を含む寒天(0.9%)培地に置床し、15日間培養を
行った。その結果、KBA4404(pTOK163)
で処理した子葉断片108個のうち、41個の断片から
カナマイシン耐性のカルスが出現した。また、これらの
カルスを、上記寒天培地で引き続き25日間培養し、カ
ナマイシン耐性の茎葉を得た。これらの茎葉をリンスマ
イヤーとスクーグ(1965年)の無機塩類と30g/
lのショ糖を含む寒天培地に移植することによって再分
化植物を誘導したところ、1カルスにつき2個体の頻度
で再分化植物が得られた。また、対照として、LBA4
404(pTOK162)で処理するかわりに、LBA
4404(pTOK482)で処理した子葉断片を用い
て同様の実験を行った。その結果、120個の断片を供
試したにもかかわらず、カナマイシン耐性カルスは全く
出現しなかった。以上の結果から、LBA4404(p
TOK162)で処理することにより、約4割の子葉断
片よりカナマイシン耐性の形質転換植物が得られたのに
対し、LBA4404(pTOK482)で処理を行っ
ても形質転換植物は全く得ることはできず、本発明の効
果は明かであった。
(pTOK162 )を得て、トマトの形質転換実験
を行い、LBA4404 (pGA482)と比較した
。尚、このpGA482というプラスミドはpTiBo
542由来のDNAを含まないプラスミドである。形質
転換は、トマト品種モモタロウの種子を滅菌し、無菌的
に発芽させた植物の子葉を材料として行った。すなわち
、LinsmaierandSkoog (1965年
)の無機塩類と30g/lのグルコースより成る液体培
地中でこの子葉の断片約1gと、Agrobacter
iumtumefaciens 約108 細胞とを4
8時間共存培養した。そして、子葉断片を洗浄し、細菌
を洗い落とした後、子葉断片をカナマイシン100mg
/l、セフォタキシム250mg/l、インドール酢酸
0.3mg/l、イソペンテニルアデニン10mg/l
を含む寒天(0.9%)培地に置床し、15日間培養を
行った。その結果、KBA4404(pTOK163)
で処理した子葉断片108個のうち、41個の断片から
カナマイシン耐性のカルスが出現した。また、これらの
カルスを、上記寒天培地で引き続き25日間培養し、カ
ナマイシン耐性の茎葉を得た。これらの茎葉をリンスマ
イヤーとスクーグ(1965年)の無機塩類と30g/
lのショ糖を含む寒天培地に移植することによって再分
化植物を誘導したところ、1カルスにつき2個体の頻度
で再分化植物が得られた。また、対照として、LBA4
404(pTOK162)で処理するかわりに、LBA
4404(pTOK482)で処理した子葉断片を用い
て同様の実験を行った。その結果、120個の断片を供
試したにもかかわらず、カナマイシン耐性カルスは全く
出現しなかった。以上の結果から、LBA4404(p
TOK162)で処理することにより、約4割の子葉断
片よりカナマイシン耐性の形質転換植物が得られたのに
対し、LBA4404(pTOK482)で処理を行っ
ても形質転換植物は全く得ることはできず、本発明の効
果は明かであった。
【0019】尚、本発明は以上の実施例に限定されるも
のでなくその主旨を逸脱しない範囲で適宜変更を加える
ことが可能である。例えば、Agrobacteriu
m tumefaciens 中にTiプラスミドと、
バイナリーベクターと、pTiBo542由来のDNA
断片を含むプラスミドの計3個のプラスミドを同居させ
ることも可能である。
のでなくその主旨を逸脱しない範囲で適宜変更を加える
ことが可能である。例えば、Agrobacteriu
m tumefaciens 中にTiプラスミドと、
バイナリーベクターと、pTiBo542由来のDNA
断片を含むプラスミドの計3個のプラスミドを同居させ
ることも可能である。
【図1】pTOK162 プラスミドの構造を示す図。
【図2】pTOK162 プラスミドの中間体であるp
TOK154を構築する操作を示す図。
TOK154を構築する操作を示す図。
Claims (3)
- 【請求項1】 Agrobacterium tum
efaciens のTiプラスミドpTiBo542
のヴィルレンス領域由来のDNA領域を含むプラスミド
を導入したAgrobacterium tumefa
ciens でトマトを形質転換することから成るトマ
トの形質転換方法。 - 【請求項2】 前記pTiBo542のヴィルレンス
領域由来のDNAは、virB、virG及びvirC
遺伝子を含む請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 前記TiプラスミドpTiBo542
のヴィルレンス領域由来のDNAを含有するプラスミド
はpTOK162 である請求項2記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP41168190A JPH04222527A (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | トマトの形質転換方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP41168190A JPH04222527A (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | トマトの形質転換方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04222527A true JPH04222527A (ja) | 1992-08-12 |
Family
ID=18520640
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP41168190A Pending JPH04222527A (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | トマトの形質転換方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH04222527A (ja) |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5731179A (en) * | 1993-12-08 | 1998-03-24 | Japan Tobacco Inc. | Method for introducing two T-DNAS into plants and vectors therefor |
US5747327A (en) * | 1993-09-30 | 1998-05-05 | Japan Tobacco Inc. | Phospholipase D gene originated from plant |
US5981840A (en) * | 1997-01-24 | 1999-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for agrobacterium-mediated transformation |
US6329571B1 (en) | 1996-10-22 | 2001-12-11 | Japan Tobacco, Inc. | Method for transforming indica rice |
US6420630B1 (en) | 1998-12-01 | 2002-07-16 | Stine Biotechnology | Methods for tissue culturing and transforming elite inbreds of Zea mays L. |
US6610913B1 (en) | 1997-02-10 | 2003-08-26 | Japan Tobacco, Inc. | Rice plants transformed to provide a PCK-type C4 cycle and methods of making |
US7060876B2 (en) | 1992-07-07 | 2006-06-13 | Japan Tobacco Inc. | Method for transforming monocotyledons |
EP1983056A1 (en) | 1992-07-07 | 2008-10-22 | Japan Tobacco Inc. | Method for transforming monocotyledons |
EP2283721A2 (en) | 1997-08-12 | 2011-02-16 | North Carolina State University | Genetically engineered duckweed |
EP2290090A1 (en) | 2000-08-11 | 2011-03-02 | Syngenta Participations AG | Methods for stable transformation of plants |
EP2366788A1 (en) | 2001-07-27 | 2011-09-21 | Coöperatie Avebe U.A. | Transformation method for obtaining marker-free plants |
WO2013116750A1 (en) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Conicet | HaHB11 PROVIDES IMPROVED PLANT YIELD AND TOLERANCE TO ABIOTIC STRESS |
WO2013136273A2 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | University Of Guelph | Methods of increasing tolerance to heat stress and amino acid content of plants |
WO2017078836A1 (en) | 2015-11-06 | 2017-05-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions of improved plant transformation |
-
1990
- 1990-12-19 JP JP41168190A patent/JPH04222527A/ja active Pending
Cited By (15)
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WO2013136273A2 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | University Of Guelph | Methods of increasing tolerance to heat stress and amino acid content of plants |
WO2017078836A1 (en) | 2015-11-06 | 2017-05-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions of improved plant transformation |
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