CN105682675A - Vegf-c和ccbe1的治疗用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗涉及受损淋巴系统的疾病和病症，特别是淋巴水肿的治疗方法、用途和包括CCBE1和VEGF-C的组合物。

Description

VEGF-C和CCBE1的治疗用途

技术领域

本发明涉及用于治疗涉及受损淋巴系统的疾病(紊乱，disorder)和病症(特别是淋巴水肿)的治疗方法、用途和组合物。

背景技术

淋巴水肿是一种由功能失调的淋巴系统引起的局部淋巴液潴留(retention)和进行性(progressive)肿胀的慢性致残性(disabling)及毁损性(disfiguring)病症。这是一种严重影响全世界约一亿四千万患者的生活质量的终身病症。

原发性淋巴水肿是一种罕见的遗传性疾病，通常由淋巴管的异常发育引起。原发性淋巴水肿的症状可能在出生时或在以后的生活中出现。

后天性或继发性淋巴水肿由淋巴系统受损引起。在西方国家，最常见的是由淋巴结清除术、外科手术和/或放射治疗引起，其中在癌症(特别是乳腺癌)的治疗期间引起了淋巴系统受损。据估计，在美国，约有110000例乳腺癌患者由于腋窝淋巴结清除和/或辐射而患有淋巴水肿，并且每年有近15000例新患者发展为乳腺癌相关的淋巴水肿。

治疗性淋巴管新生(lymphangiogenesis)(淋巴管的再生)对于治疗淋巴水肿是具有诱人前景的。尽管近来关于支配淋巴管新生的分子机制方面的知识剧增，但仍然未能完全了解起始淋巴管新生的准确形态发生(morphogenetic)机制。

血管内皮生长因子C(VEGF-C)是胚胎发育中和成年人的各种淋巴管生成过程中淋巴管新生的主要驱动器(驱动因子，driver)(Alitalo,2011,NatureMedicine(自然医学)17:1371-1380)。VEGF-C通过激活VEGFR-3以及(在其蛋白水解处理的成熟形式)也激活VEGFR-2来发挥作用。小鼠中Vegfc基因的缺失会导致淋巴发育的失败，这是由于新分化的淋巴内皮细胞无法从中央静脉迁移至在其处形成了最初淋巴结构(firstlymphaticstructure)的位点(Karkkainen等人,2003,NatureImmunology(自然免疫学)5:74-80；等人,2013,EMBOJ32:629-644)。可以通过应用重组VEGF-C来恢复(rescue)该表型(Karkkainen等人,2003,出处同上)。为了恢复，使用“成熟”重组形式的VEGF-C，其缺乏N端和C端前肽(propeptide)。在分泌内源性VEGF-C的细胞中，需要从中央VEGF同源结构域(VHD)蛋白水解地切除这些前肽，以使VEGF-C达到其全部信号传导潜能(fullsignalingpotential)(Joukov等人,1997,EMBOJ16:3898-3911)。仅在切除两种前肽时VEGF-C才可以显著激活主要的血管生成(angiogenic)受体VEGFR-2(Joukov等人,1997,出处同上)，并且因此成熟的VEGF-C还刺激血管新生(angiogenesis)。

VEGF-C受体VEGFR-3的突变已显示出会导致被称为米尔罗伊氏病(Milroydisease)的遗传性淋巴水肿(Karkkainen等人,2000,NatureGenetics(自然遗传学)25:153-159)。另一方面，Hennekam淋巴管扩张-淋巴水肿综合征与结合胶原蛋白和钙的EGF结构域1(CCBE1)基因中的突变存在关联(Alders等人,2009,NatureGenetics(自然遗传学)41:1272-1274)，但并不清楚突变的CCBE1如何引起淋巴表型。在任何情况下，由于双杂合CCBE1+/-；VEGF-C+/-小鼠的表型，已经表明CCBE1和VEGF-C的遗传互作(geneticinteraction)(等人,2013,出处同上)。

虽然在角膜微囊袋(micropocket)测定中已经表明CCBE1使VEGF-C的促淋巴管生成活性增强(Bos等人,2011,CirculationResearch(循环研究)109:486-491)，但其在淋巴管新生中的真正作用仍然是不清楚的。原因之一在于，由于产生天然全长CCBE1是不可能的，所以在实验中使用的CCBE1蛋白质是与人IgG的Fc结构域融合的人造截短的(truncated)CCBE1蛋白。

尽管近年来在识别特异性表达在淋巴管上的分子方面取得了很大的进步，但仍然没有可用于淋巴水肿的治愈疗法。由于目前的做法仅涉及姑息治疗，所以需要用于淋巴水肿的改进的疗法。

发明内容

在一个方面，本发明涉及一种用在淋巴水肿的治疗中的全长CCBE1和VEGF-C的组合。

在另一方面，本发明涉及一种通过向有需要的患者同时地、单独地或顺序地施用全长CCBE1和VEGF-C的组合来治疗淋巴水肿的方法。

在上述方面的一些实施方式中，该组合包括多肽形式的CCBE1，包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列、SEQIDNO：1的氨基酸35-406、或与其具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些其他的实施方式中，该组合包括多核苷酸形式的CCBE1，包括如SEQIDNO：2所示的核酸序列、SEQIDNO：2的核苷酸71-1291、或与其具有至少80％的核酸序列同一性的核酸序列。

在另一些实施方式中，该组合包括多肽形式的VEGF-C，包括选自由以下各项组成的组中的氨基酸序列：SEQIDNO：3的氨基酸32-419、SEQIDNO：3的与氨基酸228-419共价连接的氨基酸32-227、SEQIDNO：3的氨基酸112-227、SEQIDNO：3的氨基酸103-227、以及与其具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在又一些实施方式中，该组合包括多核苷酸形式的VEGF-C，包括选自由以下各项组成的组中的核酸序列：SEQIDNO：4的核酸524-1687、SEQIDNO：4的核酸737-1687、SEQIDNO：4的核酸764-1687、SEQIDNO：4的核酸737-1111、SEQIDNO：4的核酸764-1111、以及与其具有至少80％的核酸序列同一性的核酸序列。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包括在上述实施方式中的任一个中示出的全长CCBE1和VEGF-C的组合。

本发明的其他方面、具体实施方式、目的、细节和优点将在以下的附图、详细说明和实例中列出。

附图说明

以下将借助于优选实施方式参照附图来更详细地描述本发明，在附图中：

图1表明了CCBE1共表达增加了VEGF-C蛋白水解处理至成熟的完全活化的VEGF-C。单独用CCBE1(图1A)或用VEGF-C+/-CCBE1(图1D)转染293T细胞，用放射性氨基酸培养经转染的293T细胞，并通过用V5抗体(IP：V5)和可溶VEGF-C受体(VEGFR-3/Fc)进行沉淀而后进行放射自显影(autoradiography)来分析培养基上清液(sup)和细胞裂解物。要注意，检测到细胞内的和细胞外的CCBE1两者，并且与胶原蛋白不同，CCBE1分泌不依赖于对细胞培养基的抗坏血酸盐补充。图1B示出了VEGF-C的生物合成和处理的示意图。所显示的是VEGF-C前体和各种经处理的形式的示意结构(Karpanen和Alitalo,2008,AnnualReviewofPathology(病理学年度回顾):MechanismsofDisease(疾病的发病机制)3:367-397)。箭头指向板D中相对应的带。图1D表明了用VEGFR-3/Fc沉淀的VEGF-C包含未切割的、部分切割和切割的VEGF-C。用CCBE1共表达使未切割的VEGF-C的量降低，而使被活化的VEGF-C的量增加。图1C说明与来自仅表达VEGF-C的培养物的上清液相比，来自表达CCBE1和VEGF-C两者的培养物的上清液在促进Ba/F3-VEGFR-3/EpoR细胞的生长方面具有较高的活性。P<0.05的统计学显著性差异用*标记，且P<0.001的统计学显著性差异用***标记，而n.s.表明无统计学显著性差异；n＝4。

图2表明了CCBE1促进VEGF-C分泌。图2A示出了来自所示出的用VEGF-C与CCBE1一起转染的和用VEGF-C而未用CCBE1转染的细胞的上清液和裂解物的VEGF-C免疫沉淀。左侧的分子量示出了主要VEGF-C形式的迁移率(mobility)。要注意，CCBE1共转染时，上清液中成熟21kDa形式的VEGF-C的量增加(8倍)，而未切割VEGF-C的量和29/31kDa多肽的量减少(相应地减少了74％和51％)(比较泳道(lane)1、2和3、4)。仅在共转染的细胞的上清液中检测到由VEGF-C的N-端切割(cleavage)产生的14kDa片段。由于CCBE1共转染的细胞的细胞裂解物中细胞内VEGF-C多肽减少了80％(比较泳道5、6和7、8)，所以用CCBE1共转染促进了VEGF-C的分泌。图2B示出与来自仅表达VEGF-C的培养物的上清液相比，来自表达CCBE1和VEGF-C两者的培养物的条件培养基在促进表达鼠(m)或人(h)VEGFR-2/EpoR嵌合体的Ba/F3细胞的生长方面具有较高的活性。

图3表明了胶原蛋白结构域截短的Fc融合的CCBE1不影响VEGF-C的VEGFR-3刺激活性。在恒定剂量(5μg/ml)的截短CCBE1-Fc(“A”)或仅由Fc部分组成的阴性对照蛋白(“B”)的存在下，用递增浓度的人VEGF-C_△N_△C(成熟VEGF-C；图3A)或全长VEGF-C(VEGF-C前体；图3B)刺激hVEGFR-3/EpoR-Ba/F3细胞。将细胞在刺激条件下培养共3天。在该时期结束时，向细胞培养物中加入溴化噻唑蓝四氮唑(MTT，Sigma-Aldrich公司)，并通过OD540光学密度来测量每个培养物中活细胞的量(细胞增殖的直接评分(directscore))(通过活细胞的线粒体酶产生深蓝色物质来减少黄色MTT)。

图4示出通过反式表达CCBE1的细胞增强了VEGF-C切割。用VEGF-C或CCBE1转染单独的(不同的，separate)细胞群，然后将其混合以用于代谢标记期，如所指示的。要注意，当(共)转染CCBE1时，上清液中成熟VEGF-C(21kDa)的量增加并且全长(58kDa)的或部分切割(29/31kDa)的VEGF-C的量降低(图4A)，而细胞裂解物中的量保持不变(图4B)。还要注意在稳定和瞬时转染的细胞之间VEGF-C迁移(migration)的微小差异，其由通过稳定转染的293SGnTI-细胞产生的VEGF-C的不同糖基化模式引起(Chaudhary等人,2012,NatureProtocols(自然协议)7:453-466)。

图5示出CCBE1的VEGF-C切割增强活性物(activity)被分泌到培养基中，即为产生CCBE1的293T细胞的条件上清液的可溶性组分。这表明了活性物不局限于细胞表面的或细胞外的基质，而可以在治疗上例如作为可溶性蛋白给药。此外，添加10％的FCS不抑制或不显著抑制该切割增强活性物。然而，并非所有形式的CCBE1都增强VEGF-C的切割。例如，由DU-4475产生的CCBE1不增强VEGF-C的切割。

图6表明了CCBE1增强了体内的淋巴管新生。由编码指示因子的AAV9转导的和针对指示抗原染色的鼠胫骨前肌的免疫染色。要注意，单独用全长VEGF-C仅诱导轻度的淋巴管生成反应，但其与CCBE1共转导引起了强烈的反应，如通过淋巴管的LYVE-1和Prox-1染色所检测到的。使用编码△N△C-VEGF-C(完全处理的成熟VEGF-C的等同物)的AAV9作为阳性对照。对血清白蛋白的反应与仅CCBE1时的反应相当。P<0.05的统计学显著性差异用*标记，且P<0.01的统计学显著性差异用**标记以及P<0.001的统计学显著性差异用***标记，而n.s.表明无统计学显著性差异；n≥5。

图7表明了CCBE1与VEGF-C的共转导刺激了血管新生。针对胫骨前肌中内皮细胞(PECAM-1)和平滑肌细胞(SMA)标记物的免疫组织化学法。在右侧示出了所染色区域的定量化。P<0.05的统计学显著性差异用*标记，P<0.01的统计学显著性差异用**标记以及P<0.001的统计学显著性差异用***标记；n≥5。

图8示出了通过CCBE1/VEGF-C共转导进行的CD45+白细胞的募集。Prox1转录因子被用作用于淋巴管内皮细胞的标记。如图7中所示的那样进行分析。

图9示出了在胫骨前肌中注射了所指示的AAV9载体的小鼠中的VEGFR-3荧光素酶报告信号。要注意，利用VEGF-C和CCBE1的共转导引起了指示大量的淋巴管新生反应的强荧光素酶信号，而全长VEGF-C和CCBE1仅引起了少量的萤光素酶活性。

图10示出了在脉冲追踪中，野生型VEGF-C分泌在2h时达到峰值，而不具有C端前肽的VEGF-C突变体(△C-VEGF-C)在15和45分钟之间已经达到峰值。

图11示出了VEGF-C的N端和C端前肽对生长因子处理的影响。要注意，通过与C端和N端前肽的竞争，成熟21kDa形式的VEGF-C和14kDaN端前肽两者的量均减少(图11A)。图11B说明在CCBE1共转染存在或不存在的情况下，VEGF-D和VEGF-D/VEGF-C嵌合体(CDC)的蛋白水解处理。C-pp，C端前肽；N-pp，N端前肽；HSA，人血清白蛋白；△N△C，相当于成熟VEGF-C的C端和N端截短形式的VEGF-C。

具体实施方式

本发明基于以下发现：全长的结合胶原蛋白和钙的EGF结构域1(CCBE1)蛋白促进血管内皮生长因子C(VEGF-C)分泌和很大成程度上无活性的VEGF-C前体的蛋白水解切割，从而引起VEGF-C的完全活化，这使体内的VEGF-C受体VEGFR-3和VEGFR-2信号传导、淋巴管新生和血管新生增加。因此，本发明提供了一种用于在与功能失调的淋巴系统相关的各种疾病(诸如淋巴水肿)中调节淋巴管新生和血管新生的治疗工具(tool)，即CCBE1和VEGF-C的组合。

CCBE1和VEGF-C的治疗用途可以以各种方式来实现。例如，CCBE1和VEGF-C的共同给药可以通过基因治疗、蛋白质治疗或它们的任何期望组合来实现。换言之，可以独立地选择CCBE1和VEGF-C给药的途径和方法。此外，CCBE1和VEGF-C的共同给药可以是同时的、独立的或顺序的。

如本文中所用的，除非上下文另有明确说明，否则术语“或”是一种包容性的“或”操作符，并且等同于术语“和/或”。此外，在整个说明书中，“一个(a)”、“一种(an)”和“该”的意思包括复数个/多个。

如本文中所用的，术语“基因治疗”是指以使CCBE1或VEGF-C多核苷酸能够以治疗有效量表达的方式将CCBE1或VEGF-C多核苷酸转移到所选择的靶细胞或组织中。根据本发明，基因治疗可以用于在具有受损淋巴系统的哺乳动物(特别是人)中取代有缺陷的基因或补充基因产物，其产生没有达到治疗有效量或治疗有用时间。

如本文中所用的，术语“蛋白质治疗”是指对寻求治疗的具有受损淋巴系统的哺乳动物(特别是人)施用治疗有效量的CCBE1或VEGF-C多肽。本文中，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，以指具有任何长度的氨基酸聚合物。

如本文中所用的，术语“治疗有效量”是指CCBE1或VEGF-C的下述量，在该量下，受损淋巴系统的有害影响被降低至最小程度。

如本文中所用的，除非明确地另有说明，否则术语“CCBE1”是指全长CCBE1多肽或指编码所述全长CCBE1的多核苷酸。优选地，CCBE1是哺乳动物(优选人类)的CCBE1。在一些实施方式中，全长CCBE1多肽包括SEQIDNO：1中描述的氨基酸序列，优选地不具有信号肽。据推测，人CCBE1的信号肽由SEQIDNO：1的氨基酸1-34组成，但当在哺乳动物细胞中产生时，该信号肽自动地被准确地切割。值得注意的是CCBE1多肽，由Bos等人在ClinicalResearch2011,109:486-491中公开的CCBE1^{△胶原蛋白}-Fc，是由对SEQIDNO：1的氨基酸1-191编码的cDNA所产生的截短CCBE1多肽和人IgG₁的Fc部分。这种截短CCBE1由融合至人IgG的Fc结构域的CCBE1的EGF和钙结合EGF结构域组成，但是没有胶原蛋白重复结构域。

对于本领域技术人员而言明显的是，根据本发明待使用的CCBE1多肽可以与SEQIDNO：1中描述的多肽不同，只要该CCBE1多肽保留其生物活性即可。一种确定CCBE1变异体是否保持其生物活性的示例性方法是确定其切割全长VEGF-C的能力。这可以例如通过下述方式来实现：培养具有正讨论的CCBE1变异体的表达全长VEGF-C的细胞，并且如果VEGF-C切割增强，则断定该CCBE1变异体保留了其生物活性。根据本领域中公知的方法，可以例如通过代谢标记和蛋白质特异性沉淀(诸如免疫沉淀)来确定所述VEGF-C切割。如果需要的话，可以将具有SEQIDNO：1中描述的氨基酸序列的CCBE1用作阳性对照。

在一些实施方式中，CCBE1多肽包括作为SEQIDNO：1的保守序列变异体的氨基酸序列。关于多肽，术语“保守序列变异体”是指氨基酸序列修饰，这样的修饰产生于使用本领域中公知的相似氨基酸(例如，具有相似大小并具有相似电荷性质的氨基酸)进行的氨基酸取代，并且这样的修饰并不会显著改变正讨论的多肽的生物学性质。还设想了氨基酸的缺失和添加。在一些其他实施方式中，CCBE1多肽包括与SEQIDNO：1中描述的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

如本文中所用的，两个序列之间的同一性％是在考虑到空位(空缺，gap)的数量以及每个空位的长度的情况下由序列共享的相同位置的数量的函数(即同一性％＝#个相同位置/总共#个位置×100)，其中空位的数目以及每个空位的长度需要被引入以用于这两个序列的最优比对。可以使用本领域中可用的数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。这适用于氨基酸序列和核酸序列两者。

如本文中所用的，术语“CCBE1多核苷酸”是指包括编码CCBE1多肽的核酸序列的任何多核苷酸，诸如单链或双链DNA或RNA。在一些实施方式中，CCBE1多核苷酸包括SEQIDNO：2中所描述的具有5'和3'非翻译区(UTR)的核酸序列或其保守序列变异体。在一些优选实施方式中，CCBE1多核苷酸包括针对全长CCBE1的编码序列(CDS)(即SEQIDNO：2的核酸71-1291)或其保守序列变异体。

关于多核苷酸，术语“保守序列变异体”是指不显著改变所编码多肽的生物学性质的核苷酸序列修饰。保守核苷酸序列变异体包括由遗传密码的退化(简并，degeneration)以及由沉默突变(silentmutation)产生的变异体。还设想了核苷酸的取代、缺失和添加。因此，对于任何CCBE1多肽存在编码多核苷酸序列的多种CCBE1，它们中的任一种可以根据本发明在治疗上使用。在一些其他实施方式中，CCBE1多核苷酸可以与SEQIDNO：2中描述的核酸序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性，只要该CCBE1多核苷酸编码保留其生物活性的CCBE1多肽即可。

如本文中所用的，术语“VEGF-C多肽”是指任何已知形式的VEGF-C，其包括前原VEGF-C、部分处理的VEGF-C和完全处理的成熟VEGF-C。在其生物合成期间，全长形式的VEGF-C(58kDa)首先经历在C端部分的蛋白水解切割，这引起通过二硫键结合在一起的29/31kDa中间形式，并且在N端的两个替代位点处进行后续切割，从而产生成熟的完全活化的21kDa或23kDa形式的VEGF-C。众所周知此过程是低效的，因为大多数的VEGF-C蛋白质未被活化。然而，在成熟和29/31kDa中间形式之间的淋巴管生成潜力的差异是显著的(Anisimov等人,2009,CirculationResearch104:1302-1312)。

在一些实施方式中，根据本发明待在治疗上使用的VEGF-C多肽是全长或前原形式的VEGF-C。在一些其他非限制性实施方式中，前原VEGF-C多肽缺少信号序列，并且因此可以包括例如SEQIDNO：3中所描述的序列的氨基酸32-419。本领域技术人员认识到，针对信号肽酶存在替代的切割位点，并且其他蛋白酶可以处理VEGF-C的N端而不会影响其活性。因此，VEGF-C多肽可以不同于包括SEQIDNO：3的氨基酸32-419的多肽或由SEQIDNO：3的氨基酸32-419组成的多肽。

可替换地或另外地，VEGF-C多肽可以是部分处理的VEGF-C的形式，诸如包括与SEQIDNO：3中所描述的氨基酸序列的氨基酸228-419共价连接的氨基酸32-227的多肽。再者，由于针对信号肽酶和其他蛋白酶的替代切割位点，部分处理的VEGF-C多肽可以具有与上述非限制性实例的氨基酸组成不同的氨基酸组成，而不偏离本发明及其实施方式。

在又一些其他的实施方式中，待向患有受损淋巴管新生的受试者施用的VEGF-C多肽是其完全处理或成熟形式，诸如包括SEQIDNO：3中所描述的氨基酸序列的氨基酸112-227或103-227的VEGF-C多肽。此外，VEGF-C多肽可以是任何其他天然存在形式或工程化形式。如果需要的话，不同形式的VEGF-C多肽可以以任何组合使用。优选地，VEGF-C多肽是哺乳动物的VEGF-C多肽，更优选地是人VEGF-C多肽。

还设想了，本文所述的VEGF-C多肽中的任一种可以在其氨基酸序列方面不同，只要VEGF-C多肽保留它们的生物学活性，特别是它们结合和激活VEGFR-2和/或VEGFR-3的能力即可。在一些实施方式中，VEGF-C多肽可以是本文描述述的任何VEGF-C多肽的保守序列变异体，或者它可以包括与SEQIDNO：3中所描述的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列或其任何生物学相关片段。

如本文中所用的，术语“VEGF-C多核苷酸”是指包括编码任何VEGF-C多肽的核酸序列的任何多核苷酸，诸如单链或双链DNA或RNA。例如，VEGF-C多核苷酸可以编码全长VEGF-C，并且包括SEQIDNO：4中所描述的核酸序列的核酸524-1687或由SEQIDNO：4中所描述的核酸序列的核酸524-1687组成。在一些其他实施方式中，VEGF-C多核苷酸可以编码中间形式的VEGF-C，并且包括SEQIDNO：4中所描述的核酸序列的核酸737-1687或764-1687或由SEQIDNO：4中所描述的核酸序列的核酸737-1687或764-1687组成。在一些其他的实施方式中，VEGF-C多核苷酸可以编码成熟形式的VEGF-C，并且包括SEQIDNO：4中所描述的核酸序列的核酸737-1111或764-1111或由SEQIDNO：4中所描述的核酸序列的核酸737-1111或764-1111组成。上述实施方式均不包含编码信号肽或终止密码子的序列，但其他实施方式可以包括这样的序列。在又一些其他的实施方式中，成熟形式的C端可以缩短，而不失去受体活化潜力。

也设想了所述核酸序列的保守序列变异体。因此，对于任何给定的VEGF-C多肽存在编码多核苷酸序列的多种VEGF-C，它们中的任何一种可以如本文所述的在治疗上使用。

在一些其他的实施方式中，VEGF-C多核苷酸可以包括与上述VEGF-C核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的核酸序列，只要该VEGF-C多核苷酸编码保留其生物学活性(特别是结合和激活VEGFR-2和VEGFR-3的能力)的VEGF-C多肽即可。

优选地，本文所描述的任何CCBE1或VEGF-C多核苷酸包括对可操作地连接至多核苷酸序列的分泌信号肽编码的附加N端核苷酸序列基序。该分泌信号肽通常包括具有约5至30个氨基酸的链，引导细胞外的多肽运输通过内质网，并且被从所分泌的多肽切割。合适的信号肽序列包括用于CCBE1或VEGF-C的那些天然序列、源自另一些所分泌蛋白质(诸如CD33、Igκ或IL-3)的那些序列以及合成的信号序列。

CCBE1或VEGF-C多核苷酸还可以包括用于在靶细胞中表达的合适的启动子和/或增强子序列，所述序列可操作地连接编码序列的上游。如果需要，该启动子可以是诱导型启动子或细胞类型特异性启动子，诸如内皮细胞特异性启动子。合适的启动子和/或增强子序列是本领域中容易得到的，并且包括但不限于EF1、CMV和CAG。

此外，本文中所述的任何CCBE1或VEGF-C多核苷酸可以包括可操作地连接编码序列的下游的合适的聚腺苷酸化(polyadenylation)序列。

对于基因治疗，上述“裸”CCBE1或VEGF-C多核苷酸可以以重组DNA、质粒或病毒载体的形式应用。裸多核苷酸的递送可以通过物理地或化学地渗透(permeabilize)细胞膜的任何方法来进行。这样的方法在本领域中是可获得的，并且包括但不限于电穿孔、基因轰击(genebombardment)、声孔效应(sonoporation)、磁性转染(magnetofection)、脂质转染、脂质体介导的核酸递送、以及它们的任何组合。

在一些其他实施方式中，CCBE1或VEGF-C多核苷酸可以在合适的表达控制序列下结合到病毒载体中。用于这种基因治疗的合适病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体(诸如慢病毒载体)、腺相关病毒载体、和腺病毒载体。优选地，病毒载体是复制缺陷型病毒载体，即不能在哺乳动物受试者中复制的载体。这样的复制缺陷型载体的非限制性优选实例是复制缺陷型腺病毒。合适的病毒载体是本领域中容易得到的。

可以通过本领域中熟知的各种方式来实现将治疗性CCBE1或VEGF-C多核苷酸递送至哺乳动物受试者，优选地是人受试者。例如，可以例如通过注射到具有受损淋巴管的靶组织中向待治疗的受试者的身体直接施用包括编码多核苷酸的CCBE1或VEGF-C的病毒载体。这样的递送引起多肽在体内的表达，并因此经常被称为体内基因治疗。可替换地或者或另外地，通过使用病毒载体或裸多肽，可以在体外实现本发明治疗性多肽的递送。体外基因治疗是指用本发明多核苷酸体外转染(或用病毒转导)优选地从待治疗的受试者获得的靶细胞，然后向该受试者施用以用于治疗的目的。用于体外基因治疗的合适靶细胞的非限制性实例包括内皮细胞、内皮祖细胞、平滑肌细胞、白细胞、以及特别是各种干细胞。

在基因治疗中，CCBE1或VEGF-C的表达可以是稳定的或瞬时的。瞬时表达通常是优选的。本领域技术人员知道何时以及如何使用稳定的或瞬时的基因治疗。

在治疗涉及受损淋巴脉管的疾病或病症的临床领域中的技术人员可以容易地确定根据本发明的CCBE1和VEGF-C的治疗性给药的量和方案(regimen)。一般地，CCBE1或VEGF-C治疗的剂量将根据以下因素变化：诸如，待治疗患者的年龄、性别和总体健康状况；如果有的话，同步治疗(同期治疗，concurrenttreatment)的种类；治疗的频率和所期望效果的性质；组织损伤的程度；症状的持续时间；以及待由医生个人调整的其他变量。例如，当要将病毒载体用于基因递送时，通常可选地在药学上可接受的载体中以10⁷至10¹³个病毒颗粒的量(优选地至少10⁹个病毒颗粒的量)施用该载体。另一方面，当使用蛋白质治疗时，典型的剂量在0.01至20mg/kg的范围内，更优选地在0.1至10mg/kg的范围内，最优选地在0.5至5mg/kg的范围内。可以以一种或多种剂量且以合适的间隔将所期望的剂量给药，以获得所期望的效果。典型的非限制性日剂量可以从约50mg/天至约300mg/天变化。

对于蛋白质治疗，CCBE1或VEGF-C可以通过标准重组方法获得。根据本领域中熟知的方法，可以将所期望的多核苷酸克隆至合适的表达载体中并在亲和宿主(compatiblehost)中进行表达。合适的宿主的实例包括但不限于细菌(诸如大肠杆菌)、酵母(诸如酿酒酵母)、昆虫细胞(诸如SF9细胞)、以及优选地哺乳动物细胞系。表达标记(诸如组氨酸标记、血凝素(hemagglutinin)表位(HA-标记)或谷胱甘肽-S-转移酶表位(GST-标记))可用于促进CCBE1或VEGF-C的纯化。如果要利用表达标记，则它们必须在向有需要的受试者施用之前被切割。

如上所述，本发明的治疗方法和用途与涉及受损淋巴脉管的疾病和病症的治疗相关。这样的疾病和病症的非限制性实例包括淋巴水肿，诸如原发性淋巴水肿(例如米尔罗伊氏综合征、美格氏(Meige's)淋巴水肿和迟发性淋巴水肿)、继发性淋巴水肿、和脂肪水肿。

如本文中所用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指出于下述目的向哺乳动物(优选地是人)受试者共同施用CCBE1和VEGF-C，所述目的不仅包括与受损淋巴系统相关的疾病或症状的完全治愈，还包括这样的疾病或症状的预防、改善、或减轻。CCBE1和VEGF-C的共同给药的治疗效果可以通过监测受影响组织的症状(诸如肿胀、疼痛、不适、沉重感(heaviness)或绷紧度(tightness))来进行评估。

本发明不仅提供了用于治疗与受损淋巴脉管相关的疾病和病症的治疗方法和用途，而且还提供了在所述方法和治疗用途中使用的药物组合物。这种药物组合物包括CCBE1和VEGF-C(无论是单独地或组合地)以及任何药学上可接受的载体(诸如药学上可接受的溶剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或载体)。例如，药学上可接受的载体可以是无菌非水性载体(诸如丙二醇、聚乙二醇或可注射有机酯)。合适的水性载体包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水和林格氏(Ringer's)葡萄糖溶液。

可以使用各种给药途径以实现在期望作用位点处的有效剂量，如本领域中公知的。因此，合适的给药途径包括但不限于肠胃外递送(例如静脉注射)、肠内递送(例如口服)、局部给药、外用(topicaladministration)(例如经皮地或透皮地(transdermally))，如本领域技术人员公知的。

该药物组合物可以以浓缩的形式或粉末的形式提供，以根据需要进行重构。在冻干的情况下，某些冷冻保护剂是优选的，包括聚合物(聚维酮、聚乙二醇、葡聚糖)、糖(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、氨基酸(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)和白蛋白。如果将用于重构的溶液加入到包装，则它可以例如由无菌水、氯化钠溶液、或右旋糖或葡萄糖溶液组成。

用于配制本发明的药物制剂的装置和方法是本领域技术人员已知的，并且其可以以本身已知的方式(例如，通过常规的混合、制粒、溶解、冻干或类似的方法)来制造。

上述的任何实施方式和特征可以独立地应用于CCBE1和VEGF-C，并且可以以任何期望的组合来使用。因此，CCBE1和VEGF-C的任一种或两种可以通过基因治疗或蛋白质治疗被递送。还设想了可以利用基因治疗和蛋白质治疗两者施用CCBE1或VEGF-C。

对本领域技术人员而言显而易见的是，随着技术的进步，本发明的概念可以以各种方式来实现。本发明及其实施方式不限于以下描述的实例，而可以在权利要求的范围内变化。

实施例

材料和方法

克隆。将通过重组腺相关病毒(rAAV9)载体表达的基因克隆到psubCAG-WPRE质粒中(Paterna等人,2000,GeneTherapy(基因治疗)7:1304-1311)，该psubCAG-WPRE质粒是psubCMV-WPRE的衍生物，其中CMV启动子已被复合CAG启动子代替，该复合CAG启动子由鸡β-肌动蛋白启动子、巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白内含子组成(Okabe等人,1997,FEBSLetters407:313-319)。早期已描述了将全长mVEGF-C、△N△C-mVEGF-C和HAS克隆到AAV-载体(psubCAG-WPRE)中(Anisimov等人,2009,出处同上)。融合至V5标记的mCCBE1(mCCBE1-V5)按如下进行克隆：将编码DNA序列的部分CCBE1(CDS；基因库#BC152322，图像克隆ID40140631)作为SacI/XbaI片段克隆至pVK1(pUC19-衍生的载体(Anisimov等人,2007,MolecularBreeding(分子育种)19:241-253))中。用引物5'-GCCGCTAGCGCCACCATGGTGCCGCCGCCT-3'(SEQIDNO：5)和5'-GGAGCTTGGGCACAAATGTC-3'(SEQIDNO：6)扩增褐色脂肪组织mRNA得到缺失的核苷酸，并且通过插入NheI/SacI片段来完成上述的CDS，从而得到载体pVK1-CCBE1。PCR扩增的V5标记(使用引物5'-ACCAGGAGCACCAGGAAGAC-3'(SEQIDNO：7)和5'-GCCTCTAGAACGCGTCTAGGTGCTGTCCAGGCCCAG-CAGAGGGTTAGGGATAGGCTTGCCTGGATAAAAATTTCTTGGGG-3'(SEQIDNO：8)获得的)被加入到CDS中作为Eco81I/XbaI片段。从所得载体切除完整CDS作为MluI片段，并将完整CDS克隆至psubCAG-WPRE中。

对于体外研究，构建相同的载体，其中，鼠CCBE1CDS被人CCBE1CDS(基因库#NM_133459)代替，并且对于免疫共沉淀研究，StrepIII标记(Junttila等人,2005,PROTEOMICS5:1199-1203)紧接着插入在CCBE1CDS之后。之前已经描述了用于VEGF-C和△C-VEGF-C构建体的哺乳动物表达构建体(Joukov等人,1997,出处同上)。通过重叠PCR将嵌合的VEGF-C/VEGF-D(CDC)表达构建体组装到pMosaic载体中(Jeltsch等人,2006,J.Biol.Chem.281:12187-12195)。插入物包括编码来自人VEGF-C的氨基酸残基Phe32-Ala111和Ser228-Ser419以及干预来自人VEGF-D的残基Thr92-Arg206的序列。

用于S2细胞中的重组蛋白质表达的构建体使用pMT-Ex载体(pMT-BiP-V5His-C的改良版本(修饰版本，modifiedversion)(等人,2006,TheFASEBJournal20:1462-1472))，并且包括编码N端前肽的氨基酸残基Phe32-Ala111、C端前肽的氨基酸残基Ser228-Ser419和△N△C形式的VEGF-C的氨基酸残基Thr112-Arg227的序列，接着是编码六组氨酸标记的序列。

rAAV产生。rAAV9病毒是通过三质粒转染法制成，并使用不连续碘克沙醇梯度法通过超速离心来纯化，如所描述的(Anisimov等人,2009,出处同上)。为了生成AAV9血清型，我们使用血清型确定的辅助质粒p5E18-VP2/9，而不是p5E18-VP2/8(Michelfelder等人,2011,PLoSONE6:e23101)。

蛋白质表达和纯化。使用Effectene(Qiagen公司，Venlo，荷兰)转染S2细胞。转染后2天开始用400μg/ml的潮霉素选择稳定的细胞群持续3周。对于蛋白质产生，使细胞适应于悬浮培养，并用1mMCuSO₄诱导4-5天。当从pH调节的条件上清液批次结合至Ni²⁺NTA琼脂糖之后，将该Ni²⁺NTA琼脂糖装载到柱上，并用20mM咪唑进行清洗，以及用阶梯梯度的250mM咪唑进行洗脱(洗提，elute)。在Superdex200柱上用PBS作为运行缓冲液来进一步将蛋白质依大小而分离。

细胞培养。293T、293SGnTI-和NIH-3T3细胞在含10％FCS的D-MEM中生长。PC-3细胞在含10％FCS的Ham'sF-12中生长，DU-4475细胞在含20％FCS的RPMI1640中生长，以及S2细胞在HyCloneSFX-Insect(Thermo-Scientific公司,罗克福德,伊利诺伊州)或Insect-Xpress(LonzaGroup公司,巴塞尔,瑞士)中生长。

转染、代谢标记和蛋白质分析。用编码指示蛋白质的表达构建体(共)转染293T和293SGnTI-细胞。在转染后24小时，用[³⁵S]-半胱氨酸/[³⁵S]-蛋氨酸(PerkinElmer公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)代谢地标记细胞，并且在48小时后，获取条件细胞培养基和细胞裂解物。对于短标记实验，在24小时后已经完成了获取。可替换地，为了产生用于免疫印迹的未标记蛋白质，用含0.2％BSA的D-MEM替换该细胞的培养基，并在48小时后获取上清液和细胞裂解物。

在免疫沉淀之前，可选地，用蛋白质A琼脂糖(多克隆抗体和兔抗血清)或蛋白质G琼脂糖(单克隆抗体)预清洗样品。抗VEGF-C抗血清(Baluk等人,2005,J.Clin.Invest.115:247-257)、抗V5抗体(Invitrogen公司,卡尔斯巴德,加利福尼亚州,#46-0705)、抗hCCBE1抗体(AtlasAntibodiesAB公司,斯德哥尔摩,瑞典,#HPA041374)、抗VEGF-D抗体VD1(Achen等人,2000,Eur.J.Biochem.267:2505-2515)或嵌合的VEGFR-3/lgGFc(等人,2001,NatureMedicine7:199-205)用于免疫沉淀。

洗涤样品，并由4-20％的SDS-PAGE溶解样品。对于放射自显影，使凝胶干燥，并将其暴露于磷光影像分析板或X射线胶片。对于免疫检测，将蛋白质转移至硝酸纤维素。用抗VEGF-C抗血清、抗V5抗体或抗hCCBE1抗体与ECL联合来检测特异性信号。使用ImageJ软件(NIH公司,贝塞斯达,马里兰州)，根据激光扫描仪读数或所扫描的X射线胶片来进行放射自显影和蛋白质印迹的定量。

Ba/F3-VEGFR/EpoR测定。使用条件细胞培养基进行Ba/F3-hVEGFR-3/EpoR(Achen等人,2000,出处同上)和Ba/F3-mVEGFR-2/EpoR(Stacker等人,1999b)生物测定，基本上如所描述的(等人,2001,出处同上)。与上述细胞系相似地生成Ba/F3-hVEGFR-2/EpoR细胞系；然而，使用pCI-neo代替pEF-BOS。嵌合体的连接(junctional)氨基酸序列为...FFIIEGAQEKTNLEGS(VEGFR-2部分的结束)-(mEpoR部分的开始)LILTLSLILVLISLLLTVLALLSHRRTLQQKIWPGIPSPESEFE...(分别为SEQIDNO：9和SEQIDNO：10)。使用一个30ms的1400V脉冲(氖转染设备，Invitrogen公司)将该嵌合构建体电穿孔到Ba/F3细胞中。该细胞在含2ng/ml的mIL-3的培养基中生长36小时，之后细胞分裂，并开始用1.2mg/ml的G418进行持续三周的选择。用次最佳的mIL-3浓度(0.4ng/ml)和最佳的VEGF-A和VEGF-C浓度(分别是200和300ng/ml)来维持细胞。

脉冲追踪。293T细胞被转染，并在6cm器皿上生长36小时以接近融合状态(confluency)。使细胞在蛋氨酸(Met)/半胱氨酸(Cys)缺乏的含有5％透析的FCS的D-MEM中饥饿30分钟，之后细胞用[³⁵S]-半胱氨酸/[³⁵S]-蛋氨酸代谢地标记2小时。此后，用温PBS清洗细胞并加入5ml追踪培养基(D-MEM，10％FCS+2mM冷L-蛋氨酸+2mM冷L-半胱氨酸)。在所指示的时间点，将器皿置于冰上并除去培养基以用于分析。

通过VEGF-C前肽竞争VEGF-C切割。纯化的组氨酸标记的蛋白质以25μg/ml的浓度包含在VEGF-C/CCBE1共转染的293T细胞的标记培养基中。从转染后30-72小时起调整标记培养基，并用Ni²⁺NTA琼脂糖耗尽组氨酸标记的蛋白质，以及对VEGF-C进行免疫沉淀，通过PAGE进行分离并且通过暴露于X-射线胶片而显影。通过根据激光扫描器读数量化14kDaN端切割产物来测量对VEGF-C的N端切割的抑制。

链球菌(strep)标记的CCBE1的共免疫沉淀分析。用CCBE1-strepIII或全长VEGF-C构建体转染293T细胞。条件培养基单独地或作为CCBE1和全长VEGF-C的混合用于链球菌-肌动蛋白(Strep-Tactin)(Qiagen公司)下拉实验(pull-down)中。混合的培养基在应用于下拉实验之前于RT(室温)下培养10分钟。在SDS-PAGE和蛋白印迹之后，用抗CCBE1抗体和抗VEGF-C抗血清分析沉淀物。输入表示25μl全长VEGF-C条件培养基，其作为阳性对照被负载(调入，load)。

体内实验。向FVB/N雄性小鼠的胫骨前肌注射编码m(鼠)CCBE1-V5、全长mVEGF-C或HAS的rAAV9的1：1混合溶液。AAV9-HSA和AAV9-△N△C-mVEGF-C单载体对应地作为阴性和阳性对照。在单次注射剂量中载体颗粒的总浓度为6×10¹⁰。在转导后三周，通过过量的CO₂处死小鼠。分离胫骨前肌，将其包埋至O.C.T.(SakuraFinetekEurope公司,莱茵河畔阿尔芬,荷兰)、切片(10μm厚度)并且针对淋巴管(LYVE-1、Prox-1)和血管(PECAM-1)以及平滑肌细胞/周细胞(平滑肌肌动蛋白，SMA)和白细胞标记物(CD45)进行染色，然后使用Alexa结合的二抗(分子探针，Invitrogen公司)。在Axioplan2显微镜(CarlZeissAG公司,奥伯科亨,德国)中获得荧光图像；物镜为：10×NA＝0.3WD5.6和20×NA＝0.5WD2.0；照相机是蔡司(Zeiss)AxioCam-HRm14位灰度CCD；采集软件是蔡司AxioVision4.6。使用ImageJ软件完成染色区的定量。手工计数Prox-1阳性细胞核。如先前所述的进行对EGFP/LucVegfr3EGFP/Luc小鼠中萤光素酶活性的检测(Martínez-Corral等人,2012,PNAS109:6223-6228)。南芬兰省国办的动物实验的国家委员会批准在这项研究中进行的所有动物实验。

统计分析。采用单因素ANOVA确定差异的显著性。当假定方差相等时，Tukey(图基)检验用作事后检验。当假定方差不相等时，Games-Howell检验用作事后检验。使用逻辑回归计算Ba/F3测定的EC50。图中的误差条表示标准偏差。

结果

CCBE1增强了VEGF-C处理和分泌，导致VEGFR-3活化增加。在用CCBE1表达载体转染的293T细胞的细胞裂解物和条件培养基两者中检测到CCBE1是分子量为40-55kDa的蛋白质(图1A)。在上清液中，CCBE1的部分迁移作为与推定的CCBE1二聚体相对应的扩散的糖基化带。将转染的VEGF-C表示为未切割的58kDa前体、C端处理的29/31kDa和完全处理的21kDa成熟形式(图1D，泳道1)。然而，当将VEGF-C和CCBE1共转染时，未切割的VEGF-C和29/31kDa多肽的量显著地减少，而成熟的完全活化的VEGF-C成为主要种类(图1D，比较泳道1和3)。这些结果表明，CCBE1使VEGF-C的N端和C端蛋白水解处理两者都加速。

为了能够分析CCBE1共转染对细胞内VEGF-C形式的影响，我们使用较短的标记时期。由于在共转染细胞的裂解物中细胞内量减少了80％(图2A，比较泳道5、6和7、8)，所以用CCBE1共转染促进了VEGF-C的分泌。

与仅用VEGF-C转染的细胞的上清液相比，来自CCBE1/VEGF-C共转染培养物的条件培养基较好地刺激Ba/F3-VEGFR-3/EpoR和Ba/F3-VEGFR-2/EpoR细胞的生长和存活，而单独的CCBE1显示出非常低的活性。这证实了，增强的分泌和切割导致培养物中活性VEGF-C蛋白质的水平增加(图1C和图2B)。要注意，仅表达CCBE1的细胞的上清液也引起Ba/F3-VEGFR-3/EpoR细胞的存活的轻微增加，这大概是因为由细胞产生的内源性VEGF-C的处理和活化增加。

截短的CCBE1不增强VEGF-C刺激的VEGFR-3活性。如由Bos等人(2011，出处同上)所公开的那样截短CCBE1，即使得去除了结合胶原蛋白的结构域，并且为了较好的蛋白质稳定性将CCBE1分子的其余部分融合至人IgG的Fc结构域。将截短的CCBE1纯化至同质(均质，homogeneity)，并在建立的体外系统中与纯化的全长或成熟的VEGF-C蛋白质一起进行检验。我们如下进行实验。在恒定剂量(5μg/ml)的截短CCBE1-Fc或作为Fc部分的阴性对照蛋白质的存在下，通过增加人VEGF-C△N△C(成熟VEGF-C)(图3A)或全长VEGF-C(VEGF-C前体)(图3B)的浓度来刺激hVEGFR-3/EpoR-Ba/F3细胞。将细胞在刺激条件下培养共3天。在此时期结束时，向细胞培养物中加入溴化噻唑蓝四氮唑(MTT，Sigma-Aldrich公司)，并通过OD540光学密度来测量每个培养物中活细胞的数量(细胞增殖的直接评分)(通过活细胞的线粒体酶产生深蓝色物质来减少黄色MTT)。结果清楚地表明截短的CCBE1不能增强VEGF-C的VEGFR-3刺激活性。

CCBE1能够反式增强VEGF-C处理。在发育中的小鼠胚胎和斑马鱼中，CCBE1表达在邻近于发育中的淋巴结构处，而非由内皮组织本身表达(Hogan等人,2009,NatureGenetics(自然遗传学)41:396-398)。因此，我们希望确定由其他细胞反式产生的CCBE1是否还能够增强VEGF-C处理。我们使用VEGF-C或CCBE1转染293T细胞的单独培养物，并在转染后24小时混合细胞群。可替换地，我们将CCBE1转染的细胞与稳定表达VEGF-C的细胞混合。如在共转染实验中一样，CCBE1提高了VEGF-C的细胞外处理的效率(图4A)。相反，当相邻细胞产生过量的CCBE1时，VEGF-C的细胞内处理和分泌不受影响(图4B)。

CCBE1增强体内VEGF-C的淋巴管生成活性。为了研究CCBE1是否使体内淋巴管新生增强，我们单独使用表达CCBE1的腺相关病毒(AAV)载体(AAV9-CCBE1)、以1:1比例与AAV9-VEGF-C载体一起使用表达CCBE1的腺相关病毒载体、或作为阴性对照的AAV9-人血清白蛋白(HSA)来转导鼠胫骨前肌。编码活化形式的VEGF-C(△N△C-VEGF-C)的AAV9用作阳性对照，以模拟完全蛋白水解处理(成熟)形式的VEGF-C。

在AAV转导后两周，使用用于内皮细胞(PECAM-1)、淋巴内皮细胞(LYVE-1、Prox1)和白细胞(CD45)的标记物通过免疫组织化学分析骨骼肌。在该测定中，全长VEGF-C和△N△C-VEGF-C两者均刺激淋巴管新生，尽管后者(“成熟”形式)在相同病毒剂量下给出相当强的反应，但是仅△N△C-VEGF-C刺激了血管新生(图6和图7，底行)。这表明了全长VEGF-C的蛋白水解处理在AAV9转导肌肉中是低效的。

然而，当全长VEGF-C与CCBE1共转导时，淋巴管新生显著地增强，如由LYVE-1和Prox-1染色所示的(图6)。我们还观察到显著较多的血管新生(图7)，表明CCBE1还使体内VEGF-C的蛋白水解处理增强。在全长VEGF-C/CCBE1的共转导之后观察到CD45+白细胞的数量增加(图8)，表明VEGF-C活化还通过VEGFR-3使白细胞募集增加。

为了证实这些发现，我们用AAV9转导的杂合Vegfr3EGFP/Luc小鼠(Martínez-Corral等人,2012,出处同上)来通过光学生物发光成像监测体内淋巴管新生。我们在用编码VEGF-C和CCBE1的AAV共转导的小鼠中检测到强荧光素酶信号，而在用VEGF-C或CCBE1单独转导的小鼠中检测到较弱的信号，并且在用HSA转导的小鼠中没有检测到生物发光信号(图9)。

VEGF-C前肽参与CCBE1介导的蛋白水解。我们试图证明VEGF-C和CCBE1的物理相互作用是不成功的。因此，我们假设CCBE1-VEGF-C相互作用是较弱的、短暂的，并且也许是间接的。我们试图确定VEGF-C中对CCBE1介导的加速的分泌和切割负责的结构元素。当我们在脉冲追踪实验中比较野生型VEGF-C和缺乏其C端前肽的VEGF-C突变体之间的分泌动力学时，标记的VEGF-C突变体在15至45分钟之间已经达到其分泌峰值，而野生型VEGF-C仅在两个小时之后才达到其分泌峰值(图10)。这表明C端前肽调节分泌效率。我们试着通过添加高浓度的纯化的VEGF-CN端或C端前肽或者VHD来抑制VEGF-C的CCBE1增强的处理。在C端前肽的情况下观察到VEGF-C处理的约79％的抑制，并且在N端前肽的情况下观察到VEGF-C处理的约43％的抑制，而VHD或BSA对照未改变由所转染细胞产生的蛋白水解片段的比率(图11A)，证实了VEGF-C前肽参与了CCBE1介导的切割。尽管VEGF-D与VEGF-C在结构和蛋白水解处理上非常相似(等人,2011,Blood117:1507-1515；Stacker等人,1999a,J.Biol.Chem.274:32127-32136)，但CCBE1共转染并没有使人全长VEGF-D或嵌合因子的蛋白水解处理加速，其中VEGF-D的VHD的两侧是VEGF-C的N和C端前肽(图11B，泳道3-6)。

Claims (13)

1.一种用于淋巴水肿的治疗的用途的全长CCBE1和VEGF-C的组合。

2.根据权利要求1所述的用于所述用途的组合，其中，所述CCBE1是多肽的形式，包括SEQIDNO：1中示出的氨基酸序列、SEQIDNO：1中示出的氨基酸35-406、或者与其具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的用于所述用途的组合，其中，所述CCBE1是多核苷酸的形式，包括SEQIDNO：2中示出的核酸序列或与其具有至少80％的核酸序列同一性的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的用于所述用途的组合，其中，所述VEGF-C是多肽的形式，包括选自由以下组成的组中的氨基酸序列：SEQIDNO：3的氨基酸32-419、SEQIDNO：3的与氨基酸228-419共价连接的氨基酸32-227、SEQIDNO：3的氨基酸112-227、以及SEQIDNO：3的氨基酸103-227、以及与其具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的用于所述用途的组合，其中，所述VEGF-C是多核苷酸的形式，包括选自由以下组成的组中的核酸序列：SEQIDNO：4的核酸524-1687、SEQIDNO：4的核酸737-1687、SEQIDNO：4的核酸764-1687、SEQIDNO：4的核酸737-1111、SEQIDNO：4的核酸764-1111、以及与其具有至少80％的核酸序列同一性的核酸序列。

6.根据权利要求1所述的用于所述用途的组合，其中，淋巴水肿选自由原发性淋巴水肿、米尔罗伊氏综合征、美格氏淋巴水肿、迟发性淋巴水肿、继发性淋巴水肿、和脂肪水肿组成的组。

7.一种药物组合物，包括权利要求1至6中任一项所限定的组合和药学上可接受的载体。

8.一种通过向有需要的患者同时地、单独地或顺序地施用全长CCBE1和VEGF-C的组合来治疗淋巴水肿的方法。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述CCBE1是多肽的形式，包括SEQIDNO：1中示出的氨基酸序列、SEQIDNO：1中示出的氨基酸35-406、或与其具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述CCBE1是多核苷酸的形式，包括SEQIDNO：2中示出的核酸序列或与其具有至少80％的核酸序列同一性的核酸序列。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述VEGF-C是多肽的形式，包括选自由以下组成的组中的氨基酸序列：SEQIDNO：3的氨基酸32-419、SEQIDNO：3的与氨基酸228-419共价连接的氨基酸32-227、SEQIDNO：3的氨基酸112-227、SEQIDNO：3的氨基酸103-227、以及与其具有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

12.根据权利要求8所述的方法，其中，所述VEGF-C是多核苷酸的形式，包括选自由以下组成的组中的核酸序列：SEQIDNO：4的核酸524-1687、SEQIDNO：4的核酸737-1687、SEQIDNO：4的核酸764-1687、SEQIDNO：4的核酸737-1111、SEQIDNO：4的核酸764-1111、以及与其具有至少80％的核酸序列同一性的核酸序列。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，淋巴水肿选自由原发性淋巴水肿、米尔罗伊氏综合征、美格氏淋巴水肿、迟发性淋巴水肿、继发性淋巴水肿、和脂肪水肿组成的组。