JP5701747B2 - アルツハイマー病に対するｄｎａワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、アルツハイマー病に対するDNAワクチンに関する。
アルツハイマー病（Alzheimer's disease, AD）は、認知障害（記憶障害、見当識障害、学習の障害、注意の障害、空間認知機能障害、問題解決能力の障害など）を主症状として中年以降に多発する疾患である。この疾患の症状は数年の経過を経て進行するが、経過中に被害妄想、幻覚、暴言、暴力、徘徊、不潔行為などの問題行動が出現することが多い。このため、患者本人のみならず、その家族や介護者等の周囲の関係者に悪影響を及ぼしている。
アルツハイマー病の病理像として、老人斑（Aβ沈着）、神経原線維変化（タウ沈着）、及び神経細胞脱落という３つの特徴がある。Aβ沈着がタウ沈着や神経細胞の変化に先行することは多くの研究により明らかとなり、Aβ沈着を防止できるならば、その後に生じる事象、すなわち神経細胞内のタウ蓄積、神経細胞の脱落などをある程度防ぐことができるとする「アミロイド仮説」が広く知られるようになった。
アミロイド仮説をもとに、アルツハイマー病の根治的治療法としてAβペプチドワクチン療法が提唱された（非特許文献１)。このワクチン療法は、マウスの実験により体外からAβペプチドを免疫賦活剤（アジュバンド）とともに投与し、体内で抗Aβ抗体の産生を誘導し、脳内のAβ蓄積を減少させるというものである。
しかしながら、ヒトの臨床試験においては、実薬投与を受けた症例に髄膜脳炎が発症するなど副作用の問題が生じたことから、試験は中止されている。
しかしながら、ヒトの臨床試験においては、実薬投与を受けた症例に髄膜脳炎が発症するなど副作用の問題が生じたことから、試験は中止されている。
臨床試験後、脳炎を惹起しないようなワクチン製剤を作製することを目標として開発が進められている。そして、AβペプチドはそのC末端側フラグメントが主としてTh1反応を誘導し、N末端側フラグメントがTh2反応を誘導することが知られている。そこで、AβのN末端側フラグメントをキャリアタンパク質に結合させたワクチンの臨床試験が行われた（非特許文献２)。
しかしながら、脳炎などの副作用を克服することは、なおも困難であった。
しかしながら、脳炎などの副作用を克服することは、なおも困難であった。
そこで、これらのAβペプチドワクチンに代わるアルツハイマー病の新ワクチン療法としてDNAワクチン療法が開発された。そして、本発明者は、沈着Aβの削減に有効であり、かつ安全性の高いDNAワクチンを開発した（非特許文献３)。本発明者が開発したDNAワクチンとしては、IgL-Aβ-Fcワクチンが知られている（特許文献１）。
また、最近の研究から、神経毒性を示すAβにも様々な亜種があることが明らかになりつつある。最もよく分析されているAβオリゴマーにも2分子、3分子又は4分子が凝集した低分子型と12分子以上の高分子型に大別できる。また、翻訳後修飾によりN末が欠損してピロル化したpEAβ3-42にも強い神経毒性があることが示されている（非特許文献４、５）。さらに、アミノ酸配列はAβと全く異なるものの、高いアミロイド凝集性を示すABri（非特許文献６）やADanといった分子もアルツハイマー病の発病に関係していることを示唆する所見も得られつつある。
Schenk D. et al., Nature 400: 173-177, 1999
Masters CL et al., Brain 129: 2823-2839, 2006
Y. Okura, et al., PNAS vol. 103: 9619-9624, 2006
Saido et al., Neurosci Lett, 215, 173-176, 1996
Schlenzig et al., Biochemistry, 48, 7072-7078, 2009
Ghiso et al., Brain Pathol, 16, 71-79, 2006
これまでの研究から、現在のDNAワクチンよりもさらに有効かつ安全なDNAワクチン療法の開発が望まれていた。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、AβをコードするDNA及びTh2サイトカインをコードするDNAを連結したベクター、並びにAβをコードするDNA、Th2サイトカインをコードするDNA及び免疫グロブリンFc配列をコードするDNAを連結したベクターを構築し、これをアルツハイマー病モデル動物に投与することにより治療効果を有することを見出した。さらに、上記ベクターが、神経毒性や高いアミロイド凝集性を示す多様な分子（pEAβ3-42、ABri、ADan等）に対する抗体をも誘導することを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）アミロイドβをコードするDNA及びTh2サイトカインをコードするDNAを含む組み換えベクター。
（２）免疫グロブリンFc配列をコードするDNAをさらに含む、上記（１）に記載のベクター。
（３）アミロイドβをコードするDNAが、その繰り返し配列からなるものである、上記（１）又は（２）に記載のベクター。
（４）アミロイドβがAβ1-42である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のベクター。
（５）Th2サイトカインがインターロイキン4又はM-CSFである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のベクター。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、アルツハイマー病予防又は治療用DNAワクチン。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、脳内Aβ削減用DNAワクチン。
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、抗Aβ抗体誘導剤。
（２）免疫グロブリンFc配列をコードするDNAをさらに含む、上記（１）に記載のベクター。
（３）アミロイドβをコードするDNAが、その繰り返し配列からなるものである、上記（１）又は（２）に記載のベクター。
（４）アミロイドβがAβ1-42である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のベクター。
（５）Th2サイトカインがインターロイキン4又はM-CSFである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のベクター。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、アルツハイマー病予防又は治療用DNAワクチン。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、脳内Aβ削減用DNAワクチン。
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、抗Aβ抗体誘導剤。
本発明により、アルツハイマー病に対するDNAワクチンが提供される。本発明のDNAワクチンは老人斑への親和性が高いことから、アルツハイマー病に対する高い治療効果を有するといえる。また、本発明により、神経毒性や高いアミロイド凝集性を示す多様な分子（pEAβ3-42、ABri、ADan等）に対する抗体が誘導される。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2009年3月26日に出願された日本国特許出願（特願2009-75832号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、アルツハイマー病に対するDNAワクチンである。また、本発明は、Aβ遺伝子にTh2サイトカイン遺伝子を連結して作製されたベクターである。さらに、本発明は、このベクターにさらに免疫グロブリンFc（IgFc）配列を連結して作製されたベクターである。
DNAワクチンは、遺伝子を運ぶベクター（プラスミドやウイルス）にAβタンパク質を作らせる遺伝子を組み込んで患者に投与し、ワクチンを取り込んだ細胞にAβタンパク質を作らせるというものである。産生されたAβは免疫系を刺激し、抗Aβ抗体を誘導する（Y. Okura, et al., BRAIN and NERVE 60(8): 931-940, 2008）。DNAワクチンは、投与後長時間体内に止まり、コードされたペプチドを緩徐に作り続けるため、過剰な免疫反応を避けることが可能であり、単純な構造であるために改良も可能である（Tang DC et al., Nature 356: 152-154, 1992; Barry MA et al., Nature 377: 632-635, 1995)。さらに、宿主に誘導される免疫反応はTh2型であるという利点がある（Tang DC et al., Nature 356: 152-154, 1992; Ulmer JB et al., Science 259: 1745-1749, 1993; Hoffman SL et al., Ann N Y Acad Sci 772: 88-94, 1995)。
DNAワクチンは、遺伝子を運ぶベクター（プラスミドやウイルス）にAβタンパク質を作らせる遺伝子を組み込んで患者に投与し、ワクチンを取り込んだ細胞にAβタンパク質を作らせるというものである。産生されたAβは免疫系を刺激し、抗Aβ抗体を誘導する（Y. Okura, et al., BRAIN and NERVE 60(8): 931-940, 2008）。DNAワクチンは、投与後長時間体内に止まり、コードされたペプチドを緩徐に作り続けるため、過剰な免疫反応を避けることが可能であり、単純な構造であるために改良も可能である（Tang DC et al., Nature 356: 152-154, 1992; Barry MA et al., Nature 377: 632-635, 1995)。さらに、宿主に誘導される免疫反応はTh2型であるという利点がある（Tang DC et al., Nature 356: 152-154, 1992; Ulmer JB et al., Science 259: 1745-1749, 1993; Hoffman SL et al., Ann N Y Acad Sci 772: 88-94, 1995)。
そこで本発明者は、Aβと共にTh2サイトカインをコードする遺伝子を導入することを考え、細胞性免疫による副作用を抑制するとともに、アルツハイマー病に対するワクチンを構築し、その効果を検討した。その結果、本発明のベクターは、低用量および少投与回数で高いAβ消失効果を示した。また、本発明者らは、Aβ及びTh2サイトカインをコードする遺伝子に加えて、IgFc配列をコードする遺伝子を導入することにより、発現したAβの細胞外放出を促進し、Aβに対する免疫応答をより強く刺激することに成功した。さらに本発明者らは、AβをコードするDNAの繰り返し配列を含むベクターを構築することにより、より高い脳内Aβ削減効果を示すワクチンの開発に成功した。さらに本発明者らは、上記ベクターが神経毒性や高いアミロイド凝集性を示す多様な分子（pEAβ3-42、ABri、ADan等）に対する抗体をも誘導することを見出した。
したがって、本発明のベクターは、外来遺伝子としてAβをコードするDNA及びTh2サイトカインをコードするDNAを含む。また別の態様において、本発明のベクターは、AβをコードするDNA及びTh2サイトカインをコードするDNAに加えてIgFc配列をコードするDNAを含む。さらに別の態様において、本発明のベクターに含まれるAβをコードするDNAは、その繰り返し配列からなるものである。
したがって、本発明のベクターは、外来遺伝子としてAβをコードするDNA及びTh2サイトカインをコードするDNAを含む。また別の態様において、本発明のベクターは、AβをコードするDNA及びTh2サイトカインをコードするDNAに加えてIgFc配列をコードするDNAを含む。さらに別の態様において、本発明のベクターに含まれるAβをコードするDNAは、その繰り返し配列からなるものである。
Aβ、Th2サイトカイン及びIgFc配列の由来は、DNAワクチンの投与の対象となる動物と同種の動物由来であってもよく、異なる動物由来であってもよいが、同種の動物由来のAβ、Th2サイトカイン及びIgFc配列を用いることが好ましい。
AβをコードするDNA、Th2サイトカインをコードするDNA及びIgFc配列をコードするDNAは、すでにクローニングされている。したがって、本発明のベクターに含まれるDNAは、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となるDNA配列を単離又は合成した後に、それぞれのDNAに特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。
アミロイドβタンパク質（Aβ）は、β-及びγ-セクレターゼの働きにより前駆体蛋白(APP: amyloid β protein precursor)から切り出される40-43アミノ酸からなるポリペプチドである。
このようなポリペプチドは、Aβに対する抗原性を提示するために、天然のAβのアミノ酸配列由来の連続した15アミノ酸以上、好ましくは連続した20アミノ酸以上を含む。天然の全長Aβを含むポリペプチドを用いることもできる。
これらのDNAの塩基配列は、所定のデータベースから入手可能である。ヒトAβについては、例えばGenbankアクセッション番号NC_000021.7、マウスAβについては、アクセッション番号NC_000082.5が利用可能である。
このようなポリペプチドは、Aβに対する抗原性を提示するために、天然のAβのアミノ酸配列由来の連続した15アミノ酸以上、好ましくは連続した20アミノ酸以上を含む。天然の全長Aβを含むポリペプチドを用いることもできる。
これらのDNAの塩基配列は、所定のデータベースから入手可能である。ヒトAβについては、例えばGenbankアクセッション番号NC_000021.7、マウスAβについては、アクセッション番号NC_000082.5が利用可能である。
本発明の好ましい態様において、上記DNAを鋳型とし、当該遺伝子特異的なプライマーを用いてPCRを行うことにより、各断片長を有する各DNA領域を調製することができる。本発明においては、γセクレターゼにより切断される43のアミノ酸領域（「Aβ1-43」という）、AβのN末端側の１〜２０番のアミノ酸領域（「Aβ1-20」という）、N末端側の１〜４０番のアミノ酸領域（「Aβ1-40」という）、あるいはN末端側の１〜４２番のアミノ酸領域（「Aβ1-42」という）のポリペプチドを利用することができる。ヒトAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２、４、６、８に示し、マウスAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42はそれぞれ配列番号１０、１２、１４、１６に示す。
ヒトAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAの塩基配列はそれぞれ配列番号１、３、５、７に示し、マウスAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAの塩基配列はそれぞれ配列番号９、１１、１３、１５に示す。
ヒト又はマウスのAβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAは、ヒト又はマウスのAβ1-43をコードするDNAからPCRなどによって調製することができる。
ヒト又はマウスのAβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAは、ヒト又はマウスのAβ1-43をコードするDNAからPCRなどによって調製することができる。
また、上記ヒト又はマウスのAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAのほか、以下のDNAも、本発明において使用することができる。
配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号９に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号９に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
本発明においてAβ活性とは、Aβが被験者（ヒト、マウス等）の脳において生成、蓄積及び／又は凝集し、Aβ沈着（老人斑）を形成する活性を意味する。Aβ活性は、免疫組織染色、ELISA等の免疫学的手法により測定することができる。例えば、免疫組織染色の場合は、評価対象となるタンパク質を被験動物（マウス等）の脳で発現させ、発現させた組織の切片において抗Aβ抗体を用いた免疫染色を行い、Aβの生成、蓄積、凝集及び／又は沈着等を検出することにより測定することができる。
ヒトAβ1-43、ヒトAβ1-20、ヒトAβ1-40、ヒトAβ1-42、マウスAβ1-43、マウスAβ1-20、マウスAβ1-40、マウスAβ1-42は、それぞれ固有のAβ活性を有する。従って、例えば、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNAから発現するタンパク質は、ヒトAβ1-43と同等のAβ活性を有していればよい。他の配列番号に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Aβ活性を有するタンパク質をコードするDNAから発現するタンパク質についても同様である。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、0.1×SSC〜10×SSC、0.1％〜1.0％SDS及び20℃〜80℃の条件が挙げられ、より詳細には、37℃〜56℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、0.1×SSC、0.1％SDS中、室温で10〜20分の洗浄を1〜3回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press (1989)）等を参照することができる。
また、配列番号１、３、５又は７に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、ヒトAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40又はAβ1-42の構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
さらに、配列番号９、１１、１３又は１５に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40又はAβ1-42の構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
「同等の機能」とは、組織内においてAβ沈着（老人斑）を生じる機能などを意味する。
さらに、配列番号９、１１、１３又は１５に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40又はAβ1-42の構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
「同等の機能」とは、組織内においてAβ沈着（老人斑）を生じる機能などを意味する。
本発明において、AβをコードするDNAは、AβをコードするDNAの繰り返し配列からなるものであってもよい。AβをコードするDNAの繰り返し配列を含むベクターは、複数のAβを同時に発現することができる。そして、細胞外に放出されたAβはオリゴマーを形成すると考えられる。このオリゴマーは、免疫系を刺激して、抗Aβオリゴマー抗体を誘導する。これにより、Aβモノマーよりも神経毒性が強いAβオリゴマーを削減することが期待できる。
AβをコードするDNAの繰り返し回数の範囲は、Aβが折りたたみ構造を形成することにより、Aβモノマーよりも抗原性が向上する範囲であれば限定されるものでないが、その範囲としては、2〜4回が好ましく、3〜4回がさらに好ましい。
AβをコードするDNAの繰り返し回数の範囲は、Aβが折りたたみ構造を形成することにより、Aβモノマーよりも抗原性が向上する範囲であれば限定されるものでないが、その範囲としては、2〜4回が好ましく、3〜4回がさらに好ましい。
本発明において、Th2とは、CD4陽性T細胞（いわゆるヘルパーT細胞）の亜群の細胞を意味し、抗原タンパク質との接触経歴を持たないT細胞（ナイーブT細胞）がIL-4やIL-13などのサイトカインの刺激を受けることにより分化誘導された細胞を意味する。Th2は体液性免疫の調節に関与し、Th2から産生されるサイトカインは抗体産生を促進する。Th2サイトカインとしては、IL-4（インターロイキン-4）、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、M-CSF（マクロファージ-コロニー刺激因子）などが挙げられるが、IL-4が好ましい。
ヒトIL-4については、Genbankアクセッション番号NM_000589.2、マウスIL-4については、アクセッション番号NM_021283.1が利用可能である。ヒトM-CSFについては、Genbankアクセッション番号NM_000757.4、マウスM-CSFについては、アクセッション番号NM_007778.3が利用可能である。
ヒトIL-4については、Genbankアクセッション番号NM_000589.2、マウスIL-4については、アクセッション番号NM_021283.1が利用可能である。ヒトM-CSFについては、Genbankアクセッション番号NM_000757.4、マウスM-CSFについては、アクセッション番号NM_007778.3が利用可能である。
上記IL-4、M-CSFをコードするDNAの塩基配列の配列番号を以下に示す。
ヒトIL-4：配列番号１７
マウスIL-4：配列番号１８
ヒトM-CSF：配列番号１９
マウスM-CSF：配列番号２０
ヒトIL-4：配列番号１７
マウスIL-4：配列番号１８
ヒトM-CSF：配列番号１９
マウスM-CSF：配列番号２０
また、上記Th2サイトカインをコードするDNAのほか、以下のDNAも本発明に使用することができる。
配列番号１７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトIL-4活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１８に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスIL-4活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１９に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトM-CSF活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号２０に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスM-CSF活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトIL-4活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１８に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスIL-4活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１９に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトM-CSF活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号２０に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスM-CSF活性を有するタンパク質をコードするDNA。
IL-4活性とは、Th2細胞の分化、免疫グロブリンのクラススイッチ及びB細胞による抗体産生を促進する活性を意味する。IL-4活性は、例えば、ELISA、EIA等の免疫学的手法により測定することができる。
M-CSF活性とは、単球、マクロファージ等の分化及び増殖を促進する活性を意味する。M-CSF活性は、例えば、ELISA、EIA等の免疫学的手法により測定することができる。
M-CSF活性とは、単球、マクロファージ等の分化及び増殖を促進する活性を意味する。M-CSF活性は、例えば、ELISA、EIA等の免疫学的手法により測定することができる。
さらに、配列番号１７に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、ヒトIL-4の構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
さらに、配列番号１８に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスIL-4の構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
さらに、配列番号１９に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、ヒトM-CSFの構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
さらに、配列番号２０に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスM-CSFの構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
さらに、配列番号１８に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスIL-4の構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
さらに、配列番号１９に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、ヒトM-CSFの構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
さらに、配列番号２０に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスM-CSFの構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
本発明に使用される免疫グロブリンFc（IgFc）配列は、免疫グロブリンをパパインで消化して得られるフラグメントのうち、H鎖のC末端側のフラグメントをいう。
本発明において、IgFc配列をコードするDNAを含むベクターは、IgFc配列をAβに付加することにより、Aβの細胞内での転写翻訳を促進することができる。また、発現したAβの細胞外への放出も増加し、より強く免疫系を刺激することができる（図１１参照）。
本発明において、IgFc配列をコードするDNAを含むベクターは、IgFc配列をAβに付加することにより、Aβの細胞内での転写翻訳を促進することができる。また、発現したAβの細胞外への放出も増加し、より強く免疫系を刺激することができる（図１１参照）。
本発明に使用されるIgFc配列としては、ヒトIgFc配列及びマウスIgFc配列が挙げられる。ヒトIgFc配列をコードするDNAの塩基配列については、Genbankアクセッション番号BC014258、マウスIgFc配列をコードするDNAの塩基配列については、アクセッション番号XM_484178.3が利用可能である。
本発明に用いられるヒト及びマウスIgFc配列をコードするDNAの塩基配列の配列番号を以下に示す。
ヒトIgFc配列：配列番号３２
マウスIgFc配列：配列番号３３
ヒトIgFc配列：配列番号３２
マウスIgFc配列：配列番号３３
配列番号３２及び３３で示される塩基配列には、本来のIgFc配列に含まれるシステイン残基をセリン残基に置換するための変異が導入されている。これはジスルフィド結合の形成を回避することを意図したものである。
また、本発明に用いられるヒト及びマウスIgFc配列をコードするDNAとしては、以下のDNAも使用することができる。
配列番号３２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号３３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号３２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号３３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNA。
本発明において、IgFc活性とは、Aβタンパク質の細胞内産生及び細胞外への放出を促進する活性を意味する。例えば、あるタンパク質のIgFc活性は、該タンパク質とAβタンパク質との融合タンパク質を培養細胞内で発現させ、培養細胞内又は培養上清中に存在するAβタンパク質の増加量を定量することにより、測定することができる。Aβタンパク質の定量は、ELISA、EIA等の免疫学的手法を用いて行うことができる。
また、本発明には、配列番号３２に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、ヒトIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
さらに、配列番号３３に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
IgFc活性についての説明は上記と同様である。
さらに、配列番号３３に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
IgFc活性についての説明は上記と同様である。
上記DNAは、化学合成により得ることができ、あるいは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、３２又は３３で表される塩基配列からなるDNA、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。
組換えベクターの作製は、通常の遺伝子工学的手法を採用することができる。
例えば、目的のAβをコードするDNA、Th2サイトカインをコードするDNA及びIgFc配列をコードするDNAの試料をPCR等により調製する。PCRは、Taqポリメラーゼまたはその他のDNAポリメラーゼを用いる通常の方法によって実施することができる。増幅した目的断片は制限酵素で消化した後、pBluescript(商標)(Stratagene)などのプラスミドベクターの制限酵素部位またはマルチクローニング部位に挿入する。得られたPCR産物のヌクレオチド配列をシークエンサーで確認し、正しい配列を含むプラスミドを選択する。DNA試料は、電気泳動的により単一のプラスミドとして確認できることが好ましい。
例えば、目的のAβをコードするDNA、Th2サイトカインをコードするDNA及びIgFc配列をコードするDNAの試料をPCR等により調製する。PCRは、Taqポリメラーゼまたはその他のDNAポリメラーゼを用いる通常の方法によって実施することができる。増幅した目的断片は制限酵素で消化した後、pBluescript(商標)(Stratagene)などのプラスミドベクターの制限酵素部位またはマルチクローニング部位に挿入する。得られたPCR産物のヌクレオチド配列をシークエンサーで確認し、正しい配列を含むプラスミドを選択する。DNA試料は、電気泳動的により単一のプラスミドとして確認できることが好ましい。
本発明の組換えベクターに含まれるプロモーターとして、アクチンプロモーター、EF1プロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーターなどを使用することができる。これらのプロモーターは、適当なプラスミドに連結することができる。
「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質または非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。
「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質または非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。
本発明のベクターは、上記Aβ及びTh2サイトカイン、又はこれに加えてIgFc配列が発現できるように機能しうる形態で含まれている。すなわち、適切な調節エレメントの制御下に、導入される遺伝子（DNA）の発現を可能にする様式で、そのベクター中に導入遺伝子が挿入されている。Aβ、Th2サイトカイン及びIgFc配列をコードするDNAは、それぞれ同一ベクターの別の部分に挿入されていてもよく、タンデムに連続して挿入されていてもよい。ここで、調節エレメントとしては、例えばプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターなどを意味する。
本発明のベクターは、Aβ、Th2サイトカイン及びIgFc配列をコードするDNAを挿入した領域以外の位置に他の外来遺伝子を保持してもよい。このような外来遺伝子としては、例えば、ベクターをモニターするためのマーカー遺伝子、あるいはサイトカインおよびホルモンのような免疫系調節遺伝子であってもよく、特に限定されるものではない。
本発明のベクターとしては、例えば、CMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子及びIL-4遺伝子を挿入したpTARGET（図１）、並びにCMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子及びM-CSF遺伝子を挿入したpIRES2（図２）が挙げられる。
さらに、本発明のベクターとしては、例えば、CMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子、IgFc遺伝子及びIL-4遺伝子を挿入したpVAX1（図５及び６）、CMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子（DNA）の繰り返し配列、IgFc遺伝子及びIL-4遺伝子を挿入したpVAX1（図７及び８）、並びにCMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子の繰り返し配列及びIgFc遺伝子を挿入したpVAX1（図９及び１０）が挙げられる。
CMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子及びIL-4遺伝子を挿入したpTARGETは、Aβ1-42遺伝子の上流にIg leader（IgL）配列を含み、Aβ1-42遺伝子とIL-4遺伝子との間にスペーサー配列を含むことが好ましい。さらに、前記pTARGETは、CMVプロモーター、Ig leader配列、Aβ1-42遺伝子、スペーサー配列、IL-4遺伝子をこの順に含むことがより好ましい（図１）。
また、CMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子及びM-CSF遺伝子を挿入したpIRES2は、Aβ1-42遺伝子の上流にIg leader配列を含み、Aβ1-42遺伝子とM-CSF遺伝子との間にIRES配列を含むことが好ましい。さらに、前記pIRES2は、CMVプロモーター、Ig leader配列、Aβ1-42遺伝子、IRES配列、M-CSF遺伝子をこの順に含むことがより好ましい（図２）。
CMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子、IgFc遺伝子及びIL-4遺伝子を挿入したpVAX1は、CMVプロモーターとAβ1-42遺伝子との間にIg leader配列を含み、IgFc遺伝子とIL-4遺伝子との間にスペーサー配列を含むことが好ましい。さらに、前記pVAX1は、CMVプロモーター、Ig leader配列、Aβ1-42遺伝子、IgFc遺伝子、スペーサー配列、IL-4遺伝子をこの順に含むことがより好ましい（図５及び６）。
CMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子の繰り返し配列、IgFc遺伝子及びIL-4遺伝子を挿入したpVAX1は、CMVプロモーターとAβ1-42遺伝子の繰り返し配列との間にIg leader配列を含み、各Aβ1-42遺伝子間及びIgFc遺伝子とIL-4遺伝子との間にスペーサー配列を含むことが好ましい。さらに、前記pVAX1は、CMVプロモーター、Ig leader配列、Aβ1-42遺伝子の繰り返し配列（各Aβ1-42遺伝子間のスペーサー配列を含む）、IgFc遺伝子、スペーサー配列、IL-4遺伝子をこの順に含むことがより好ましい（図７及び８）。
CMVプロモーター下流にAβ1-42遺伝子の繰り返し配列及びIgFc遺伝子を挿入したpVAX1は、CMVプロモーターとAβ1-42遺伝子の繰り返し配列との間にIg leader配列を含み、各Aβ1-42遺伝子間にスペーサー配列を含むことが好ましい。さらに、前記pVAX1は、CMVプロモーター、Ig leader配列、Aβ1-42遺伝子の繰り返し配列（各Aβ1-42遺伝子間のスペーサー配列を含む）、IgFc遺伝子をこの順に含むことがより好ましい（図９及び１０）。
上記ベクターは、それぞれマウス又はヒト由来の遺伝子を有するが、マウス由来の遺伝子を有するベクターは前臨床試験又は試薬に用いることができ、ヒト由来の遺伝子を有するベクターは医薬組成物又は試薬に用いることができる。
すなわち、本発明は、上記ベクターを含む、アルツハイマー病予防及び治療用医薬組成物（DNAワクチン）を提供する。また別の態様において、本発明は、上記ベクターを含む、脳内Aβ削減用医薬組成物（DNAワクチン）を提供する。本発明において、「削減」とは、脳内に存在するAβの量を減少させることをいい、脳内Aβの蓄積量、凝集量、脳への沈着量を減少させることを含む。また、上記ベクターを含む本発明の医薬組成物は、脳内Aβの増加を抑制するためのDNAワクチンとして使用することもできる。
また別の態様において、本発明は、上記ベクターを含む抗Aβ抗体誘導剤を提供する。さらに別の態様において、本発明は、上記ベクターを含む、抗pEAβ3-42抗体、抗ABri抗体又は抗ADan抗体の誘導剤を提供する。
pEAβ3-42は、Aβ1-42のN末がgulutaminyl cyclase (QC)によって切断され、翻訳後修飾(ピロル化)された分子である。pEAβ3-42は、神経毒性が強く、この分子自体凝集性が高い。また、修飾を受けていないAβの凝集性を高める作用も有し、アルツハイマー病における病変形成の主役の一つである。
ABriは、家族性英国型認知症の原因分子であり、ADanは、家族性デンマーク型認知症の原因分子である。ABri及びADanは、前駆タンパク質のストップコドン部分に生じた遺伝子変異により、前駆タンパク質から長い分子として切り出されることにより生じる分子である。ABri及びADanは、アミロイド(アミロイドとは小分子が凝集して沈着する現象の総称)凝集性が高く、疾患進行の中心分子であり、アルツハイマー病変形成にも何らかの役割を果たしていると考えられている。
また別の態様において、本発明は、上記ベクターを含む抗Aβ抗体誘導剤を提供する。さらに別の態様において、本発明は、上記ベクターを含む、抗pEAβ3-42抗体、抗ABri抗体又は抗ADan抗体の誘導剤を提供する。
pEAβ3-42は、Aβ1-42のN末がgulutaminyl cyclase (QC)によって切断され、翻訳後修飾(ピロル化)された分子である。pEAβ3-42は、神経毒性が強く、この分子自体凝集性が高い。また、修飾を受けていないAβの凝集性を高める作用も有し、アルツハイマー病における病変形成の主役の一つである。
ABriは、家族性英国型認知症の原因分子であり、ADanは、家族性デンマーク型認知症の原因分子である。ABri及びADanは、前駆タンパク質のストップコドン部分に生じた遺伝子変異により、前駆タンパク質から長い分子として切り出されることにより生じる分子である。ABri及びADanは、アミロイド(アミロイドとは小分子が凝集して沈着する現象の総称)凝集性が高く、疾患進行の中心分子であり、アルツハイマー病変形成にも何らかの役割を果たしていると考えられている。
本発明のベクターをDNAワクチン、又は抗Aβ抗体誘導剤、抗pEAβ3-42抗体誘導剤、抗ABri抗体誘導剤若しくは抗ADan抗体誘導剤（以下、「抗Aβ抗体誘導剤等」とも称する）として使用する場合は、生体の標的部位への直接投与するか、あるいは、患者由来細胞又は遺伝子導入用の他の細胞にベクターを感染させ、その細胞を標的部位に注入する間接投与のいずれかにより、遺伝子を導入することができる。ベクターを注射により直接投与する方法としては、筋肉注射などが挙げられる。
また、本発明のベクターをリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。本発明のベクターを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等から全身投与する。脳等に局所投与することもできる。
リポソーム構造を形成するための脂質としては、リン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般に、リン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを定法に従って水素添加したものが挙げられる。また、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン等の合成リン脂質を用いることができる。
リポソームの製造方法は、DNAが保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば、逆相蒸発法、エーテル注入法、界面活性剤法等を用いて製造できる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが，２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内に有するものを用いることにより、電気的に陰性のDNAの結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。このようにして得られるリポソームには、患部の細胞又は目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えばポリエチレングルコール等を添加することができる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが，２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内に有するものを用いることにより、電気的に陰性のDNAの結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。このようにして得られるリポソームには、患部の細胞又は目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えばポリエチレングルコール等を添加することができる。
本発明のワクチン又は抗Aβ抗体誘導剤等は、常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容されるキャリアを含むものであってもよい。このようなキャリアは添加物であってもよく、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたベクターを溶剤(例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これにTween80、Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えばマンニトール、ブドウ糖、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム等のゴム、ゼラチン、コラーゲン等などが挙げられる。
本発明のDNAワクチン又は抗Aβ抗体誘導剤等の投与対象として、例えばヒトのほか、サルなどの非ヒト霊長類、マウスおよびラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、およびイヌなどその他の全ての哺乳動物が含まれ、より好ましくはヒトである。投与対象となる動物は、例えばアルツハイマー病に罹患した個体、アルツハイマー病であることが予想される個体、Aβの沈着が亢進している個体、タウ沈着が亢進している個体、神経細胞が脱落した個体などである。
本発明のDNAワクチン又は抗Aβ抗体誘導剤等の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。DNAワクチンの有効投与量は、疾患の徴候又は状態を軽減するワクチンの量である。このようなDNAワクチンの治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えばED50(集団の50％において治療的に有効な用量)、あるいはLD50(集団の50％に対して致死的である用量)によって決定することができる。また、抗Aβ抗体誘導剤の有効投与量は、患者から採取した生体試料（血液、細胞、組織等を含む）において検出可能なレベルの抗Aβ抗体を誘導することができる誘導剤の量である。抗Aβ抗体の検出は、ELISA、免疫染色等の免疫学的手法により行うことができる。当業者は、DNAワクチン又は抗Aβ抗体誘導剤について適切な投与量を決定することが可能である。
投与経路は適切に選択することができ、例えば経皮、鼻腔内、経気管支、筋内、腹腔内、静脈内、及び皮下の経路を含むが、これらの投与経路に限定されるものではない。特に筋肉内投与、皮下投与などが好ましい。接種部位は、１箇所でも又は複数箇所でもよい。
治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、ED50／LD50として表され得る。
本発明のワクチン又は抗Aβ抗体誘導剤の投与量は、ヒトに対して投与する場合、１回あたり約1μg〜1000μg、好ましくは約10〜500μg、より好ましくは約50〜250μgである。投与回数は、1回、又は副作用が臨床上許容される範囲内である限り複数回可能である。
治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、ED50／LD50として表され得る。
本発明のワクチン又は抗Aβ抗体誘導剤の投与量は、ヒトに対して投与する場合、１回あたり約1μg〜1000μg、好ましくは約10〜500μg、より好ましくは約50〜250μgである。投与回数は、1回、又は副作用が臨床上許容される範囲内である限り複数回可能である。
これまでに、アルツハイマー病に対するワクチンの開発ではAβに対する抗体とTh2活性に着目した研究が行われている。したがって、予めワクチンとしての抗体価または細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。
例えば、細胞性免疫活性は生体よりリンパ球を分離・培養し、3H−チミジンの取り込みを測定することにより評価できる。
また、Th2活性は、末梢血より血漿を分離し、ELISAにより抗体価を測定することにより評価できる。
例えば、細胞性免疫活性は生体よりリンパ球を分離・培養し、3H−チミジンの取り込みを測定することにより評価できる。
また、Th2活性は、末梢血より血漿を分離し、ELISAにより抗体価を測定することにより評価できる。
本発明のDNAワクチンを投与対象の動物に投与すると、Aβに対する免疫反応が誘導される。すなわち、前記Aβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42のアミノ酸配列にはエピトープが存在するため、本発明のワクチンが投与された場合には抗体産生が誘導される。
Aβに対する免疫反応は、抗Aβ抗体の産生量を測定することにより検出することができる。抗体の産生量の測定は、通常の免疫学的手法、例えばELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)により測定することができる。また、ワクチンの治療効果は、脳組織内のAβ量やAβ沈着(老人斑)の減少などにより確認することができる。脳組織内のAβ量やAβ沈着の様子は、免疫組織化学等により観察することが可能である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．プラスミドベクターpTarget/Ig-leader-Aβ1-42-IgFcの構築
（１）IgL, Aβ, Fc遺伝子の増幅及びクローニング
Immunoglobulin κleader (以下IgL) 配列、及びImmunoglobulin Fc (以下Fc又はIgFc) 配列をクローニングするため、ヒト末梢血由来mRNAを材料とし、ReverTra Ace−α- (TOYOBO, Tokyo, Japan) を用いてcDNAを合成した。各配列の5'末端又は3'末端を含み、且つ適切な制限酵素サイト (IgL; Bam H I又はXho I、Fc; Kpn I又はNot I) を付加したプライマーを設計し、KOD−plus- (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、ヒトIgL及びヒトFc配列を増幅した。本来のヒトFc配列には、5'末端近傍に3箇所のシステイン残基をコードするコドンが含まれるが、S-S結合を回避するため、プライマーデザイン時にセリン残基をコードする塩基に変更（TGT→TCT又はTGC→TCC）し、増幅産物を得た。
Amyloid β1-42（以下Aβ）配列は、オリゴヌクレオチド合成により作製した。但し、全長（126 bp）をカバーする配列の合成は困難であるため、先ず、Aβ配列の5'末端又は3'末端を含み、部分的に相補的（Aβ配列の中央部24 bp）な2本のオリゴヌクレオチドを合成した。各末端には適切な制限酵素サイト（Xho I、Kpn I）を付加した。これらをアニーリング後、ポリメラーゼ反応により完全な2本鎖を作製した。
得られた各産物をクローニングベクターに挿入し (IgL及びFc; Zero Blunt TOPO PCR Kit for Sequencing, Invitrogen, Tokyo, Japan, Aβ; AdvanTAge PCR Cloning Kit, TAKARA, Tokyo, Japan)、シークエンス解析により目的の配列を有するクローンを選定した。
（１）IgL, Aβ, Fc遺伝子の増幅及びクローニング
Immunoglobulin κleader (以下IgL) 配列、及びImmunoglobulin Fc (以下Fc又はIgFc) 配列をクローニングするため、ヒト末梢血由来mRNAを材料とし、ReverTra Ace−α- (TOYOBO, Tokyo, Japan) を用いてcDNAを合成した。各配列の5'末端又は3'末端を含み、且つ適切な制限酵素サイト (IgL; Bam H I又はXho I、Fc; Kpn I又はNot I) を付加したプライマーを設計し、KOD−plus- (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、ヒトIgL及びヒトFc配列を増幅した。本来のヒトFc配列には、5'末端近傍に3箇所のシステイン残基をコードするコドンが含まれるが、S-S結合を回避するため、プライマーデザイン時にセリン残基をコードする塩基に変更（TGT→TCT又はTGC→TCC）し、増幅産物を得た。
Amyloid β1-42（以下Aβ）配列は、オリゴヌクレオチド合成により作製した。但し、全長（126 bp）をカバーする配列の合成は困難であるため、先ず、Aβ配列の5'末端又は3'末端を含み、部分的に相補的（Aβ配列の中央部24 bp）な2本のオリゴヌクレオチドを合成した。各末端には適切な制限酵素サイト（Xho I、Kpn I）を付加した。これらをアニーリング後、ポリメラーゼ反応により完全な2本鎖を作製した。
得られた各産物をクローニングベクターに挿入し (IgL及びFc; Zero Blunt TOPO PCR Kit for Sequencing, Invitrogen, Tokyo, Japan, Aβ; AdvanTAge PCR Cloning Kit, TAKARA, Tokyo, Japan)、シークエンス解析により目的の配列を有するクローンを選定した。
（２）IgL, Aβ, Fc配列の発現ベクターへの挿入
IgL、Aβ、Fc配列のDNAは、各配列に予め付加した制限酵素サイトを利用してクローニングベクターから切り出し、アガロースゲルより精製した (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen, Tokyo, Japan)。pTargetベクターは、TAクローニングサイトを利用せず、このサイトの上流及び下流にそれぞれ存在するXho I、Kpn Iの2箇所の制限酵素サイトで切断してAβ配列と同一の突出末端を作製し、アガロースゲルより精製 (MinElute Gel Extraction Kit) した。
先ず、pTargetベクターとAβ配列を、Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、pTarget/Aβを作製した。続いて、Aβ配列のすぐ上流をBam H I、Xho Iで制限酵素処理し、IgL配列を組込んでpTarget/IgL-Aβを作製した。更に、Aβ配列直下のKpn I、Not Iサイトの切断処理を行い、Fc配列をライゲーションして、pTarget/IgL- Aβ-Fcを完成させた。
IgL、Aβ、Fc配列のDNAは、各配列に予め付加した制限酵素サイトを利用してクローニングベクターから切り出し、アガロースゲルより精製した (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen, Tokyo, Japan)。pTargetベクターは、TAクローニングサイトを利用せず、このサイトの上流及び下流にそれぞれ存在するXho I、Kpn Iの2箇所の制限酵素サイトで切断してAβ配列と同一の突出末端を作製し、アガロースゲルより精製 (MinElute Gel Extraction Kit) した。
先ず、pTargetベクターとAβ配列を、Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、pTarget/Aβを作製した。続いて、Aβ配列のすぐ上流をBam H I、Xho Iで制限酵素処理し、IgL配列を組込んでpTarget/IgL-Aβを作製した。更に、Aβ配列直下のKpn I、Not Iサイトの切断処理を行い、Fc配列をライゲーションして、pTarget/IgL- Aβ-Fcを完成させた。
２．pTarget/Ig leader-Amyloid β 1-42-IL-4（IgL-Aβ-IL-4）ワクチンの作製
（１）IL-4配列の増幅
Ig leader-Amyloid β 1-42-IL-4（IgL-Aβ-IL-4）（図１）は、上述のpTarget/Ig leader-Amyloid β 1-42-Ig Fc (IgL-Aβ-Fc)を利用して作製した。先ず、ヒト末梢血由来mRNA及びマウス脾臓由来mRNAを用いて、ReverTra Ace−α- (TOYOBO, Tokyo, Japan) によりcDNAを合成した。ヒト及びマウスIL-4 mRNA (coding region) の5’末端又は3’末端を含み、且つ適切な制限酵素サイト (Kpn I又はNot I) を付加したプライマーを設計し、KOD−plus- (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、ヒト、マウスIL-4全長配列を増幅した。PCR産物をアガロースゲルから精製 (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen, Tokyo, Japan) してクローニングベクターに挿入し (Zero Blunt TOPO PCR Kit for Sequencing, Invitrogen, Tokyo, Japan)、シークエンス解析により目的の配列を有するクローンを選定した。 ヒトIL-4ではスプライシングバリアントであるisotype 1（hIL-4）とisotype 2（hIL-4δ2）の両配列が増幅されたが、後者はIL-4のレセプターアンタゴニストであるため（Alms WJ et al, Mol Immunol 1996, 33:361-370; Fletcher HA et al, Immunology 2004, 112:669-673; Plante S. et al, J Allergy Clin Immunol 2006, 117:1321-1327）、isotype 1を選択した。
（１）IL-4配列の増幅
Ig leader-Amyloid β 1-42-IL-4（IgL-Aβ-IL-4）（図１）は、上述のpTarget/Ig leader-Amyloid β 1-42-Ig Fc (IgL-Aβ-Fc)を利用して作製した。先ず、ヒト末梢血由来mRNA及びマウス脾臓由来mRNAを用いて、ReverTra Ace−α- (TOYOBO, Tokyo, Japan) によりcDNAを合成した。ヒト及びマウスIL-4 mRNA (coding region) の5’末端又は3’末端を含み、且つ適切な制限酵素サイト (Kpn I又はNot I) を付加したプライマーを設計し、KOD−plus- (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、ヒト、マウスIL-4全長配列を増幅した。PCR産物をアガロースゲルから精製 (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen, Tokyo, Japan) してクローニングベクターに挿入し (Zero Blunt TOPO PCR Kit for Sequencing, Invitrogen, Tokyo, Japan)、シークエンス解析により目的の配列を有するクローンを選定した。 ヒトIL-4ではスプライシングバリアントであるisotype 1（hIL-4）とisotype 2（hIL-4δ2）の両配列が増幅されたが、後者はIL-4のレセプターアンタゴニストであるため（Alms WJ et al, Mol Immunol 1996, 33:361-370; Fletcher HA et al, Immunology 2004, 112:669-673; Plante S. et al, J Allergy Clin Immunol 2006, 117:1321-1327）、isotype 1を選択した。
（２）Fc配列からIL-4配列への組換え
予め付加した制限酵素サイト (Kpn I、Not I) を利用してクローニングベクターからIL-4配列を切り出し、同時に、pTarget/IgL-Aβ-Fcから同一の制限酵素ペアによりFc配列を切り出した。hIL-4又はmIL-4配列、及びpTarget/IgL-Aβをそれぞれアガロースゲルより精製し (MinElute Gel Extraction Kit)、 Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いて、16℃で一晩ライゲーション反応を行った。TOP10F’ (Invitrogen, Tokyo, Japan) にトランスフォーメーションし、blue-white selectionをすると共に、制限酵素切断により目的配列（正しいサイズのインサート）が挿入されているクローンを選定した。得られたpTarget/IgL-Aβ1-42-hIL-4のインサートの塩基配列を配列番号２１で表し、pTarget/IgL-Aβ1-42-mIL-4のインサートの塩基配列を配列番号２２で表す。
予め付加した制限酵素サイト (Kpn I、Not I) を利用してクローニングベクターからIL-4配列を切り出し、同時に、pTarget/IgL-Aβ-Fcから同一の制限酵素ペアによりFc配列を切り出した。hIL-4又はmIL-4配列、及びpTarget/IgL-Aβをそれぞれアガロースゲルより精製し (MinElute Gel Extraction Kit)、 Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いて、16℃で一晩ライゲーション反応を行った。TOP10F’ (Invitrogen, Tokyo, Japan) にトランスフォーメーションし、blue-white selectionをすると共に、制限酵素切断により目的配列（正しいサイズのインサート）が挿入されているクローンを選定した。得られたpTarget/IgL-Aβ1-42-hIL-4のインサートの塩基配列を配列番号２１で表し、pTarget/IgL-Aβ1-42-mIL-4のインサートの塩基配列を配列番号２２で表す。
３．pIRES2/Ig leader-Amyloid β 1-42-M-CSF（IgL-Aβ-M-CSF）ワクチンの作製
M-CSF分子はホモダイマーを形成して作用するタンパクであるため、IRESシステムを利用して、Aβ1-42とM-CSFを独立のタンパクとして発現させる方法を採用した。
（１）M-CSF配列及びIg leader (IgL) 配列の増幅
マウス脾臓由来mRNAを用いて、ReverTra Ace -α- (TOYOBO, Tokyo, Japan) によりcDNAを合成した。マウスM-CSF（moM-CSF）mRNA (coding region) の5’末端又は3’末端を含み、且つ任意の適する制限酵素サイト (BamH I又はNot I) を付加したプライマーを設計し、KOD -plus- (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、マウスM-CSF全長配列を増幅した。Ig leader (IgL) 配列は、pTarget/Ig leader-Amyloid β 1-42-Ig Fc (pTarget/IgL-Aβ-Fc)を鋳型とし、必要な制限酵素サイト (Nhe I、Xho I) を付加したプライマーにより増幅した。それぞれのPCR産物をアガロースゲルから精製 (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen, Tokyo, Japan) してクローニングベクターに挿入し (Zero Blunt TOPO PCR Kit for Sequencing, Invitrogen, Tokyo, Japan)、シークエンス解析により目的の配列を有するクローンを選定した。
M-CSF分子はホモダイマーを形成して作用するタンパクであるため、IRESシステムを利用して、Aβ1-42とM-CSFを独立のタンパクとして発現させる方法を採用した。
（１）M-CSF配列及びIg leader (IgL) 配列の増幅
マウス脾臓由来mRNAを用いて、ReverTra Ace -α- (TOYOBO, Tokyo, Japan) によりcDNAを合成した。マウスM-CSF（moM-CSF）mRNA (coding region) の5’末端又は3’末端を含み、且つ任意の適する制限酵素サイト (BamH I又はNot I) を付加したプライマーを設計し、KOD -plus- (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、マウスM-CSF全長配列を増幅した。Ig leader (IgL) 配列は、pTarget/Ig leader-Amyloid β 1-42-Ig Fc (pTarget/IgL-Aβ-Fc)を鋳型とし、必要な制限酵素サイト (Nhe I、Xho I) を付加したプライマーにより増幅した。それぞれのPCR産物をアガロースゲルから精製 (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen, Tokyo, Japan) してクローニングベクターに挿入し (Zero Blunt TOPO PCR Kit for Sequencing, Invitrogen, Tokyo, Japan)、シークエンス解析により目的の配列を有するクローンを選定した。
（２）APL配列からIgL配列への組換え
事前に作製したpIRES2-EGFP/Alkaline phosphatase leader-Amyloid β 1-42 (pIRES2-EGFP/APL-Aβ) (pIRES2-EGFPベクター: Takara-Chlontech, Tokyo, Japan) を利用して、先ずpIRES2-EGFP/Ig leader-Amyloid β 1-42（pIRES2-EGFP/IgL-Aβ）を作製した。APL配列の両端に付加された制限酵素サイト (Nhe I、Xho I) によりこの配列を切り出し、クローニングベクターから同一の制限酵素ペアによりIgL配列を切り出した。pIRES2-EGFP/Aβ及びIgL配列をそれぞれアガロースゲルより精製し (MinElute Gel Extraction Kit)、 Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、16℃で一晩ライゲーション反応を行った。TOP10 (Invitrogen, Tokyo, Japan) にトランスフォーメーションし、制限酵素切断により目的配列（正しいサイズのインサート）が挿入されているクローンを選定した。
事前に作製したpIRES2-EGFP/Alkaline phosphatase leader-Amyloid β 1-42 (pIRES2-EGFP/APL-Aβ) (pIRES2-EGFPベクター: Takara-Chlontech, Tokyo, Japan) を利用して、先ずpIRES2-EGFP/Ig leader-Amyloid β 1-42（pIRES2-EGFP/IgL-Aβ）を作製した。APL配列の両端に付加された制限酵素サイト (Nhe I、Xho I) によりこの配列を切り出し、クローニングベクターから同一の制限酵素ペアによりIgL配列を切り出した。pIRES2-EGFP/Aβ及びIgL配列をそれぞれアガロースゲルより精製し (MinElute Gel Extraction Kit)、 Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、16℃で一晩ライゲーション反応を行った。TOP10 (Invitrogen, Tokyo, Japan) にトランスフォーメーションし、制限酵素切断により目的配列（正しいサイズのインサート）が挿入されているクローンを選定した。
（３）EGFP配列からM-CSF配列への組換え
次に、pIRES2-EGFP/IgL-Aβより、制限酵素サイト（Bst X I、Not I） を利用してEGFP配列を切り出した。同時に、クローニングベクターからM-CSF配列を制限酵素切断 (BamH I、Not I) により切り出し、pIRES2/IgL-Aβ及びM-CSFをアガロースゲルから精製後、両コンストラクトの突出末端をKOD DNA polymerase (Toyobo, Tokyo, Japan) により平滑化した。pIRES2/IgL-Aβはアルカリフォスファターゼ処理 (E. coli Alkaline Phosphatase, Toyobo, Tokyo, Japan) し、clean upを行った（QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen, Tokyo, Japan）。Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて二つのコンストラクトをライゲーションし、pIRES2/IgL-Aβ-moM-CSFを完成させた。
得られたpIRES2/IgL-Aβ-moM-CSFのインサートの塩基配列を配列番号２３で表す。
次に、pIRES2-EGFP/IgL-Aβより、制限酵素サイト（Bst X I、Not I） を利用してEGFP配列を切り出した。同時に、クローニングベクターからM-CSF配列を制限酵素切断 (BamH I、Not I) により切り出し、pIRES2/IgL-Aβ及びM-CSFをアガロースゲルから精製後、両コンストラクトの突出末端をKOD DNA polymerase (Toyobo, Tokyo, Japan) により平滑化した。pIRES2/IgL-Aβはアルカリフォスファターゼ処理 (E. coli Alkaline Phosphatase, Toyobo, Tokyo, Japan) し、clean upを行った（QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen, Tokyo, Japan）。Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて二つのコンストラクトをライゲーションし、pIRES2/IgL-Aβ-moM-CSFを完成させた。
得られたpIRES2/IgL-Aβ-moM-CSFのインサートの塩基配列を配列番号２３で表す。
４．pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4ワクチンの作製
（１）huIgFc-huIL-4及びmIgFc-mIL-4コンストラクトの作製
huIgFcは、pTarget/IgL-Aβ1-42-huIgFcをテンプレートとし、適当な制限酵素サイト（Kpn I及びSal I）を付加し、且つstopコドンを除去したプライマーを用いてPCR法により増幅した。
mIgFcは、マウス脾臓より抽出したmRNA由来のcDNAをテンプレートとして、制限酵素サイト（Kpn I及びSal I）を付加し、且つstopコドンを除去したプライマーを用いてPCR法により増幅した。
なお、本来のIgFc配列には、システイン残基（Cys）をコードするコドンが含まれるが、S-S結合を回避するため、7箇所のCysがSerに置換されるようにプライマーを設計した。
huIL-4及びmIL-4は、それぞれpTarget/IgL-Aβ1-42-huIL-4及びpTarget/IgL-Aβ1-42-mIL-4をテンプレートとし、それぞれのleader配列（シグナルペプチド）を除去し、且つ5’側にリンカー配列（TCTTCTGGTGGTGGTGGT：配列番号２４）を付加したプライマーを用いてPCR法により増幅した。この際、両コンストラクトとも制限酵素サイト（Sal I及びNot I）を付加し、テンプレートに存在するstopコドンはそのまま増幅した。
増幅したhuIL-4及びmIL-4の遺伝子断片を、予め付加した制限酵素サイトにより切断処理し、huIgFcとhuIL-4、及びmIgFcとmIL-4のペアを、それぞれLigation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、クローニング(pCR4-Blunt TOPO; Invitrogen, Tokyo, Japan) 後、シークエンス解析により正しい配列のhuIgFc-huIL-4又はmIgFc-mIL-4を有するクローンを選定した。
（１）huIgFc-huIL-4及びmIgFc-mIL-4コンストラクトの作製
huIgFcは、pTarget/IgL-Aβ1-42-huIgFcをテンプレートとし、適当な制限酵素サイト（Kpn I及びSal I）を付加し、且つstopコドンを除去したプライマーを用いてPCR法により増幅した。
mIgFcは、マウス脾臓より抽出したmRNA由来のcDNAをテンプレートとして、制限酵素サイト（Kpn I及びSal I）を付加し、且つstopコドンを除去したプライマーを用いてPCR法により増幅した。
なお、本来のIgFc配列には、システイン残基（Cys）をコードするコドンが含まれるが、S-S結合を回避するため、7箇所のCysがSerに置換されるようにプライマーを設計した。
huIL-4及びmIL-4は、それぞれpTarget/IgL-Aβ1-42-huIL-4及びpTarget/IgL-Aβ1-42-mIL-4をテンプレートとし、それぞれのleader配列（シグナルペプチド）を除去し、且つ5’側にリンカー配列（TCTTCTGGTGGTGGTGGT：配列番号２４）を付加したプライマーを用いてPCR法により増幅した。この際、両コンストラクトとも制限酵素サイト（Sal I及びNot I）を付加し、テンプレートに存在するstopコドンはそのまま増幅した。
増幅したhuIL-4及びmIL-4の遺伝子断片を、予め付加した制限酵素サイトにより切断処理し、huIgFcとhuIL-4、及びmIgFcとmIL-4のペアを、それぞれLigation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、クローニング(pCR4-Blunt TOPO; Invitrogen, Tokyo, Japan) 後、シークエンス解析により正しい配列のhuIgFc-huIL-4又はmIgFc-mIL-4を有するクローンを選定した。
（２）pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4の作製
huIgFc-huIL-4又はmIgFc-mIL-4コンストラクトを、両端の制限酵素サイト（Kpn I及びNot I）で切り出し、同一サイトで切り出したpTarget/IgL-Aβ1-42-huIL-4のhuIL-4部分と組み換えた。これにより、pTarget/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpTarget/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4を得た。更に、IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びIgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4を、pTargetベクターからそれぞれ両端の制限酵素サイト（BamH I及びNot I）で切り出し、同一の制限酵素ペアで処理したpVAX1ベクター (Invitrogen, Tokyo, Japan) に、Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4を完成させた。得られたpVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4のインサートの塩基配列を、それぞれ配列番号２５及び２６で表す。
huIgFc-huIL-4又はmIgFc-mIL-4コンストラクトを、両端の制限酵素サイト（Kpn I及びNot I）で切り出し、同一サイトで切り出したpTarget/IgL-Aβ1-42-huIL-4のhuIL-4部分と組み換えた。これにより、pTarget/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpTarget/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4を得た。更に、IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びIgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4を、pTargetベクターからそれぞれ両端の制限酵素サイト（BamH I及びNot I）で切り出し、同一の制限酵素ペアで処理したpVAX1ベクター (Invitrogen, Tokyo, Japan) に、Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4を完成させた。得られたpVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4のインサートの塩基配列を、それぞれ配列番号２５及び２６で表す。
５．pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-moIgFc-mIL-4ワクチンの作製
Aβ1-42 遺伝子の４回繰り返し配列（(Aβ1-42)x4）のコンストラクトは、4個のAβ1-42を3個のリンカー配列(GGTGGCGGTGGCTCG：配列番号２７)で連結することにより作製した。先ず、Aβ1-42+リンカー配列+Aβ1-6及びAβ37-42+リンカー配列+ Aβ1-42という2種類のコンストラクトを、PCR増幅により作製した。次に、両コンストラクトを混合してテンプレートとし、Aβ1-42の5’側に制限酵素サイトXho Iを付加したセンスプライマー及びAβ1-42の3’側に制限酵素サイトKpn Iを付加したアンチセンスプライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、ラダー状に現れたバンドのうち、(Aβ1-42)x4の分子量に合致する約560 bpのバンドを切り出して精製した。
作製した(Aβ1-42)x4コンストラクトをクローニングし、シークエンス解析後、予め付加した制限酵素サイト（Xho I及びKpn I）で切り出し、同一サイトで切り出したpTarget/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpTarget/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4のAβ1-42部分と組み換えた。これにより、pTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びpTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4を得た。更に、IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びIgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4を、pTargetベクターからそれぞれ両端の制限酵素サイト（BamH I及びNot I）で切り出し、同一の制限酵素ペアで処理したpVAX1ベクター (Invitrogen, Tokyo, Japan) に、Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4を完成させた。得られたpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4のインサートの塩基配列を、それぞれ配列番号２８及び２９で表す。
Aβ1-42 遺伝子の４回繰り返し配列（(Aβ1-42)x4）のコンストラクトは、4個のAβ1-42を3個のリンカー配列(GGTGGCGGTGGCTCG：配列番号２７)で連結することにより作製した。先ず、Aβ1-42+リンカー配列+Aβ1-6及びAβ37-42+リンカー配列+ Aβ1-42という2種類のコンストラクトを、PCR増幅により作製した。次に、両コンストラクトを混合してテンプレートとし、Aβ1-42の5’側に制限酵素サイトXho Iを付加したセンスプライマー及びAβ1-42の3’側に制限酵素サイトKpn Iを付加したアンチセンスプライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、ラダー状に現れたバンドのうち、(Aβ1-42)x4の分子量に合致する約560 bpのバンドを切り出して精製した。
作製した(Aβ1-42)x4コンストラクトをクローニングし、シークエンス解析後、予め付加した制限酵素サイト（Xho I及びKpn I）で切り出し、同一サイトで切り出したpTarget/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpTarget/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4のAβ1-42部分と組み換えた。これにより、pTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びpTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4を得た。更に、IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びIgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4を、pTargetベクターからそれぞれ両端の制限酵素サイト（BamH I及びNot I）で切り出し、同一の制限酵素ペアで処理したpVAX1ベクター (Invitrogen, Tokyo, Japan) に、Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4を完成させた。得られたpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4のインサートの塩基配列を、それぞれ配列番号２８及び２９で表す。
６．pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcワクチンの作製
Stopコドンを付加したhuIgFc及びmIgFcは、それぞれpTarget/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpTarget/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4をテンプレートとし、適当な制限酵素サイト（Kpn I及びNot I）及びstopコドンを付加したプライマーを用いて増幅した。増幅産物をクローニングし、シークエンス解析を行った後、制限酵素サイト（Kpn I及びNot I）で切り出し、同一サイトで切り出したpTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4のhuIgFc-huIL-4部分、又はpTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4のmIgFc-mIL-4部分と組み換えた。これにより、pTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc及び pTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを得た。更に、IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc及びIgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを、pTargetベクターからそれぞれ両端の制限酵素サイト（BamH I及びNot I）で切り出し、同一の制限酵素ペアで処理したpVAX1ベクター (Invitrogen, Tokyo, Japan) に、Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFcとpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを完成させた。得られたpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFcとpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcのインサートの塩基配列を、それぞれ配列番号３０及び３１で表す。
Stopコドンを付加したhuIgFc及びmIgFcは、それぞれpTarget/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4及びpTarget/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4をテンプレートとし、適当な制限酵素サイト（Kpn I及びNot I）及びstopコドンを付加したプライマーを用いて増幅した。増幅産物をクローニングし、シークエンス解析を行った後、制限酵素サイト（Kpn I及びNot I）で切り出し、同一サイトで切り出したpTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4のhuIgFc-huIL-4部分、又はpTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4のmIgFc-mIL-4部分と組み換えた。これにより、pTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc及び pTarget/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを得た。更に、IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc及びIgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを、pTargetベクターからそれぞれ両端の制限酵素サイト（BamH I及びNot I）で切り出し、同一の制限酵素ペアで処理したpVAX1ベクター (Invitrogen, Tokyo, Japan) に、Ligation high (Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてライゲーションし、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFcとpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを完成させた。得られたpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFcとpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcのインサートの塩基配列を、それぞれ配列番号３０及び３１で表す。
ワクチン投与試験
１．pTarget/IgL-Aβ1-42-mIL-4及びpIRES2/IgL-Aβ1-42-moM-CSFの投与試験
（１）材料及び方法
ワクチン投与試験には、アルツハイマー病のモデルマウスを用いた。当該モデルマウスは、米国ジャクソン研究所から入手した。また、ワクチンとしては、プラスミドにマウスIL-4を組み込んだpTarget/IgL-Aβ1-42-mIL-4（「Aβ-IL4ワクチン」とも称する）又はマウスM-CSFを組み込んだ pIRES2/IgL-Aβ1-42-moM-CSF（「M-CSFワクチン」とも称する）を用いた。
１．pTarget/IgL-Aβ1-42-mIL-4及びpIRES2/IgL-Aβ1-42-moM-CSFの投与試験
（１）材料及び方法
ワクチン投与試験には、アルツハイマー病のモデルマウスを用いた。当該モデルマウスは、米国ジャクソン研究所から入手した。また、ワクチンとしては、プラスミドにマウスIL-4を組み込んだpTarget/IgL-Aβ1-42-mIL-4（「Aβ-IL4ワクチン」とも称する）又はマウスM-CSFを組み込んだ pIRES2/IgL-Aβ1-42-moM-CSF（「M-CSFワクチン」とも称する）を用いた。
モデルマウス4ヶ月齢から、2週に1回筋肉注射により100 μgのワクチン投与を行い、10ヶ月齢で沈着Aβの削減効果を見た（図３）。まず、深麻酔下にマウスを屠殺し、大脳を取り出し、4％パラフォルムアルデヒドで固定した。固定脳を脱水後パラフィン包埋し、薄切した。切片を脱パラフィン後、抗Aβ抗体を用いた免疫染色を行った(図３A-C)。各染色切片から大脳皮質、及び海馬の10視野をランダムに写真撮影し、NIH imageソフトウエアを用いてAβの沈着総面積として定量化した(図３D)。
ワクチン投与動物の抗体の総量はELISAで、その特性はAβ親和性試験で解析した。ELISAは定法通り、Aβ親和性試験は以下のように行った。被検血漿を段階希釈し、それぞれの検体をモデルマウスの大脳切片にかけて、免疫組織学的に検体の結合の有無を判定した。
陽性となる最大希釈倍率をもって、その検体のAβ親和活性とした。
陽性となる最大希釈倍率をもって、その検体のAβ親和活性とした。
（２）結果
結果を図３及び図４に示す。図３D及び図４において、「noTx」とは未治療群を表し、「Aβ」とはAβワクチン投与群を表し、「Fc」とはAβ-Fcワクチン投与群を表す。また、「IL-4」とはAβ-IL4ワクチン投与群を表し、「MCSF」とはM-CSFワクチン投与群を表す。
結果を図３及び図４に示す。図３D及び図４において、「noTx」とは未治療群を表し、「Aβ」とはAβワクチン投与群を表し、「Fc」とはAβ-Fcワクチン投与群を表す。また、「IL-4」とはAβ-IL4ワクチン投与群を表し、「MCSF」とはM-CSFワクチン投与群を表す。
図３において、現有ワクチン投与群（Aβワクチン、図３B）は、未治療群（図３A）に比し、Aβの削減効果が認められるが、あまり顕著ではない。一方、新型ワクチン（Aβ-IL4ワクチン）投与では明らかにより強いAβ削減効果が認められた（図３C）。これらの所見を定量解析したところ、Aβ-IL4ワクチンは、現有ワクチン（Aβワクチン、Aβ-Fcワクチン（IgL- Aβ-Fc））に比し、Aβ削減効果が有意に強力であることが明らかとなった（図３D）。また、M-CSFワクチンにも顕著なAβ削減効果が認められた（図３D）。
図４において、Aβ-IL4ワクチン投与マウスでは、抗Aβ-IgG値は対照群と有意の差はないものの、Aβ沈着（老人斑）に親和性の高い抗体が増加していることが明らかとなった（図４）。この誘導抗体の性質は、新型Aβ-IL4ワクチン投与によるAβ削減効果が高いことの裏付けであると考えられた。
２．pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4(YM3711)等の投与試験
（１）材料及び方法
pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4（図５）、pVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4（図６）、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4（図７）、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4（図８）、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc（図９）及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc（図１０）を新たに作製し、投与試験を行った。
（１）材料及び方法
pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4（図５）、pVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4（図６）、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4（図７）、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4（図８）、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc（図９）及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc（図１０）を新たに作製し、投与試験を行った。
ワクチン投与試験には、アルツハイマー病のモデルマウスを用いた。当該モデルマウスは、米国ジャクソン研究所から入手した。
ワクチンとしては、マウスにはpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4、及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを用いた。ウサギにはpVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4、およびpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを投与した。
まず、上記ワクチンを培養細胞に導入し、3日間培養後、細胞内と培養上清に存在するAβ量をサンドイッチELISAで定量した。培養細胞としては、HEK392細胞を用いた。
次に、モデルマウス10ヶ月齢から、週に1回筋肉注射により100 μgのワクチン投与を行い、経時的に眼窩より採血した。血漿を分離して、ELISA法により抗Aβ抗体の力価を測定した。同様に、ウサギにもワクチン投与を行い、血漿中の抗体価を測定した。
モデルマウスは12ヶ月齢で屠殺し、ワクチン投与による脳内沈着Aβの削減効果を検討した。まず、深麻酔下に頸椎脱臼を行い、大脳を取り出して、4％パラフォルムアルデヒドで固定した。固定脳を脱水後パラフィン包埋し、薄切した。切片を脱パラフィン後、抗Aβ抗体を用いた免疫染色を行った。各染色切片から大脳皮質の10視野をランダムに写真撮影し、NIH imageソフトウエアを用いてAβの沈着総面積として定量化した。
ワクチンとしては、マウスにはpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4、及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを用いた。ウサギにはpVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4、およびpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFcを投与した。
まず、上記ワクチンを培養細胞に導入し、3日間培養後、細胞内と培養上清に存在するAβ量をサンドイッチELISAで定量した。培養細胞としては、HEK392細胞を用いた。
次に、モデルマウス10ヶ月齢から、週に1回筋肉注射により100 μgのワクチン投与を行い、経時的に眼窩より採血した。血漿を分離して、ELISA法により抗Aβ抗体の力価を測定した。同様に、ウサギにもワクチン投与を行い、血漿中の抗体価を測定した。
モデルマウスは12ヶ月齢で屠殺し、ワクチン投与による脳内沈着Aβの削減効果を検討した。まず、深麻酔下に頸椎脱臼を行い、大脳を取り出して、4％パラフォルムアルデヒドで固定した。固定脳を脱水後パラフィン包埋し、薄切した。切片を脱パラフィン後、抗Aβ抗体を用いた免疫染色を行った。各染色切片から大脳皮質の10視野をランダムに写真撮影し、NIH imageソフトウエアを用いてAβの沈着総面積として定量化した。
（２）結果
図１１〜１３に代表的な結果を示す。
図１１において、「IgL-Aβ-IL4」はpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIL-4を表し、「IgL-Aβ-Fc-IL4」はpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4を表す。また、「cell pellet」は細胞ペレットを表し、「sup.」は培養上清を表す。
免疫グロブリンFc配列を有するワクチン（「IgL-Aβ-Fc-IL4」）は、培養細胞に導入すると、Fc配列を有しないワクチン（「IgL-Aβ-IL4」）に比べ、数倍以上の培養細胞内Aβ産生が認められた（「cell pellet」）。また、培養上清へのAβ分泌もFc配列を有しないワクチンではほとんど認められないのに対し、Fc配列を有するワクチンでは顕著な分泌が認められた（「sup.」）。
pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4（以下「Aβ(1-42)x1ワクチン」とも称する）及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4（以下「YM3711」とも称する）をウサギに投与すると、Aβ1-42の繰り返し構造を持たないAβ(1-42)x1ワクチンもAβ1-42の繰り返し構造を持つYM3711も有意な抗Aβ抗体を誘導した(図１２)。さらに、Aβ1-42の繰り返し構造を持つYM3711を投与したウサギ（図１２中「ウサギ＃３〜４」）は、Aβ1-42の繰り返し構造を持たないAβ(1-42)x1ワクチンを投与したウサギ（図１２中「ウサギ＃１〜２」）よりも高い抗体力価を示した（図１２）。この結果は、本発明のベクターが抗Aβ抗体誘導剤として有用であることを示すものである。
脳内Aβ沈着の定量では、未治療群に比し、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4を投与したマウスで明らかに顕著なAβ削減効果が認められた(図１３)。
図１１〜１３に代表的な結果を示す。
図１１において、「IgL-Aβ-IL4」はpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIL-4を表し、「IgL-Aβ-Fc-IL4」はpVAX1/IgL-Aβ1-42-mIgFc-mIL-4を表す。また、「cell pellet」は細胞ペレットを表し、「sup.」は培養上清を表す。
免疫グロブリンFc配列を有するワクチン（「IgL-Aβ-Fc-IL4」）は、培養細胞に導入すると、Fc配列を有しないワクチン（「IgL-Aβ-IL4」）に比べ、数倍以上の培養細胞内Aβ産生が認められた（「cell pellet」）。また、培養上清へのAβ分泌もFc配列を有しないワクチンではほとんど認められないのに対し、Fc配列を有するワクチンでは顕著な分泌が認められた（「sup.」）。
pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc-huIL-4（以下「Aβ(1-42)x1ワクチン」とも称する）及びpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4（以下「YM3711」とも称する）をウサギに投与すると、Aβ1-42の繰り返し構造を持たないAβ(1-42)x1ワクチンもAβ1-42の繰り返し構造を持つYM3711も有意な抗Aβ抗体を誘導した(図１２)。さらに、Aβ1-42の繰り返し構造を持つYM3711を投与したウサギ（図１２中「ウサギ＃３〜４」）は、Aβ1-42の繰り返し構造を持たないAβ(1-42)x1ワクチンを投与したウサギ（図１２中「ウサギ＃１〜２」）よりも高い抗体力価を示した（図１２）。この結果は、本発明のベクターが抗Aβ抗体誘導剤として有用であることを示すものである。
脳内Aβ沈着の定量では、未治療群に比し、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-mIgFc-mIL-4を投与したマウスで明らかに顕著なAβ削減効果が認められた(図１３)。
これまで、プラスミドベクター中にAβ 1-42やIL-4や組織プラスミノーゲンアクチベーターの遺伝子を導入したワクチンを作製して、アルツハイマーモデルマウスの治療を試みた例がある。しかしDNAワクチン単独で脳内Aβの減少を誘導することはできなかった。これはワクチンの構造内に抗Aβ抗体を上昇させる機構に不備があるためであると推測されている。ここで示したように、本発明者らが作製したワクチンは単独で有効であり、現有の他のワクチンに比して明らかにAβ削減効果が高いことが示された。特に、ヒト型及びマウス型のpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-IgFc-IL-4ワクチンのAβ削減効果は、極めて高いものであることが示された。
３．pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4(YM3711)の各種抗体誘導能の検討
本発明者らは、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4(YM3711)の各種抗体誘導能について、上記２．の投与試験と同様の方法を用いて検討を行った。具体的には、ウサギに1mgのYM3711を６回（週に1回、6週間）筋肉注射し、経時的に採血した。血漿を分離して、ELISA法により血漿中の抗Aβ抗体の力価を測定し、免疫前血漿と比較した。また、同様の試験を既存ワクチン（pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc）を用いて行い、抗体価の程度をYM3711と比較した。ウサギを用いた場合のDNAワクチンの投与スケジュール及び抗体価測定手順を図１４に示す。
その結果、既存ワクチンを投与したウサギ（図１５中「ウサギ＃１〜２」）に比し、YM3711を投与したウサギ（図１５中「ウサギ＃３〜４」）では抗Aβ1-42抗体の抗体価の増加率が高いことが示された (図１５)。YM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表１に示す。
表１に示すとおり、既存ワクチンを投与したウサギ（表１中「ウサギ＃１〜２」）は、免疫前と比較して12〜39％の増加率を示した。これに対し、YM3711を投与したウサギ（表１中「ウサギ＃３〜４」）は58〜68％もの増加率を示した。このことは、ウサギにおいて、YM3711が既存ワクチンと比較して顕著に抗Aβ1-42抗体を誘導することを示す。
本発明者らは、pVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4(YM3711)の各種抗体誘導能について、上記２．の投与試験と同様の方法を用いて検討を行った。具体的には、ウサギに1mgのYM3711を６回（週に1回、6週間）筋肉注射し、経時的に採血した。血漿を分離して、ELISA法により血漿中の抗Aβ抗体の力価を測定し、免疫前血漿と比較した。また、同様の試験を既存ワクチン（pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc）を用いて行い、抗体価の程度をYM3711と比較した。ウサギを用いた場合のDNAワクチンの投与スケジュール及び抗体価測定手順を図１４に示す。
その結果、既存ワクチンを投与したウサギ（図１５中「ウサギ＃１〜２」）に比し、YM3711を投与したウサギ（図１５中「ウサギ＃３〜４」）では抗Aβ1-42抗体の抗体価の増加率が高いことが示された (図１５)。YM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表１に示す。
表１に示すとおり、既存ワクチンを投与したウサギ（表１中「ウサギ＃１〜２」）は、免疫前と比較して12〜39％の増加率を示した。これに対し、YM3711を投与したウサギ（表１中「ウサギ＃３〜４」）は58〜68％もの増加率を示した。このことは、ウサギにおいて、YM3711が既存ワクチンと比較して顕著に抗Aβ1-42抗体を誘導することを示す。
抗Aβ1-42抗体の抗体価の上昇は免疫後2週目から観察され、以降高値を持続していた（図１６）。また、ウサギ以外に、野生型マウス又はモデルマウスでもDNAワクチン投与で抗体価の上昇が認められた（図１７）。野生型マウス及びモデルマウスにそれぞれYM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表２に示す。
表２に示すとおり、YM3711は、野生型マウスにおいては91〜124％、モデルマウスにおいては81〜111％の増加率を示した。このことは、YM3711が野生型マウス及びモデルマウスのいずれにおいても顕著に抗Aβ1-42抗体を誘導することを示す。
表２に示すとおり、YM3711は、野生型マウスにおいては91〜124％、モデルマウスにおいては81〜111％の増加率を示した。このことは、YM3711が野生型マウス及びモデルマウスのいずれにおいても顕著に抗Aβ1-42抗体を誘導することを示す。
さらに、本発明者らは薬剤開発上最も重要なサルにおいても同様の試験を行った。具体的には、3.5-4.5歳の雄カニクイザル(3.0-4.0kg)に0.5 mg/kgのYM3711を週1回筋注し、免疫前と2週目、4週目に採血した。この血漿を用いて、Aβ1-42ペプチドを抗原とするELISAを行い、抗Aβ抗体価を測定した。この際、免疫前の抗体価を100％として、その上昇率（増加率）を算定した。
その結果、既存ワクチン（pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc）を投与したサル（図１８中「サル＃１〜３」）に比し、YM3711を投与したサル（図１８中「サル＃３〜４」）では抗Aβ1-42抗体の抗体価の増加率が顕著に高いことが示された (図１８)。YM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表３に示す。
表３に示すとおり、既存ワクチンを投与したサル（表３中「サル＃１〜３」）は、免疫前と比較して8〜12％の増加率を示した。これに対し、YM3711を投与したサル（表３中「サル＃４〜６」）は58〜81％もの増加率を示した。このことは、サルにおいて、YM3711が既存ワクチンと比較して顕著に抗Aβ1-42抗体を誘導することを示す。
また、被検対象がサルの場合は、被検対象がウサギの場合（図１５及び表１）と比較して、既存ワクチン免疫後の抗体価の増加率とYM3711免疫後の抗体価の増加率との差が顕著であることが示された。このことは、既存ワクチンと比べてYM3711がヒトにより近い動物に適合するワクチン又は抗Aβ1-42抗体誘導剤であることを示す。
その結果、既存ワクチン（pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc）を投与したサル（図１８中「サル＃１〜３」）に比し、YM3711を投与したサル（図１８中「サル＃３〜４」）では抗Aβ1-42抗体の抗体価の増加率が顕著に高いことが示された (図１８)。YM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表３に示す。
表３に示すとおり、既存ワクチンを投与したサル（表３中「サル＃１〜３」）は、免疫前と比較して8〜12％の増加率を示した。これに対し、YM3711を投与したサル（表３中「サル＃４〜６」）は58〜81％もの増加率を示した。このことは、サルにおいて、YM3711が既存ワクチンと比較して顕著に抗Aβ1-42抗体を誘導することを示す。
また、被検対象がサルの場合は、被検対象がウサギの場合（図１５及び表１）と比較して、既存ワクチン免疫後の抗体価の増加率とYM3711免疫後の抗体価の増加率との差が顕著であることが示された。このことは、既存ワクチンと比べてYM3711がヒトにより近い動物に適合するワクチン又は抗Aβ1-42抗体誘導剤であることを示す。
サルにおいて、抗Aβ1-42抗体の抗体価の上昇は免疫後2週目から観察され、以降高値を持続し、免疫後4週までに十分な抗Aβ抗体の上昇が認められた（図１９）。
また、YM3711の各種抗体の誘導能を検討するため、上記抗Aβ1-42抗体の抗体価測定と同様の方法を用いて、強い神経毒性を示すpE Aβ3-42に対する抗体、アミノ酸配列はAβと全く異なるものの高いアミロイド凝集性を示すABri及びADanに対する抗体の抗体価を測定した。抗体価測定は、ウサギとサルを用いて行った。
ウサギにおける結果を図２０〜２２に示す。図２０はYM3711によるpEAβ3-42抗体の誘導効果を示し、図２１はYM3711による抗ABri抗体の誘導効果を示し、図２２はYM3711による抗ADan抗体の誘導効果を示す。図２０〜２２において、「ウサギ＃１〜２」は既存のワクチン（pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc）を投与したウサギにおける結果を示し、「ウサギ＃３〜４」はYM3711を投与したウサギにおける結果を示す。
この結果から、YM3711は、これを投与したウサギにおいて抗pEAβ3-42抗体、抗ABri抗体及び抗ADan抗体を誘導することが示された。YM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表４に示す。
表４に示すとおり、既存ワクチンを投与したウサギ（表４中「ウサギ＃１〜２」）は、免疫前と比較して、抗pEAβ3-12抗体については1〜18％、抗ABri抗体については26〜50％、抗ADan抗体については8〜20％の増加率を示した。これに対し、YM3711を投与したウサギ（表４中「ウサギ＃３〜４」）は、抗pEAβ3-12抗体については37〜38％、抗ABri抗体については81〜100％、抗ADan抗体については39〜43％の増加率を示した。このことは、ウサギにおいて、YM3711が既存ワクチンと比較して顕著に抗pEAβ3-12抗体、抗ABri抗体及び抗ADan抗体を誘導することを示す。
この結果から、YM3711は、これを投与したウサギにおいて抗pEAβ3-42抗体、抗ABri抗体及び抗ADan抗体を誘導することが示された。YM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表４に示す。
表４に示すとおり、既存ワクチンを投与したウサギ（表４中「ウサギ＃１〜２」）は、免疫前と比較して、抗pEAβ3-12抗体については1〜18％、抗ABri抗体については26〜50％、抗ADan抗体については8〜20％の増加率を示した。これに対し、YM3711を投与したウサギ（表４中「ウサギ＃３〜４」）は、抗pEAβ3-12抗体については37〜38％、抗ABri抗体については81〜100％、抗ADan抗体については39〜43％の増加率を示した。このことは、ウサギにおいて、YM3711が既存ワクチンと比較して顕著に抗pEAβ3-12抗体、抗ABri抗体及び抗ADan抗体を誘導することを示す。
サルにおける結果を図２３及び２４に示す。図２３は、YM3711によるpEAβ3-42抗体の誘導効果を示し、図２４はYM3711による抗ADan抗体の誘導効果を示す。図２３及び２４において、「サル＃１〜３」は既存のワクチン（pVAX1/IgL-Aβ1-42-huIgFc）を投与したサルにおける結果を示し、「サル＃４〜６」はYM3711を投与したサルにおける結果を示す。
この結果から、YM3711は、これを投与したサルにおいて抗pEAβ3-42抗体及び抗ADan抗体を誘導することが示された。YM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表５に示す。
表５に示すとおり、既存ワクチンを投与したサル（表５中「サル＃１〜３」）は、免疫前と比較して、抗pEAβ3-12抗体については10〜30％、抗ADan抗体については0〜9％の増加率を示した。これに対し、YM3711を投与したサル（表５中「サル＃４〜６」）は、抗pEAβ3-12抗体については39〜50％、抗ADan抗体については30〜49％の増加率を示した。このことは、サルにおいて、YM3711が既存ワクチンと比較して顕著に抗pEAβ3-12抗体及び抗ADan抗体を誘導することを示す。
この結果から、YM3711は、これを投与したサルにおいて抗pEAβ3-42抗体及び抗ADan抗体を誘導することが示された。YM3711を免疫した後の抗体価の増加率（％）を以下の表５に示す。
表５に示すとおり、既存ワクチンを投与したサル（表５中「サル＃１〜３」）は、免疫前と比較して、抗pEAβ3-12抗体については10〜30％、抗ADan抗体については0〜9％の増加率を示した。これに対し、YM3711を投与したサル（表５中「サル＃４〜６」）は、抗pEAβ3-12抗体については39〜50％、抗ADan抗体については30〜49％の増加率を示した。このことは、サルにおいて、YM3711が既存ワクチンと比較して顕著に抗pEAβ3-12抗体及び抗ADan抗体を誘導することを示す。
さらに、YM3711を免疫することにより、抗IgFc抗体及び抗IL-4抗体が誘導されるかどうかについて検討したところ、これらの抗体は誘導されなかった。Aβの繰り返し部分に対する抗体が誘導され、IgFc部分やIL-4部分に対する抗体が誘導されない理由は明らかではないが、ヒトIgFc分子やIL-4分子はサルにとって自己成分に近いため、生体が自己と認識し、これらの分子に対する抗体は誘導されにくいと考えられる。一方、Aβは自己成分由来であるが異常に凝集するため、生体が異物と認識して、抗体を産生するのであろう。
この所見は、ワクチンを臨床応用する上で、不必要な免疫応答を避け、ワクチンの安全性を高める点で重要である。
この所見は、ワクチンを臨床応用する上で、不必要な免疫応答を避け、ワクチンの安全性を高める点で重要である。
以上のように、本発明のワクチンは、アルツハイマー病において神経毒性を示すAβを中心とした様々な分子に対して広範な種類の抗体を誘導し、さらにAβ沈着を削減することが明らかとなった。このような作用機序を示すDNAワクチンはこれまで報告されていない。
本発明によりアルツハイマー病予防又は治療用DNAワクチンが提供される。本発明のワクチンはAβの蓄積を顕著に抑制することから、アルツハイマー病治療又は予防用医薬組成物として有用である。
配列番号１：合成DNA
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Claims (5)
- Aβ1-42の繰り返し配列をコードするDNA、免疫グロブリンFc配列をコードするDNA及びインターロイキン4をコードするDNAを含む組み換えベクター。
- スペーサー配列をさらに含む、請求項１に記載の組み換えベクター。
- 請求項１又は２に記載の組み換えベクターを含む、アルツハイマー病予防又は治療用DNAワクチン。
- 請求項１又は２に記載の組み換えベクターを含む、脳内Aβ削減用DNAワクチン。
- 請求項１又は２に記載の組み換えベクターを含む、抗Aβ抗体誘導剤。
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