CN102741277A - 在治疗运动神经元疾病中的IFNγ抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗运动神经元疾病或病症的新组合物用途和运动神经元疾病或病症的相关方法。尤其是，本发明涉及IFNγ拮抗剂或病毒载体的新用途、使用、其组合物，以及用于治疗运动神经元疾病或病症诸如ALS的相关方法。

Description

在治疗运动神经元疾病中的IFNγ抑制剂
发明领域
本发明涉及运动神经元疾病的治疗，尤其是肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis ALS)的治疗。
发明背景
ALS是不能治愈的在成年人中发病的神经变性疾病，其主要影响脑和脊髓中的上运动神经元和下运动神经元。超氧化物歧化酶-1(Sod1)基因中的显性突变是遗传的ALS的最主要诱因：ALS案例的约10%具有该疾病的家族史，这其中20%是由于超氧化物歧化酶-1(SOD1)基因中的显性遗传性突变所导致的。积累的证据显示在神经胶质细胞中由突变的SOD1介导损伤通过释放对于运动神经元有选择性毒性的因子而引发ALS发病，但是对于运动神经元的特异性消除的理论基础的了解还非常有限，因此妨碍了有效的治疗方法的发展。
小鼠表达人SOD1突变发展为具有人疾病特征的运动神经元综合征(motor syndrome)(Bruijn等人，2004,Als.Annu.Rev.Neurosci.,27,723-749)。通过突变的SOD1介导的细胞自主性和非细胞自主性过程均对运动神经元退化有贡献(Boillee等人，2006,Neuron,52,39-59)：已经有文献报道在运动神经元中的突变的SOD1的毒作用对于疾病的发病和疾病进展的早期阶段是至关重要的(Boillee等人，2006，Science,312,1389-1392)，然而，涉及损害星形胶质细胞和小胶质细胞的非细胞自主性成分是疾病进展的决定子(Yamanaka等人，2008,Nat.Neurosci.,11,251-253)。
LIGHT(TNFSF14)是与淋巴毒素β受体(LT-βR)、疱疹病毒侵入介体(HVEM)和诱捕受体3(DcR3)相关的TNFR超家族的II型跨膜蛋白。LIGHT由未成熟树突细胞、激活的淋巴细胞、单核细胞、以及自然杀伤细胞表达，对于固有和适应性免疫过程是重要的。通过LT-βR或HVEM的LIGHT信号转导作为T细胞增殖和引发不同的细胞因子分泌、以及粘附分子的表达的共刺激信号。显著的是，LIGHT能够与免疫调节细胞因子干扰素γ(IFNγ)作用从而在肿瘤细胞中引发异常的缓慢的细胞凋亡性死亡(Chen等人，2000，J.Biol.Chem.,275,38794-38801)，这是在ALS中运动神经元退化进展性质的表征。
IFNγ是由T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的免疫调节细胞因子。在中枢神经系统中，在慢性炎症性疾病(例如多发性硬化)中或损伤之后增加的IFNγ能够激活星形胶质细胞和小胶质细胞。有趣的是，已经证明在SOD1突变体小鼠和偶发患者中均发现IFNγ水平升高(Hensley等人，2003,Neurobiol.Dis.,14,74-80)。
有关运动神经元疾病的治疗途径的主要具有挑战性的问题在于向最广泛的运动神经元成员传递治疗信号。目前，不存在针对ALS的治疗。证实了已开发的通过减少谷氨酸(glutamate)的释放来降低对运动神经元的损伤的治疗延长了ALS患者的存活数月，主要是在那些具有吞咽困难的患者中，并且延长了患者需要通气支持之前的时间。但是没有治疗能够逆转已经对运动神经元造成的损伤。因此，用于有效阻止或减缓运动神经元疾病以及它们的综合征的发展的方法和化合物是非常令人期望的。
发明内容
本发明涉及IFNγ拮抗剂(antagonist)在治疗运动神经元疾病(诸如ALS)中的新用途，涉及新组合物及其用途，以及治疗ALS的相关方法。具体来说，本发明涉及IFNγ拮抗剂，诸如抗体、适体、嵌合蛋白、或病毒载体的新用途，新组合物及其用途，以及治疗运动神经元疾病(诸如ALS)的相关方法。
本发明的第一方面提供IFNγ拮抗剂在用于制造治疗运动神经元疾病或病症的药物中的用途。
本发明的第二方面提供治疗需要治疗的受试者中运动神经元疾病或病症的方法，该方法包括向所述受试者给药包括IFNγ拮抗剂的药物组合物。
本发明的第三方面提供向细胞递送编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的方法，所述细胞选自：神经细胞、小胶质细胞和脑膜细胞，该方法包括：
(a)提供包括病毒载体的病毒粒子，所述载体包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件；
(b)使病毒粒子与所述细胞接触，由此病毒载体的转导使得在经转导的细胞中表达所述核酸序列以及通过所述细胞表达所述核酸序列。
本发明的第四个方面提供治疗需要的受试者中运动神经元疾病或病症的方法，该方法包括向所述受试者给药药物组合物，该药物组合物包括(a)可药用赋形剂；以及(b)包括病毒载体的病毒粒子，所述病毒载体包括编码IFNγ拮抗剂的核酸序列，其可操作连接至至少一种能够调控所述核酸序列表达的表达调控元件。
本发明的第五个方面提供治疗需要的受试者中运动神经元疾病或病症的方法，该方法包括植入和/或移植遗传工程的干细胞，该干细胞在所述受试者的中枢神经系统中分泌IFNγ拮抗剂。
本发明的第六个方面提供用于对来自受试者样品中的运动神经元疾病进行检测和/或预后评估(prognosis)的体外方法，该方法包括下述步骤：(a)检测来自所述受试者的样品中的IFNγ水平；以及(b)比较通过步骤(a)获得的IFNγ水平数据与罹患运动神经元疾病的受试者的IFNγ水平数据，其中在所述受试者中IFNγ水平与运动神经元疾病状态相关。
本发明的第七个方面提供用于体外检测受试者运动神经元疾病的试剂盒，该试剂盒包括：(a)至少一个样品测试装置，其提供与样品中IFNγ浓度成比例的可读的信号；(b)电子监控器，其具有读取机构以读取在步骤(a)中获得的可读信号，并包含计算机机构以解释可读信号，与之前的样品测试数据结合来确定所述受试者运动神经元退化状态。
本发明的第八个方面提供根据本发明的病毒载体。
本发明的第九个方面提供用作药物的根据本发明的病毒载体。
本发明的第十个方面提供用于治疗神经元疾病，诸如ALS病症的根据本发明的IFNγ拮抗剂。
本发明的第十一个方面提供药物制剂，该药物制剂包括至少一种根据本发明的病毒载体以及可药用载体或赋形剂。
附图说明
图1示出依赖于剂量方式的可溶小鼠重组IFNγ-引发的运动神经元死亡，以如实施例1描述的在48h后的存活运动神经元的百分比来度量。A：经24h培养并且与来自两个不同来源的可溶小鼠重组IFNγ的递增的浓度温育的运动神经元；B：通过LIGHT介导的IFNγ-诱导的运动神经元死亡。在经或不经LT-βR-Fc(100ng/ml)、Fas-Fc(1μg/ml)或TNFR1-Fc(100ng/ml)处理(与或不与250ng/ml的IFNγ处理结合)48h之后，检测运动神经元存活率。将存活的运动神经元的数量表示为占对照条件(无)下运动神经元的数量的百分比。
图2示出在指示的基因型(野生型、SOD1G93A)的星形胶质细胞单层上平铺的野生型运动神经元与或不与功能阻断性抗-IFNγ抗体(500ng/ml)或LT-βR-Fc(100ng/ml)温育48小时的存活百分比，并表示为在不存在任何处理如实施例1所描述的野生型星形胶质细胞单层上的运动神经元的数量的百分比形式。(结合Tukey-Kramer’s事后检验的方差分析(ANOVA)，n=3，**P<0.01，***P<0.001)。进行一式三份的三次独立实验的平均值。
图3示出在13周龄的SOD1G93A、SOD1WT以及野生型小鼠的血清(A)和分离的腰脊髓(B)中的IFNγ水平，通过如实施例2所描述的酶联免疫吸附测定(ELISA)分析测定。结合Tukey-Kramer’s事后检验的单因素方差分析；n=3，***P<0.001，**P<0.01，值表示为平均值±S.D。
图4表示IFNγ在ALS小鼠中运动神经元疾病发病期以及具有症状的期间的作用。在运动神经元疾病的这些期间IFNγ水平增加，从所指示年龄的野生型和SOD1G93A小鼠的腰脊髓中提取的总蛋白质通过SDS-PAGE解析并且用抗体检测IFNγ和肌动蛋白，如实施例2所述。对IFNγ信号进行定量，并对肌动蛋白信号标准化，且表示为SOD1G93A与野生型值的比值(n=3，*P<0.05，值为平均值±S.D)。
图5表示中和性抗-IFNγ抗体保护培养的运动神经元不发生IFNγ-引发的死亡的潜能。培养小鼠运动神经元24h并且不利用或利用重组的小鼠IFNγ(250ng/ml)单独或与指示浓度的抗-IFNγ抗体结合处理或用无关的大鼠IgG(0.5μg/ml)或抗-IFNγ抗体(0.5μg/ml)处理作为对照。在48h后测定运动神经元存活并且表示为相对于未处理的细胞的形式。值为三组平行样品的平均值±S.D。1：无处理；2：IFNγ单独；3：抗-IFNγ抗体0.01μg/ml+IFNγ；1：无处理；2：IFNγ单独；3：抗-IFNγ抗体0.01μg/ml+IFNγ；4：抗-IFNγ抗体0.05μg/ml+IFNγ；5：抗-IFNγ抗体0.1μg/ml+IFNγ；6：抗-IFNγ抗体0.5μg/ml+IFNγ；7：抗-IFNγ抗体单独；8：IgG对照；9：IgG对照+IFNγ。
图6表示用于针对受体和对照的星形细胞投递的重组腺伴随病毒(rAAV)的嵌合蛋白构建体，如实施例4所述。构建体的原理性描述：IFNγR1、DcR3或Fas细胞外部分与COMP融合并且利用人流感血凝素(HA)标签标记。通过删除>80%Fas的细胞外部分来产生COMP对照。然后将构建体克隆到AAV穿梭载体中，其组入了星形胶质细胞特异性gfaABC1D启动子对照、β-珠蛋白内含子、多克隆位点(MCS)以及人生长激素多聚腺苷酸化序列(hGH)。ITR，反向末端重复序列。
图7表示重组蛋白IFNγR1-COMP、DcR3-COMP、以及Fas-COMP(以AAV病毒载体的形式，1.5x105TU/ml)干涉由它们各自的配体(一个或多个)或细胞因子(sFasL(50ng/ml)、sLight(50ng/ml)、IFNγ(250ng/ml))引发的死亡的效率，与阴性对照(COMP)相比。在48h后检测细胞的存活，如实施例4所描述的。所有的值以三个独立的实验的平均值±S.D的形式表示。
图8表示当在SOD1G93A小鼠中遗传学地删除了LIGHT时，对ALS发病和行为以及存活挽救(behavioural and survival rescue)中的IFNγ-LIGHT-LT-βR途径的功能牵涉。通过评价小鼠每周的游泳表现来确定SOD1G93A/LIGHT+/+、SOD1G93A/LIGHT-/-、LIGHT+/+、以及LIGHT-/-的进行性运动缺陷(progressive motor deficit)。值为平均值±S.E.M。
图9表示在具体描述中描述的序列。
发明详述
术语“运动神经元疾病(motoneuron disease)”包括肌萎缩侧索硬化、夏科氏关节病(Charcot’s disease)、葛雷克氏症(Lou Gehrig′s diease)、其它以上或下运动神经元退化征候为特征的运动神经元病症，诸如脊髓性萎缩(SMA)、肯尼迪病(Kennedy’s disease)(或脊延髓肌萎缩症)、遗传性痉挛性截瘫、原发性侧索硬化、进行性肌萎缩。ALS是一种快速进展、一定是致死的神经变性疾病，其以运动神经元的逐渐退化和死亡为特征。在ALS中，上运动神经元和下运动神经元均退化或死亡，不再向肌肉传递信息导致逐渐的肌肉虚弱、肌肉萎缩、以及肌肉肌束震颤。大部分具有ALS的人由于呼吸衰竭死亡，通常在该疾病的症状发病起的3~5年内。此外，患者还可能会遭受认知功能、决策以及记忆方面的变化。
用于本文的术语“有效量”是指至少一种根据本发明的多肽或其药物制剂在组织、系统、动物或人中引起所寻求的生物或医学的响应的量。在一个实施方式中，有效量是减缓接受治疗的疾病或病况的症状的“治疗有效量”。在另外的实施方式中，有效量是预防需要预防的疾病或病况的症状的“预防有效量”。在此使用的该术语还包括有效减少疾病的进展、尤其是减少或抑制运动神经元损伤发展，以及在引发所寻求的响应的IFNγ拮抗剂的量(即“抑制有效量”)。
根据本发明的治疗的“效力(efficacy)”术语可以基于响应于根据本发明的用途或方法的疾病过程中的变化来度量。例如，根据本发明的治疗的效力可以通过与ALS相关的运动缺陷的减少和/或针对于运动神经元损害的保护效果等来度量。根据本发明的治疗的效力可以通过行动症状的减轻来度量，其还应当对在ALS病患中观察到的主要症状施加正面影响。
在本文中使用的“治疗(treatment)”以及“处理(treating)”等通常是指获得期望的药理学和生理学效果。该效果在预防或部分预防该疾病、症状或病况方面可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病、病况、症状或归因于该疾病的不良效应方面可以是治疗性的。在本文中使用的术语“治疗”覆盖在哺乳动物、尤其是人中的任何治疗，其包括：(a)预防该疾病在受试者中出现，该受试者可能易受该疾病的损害，但目前还未被诊断为患病，诸如预防性的早期无症状介入；(b)抑制该疾病，即，阻止其发展或减轻该疾病，即引起疾病和/或其症状或病况的消退，诸如对伤害的改善或补救。尤其是，根据本发明的方法、用途、多肽以及组合物可以用于保护和/或恢复ALS患者中的至少一种选自如下的功能性参数：神经元功能完整性、运动和认知能力。
在本文中使用的术语“受试者(subject)”是指哺乳动物。例如，本发明预期的哺乳动物包括人、灵长类、家养动物诸如牛、绵羊、猪、马、实验用啮齿类动物等。在特定的实施方式中，受试者是罹患或易于罹患运动神经元疾病的患者。在另外特定的实施方式中，受试者是运动神经元疾病的动物模型。
使用的术语“分离的(isolated)”是指不与其它蛋白质或多肽相伴随的分子，例如作为重组宿主细胞培养物的纯化产物或作为经纯化的提取物。
术语“抗体”包括结合至IFNγ或IFNγ受体，诸如IFNγ受体1和/或IFNγ受体2或IFNγ效应物(effector)LIGHT、LT-βR、HVEM、或DcR3、或它们的片段等的抗体、嵌合抗体、纯人类抗体、人源化抗体、基因工程抗体或双特异或多特异抗体，以及它们的片段诸如单链抗体(scFv)或单域抗体。本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体，或具有基本上相同的抗原特异性的它们的片段或衍生物。术语“选择地”是指该抗体优先地识别和/或结合目标多肽或表位，即具有与任何其它抗原或表位的任何结合相比更高的亲和性，即，与目标多肽的结合能够与和其它抗原的非特异性结合相区别。抗体的结合亲和性可以由本领域技术人员容易地确定，例如通过Scatchard分析(Scatchard等人，1949,Ann NY Acad.ScL,51,660-672)。根据一个实施方式，根据本发明的抗-IFNγ抗体选自R4-6A2和I5027。
根据本发明的抗体可以通过免疫合适的宿主(例如，小鼠、人源化小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、驴、猴子)来产生。根据本发明的抗体还可以通过下述方法来产生：使用抗体展示，尤其是噬菌体展示，或使用人B细胞分离，以及向免疫缺陷的小鼠中移植经选择的人B细胞。与免疫原性的IFNγ多肽的免疫反应性的确定可以通过本领域已知的一些方法中的任何方法来进行，包括例如：免疫印迹分析以及ELISA。可以通过在Holliger等人，2005,Nat.Biotech.,23,1126-1136中描述的方法将根据本发明的抗体修饰成在治疗上有用的衍生物。
在本文中使用的术语“单克隆抗体”是指通过基本上同质的抗体种群获得的抗体，即组成种群的单独抗体是相同的，除了可能天然出现的以少量存在的突变。单克隆抗体是高度特异的，其针对单一的抗原位点。“单克隆”的修饰语是指抗体是从基本上同种的抗体种群中获得的这一性质，而不应解释为抗体需要通过任何特定的方法来生产。
术语“抑制剂”或“拮抗剂”被定义为完全地或部分地拮抗或抑制生物分子活性的分子。
编码人IFNγR1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1(Genbank登录号NM_00416)所示，人IFNγR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。编码人IFNγR2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3(Genbank登录号NM_005534)所示，以及人IFNγR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所述。在本文中使用的术语IFNγ包括具有SEQ ID NO：5(Genbank登录号NM_000619)氨基酸序列的人IFNγ多肽，该序列由SEQ ID NO：6的核苷酸序列以及其片段编码。此外，IFNγ包括与SEQ ID NO：5氨基酸序列具有高度相似性或具有高度同一性的多肽，并且该多肽具有生物学活性。根据实施方式，IFNγ包括基本上与SEQID NO：5的序列同源的多肽，但因为一个或多个缺失、插入或取代，其具有至少一个不同于原始序列的氨基酸序列。
“基本上同源”是指变体氨基酸序列与如上文公开的原始的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。两个氨基酸序列的百分比同一性可以通过视觉观察和/或数学计算来确定，或者更为简单地利用用于序列比对的已知的计算机程序来比较序列信息，诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)或Clustal package version 1.83。
术语“IFNγ拮抗剂”或“IFNγ抑制剂”包括本文中所描述的IFNγ或IFNγ受体所有合适形式(诸如IFNγ受体1和/或IFNγ受体2、或IFNγ效应物LIGHT、LT-βR、HVEM、或DcR3、或它们的片段)的所有拮抗剂/抑制剂，它们拮抗一种或多种IFNγ和/或IFNγ受体和/或IFNγ变体或它们的片段的生物活性。例如，本发明的IFNγ拮抗剂能够拮抗IFNγ与IFNγ受体1和/或IFNγ受体2相互作用的能力，以调节通过IFNγ受体复合物的LIGHT-LT-βR死亡途径的激活(例如拮抗LIGHT表达的能力)或促炎症反应分子的产生。术语“IFNγ拮抗剂”包括但不限于：任何种类的IFNγ拮抗性特异性抗体(多克隆、单克隆、抗体片段、抗体变体)、嵌合蛋白、具有IFNγ拮抗活性的天然或非天然蛋白质、小分子、核酸衍生的聚合物(诸如DNA和RNA适体、PNAs或LNAs)、拟肽、融合蛋白、或促使此类IFNγ拮抗剂表达的基因治疗载体、编码IFNγ拮抗剂的病毒载体。另外的实施方式包括作为IFNγ拮抗剂、可溶的IFNγ融合蛋白，诸如但不限于：可以阻断IFNγ细胞内信号作用的分子、可溶的单体的或低聚的IFNγ受体1和/或IFNγ受体2。通常，IFNγ拮抗剂能够结合IFNγ和/或阻断IFNγ以及其它结合伴侣诸如IFNγ受体(诸如IFNγ1和/或IFNγ受体2)的结合。
术语“IFNγ适体”包括非编码核酸分子，其以高特异性和亲和性与IFNγ或IFNγ受体1和/或IFNγ受体2、或IFNγ效应物LIGHT、LT-βR、HVEM或DcR3结合，通过采取特异的二级和三级结构。适体可以选自使用SELEXTM(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)方法或相似的方法(Cox等人，1998,Biotechnol.Prog.,14,845-850；Berezovski等人，2006，J.Am.Chem.Soc.,128:,1410-1411)鉴定的序列组。本文中描述的IFNγ适体能够特异性地结合至以及中和IFNγ或IFNγ受体、IFNγ受体1和/或IFNγ受体2、或IFNγ效应物LIGHT、LT-βR、HVEM或DcR3，由此拮抗IFNγ和/或IFNγ受体和/或IFNγ变体或它们的片段的一种或多种生物活性，或调节IFNγ和IFNγ受体1和/或IFNγ受体2之间的相互作用，或拮抗通过IFNγ受体复合物的LIGHT-LT-βR死亡途径的激活(例如拮抗LIGHT表达的能力)或促炎症反应分子的产生。例如，IFNγ适体通过结合、分裂和扩增的反复过程产生。通过PCR将单链DNA引物和模板扩增为双链可转录模板。将序列库直接用于选择DNA适体，或转录为RNA库用于RNA适体的选择。模板序列可以是例如为单链序列，其由在侧翼具有确定的引物退火序列的40个随机的核苷酸(40N)构成(5′-GGG AGG ACG AUG CGG[40N]CAG ACG ACU CGCCCG A-3′)(SEQ ID NO：7)，通过SELEX PCR引物5′-TAA TAC GAC TCA CTATAG GGA GGA CGA TGC GG-3′(SEQ ID NO：8)和5′-TCG GGC GAG TCGTCT G-3′(SEQ ID NO：9)扩增。由此产生的RNA分子然后针对它们与人和/或鼠类的IFNγ或IFNγ受体1和/或IFNγ受体2、或IFNγ效应物LIGHT、LT-βR、HVEM、或DcR3相互作用的能力来进行筛选，例如通过亲和色谱、磁珠或过滤。在递增的严谨度下重复交替轮次的选择和扩增，以产生对于靶标分子具有高特异性、高亲和性候选物的有限的子集。然后将选定的候选物截短并且对其进行化学修饰以提高对于核酸酶的抗性和药理学性质。IFNγ适体可以包括但不限于：寡核苷酸序列5’-GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGTGT-3’(SEQ ID NO：10)或其保持结合能力的片段(Lee等人，1996，Transplantation 62,1297-1301；Ramanathan等人，1994,J.Biol.Chem.,269,24564-24574)或寡核苷酸序列5’-CAG GUAAUU ACA UGAAGG UGG GUUAGG UAC UUU CAG GGU-3’(SEQ ID NO：11)或其保持结合能力的片段(Kubik等人，1997,J.Immunol.,159(1)，：259-267)。适体可以包括生物稳定的适体，诸如spiegelmersTM(Klussmann等人，1996，Nat.Biotechnol.,14,1112-1115；Vater和Klussmann，2003,Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.,6,253-261)。
术语“IFNγ嵌合蛋白”包括但不限于分子地、物理地或化学地失活的，对于IFNγ受体1和/或IFNγ受体2具有保持的亲和性的IFNγ的蛋白质衍生物或片段、或对于IFNγ具有保持的亲和性的IFNγ受体1或IFNγ受体2的蛋白质衍生物或片段、或对于LIGHT具有保持的亲和性的LT-βR的蛋白质衍生物或片段、对于LIGHT具有保持的亲和性的HVEM的蛋白质衍生物或片段、对于LIGHT和FasL具有保持的亲和性的DcR3(核苷酸SEQ ID NO：12(Genbank登录号NM_032945.2)和氨基酸SEQ ID NO：13)的蛋白质衍生物或片段。此类衍生物或片段可以融合至允许显性负突变体成簇的寡聚化结构域诸如免疫球蛋白的COMP域或Fc片段(Holler等人，2000,J.Immunol.Methods,237,159-173)，或融合至其它人蛋白质的片段。
术语“病毒载体”包括重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体以及重组慢病毒(rLV)载体。在具体的实施方式中，术语“病毒载体”包括自身互补型腺伴随病毒(scAAV)载体。
定义术语“拟肽”为含有非肽结构元素的肽类似物，该肽能够模仿或拮抗天然亲本肽(parent peptide)的生物活性(一种或多种)。拟肽不再具有传统的肽的特性，诸如可被酶裂解的肽键。
术语“表达调控元件”包括针对基因的转录和翻译和/或控制蛋白质在例如期望的宿主细胞中体内表达而提供的序列。
术语“神经细胞”包括在运动神经元(上和下)附近的细胞，诸如例如星形胶质细胞(通常当根据本发明的方法包括通过全身或脊柱内递送核酸时)以及其它神经元细胞诸如运动神经元(通常当根据本发明的方法包括通过肌内或全身递送核酸时)，少突胶质细胞以及中间神经元。
术语“小胶质细胞”包括静息小胶质细胞(resting microglia)或浸润小胶质细胞(infiltrating microglia)。
术语“脑膜细胞”包括包围中枢神经系统的膜。
表述“发展成运动神经元病症的风险”是指相对于没有显示出提高的IFNγ水平的个体(诸如哺乳动物)，具有更高的发展运动神经元病症的风险。
组合物
根据本发明的IFNγ拮抗剂可以作为药物制剂的形式给药，该药物制剂可以含有以本文所述的任何形式存在的一种或多种根据本发明的多肽。本发明的组合物还可以包括一种或多种可药用的额外的成分，诸如明矾、稳定剂、抗菌剂、缓冲剂、着色剂、调味剂、佐剂等。
本发明的IFNγ拮抗剂，以及传统使用的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂可以单独放置在药物组合物以及其单元剂量的形式中，此类形式可以以固体，例如片剂或填充的胶囊的形式利用，或者以诸如溶液、悬浮液、乳液、酏剂的液体形式，或者填充有相同物质的胶囊，所有的均口服使用，或者为针对非消化道(包括皮下)以及经鼻使用的无菌可注射溶液的形式。该药物组合物以及其单元剂量形式可以包括为传统比例的成分，具有或不具有额外的活性化合物或要素成分，并且该单元剂量形式可以含有活性成分的任何合适的有效量，其与待使用的预期的每日剂量范围相当。根据本发明的IFNγ拮抗剂组合物优选可注射的。
本发明的IFNγ拮抗剂还可以是液体制剂，包括但是不限于：水性的或油性的悬浮液、溶液、乳液、糖浆以及酏剂。也可以将IFNγ拮抗剂配制成干燥产物，利用水或其它合适的媒介物在使用前重建。此类液体制剂可以含有添加剂，包括但不限于：助悬剂、乳化剂、非水性媒介物以及防腐剂。助悬剂包括但不限于：山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、以及氢化的可食用脂肪。乳化剂包括但不限于：卵磷脂、失水山梨糖醇单油酸酯、以及阿拉伯胶。可注射组合物通常基于可注射无菌盐水或磷酸盐缓冲的盐水或其它本领域已知的可注射载体。
本发明的IFNγ拮抗剂还可以被配制成用于非消化道给药，包括但不限于：通过注射或连续输注。通常地，根据本发明的IFNγ拮抗剂的连续输注可以如下实现：通过向中枢神经系统中植入或移植表达和分泌IFNγ拮抗剂的经修饰的细胞，包埋的细胞(encapsulated cell)，或通过经由渗透或机械泵的给药。
本发明的IFNγ拮抗剂还可以被配制成用于鼻内递送，包括但不限于：利用专门适用的装置，诸如靶向鼻腔的上三分之一的装置、光纤导镜(fiberoptic guided scopes)、或可以直接向鼻腔的顶部喷雾药剂的柔性的电鼻咽镜、电喷雾器、加压经鼻递送系统(pressurized olfactory delivery system)、鼻内插管法、鼻内滴剂和喷雾、或局部植入的延长的释放装置。通常鼻内递送方法，靶标IFNγ拮抗剂通过鼻粘膜直接到达脑，而使向血液的递送最小化，从而避免了通过肝脏和肾脏的代谢和清除，避免了与血浆蛋白结合，以及还避免了不期望的全身暴露和副作用。
本发明的IFNγ拮抗剂还可以被配制为长效制剂(depot preparation)，其可以通过植入或肌内、或静脉内、或脑室内、或鞘内或脑池内、或腹膜内、或皮下、或鼻内、或玻璃体内、或经巩膜、或硬膜外、或口服给药来给药。本发明的IFNγ拮抗剂还可以以缓释剂型或以缓释药物递送系统形式给药。另外的材料以及制剂的制作方法等在Remington′s Pharmaceutical Sciences,21stEdition,2005,University of the Sciences in Philadelphia,Lippincott Williams &Wilkins的第五部分陈述，在此将其并入作为参考。
本发明的IFNγ拮抗剂还可以作为非复制性病毒载体给药。
根据具体的实施方式，根据本发明的病毒载体包括重组腺伴随病毒(rAAV)载体以及重组慢病毒(rLV)载体，包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件。在具体的实施方式中，由星形胶质细胞分泌IFNγ拮抗剂。
在另外具体的实施方式中，根据本发明的病毒载体包括自身互补型腺伴随病毒载体(scAAV)，包括单链反向重复基因组，通过突变的末端分离位点分离，设计为允许DNA其本身折叠以及不需要DNA合成就可产生双链DNA(McCarty等人，2003,Gene Ther.,10,2112-2118)。ScAAV载体在一些组织中具有改善的转导效率以及更强的转基因表达，上述组织包括中枢神经系统、骨髓、以及肌肉。
在具体的实施方式中，根据本发明的病毒载体可以转导选自如下的细胞：神经细胞、小胶质细胞以及脑膜细胞，遍及脑和骨髓。
在具体的实施方式中，本发明提供病毒载体，其包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件；其中编码IFNγ拮抗剂的所述核酸序列包括：编码IFNγR1(SEQ ID NO：2)的核酸序列，以及编码寡聚化结构域(SEQ ID NO：19)的核酸序列。
在另外具体的实施方式中，本发明提供根据本发明的病毒载体，其中编码IFNγ拮抗剂的核酸序列编码小鼠IFNγR1-COMP(SEQ ID NO：15)或与SEQID NO：15具有至少80%同一性的其变体，或编码人IFNγR1-COMP(SEQ IDNO：27)或与SEQ ID NO：27具有至少80%同一性的其变体。
在另外具体的实施方式中，本发明提供根据本发明的病毒载体，其中编码IFNγ拮抗剂的核酸序列编码人IFNγR1-COMP，并且具有由SEQ ID NO：26构成的序列，或编码小鼠IFNγR1-COMP，并且具有由SEQ ID NO：14构成的序列。
在另外具体的实施方式中，本发明提供根据本发明的病毒载体，其包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件；其中编码IFNγ拮抗剂的所述核酸序列包括：编码DcR3(SEQ ID NO：13)的核酸序列，以及编码寡聚化结构域(SEQ ID NO：19)的核酸序列。
在另外具体的实施方式中，本发明提供根据本发明的病毒载体，其中编码IFNγ拮抗剂的核酸序列编码DcR3-COMP(SEQ ID NO：17)与SEQ ID NO：17具有至少80%同一性的其变体。
在另外具体的实施方式中，本发明提供根据本发明的病毒载体，其中编码IFNγ拮抗剂的核酸序列编码DcR3-COMP，并且具有由SEQ ID NO：16构成的序列。
在具体的方面，根据本发明的AAV载体包括AAV血清型9或AAV血清型6，例如根据本发明的AAV载体包括AAV血清型9或6的衣壳蛋白。在另外的方面，根据本发明的AAV载体包括AAV血清型6，具体来说，作为载体在肌内给药后转导运动神经元。在另外的方面，根据本发明的AAV载体包括AAV血清型9，具体来说，作为载体在静脉内给药后转导星形胶质细胞(最终遍及脑和骨髓)。
在具体的实施方式中，根据本发明的病毒载体能够促使IFNγ拮抗剂与寡聚化结构域一起表达，这样有利于IFNγ受体的寡聚化，从而有利于分泌的IFNγ拮抗剂的寡聚化。通常，此类病毒载体包括编码寡聚化结构域的核酸序列，所述寡聚化结构域允许显性负突变体成簇诸如如Holler等人，2000,上述，描述的免疫球蛋白的COMP域或Fc片段。在另外具体的实施方式中，根据本发明的病毒载体包括编码基本上与SEQ ID NO：19序列同源的寡聚化结构域的核酸序列，但因为一个或多个缺失、插入或取代，其具有至少一个不同于原始序列的氨基酸序列。例如，本发明包括编码SEQ ID NO：19的寡聚化结构域的变体，该变体与SEQ ID NO：19至少具有80%的同一性。
在另外具体的实施方式中，IFNγ拮抗剂是IFNγ抗体或IFNγ受体抗体，诸如IFNγ受体1和/或IFNγ受体2抗体或它们的片段。
在还另外的实施方式中，IFNγ拮抗剂是IFNγ抗体。
在还另外的实施方式中，IFNγ拮抗剂是病毒载体。
在另外具体的实施方式中，IFNγ拮抗剂是根据本发明的病毒载体。
在还另外具体的实施方式中，提供的病毒载体包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件，其中该编码IFNγ拮抗剂的核酸序列包括编码IFNγR1的核酸序列以及编码寡聚化结构域的核酸序列。根据另外另一具体的实施方式，所提供的病毒载体包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件，其中该编码IFNγ拮抗剂的核酸序列包括编码DcR3的核酸序列以及编码寡聚化结构域的核酸序列。
在还另外的实施方式中，提供根据发明的病毒载体，其中表达调控元件选自神经元或神经胶质特异性启动子(例如GfaABC1-D)。
在另一具体的实施方式中，提供根据本发明的病毒载体用作药剂。
在另一具体的实施方式中，提供根据本发明的病毒载体用于治疗运动神经元疾病或病症，诸如ALS病症。
在另一具体的实施方式中，提供的药物制剂包括至少一种根据本发明的病毒载体和可药用载体或赋形剂。
在另一具体的实施方式中，提供根据本发明的病毒载体用于制造治疗运动神经元病症的药物的用途。
在另一具体的实施方式中，根据本发明提供的用途，其中，rAAV载体是纯化自感染辅助腺病毒，从而在不存在针对该IFNγ拮抗剂的破坏性免疫应答的条件下表达IFNγ拮抗剂。可以如下纯化rAAV：通过碘克沙醇或氯化铯梯度；肝素或粘蛋白柱；通过在肝素柱上的高压液相色谱法(HPLC)，或离子交换HPLC，按照在下述文献中描述的步骤：Grieger等人，2006，Nat.Protoc.,1(3):1412-28；Towne等人，2008,Mol.Ther.16，1018-25；Kaludov等人，2002,Hum.Mol.Genet.,1；13(10):1235-43。用于大规模制备病毒载体的载体制备步骤可以通过但不限于如下来进行：利用生物反应器并且基于杆状病毒/昆虫细胞系统(Virag等人，2009,Hum.Gene Ther.,20(8),807-17)。
在另一具体的实施方式中，根据本发明提供的用途，其中慢病毒载体是经修饰以增加转基因表达的复制缺陷慢病毒载体，在293T细胞中生产，通过超速离心浓缩并重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS)/1%牛血清白蛋白(BSA)中(Hottinger等人，2000,J.Neurosci.,20:5587-93)。
在另一具体的实施方式中，根据本发明提供的用途，其中药物处于适于通过肌内、或静脉内、或脑室内、或鞘内或脑池内、或腹膜内、或皮下、或鼻内、或玻璃体内、或经巩膜、或硬膜外、或口服给药来递送病毒载体的形式，其中表达所述IFNγ拮抗剂。
在另一具体的实施方式中，药物适于通过单独或重复给药来递送。
在具体的方面，药物包括至少105个rAAV转导单位。
在另外的实施方式中，提供治疗需要的受试者运动神经元疾病或病症的方法，其包括在所述受试者中给药药物组合物，该药物组合物包括根据本发明的IFNγ拮抗剂。
在另一具体的实施方式中，提供IFNγ拮抗剂用于治疗运动神经元疾病或病症。
在另一具体的实施方式中，提供IFNγ抗体用于制备用来治疗运动神经元疾病或病症的药物制剂的用途。
在另一具体的实施方式中，提供向细胞递送编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的方法，该细胞选自：神经细胞、小胶质细胞和脑膜细胞，该方法包括：(a)提供包括病毒载体的病毒粒子，所述载体包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件；(b)使病毒粒子与所述细胞接触，由此病毒载体的转导使得所述核酸序列在经转导的细胞中表达以及所述核酸序列被所述细胞表达。
在另一具体的实施方式中，根据本发明提供的方法，其中所述核酸序列的表达出现在经转导的星形胶质细胞中，并且通过星形胶质细胞表达所述核酸序列从而降低运动神经元损伤。
在还另外具体的实施方式中，提供治疗需要的受试者运动神经元病症的方法，该方法包括在所述受试者中给药药物组合物，该药物组合物包括：(a)可药用赋形剂；以及(b)包括病毒载体的病毒粒子，所述病毒载体包括编码IFNγ拮抗剂的核酸序列，其可操作连接至至少一种能够调控所述核酸序列表达的表达调控元件。
在另一具体的实施方式中，根据本发明提供的病毒载体、用途或方法，其中IFNγ拮抗剂是IFNγ抗体或IFNγ受体抗体，诸如IFNγ受体1和/或IFNγ受体2抗体或它们的片段。
在另一具体的实施方式中，根据本发明提供的病毒载体、用途或方法，其中IFNγ拮抗剂是根据本发明的病毒载体。
在另外的方面中，本发明提供用于治疗需要的受试者运动神经元疾病或病症的方法，其包括植入和/或移植遗传工程的干细胞，其在所述受试者的中枢神经系统中分泌IFNγ拮抗剂。具体地，该方法包括描述在Suzuki等人，2008,Mol.Ther.,16(12):2002-10中的步骤。
在另外的方面中，本发明提供用来在来自受试者样品中对运动神经元疾病进行检测和/或预后评估的体外方法，该方法包括下述步骤：(a)检测来自所述受试者的样品中的IFNγ水平；以及(b)比较通过步骤(a)获得的IFNγ水平数据与罹患运动神经元疾病的受试者的IFNγ水平数据，其中IFNγ水平与所述受试者中运动神经元疾病状态相关。通常地，该样品可以是血液样品、脑脊液或泪液样品。IFNγ水平可以通过多种技术来测定，例如诸如ELISA的免疫测定法、免疫印迹、以及侧向层流免疫测定(lateral flow)。通常IFNγ水平超过约100pg/ml是表示受试者罹患运动神经元疾病或具有发展成运动神经元疾病的风险的指标，IFNγ水平低于约10pg/ml是表示受试者没有罹患运动神经元疾病或不太可能发展运动神经元疾病的指标。
在另外的方面，本发明提供根据本发明的体外方法，其中样品选自血清样品、脑脊液样品和泪液样品。考虑的方法是例如ELISA、RIA、EIA、质谱、微阵列分析、ELISPOT、流式细胞仪、基于珠的检测、PCR、RT-PCR、免疫PCR技术、或其它高灵敏度免疫检测方法，诸如放射免疫测定。通常，根据本发明的体外方法基于根据已知方法的ELISA检测。例如，利用针对IFNγ的一种类型的抗体包覆微量滴定板，然后封闭该滴定板，将样品或标准品上样到所述滴定板上，然后施用针对IFNγ的第二种类型的抗体，随后添加用于检测第二抗体具体类型与合适的标记物缀合的第三抗体，使用该标记物来定量IFNγ的量。
在另外的方面，本发明提供根据本发明的方法，其中受试者是哺乳动物，通常是人。根据还另外的方面，本发明提供根据本发明的方法，其中受试者是运动神经元疾病的动物模型，诸如大鼠或小鼠。
在另外的方面，本发明用于体外检测受试者运动神经元疾病的试剂盒，该试剂盒包括：(a)至少一个样品测试装置，其提供与样品中IFNγ浓度成比例的可读的信号；(b)电子监控器，其具有读取机构以读取在步骤(a)中获得的可读信号，并包含计算机机构以解释可读信号，并由此与来自之前的样品测试数据结合来确定所述受试者运动神经元状态。通常在根据本发明的体外方法和试剂盒具有通过IFNγ水平数据，在运动神经元病症的疾病发病和显示症状阶段检测运动神经元的退化的优势。
在具体的实施方式中，运动神经元病症是ALS病症。
给药方式
本发明的IFNγ拮抗剂可以通过任何方式给药，所述方式包括但不限于：静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、脑室内、脑池内和鞘内。在另外的方面，IFNγ拮抗剂可以通过鼻内、玻璃体内、经巩膜、硬膜外、以及口服给药来给药。本发明的IFNγ拮抗剂还可以以植入物的形式给药，其使得组合物可以缓慢释放，以及缓慢经控制静脉输注。
具体来说，根据本发明的IFNγ拮抗剂还可以在肌内空间递送，诸如后肢、前肢、背部以及面肌或躯干的肌肉或骨髓(脑实质内(intraparenchymal))、大池、膜内空间、鼻粘膜，从而避免全身递送并且提高它们的半寿期，它们改善与骨髓、脑干和脑系统的接触，或减少可能的副作用。
本发明所列举的实例不意在以任何方式限制本发明的范围。向个体给药的剂量，以单一或多剂量的形式，依据多种因素而变化，所述因素包括药物代谢动力学性质、患者状况以及特征(性别、年龄、体重、健康状况、尺寸)、症状的程度、同时进行的治疗、治疗的频率以及所期望的效果。
根据一个方面，根据本发明的治疗包括给药有效量的核酸分子，该核酸分子直接与IFNγ、或IFNγ受体1和/或IFNγ受体2、或IFNγ效应物LIGHT、LT-βR、HVEM、或DcR3高特异性和亲和性地结合，或使用编码IFNγ拮抗剂(诸如本文所述)的病毒载体。
组合(联用，combination)
根据本发明，IFNγ拮抗剂，诸如根据本发明的IFNγ抗体、IFNγ适体、IFNγ嵌合蛋白、或病毒载体，以及它们的药物制剂可以单独给药或与用于治疗运动神经元病症(诸如ALS病症)的联合药剂(例如利鲁唑)组合给药。
本发明包括给药根据本发明的IFNγ拮抗剂，诸如根据本发明的IFNγ抗体、IFNγ适体、IFNγ嵌合蛋白、或病毒载体、或它们的药物制剂，其中在给药其它用于治疗ALS病症的治疗方案或联合药剂(例如多种药疗方案)之前、同时或随后给药IFNγ拮抗剂和其药物制剂，以治疗有效量给药。与所述联合药剂同时给药的根据本发明的IFNγ拮抗剂或其药物制剂，可以以相同或不同的组合物(一种或多种)形式给药，通过相同或不同的途径(一种或多种)给药。
患者
在实施方式中，根据本发明的患者是罹患运动神经元病症的患者。
在具体的实施方式中，根据本发明的患者正在罹患ALS病症。
在具体的实施方式中，根据本发明的患者在罹患偶发和家族性的ALS、非典型ALS(锥体外系征候诸如震颤)、与ALS典型表现型相关的痴呆包括FTD-ALS(额颞痴呆ALS)，即认知缺损，以及其它运动神经元疾病诸如脊髓性萎缩(SMA)、肯尼迪病(或脊延髓肌萎缩症)、遗传性痉挛性截瘫、原发性侧索硬化、进行性肌萎缩。
本文中引用的文献在此通过参考以它们的整体并入。本发明不限于本文中描述的具体实施方式的范围，该具体实施方式仅意在说明本发明的单独的方面，功能等同的方法和组分在本发明的范围中。已经描述了本发明，以下陈述的实施例意在说明而不是限制。
实施例
下述简写分别指代下述定义：
H(小时)，i.c.v.(脑室内)，AAV(腺伴随病毒)，cDNA(互补DNA)，EDTA(乙二胺四乙酸)，GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白)，HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)，IU(国际单位)，PCR(聚合酶链式反应)，TU(转导单位)。
通常步骤和条件
在具体的方面中，本发明由给药根据本发明的IFNγ抑制剂或通过IFNγ拮抗剂抑制LIGHT-LT-βR途径构成，该IFNγ抑制诸如功能阻断性抗-IFNγ抗体或介导IFNγ拮抗剂的表达的非复制病毒载体，通过全身、肌内、鼻内、鞘内、脑池内或脑室内途径注射。
实施例1：IFNγ-诱导运动神经元死亡
为了支持IFNγ在ALS中的运动神经元死亡中的作用，进行了下述初步实验。
在健康的运动神经元中
在体外，在几乎所有Hb9::GFP运动神经元(从在运动神经元选择性Hb9启动子的调控下表达的绿色荧光蛋白(GFP)以促进运动神经元的跟踪的转基因小鼠中分离的胚胎运动神经元(E12.5))中表达IFNγ受体链1(IFNγR1)和链2(IFNγR2)，通过如下所述地接种抗IFNγR1或IFNγR2的抗体24小时后的免疫染色显示。
将运动神经元暴露于sLIGHT的最适度以下剂量，以及递增的IFNγ剂量，显示IFNγ实质上提高了LIGHT杀灭效果，该协同致死效果是特异性针对LIGHT的，因为IFNγ对于sFasL-诱导的死亡没有作用(图1B)。重组IFNγ以剂量依赖方式诱导了约50%的运动神经元的死亡(图1A)。IFNγ对于LIGHT-诱导的死亡的协同致死效果是限于运动神经元的，这是因为无论皮质神经元、海马神经元、感觉神经元或纹状体神经元(所有均表达全部IFNγ受体，IFNγR1和IFNγR2)均对于IFNγ与sLIGHT的组合(其对于运动神经元是致死的)不敏感。
IFNγ通过显著提高LIGHT的表达水平而作为神经调节细胞因子发挥作用。另外，观察到IFNγ能够导致新鲜分离的运动神经元(其不会通过LIGHT死亡)响应于sLIGHT或拮抗性抗-LT-βR抗体(功能性山羊的多克隆抗体(R&D systems))，如通过不用或用sLIGHT拮抗性抗-LT-βR抗体、IFNγ、或IFNγ与sLIGHT或抗-LT-βR抗体组合来处理运动神经元0、24或72h来显示。
总而言之，结果支持IFNγ的作用在于通过LIGHT-LTβR途径在运动神经元中特异性地引发胱天蛋白酶-9和-6依赖型死亡程序。
在SOD1G93A突变体运动神经元和星形胶质细胞中
来自过表达G93A SOD1突变体小鼠(小鼠发展了具有人ALS特征的运动神经元综合征，如Gurney等人，1994,Science,264,1772-1775所述)的运动神经元如前人所述进行培养(Raoul等人，2002,Neuron,35,1067-1083)。将它们对于IFNγ和LIGHT的敏感性与野生型运动神经元对于IFNγ和LIGHT的敏感性进行比较，显示SOD1G93A突变没有加重运动神经元对于IFNγ和LIGHT的应答性。
在SOD1G93A大鼠星形胶质细胞中检测IFNγ和LIGHT的表达水平，方法是通过针对总蛋白质提取物的免疫印迹，使用抗-IFNγ和抗-LIGHT抗体：相比较于野生型，SOD1G93A星形胶质细胞表达显著水平的IFNγ，但对于LIGHT的表达水平，在突变的和野生型星形胶质细胞中没有观察到不同。
在经充分表征的免疫纯化的野生型大鼠运动神经元和野生型或SOD1G93A大鼠星形胶质细胞单层共培养系统(Cassina等人，2008,J.Neurosci.,28,4115-4122)(检测了经纯化的大鼠运动神经元与小鼠运动神经元具有对于sLIGHT，拮抗性抗-LT-βR抗体(R&D systems)和IFNγ相同的响应率)中，通过利用如上所述的形态学标准(Raoul等人，1999,J.Cell.Biol.,147,1049-1062)计数相差明亮(phase-bright)的神经元，确认了运动神经元对于表达突变的SOD1星形胶质细胞的敏感性(vulnerability)：在共培养48h后，与在野生型星形胶质细胞上培养的运动神经元相比，在SOD1G93A星形胶质细胞上平铺的约50%的经纯化的野生型运动神经元死亡(图2)。
这些结果共同地支持了IFNγ-诱发的选择性运动神经元死亡与由突变体SOD1赋予的星形细胞的神经毒性相关。
实施例2：在ALS中的血清和脑脊液中IFNγ水平的升高
通过在不同的疾病阶段检测在SOD1G93A小鼠和ALS患者的血清和脊髓中的IFNγ水平，来检测根据本发明的用来检测和/或预后评估ALS和疾病进展的方法的效力。
SOD1G93A小鼠与年龄相符的野生型和SOD1WT小鼠的血清和腰脊髓中的IFNγ水平比较
进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)分析，以测定IFNγ水平，其中，指定基因型的小鼠在13周龄取血。将腰脊髓分离在含蛋白酶抑制剂的混合物的50mM Tris-Hcl pH 7.5，100mM NaCl(完全不含EDTA规格，Roche Diagnostic)中。然后在+4°C以10000X g离心脊髓均浆10分钟，并使用了Bradford检测(BioRad)测定了上清液中蛋白质浓度。然后利用IFNγELISA kit IIOptEIATM(BD Biosciences)，根据制造商的推荐步骤(BD Biosciences)测定了IFNγ水平。与年龄相符的野生型和SOD1WT小鼠相比，在SOD1G93A小鼠的血清和腰部脊髓中IFNγ水平显著增加(图3A和B)。
不同的疾病阶段
在野生型和SOD1G93A小鼠的疾病的过程中通过对来自腰脊髓的总蛋白质提取物的定量分析和免疫组织学分析来监测IFNγ表达。在症状发生前的阶段，SOD1G93A的脊髓中的总IFNγ水平几乎不可检出，，且与在非转基因的小鼠中观察到的结果无法区分，而在疾病发病的早期，与野生型同窝出生的对照小鼠相比IFNγ水平明显升高，并且在有症状的阶段进一步增加，(图4)，并且显示IFNγ特异性地由星形胶质细胞表达。在野生型和症状发生前的突变的SOD1小鼠两者的脊髓中均无法检测IFNγ，但在发病早期和有症状阶段，通过胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Millipore)来鉴别能够容易地在星形胶质细胞中检测到，但在利用离子钙结合适体分子1(Iba1)抗体(Wako Chem Ind)鉴别的小胶质细胞中未检测到。使用非磷酸化的神经丝抗体(SMI32)和VAChT抗体(Steinberger Monoclonals)鉴别，在发病早期和有症状阶段为IFNγ阳性的其它细胞类型仅有运动神经元。
与在疾病发病的早期和有症状阶段的总IFNγ表达增加和其在星形细胞的定位一致，对于IFNγ具有免疫反应性的运动神经元的百分比在13和16周龄显著增加，与10.5周龄大的SOD1G93A小鼠和年龄相符的野生型小鼠相比。在有症状的(52周龄)SOD1G85R转基因小鼠(发展了具有人ALS特征的运动神经元综合征的小鼠，如Bruijn等人，1997,Neuron,18,327-338所描述的)中观察到了IFNγ的相似的增加，而过表达非致病性的SOD1WT的小鼠(Reaume等人，1996，Nat.Genet.,13,43-47)在运动神经元和神经胶质细胞中均未显示出IFNγ的任何增加，并且与年龄相符的非转基因小鼠相比是无法区分的。
总体来说，这些结果显示突变的星形胶质细胞和运动神经元的IFNγ表达发生在发病和有症状的阶段，说明IFNγ有可能不止在发病时促进运动神经元疾病的发展。
在人ALS中IFNγ水平的增加
通过Western Blot分析检测在偶发性ALS患者和非ALS对照的死后脊髓样品中IFNγ的表达水平。使用“Image Processing and Analysis in Java”(ImageJ)软件中的分析的密度分析显示与对照相比，在人ALS的脊髓中IFNγ水平升高。另外，如下所述的ALS脊髓切片中的IFNγ、LT-βR和LIGHT的表达模式的免疫组织学分析显示对于在ALS患者中的腹侧角(ventral horn)运动神经元以及在大量周围的神经胶质细胞中的IFNγ显著染色，但在对照组织中没有明显染色。与在小鼠中的结果一致，LT-βR和LIGHT两者均主要在ALS和非ALS组织的运动神经元中表达。在偶发性ALS脊髓中的观察结果提供了IFNγ和其效应物途径(effector pathway)与该疾病的牵连的较强的证据。通过Western blot、ELISA、细胞计量术和定量PCR以及侧向层流免疫测定对在来自偶发性和家族性ALS患者两者的脑脊液、血液、脊髓和泪液样品中的IFNγ水平进行了研究。
针对每个患者，将血液样品收集在：用于血清的干燥管、用于流式细胞术的EDTA管、以及用于血浆和将在氮液体定量PCR中冷冻的PBMC分离的具有柠檬酸钠的BD
Figure BDA00001901477800211
CPTTM细胞制备管。立即将CSF样品在800r.p.m离心5分钟。利用流式细胞术分析细胞沉淀。将CSF的液相储存在-80°C，直到进行细胞因子检测。通过细胞因子珠阵列(CBA,BD bioscience)检测血清和CSF样品中的IFNγ水平。使用具有下述标志物的多色流式细胞术对全血样品进行表型分析：IFNγ、NKp46、CD3、CD4、CD8、CD56、CD69、CD11c和CD14。
细胞培养物
按照如(Arce等人，1999,J.Neurosci.Res.,55,119-12)所述并由Raoul等人，2002(同上文)改进的方法使用碘克沙醇密度梯度离心来分离来自CD1、Hb9::GFP、或SOD1G93A胚胎的E12.5脊髓的运动神经元，。在添加的Neurobasal培养基TM(Invitrogen)中存在(或不存在，当提及时)神经营养因子的混合物(0.1ng/ml神经胶质来源的神经营养因子(GDNF)、1ng/ml脑来源的神经营养因子(BDNF)、以及10ng/ml睫状神经营养因子(CNTF))的条件下，将运动神经元铺在经多鸟氨酸/层粘连蛋白处理的孔上。当需要时，在铺板之前，用标明的表达构建体(如在Raoul等人，2002(同上)中所述)对运动神经元进行电穿孔。使用Ig192小鼠单克隆抗-p75抗体对来自E14大鼠胚胎的运动神经元进行免疫纯化，如Cassina等人，2008，上述所述，在添加的Neurobasal培养基中在GDNF(0.1ng/ml)的存在下，进行培养。按照Zala等人，2005,Neurobiol.Dis.,20,785-798和Raoul等人，2002，上述中的描述从E17.5胚胎中分离皮质神经元、海马神经元、背根神经节神经元以及纹状体神经元。将皮质神经元、海马神经元、感觉神经元或纹状体神经元铺在经多鸟氨酸/层粘连蛋白处理的孔上，并在添加了1mM丙酮酸钠、2%B27添加剂(Invitrogen)的Neurobasal培养基中培养，除了感觉神经元之外，感觉神经元保持在如下培养基中：与用于运动神经元的相同的添加的Neurobasal培养基，但存在100ng/ml神经生长因子(NGF)代替GDNF、BDNF和CNTF。除非另外指出，在从CD1小鼠上分离的神经元上进行细胞存活实验。以1500个细胞/cm2的密度接种所有神经元类型，并在光学或荧光显微镜下直接对存活的神经元进行计数。在添加有10%胎牛血清的Dulbecco Modified Eagle培养基(DMEM,Invitrogen)中保持Cos-7细胞。针对FLAG标记的LT-βR(表达载体LT-bR ou TNFRSF3：Genbank登录号NM_002342)和HA标记的LIGHT(表达载体LIGHT ou TNFSF14：Genbank登录号AF036581)的表达分析，使用Fugene 6按照制造商的说明(Roche diagnostics)进行细胞转染。利用编码人LIGHT和人LT-bR(Aebischer等人，2010,Cell Death Differ.,Nov12)的pcDNA3.1哺乳动物表达载体转染的Cos-7用作针对LIGHT和LT-bR的检测的免疫印迹的阳性对照。
动物
所有的动物实验均依据欧共体和国家针对实施动物的管理和使用的文件进行。HB9::GFP小鼠(Wichterley等人，2002,Cell,110,385-397)保持在CD1背景下。SOD1G93A小鼠保持在混合的B6SJL背景(Gurney等人，1994,上述)下。SOD1G85R(Bruijn等人，1997,上述)和SOD1WT(Reaume等人，1996，上述)小鼠保持于C57BL/6背景(Bruijn等人，1997,Annu.Rev.Neurosci.,27,723-749)。Sprague-Dawley SOD1G93AL26H大鼠如Cassina等人，2008,上述所述保持。
用于存活检测的蛋白质和化学物质
用于聚集经标记的sFasL、Fas-Fc、TNFR1-Fc、LT-βR-Fc的可溶的人重组LIGHT和FasL、增强子抗体购自Alexis Biochemicals。可溶的小鼠重组LIGHT、功能性山羊多克隆抗-LT-βR抗-HVEM抗体购自R&D systems。可溶的小鼠重组IFNγ(来源1)购自Calbiochem。可溶的小鼠重组IFNγ(来源2)以及可溶的重组大鼠IFNγ购自PBL Biomedical laboratories。中和性山羊多克隆抗-IFNγ抗体(I5027)购自Sigma-Aldrich。
免疫细胞化学
从E12.5HB9::GFP胚胎(Wichterley等人，2002,上述)中纯化Hb9::GFP运动神经元，并以5000个细胞/cm2的密度接种在经多鸟氨酸/层粘连蛋白处理的玻璃盖玻片上，并在上述的添加的Neurobasal培养基中培养。在指定的时间处理神经元以进行免疫细胞化学，如Raoul等人，2005,Nat.Med.,11,423-428所述。第一抗体为：抗-LT-βR(sc-8376,Santa Cruz Biotechnology,1:50)、抗-HVEM(AF2516,R&D systems,1:50)、抗-LIGHT(sc-28880,SantaCruz Biotechnology,1:50)、抗-IFNγR1(559911,BD Biosciences,1:250)、抗-IFNγR2(ab31606,Abcam,1:2000)。Alexa Fluor 555-结合的驴抗-山羊、抗-兔子或抗-小鼠用作第二抗体(Invitrogen)。使用Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜(用Carl Zeiss(Jena,Germany)生产)照相。
Western Blot
将神经元以20000个细胞/cm2铺在含有相应的补足的Neurobasal培养基(参见上述)的6cm直径盘中。针对神经元、星形胶质细胞(重复样品)和解剖的腰脊髓，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Westernblotting，利用在Raoul等人，2005,上述中所描述的步骤。第一抗体为抗-LT-βR(sc-8377,Santa Cruz Biotechnology,1:500)、抗-LIGHT(sc-28880,SantaCruz Biotechnology,1:500)、抗-IFNγ(sc-52557,Santa Cruz Biotechnology,1:500)、抗-IFNγR1(559911,BD Biosciences,1:500)、抗-IFNγR2(ab31606,Abcam,1:2000)、抗-α-微管蛋白(B-5-1-2,Sigma-Aldrich,1:20,000)、抗-肌动蛋白(AC-40,Sigma-Aldrich,1:20,000)。利用缀合辣根过氧化物酶(HRP)的第二抗体检测蛋白质，并且利用化学发光HRP底物(Millipore)使其可视化。在指明之处，使用NIH ImageJ软件对免疫印迹图像进行定量并相对于α-微管蛋白或肌动蛋白水平进行标准化。
运动神经元-星形胶质细胞共培养物
由P1-P2野生型和SOD1G93A大鼠的脊髓来制备原代星形胶质细胞培养物，如上所述(Cassina等人，2008,上述)。以2x 104个细胞/cm2的密度平铺星形胶质细胞，并保持在添加了10%胎牛血清、HEPES(3.6g/l)、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM中。星形胶质细胞单层是98%纯的(通过GFAP免疫反应性测定)，且不含OX42-阳性小胶质细胞。将如上所述纯化的野生型运动神经元以300个细胞/cm2的密度平铺在不同的基因型的大鼠星形胶质细胞单层上，并保持在添加有2%马血清、0.63mg/ml碳酸氢盐、5μg/ml胰岛素、0.1mg/ml伴清蛋白、0.1mM腐胺、30nM亚硒酸钠、20nM孕酮、20mM葡萄糖、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的L15培养基(Invitrogen)中保持48h。
免疫组织化学
通过Raoul等人，2006,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103,6007-6012所述的方法进行腰脊髓切片的免疫染色。使用了下述抗体：抗-IFNγ(I5027,Sigma-Aldrich,1:100)、抗-非磷酸化神经丝(SMI32,Sternberger Monoclonals,1:500)、抗-GFAP(MAB360,Millipore,1:500)、抗-离子钙结合适体分子1(Iba1,Wako Chemical Industries,1:100)、抗-LT-βR(sc-8376,Santa Cruz Biotechnology,1:50)、抗-LIGHT(sc-28880,Santa Cruz Biotechnology,1:50)以及抗-VAChT(V5387,Sigma-Aldrich,1:2500)。利用缀合荧光染料的第二抗体(Alexa Fluor488或555)或过氧化物酶/DAB检测系统，按照制造商的说明(Dako)对蛋白质进行了检测。
统计分析
利用未配对双尾t检验(unpaired two-tailed t test)或在指出时利用变量的单因素分析(方差分析)，然后通过使用GraphPad Instat软件的Tukey-Kramer‘s事后检验确定统计显著性。在P<0.05的水平接受显著性。
综上，上述结果显示表达ALS-关联的突变体SOD1的星形胶质细胞通过促炎症反应细胞因子IFNγ(其激活LIGHT-LT-βR死亡途径)介导运动神经元的选择性死亡。
实施例3：通过拮抗IFNγ-诱导的LIGHT-引发的死亡途径从星形胶质细 胞的神经毒性中援救
在体外和体内使用拮抗性抗体通过对IFNγ抑制的治疗作用来检测根据本发明的方法的效力。按照在实施例2中描述的行为分析和组织病理学分析确定疾病进展和寿命。
利用中和性抗-IFNγ抗体援救经纯化的运动神经元
首先在体外在培养的运动神经元中评估抗-IFNγ抗体保护运动神经元免遭由重组小鼠IFNγ诱导的死亡的潜力(图5)。如实施例1所述，重组IFNγ、或sLIGHT、或拮抗的抗-LT-βR抗体诱导约50%的运动神经元的死亡。中和性山羊多克隆抗-IFNγ抗体(I5027,Sigma-Alrich)有效地阻断了IFNγ-或LIGHT-诱导的培养的运动神经元的死亡。IFNγ与不相关的大鼠IgG的组合不会使运动神经元从死亡中获救。单独的抗-IFNγ抗体和不相关的大鼠IgG用作对照。
然后使运动神经元与野生型和SOD1G93A大鼠星形胶质细胞共培养。中和性抗-IFNγ抗体(I5027,Sigma-Alrich)对于IFNγ活性的抑制没有显著影响在野生型星形胶质细胞共培养物中的运动神经元的存活，但是显著地阻止了由SOD1G93A突变体星形胶质细胞诱导的运动神经元死亡，其程度高于阻止LIGHT-LT-βR与LT-βR-Fc诱饵(decoy)(Alexis Biochemicals)相互作用(图2)。
因此，通过对抗IFNγ-诱导的LIGHT-引发的死亡途径从表达ALS-关联的突变的SOD1的星形胶质细胞的IFNγ-介导的神经毒性中援救了经纯化的运动神经元。这些结果支持了根据本发明的IFNγ拮抗剂在治疗选择性运动神经元死亡(诸如ALS病状)中的有益用途。
在小鼠中的功能阻断性抗-IFNγ抗体的脑脊液注射
对90天龄小鼠(早期发病，在B6SJL-TgN(SOD 1-G93A)1Gur转基因小鼠(G1H系)中)(Gurney等人，2004,Science 17,1772-1775)进行麻醉，将永久性30号不锈钢输注导管(Alzet Brain Infusion Kit 3；Durect Corp.)立体定位放置在前囟点的0.3mm前、头骨表面的1mm侧和2.6mm下。使用胶水和牙粘固粉将导管固定在头骨上。通过聚乙烯管将脑室内插管(cannulae)与Alzet渗透泵(型号2004)连接。Alzet渗透泵中填充有200-300μg/ml特异性中和小鼠IFNγ的大鼠单克隆拮抗性抗-IFNγ抗体(克隆R4-6A2)(Havell,1986，J.Interferon.Res.,6，489-497)或不相关大鼠单克隆抗体或与功能阻断抗体(IgG1)相同的同种型。将alzet泵植入到小鼠背部的中肩部(midscapular)区域的皮下袋中。以0.25μl/h的速率连续地输注功能阻断性抗体或不相关对照抗体溶液4周。
在向13周龄小鼠的侧脑室中植入了输注R4-6A2IgG的插管三周后，在脑、脑干和脊髓的广泛的区域上观察到了较强的免疫反应染色。在纹状体、皮层、外囊、丘脑、以及海马、面神经核、颈部脊髓、胸脊髓的和腰脊髓中发现了IgG染色。中和性抗-IFNγ可以高效地被递送至脑和脊髓最高达3周。
行为测试和组织病理学和生化学分析
通过之前在Raoul等人，2005,(同上)中所述的行为和组织病理学分析来确定向SOD1-G93A小鼠的脑脊液中递送拮抗性抗-IFNγ抗体对于疾病进展和寿命的治疗效果，所述测试诸如游泳槽和旋转测试、体重减轻、在甲酚紫染色的脊髓切片中对存活的运动神经元计数、运动皮质异常、计数四氧化锇处理的腹根中的运动纤维。每周足迹分析每周进行，通过前爪和后爪之间的距离(以mm计)来表示，显示抗-IFNγ免疫疗法显著地延迟了SOD1G93A小鼠的运动退化。使用不相关的大鼠IgG作为对照。如预料的，在疾病的早期发病阶段，抗-IFNγ抗体的治疗效果是暂时的，在植入后4周的组织中，没有再检测到在该实验设置中使用的抗体。结果支持了IFNγ参与了致病过程，并显示了在运动神经元疾病中使用IFNγ功能阻断分子的治疗潜力。
当运动退化被延迟时，进行使用合适的标志物在大脑和脊髓中的进行免疫组织化学和免疫印迹，以及生化分析，以确认神经保护作用并进一步表征哪些细胞和分子事件与保护效果相关。具体地，通过免疫组织化学方法，对星形胶质细胞和小胶质细胞激活的程度详细地定性和定量分析(Raoul等人，2005,上述；Boillée等人，2006，上述)。定量地，基于背柱中的皮质脊髓束(CST)和脊髓的背外侧的CST的退化来研究上运动神经元的存活(Yamanaka等人，2006,上述)。
功能阻断抗-IFNγ抗体的脑室内输注
将30号不锈钢输注导管(ABrain Infusion Kit 3；Durect Corp.,CA,USA)立体定位植入到13周龄小鼠的脑室的侧面(相对于前囟点0.3mm前和1mm侧；头骨表面的2.5mm下)。使用胶水和牙粘固粉将导管固定在头骨上，并将Alzet渗透泵(型号2004)植入到小鼠背部的中肩部区域的皮下袋中。在PBS中以300μg/ml的浓度稀释大鼠单克隆拮抗性抗-IFNγ抗体(杂交瘤产物R4-6A2)或不相关的大鼠IgG1单克隆抗体，并以0.25μl/hr的连续速率经心室内输注。
足迹分析
每周对小鼠进行足迹分析。在前爪和后爪涂上两种不同颜色的水基无毒颜料。将小鼠放置在纸片上并使其步行通过一隧道。扫描足迹图案，利用NIH ImageJ软件计算前爪和后爪印迹之间的距离。针对每组爪印进行4次测量。
实施例4：在SOD1突变体ALS小鼠模型中的IFNγ抑制剂的AAV血清 型9或6-介导的递送
通过对运动神经元特异的IFNγ-和LIGHT-LT-βR-依赖死亡途径的抑制的治疗效果来测试根据本发明的方法和组合物的效力，方式是借助通过大脑内、脑脊髓内(intracerebrospinal)、肌内、或全身注射非复制腺伴随病毒(AAV)或自互补AAV载体，在SOD1突变体ALS小鼠模型中阻断IFNγ或IFNγ效应物LIGHT对运动神经元退化的影响。通过实施例2中描述的行为和组织病理学分析来确定IFNγ/LIGHT抑制剂的AAV-介导的递送对于疾病进展和寿命的治疗效益。
病毒构建物和生产
制造下述病毒构建物以驱使在星形胶质细胞中在遍在表达的磷酸甘油激酶(PGK1)(SEQ ID NO：20)或GfaABC1-D(SEQ ID NO：21)、或巨细胞病毒(SEQ ID NO：23)、或嵌合CMV-鸡β-肌动蛋白(SEQ ID NO：22)启动子(如Raoul等人，2005,上述)(图6)的控制下表达IFNγR1-COMP(核酸SEQ ID NO：14，氨基酸序列SEQ ID NO：15)、DcR3-COMP(核酸SEQ ID NO：16，氨基酸序列SEQ ID NO：17)、以及软骨低聚基质蛋白(COMP)的卷曲-卷曲域(核酸SEQ ID NO：18，氨基酸序列SEQ ID NO：19)(阴性对照)。使用IFNγR1-COMP来抑制IFNγ/IFNγR相互作用，DcR3-COMP作为FasL和LIGHT两者的诱饵，用于抑制IFNγ-LIGHT-LT-βR和Fas途径两者。此外，Fas-COMP，由Fas的细胞外部分与COMP融合而成，也用于抑制Fas/FasL，且通过删除Fas的细胞外部分的约80%(称为分泌的COMP，COMP)来制造阴性对照。上述COMP包括连接肽(SEQ ID NO：24的PQPQPKPQPKPEPE)、软骨低聚基质蛋白(COMP)的五聚体域(pentamerisation domain)(褐家鼠，Genbank登录号NP_036966和位于C末端部分的血凝素序列(HA标签序列)，(SEQ ID NO：25的YPYDVPDYA)，用来形成基于该嵌合模型的显性负突变受体途径(dominant negative receptor approach)，从而有效地在体内抑制LIGHT/LT-βR和IFNγ-IFNγR相互作用。
功能性AAV载体的制造
根据标准方法，通过在稳定地表达激活rep和cap启动子所需的E1基因(Grimm等人，2003,Mol.Ther.,7,839-850)的293AAV细胞工厂上瞬时共转染穿梭和pDF6辅助质粒两者来生产重组AAV载体血清型6，并通过在肝素亲和柱上的液相色谱(LC)(Towne等人，2008,上述)来获得浓缩的病毒悬浮液。
为了生产AAV9载体，将编码血清型6VP1、VP2和VP3的cap-6序列置换为cap-9序列以产生pDF9辅助质粒(Cearley等人，2008,Mol.Ther.,19,1359-1368；Bish等人，2008,Mol.Ther.,16，1953-1959)。通过利用流式细胞仪检测293T和HeLa细胞系上来自荧光EGFP表达框的表达来检测AAV9生产的功能性。通过实时PCR对上述病毒悬浮液测定包装的效率(Towne等人，2008,上述)。
通过测序来检查构建物。在体外通过免疫沉淀分析，对通过星形胶质细胞高效地分泌IFNγR1-COMP、DcR3-COMP、Fas-COMP、以及COMP的效率，以及它们与各自配体的特异性相互作用进行了评价。用编码IFNγR1-COMP、DcR3-COMP、Fas-COMP、或COMP的载体转导胶质瘤细胞系并收集条件化培养基。向不同的条件化培养基中添加重组可溶LIGHT和IFNγ。使用抗-血凝素(HA)标签抗体来进行配体-受体复合物的免疫沉淀，因为这些构建物在它们的C端包含HA标签，通过SDS-PAGE分析免疫复合物，然后利用针对LIGHT、IFNγR1和IFNγ的抗体的免疫印迹分析免疫复合物。免疫沉淀结果显示IFNγR1-、DcR3-以及Fas-COMP嵌合受体与它们相应的重组配体有效地相互作用，与显性负效应一致。
IFNγR1-COMP或DcR3-COMP从LIGHT/IFNγ-诱导的死亡中援救运动神经元
在如实施例2所述的分离的运动神经元培养系统中评价显性负突变在抑制Fas和LIGHT/IFNγ-诱导的死亡方面的功能。培养从E12.5CD1小鼠的脊髓分离的胚胎的运动神经元6h，然后利用50TU/ml指明的AAV-IFNγR1-COMP、AAV-DcR3-COMP、AAV-Fas-COMP或AAV-COMP病毒载体感染所述运动神经元。在温育6h后替换培养基，随后，利用有效剂量的sFasL(50ng/ml)、sLight(50ng/ml)或IFNγ(250ng/ml)处理运动神经元48h(当指出时)。48小时后，通过运动神经元的直接计数来确定存活(图7)。如所预期的，Fas-COMP高效地从sFasL-诱导的死亡中援救了运动神经元，但未对运动神经元带来任何针对LIGHT杀灭作用的保护效果，而DcR3-COMP从sFasL-和sLIGHT-诱导的死亡中援救了运动神经元。另一方面，IFNγ-引发的死亡被IFNγR1-COMP阻断。阴性对照COMP(图7上)未干扰由任一配体或细胞因子导致的死亡。
动物和病毒载体给药
如上所述的编码IFNγR1-COMP和COMP对照并使用PGK1启动子的AAV6，通过肌内、脑脊髓内或全身注射递送到SOD1突变体小鼠中。在后肢、前肢、背部和面肌向小鼠注射(2.5105-106TU)以确保治疗信息沿着脊髓和脑干的最佳递送。我们观察到AAV6肌内注射导致运动神经元的约30%的转导(Duplan等人，2010，J.Neurosci.30,785-796)以及全身的AAV6注射导致约5%运动神经元转导(Towne等人，2008,Mol.Ther.16，1018-1025)。将编码IFNγR1-COMP、DcR3-COMP、Fas-COMP或COMP对照并利用CMV启动子或GfaABC1-D启动子的AAV9通过血管内(尾部静脉中)以及肌肉注射递送，初始剂量为4x1012基因组拷贝。观察到全身的AAV9给药导致运动神经元的70%转导(Wang等人，2010,Mol.Ther.,28Sept 2010)。在运动障碍出现之前(未出现症状阶段，40天)，以及在疾病发病时(90天)进行AAV给药，疾病发病时是更为迫切的状况，但是更为接近临床实际。
通过实施例2中描述的免疫组织学，来监测在全身和肌内注射编码报告EGFP-表达框的AAV6或9载体后获得的感染情况，从而能够确定哪种细胞类型表达转基因，特别是在脊髓和运动皮质的水平，使用上述针对运动神经元的特异性标志物(VAChT)以及针对星状胶质细胞/小胶质细胞的特异性标志物(GFAP，Iba1)。关于皮质运动神经元，将利用非磷酸化的神经丝(SMI32)染色、它们在皮质的V层中的位置以及它们的大小来对它们进行鉴定。还将研究肝、心、脾以及骨骼肌的EGFP表达。
实施例5：在LIGHT-缺失的SOD1 G93A 小鼠中的疾病进展的延迟和寿命 的延长
通过在SOD1突变体ALS小鼠模型中删除LIGHT来评价抑制运动神经元特异性IFNγ-诱导的LIGHT-LT-βR-依赖的死亡途径的治疗效果。通过实施例2中描述的行为和组织病理学分析来确定LIGHT除去对于疾病进展和寿命的治疗效益。
SOD1G93A小鼠的LIGHT的遗传去除延迟疾病进展
为了评价在ALS发病中的IFNγ-LIGHT-LT-βR途径的功能性参与，通过杂交育种(SOD1G93A/LIGHT-/-)在过表达SOD1G93A的小鼠中遗传去除LIGHT。LIGHT缺失小鼠是能够生存并能够繁殖，且不具有行动异常(Scheu等人，2002,J.Exp.Med.,195,1613-1624)。如Boillee等人，2006,Science,312,1389-1392所述，通过体重曲线的峰来评价SOD1G93A/LIGHT+/+、SOD1G93A/LIGHT+/-、和SOD1G93A/LIGHT-/-小鼠发病的累积可能性。在SOD1G93A/LIGHT+/+和SOD1G93A/LIGHT+/-小鼠之间没有观察到显著的不同。然后在LIGHT+/+、LIGHT-/-、SOD1G93A/LIGHT+/+、和SOD1G93A/LIGHT-/-小鼠的组(cohort)中每周通过测定小鼠的游泳表现(其依赖于后肢踢动的频率和强度)(Raoul等人，2005,Nat.Med.,11,423-428)对疾病进展进行评价。LIGHT缺失明显地延迟了ALS小鼠中运动功能的衰退(图8A)。SOD1G93A/LIGHT+/+和SOD1G93A/LIGHT-/-小鼠的Kaplan-Meier存活曲线还显示LIGHT缺失延长了SOD1G93A突变体小鼠的寿命17.9天。
SOD1G93A小鼠中的LIGHT遗传去除对抗运动神经元死亡
考察了LIGHT缺失SOD1小鼠的运动行为改善与运动神经元存活增加的可能联系。如实施例2所述的在VAChT-免疫染色的切片上对存活的运动神经元的数量进行定量，该切片是从不同基因型的120天龄小鼠脊髓的腰区获得的。在这个阶段，可以在SOD1G93A/LIGHT+/+小鼠中观察到腰部的运动神经元的显著的损失，而在SOD1G93A/LIGHT-/-小鼠中观察到存活的运动神经元的数量的显著增加。
LIGHT和SOD1G93A突变体小鼠的分析
如上所述确定LIGHT-/-和SOD1G93A小鼠的基因型(Duplan等人，2010,J.Neurosci.,30,785-796；Scheu等人，2002,上述)。将LIGHT-/-雄性小鼠与SOD1G93A雌性小鼠杂交来获得SOD1G93A/LIGHT+/-小鼠。然后使SOD1G93A/LIGHT+/-雄性小鼠与LIGHT+/-雌性小鼠回交。在双杂交之后，仅选择LIGHT+/+、LIGHT-/-、SOD1G93A/LIGHT+/+和SOD1G93A/LIGHT-/-小鼠用来进行行为分析。为了确定疾病的发病，从50天起每两天测量体重，并确定且何时体重曲线达到平台(Yamanaka等人，2008,Nat.Neurosci.,11,251-253)。为了分析运动衰退的进展，在50日龄时进行游泳槽测试，并且如前人所述测定游泳速度(Raoul等人，2005,上述)。出于统计的目的，将最大游泳等待时间设定为20秒。死亡(mortality)定义为在背朝下放置小鼠之后小鼠不能在30秒内使其自身处于正确位置的时间点。所有的行为研究均以盲检方式进行。
统计分析
如实施例2所述确定统计显著性。利用双因素(组x时间)重复测量方差分析，然后进行Newman-Keuls′s事后检验来进行游泳表现的统计分析。使用log-rank检测来计算在不同小鼠同龄组的发病和存活方面的统计差异。使用软件(GraphPad Software,Inc.,USA)绘制Kaplan-Meier存活曲线。使用GraphPad PrismTM和StatSoftTM统计软件(StatSoft,Inc.,USA)来进行计算。在P<0.05的水平接受显著性。
总而言之，结果显示在ALS小鼠中，LIGHT促进疾病进展，但不促进疾病的发病，在SOD1小鼠LIGHT缺失对抗运动神经元退化，并且显著地延迟了进行性运动缺陷以及死亡，强调了在ALS发病机制中的IFNγ-LIGHT-LT-βR途径的功能性参与。

Claims (29)

1.IFNγ拮抗剂在用于制造治疗运动神经元疾病或病症的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述IFNγ拮抗剂选自IFNγ抗体、IFNγ抗体片段、IFNγ适体、IFNγ嵌合蛋白以及病毒载体。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述IFNγ拮抗剂是IFNγ抗体。
4.根据权利要求1或2的用途，其中所述IFNγ拮抗剂是病毒载体。
5.治疗需要治疗的受试者中运动神经元疾病或病症的方法，该方法包括向所述受试者给药包括IFNγ拮抗剂的药物组合物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述IFNγ拮抗剂选自：IFNγ抗体、IFNγ适体、IFNγ嵌合蛋白以及病毒载体。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述IFNγ拮抗剂是IFNγ抗体。
8.根据权利要求5或6的方法，其中所述IFNγ拮抗剂是病毒载体。
9.向细胞递送编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的方法，所述细胞选自神经细胞、小胶质细胞和脑膜细胞，该方法包括：
(a)提供包括病毒载体的病毒粒子，所述载体包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件；
(b)使病毒粒子与所述细胞接触，由此病毒载体的转导使得所述核酸序列在经转导的细胞中表达以及所述核酸序列被所述细胞表达。
10.病毒载体，其包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件，其中编码IFNγ拮抗剂的所述核酸序列包括：
编码IFNγR1(SEQ ID NO：2)的核酸序列，以及编码寡聚化结构域(SEQID NO：19)或与SEQ ID NO：19至少80%相同的寡聚化结构域的变体的核酸序列。
11.根据权利要求10的病毒载体，其中编码IFNγ拮抗剂的所述核酸序列编码IFNγR1-COMP(SEQ ID NO：27)或与SEQ ID NO：27至少80%相同的IFNγR1-COMP的变体。
12.根据权利要求10或11的病毒载体，其中编码IFNγ拮抗剂的所述核酸序列编码IFNγR1-COMP，并具有由SEQ ID NO：26构成的序列。
13.病毒载体，其包括至少一种可操作连接至编码IFNγ拮抗剂的核酸序列的表达调控元件，其中编码IFNγ拮抗剂的所述核酸序列包括：
编码DcR3(SEQ ID NO：13)的核酸序列，以及编码寡聚化结构域(SEQ IDNO：19)或与SEQ ID NO：19至少80%相同的寡聚化结构域的变体的核酸序列。
14.根据权利要求13的病毒载体，其中编码IFNγ拮抗剂的所述核酸序列编码DcR3-COMP(SEQ ID NO：17)或与SEQ ID NO：17至少80%相同的DcR3-COMP的变体。
15.根据权利要求13或14的病毒载体，其中编码IFNγ拮抗剂的所述核酸序列编码DcR3-COMP，并具有由SEQ ID NO：16构成的序列。
16.根据权利要求10~15中任一项的病毒载体，其中所述病毒载体是包括AAV血清型9或6的衣壳蛋白的rAAV。
17.根据权利要求10~16中任一项的病毒载体，其中所述表达调控元件是遍在的启动子、神经元特异性启动子或神经胶质特异性启动子。
18.根据权利要求10~16中任一项的病毒载体，其中所述表达调控元件是遍在的启动子、神经元特异性启动子或神经胶质特异性启动子，其选自：磷酸甘油激酶(PGK1)(SEQ ID NO：20)或GfaABC1-D(SEQ ID NO：21)、或巨细胞病毒(SEQ ID NO：23)、或嵌合CMV-鸡β-肌动蛋白(SEQ ID NO：22)。
19.根据权利要求10~18中任一项的病毒载体，其用作药物。
20.根据权利要求10~18中任一项的病毒载体，其用于治疗运动神经元疾病或病症。
21.药物制剂，其包括至少一种根据权利要求10~18中任一项的病毒载体以及可药用载体或赋形剂。
22.根据权利要求1、2或4中任一项的用途，其中所述IFNγ拮抗剂是根据权利要求10~18中任一项的病毒载体。
23.根据权利要求1、2、4或22的用途，其中所述运动神经元疾病或病症是肌萎缩侧索硬化。
24.根据权利要求1、2、4、22或23中任一项的用途，其中所述药物为适于通过肌内或静脉内或脑室内、脑池内或鞘内空间或鼻内或腹膜内或皮下或玻璃体内或经巩膜或硬膜外或口服给药递送病毒载体的形式。
25.用于在来自受试者样品中对运动神经元疾病进行检测和/或预后评估的体外方法，该方法包括下述步骤：
(a)检测来自所述受试者的样品中的IFNγ水平；以及
(b)比较通过步骤(a)获得的IFNγ水平数据与罹患运动神经元疾病的受试者的IFNγ水平数据，其中在所述受试者中IFNγ水平与运动神经元疾病状态相关。
26.根据权利要求26的方法，其中所述样品选自：血清样品、脑脊液样品或泪液样品。
27.根据权利要求9的方法，其中所述核酸序列的表达发生在经转导的细胞中，以及通过细胞的所述核酸序列的表达导致运动神经元损伤的减少。
28.根据权利要求5~6或8中任一项的方法，其中所述IFNγ拮抗剂是根据权利要求10~18中任一项所述的病毒载体。
29.治疗需要的受试者中运动神经元疾病或病症的方法，该方法包括：
在所述受试者中给药药物组合物，该药物组合物包括：
(a)可药用赋形剂；以及
(b)包括病毒载体的病毒粒子，所述病毒载体包括编码IFNγ拮抗剂的核酸序列，其可操作连接至至少一种能够调控所述核酸序列表达的表达调控元件。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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