JPH04222527A - トマトの形質転換方法 - Google Patents
トマトの形質転換方法Info
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- JPH04222527A JPH04222527A JP41168190A JP41168190A JPH04222527A JP H04222527 A JPH04222527 A JP H04222527A JP 41168190 A JP41168190 A JP 41168190A JP 41168190 A JP41168190 A JP 41168190A JP H04222527 A JPH04222527 A JP H04222527A
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトマトの形質転換方法に
係り、特に、細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ を用いたトマトの形質転換方法に
関する。
係り、特に、細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ を用いたトマトの形質転換方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】トマトは主要作物の１つであり、その品
種改良は重要である。トマトの品種改良を形質転換法に
より行うことが従来より研究されている。従来より、ト
マトの形質転換方法として、細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ を用いた方法がい
くつか報告されている（マコーミックら著、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ５：８１−８４ 、１９８
７年、チイ及びフィリップス著、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｏｒｔ ６：１０５−１０８ 、１９８７年、
デ・ブロックら著、ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２５１３−２
５１８ 、１９８７年）。このＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ は植物細胞を形質転換
し、腫瘍化する能力を有する土壌細菌であり、この細菌
には腫瘍誘導性プラスミド（Ｔｉプラスミド）が含まれ
ている。Ｔｉプラスミドにおいて重要な部位は形質転換
に関与する領域であるヴィルレンス領域と、植物細胞に
転移される腫瘍化遺伝子が含まれているＴ領域である。 そして、Ｔ領域においては、腫瘍化遺伝子の転移に必須
の部分はＴ領域においてその両端に位置する境界配列と
呼ばれる領域のみである。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ としては、これまで多くの
菌種が単離されており、その中でＬＢＡ４４０４という
菌種はＴ領域が除去されたＴｉプラスミドを有する非腫
瘍誘導性菌系であり、形質転換に用いるのに都合がよい
。 また、Ａ２８１という菌種は、特に強病原性であるとが
知られており、形質転換効率が極めて高い。この性質は
、Ａ２８１に含まれるＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域の能力が高いことによる（フッドら
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ 、２：７０２−７０９ 、
１９８４年、フッドら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
、１６８：１２８３−１２０９ 、１９８６年、コマリ
ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 、１６６：８８−９
４ 、１９８６年、ジンら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
． 、１６９：４４１７−４４２５ 、１９８７年、コ
マリ、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ 、６０：２２３−
２２９、１９８９年）。従って、このＡ２８１という菌
種を植物の形質転換実験に使用することも可能である。
種改良は重要である。トマトの品種改良を形質転換法に
より行うことが従来より研究されている。従来より、ト
マトの形質転換方法として、細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ を用いた方法がい
くつか報告されている（マコーミックら著、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ５：８１−８４ 、１９８
７年、チイ及びフィリップス著、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｏｒｔ ６：１０５−１０８ 、１９８７年、
デ・ブロックら著、ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２５１３−２
５１８ 、１９８７年）。このＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ は植物細胞を形質転換
し、腫瘍化する能力を有する土壌細菌であり、この細菌
には腫瘍誘導性プラスミド（Ｔｉプラスミド）が含まれ
ている。Ｔｉプラスミドにおいて重要な部位は形質転換
に関与する領域であるヴィルレンス領域と、植物細胞に
転移される腫瘍化遺伝子が含まれているＴ領域である。 そして、Ｔ領域においては、腫瘍化遺伝子の転移に必須
の部分はＴ領域においてその両端に位置する境界配列と
呼ばれる領域のみである。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ としては、これまで多くの
菌種が単離されており、その中でＬＢＡ４４０４という
菌種はＴ領域が除去されたＴｉプラスミドを有する非腫
瘍誘導性菌系であり、形質転換に用いるのに都合がよい
。 また、Ａ２８１という菌種は、特に強病原性であるとが
知られており、形質転換効率が極めて高い。この性質は
、Ａ２８１に含まれるＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域の能力が高いことによる（フッドら
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ 、２：７０２−７０９ 、
１９８４年、フッドら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
、１６８：１２８３−１２０９ 、１９８６年、コマリ
ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 、１６６：８８−９
４ 、１９８６年、ジンら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
． 、１６９：４４１７−４４２５ 、１９８７年、コ
マリ、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ 、６０：２２３−
２２９、１９８９年）。従って、このＡ２８１という菌
種を植物の形質転換実験に使用することも可能である。
【０００３】一般に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ を用いたトマトの形質転換方法
において、トマトに導入しようとするＤＮＡ断片はＴｉ
プラスミドのＴ領域の２つの境界配列の間に配置される
。このＤＮＡ断片はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ 中においてＴｉプラスミド又は他
のプラスミド上に配置され、この細菌中のＴｉプラスミ
ドのヴィルレンス領域中の遺伝子の機能により植物細胞
に転移されるものである。そして、従来の技術において
は、ヴィルレンス領域の遺伝子としては、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ に内在する
Ｔｉプラスミドのみが利用されていた。
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ を用いたトマトの形質転換方法
において、トマトに導入しようとするＤＮＡ断片はＴｉ
プラスミドのＴ領域の２つの境界配列の間に配置される
。このＤＮＡ断片はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ 中においてＴｉプラスミド又は他
のプラスミド上に配置され、この細菌中のＴｉプラスミ
ドのヴィルレンス領域中の遺伝子の機能により植物細胞
に転移されるものである。そして、従来の技術において
は、ヴィルレンス領域の遺伝子としては、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ に内在する
Ｔｉプラスミドのみが利用されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＬＢＡ
４４０４ を用いたトマトの形質転換方法においては、
形質転換の効率が極めて低い場合があり、また、品種に
よっては形質転換が著しく困難である。また、Ａ２８１
を用いた形質転換方法においては、ＬＢＡ４４０４ を
用いた形質転換方法よりも形質転換効率は高いが、奇形
植物が出現する例もあった。本発明は上述した点に鑑み
て創案されたものであり、形質転換の効率の高いトマト
の形質転換方法を提供することを目的とする。
４４０４ を用いたトマトの形質転換方法においては、
形質転換の効率が極めて低い場合があり、また、品種に
よっては形質転換が著しく困難である。また、Ａ２８１
を用いた形質転換方法においては、ＬＢＡ４４０４ を
用いた形質転換方法よりも形質転換効率は高いが、奇形
植物が出現する例もあった。本発明は上述した点に鑑み
て創案されたものであり、形質転換の効率の高いトマト
の形質転換方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者は効率の高い
トマトの形質転換方法について鋭意研究を行った結果、
ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域由来のＤＮＡ断片
を含有するプラスミドを導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ を用いることにより
高効率でトマトの形質転換を行うことができることを見
い出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの
ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域由
来のＤＮＡ領域を含むプラスミドを導入したＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ でトマト
を形質転換することから成るトマトの形質転換方法を提
供する。
トマトの形質転換方法について鋭意研究を行った結果、
ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域由来のＤＮＡ断片
を含有するプラスミドを導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ を用いることにより
高効率でトマトの形質転換を行うことができることを見
い出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの
ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域由
来のＤＮＡ領域を含むプラスミドを導入したＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ でトマト
を形質転換することから成るトマトの形質転換方法を提
供する。
【０００６】以下、本発明について詳細に説明する。上
述のように、本発明の方法においては、Ｔｉプラスミド
ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域由来のＤＮＡ領域
を含有するプラスミドを用いる。ｐＴｉＢｏ５４２は、
上記したように、フッドら、ジンら及びコマリらの各文
献に記載された公知のプラスミドであり、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（受託番号 ３７３４９）から入手可能なものである
。ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域にはｖｉｒＢ、
ｖｉｒＣ、ｖｉｒＧなどの遺伝子が存在するが、ｐＴ
ｉＢｏ５４２を制限酵素Ｋｐｎ Ｉ で切断すると、ｖ
ｉｒＢ、 ｖｉｒＣ及びｖｉｒＧ遺伝子を含む１５．２
ｋｂ の断片が得られ、これをｐＴｉＢｏ５４２のヴ
ィルレンス領域由来のＤＮＡ領域として利用することが
できる。
述のように、本発明の方法においては、Ｔｉプラスミド
ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域由来のＤＮＡ領域
を含有するプラスミドを用いる。ｐＴｉＢｏ５４２は、
上記したように、フッドら、ジンら及びコマリらの各文
献に記載された公知のプラスミドであり、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（受託番号 ３７３４９）から入手可能なものである
。ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス領域にはｖｉｒＢ、
ｖｉｒＣ、ｖｉｒＧなどの遺伝子が存在するが、ｐＴ
ｉＢｏ５４２を制限酵素Ｋｐｎ Ｉ で切断すると、ｖ
ｉｒＢ、 ｖｉｒＣ及びｖｉｒＧ遺伝子を含む１５．２
ｋｂ の断片が得られ、これをｐＴｉＢｏ５４２のヴ
ィルレンス領域由来のＤＮＡ領域として利用することが
できる。
【０００７】一方、本発明の方法において、Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ に導入され
るプラスミドは、ＴｉプラスミドのＴ領域を有するＤＮ
Ａ領域を含む。Ｔ領域は、Ｔｉプラスミドまたはそれか
ら誘導された公知の各種プラスミド中に含まれており、
また、このようなＴ領域中に適当な制限酵素部位を有す
るものも知られているので、このようなプラスミドに上
記ヴィルレンス領域由来ＤＮＡ領域を組み込むことによ
り、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ に導入すべきプラスミドを構築することができる
。
ａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ に導入され
るプラスミドは、ＴｉプラスミドのＴ領域を有するＤＮ
Ａ領域を含む。Ｔ領域は、Ｔｉプラスミドまたはそれか
ら誘導された公知の各種プラスミド中に含まれており、
また、このようなＴ領域中に適当な制限酵素部位を有す
るものも知られているので、このようなプラスミドに上
記ヴィルレンス領域由来ＤＮＡ領域を組み込むことによ
り、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ に導入すべきプラスミドを構築することができる
。
【０００８】下記実施例においては、ｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域由来のクローン化されたＤＮＡ断片
を含有するプラスミドの一例として、ｐＴＯＫ１６２
を構築した。その構造を図１に示す。このプラスミドは
、大腸菌及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ 中で増殖可能であるｐＴＯＫ１５４ と
呼ばれるプラスミド（Ｔｉプラスミドから誘導された公
知のｐＧＡ４７２プラスミドとｐＶＣＫ１０１ と呼ば
れる公知の広宿主域プラスミドから後述の方法により構
築された、Ｔ領域を含むプラスミド）にｐＴｉＢｏ５４
２のヴィルレンス領域由来の既にクローン化されていた
上記１５．２キロベースのＫｐｎｌ断片（ｖｉｒＢ、ｖ
ｉｒＧ、ｖｉｒＣ各遺伝子を含む）を組み込んだもので
ある。このｐＴＯＫ１５４ には、Ｔ領域の２つの境界
配列とその間にトマトに導入しようとする遺伝子として
カナマイシン耐性遺伝子が配列されており、本実施例は
、トマトに導入しようとする遺伝子がｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域由来のクローン化されたＤＮＡ断片
を含有するプラスミド上に配置されている例である。
のヴィルレンス領域由来のクローン化されたＤＮＡ断片
を含有するプラスミドの一例として、ｐＴＯＫ１６２
を構築した。その構造を図１に示す。このプラスミドは
、大腸菌及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ 中で増殖可能であるｐＴＯＫ１５４ と
呼ばれるプラスミド（Ｔｉプラスミドから誘導された公
知のｐＧＡ４７２プラスミドとｐＶＣＫ１０１ と呼ば
れる公知の広宿主域プラスミドから後述の方法により構
築された、Ｔ領域を含むプラスミド）にｐＴｉＢｏ５４
２のヴィルレンス領域由来の既にクローン化されていた
上記１５．２キロベースのＫｐｎｌ断片（ｖｉｒＢ、ｖ
ｉｒＧ、ｖｉｒＣ各遺伝子を含む）を組み込んだもので
ある。このｐＴＯＫ１５４ には、Ｔ領域の２つの境界
配列とその間にトマトに導入しようとする遺伝子として
カナマイシン耐性遺伝子が配列されており、本実施例は
、トマトに導入しようとする遺伝子がｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域由来のクローン化されたＤＮＡ断片
を含有するプラスミド上に配置されている例である。
【０００９】トマトに組み込もうとする所望の遺伝子は
、上記プラスミドのＴ領域中の制限酵素部位に常法によ
り組み込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等
の適当な選択マーカーに基づいて選択することができる
。もっとも、第１図に示すｐＴＯＫ１６２ のように、
大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクロー
ニングの手法では所望のＤＮＡをＴ領域内に導入するこ
とが必ずしも容易ではないことがある。このような場合
には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ 細胞内のｉｎ ｖｉｖｏ 系での相同組換え（
ヘレラ−エステレラら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：９８７−９
９５、１９８３年、ホーチら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３
：４９６ー４９８、１９８４年）を利用することにより
、目的のＤＮＡをｐＴＯＫ１６２ に導入することが可
能になる。すなわち、例えば、先ず、ｐＴＯＫ１６２
をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓに導入しておいて、この菌にさらに所望ＤＮＡを導入
したｐＢＲ３２２と呼ばれるプラスミド（類似のプラス
ミドを含む）を導入する。ｐＴＯＫ１６２のＤＮＡには
ｐＢＲ３２２と相同な部分があるので、ｐＢＲ３２２誘
導体は相同配列を介した組み換えによりｐＴＯＫ６１２
に組み込まれることになる。ｐＢＲ３２２はｐＴＯＫ
１６２ と異なりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ 中では複製できないので、このよう
な組み込まれた状態（ｐＴＯＫ１６２：：ｐＢＲ３２２
誘導体という）でなければＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 中で生存することができ
ない。そして、ｐＴＯＫ１６２ とｐＢＲ３２２誘導体
のそれぞれに特異的な特性（薬剤耐性等）について選抜
すれば、ｐＴＯＫ１６２：：ｐＢＲ３２２ 誘導体を有
するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ を得ることができる。さらに、ｐＴＯＫ１６２
を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ に各種のプラスミドを導入して研究したとこ
ろ、ｐＢＲ３２２誘導体の選抜マーカーとしては、トラ
ンスポゾンＴｎ７（デグリーブら、Ｐｌａｓｍｉｄ ６
：２３５−２４８、１９８１）由来のスペクチノマシ
ン耐性遺伝子（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ｓｐｅｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅ， ＳＰＴ） が優れていることが判明した。従っ
て、すでに所望の遺伝子がｐＢＲ３２２にクローン化さ
れている場合には、ＳＰＴ遺伝子をそのプラスミドに挿
入すれば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ 内の相同組替えにより、ｐＴＯＫ１６２
のＴ領域に所望の遺伝子を導入することができる。また
その他の場合には、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡとＳＰＴ
遺伝子から構成されるプラスミドを用意しておいて、こ
れに所望の遺伝子を挿入する方法も考えられる。この際
、Ｔ領域の境界配列を活用すれば、最終的に、ｐＴＯＫ
１６２ 上において、カナマイシン耐性遺伝子と所望の
遺伝子を別々のＴ領域中に配置することも可能である。 カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形質転換した
場合、両Ｔ領域とも導入される場合も相当の比率で生じ
るわけであるので、目的遺伝子の導入は十分達成できる
。また、両Ｔ領域が別々の染色体に組み込まれる場合も
あり得るので、後に目的の遺伝子をカナマイシン耐性遺
伝子から分離することも可能となる。
、上記プラスミドのＴ領域中の制限酵素部位に常法によ
り組み込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等
の適当な選択マーカーに基づいて選択することができる
。もっとも、第１図に示すｐＴＯＫ１６２ のように、
大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクロー
ニングの手法では所望のＤＮＡをＴ領域内に導入するこ
とが必ずしも容易ではないことがある。このような場合
には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ 細胞内のｉｎ ｖｉｖｏ 系での相同組換え（
ヘレラ−エステレラら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：９８７−９
９５、１９８３年、ホーチら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３
：４９６ー４９８、１９８４年）を利用することにより
、目的のＤＮＡをｐＴＯＫ１６２ に導入することが可
能になる。すなわち、例えば、先ず、ｐＴＯＫ１６２
をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓに導入しておいて、この菌にさらに所望ＤＮＡを導入
したｐＢＲ３２２と呼ばれるプラスミド（類似のプラス
ミドを含む）を導入する。ｐＴＯＫ１６２のＤＮＡには
ｐＢＲ３２２と相同な部分があるので、ｐＢＲ３２２誘
導体は相同配列を介した組み換えによりｐＴＯＫ６１２
に組み込まれることになる。ｐＢＲ３２２はｐＴＯＫ
１６２ と異なりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ 中では複製できないので、このよう
な組み込まれた状態（ｐＴＯＫ１６２：：ｐＢＲ３２２
誘導体という）でなければＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 中で生存することができ
ない。そして、ｐＴＯＫ１６２ とｐＢＲ３２２誘導体
のそれぞれに特異的な特性（薬剤耐性等）について選抜
すれば、ｐＴＯＫ１６２：：ｐＢＲ３２２ 誘導体を有
するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ を得ることができる。さらに、ｐＴＯＫ１６２
を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ に各種のプラスミドを導入して研究したとこ
ろ、ｐＢＲ３２２誘導体の選抜マーカーとしては、トラ
ンスポゾンＴｎ７（デグリーブら、Ｐｌａｓｍｉｄ ６
：２３５−２４８、１９８１）由来のスペクチノマシ
ン耐性遺伝子（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ｓｐｅｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅ， ＳＰＴ） が優れていることが判明した。従っ
て、すでに所望の遺伝子がｐＢＲ３２２にクローン化さ
れている場合には、ＳＰＴ遺伝子をそのプラスミドに挿
入すれば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ 内の相同組替えにより、ｐＴＯＫ１６２
のＴ領域に所望の遺伝子を導入することができる。また
その他の場合には、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡとＳＰＴ
遺伝子から構成されるプラスミドを用意しておいて、こ
れに所望の遺伝子を挿入する方法も考えられる。この際
、Ｔ領域の境界配列を活用すれば、最終的に、ｐＴＯＫ
１６２ 上において、カナマイシン耐性遺伝子と所望の
遺伝子を別々のＴ領域中に配置することも可能である。 カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形質転換した
場合、両Ｔ領域とも導入される場合も相当の比率で生じ
るわけであるので、目的遺伝子の導入は十分達成できる
。また、両Ｔ領域が別々の染色体に組み込まれる場合も
あり得るので、後に目的の遺伝子をカナマイシン耐性遺
伝子から分離することも可能となる。
【００１０】プラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ に導入する操作は従来法に
より行うことができ、例えば、細菌の三系交雑手法（デ
ィッタら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、７７：７３４７−７３５１、１９８０年）により行
うことができる。
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ に導入する操作は従来法に
より行うことができ、例えば、細菌の三系交雑手法（デ
ィッタら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、７７：７３４７−７３５１、１９８０年）により行
うことができる。
【００１１】このようにして調製されるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ には、ｐＴＯＫ
１６２ 由来のヴィルレンス能力の高いＤＮＡが含まれ
るので、高い効率でトマトの形質転換を行うことが可能
である。また、本発明においては病原性の高いＡ２８１
のような菌種を直接的に用いるものではないので、奇形
等が生じるおそれが小さい。
ｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ には、ｐＴＯＫ
１６２ 由来のヴィルレンス能力の高いＤＮＡが含まれ
るので、高い効率でトマトの形質転換を行うことが可能
である。また、本発明においては病原性の高いＡ２８１
のような菌種を直接的に用いるものではないので、奇形
等が生じるおそれが小さい。
【００１２】尚、本発明においては、トマトに導入しよ
うとする遺伝子は、従来の技術と同様にＴ領域の境界配
列の間に配置されるものであるが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 中で、Ｔｉプラス
ミド上に配置されてもよく又は他のプラスミド上に配置
されてもよい。
うとする遺伝子は、従来の技術と同様にＴ領域の境界配
列の間に配置されるものであるが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 中で、Ｔｉプラス
ミド上に配置されてもよく又は他のプラスミド上に配置
されてもよい。
【００１３】本発明において、トマトの形質転換は、従
来法と同様に行うことができる。例えば、上記プラスミ
ドを導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ とトマトの子葉断片を液体培地中で共存
培養すること等により行われる。
来法と同様に行うことができる。例えば、上記プラスミ
ドを導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ とトマトの子葉断片を液体培地中で共存
培養すること等により行われる。
【００１４】
【発明の効果】以上のように構成した本発明によれば、
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ｐにＴｉＢｏ５４２ 由来のヴィルレンス能力が高いＤ
ＮＡが導入されているので、高効率でトマトの形質転換
を行うことが可能になるという効果が奏される。また、
直接的に病原性の高い菌種を用いるものではないので、
トマトの形質転換を行う際、奇形等が生じるおそれが小
さいという効果が奏される。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ｐにＴｉＢｏ５４２ 由来のヴィルレンス能力が高いＤ
ＮＡが導入されているので、高効率でトマトの形質転換
を行うことが可能になるという効果が奏される。また、
直接的に病原性の高い菌種を用いるものではないので、
トマトの形質転換を行う際、奇形等が生じるおそれが小
さいという効果が奏される。
【００１５】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。なお、下記実施例に
おいて、各操作は、特に断りがない限り、ティー・マニ
アティスら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８２
に記載の方法により行った。
はこれに限定されるものではない。なお、下記実施例に
おいて、各操作は、特に断りがない限り、ティー・マニ
アティスら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８２
に記載の方法により行った。
【００１６】（１） ｐＴＯＫ１６２ の調製広宿主域
プラスミドであるｐＶＣＫ１０１ （ナウフとネスター
、Ｐｌａｓｍｉｄ ８：４５−５４、１９８２年、ネス
ターより入手可能）からＥｃｏ ＲＩ部位を取り除くた
め、これをＥｃｏ ＲＩで切断し、クレノウ酵素処理に
より末端を平滑末端とした後、再び環状化した。また、
バイナリーベクターであるｐＧＡ４７２（アンら、ＥＭ
ＢＯ Ｊ．４：２７７−２８４、１９８５年に記載、ア
ンより入手可能）をＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌ ＩＩで切
断し、クレノウ酵素処理後再び環状化することによって
、Ｔ領域からＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ 、Ｓａｌ
Ｉ 、ＢｇｌＩＩの各認識部位を除去した。この分子か
ら、Ｔ領域を含むＳａｌ Ｉ 断片を取り出し、クレノ
ウ酵素処理後、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓａｌ Ｉ 、Ｘｂａ
Ｉ 、ＢａｍＨＩ 、Ｋｐｎ Ｉ 、Ｓａｃ Ｉ の
各認識部位を有する合成リンカーＤＮＡを結合させ環状
化した。さらに、これをＳａｌ Ｉ により開環し、上
記のｐＶＣＫ１０１ 誘導体のＸｈｏ Ｉ 部位とＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位の間に挿入しｐＴＯＫ１５４ を作製し
た。この操作を図２に示す。上記の記載からわかるよう
に、ｐＴＯＫ１５４ は、Ｔ領域外にＳｓｔ Ｉ 、Ｋ
ｐｎ Ｉ 、ＸｂａＩ 、Ｂｇｌ ＩＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ の唯一の認識部位を持っている。 また、ｐＶＣＫ１０１のＥｃｏ ＲＩ部位を除去したの
で、Ｔ領域内に唯一のＥｃｏ ＲＩ部位が存在する。こ
の部位に外来ＤＮＡ断片を挿入し、植物ゲノムに導入す
ることができるので、他の実験にも応用可能である。一
方、ｐＴｉＢｏ５４２をＫｐｎ Ｉ で消化し、ヴィル
レンス領域内のｖｉｒＢ、ｖｉｒＧ及びｖｉｒＣ遺伝子
を含む１５．２ ｋｂ の断片を切り出し、これをｐＵ
Ｃ１９のＫｐｎ Ｉ 部位に挿入し、クローニングした
。これを、上記ｐＴＯＫ１５４ のＫｐｎ Ｉ 部位に
挿入し、図１に示すｐＴＯＫ１６２ を作製した。
プラスミドであるｐＶＣＫ１０１ （ナウフとネスター
、Ｐｌａｓｍｉｄ ８：４５−５４、１９８２年、ネス
ターより入手可能）からＥｃｏ ＲＩ部位を取り除くた
め、これをＥｃｏ ＲＩで切断し、クレノウ酵素処理に
より末端を平滑末端とした後、再び環状化した。また、
バイナリーベクターであるｐＧＡ４７２（アンら、ＥＭ
ＢＯ Ｊ．４：２７７−２８４、１９８５年に記載、ア
ンより入手可能）をＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌ ＩＩで切
断し、クレノウ酵素処理後再び環状化することによって
、Ｔ領域からＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ 、Ｓａｌ
Ｉ 、ＢｇｌＩＩの各認識部位を除去した。この分子か
ら、Ｔ領域を含むＳａｌ Ｉ 断片を取り出し、クレノ
ウ酵素処理後、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓａｌ Ｉ 、Ｘｂａ
Ｉ 、ＢａｍＨＩ 、Ｋｐｎ Ｉ 、Ｓａｃ Ｉ の
各認識部位を有する合成リンカーＤＮＡを結合させ環状
化した。さらに、これをＳａｌ Ｉ により開環し、上
記のｐＶＣＫ１０１ 誘導体のＸｈｏ Ｉ 部位とＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位の間に挿入しｐＴＯＫ１５４ を作製し
た。この操作を図２に示す。上記の記載からわかるよう
に、ｐＴＯＫ１５４ は、Ｔ領域外にＳｓｔ Ｉ 、Ｋ
ｐｎ Ｉ 、ＸｂａＩ 、Ｂｇｌ ＩＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ の唯一の認識部位を持っている。 また、ｐＶＣＫ１０１のＥｃｏ ＲＩ部位を除去したの
で、Ｔ領域内に唯一のＥｃｏ ＲＩ部位が存在する。こ
の部位に外来ＤＮＡ断片を挿入し、植物ゲノムに導入す
ることができるので、他の実験にも応用可能である。一
方、ｐＴｉＢｏ５４２をＫｐｎ Ｉ で消化し、ヴィル
レンス領域内のｖｉｒＢ、ｖｉｒＧ及びｖｉｒＣ遺伝子
を含む１５．２ ｋｂ の断片を切り出し、これをｐＵ
Ｃ１９のＫｐｎ Ｉ 部位に挿入し、クローニングした
。これを、上記ｐＴＯＫ１５４ のＫｐｎ Ｉ 部位に
挿入し、図１に示すｐＴＯＫ１６２ を作製した。
【００１７】（２） ｐＴＯＫ１６２ のＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 内への導入 このようにして得られたｐＴＯＫ１６２ をＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の菌種Ｌ
ＢＡ４４０４ （文献：ホエケマら、Ｎａｔｕｒｅ、３
０３：１７９−１８０、１９８３年）に導入し、ＬＢＡ
４４０４（ｐＴＯＫ１６２）を得た。導入は、上記の三
系交雑手法により行った。
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 内への導入 このようにして得られたｐＴＯＫ１６２ をＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の菌種Ｌ
ＢＡ４４０４ （文献：ホエケマら、Ｎａｔｕｒｅ、３
０３：１７９−１８０、１９８３年）に導入し、ＬＢＡ
４４０４（ｐＴＯＫ１６２）を得た。導入は、上記の三
系交雑手法により行った。
【００１８】（３） トマトの形質転換ＬＢＡ４４０４
（ｐＴＯＫ１６２ ）を得て、トマトの形質転換実験
を行い、ＬＢＡ４４０４ （ｐＧＡ４８２）と比較した
。尚、このｐＧＡ４８２というプラスミドはｐＴｉＢｏ
５４２由来のＤＮＡを含まないプラスミドである。形質
転換は、トマト品種モモタロウの種子を滅菌し、無菌的
に発芽させた植物の子葉を材料として行った。すなわち
、ＬｉｎｓｍａｉｅｒａｎｄＳｋｏｏｇ （１９６５年
）の無機塩類と３０ｇ／ｌのグルコースより成る液体培
地中でこの子葉の断片約１ｇと、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 約１０８ 細胞とを４
８時間共存培養した。そして、子葉断片を洗浄し、細菌
を洗い落とした後、子葉断片をカナマイシン１００ｍｇ
／ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／ｌ、インドール酢酸
０．３ｍｇ／ｌ、イソペンテニルアデニン１０ｍｇ／ｌ
を含む寒天（０．９％）培地に置床し、１５日間培養を
行った。その結果、ＫＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ１６３）
で処理した子葉断片１０８個のうち、４１個の断片から
カナマイシン耐性のカルスが出現した。また、これらの
カルスを、上記寒天培地で引き続き２５日間培養し、カ
ナマイシン耐性の茎葉を得た。これらの茎葉をリンスマ
イヤーとスクーグ（１９６５年）の無機塩類と３０ｇ／
ｌのショ糖を含む寒天培地に移植することによって再分
化植物を誘導したところ、１カルスにつき２個体の頻度
で再分化植物が得られた。また、対照として、ＬＢＡ４
４０４（ｐＴＯＫ１６２）で処理するかわりに、ＬＢＡ
４４０４（ｐＴＯＫ４８２）で処理した子葉断片を用い
て同様の実験を行った。その結果、１２０個の断片を供
試したにもかかわらず、カナマイシン耐性カルスは全く
出現しなかった。以上の結果から、ＬＢＡ４４０４（ｐ
ＴＯＫ１６２）で処理することにより、約４割の子葉断
片よりカナマイシン耐性の形質転換植物が得られたのに
対し、ＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ４８２）で処理を行っ
ても形質転換植物は全く得ることはできず、本発明の効
果は明かであった。
（ｐＴＯＫ１６２ ）を得て、トマトの形質転換実験
を行い、ＬＢＡ４４０４ （ｐＧＡ４８２）と比較した
。尚、このｐＧＡ４８２というプラスミドはｐＴｉＢｏ
５４２由来のＤＮＡを含まないプラスミドである。形質
転換は、トマト品種モモタロウの種子を滅菌し、無菌的
に発芽させた植物の子葉を材料として行った。すなわち
、ＬｉｎｓｍａｉｅｒａｎｄＳｋｏｏｇ （１９６５年
）の無機塩類と３０ｇ／ｌのグルコースより成る液体培
地中でこの子葉の断片約１ｇと、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 約１０８ 細胞とを４
８時間共存培養した。そして、子葉断片を洗浄し、細菌
を洗い落とした後、子葉断片をカナマイシン１００ｍｇ
／ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／ｌ、インドール酢酸
０．３ｍｇ／ｌ、イソペンテニルアデニン１０ｍｇ／ｌ
を含む寒天（０．９％）培地に置床し、１５日間培養を
行った。その結果、ＫＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ１６３）
で処理した子葉断片１０８個のうち、４１個の断片から
カナマイシン耐性のカルスが出現した。また、これらの
カルスを、上記寒天培地で引き続き２５日間培養し、カ
ナマイシン耐性の茎葉を得た。これらの茎葉をリンスマ
イヤーとスクーグ（１９６５年）の無機塩類と３０ｇ／
ｌのショ糖を含む寒天培地に移植することによって再分
化植物を誘導したところ、１カルスにつき２個体の頻度
で再分化植物が得られた。また、対照として、ＬＢＡ４
４０４（ｐＴＯＫ１６２）で処理するかわりに、ＬＢＡ
４４０４（ｐＴＯＫ４８２）で処理した子葉断片を用い
て同様の実験を行った。その結果、１２０個の断片を供
試したにもかかわらず、カナマイシン耐性カルスは全く
出現しなかった。以上の結果から、ＬＢＡ４４０４（ｐ
ＴＯＫ１６２）で処理することにより、約４割の子葉断
片よりカナマイシン耐性の形質転換植物が得られたのに
対し、ＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ４８２）で処理を行っ
ても形質転換植物は全く得ることはできず、本発明の効
果は明かであった。
【００１９】尚、本発明は以上の実施例に限定されるも
のでなくその主旨を逸脱しない範囲で適宜変更を加える
ことが可能である。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 中にＴｉプラスミドと、
バイナリーベクターと、ｐＴｉＢｏ５４２由来のＤＮＡ
断片を含むプラスミドの計３個のプラスミドを同居させ
ることも可能である。
のでなくその主旨を逸脱しない範囲で適宜変更を加える
ことが可能である。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 中にＴｉプラスミドと、
バイナリーベクターと、ｐＴｉＢｏ５４２由来のＤＮＡ
断片を含むプラスミドの計３個のプラスミドを同居させ
ることも可能である。
【図１】ｐＴＯＫ１６２ プラスミドの構造を示す図。
【図２】ｐＴＯＫ１６２ プラスミドの中間体であるｐ
ＴＯＫ１５４を構築する操作を示す図。
ＴＯＫ１５４を構築する操作を示す図。
Claims (3)
- 【請求項１】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ のＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域由来のＤＮＡ領域を含むプラスミド
を導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ でトマトを形質転換することから成るトマ
トの形質転換方法。 - 【請求項２】 前記ｐＴｉＢｏ５４２のヴィルレンス
領域由来のＤＮＡは、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＧ及びｖｉｒＣ
遺伝子を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２
のヴィルレンス領域由来のＤＮＡを含有するプラスミド
はｐＴＯＫ１６２ である請求項２記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41168190A JPH04222527A (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | トマトの形質転換方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41168190A JPH04222527A (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | トマトの形質転換方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04222527A true JPH04222527A (ja) | 1992-08-12 |
Family
ID=18520640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP41168190A Pending JPH04222527A (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | トマトの形質転換方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04222527A (ja) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5731179A (en) * | 1993-12-08 | 1998-03-24 | Japan Tobacco Inc. | Method for introducing two T-DNAS into plants and vectors therefor |
| US5747327A (en) * | 1993-09-30 | 1998-05-05 | Japan Tobacco Inc. | Phospholipase D gene originated from plant |
| US5981840A (en) * | 1997-01-24 | 1999-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for agrobacterium-mediated transformation |
| US6329571B1 (en) | 1996-10-22 | 2001-12-11 | Japan Tobacco, Inc. | Method for transforming indica rice |
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