CN102134561B - 一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基 - Google Patents
一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基；旨在提供一种可以提高青天葵组织培养的速度，增加青天葵组培根状茎的鲜重，使青天葵组培根状茎快速繁殖的培养基；该培养基用蒸馏水配置，培养基内各种物质的浓度为包括基本培养基含有MS、6-BA1.2～1.4mg·L-1、PP3331.0～1.3mg·L-1、KT1.3～1.6mg·L-1、酵母膏1.0g·L-1、蔗糖10～30g·L-1；该培养基可使青天葵组培根状茎的快速增殖，具有较强的实用性和推广性。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基，尤其涉及一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，属于生物培养基技术领域。
背景技术
青天葵是我国珍稀濒危植物，用于治疗肺痨咯血，肺热咳嗽、口腔炎、咽喉肿痛、瘰疬、疮疡肿毒、跌打损伤等疾病。青天葵主要以球茎进行繁殖，但繁殖系数极低，加之多年来人们灭绝式的挖掘，导致野生青天葵资源日益枯竭。然而，国内外市场的需求量却逐年加大，青天葵已远远满足不了市场的需求。因此，组织培养与人工种植成为保护野生青天葵资源，解决供需矛盾的有效途径，然而在现有的技术中青天葵组织培养过程中普遍存在的根状茎增殖速度慢的技术问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种青天葵组培根状茎的快速增殖的培养基，使青天葵组培根状茎快速繁殖，增加青天葵组培根状茎的鲜重。
本发明所述的一种青天葵组培根状茎的快速增殖的培养基，其中所述的培养基包括基本培养基和水，还含有碳源10～40g·L-1、重量份1%天然添加物、激素0～3mg·L-1。
上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述的碳源为蔗糖或白砂糖的其中之一。
上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述的基本培养基为KC或BM或MS或1/2MS的其中之一。
上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述的天然添加物是浓度为100 g·L-1的苹果或香蕉或番茄或椰子的其中之一，也可以是浓度为1.0 g·L-1的蛋白胨或牛肉膏或酵母膏的其中之一。
上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述的激素为6-苄基嘌呤6-BA或多效唑PP333或激动素KT的其中之一或者它们的组合物。
上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述的水为蒸馏水。
进一步的，上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述的基本培养基KC的配方为：(NH4)2SO4 250mg·L-1、MgSO4·7H2O 250mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 1000mg·L-1、KH2PO4 250mg·L-1、FeSO4·7H2O 250 mg·L-1、MnSO4·4H2O 7.5mg·L-1；BM的配方为：NH4NO3 1650mg·L-1、KNO3 1900 mg·L-1、CaCl2·2H2O 440mg·L-1、MgSO4·7H2O 370mg·L-1、KH2PO4 170mg·L-1；KI 0.83mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1、Na2MnO4·2H2O 0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025mg·L-1；FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg·L-1；肌醇100 mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、维生素B6 0.5mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1；MS的配方为NH4NO3 1650mg·L-1、KNO3 1900mg·L-1、CaCl2·2H2O 440mg·L-1、KH2PO4 170mg·L-1、MgSO4·7H2O 370mg·L-1、KI 0.83mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1、Na2MnO4·2H2O 0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg·L-1、肌醇100mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、维生素B6 0.5mg·L-1、维生素B1 0.1mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1；1/2 MS的配方为：NH4NO3 1325mg·L-1、KNO3 950 mg·L-1、CaCl2·2H2O 220mg·L-1、MgSO4·7H2O 185mg·L-1、KH2PO4 85mg·L-1、KI 0.83mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1、Na2MnO4·2H2O 0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025mg·L-1、FeSO4·7H2O27.8mg·L-1、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg·L-1、肌醇 100mg·L-1 、烟酸 0.5mg·L-1、维生素B6 0.5mg·L-1、盐维生素B1 0.1mg·L-1、甘氨酸 2.0mg·L-1。
进一步的，上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述的激素6-苄基嘌呤6-BA浓度为1～3 mg·L-1、多效唑PP333浓度为0～2 mg·L-1、激动素KT浓度为0～2 mg·L-1。
进一步的，上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述天然添加物的制作方法是将苹果、香蕉、番茄，切碎，称取所需量（按重量/体积=100g·L-1），放入烧杯中，加入500mL蒸馏水，加热至沸腾，保持30min，过滤，取滤液配制培养基；椰汁过滤后，取滤液加500mL蒸馏水配制培养基；称取所需量（1.0g·L-1）的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，加500mL蒸馏水溶解后配制培养基。
进一步的，上述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其中所述的碳源10～40g·L-1、基本培养基、重量份1%天然添加物、激素0～3mg·L-1和水，采用单因素实验和正交试验得到优选配方为MS、6-BA1.3 mg·L-1、 PP3331.1mg·L-1、 KT1.5mg·L-1、酵母膏1.0g·L-1、蔗糖20g·L-1。
本发明与现有技术比较，该培养基可以提高青天葵组织培养的速度，达到快速繁殖的目的；另外，青天葵组培根状茎的鲜重增长率可达1948.8%，高于文献报道，具有较强的实用性和推广性。
附图说明
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明的碳源对根状茎鲜重增长率的影响；
图中：1. 蔗糖10g·L-1，2. 蔗糖20g·L-1，3. 蔗糖30g·L-1，4. 蔗糖40g·L-1， 5. 白砂糖10g·L-1，6. 白砂糖20 g·L-1，7. 白砂糖30g·L-1，8. 白砂糖40g·L-1。
图2是本发明的基本培养基对根状茎鲜重增长率的影响；
图中：1. KC，2. BM，3. MS，4. 1/2MS。
图3是本发明的天然添加物对根状茎鲜重增长率的影响。
图中：1. 番茄，2. 香蕉， 3. 苹果， 4. 椰汁，5. 蛋白胨，6. 酵母，7.牛肉膏，8. 空白。
具体实施方式
实施例1 青天葵根状茎的诱导外植体试验
取青天葵球茎，洗净泥沙，用75%酒精灭菌30s，0.2%的氯化汞灭菌25min，再接种于MS+6-BA 2mg·L-1的培养基上，待青天葵长出萌芽后，再取青天葵萌芽分接到培养基MS+6-BA 2mg·L-1的培养基上进行继代培养，青天葵根状茎的诱导外植体生长状态良好，无褐变产生。
实施例2 水质对根状茎鲜重增长率影响的单因素试验
采用1/2MS+ 6-BA 2.5mg·L-1+PP333 0.4 mg·L-1作为培养基，考察蒸馏水与自来水对根状茎鲜重增长率的影响。
取生长一定时期的根状茎分别接蒸馏水、自来水配制的基本培养中，1月后统计根状茎鲜重增长率，结果见表1。
表1 水质对根状茎鲜重增长率的影响
鲜重增长率（%）=（生长后的鲜重-接种时的鲜重）/接种时的鲜重×100%。
从表1的结果可知，使用蒸馏水配制的培养基对青天葵组培根状茎鲜重增长率高于使用自来水配制的培养基。
实施例3 碳源对根状茎鲜重增长率影响的单因素试验
采用1/2MS+ 6-BA 2.5mg·L-1+ PP333 0.4 mg·L-1培养基，考察不同碳源对根状茎鲜重增长率的影响，实验设计见表2。
表2 碳源对根状茎鲜重增长率的影响
1月后统计根状茎鲜重增长率，结果见表3和附图1。
表3 碳源对根状茎鲜重增长率的影响
由表3和附图1可知，培养基中碳源对青天葵组培根状茎鲜重增长率有较显著的影响，蔗糖的平均增长率高于白砂糖的平均增长率，说明蔗糖对青天葵组培根状茎增殖效果好；比较蔗糖的含量对增长率影响发现，当蔗糖含量为10g·L-1时，根状茎鲜重增长率最低，升高为20g·L-1时，达到最大值，再增加蔗糖量，根状茎鲜重增长率反而下降。
实施例4 培养基对根状茎鲜重增长率影响的单因素试验
考察基本培养基KC、BM、MS、1/2MS四种培养基对根状茎鲜重的影响，取生长同样时间的根状茎接入上述四种基本培养中，1月后统计根状茎鲜重增长率，结果见表4和图2。
表4 基本培养基对根状茎鲜重增长率的影响
由表4和图2结果可知，基本培养基对青天葵组培根状茎鲜重增长率有较显著的影响，其中MS培养基对根状茎鲜重增长率最高。
实施例5 天然添加物对根状茎鲜重增长率影响的单因素试验
采用MS+6-BA 2.5mg·L-1+PP3330.4mg·L-1培养基，考察重量份10%苹果、10%香蕉、10%番茄、10%椰子、1g·L-1蛋白胨、1g·L-1牛肉膏、1g·L-1酵母膏对青天葵组培根状茎鲜重增长率的影响，以不添加天然营养物质的MS+ 6-BA 2.5mg·L-1+PP333 0.4mg·L-1培养基为空白对照。将青天葵组培根状茎接种到新鲜的添加了不同天然营养物质的培养基中，1个月后统计根状茎鲜重生长率，结果见表5和附图3。
表5 天然添加物对根状茎鲜重增长率的影响
由表5和附图3可知，上述8种培养基中，对青天葵组培根状茎增殖效果为6>3>8>2>1>5>7>4，即酵母膏>苹果>空白>香蕉>番茄>蛋白胨>牛肉膏>椰汁。其中酵母膏和苹果的增长率高于空白对照组，且添加酵母膏的培养基根状茎生长最快，增长率高达144.1，说明酵母膏和苹果汁对青天葵组培根状茎的生长具有促进作用，香蕉、番茄、蛋白胨、牛肉膏、椰汁对青天葵组培根状茎的增长率低于空白对照组，其中添加椰汁的培养基根状茎生长最慢，增长率只有60.9%，说明香蕉、番茄、蛋白胨、牛肉膏、椰汁对青天葵组培根状茎的生长具有抑制作用。因此可在培养基中添加1.0g·L-1酵母膏、10%苹果促进青天葵组培根状茎的生长。
实施例6 激素对根状茎鲜重增长率影响的单因素试验
以MS+1.0g·L-1酵母膏为培养基，采用均匀设计法，选用U9（94）见表6，同时考察了6-BA、PP333、KT浓度交叉配比对青天葵组培根状茎鲜重增长率的影响。表6、表7和方程中，X1为6-BA浓度，X2为PP333浓度、X3为KT浓度，y为青天葵组培根状茎鲜重增长率。
表6 U9（94）表因素及水平设计
表7 U9（94）均匀设计试验安排及结果
数据经DPS v7.05分析软件逐步回归分析，得回归方程为y=2322.4-1436.2X1-1727.1X2+257.8X3-44.1X1X2+558.2X1 2+758.4X2 2，样本N=10，显著水平p=0.017小于0.05，复相关系数R=0.9970，检验值F=55.868，Durbin-Watson统计量 d=2.67347959 接近于2，各回归系数的偏相关系数的显著水平p值均小于等于0.05从上述分析结果可看出，回归方程的拟合效果很好。对回归方程求解，得最优组合为：X1：1.3，X2：1.1，X3：1.5，即6-BA1.3 mg·L-1、多效唑PP3331.1mg·L-1、激动素KT1.5mg·L-1。
另外，在9种不同增殖培养基中，青天葵根状茎的形态有较大差异。其中1号、3号、4号培养基中根状茎形态相似，较粗状，茎节短；2号和9号培养基中芽较多；5号和7号培养基中根状茎形态相似，呈鸡爪状，茎节较长。
实施例7 正交试验
以MS +6-BA1.3mg·L-1+PP333 1.1mg·L-1+KT1.5mg·L-1+酵母膏1.0 g·L-1、为培养基，采用正交设计法，选用L9(43)正交表，考察a-萘乙酸、活性炭、蔗糖配比及光照条件对青天葵球茎生成的影响，见表8，每组6个重复。
表8 L9(43) 因子水平表
表9 L9(43)实验安排及结果
直观分析可以发现，a-萘乙酸用量、光照对实验结果影响较大。为了进一步反映各因子之间的差异，以便寻求最佳水平，对球茎生成数进行方差分析，结果见表10。
表10 L9(43)方差分析
由表10知，因子a-萘乙酸的用量对球茎生成作用显著，当a-萘乙酸为0时才能生成球茎，a-萘乙酸对球茎的生成有抑制作用。因子活性炭、蔗糖、光照条件作用不显著。4个因子对青天葵球茎生成影响因素作用大小依次为：a-萘乙酸>光照条件>活性炭 >蔗糖。由表4.9可知青天葵球茎生成的最佳培养条件为：a-萘乙酸0.0mg·L-1、活性炭0.0%·L-1、蔗糖20 g·L-1、黑暗，即MS培养基于黑暗处培养。用些条件培养青天葵根状茎，生成的球茎最多。
实施例8 根茎诱导形成球茎再形成植株试验
将青天葵组培根状茎接种于不加激素和添加物的MS培养基中黑暗诱导形成球茎，然后将生成的球茎移至有光条件下继续培养，球茎顶端长出绿色的细长芽，底部长出白色的根，芽端逐渐伸长形成叶柄和叶片。
实施例9 炼苗与移栽试验
将已经长出芽的球茎或已经生根的试管苗，置于自然光下培养3天后，打开试管苗瓶盖炼苗3天，然后用镊子轻轻夹出试管苗，洗去基部的琼脂，移栽于营养土见或腐殖土中，保持一定湿度，避免强光照射，移栽成活率90%以上，植株长势良好。
实施例10 优选条件试验
取青天葵球茎，洗净泥沙，用75%酒精灭菌30s，0.2%的氯化汞灭菌25min，再接种到MS+6-BA 2mg/L的培养基上，能够萌发，长出根状茎，将根状茎接种到MS+6-BA1.3 mg·L-1+PP3331.1mg·L-1+KT1.5mg·L-1+酵母膏1.0g·L-1+蔗糖20g·L-1的培养基上，生长1月后统计根状茎鲜重增长率达1948.8%。使用该培养基该可使青天葵组培根状茎的快速增殖，增加根状茎的鲜重，具有较强的实用性和推广性。
Claims (2)
1.一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，包括基本培养基和水，其特征在于，培养基的配方为MS、6-苄基嘌呤6-BA 1.2～1.4 mg.L-1、多效唑PP333 1.0～1.3mg.L-1、激动素KT 1.3～1.6mg.L-1、酵母膏1.0g.L-1和蔗糖10～30g.L-1，所述的MS的配方为NH4NO3 1650mg·L-1、KNO3 1900mg·L-1、CaCl2·2H2O 440mg·L-1、KH2PO4 170mg·L-1、MgSO4·7H2O 370mg·L-1、KI 0.83mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1、Na2MnO4·2H2O 0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg·L-1、肌醇100mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、维生素B6 0.5mg·L-1、维生素B1 0.1mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1。
2. 根据权利要求1所述的一种青天葵组培根状茎快速增殖的培养基，其特征在于，所述的水为蒸馏水。
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