CN110384043B - 一种基本培养基、半夏组织培养基及半夏组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基本培养基、半夏组织培养基及半夏组织培养方法，一种基本培养基包括大量元素组分a、大量元素组分b、微量元素组分、有机元素组分和铁盐组分；本发明建立了采用该基本培养基进行配比的半夏基本培养基，并对培养方法中涉及的采用该半夏基本培养基为基础配制的半夏丛生芽诱导培养基、半夏丛生芽增殖培养基和半夏生根培养基进行了选择优化，具有芽诱导率高、增殖系数高、生根率高、且生根快，根系发达，植株粗壮，移栽存活率高，成本低的优点，实现半夏组培工厂化育苗，利于推广和使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术中的植物组织培养技术领域，具体涉及一种基本培养基、半夏组织培养基及半夏组织培养方法。
背景技术
半夏是天南星科多年生草本植物,以块茎入药,具有燥湿化痰,降逆止呕,消痞散结等功效,是一种重要的传统中药材，多生于山地、农田、溪边或林下。作为运用广泛的大宗中药材,随着市场用量的有增无减,半夏野生资源逐年锐减,已不能满足日益增长的市场需求,人工栽培是获取半夏药材的主要途径。
目前人工栽培采用小块茎育苗,用种量大,成本高,且存在叶型变异,子块茎多、种质退化等问题；利用组织培养技术,由外植体直接诱导分化成苗,作为种苗栽种,可提高繁殖率,防止种质退化缩短其生长周期；有效降低栽种成本，而培养基在整个组培过程中起着重要作用。半夏组培快繁多数使用MS培养基作为基本培养基，硝酸铵是MS培养基中的大量元素之一，起着非常重要的作用，现由于硝酸铵在国内属于违禁品，市场上难以购买，无法配置MS培养基。
因此，有必要研制一种替代MS培养基用于半夏组织培养。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，以提供一种能完全替代MS培养基用于半夏组织培养，解决半夏组培快繁的效率低、无法快繁优良形状半夏的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基本培养基，其特征在于，包括大量元素组分a、大量元素组分b、微量元素组分、有机元素组分和铁盐组分；所述大量元素组分a由以下重量配比的组分组成：硫酸铵2-3份、硝酸钾38-70份、磷酸二氢钾2-4份和硫酸镁4-8份；所述大量元素组分b由以下重量配比的组分组成：硝酸铵钙10-14份；所述微量元素组分由以下重量配比的组分组成：四水硫酸锰4.46份、七水硫酸锌17.72份、硼酸1.24份、碘化钾0.17份、二水钼酸钠0.05份、五水硫酸铜0.01份和六水氯化钴0.01份；所述有机元素组分由以下重量配比的组分组成：肌醇20份、盐酸硫胺素2份、盐酸吡哆醇0.2份和烟酸0.2份；所述铁盐组分由以下重量配比的组分组成：乙二胺四乙酸二钠7.46份和七水硫酸亚铁5.56份。
进一步的，一种半夏基本培养基，每升培养基包括以下组分：大量元素组分a包括硫酸铵100-150mg、硝酸钾1900-3500mg、磷酸二氢钾100-200mg和硫酸镁200-400mg大量元素组分b包括：硝酸铵钙500-700mg；微量元素组分包括：四水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.85mg、二水钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.05mg和六水氯化钴0.05mg；有机元素组分包括：肌醇100mg、盐酸硫胺素10mg、盐酸吡哆醇1mg和烟酸1mg；铁盐组分包括：乙二胺四乙酸二钠37.3mg和七水硫酸亚铁27.8mg。
进一步的，所述基本培养基的溶剂为超纯水。
进一步的，采用所述基本培养基的半夏丛生芽诱导培养基中每升还含有：白砂糖30g、琼脂5.5g、萘乙酸0.05mg和6-苄氨基嘌呤1mg。
进一步的，采用所述基本培养基的半夏丛生芽增殖培养基中每升还含有：白砂糖30g、琼脂5.5g、萘乙酸0.02mg和6-苄氨基嘌呤1.0mg。
进一步的，采用所述基本培养基的半夏生根培养基中每升还含有：白砂糖20-60g、琼脂5-6g、萘乙酸0.1-1mg和香蕉汁20-40g。
进一步的，所述香蕉汁的原料为成熟的香蕉皮、香蕉肉或香蕉中的一种。
一种采用基本培养基的半夏组织培养方法，包括以下步骤：
1)丛生芽的诱导培养：取半夏当年生幼嫩叶柄为外植体，经清洗灭菌处理后，将半夏叶柄切成1cm的小段接种到所述丛生芽诱导培养基上进行丛生芽的诱导，光照强度为2000lx，光照12h/d，温度25±1℃；
2)丛生芽的增殖培养：将诱导出来的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种到所述丛生芽增殖培养基中进行丛生芽的增殖培养，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃；
3)生根培养：从增殖的半夏丛生芽上切取健壮的3-5mm3单芽接种到所述生根培养基中进行生根培养，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃。
进一步的，所述半夏丛生芽诱导培养基、所述半夏丛生芽增殖培养基和所述半夏生根培养基的PH值均为5.8。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1.本发明提供的基本培养基，其配方科学合理，采用各组分母液进行配制，能够根据各植物性状的组培需要，进行各组分母液的不同配比调配适合不同植物组培需求，并在此基础上添加其他激素和药液，使得培养基更具有针对性，能够实现多种具有优良性状的植物快速繁殖，为多种植物组培工厂化育苗提供了新的技术支撑；
2.本发明提供的半夏基本培养基，采用本发明提供的基本培养基的各组分进行母液配比，根据半夏的组培需要选取一定比例配制半夏基本培养基；能够在该半夏基本培养基的基础上添加其他激素和药液，实现半夏的组培快繁和半夏组培工厂化育苗；
3.本发明提供的半夏组培用诱导培养基，采用本发明提供的半夏基本培养基，并添加有白砂糖、琼脂粉、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤，其配方科学合理；采用本发明配方制备的半夏丛生芽诱导培养基，有效提高半夏组织的诱导分化率，提高了半夏组培的生产效率和生产质量；
4.本发明提供的半夏丛生芽增殖培养基，利用半夏基本培养基，并添加有白砂糖、琼脂、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤，其配方科学合理；采用本发明配方制备的半夏丛生芽增殖培养基，其诱导的丛生芽增殖系数高，实现了半夏丛生芽的高效诱导增殖，进一步提高了半夏组培的生产效率和生产质量；
5.本发明提供的半夏生根培养基，利用半夏基本培养基，并添加有添加白砂糖、琼脂、萘乙酸，香蕉汁，其配方科学合理；采用本发明配方制备的半夏生根培养基，其生根率高达100％，且生根快，根系发达，植株粗壮，移栽存活率高，从而缩短了半夏的育苗周期，可在短期内获得大量脱毒组培苗，大大提高半夏的生产效率和质量，实现半夏组培工厂化育苗，利于推广和使用。
附图说明
图1为本发明半夏丛生芽增殖培养基诱导的丛生芽生长效果图；
图2为本发明半夏生根培养基进行半夏组织生根培养13天的生根效果图；
图3为本发明半夏生根培养基进行半夏组织生根培养55天的生根效果图。
具体实施方式
本发明公开了一种半夏组织培养基，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所述实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：基本培养基各母液的配置
处理S1：
1.称取大量元素组分a：硫酸铵2g、硝酸钾38g、磷酸二氢钾2g和硫酸镁4g，再依次用超纯水溶解后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后倒入广口瓶中待用，配成母液Ⅰ，使用时配制每升培养基取50ml母液Ⅰ；
称取大量元素组分b硝酸铵钙10g，再用超纯水溶解后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后倒入干净的光口瓶中待用，配成母液Ⅱ，使用时配制每升培养基取50ml母液Ⅱ；
2.称取微量元素组分：四水硫酸锰4.46g、七水硫酸锌1.72g、硼酸1.24g、碘化钾0.17g、二水钼酸钠0.05g、五水硫酸铜0.01g和六水氯化钴0.01g，再依次用超纯水溶解后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后，倒入干净的广口瓶中待用，配成母液Ⅲ，使用时配制每升培养基取5ml母液Ⅲ；
3.称取有机元素组分：肌醇20g、盐酸硫胺素2g、盐酸吡哆醇0.2g和烟酸0.2g，再依次用超纯水溶解后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后，倒入干净的广口瓶中待用，配成母液Ⅳ，使用时配制每升培养基取5ml母液Ⅳ；
4.称取铁盐组分：乙二胺四乙酸二钠7.46g和七水硫酸亚铁5.56g，再分别溶解于400mL的超纯水中后，充分搅拌后，将二者合并、快速搅拌均匀后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后，倒入干净的棕色瓶中待用，配成母液配成母液Ⅴ，使用时配制每升培养基取5ml母液Ⅴ。
采用该处理S1制备得到的基本培养基每升含有：硫酸铵100mg、硝酸钾1900mg、磷酸二氢钾100mg、硫酸镁200mg、硝酸铵钙500mg、四水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.85mg、二水钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.05mg、六水氯化钴0.05mg、肌醇100mg、盐酸硫胺素10mg、盐酸吡哆醇1mg和烟酸1mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg和七水硫酸亚铁27.8mg。
处理S2
1.称取大量元素组分a：硫酸铵2.8g、硝酸钾60g、磷酸二氢钾3g和硫酸镁6g，再依次用超纯水溶解后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后倒入广口瓶中待用，配成母液Ⅰ,使用时配制每升培养基取50ml母液Ⅰ；
称取大量元素组分b硝酸铵钙13g，再用超纯水溶解后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后倒入干净的光口瓶中待用，配成母液Ⅱ,使用时配制每升培养基取50ml母液Ⅱ；
2.微量元素组分、有机元素组分和铁盐组分母液的配置与处理S1相同。
采用该处理S2制备得到的基本培养基每升含有：硫酸铵140mg、硝酸钾3000mg、磷酸二氢钾150mg、硫酸镁300mg、硝酸铵钙650mg、四水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.85mg、二水钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.05mg、六水氯化钴0.05mg、肌醇100mg、盐酸硫胺素10mg、盐酸吡哆醇1mg和烟酸1mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg和七水硫酸亚铁27.8mg。
处理S3
1.称取大量元素组分a：硫酸铵3g、硝酸钾70g、磷酸二氢钾4g和硫酸镁8g，再依次用超纯水溶解后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后倒入广口瓶中待用，配成母液Ⅰ,使用时配制每升培养基取50ml母液Ⅰ；
称取大量元素组分b硝酸铵钙14g，再用超纯水溶解后定容于1L的容量瓶中，颠倒1L容量瓶混匀后倒入干净的光口瓶中待用，配成母液Ⅱ，使用时配制每升培养基取50ml母液Ⅱ；
2.微量元素组分、有机元素组分和铁盐组分母液的配置与处理S1相同。
采用该处理S3制备得到的基本培养基每升含有：硫酸铵150mg、硝酸钾3500mg、磷酸二氢钾200mg、硫酸镁400mg、硝酸铵钙700mg、四水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.85mg、二水钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.05mg、六水氯化钴0.05mg、肌醇100mg、盐酸硫胺素10mg、盐酸吡哆醇1mg和烟酸1mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg和七水硫酸亚铁27.8mg。
不用处理制备得到的半夏基本培养基中大量元素组分的配方对比见表1
表1各处理制备得到的半夏基本培养基中大量元素组分的对比配方表
实施例2：半夏丛生芽诱导培养基试验
处理1
1.半夏丛生芽诱导培养基各激素母液的配制
称取100mg萘乙酸放入2ml浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，完全溶解后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
称取100mg 6-苄氨基嘌呤溶液溶于2ml 1mol/L的氢氧化钠中，完全溶解以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的6-苄氨基嘌呤激素母液。
2.半夏丛生芽诱导培养基的制备
将500ml超纯水煮沸，按实施例1中处理S1取各组分母液的用量，并添加5.5g琼脂粉，继续加热至琼脂粉完全溶化后，加入30g白砂糖，加入1ml浓度为1mg/ml 6-苄氨基嘌呤激素母液，混匀；再加入50μl浓度为1mg/ml萘乙酸激素母液，混匀；定容为1L，混匀；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.8，分装入350ml的玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min，制得半夏丛生芽诱导培养基；
3.半夏丛生芽诱导培养基试验方法：
选取半夏当年生幼嫩叶柄为外植体，用清水清洗干净为止，用吸水纸吸干放入无菌操作台上干净的玻璃空瓶中，加入75％酒精摇晃浸泡30s，清水洗3次，将水倒于玻璃空瓶中；向上述瓶中倒入0.1％的升汞使半夏叶柄浸没其中，摇晃浸泡9min，清水洗5次，将水倒于玻璃空瓶中；用镊子无菌操作将半夏叶柄切成1cm的小段接种到上述步骤制备得到的半夏丛生芽诱导培养基上，共30组，每组2颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照12h/d，温度25±1℃；培养30d。
处理2
1.半夏丛生芽诱导培养基各激素母液的配制
称取100mg萘乙酸放入2ml浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，完全溶解后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
称取100mg 6-苄氨基嘌呤溶液溶于2ml 1mol/L的氢氧化钠中，完全溶解以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的6-苄氨基嘌呤激素母液。
2.半夏丛生芽诱导培养基的制备
将500ml超纯水煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加5.5g琼脂粉，继续加热至琼脂粉完全溶化后，加入30g白砂糖，加入1ml浓度为1mg/ml 6-苄氨基嘌呤激素母液，混匀；再加入50μl浓度为1mg/ml萘乙酸激素母液，混匀；定容为1L，混匀；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.8，分装入350ml的玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min，制得半夏丛生芽诱导培养基；
3.半夏丛生芽诱导培养基试验方法：
选取半夏当年生幼嫩叶柄为外植体，用清水清洗干净为止，用吸水纸吸干放入无菌操作台上干净的玻璃空瓶中，加入75％酒精摇晃浸泡30s，清水洗3次，将水倒于玻璃空瓶中；向上述瓶中倒入0.1％的升汞使半夏叶柄浸没其中，摇晃浸泡9min，清水洗5次，将水倒于玻璃空瓶中；用镊子无菌操作将半夏叶柄切成1cm的小段接种到上述步骤制备得到的半夏丛生芽诱导培养基上，共30组，每组2颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照12h/d，温度25±1℃；培养30d。
处理3
1.半夏丛生芽诱导培养基各激素母液的配制
称取100mg萘乙酸放入2ml浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，完全溶解后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
称取100mg 6-苄氨基嘌呤溶液溶于2ml 1mol/L的氢氧化钠中，完全溶解以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的6-苄氨基嘌呤激素母液。
2.半夏丛生芽诱导培养基的制备
将500ml超纯水煮沸，按实施例1中处理S3取各组分母液的用量，并添加5.5g琼脂粉，继续加热至琼脂粉完全溶化后，加入30g白砂糖，加入1ml浓度为1mg/ml 6-苄氨基嘌呤激素母液，混匀；再加入50μl浓度为1mg/ml萘乙酸激素母液，混匀；定容为1L，混匀；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.8，分装入350ml的玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min，制得半夏丛生芽诱导培养基；
3.半夏丛生芽诱导培养基试验方法：
选取半夏当年生幼嫩叶柄为外植体，用清水清洗干净为止，用吸水纸吸干放入无菌操作台上干净的玻璃空瓶中，加入75％酒精摇晃浸泡30s，清水洗3次，将水倒于玻璃空瓶中；向上述瓶中倒入0.1％的升汞使半夏叶柄浸没其中，摇晃浸泡9min，清水洗5次，将水倒于玻璃空瓶中；用镊子无菌操作将半夏叶柄切成1cm的小段接种到上述步骤制备得到的半夏丛生芽诱导培养基上，共30组，每组2颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照12h/d，温度25±1℃；培养30d。
处理4
对照组：以MS培养基为基本培养基对半夏进行丛生芽诱导培养
1.以MS培养基为基本培养基的半夏丛生芽诱导培养基配方为：MS培养基+白砂糖30g/L+琼脂5.5g/L+萘乙酸0.05mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L。
2.试验方法：用镊子无菌操作将用同上外植体消毒法处理后的半夏叶柄切成1cm的小段接种到以MS培养基为基本培养基的半夏丛生芽诱导培养基中进行诱导培养，共30组，每组2颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照12h/d，温度25±1℃；培养30d。
不同半夏基本培养基各母液的配比下外植体的诱导率见表2
表2不同半夏基本培养基各母液的配比下外植体的诱导率
试验结论：由表2可知，处理2的诱导系数最为突出，诱导分化的丛生芽成活数高，生长情况最好，诱导出来的芽较粗，呈嫩绿色；从诱导系数为主要判断标注来看，利于半夏丛生芽诱导培养的培养基选用实施例1中处理S2配制的半夏基本培养基。
与对照组相比：处理2的叶柄诱导的成活数和对照组相当，利用处理2制备的半夏丛生芽诱导基本培养基诱导系数略高于对照组，且处理2中芽的生长状态和对照组相当，因此选用实施例1中处理S2配制的半夏基本培养基作为半夏丛生芽诱导培养基的最佳基本培养基。
实施例3：半夏丛生芽增殖培养基试验
处理1
1.半夏丛生芽增殖培养基各激素母液的配制
称取100mg萘乙酸放入2ml浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，完全溶解后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
称取100mg 6-苄氨基嘌呤溶液溶于2ml 1mol/L的氢氧化钠中，完全溶解以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的6-苄氨基嘌呤激素母液。
2.半夏丛生芽增殖培养基的制备
将500ml超纯水煮沸，按实施例1中处理S1取各组分母液的用量，并添加5.5g琼脂粉，继续加热至琼脂粉完全溶化后，加入30g白砂糖，加入1ml浓度为1mg/ml 6-苄氨基嘌呤激素母液，混匀；再加入20μl浓度为1mg/ml萘乙酸激素母液，混匀；定容为1L，混匀；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.8，分装入350ml的玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min，制得半夏丛生芽增殖培养基；
3.半夏丛生芽增殖培养基试验方法：
将上述步骤得到的半夏丛生芽增殖培养基转入超净台中无菌操作，将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2中制备得到的丛生芽增殖培养基中培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养22天，半夏丛生芽增殖7.00±0.10倍，芽点多，绿色。
处理2
1.丛生芽增殖培养基各激素母液的配制
称取100mg萘乙酸放入2ml浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，完全溶解后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
称取100mg 6-苄氨基嘌呤溶液溶于2ml 1mol/L的氢氧化钠中，完全溶解以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的6-苄氨基嘌呤激素母液。
2.丛生芽增殖培养基的制备
将500ml超纯水煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加5.5g琼脂粉，继续加热至琼脂完全溶化，添加白砂糖30g，加入1ml浓度为1mg/ml6-苄氨基嘌呤激素母液，混匀；再加入20μl浓度为1mg/ml萘乙酸激素母液，混匀；定容为1L的容量瓶中，混匀；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.8，分装入350ml的玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min，制得丛生芽增殖培养基；
3.丛生芽增殖培养基试验方法：
将上述步骤得到的丛生芽增殖培养基转入超净台中无菌操作，将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2中制备得到的丛生芽增殖培养基中培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养22天，半夏丛生芽增殖9.89±0.80倍，芽多，绿色。
处理3
1.半夏丛生芽增殖培养基各激素母液的配制
称取100mg萘乙酸放入2ml浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，完全溶解后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
称取100mg 6-苄氨基嘌呤溶液溶于2ml 1mol/L的氢氧化钠中，完全溶解以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的6-苄氨基嘌呤激素母液。
2.半夏丛生芽增殖培养基的制备
将500ml超纯水煮沸，按实施例1中处理S3取各组分母液的用量，并添加5.5g琼脂粉，继续加热至琼脂完全溶化，加入白砂糖30g，加入1ml浓度为1mg/ml6-苄氨基嘌呤激素母液，混匀；再加入20μl浓度为1mg/ml萘乙酸激素母液，混匀；定容为1L的容量瓶中，混匀；然后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.8，分装入350ml的玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min，制得半夏丛生芽增殖培养基；
3.半夏丛生芽增殖培养基试验方法：
将上述步骤得到的丛生芽增殖培养基转入超净台中无菌操作，将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2中制备得到的丛生芽增殖培养基中培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养22天，半夏丛生芽增殖8.01±0.20倍，芽多，绿色。
处理4
对照组：以MS培养基为基本培养基对半夏进行丛生芽增殖培养
1.以MS培养基为基本培养基的半夏丛生芽增殖培养基配方为：MS培养基+白砂糖30g/L+琼脂5.5g/L+萘乙酸0.02mg/L+6-苄氨基嘌呤1.0mg/L。
2.试验方法：将实施例2中处理4培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种到以MS培养基为基本培养基的半夏增殖培养基中进行诱导增殖，共10组，每组4颗/瓶，贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养22天，半夏增殖倍数为9.10±0.50倍，芽点多，嫩绿色。
不同半夏基本培养基各母液配比下的丛生芽的增殖情况见表3
表3不同半夏基本培养基各母液的配比下丛生芽的增殖率
试验结论：由表3可知，处理2的增殖系数最为突出，芽苗成活数高，生长情况最好。从增殖系数为主要判断标注来看，利于半夏丛生芽增殖培养的培养基选用实施例1中处理S2配制的半夏基本培养基。
与对照组相比：处理2的增殖系数差异不明显，成活率相当，生长状态良好，由此可以判断实施例1中处理S2的半夏基本培养基作为基本培养基其培养效果与MS培养基相当，因此选用实施例1中处理S2配制的半夏基本培养基作为半夏丛生芽增殖培养基的最佳基本培养基。
实施例4半夏生根培养基的试验
处理1
1.半夏生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将20g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.半夏生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉5.5g，继续加热至琼脂完全溶化后，加入20g白砂糖，加入0.1ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.半夏生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的半夏生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得的半夏苗绿色，高度6-8cm，根较壮，根长4-7cm，根数3-4根。
处理2
1.半夏生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将30g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.半夏生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉，继续加热至琼脂完全溶化后，加入20g白砂糖，加入0.5ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.半夏生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得的半夏苗绿色，平均高度9-10cm，根较细，根长2-4cm，根数20-30根。
处理3
1.生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将40g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉，继续加热至琼脂完全溶化，加入20g白砂糖，加入1ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天，获得的半夏苗绿色，平均高度6-7cm，根较细，根长1-2cm，根数20-40根。
处理4
1.生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将20g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉5.5g，继续加热至琼脂完全溶化，加入30g白砂糖，加入0.1ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得的半夏苗绿色，高度6-8cm，根较壮，根长3-7cm，根数3-6根。
处理5
1.生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将30g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉5.5g，继续加热至琼脂完全溶化，加入30g白砂糖，加入0.5ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得半夏苗绿色，平均高度12-14cm，根较细，根长2-5cm，根数20-30根。
处理6
1.生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将40g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉5.5g，继续加热至琼脂完全溶化，加入30g白砂糖，加入1ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得半夏苗绿色，平均高度6-9cm，根较细，根长1-3cm，根数25-35根。
处理7
1.生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将20g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉5.5g，继续加热至琼脂完全溶化，加入60g白砂糖，加入0.1ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得半夏苗绿色，高度3-6cm，根较壮，根长2-4cm，根数2-6根。
处理8
1.生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将30g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉5.5g，继续加热至琼脂完全溶化，加入60g白砂糖，加入0.5ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得半夏苗绿色，高度2-5cm，根较壮，根长2-3cm，根数2-4根。
处理9
1.生根培养基激素母液和香蕉汁的配制
称取100mg萘乙酸溶于2ml浓度为1mol/L的NaOH溶液中，溶解完全以后用超纯水定容于100ml的容量瓶中即可获得浓度为1mg/ml的萘乙酸激素母液；
将40g带皮成熟香蕉皮切碎放入500ml水中煮烂，用无菌纱布过滤2-3次去除残渣，得到香蕉汁待用。
2.生根培养基的制备：
将上述步骤得到的香蕉汁煮沸，按实施例1中处理S2取各组分母液的用量，并添加琼脂粉5.5g，继续加热至琼脂完全溶化，加入60g白砂糖，加入1ml浓度为1mg/ml的萘乙酸，混匀，定容为1L，混匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值为5.8，分装入350ml玻璃瓶中，121℃高温高压灭菌20min。
3.生根培养基的试验方法
将上述步骤得到的生根培养基转入超净台中无菌操作：将实施例2中处理2培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种于上述步骤2配制得到的半夏生根培养基中生根培养，共10组，每组4颗/瓶；贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得半夏苗绿色，平均高度2-5cm，根较壮，根长2-3cm，根数3-4根。
处理10
对照组：以MS培养基为基本培养基对半夏进行生根培养
1.以MS培养基为基本培养基的半夏生根培养基配方为：MS培养基+白砂糖30g/L+琼脂5.5g/L+萘乙酸0.5mg/L+香蕉汁30g/L，pH 5.8。
2.试验方法：将实施例2中处理4培养得到的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种到以MS培养基为基本培养基的半夏生根培养基中进行生根培养，共10组，每组4颗/瓶，贴好标签，放于组培室培养。培养条件为：光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃，培养55天获得的半夏苗绿色，平均高度11-14cm，根较细，根长2-4cm，根数20-30根。
各组添加不同含量激素及香蕉配比的生根效果见表4。
表4各添加不同含量激素及香蕉配比的半夏生根效果
试验结论：由表4可知，处理5的半夏苗生长情况最好，苗高12-14cm，根系发达，根长2-5cm，根数20-30根，因此，利于半夏组织培养的生根培养基选用每升含有：硫酸铵140mg、硝酸钾3000mg、磷酸二氢钾150mg、硫酸镁300mg、硝酸铵钙650mg、四水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.85mg、二水钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.05mg、六水氯化钴0.05mg、肌醇100mg、盐酸硫胺素10mg、盐酸吡哆醇1mg和烟酸1mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg和七水硫酸亚铁27.8mg的半夏基本培养基，并添加有白砂糖30g/L、琼脂5.5g/L、萘乙酸0.5mg/L和香蕉汁30g/L。
与对照组相比：处理5的半夏苗高略微高于对照组的半夏苗，根系数量与长度相差不大，因此选用实施例1中处理S2配制的半夏基本培养基作为半夏生根培养基的最佳基本培养基，其生根效果与采用MS培养基的组培生根效果相当。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种半夏基本培养基，其特征在于，每升培养基由以下组分组成：
大量元素组分a由硫酸铵140mg、硝酸钾3000mg、磷酸二氢钾150mg和硫酸镁300mg组成；
大量元素组分b为硝酸铵钙650mg；
微量元素组分由四水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.85mg、二水钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.05mg和六水氯化钴0.05mg组成；
有机元素组分由肌醇100mg、盐酸硫胺素10mg、盐酸吡哆醇1mg和烟酸1mg组成；
铁盐组分由乙二胺四乙酸二钠37.3mg和七水硫酸亚铁27.8mg组成。
2.根据权利要求1所述的一种半夏基本培养基，其特征在于，所述基本培养基的溶剂为超纯水。
3.一种采用权利要求1或2所述半夏基本培养基的半夏丛生芽诱导培养基，其特征在于：所述丛生芽诱导培养基中每升还含有：白砂糖30g、琼脂5.5g、萘乙酸0.05mg和6-苄氨基嘌呤1mg。
4.一种采用权利要求1或2所述半夏基本培养基的半夏丛生芽增殖培养基，其特征在于，所述丛生芽增殖培养基中每升还含有：白砂糖30g、琼脂5.5g、萘乙酸0.02mg和6-苄氨基嘌呤1.0mg。
5.一种采用权利要求1或2所述半夏基本培养基的半夏生根培养基，其特征在于，所述半夏生根培养基中每升还含有：白砂糖20-60g、琼脂5.5g、萘乙酸0.1-1mg和香蕉汁20-40g。
6.根据权利要求5所述的一种半夏生根培养基，其特征在于，所述香蕉汁的原料为成熟的香蕉皮、香蕉肉或香蕉中的一种。
7.一种采用权利要求1或2所述半夏基本培养基的半夏组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)丛生芽的诱导培养：取半夏当年生幼嫩叶柄为外植体，经清洗灭菌处理后，将半夏叶柄切成1cm的小段接种到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽的诱导，光照强度为2000lx，光照12h/d，温度25±1℃；所述丛生芽诱导培养基采用权利要求1或2所述基本培养基进行制备，所述丛生芽诱导培养基中每升还含有：白砂糖30g、琼脂5.5g、萘乙酸0.05mg和6-苄氨基嘌呤1mg；
2)丛生芽的增殖培养：将诱导出来的半夏丛生芽切成3-5mm3单芽接种到丛生芽增殖培养基中进行丛生芽的增殖培养，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃；所述丛生芽增殖培养基采用权利要求1或2所述基本培养基进行制备，所述丛生芽增殖培养基中每升还含有：白砂糖30g、琼脂5.5g、萘乙酸0.02mg和6-苄氨基嘌呤1.0mg；
3)生根培养：从增殖的半夏丛生芽上切取健壮的3-5mm3单芽接种到生根培养基中进行生根培养，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，培养温度为25±1℃；所述生根培养基采用权利要求1或2所述基本培养基进行制备，所述生根培养基中每升还含有：白砂糖20-60g、琼脂5.5g、萘乙酸0.1-1mg和香蕉汁20-40g。
8.根据权利要求7所述的一种采用半夏基本培养基的半夏组织培养方法，其特征在于，所述半夏丛生芽诱导培养基、所述半夏丛生芽增殖培养基和所述半夏生根培养基的PH值均为5.8。
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Also Published As
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