CN107006373B - 一种青天葵的组培繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青天葵的组培繁殖方法，包括步骤一、培养基准备；步骤二、外植体处理和接种：采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步；步骤三、培养：该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度23±2℃，采用波长在520‑580的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射3小时后，停止光照3小时，再照射3小时，如此循环交替照射，光照强度600‑1000流明，培养时间2‑3个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；步骤四、移栽。本发明采用3个月的组培时间即可形成根系发达，枝叶健壮的组培苗，且本发明的青天葵块茎平均重于野生青天葵的块茎10克以上。

Description

一种青天葵的组培繁殖方法

技术领域

本发明涉及组培繁殖的技术领域，尤其涉及一种青天葵的组培繁殖方法。

背景技术

目前，随着生物技术的迅猛发展，一些珍稀菌类和珍稀植物已逐渐走向产业化人工驯养和规模栽植，例如珍稀植物金线莲、半光植物石斛、青天葵等。青天葵又称“一粒癀”，为兰科植物。它是一种珍稀中草药，民间有悠久的应用史。野生青天葵数量少，分布星散和难寻找，影响科研和利用的深入进行，为解决上述矛盾，需进行无性快速繁殖技术的研究。

青天葵是一种地生兰稃植物。植物体的地下部分有一个近圆球形至椭圆形的块茎，为药用主要部分。块茎乳白色，略透明。块茎、根状茎和根表面密布细如蛛丝状的共生真菌苗丝。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种青天葵的组培繁殖方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青天葵的组培繁殖方法，以获得成活率高、生长快、产量高、营养成分高的青天葵。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：

一种青天葵的组培繁殖方法，包括如下步骤：

步骤一、培养基准备：

以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤0.1-0.5mg、萘乙酸0.2-0.5mg、香蕉100g、土豆25g和琼脂6.5g，混合后的培养基的pH值调节至4.5-6.5；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；高压锅灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

步骤二、外植体处理和接种：

采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步，其中：

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2-3小时；

消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润8-10秒后，放入10％的氯化汞溶液中消毒10-15分钟，用无菌水清洗3-6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长8-12cm、含一个茎节的若干茎段，接于所述培养基上，每瓶接1个茎段；

步骤三、培养：

该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度23±2℃，采用波长在520-580的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射3小时后，停止光照3小时，再照射3小时，如此循环交替照射，光照强度600-1000流明，培养时间2-3个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

步骤四、移栽：

选苗高6-8cm、茎基直径约2mm、发根2-3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至大棚种植基质中栽培，按株距6cm×6cm、行距10cm×10cm的标准种植，填土压实。

作为实施例的优选方式，所述种植基质包括无机基质层及有机基质层，采用赤红壤作为无机基质层，烈日下暴晒2-6天；将暴晒后所述赤红壤装在标准种植盘上，厚度为3-5cm；再在所述赤红壤上方铺设有机基质层，厚度为2-3cm；所述机基质层的制备方法为：称取如下重量份数的原料：牛粪60-80、落叶20-30、秸秆20-35、锯末15-20及树皮25-30；将上述原料混合均匀，加入适量的水，接种酵母菌，堆积发酵20-25天，消毒制得。

作为实施例的优选方式，大棚栽培的条件为：

1)温度的控制：所述青天葵在15-30℃内可以正常生长，当温度超过28℃以上，通过喷雾装置降温；冬天放下塑料薄膜、保温至6℃以上；

2)湿度的控制：所述青天葵生长空气湿度为60-80％；

3)光度的控制：所述青天葵光度为600-1000流明。

本发明采用上述技术方案后，本发明具有以下有益效果：

1.本发明人在一次偶然地试验中，意外地发现采用波长在520-580的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，可以大大提高青天葵的生长速度及产量，传统青天葵组培的时间一般要在4个月以上，而本发明3个月即可，且本发明组培的青天葵块茎鲜重都明显大于野生的青天葵块茎，平均重于野生的青天葵块茎10克以上。

2.在培养基中加入香蕉对于促进幼苗生长非常有利，叶片净增量、发根数和鲜重净增量高。

3.经过组培试验，增殖率可达8倍。

具体实施方式

实施例1

一种青天葵的组培繁殖方法，包括如下步骤：

步骤一、培养基准备：

以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤0.1mg、萘乙酸0.2mg、香蕉100g、土豆25g和琼脂6.5g，混合后的培养基的pH值调节至5.6；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；高压锅灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

步骤二、外植体处理和接种：

采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步，其中：

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2小时；

消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润8秒后，放入10％的氯化汞溶液中消毒10分钟，用无菌水清洗3-6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长8cm、含一个茎节的若干茎段，接于所述培养基上，每瓶接1个茎段；

步骤三、培养：

该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度23℃，采用波长在520的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射3小时后，停止光照3小时，再照射3小时，如此循环交替照射，光照强度600流明，培养时间3个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

步骤四、移栽：

选苗高6-8cm、茎基直径约2mm、发根2-3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至大棚种植基质中栽培，按株距6cm×6cm、行距10cm×10cm的标准种植，填土压实。

作为实施例的优选方式，所述种植基质包括无机基质层及有机基质层，采用赤红壤作为无机基质层，烈日下暴晒2-6天；将暴晒后所述赤红壤装在标准种植盘上，厚度为3-5cm；再在所述赤红壤上方铺设有机基质层，厚度为2-3cm；所述机基质层的制备方法为：称取如下重量份数的原料：牛粪60-80、落叶20-30、秸秆20-35、锯末15-20及树皮25-30；将上述原料混合均匀，加入适量的水，接种酵母菌，堆积发酵20-25天，消毒制得。

实施例2

一种青天葵的组培繁殖方法，包括如下步骤：

步骤一、培养基准备：

以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.5mg、香蕉100g、土豆25g和琼脂6.5g，混合后的培养基的pH值调节至5.6；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；高压锅灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

步骤二、外植体处理和接种：

采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步，其中：

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗3小时；

消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润10秒后，放入10％的氯化汞溶液中消毒15分钟，用无菌水清洗3-6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长12cm、含一个茎节的若干茎段，接于所述培养基上，每瓶接1个茎段；

步骤三、培养：

该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度25℃，采用波长在580的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射3小时后，停止光照3小时，再照射3小时，如此循环交替照射，光照强度1000流明，培养时间2个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

步骤四、移栽：

选苗高6-8cm、茎基直径约2mm、发根2-3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至大棚种植基质中栽培，按株距6cm×6cm、行距10cm×10cm的标准种植，填土压实。

作为实施例的优选方式，所述种植基质包括无机基质层及有机基质层，采用赤红壤作为无机基质层，烈日下暴晒2-6天；将暴晒后所述赤红壤装在标准种植盘上，厚度为3-5cm；再在所述赤红壤上方铺设有机基质层，厚度为2-3cm；所述机基质层的制备方法为：称取如下重量份数的原料：牛粪60-80、落叶20-30、秸秆20-35、锯末15-20及树皮25-30；将上述原料混合均匀，加入适量的水，接种酵母菌，堆积发酵20-25天，消毒制得。

实施例3

一种青天葵的组培繁殖方法，包括如下步骤：

步骤一、培养基准备：

以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤0.3mg、萘乙酸0.3mg、香蕉100g、土豆25g和琼脂6.5g，混合后的培养基的pH值调节至5.6；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；高压锅灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

步骤二、外植体处理和接种：

采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步，其中：

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2-3小时；

消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润10秒后，放入10％的氯化汞溶液中消毒15分钟，用无菌水清洗3-6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长8cm、含一个茎节的若干茎段，接于所述培养基上，每瓶接1个茎段；

步骤三、培养：

该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度27℃，采用波长在560的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射3小时后，停止光照3小时，再照射3小时，如此循环交替照射，光照强度800流明，培养时间2.5个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

步骤四、移栽：

选苗高6-8cm、茎基直径约2mm、发根2-3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至大棚种植基质中栽培，按株距3-7cm、行距3-7cm的标准种植，填土压实。

作为实施例的优选方式，所述种植基质包括无机基质层及有机基质层，采用赤红壤作为无机基质层，烈日下暴晒2-6天；将暴晒后所述赤红壤装在标准种植盘上，厚度为3-5cm；再在所述赤红壤上方铺设有机基质层，厚度为2-3cm；所述机基质层的制备方法为：称取如下重量份数的原料：牛粪60-80、落叶20-30、秸秆20-35、锯末15-20及树皮25-30；将上述原料混合均匀，加入适量的水，接种酵母菌，堆积发酵20-25天，消毒制得。

作为实施例1-3的优选方式，大棚栽培的条件为：

1)温度的控制：所述青天葵在15-30℃内可以正常生长，当温度超过28℃以上，通过喷雾装置降温；冬天放下塑料薄膜、保温至6℃以上；

2)湿度的控制：所述青天葵生长空气湿度为60-80％；

3)光度的控制：所述青天葵光度为600-1000流明。

对比例1

一种青天葵的组培繁殖方法，包括如下步骤：

步骤一、培养基准备：

以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤0.3mg、萘乙酸0.3mg、香蕉100g、土豆25g和琼脂6.5g，混合后的培养基的pH值调节至5.6；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；高压锅灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

步骤二、外植体处理和接种：

采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步，其中：

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2-3小时；

消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润10秒后，放入10％的氯化汞溶液中消毒15分钟，用无菌水清洗3-6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长8cm、含一个茎节的若干茎段，接于所述培养基上，每瓶接1个茎段；

步骤三、培养：

该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度27℃，采用波长在560的可见光谱作为光源，不间断照射，光照强度800流明，培养时间2.5个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

步骤四、移栽：

选苗高6-8cm、茎基直径约2mm、发根2-3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至大棚种植基质中栽培，按株距3-7cm、行距3-7cm的标准种植，填土压实。

作为对比例1的优选方式，所述种植基质包括无机基质层及有机基质层，采用赤红壤作为无机基质层，烈日下暴晒2-6天；将暴晒后所述赤红壤装在标准种植盘上，厚度为3-5cm；再在所述赤红壤上方铺设有机基质层，厚度为2-3cm；所述机基质层的制备方法为：称取如下重量份数的原料：牛粪60-80、落叶20-30、秸秆20-35、锯末15-20及树皮25-30；将上述原料混合均匀，加入适量的水，接种酵母菌，堆积发酵20-25天，消毒制得。

对比例2

一种青天葵的组培繁殖方法，包括如下步骤：

步骤一、培养基准备：

以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤0.3mg、萘乙酸0.3mg、香蕉100g、土豆25g和琼脂6.5g，混合后的培养基的pH值调节至5.6；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；高压锅灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

步骤二、外植体处理和接种：

采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步，其中：

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2-3小时；

消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润10秒后，放入10％的氯化汞溶液中消毒15分钟，用无菌水清洗3-6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长8cm、含一个茎节的若干茎段，接于所述培养基上，每瓶接1个茎段；

步骤三、培养：

该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度27℃，采用波长在560的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射6小时后，停止光照6小时，再照射6小时，如此循环交替照射，光照强度800流明，培养时间2.5个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

步骤四、移栽：

选苗高6-8cm、茎基直径约2mm、发根2-3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至大棚种植基质中栽培，按株距3-7cm、行距3-7cm的标准种植，填土压实。

作为对比例2的优选方式，所述种植基质包括无机基质层及有机基质层，采用赤红壤作为无机基质层，烈日下暴晒2-6天；将暴晒后所述赤红壤装在标准种植盘上，厚度为3-5cm；再在所述赤红壤上方铺设有机基质层，厚度为2-3cm；所述机基质层的制备方法为：称取如下重量份数的原料：牛粪60-80、落叶20-30、秸秆20-35、锯末15-20及树皮25-30；将上述原料混合均匀，加入适量的水，接种酵母菌，堆积发酵20-25天，消毒制得。

对比例3

一种青天葵的组培繁殖方法，包括如下步骤：

步骤一、培养基准备：

以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤0.3mg、萘乙酸0.3mg、香蕉100g、土豆25g和琼脂6.5g，混合后的培养基的pH值调节至5.6；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；高压锅灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

步骤二、外植体处理和接种：

采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步，其中：

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2-3小时；

消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润10秒后，放入10％的氯化汞溶液中消毒15分钟，用无菌水清洗3-6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长8cm、含一个茎节的若干茎段，接于所述培养基上，每瓶接1个茎段；

步骤三、培养：

该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度27℃，采用波长在560的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射12小时后，停止光照12小时，再照射12小时，如此循环交替照射，光照强度800流明，培养时间2.5个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

步骤四、移栽：

选苗高6-8cm、茎基直径约2mm、发根2-3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至大棚种植基质中栽培，按株距3-7cm、行距3-7cm的标准种植，填土压实。

作为对比例2的优选方式，所述种植基质包括无机基质层及有机基质层，采用赤红壤作为无机基质层，烈日下暴晒2-6天；将暴晒后所述赤红壤装在标准种植盘上，厚度为3-5cm；再在所述赤红壤上方铺设有机基质层，厚度为2-3cm；所述机基质层的制备方法为：称取如下重量份数的原料：牛粪60-80、落叶20-30、秸秆20-35、锯末15-20及树皮25-30；将上述原料混合均匀，加入适量的水，接种酵母菌，堆积发酵20-25天，消毒制得。

经测定实施例1-3及对比例1-3的青天葵的块茎，实施例3的块茎平均重量重于实施例1和2的块茎平均重量3克以上，而重于对比例1-3的青天葵的块茎平均重量10克以上，说明采用波长在560的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射3小时后，停止光照3小时，再照射3小时可显著提高青天葵的块茎重量。与野生青天葵的块茎相比，本发明实施例1-3的青天葵的块茎平均重量重于野生青天葵的块茎10克以上。

本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种青天葵的组培繁殖方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一、培养基准备：

以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤0.1-0.5mg、萘乙酸0.2-0.5mg、香蕉100g、土豆25g和琼脂6.5g，混合后的培养基的pH值调节至4.5-6.5；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；高压锅灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

步骤二、外植体处理和接种：

采用自然生长的植株作为外植体，包括清洗，消毒，接种三步，其中：

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2-3小时；

消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润8-10秒后，放入10％的氯化汞溶液中消毒10-15分钟，用无菌水清洗3-6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长8-12cm、含一个茎节的若干茎段，接于所述培养基上，每瓶接1个茎段；

步骤三、培养：

该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度23±2℃，采用波长在520-580的可见光谱作为光源，并采用循环交替的方式进行照射，即照射3小时后，停止光照3小时，再照射3小时，如此循环交替照射，光照强度600-1000流明，培养时间2-3个月，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

步骤四、移栽：

选苗高6-8cm、茎基直径2mm、发根2-3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至大棚种植基质中栽培，按株距6cm×6cm、行距10cm×10cm的标准种植，填土压实。

2.如权利要求1所述的一种青天葵的组培繁殖方法，其特征在于：所述种植基质包括无机基质层及有机基质层，采用赤红壤作为无机基质层，烈日下暴晒2-6天；将暴晒后所述赤红壤装在标准种植盘上，厚度为3-5cm；再在所述赤红壤上方铺设有机基质层，厚度为2-3cm；所述机基质层的制备方法为：称取如下重量份数的原料：牛粪60-80、落叶20-30、秸秆20-35、锯末15-20及树皮25-30；将上述原料混合均匀，加入适量的水，接种酵母菌，堆积发酵20-25天，消毒制得。

3.如权利要求1所述的一种青天葵的组培繁殖方法，其特征在于：大棚栽培的条件为：

1)温度的控制：所述青天葵在15-30℃内可以正常生长，当温度超过28℃以上，通过喷雾装置降温；冬天放下塑料薄膜、保温至6℃以上；

2)湿度的控制：所述青天葵生长空气湿度为60-80％；

3)光度的控制：所述青天葵光度为600-1000流明。