CN101918561A - 绿豆黄色花叶病印度病毒(mymiv)的嵌合构建体和其应用 - Google Patents

绿豆黄色花叶病印度病毒(mymiv)的嵌合构建体和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B的二聚体的重组DNA构建体、重组载体和宿主细胞。

Description

绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的嵌合构建体和其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。更特别地，本发明涉及绿豆黄色花叶病印度病毒(Mungbean Yellow Mosaic India Virus，MYMIV)毒性克隆的构建体和其用途。
背景技术
绿豆黄色花叶病的特征是被感染植物的叶上具有亮黄色花斑，该疾病造成绿豆(Vigna radiata)作物的大量损失。黄色花叶病是五种重要豆类作物的主要危害：黑吉豆(Black gram)、绿豆、菜豆(French bean)、木豆和大豆。其造成每年约3亿美元的损失。大豆是一种主要的豆类作物。取决于严重程度，其高度易患黄色花叶病并造成21-86％的产量损失。经鉴定，该疾病的病原体为绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)，其是双粒病毒组和菜豆金色花叶病毒属(Begomoviruses)家族的成员。在印度，该病毒通过粉虱传播。该疾病的症状包括小的黄色散在的斑点，该斑点的融合使得叶完全变黄。新生的叶显示黄色花斑和斑纹。
与大多数二连的双粒病毒相似，MYMIV的遗传物质为两条单链共价闭环DNA。该DNA被命名为DNA-A和DNA-B，每个约2.7kb的大小。DNA A主要编码4个蛋白，所述蛋白在复制和转录两种DNA成分中起重要的作用。DNA B只编码两个蛋白，所述蛋白帮助病毒颗粒的移动。它们在成熟植物细胞细胞核中通过双链DNA中间物复制。
为了研究许多这些二连菜豆金色花叶病毒的生物学过程，为了筛选群体中的抗性品种，需要用病毒感染植物。为了这一目的，已经开发了许多感染方法，如(1)在粉虱(烟粉虱(B.tabaci))的帮助下从被感染的植物传播至未感染植物，(2)向健康植物机械接种来自被感染植物的纯化病毒或病毒DNA二聚体，及(3)接种具有在Ti质粒中的DNA A和DNA B的部分或完整二聚体的农杆菌属混悬剂。
粉虱介导的接种是用于感染植物的最早方法。但是一些重要的二连菜豆金色花叶病毒不能通过粉虱传播至其他宿主，并且感染的频率低，因为其取决于粉虱。另外，保存纯的含有病毒的粉虱储存液是非常不方便的和有害的；完全可控制地将昆虫引入植物是困难的。在粉虱介导的感染中，筛选种子种群也不是完全可靠的；因为抗性可针对粉虱本身产生(Grimsley，N.，Hohn，B.，Hohn，T.和Walden，R.(1986).“Agroinfection”，an alternative route for viral infection of plants by usingthe Ti plasmid.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：3282-3286)。
为了克服使用昆虫载体进行病毒接种的困难，早期研究中也测试了机械方法。这些方法包括通过机械损伤向未感染的植物接种纯化病毒或DNA A和B的二聚体(Etessami，P.，Callis，R.，Ellwood，S.，Stanley，J.，(1988).Delimitation of essential genes of cassava latent virusDNA 2.Nucleic Acid Res.16，4811-4829)。在少数植物如番茄中，可通过使用这些方法获得100％的感染。但是结果不乐观。对于不能通过机械传播的其它病毒如玉米条纹病毒、甜菜曲顶病毒和南瓜叶卷曲病毒，需要有效的感染方法(Stanley，J.，Markham，P.G.，Callis，R.J.，Pinner，M.S.，(1986).The nucleotide sequence of an infectious clone of thegeminivirus beet curly top virus.EMBO J.5，1761-1767)。
因为大多数双粒病毒不能通过机械传播，所以发现新方法如农杆菌介导的接种是用这些病毒人工感染植物的可靠和合适的方法(Grimsley，N.，Hohn，B.，Hohn，T.和Walden，R.(1986)“Agroinfection”，an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83：3282-3286)。通过使用该方法，用番茄金色花叶病毒接种了牵牛花(Petunia)植物(Rogers，S.G.，Bisaro，D.M.，Horsch，R.B.，Fraley，R.T.，Hoffmann，N.L.，Brand，L.，Elmer，J.S.和Lloyd，A.M.(1986)Tomato golden mosaic virus A component DNAreplicates autonomously in transgenic plants.Cell 45：593-600)。这是对二连菜豆金色花叶病毒的农杆菌接种的第一个报道。该方法使用了农杆菌通过重组从细菌细胞向植物染色体转移其Ti质粒DNA的能力(Wang，K；Herrera-Estrella，L；Van Montagu，M；Zambryski，P.Right 25bp terminus sequence of the nopaline T-DNA is essential for anddetermines direction of DNA transfer from agrobacterium to the plantgenome.Cell.(1984)Sep；38(2)：455-462)。
通常，为了用MYMIV感染植物，将二连菜豆金色花叶病毒DNA A和DNA B的部分二聚体或完整二聚体克隆入两个单独Ti质粒的T-DNA中，并引入单独的农杆菌培养物。这两个农杆菌培养物(具有DNA A的二聚体和DNA B的二聚体)等量混合并用于植物接种，称为农杆菌共接种(co-Agroinoculation)。在T-DNA重组和转移至植物染色体后，单位长度的双粒病毒基因组在病毒和植物蛋白的帮助中下释放。该方法广泛用于许多菜豆金色花叶病毒如番茄金色花叶病毒、绿豆黄色花叶病毒、绿豆黄色花叶病印度病毒(Katoor S.Usharani，Baliji Surendranath，Qazi M.R.Haq和Varagur G.Malathi(2005)，Infectivity analysis of a soybean isolate of Mungbean yellowmosaic India virus by agroinoculation.J Gen Plant Pathol 71：230-237)和马铃薯黄色花叶病毒和木薯花叶病毒。
在二连菜豆金色花叶病毒的农杆菌接种方法的改进版本中，将DNA A和DNA B的部分串联重复序列克隆至两个单独的Ti质粒DNA上，并将其引入相同的农杆菌细胞并用于植物的接种(Jacob S S，Vanitharani R，Karthikeyan A S，Chinchore Y，Thillaichidambaram P和Veluthambi K(2003)Mungbean yellow mosaic virus-Vi agroinfection bycodelivery of DNA A and DNA B from one Agrobacterium strain；PlantDis.87247-251)。
近期的对MYMIV感染大豆植物的研究通过用混合的农杆菌培养物(单独含有DNA A和DNA B的部分二聚体)接种植物进行。发现感染的最大效率只有21％(Katoor S.Usharani，Baliji Surendranath，Qazi M.R.Haq和Varagur G.Malathi(2005)Infectivity analysis of asoybean isolate of Mungbean yellow mosaic India virus by agroinoculation.J.Gen.Plant Pathol.71：230-237)。因此，需要更好的用绿豆花叶病印度病毒(MYMIV)感染植物的系统，该系统给出用病毒感染植物的更高的效率。
发明内容
本发明涉及绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)毒性克隆的构建体和其用途。本发明提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B二聚体的重组构建体、重组载体和宿主细胞。
本发明的一个具体实施方式提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组DNA构建体。
本发明的另一个具体实施方式提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组DNA构建体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13中所列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14中所列。
本发明的另一个具体实施方式提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组载体。
本发明的另一个具体实施方式提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组载体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO：11或SEQID NO：13中所列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14中所列。
本发明的一个具体实施方式提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A二聚体的重组载体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13中所列。
本发明的另一个具体实施方式提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA B二聚体的重组载体，其中DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14中所列。
本发明的另一具体实施方式提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组植物转化载体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO：11中所列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO：12中所列。
本发明的另一个具体实施方式提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组植物转化载体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO：13中所列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO：14中所列。
本发明的另一个具体实施方式提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A二聚体的重组植物转化载体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO：11中所列。
本发明的另一个具体实施方式提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA B二聚体的重组植物转化载体，其中DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO：12中所列。
本发明提供在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组宿主细胞，其中宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)或农杆菌。
本发明还提供含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的植物细胞。
本发明的另一个具体实施方式提供了一种筛选绿豆黄色花叶病印度病毒抗性/耐受植物的方法，该方法使用在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组DNA构建体或重组载体。
本发明进一步提供了一种筛选绿豆黄色花叶病印度病毒抗性/耐受植物的方法，该方法使用在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B二聚体的重组DNA构建体或重组载体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO：11中所列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO：12中所列。
在一个具体实施方式中，本发明提供了如SEQ ID NO：11中所列的多核苷酸序列。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了如SEQ ID NO：12中所列的多核苷酸序列。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了具有如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所列的核苷酸序列的寡核苷酸。
令人惊讶地，据发现，机械接种含有重组DNA构建体(在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒的DNA A和DNA B二聚体)的农杆菌培养物可以在MYMIV易感植物中增加病毒感染频率达90％至100％。
本发明提供的在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B二聚体的重组DNA构建体、载体和宿主细胞可以用作以病毒感染植物的高价值系统。
本发明提供的在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B二聚体的重组DNA构建体、载体和宿主细胞可以用于以病毒感染植物，以从病毒易感植物筛选病毒抗性/耐受植物而鉴定病毒抗性植物。
本发明提供的在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B二聚体的重组DNA构建体、载体和宿主细胞还可以用于标记MYMIV的抗性标记。
克隆全长MYMIV DNA A
来自MYMIV感染的大豆(Glycine max)植物的有症状叶的总DNA通过CTAB方法制备。其它本领域已知的方法也可以用于分离DNA。通过使用具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所列的核苷酸序列的引物序列以聚合酶链反应扩增全长MYMIV DNA A。
Afl1：GGATCCATTGTTGAACGACTTTCC    SEQ ID NO：1
Afl2：GGATCCCACATTGTTAGTGGGTTC    SEQ IDNO：2
通过使用(3956bp)Zero Blunt TOPO PCR Cloning试剂盒(Invitrogen)将获得的2747bp扩增产物直接克隆进入pCR4Blunt-TOPO质粒载体，将因此获得的重组载体命名为pTOPOA(6703bp)。将重组载体pTOPOA引入大肠杆菌的感受态细胞
Figure BPA00001184818300061
菌株。本领域熟知的方法也可用于在合适的克隆载体中克隆片段以获得重组载体。可以使用本领域已知的方法在大肠杆菌或其它宿主细胞中进行重组载体的转化。具体的过程在实施例1中提供。
含有DNA A串联重复序列克隆(二聚体)的重组载体pTOPOA2的构建
通过在原始克隆pTOPOA中进一步克隆全长DNA A片段构建MYMIV DNA A的串联重复序列(二聚体)。因此获得的重组载体被命名为只含有一个有效BamHI位点的pTOPOA’。将从重组载体pTOPOA消化获得的PstI小片段在PstI限制性位点上克隆入载体pTOPA’从而获得全长DNA A。因此获得的重组载体被命名为具有一个BamHI限制性位点的pTOPOA1。将BamHI消化的DNA A的第二个片段克隆入pTOPOA1的BamHI位点从而获得含有全整DNA A二聚体的重组载体pTOPOA2。请参考实施例2。相似地，构建包含具有如SEQ ID NO：13所列的核苷酸序列的DNA A的重组载体，该重组载体被命名为pTOPOC2。
克隆全长MYMIV DNA B
利用CTAB方法制备来自用MYMIV感染的大豆(Glycine max)植物的有症状叶的总DNA。其它本领域中已知的方法也可以用于分离DNA。通过使用具有如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所列的核苷酸序列的引物序列以聚合酶链反应扩增全长MYMIV DNA B。
Bfl1：CGGGATCCAATGATGCCTCTGGCAATTTGTG SEQ IDNO：3
Bfl2：CGGGATCCTGGAGATTCAATATCTCAG SEQ IDNO：4
通过使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning试剂盒(Invitrogen)直接将2671bp的扩增产物克隆入pCR4Blunt-TOPO质粒载体(3956)。因此获得的重组载体被命名为pTOPOB(6627bp)。本领域熟知的方法也可以用于将片段克隆进入合适的载体。可以使用本领域已知的方法在大肠杆菌或其它宿主细胞中进行重组载体pTOPOB的转化。在实施例3中提供了具体的方法。通过限制性消化和PCR确认DNA B的克隆。通过使用本领域熟知的方法进行DNA克隆的完全测序。
DNA B的串联重复序列克隆(二聚体)的构建
通过进一步将全长的DNA B片段克隆入重组载体pTOPOB构建DNA B的串联重复序列(二聚体)。pTOPOB中的MYMIV DNA B插入片段有两个BamHI位点，一个在开头，另一个在末尾。因此获得的重组载体被命名为pTOPOB2(9298bp)。在实施例4中提供具体的方法。相似地，构建了包含具有如SEQ ID NO：13所列的核苷酸序列的DNA B的重组载体，该载体被命名为pTOPOD2。
通过将MYMIV DNA A(A2)和MYMIV DNA B(B2)的全长串联重复序列(二聚体)克隆入pCAMBIA载体构建双二聚体。
通过EcoRI消化从重组质粒pTOPOB2中切出MYMIV DNA成分B的二聚体并克隆入双元载体pCAMBIA 1305.1(Cambia，澳大利亚)的EcoRI消化的T-DNA区从而制备pCAMBIAB2。为了将二聚体DNA A克隆入相同的T-DNA，需要在DNA A二聚体的两个侧翼区上引入SalI和SacI限制性位点。用对TOPO侧翼DNA A二聚体的序列特异的引物进行PCR反应。将带有SalI位点的具有如SEQ ID NO：5所列的核苷酸序列的正向引物(Cfl1)和在其5’末端带有SacI的具有如SEQ ID NO：6所列的核苷酸序列的反向引物(Cfl2)用于扩增反应。具体过程在实施例5中有解释。
Cfl1：GGCGGATCCGTCGACAGCTCAGAATTAACCCTCACSEQ ID NO：5
Cfl2：GGCGGATCCGAGCTGTAGGGCGAATTGAATTTAGCSEQ ID NO：6
将双二聚体(pCAMBIAA2B2)克隆引入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
利用冻融方法将pCAMBIA中的MYMIV DNA A和B的重复串联重复序列即质粒pCAMBIAA2B2引入根癌农杆菌菌株EHA105中。其它的方法如电穿孔也可以用于农杆菌转化。携带DNA A和DNA B完整二聚体的重组农杆菌转化子被命名为MYMIVA2B2。利用PCR和Southern印迹分析确认转化子存在DNA A和DNA B的串联重复序列。在实施例6中提供具体的方法。其它的本领域中熟知的农杆菌菌株如LBA 4404和EHA 101也可以用于转化。相似地，构建重组植物转化载体pCAMBIAC2D2，其中载体包含具有如SEQ ID NO：13中所列的核苷酸序列的MYMIV DNA A和具有如SEQ ID NO：14中所列的核苷酸序列的MYMIV DNA B的双二聚体。
植物的农杆菌感染
通过使用含有pCAMBIAA2B2质粒(含有DNA A和DNA B完整二聚体)的重组农杆菌细胞MYMIVA2B2并利用茎接种方法进行农杆菌接种。其它本领域中已知的方法也可以用于植物的农杆菌感染。为了模拟接种，带有pCAMBIA载体的农杆菌培养物用作阴性对照。一些植物只用YEB+乙酰丁香酮接种并保持在相同的条件下作为“未接种的对照”。在实施例7中公开了具体的方法。
通过使用DNA-A和DNA-B特异性引物CP1(SEQ ID NO：7)、CP2(SEQ ID NO：8)和BV1(SEQ ID NO：9)和BV(SEQ ID NO：10)并利用聚合酶链反应确认农杆菌接种的大豆植物的农杆菌感染(实施例8)。
CP1：GAAACCTCGGTTTTACCGACTGTATAG SEQ ID NO：7
CP2：TTGCATACACAGGATTTGAGGCATGAG SEQ ID NO：8
BV：CACCGTCAAGAGGACGTTTACGTCTTC  SEQ ID NO：9
BV2：AGGCTATGCATGGATATAAATGCATAG SEQ ID NO：10
进行进一步的Southern杂交以确认各个病毒DNA整合入农杆菌感染的大豆植物。Southern分析确认了各种病毒DNA形式整合入带有症状的农杆菌接种的植物(实施例9)。
为了确认转基因的表达，进行了ELISA。在实施例10中提供具体的方法。通过使用针对外壳蛋白产生的多克隆抗体对叶的蛋白提取物进行ELISA测试。结果与PCR和Southern印迹的结果相符。
附图说明
图1：表示显示pCAMBIAA2B2构建的轮廓图。
图2：显示来自农杆菌接种的大豆植物的CP(外壳蛋白)基因的PCR扩增。
图3：显示从大豆植物中提取的总DNA的southern印迹分析，所述大豆植物用含有pCAMBIAA2B2的农杆菌培养物进行农杆菌接种。用DNA-A的Rep蛋白基因片段作为探针。还分析了模拟接种(M)和未接种(U)的植物。OC＝开环的，Lin＝线性的，SC＝超螺旋的，SS＝单链的。
具体实施方式
实施例
应该理解的是，本文所述的下列实施例只是为了举例说明的目的，各种针对性的修改或改变对本领域技术人员是已知的并包括在本发明的精神和范围内以及随附的权利要求的范围内。
实施例1
全长MYMIV DNA A的PCR扩增和克隆
利用CTAB方法或本领域中已知的方法制备来自大豆(Glycinemax)植物的有症状叶的总DNA。从已发表的序列设计具有重叠区(在其5’末端带有BamHI位点)的两套引物用于DNA扩增，从而扩增全长MYMIV DNA A。反应的条件为30个循环，解链、退火和聚合的条件分别为94℃30秒、55℃1分钟和72℃12分钟。用于扩增反应的引物(Afl1和Afl2)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2中所列。
Afl1：GGATCCATTGTTGAACGACTTTCC  SEQ ID NO：1
Afl2：GGATCCCACATTGTTAGTGGGTTC  SEQ ID NO：2。
通过根据制造商说明书使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行了扩增反应。其它本领域中已知的聚合酶也可以用于所述DNA片段的扩增。通过使用(3956bp)Zero Blunt TOPO PCR Cloning试剂盒(Invitrogen)直接将扩增产物(2747bp)克隆入pCR4Blunt-TOPO质粒载体，该载体被命名为pTOPOA(6703bp)，并引入大肠杆菌
Figure BPA00001184818300101
中。本领域熟知的方法也可以用于将片段克隆入合适的克隆载体从而获得重组载体。可以使用本领域中已知方法在大肠杆菌或其它宿主细胞中进行重组载体的转化。
在含氨苄西林(50μg/ml)、X-gal(40μg/ml)和IPTG(40μg/ml)的培养基上选择含有重组载体的重组大肠杆菌菌株
Figure BPA00001184818300111
通过使用Qiaprep(Qiagen)试剂盒并利用碱裂解法纯化质粒DNA。本领域中熟知的方法可以用于分离质粒DNA。
通过限制性消化和扩增方法确认DNA A克隆。通过本领域中已知的方法进行DNA克隆的完全测序。
实施例2
含有DNA A的串联重复序列克隆(二聚体)的重组载体pTOPOA2的构建
通过进一步将DNA A的全长片段克隆入原始克隆pTOPOA构建MYMIV DNA A的串联重复序列(二聚体)。重组载体pTOPOA中的MYMIV DNA A插入物有两个BamHI位点，一个在开头，另一个在末尾。为了制备二聚体，一个BamHI位点被无效掉，其它BamHI位点用于克隆BamHI消化的第二个全长DNA A片段。简而言之，pTOPOA的PstI消化释放了1.5kb(PstI小片段)和5.2Kb(PstI大片段)片段。自我连接大片段。因此获得的质粒被命名为pTOPOA’并只含有一个有效BamHI位点。然后通过用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理而无效BamHI位点。将从重组载体pTOPOA消化获得的PstI小片段在PstI限制性位点克隆入载体pTOPA’，从而获得全长DNA A。因此获得的重组载体被命名为具有一个BamHI限制性位点的pTOPOA1。将BamHI消化的DNA A的第二个片段克隆入pTOPOA1的BamHI位点，从而获得含有DNA A完整二聚体的重组载体pTOPOA2。利用限制性分析检查pTOPOA2(9450bp)中DNAA的串联方向。
实施例3
全长MYMIV DNA B的PCR扩增和克隆
利用CTAB方法制备来自用MYMIV感染的大豆植物有症状叶的总DNA。从已发表的序列设计具有在其5’末端具有BamHI位点的重叠区的两套引物，用于PCR反应从而扩增全长MYMIV DNA B。反应条件为30个循环，解链、退火和聚合的条件分别为94℃30秒、55°1分钟和72℃12分钟。用于PCR反应的引物的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：3(Bfl1)和SEQ ID NO：4(Bfl2)中。
Bfl1：CGGGATCCAATGATGCCTCTGGCAATTTGTG SEQ IDNO：3
Bfl2：CGGGATCCTGGAGATTCAATATCTCAG SEQ ID NO：4。
根据制造商的说明书使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行扩增反应。其它的本领域中已知的聚合酶也可以用于所述DNA片段的扩增。通过使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning试剂盒(Invitrogen)直接将扩增产物(2671bp)克隆入pCR4Blunt-TOPO质粒载体(3956)。因此获得的重组载体被命名为pTOPOB(6627bp)。本领域熟知的方法也可以用于将片段克隆入合适的载体。可以使用本领域中的已知方法在大肠杆菌或其它宿主细胞中进行重组载体pTOPOB的转化。
在含氨苄西林(50μg/ml)、X-gal(40μg/ml)和IPTG(40μg/ml)的培养基上选择含有pTOPOB的重组大肠杆菌菌株
Figure BPA00001184818300121
通过使用Qiaprep试剂盒(Qiagen)并利用碱裂解法纯化质粒DNA。本领域中熟知的方法可以用于分离质粒DNA。
利用限制性消化和PCR确认DNA B的克隆。使用本领域熟知的方法进行DNA克隆的完全测序。
实施例4
DNA B的串联重复序列克隆(二聚体)的构建
通过进一步将DNA B的全长片段克隆入重组载体pTOPOB构建DNA B的串联重复序列(二聚体)。pTOPOB中的MYMIV DNA B插入物有两个BamHI位点，一个在开头，另一个在末尾。为了制备二聚体，一个BamHI位点被失效，其它的BamHI位点用于克隆BamHI消化的第二个全长DNA B片段。pTOPOB的PstI消化给出2.4kb的小片段和4.3kb的大片段。自我连接大片段。因此获得的质粒被命名为pTOPOB’并只含有一个有效BamHI位点。通过用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理使BamHI位点失效。将从pTOPOB获得的PstI小片段重新插入pTOPOB’的PstI位点从而获得全长DNA B。因此获得的重组载体被命名为pTOPOB1并只含有一个BamHI位点。将BamHI消化的DNA B的第二个片段克隆入pTOPOB1的BamHI位点从而获得含有DNA B完整二聚体的重组载体pTOPOB2(9298bp)。利用限制性分析检查pTOPOB2中DNA B的串联方向。
实施例5
通过将MYMIV DNA A(A2)和MYMIV DNA B(B2)的完整串联重复序列(二聚体)克隆入pCAMBIA载体构建双二聚体
利用EcoRI消化从重组质粒pTOPOB2中切出MYMIV DNA成分B的二聚体，并克隆入双元载体pCAMBIA 1305.1(Cambia，澳大利亚)的EcoRI消化的T-DNA区，从而制备pCAMBIAB2。为了将二聚体DNA A克隆入相同的T-DNA，需要在DNA A二聚体的两个侧翼区引入SalI和SacI限制性位点。用对TOPO侧翼DNA A二聚体序列特异的引物进行PCR反应。将带有SalI位点并具有如SEQ IDNO：5所列的核苷酸序列的正向引物(Cfl1)和在其5’末端带有SacI并具有如SEQ ID NO：6中所列的核苷酸序列的反向引物(Cfl2)用于扩增反应。
Cfl1：GGCGGATCCGTCGACAGCTCAGAATTAACCCTCACSEQ ID NO：5
Cfl2：GGCGGATCCGAGCTGTAGGGCGAATTGAATTTAGCSEQ ID NO：6
用Pfu聚合酶进行聚合酶链反应。反应条件为30个循环，解链、退火和聚合的条件分别为94℃30秒，55℃1分钟和72℃15分钟。用SalI和SacI消化PCR产物，并将其克隆入pCAMBIAB2的T-DNA中的SalI-SacI位点。利用限制性消化检查获得的被命名为pCAMBIAA2B2的克隆(22655bp，图1)，并发现两个DNA A和DNA B二聚体在相同的T DNA上，所述二聚体由质粒DNA的小片段(small stretch)分开。还通过测序确认了克隆。
实施例6
将双二聚体(pCAMBIAA2B2)克隆引入根癌农杆菌
利用冻融方法将pCAMBIA中的MYMIV DNA A和B的重复串联序列，即质粒pCAMBIAA2B2，引入根癌农杆菌菌株EHA105中。其它的方法如电穿孔也可以用于农杆菌的转化。在1.5ml离心管中将质粒DNA(1-3μg)加至100μl的感受态农杆菌菌株EHA105。将管在液氮中冷冻30秒。将管立即转移至37℃水浴中5分钟。将1mlYEB培养基(1g/L酵母提取物、5g/L牛肉提取物、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、2mM MgSO4)加至管中并在28℃保持2-3小时，同时轻柔摇晃。在补充了卡那霉素(50μg/ml)的YEB-琼脂培养基上选择克隆。携带DNA A和DNA B的完整二聚体的农杆菌转化子被命名为MYMIVA2B2。利用PCR和Southern印迹分析确认转化子存在DNAA和DNA B的串联重复序列。
其它本领域熟知的农杆菌菌株如LBA 4404和EHA 101也可以用于转化。
实施例7
植物的农杆菌感染
将含有pCAMBIAA2B2质粒(含有DNA A和DNA B的完整二聚体)的重组农杆菌细胞MYMIVA2B2在28℃、YEB培养基(pH7.0)中培养过夜。在室温下将培养物在4000rpm离心5分钟。获得的沉淀重悬于含有100μM乙酰丁香酮的YEB培养基(pH 5.6)中。在无菌蛭石中使大豆种子发芽直到两叶阶段。利用茎接种方法进行农杆菌接种，其中通过用30号(30-gaze)针穿刺5-6次在大豆茎的生长结点区周围制造伤口。将约20μl的农杆菌培养物(MYMIVA2B2)置入伤口。对于模拟接种，具有pCAMBIA载体的农杆菌培养物用作阴性对照。将植物保持在28℃的温室中。一些植物只用YEB+乙酰丁香酮接种并保持在相同的条件下作为“未接种的对照”。
MYMIV感染症状的出现
测试六个大豆品种的农杆菌接种。在农杆菌接种10天后，在接种点上的第一个叶上开始出现黄色花叶病症状。在接种的21天内，所有的新出现的叶都显现出密集的黄色花斑。模拟接种和未接种的植物不显示症状。先前已知的野生MYMIV抗性品种UPSM用作对农杆菌接种出现抗性的阳性对照。在表1和2中提供了利用单个质粒和分开质粒上的DNA A和DNA B的农杆菌接种而获得的MYMIV对大豆品种感染性的比较数据。
表1：利用单个质粒上的DNA A和DNA B的农杆菌接种获得的MYMIV对大豆品种的感染性
  S.号   大豆品种   农杆菌接种的植物的数目   感染的植物数目   ％(百分比)
  1.   JS 335   90   82   91％
  2.   JS 71-05   10   10   100％
  3.   NRC 37   20   19   95％
  4.   TAMS-38   20   20   100％
  5.   AMS 353   20   20   100％
  6.   AMS 99-24   20   20   100％
  7.   UPSM(野生品种)   20   0   0％
表2：利用在分开的质粒上的DNA A和DNA B的农杆菌接种获得的MYMIV对大豆品种的感染性
  S.号   大豆品种   农杆菌接种的植物的数目   感染的植物的数目   ％(百分比)
  1.   JS 335   90   21   23％
  2.   JS 71-05   10   2   20％
  3.   NRC 37   20   2   10％
  4.   TAMS-38   20   3   15％
  5.   AMS 353   20   4   20％
  6.   AMS 99-24   20   3   15％
  7.   UPSM(野生品种)   20   0   0％
实施例8
DNA提取和PCR
利用CTAB方法从接种点上的三叶中提取总DNA。为了利用聚合酶链反应(PCR)检查病毒DNA的存在，使用了DNA-A和DNA-B的特异性引物CP1、CP2和BV1和BV。具有如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中所列的核苷酸序列的引物CP1和CP2对应于DNA-A的外壳蛋白基因，而具有如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中所列的核苷酸序列的引物BV1和BV2对应于DNA-B的移动蛋白基因。在PCR反应后，对应于外壳蛋白基因的575bp条带和对应于移动蛋白基因的652碱基对从农杆菌接种的植物中获得。从模拟接种的、未接种的或抗性的植物中未获得PCR片段(图2)。
CP1：GAAACCTCGGTTTTACCGACTGTATAG SEQ ID NO：7
CP2：TTGCATACACAGGATTTGAGGCATGAG SEQ ID NO：8
BV：CACCGTCAAGAGGACGTTTACGTCTTC SEQ ID NO：9
BV2：AGGCTATGCATGGATATAAATGCATAG SEQ ID NO：10
实施例9
Southern杂交
进行Southern杂交以确认各个病毒DNA在植物中的整合。约1μg的总DNA在tris-乙酸缓冲液中、在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，转移至硝酸纤维素膜上并用标记的探针(用MYMIV外壳蛋白基因和移动蛋白基因的PCR片段制成)杂交。放射性标记的探针利用随机引物标记方法或本领域中已知的方法产生。使用本领域中熟知的方法进行Southern杂交。Southern分析确认了带有症状的农杆菌接种的植物中各种病毒DNA形式的整合。在未接种的和模拟接种的植物和不带有症状的植物中未发现相应的条带(图3)。
实施例10
利用ELISA进行检测
使用双抗体夹心(Antibody-sandwich)ELISA检测来自受感染大豆植物的MYMIV外壳蛋白。针对MYMIV的外壳蛋白产生多克隆抗体。通过将抗体稀释至包被缓冲液(0.1M NaHCO3 Ph 8.6)，用该抗体制备捕获抗体。通过加入50μl的包被缓冲液并在4℃孵育过夜包被ELISA微量滴定板的每个孔。次日，用去离子水洗涤孔并在室温用50μl的3％BSA/PBS封闭。1小时后，除去封闭溶液，将来自受感染叶的蛋白提取物加入孔中。在37℃孵育微量滴定板1小时。在此之后，将蛋白提取物从孔中除去并用10x PBS/吐温20(0.05％)洗涤。现在，在1％BSA/PBS中以1∶1000稀释度向每孔加入25μl的第二抗体-碱性磷酸酶共轭物。在37℃孵育微量滴定板1小时。1小时后，用10x PBS/吐温20(0.05％)洗孔。向每个孔中加入底物溶液，在37℃使微量滴定板显色30分钟。
根据上面的描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的本质特征，并且在没有脱离本发明精神和范围的情况下，可以产生本发明的各种改变和修改从而使其适应各种应用和条件。因此，其它的具体实施方式也包括在下列权利要求的范围内。
Figure IPA00001184817900011
Figure IPA00001184817900031
Figure IPA00001184817900041
Figure IPA00001184817900051
Figure IPA00001184817900061
Figure IPA00001184817900071

Claims (10)

1.一种在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B的二聚体的重组DNA构建体，其中DNA A的多核苷酸序列与如SEQ ID NO：13中所列的核苷酸序列99％同一，并且DNA B的多核苷酸序列与如SEQ ID NO：14中所列的核苷酸序列97％同一。
2.一种在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B的二聚体的重组DNA构建体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13中所列，并且DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO：12或SEQID NO：14中所列。
3.一种含有根据权利要求1或权利要求2所述的重组DNA构建体的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其是植物转化载体。
5.一种含有根据权利要求2或权利要求3所述的重组载体的重组宿主细胞，其中宿主细胞选自大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。
6.一种通过使用根据前述权利要求任一项所述的重组DNA构建体或重组载体筛选绿豆黄色花叶病印度病毒抗性/耐受植物的方法。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组构建体或重组载体包含具有如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12中所列的核苷酸序列的多核苷酸。
8.一种具有如SEQ ID NO：11中所列的核苷酸序列的多核苷酸。
9.一种具有如SEQ ID NO：12中所列的核苷酸序列的多核苷酸。
10.具有如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中所列的核苷酸序列的寡核苷酸。
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