KR20160048103A - Vegf-c 및 ccbe1의 치료적 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 손상된 림프계, 특히 림프부종을 수반하는 질병 및 증상을 치료하기 위한 CCBE1 및 VEGF-C를 포함하는 치료 방법, 용도 및 조성물에 관한 것이다.

Description

VEGF-C 및 CCBE1의 치료적 용도{THERAPEUTIC USE OF VEGF-C AND CCBE1}

본 발명은 손상된 림프계, 특히 림프부종이 수반되는 질병 및 증상들을 치료하기 위한 치료 방법, 용도 및 조성물에 관한 것이다.

림프부종(lymphedema)은 림프계의 기능 장애에 의하여 국소적인 림프액이 저류하여 점차 부풀어오르는 만성 장애 및 손상된 상태이다. 이는 평생 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미치며 전 세계적으로 약 1억 4천만명이 앓고 있다.

일차성 림프부종(primary lyphedema)은 드물게 나타나는 유전 질환으로, 보통 림프관의 비정상적인 발달에 의해 발생한다. 일차성 림프부종의 증상은 출생시 또는 일생 중에 나타날 수 있다.

후천적 또는 이차성 림프부종(secondary lymphedema)은 림프계의 손상에 의해서 발생한다. 서부 국가에서는, 림프절 절개, 수술 및/또는 방사선 치료에 의해 가장 흔하게 유발되는데, 여기서 림프계 손상이 암, 특히 유방암 치료 중에 유발된다. 미국에서는 약 11만명의 유방암 환자들이 겨드랑이 림프절의 절개 및/또는 방사선 치료에 의하여 림프부종으로 고통받고 있는 것으로 추정되며, 매년 거의 1만 5천명의 새로운 환자들이 유방암과 관련된 림프부종을 앓게 되는 것으로 추정된다.

림프관이 재생성되는 치료적 림프관신생(lymphangiogenesis)은 림프부종 치료에 있어서 매력적인 가능성이다. 림프관 신생을 조절하는 분자적 기전에 대한 지식이 최근 폭발적으로 증가함에도 불구하고 림프관신생의 시작에 관한 정확한 형태형성 기전(morphogenetic mechanisms)은 불완전하게 이해되고 있다.

혈관 내피세포 성장 인자 C (vascular endothelial growth factor C: VEGF-C)는 배아 발생과 성인의 다양한 림프관신생 과정에 있어 림프관신생의 주요 구동자이다(Alitalo, 2011, Nature Medicine 17: 1371-1380). VEGF-C는 VEGFR-3를 활성화시킴으로써 작용하고, 또한 그의 단백질분해적으로 가공된 성숙한 형태로 VEGFR-2를 활성화시킴으로써 작용한다. 쥐에서 Vegfc 유전자의 결실은 새로이 분화된 림프관 내피세포가 중심 정맥으로부터 첫번째 림프 구조가 형성되는 부위로 이동하는 능력의 상실로 인한여 림프 발생이 되지 않게 된다(Karkkainen et al, 2003, Nature Immunology 5: 74-80; Hagerling et al, 2013, EMBO J 32: 629-644). 이 표현형은 재조합 VEGF-C의 적용에 의해서 구제될 수 있다 (Karkkainen et al, 2003, ibid.). 상기 구제에 대하여, VEGF-C의 "성숙한" 재조합 형태가 이용되었는데, 이는 N-말단과 C-말단 프로펩티드가 소실되어 있다. 내인성 VEGF-C를 분비하는 세포에서, 이 프로펩티드는 VEGF-C가 완전히 신호전달을 할 수 있는 상태가 되기 위하여 중심 VEGF 상동 도메인 (VEGF homology domain: VHD)으로부터 단백질분해되어 잘려나갈 필요가 있다 (Joukov et al, 1997, EMBO J 16: 3898-3911). VEGF-C는 두 프로펩티드 모두가 잘려진 때에 주요 혈관신생 수용체인 VEGFR-2를 유의하게 활성화시킬 수 있고, 그래서 성숙한 VEGF-C는 혈관신생 또한 자극한다.

VEGF-C 수용체인 VEGFR-3의 돌연변이는 '밀로이병 (milroy disease)'으로 알려진 유전적인 림프부종을 발생시키는 것으로 알려졌다 (Karkkainen et al, 2000, Nature Genetics 25: 153-159). 반면, 한네캄 림프관확장증-림프부종 신드롬 (Hannekam lymphangiectasia-lymphedema syndrome)은 콜라겐- 및 칼슘-결합 EGF 도메인 1 (Calcium-binding EGF domain 1: CCBE1) 유전자의 돌연변이와 연관되어 있으나 (Alders et al, 2009, Nature Genetics 41: 1272-1274), 돌연변이된 CCBE1이 어떻게 림프 표현형을 일으키는지는 불명확하다. 아무튼, CCBE1 및 VEGF-C의 유전적 상호작용은 이중 이형접합체인 CCBE1+/-;VEGF-C+/- 쥐의 표현형으로 인한 것으로 제시되었다 (Hagerling et al, 2013, ibid.).

CCBE1이 비록 각막 미세낭 분석(corneal micropocket assay)에서 VEGF-C의 림프관신생촉진 (prolymphangiogenic) 활성을 증가시키는 것으로 제시되어 왔더라도 (Bos et al. 2011, Circulation Research 109: 486-491), 림프관신생에 있어 이것의 진짜 역할은 모호하게 남아있다. 그 이유 중 하나가, 고유의 전장 CCBE1의 생산이 불가능하므로, 실험에 사용된 CCBE1 단백질이 인간 IgG의 Fc 도메인과 융합된 인공적 절단된 CCBE1이었기 때문이다.

림프관 상에 특이적으로 발현된 분자들을 확인하는데 최근 엄청난 진전이 있었음에도 불구하고, 림프부종에 적용 가능한 치료법이 없다. 현재 관행은 완화치료(palliative care)만을 포함하고 있을 뿐이므로, 림프부종에 대한 개선된 치료법이 필요하다.

발명의 요약

일 양상에 있어서, 본 발명은 림프부종의 치료에 사용하기 위한 전장 CCBE1 및 VEGF-C의 조합에 관한 것이다.

다른 양상에 있어서, 본 발명은 전장 CCBE1 및 VEGF-C 조합을 그를 필요로 하는 환자에게 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 투여함으로써 림프부종을 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기한 양상들의 일부 구체예에 있어서, 상기 조합은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열, 서열번호 1의 35 내지 406 번 아미노산, 또는 이들과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 형태인 CCBE1을 포함한다.

일부 다른 구체예에 있어서, 상기 조합은 서열번호 2에 개시된 핵산 서열, 서열번호 2의 71 내지 1291 번 뉴클레오티드, 또는 이들과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 형태인 CCBE1을 포함한다.

일부 추가의 구체예에 있어서, 상기 조합은 서열번호 3의 32 내지 419 번 아미노산; 서열번호 3의 228 내지 419 번 아미노산에 공유적으로 연결된 32 내지 227 번 아미노산; 서열번호 3의 112 내지 227 번 아미노산; 서열번호 3의 103 내지 227 번 아미노산; 및 이들 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 형태인 VEGF-C를 포함한다.

일부 다른 구체예에 있어서, 상기 조합은 서열번호 4의 524 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 737 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 764 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 737 내지 1111 번 핵산; 서열번호 4의 764 내지 1111 번 핵산; 및 이들 핵산 서열과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 형태인 VEGF-C를 포함한다.

본 발명의 추가의 양상은 상기 서술한 구체예들 중 임의 것에 개시된 전장 CCBE1 및 VEGF-C 조합을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양상, 특정한 구체예, 목적, 상세사항, 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 실예시에 개시되어 있다.

본 발명은 전장의 콜라겐- 및 칼슘 결합 EGF 도메인 1 (collagen- and calcium-binding EGF domains 1: CCBE1) 단백질이 혈관 내피세포 성장 인자 C (vascular endothelial growth factor C: VEGF-C) 분비 및 VEGF-C의 완전한 활성화를 야기시켜서, 인비보에서 증가된 VEGF-C 수용체 신호전달, 림프관 신생 및 혈관 신생을 야기시키는 크게 불활성인 VEGF-C 전구체의 단백질분해적 절단을 촉진시킨다는 발견에 바탕을 두고 있다. 따라서, 본 발명은 림프 부종과 같은 기능이상적인 림프계와 연관된 다양한 질병에서 림프관 신생 및 혈관 신생을 조절하기 위한 치료적 수단인 CCBE1 및 VEGF-C의 조합을 제시한다.

CCBE1 및 VEGF-C의 치료적 사용은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, CCBE1 및 VEGF-C의 공동-투여는 유전자 치료, 단백질 치료, 또는 그의 임의의 적합한 조합에 의해서 달성할 수 있다. 즉, CCBE1 및 VEGF-C의 투여 경로와 방법은 독립적으로 선택될 수 있다. 게다가, CCBE1 및 VEGF-C의 공동-투여는 동시에, 별개로, 또는 순차적일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "또는(or)"은 문맥이 분명하게 다른 의미를 시사하지 않는 한, "또는(or)" 연산자(operator)를 포함하고 "및/또는(and/or)"의 의미와 동등하다. 게다가, 명세서에 걸쳐서, "a", "an", 및 "the"의 의미는 복수형을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 치료(gene therapy)"는 치료적으로 효과적인 양으로 이들을 발현할 수 있도록 CCBE1 또는 VEGF-C 폴리뉴클레오티드의 선택된 목표 세포나 조직으로의 전달을 의미한다. 본 발명에 따르면, 유전자 치료는 손상된 림프계를 가진 포유동물, 특히 인간에 있어 결함이 있는 유전자를 대체하거나, 치료적으로 효과적인 양으로 또는 치료적으로 유용한 때에 생산되지 못하는 유전자 산물을 보충하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, "단백질 치료(protein therapy)"는 치료가 필요한 손상된 림프계를 갖는 포유동물, 특히 인간에 있어 치료적으로 효과적인 양의 CCBE1 또는 VEGF-C 폴리펩티드를 투여하는 것을 의미한다. 여기서 용어 "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미하는 것으로 교환가능하게 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "치료적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)"은 손상된 림프계의 해로운 효과가 최소한 개선되는 CCBE1 또는 VEGF-C의 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "CCBE1"은 명확하게 다른 의미로 언급되지 않는 한, 전장 CCBE1 폴리펩티드 또는 상기 전장 CCBE1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 바람직하게는, CCBE1은 포유동물의 CCBE1이고, 바람직하게는 인간 CCBE1이다. 일부 구체예에서, 상기 전장 CCBE1 폴리펩티드는 서열번호 1에 묘사한 아미노산 서열, 바람직하게는 신호 펩티드가 없는 것을 포함한다. 짐작건대, 인간 CCBE1의 상기 신호 펩티드는 서열번호 1의 1 내지 34 번 아미노산으로 구성되나, 포유동물 세포에서 생산된 경우, 상기 신호 펩티드는 자동적으로 적절하게 절단되어 나간다. Bos et al. in Clinical Research 2011, 109: 486-491에 의해 개시된 것에 의한 CCBE1 폴리펩티드(CCBE1^Δcollagen-Fc)는 서열번호 1의 1 내지 191 번 아미노산을 코딩하는 상보적 DNA(cDNA)로부터 생산된 절단된 CCBE1 폴리펩티드 및 인간 IgG₁의 Fc 부분이라는 것은 주목할 만하다. 이러한 절단된 CCBE1은 EGF 및 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 CCBE1의 칼슘-결합 EGF 도메인로 이루어져 있으나, 콜라겐 반복 도메인은 없다.

이 분야에 숙련된 기술을 가진 사람에게 그의 생물학적 활성을 유지하는 한본 발명에 따라 사용된 CCBE1 폴리펩티드는 서열번호 1에 묘사된 폴리펩티드와 다를 수 있다는 것은 명백하다. CCBE1 변이체가 그의 생물학적 활성을 유지하는지 여부를 결정하는 예시적 방법은 이것의 전장 VEGF-C를 절단하는 능력을 결정하는 것이다. 이것은 예를 들어, 전장 VEGF-C를 발현하는 세포를 실험대상의 상기 CCBE1 변이체와 인큐베이션하고, VEGF-C 절단이 증가되는 경우 상기 CCBE1 변이체가 생물학적 활성을 유지하는지 결론지음으로써 수행될 수 있다. 상기 VEGF-C 절단은 이 분야에 잘 알려진 방법에 따라 물질 대사 표지 및 면역침강과 같은 단백질-특이적 침강에 의해서 결정될 수 있다. 필요에 따라 서열번호 1에 묘사되는 아미노산 서열을 가진 CCBE1가 양상 대조군으로 사용될 수도 있다.

일부 구체예에서, 상기 CCBE1 폴리펩티드는 서열번호 1의 보존성 서열 변이인 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드와 관련되어, 용어 "보존성 서열 변이" (conservative sequence variant)는 이 분야에 잘 알려진 비슷한 아미노산(예를 들어, 비슷한 사이즈나 비슷한 전하 특성을 가진 아미노산)에 의하고 및 대상이 되는 프로펩티드의 생물학적 특성을 유의하게 바꾸지 않는 아미노산 치환으로부터 발생하는, 아미노산 서열 변형을 의미한다. 아미노산 결실과 첨가 또한 고려된다. 또 다른 일부 구체예에서, 상기 CCBE1 폴리펩티드는 서열번호 1에서 묘사되는 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동등한 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 두 서열 사이에 두 서열의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는, 간격의 수, 및 각 간격의 길이를 고려한 %동일성(identity)은, 상기 서열에 의해서 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, %동일성 = 동일한 위치의 수/전체 위치의 수 x 100)이다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 %동일성의 결정은 이 분야에서 이용할 수 있는 수학적 알고리듬을 사용하여 달성될 수 있다. 이는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "CCBE1 폴리뉴클레오티드(CCBE1 polynucleotide)"는 CCBE1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단일 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 CCBE1 폴리뉴클레오티드는 5'-말단 및 3'-말단 비해독부위(5'- and 3' untranslated regions: UTRs)와 함께 서열번호 2에 나타낸 핵산 서열 또는 이들의 보존적 서열 변이를 포함한다. 몇가지 바람직한 구체예에서, 상기 CCBE1 폴리뉴클레오티드는 전장 CCBE1의 코딩 서열(coding sequence: CDS), 즉 서열번호 2의 핵산 서열의 71 내지 1291 번 핵산, 또는 이들의 보존성 서열 변이를 포함한다.

폴리뉴클레오티드와 관련되어, 용어 "보존성 서열 변이(conservative sequence variant)"는 상기 코딩된 폴리펩티드의 생물학적 특성을 유의하게 변화시키지 않는, 뉴클레오티드 서열 변형을 의미한다. 보존성 뉴클레오티드 서열 변이는 유전 암호의 퇴화 및 침묵 변이로부터 유래한 변이를 포함한다. 뉴클레오티드 치환, 결실 및 첨가 또한 고려된다. 따라서, 복수의 CCBE1 코딩 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 따라 치료적으로 사용될 임의의 CCBE1 폴리펩티드에 대해서 존재할 수 있다. 일부 추가 구체예에서, 상기 CCBE1 폴리뉴클레오티드는, 이들은 그의 생물학적 활성을 가진 CCBE1 폴리펩티드를 코딩하는 한 서열번호 2에서 묘사하는 핵산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF-C 폴리펩티드(VEGF-C polypeptide)"는 프레프로-VEGF-C, 부분적으로 가공된 VEGF-C, 및 완전히 가공된 성숙한 VEGF-C를 포함하는 VEGF-C의 임의의 알려진 형태를 의미한다. 이들의 생합성 중에, 상기 VEGF-C의 전장 형태(58kDa)가 첫번째로 C-말단에 단백질분해적 절단을 겪고, 이황결합을 통하여 함께 유지되는 29/31kDa의 중간 형태를 야기하고, 그리고 N-말단의 두개의 대체적인 위치에 절단이 일어나, 성숙되고 완전히 활성인 21kDa 또는 VEGF-C의 23kDa 형태를 생산한다. 이 과정은 대부분의 VEGF-C 단백질이 활성화되지 않기 때문에, 비효율적인 것으로 알려져있다. 그러나, 상기 성숙된 형태와 상기 29/31kDa의 중간 형태 사이의 림프관신생 잠재력 차이는 상당하다(Anisimov et al, 2009, Circulation Research 104:1302-1312).

일부 구체예에서, 본 발명에 따라 치료적으로 사용되는 상기 VEGF-C 폴리펩티드는 VEGF-C의 전장, 또는 프레프로 형태이다. 일부 추가의 비제한적인 구체예에서, 상기 프레프로-VEGF-C 폴리펩티드는 신호 서열이 없어서, 예를 들어 서열번호 3에 묘사되는 아미노산 서열의 32 내지 419 번 아미노산을 포함할 수 있다. 이 분야에 숙련된 사람이라면 신호 펩티다제(peptidase)를 위한 대체적인 절단 위치가 있다는 것과 이들의 활성에 영향을 미치지 않고서 다른 프로테아제가 VEGF-C의 N-말단을 가공할 수 있다는 것을 이해한다. 결과적으로, 상기 VEGF-C 폴리펩티드는 서열번호 3의 32 내지 419 번 아미노산을 포함하거나 그로 이루어지는 것과 다를 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 상기 VEGF-C 폴리펩티드는 서열번호 3에서 묘사되는 아미노산 서열의 228 내지 419 번 아미노산에 공유적으로 연결된 32 내지 227 번 아미노산을 포함하는 것과 같이, 부분적으로 가공된 VEGF-C 형태일 수 있다. 다시, 신호 펩티다제와 다른 프로테아제를 위한 대안적인 절단 위치 때문에, 상기 부분적으로 가공된 VEGF-C 폴리펩티드는 본 발명과 본 발명의 구체예들로부터 벗어나지 않으면서 상기에서 기술된 상기 비제한적 실시예의 조성과 다른 아미노산 조성을 가질 수 있다.

추가의 일부 구체예에서, 손상된 림프관 신생으로부터 고통받는 개체에게 투여될 상기 VEGF-C 폴리펩티드는 서열번호 3에서 묘사되는 아미노산 서열의 112 내지 227 번 또는 103 내지 227 번 아미노산을 포함하는 형태와 같은 완전히 가공된 것, 또는 성숙한 것이다. 게다가, 상기 VEGF-C 폴리펩티드는 다른 어떤 자연적으로 발생한 것 또는 조작된 형태일 수 있다. 필요에 따라, VEGF-C 폴리펩티드의 다른 형태가 임의의 조합으로 이용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 VEGF-C 폴리펩티드는 포유동물 VEGF-C 폴리펩티드이고, 보다 바람직하게는, 인간이다.

또한 본 명세서에서 설명된 VEGF-C 폴리펩티드의 임의의 것은 그의 생물학적 활성, 특히 VEGFR-2 및/또는 VEGFR-3에 결합하고 활성화하는 능력을 유지하는 한 그 아미노산 서열은 다를 수 있다는 것이 고려된다. 일부 구체예에서, 상기 VEGF-C 폴리펩티드는 본 명세서에서 설명된 임의의 VEGF-C 폴리펩티드의 보존성 서열 변이일 수 있고, 또는 서열번호 3에서 묘사되는 아미노산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 또는 이들의 임의의 생물학적으로 관련된 단편이 될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "VEGF-C 폴리뉴클레오티드(VEGF-C polynucleotide)"는 임의의 VEGF-C 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단일 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 상기 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 전장 VEGF-C를 코딩할 수 있고 서열번호 4에서 묘사되는 핵산 서열의 524 내지 1687 번 핵산을 포함하거나 그로 이루어지는 것일 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 상기 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 VEGF-C의 중간형태를 코딩할 수 있고, 서열번호 4에서 묘사되는 핵산 서열의 737 내지 1687 번 또는 764 내지 1687 번 핵산을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다. 추가의 일부 구체예에서, 상기 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 성숙한 형태의 VEGF-C를 코딩하고 서열번호 4에서 묘사되는 핵산서열의 737 내지 1111 번 또는 764 내지 1111 번 핵산을 포함하거나 이루어질 수 있다. 상술한 어떠한 구체예도 신호 펩티드 또는 종결 코돈을 코딩하는 서열을 포함하지 않으나, 일부 추가 구체예는 그러한 서열을 포함할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 성숙한 형태의 C-말단은 수용체 활성화 능력을 상실하지 않고 짧아질 수 있다.

상기 핵산 서열의 보존성 서열 변이 또한 고려된다. 따라서, 복수 VEGF-C를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 본 명세서에서 설명한 대로 치료적으로 사용될 수 있는 임의의 VEGF-C 폴리펩티드를 위해 존재한다.

일부 추가의 구체예에서, 상기 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 그의 생물학적 활성, 특히 VEGFR-2와 VEGFR-3에 결합하고 활성화시키는 능력을 유지하는 상기 VEGF-C 폴리펩티드를 코딩하는 한, 상기 상술한 VEGF-C 핵산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 명세서에 서술된 임의의 CCBE1 또는 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동하게 연결된 분비 신호 펩티드를 코딩하는 추가적인 N-말단 뉴클레오티드 서열 모티프를 포함한다. 상기 분비 신호 펩티드는 전형적으로 약 5 내지 30개 아미노산의 사슬을 포함하는데, 이는 상기 폴리펩티드의 소포체를 통한 세포 밖으로의 수송을 지시하고 상기 분비된 폴리펩티드로부터 잘린다. 적절한 신호 펩티드 서열은 CCBE1 또는 VEGF-C에 대한 천연서열, CD33, Ig 카파, 또는 IL-3와 같은 다른 분비된 단백질로부터 유래한 것, 및 합성된 신호 서열을 포함한다.

CCBE1 또는 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 또한 목표 세포에서 발현을 위한 적절한 프로모터 및/또는 엔핸서 서열을 포함할 수 있는데, 상기 서열은 상기 코딩된 서열의 상류에 작동가능하게 연결된다. 필요에 따라, 상기 프로모터는 유도 프로모터 또는 내피세포 특이 프로모터와 같이 세포타입 특이적 프로모터일 수 있다. 적절한 프로모터 및/또는 엔핸서 서열은 이 분야에서 쉽게 이용가능하고 EF1, CMV, 및 CAG에 한정되지 않는 것을 포함한다.

게다가, 상술한 임의의 CCBE1 또는 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열의 하류에 작동가능하게 연결된 적절한 아데닐화 서열을 포함할 수 있다.

유전자 치료에 대하여, 상술한 "네이키드(naked)" CCBE1 또는 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 재조합 DNA, 플라스미드, 또는 바이러스 벡터의 형태로 적용될 수 있다. 네이키드 폴리뉴클레오티드의 전달은 세포 막을 물리학적 또는 화학적으로 투과가능하게 하는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 방법은 이 분야에서 이용가능하고, 전기천공법(electroporation), 유전자 충격법(gene bombardment), 소노포레이션(sonoporation), 마그네토펙션(magnetofection), 리포펙션(lipofection), 리포좀 매개 핵산 전달, 및 이들 임의의 조합을 포함하나, 이들에 제한되지 않는다.

다른 구체예에서, CCBE1 또는 VEGF-C 폴리뉴클레오티드는 적절한 발현 조절 서열 하에 바이러스 벡터 내에 통합(incorporation)될 수 있다. 이러한 유전자 치료를 위한 적절한 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 및 아데노바이러스 벡터를 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 바이러스 벡터는 복제-결함 바이러스 벡터, 즉 포유동물 개체에서 복제할 수 없는 벡터이다. 그러한 복제-결함 바이러스 벡터의 비제한적으로 바람직한 예는 복제-결함 아데노바이러스이다. 적절한 바이러스 벡터는 이 분야에서 쉽게 이용가능하다.

치료적 CCBE1 또는 VEGF-C 폴리뉴클레오티드를 포유동물 개체, 바람직하게는 인간 개체에게 전달하는 것은 이 분야에 널리 알려진 다양한 방법에 의해서 달성될 수 있다. 예를 들어, CCBE1 또는 VEGF-C를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 예를 들어 기능을 제대로 못하는 림프관을 가진 목표 조직내로 주사에 의하여 치료되어질 개체의 몸체에 직접적으로 투여될 수 있다. 그러한 전달은 인비보에서 상기 폴리펩티드의 발현을 야기하여, 종종 인비보 유전자 치료로 언급된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 치료적 폴리펩티드의 전달은 바이러스 벡터 또는 네이키드 폴리펩티드의 사용에 의하여 엑스비보에 수행될 수 있다. 엑스비보 유전자 치료는 목표 세포에, 바람직하게는 치료될 개체로부터 얻어진 것에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 엑스비보로 형질주입하고 (또는 바이러스에 의하여 형질도입), 치료적 목적을 위한 상기 개체에 투여하는 것을 의미한다. 엑스비보 유전자 치료를 위한 적절한 목표 세포의 비제한적 예시로는, 내피세포, 내피 전구세포, 평활근, 백혈구, 및 특히 다양한 종류의 줄기세포를 포함한다.

유전자 치료에서, CCBE1 또는 VEGF-C 발현은 안정적 또는 일시적일 수 있다. 일시적인 발현이 종종 선호된다. 이 분야에 숙련된 사람이라면 안정적이거나 일시적인 유전자 치료를 언제, 및 어떻게 채택할지를 알 것이다.

본 발명에 따른 CCBE1 및 VEGF-C의 치료적 투여를 위한 양 및 투여계획(regimen)은 손상된 림프 맥관구조를 수반하는 질병 또는 증상 치료의 임상분야에 숙련된 사람에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일반적으로, 상기 CCBE1 또는 VEGF-C 치료의 용량은 치료될 환자의 나이, 성별, 및 건강상태; 있다면, 동시치료의 종류; 치료의 빈도와 원하는 효과의 태양; 조직 손상의 정도: 증상의 기간; 및 개별 의사에 의하여 조정될 다른 변수들과 같은 고려사항들에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 바이러스 벡터가 유전자 전달에 사용될 때, 상기 벡터는 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 중에 10⁷ 내지 10¹³ 바이러스 입자의 양으로, 바람직하게는 10⁹ 이상 바이러스 입자의 양으로 전형적으로 투여된다. 반면, 단백질 치료가 사용될 때는, 전형적인 용량은 0.01 내지 20 mg/kg 범위이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/kg, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/kg이다. 원하는 투여 용량(dosage)은 원하는 결과를 얻기 위해서 적절한 간격을 두고 하나 이상의 용량(dose)으로 더 많이 투여될 수 있다. 전형적인 비제한적 하루 용량은 약 50 mg/day에서 약 300 mg/day까지 변할 수 있다.

단백질 치료에 대하여, CCBE1 또는 VEGF-C는 표준적 재조합 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 필요한 폴리뉴클레오티드는 적절한 발현 벡터에 클론되고, 이 분야에서 잘 알려진 방법에 따른 호환될 수 있는 숙주에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주의 예는 박테리아 (예를 들어 대장균), 효모 (예를 들어 S. cerevisiae), 곤충 세포 (예를 들어 SF9 세포), 및 바람직하게는 포유동물 세포주를 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 히스티딘 태그(Hig-tags), 헤마글루틴 에피토프(hemagglutinin epitopes: HA-tags) 또는 글루타티온-S-트란스퍼라제(glutathione-S-transferase epitopes: GST-tags)와 같은 발현 태그는 CCBE1 또는 VEGF-C의 정제를 촉진하기 위하여 사용될 수 있다. 만약 발현 태그가 이용된다면, 필요로 하는 개체에게 투여되기 전에 잘라 내어야만 한다.

앞서 개시한 바와 같이, 본 발명의 치료적 방법과 사용은 손상된 림프 맥관구조를 수반하는 질병과 증상을 치료하는 것과 관련이 있다. 이러한 질병과 증상의 비제한적 예시는, 일차성 림프부종(예를 들어, 밀로이병, 메이지 림프부종, 및 만발성 림프부종), 이차성 림프부종, 및 지방부종과 같은 림프부종을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은 포유동물, 바람직하게는 사람 개체에게 손상된 림프계와 관련된 질병 또는 증상의 완전한 치료뿐 아니라 예방, 개선, 또는 완화를 포함하는 목적을 위하여 CCBE1 및 VEGF-C를 공동-투여하는 것을 의미한다. CCBE1 및 VEGF-C 공동-투여의 치료적 효과는 부종, 가려움, 불편감, 무기력, 또는 영향을 받은 조직의 기밀도와 같은 증상을 모니터링 함으로써 평가될 수 있다.

본 발명은 손상된 림프 맥관구조와 관련된 질병 및 증상 치료를 위한 치료법 및 사용 뿐 아니라, 그 치료법 및 치료적 사용에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 그러한 약학적 조성물은 CCBE1 및 VEGF-C 각각 또는 조합, 및 약학적으로 허용가능한 용매, 희석제, 보조제, 부형제, 또는 담체와 같은, 임의의 약학적으로 허용가능한 비히클(vehicle)을 포함한다. 예를 들어, 상기 약학적으로 허용가능한 비히클은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 주사 가능한 유기 에스테르와 같은, 멸균된 비-수성 담체일 수 있다. 적절한 수성 담체는 물, 염수, 인산 완충 염수, 및 링거 덱스트로스 용액(Ringer's dextrose solution)를 포함하나, 이들에 제한되지 않는다.

원하는 작용의 위치로의 효과적인 투여 용량(dosage)을 달성하기 위하여 다양한 투여 경로가 이 분야에 널리 알려진 바와 같이 사용될 수 있다. 따라서, 이 분야에 숙련된 사람에게 알려진 바와 같이, 비경구 전달(예를 들어, 정맥 주사), 장내 전달(예를 들어, 구강 투여), 국소 투여, 국부 투여(예를 들어, 진피 투여 또는 경피 투여)를 위한 적절한 투여 경로가 포함되나 이들에 제한되지 않는다.

상기 약학적 조성물은 농축된 형태 또는 요구시 재구성될 분말 형태로 제공될 수 있다. 동결건조하는 경우, 중합체(포비돈, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란), 당류(설탕, 포도당, 젖당), 아미노산(글리신, 아르기닌, 글루탐산) 및 알부민을 포함한 특정 동결보호제가 선호된다. 만약 재구성을 위한 용액이 포장에 더해진다면 이는 예를 들어 멸균된 물, 염화나트륨 용액, 또는 덱스트로스 또는 포도당 용액으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 약학적 제제를 제형화하기 위한 수단 및 방법은 이 분야의 숙련된 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 종래의 혼합법, 과립화, 용해화, 동결 건조 또는 유사한 과정에 의하여, 그 자체 알려져 있는 방식으로 제조될 수 있다. .

상술한 임의의 구체예와 특징(features)은 CCBE1 및 VEGF-C에 독립적으로 적용될 수 있으며, 임의의 필요한 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, CCBE1 및 VEGF-C 각각 또는 모두가 유전자 치료 또는 단백질 치료에 의하여 전달될 수 있다. CCBE1 또는 VEGF-C가 유전자 치료 및 단백질 치료 모두를 사용하여 투여될 수 있다는 것도 역시 고려된다.

이 분야 숙련된 사람에게, 기술이 진보하는 것에 따라 상기 발명적 개념은 다양한 방식으로 구현될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 본 발명 및 그 구체예는 아래에 기술된 실시예에 한정되지 않고 청구항의 범위 내에서 달라질 수 있다.

아래에서 첨부된 도면에 참조된 선호되는 구체예에 의하여 본 발명은 보다 자세하게 기술될 것이다.
도 1은 CCBE1 공동발현이 성숙한 완전히 활성인 VEGF-C로의 VEGF-C 단백질분해 가공을 증가시킨다는 것을 보여준다. 293T 세포는 CCBE1 단독(도 1A) 또는 VEGF-C+/-CCBE1(도 1D)에 의해 형질주입되었고, 방사성 아미노산과 함께 인큐베이션되었고, 배지 상층액과 세포 용해물은 V5 항체(IP: V5)와 가용성 VEGF-C 수용체(VEGFR-3/Fc)에 의한 침전 및 이어서 오토라디오그라피(autoradiography)에 의하여 분석되었다. 세포 안팎의 CCBE1이 모두 검출되며, CCBE1 분비는 콜라겐과는 다르게 세포 배양 배지에 아스코르브베이트 보충에 의존하지 않는다. 도 1B는 VEGF-C의 생합성 및 가공의 도식적 뷰를 보여준다. VEGF-C 전구체 및 다양한 가공된 형태의 도식적 구조를 보여준다 (Karpanen & Alitalo, 2008, Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 3: 367-397). 화살은 판넬 D에 상응하는 밴드를 가리킨다. 도 1D는 VEGFR-3/Fc에 의한 VEGF-C 침전물은 절단되지 않은, 부분적으로 절단된, 그리고 절단된 VEGF-C를 포함한다는 것을 보여준다. CCBE1과 공동-발현은 절단되지 않은 VEGF-C의 양을 줄어들게하고, 활성화된 VEGF-C의 양을 늘린다. 도 1C는 CCBE1및 VEGF-C를 모두 발현시키는 배양물의 상층액이 VEGF-C만 발현시키는 배양물의 상층액보다 Ba/F3-VEGFR-3/EpoR 세포의 성장을 촉진시키는데 보다 큰 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 P<0.05는 *, 그리고 P<0.001은 ***, n.s.는 통계적으로 유의한 차이가 없다는 것을 나타낸다; n=4.
도 2는 CCBE1이 VEGF-C 분비를 촉진한다는 것을 보여준다. 도 2A는 나타낸바와 같이 VEGF-C를 CCBE1과 함께 또는 없이 형질주입된 세포의 상층액과 세포 용해물로부터 VEGF-C 면역침강(immunoprecipitation)한 것을 나타낸다. 왼쪽에 표시되는 분자 무게는 주요한 VEGF-C 형태의 이동성을 보여준다. VEGF-C의 성숙한 21kDa 형태의 양이 상층액에서 증가하고(8배) 절단되지 않은 VEGF-C 및 29/31kDa 폴리펩티드의 양은 CCBE1을 공동형질주입함에 따라 (각각 74% 및 51% 만큼) 줄어들었다 (1, 2 와 3, 4 번 줄을 비교해 보라). VEGF-C의 N-말단의 절단으로부터 발생한 14kDa 단편은 공동형질주입된 세포의 상층액에서만 검출된다. CCBE-1과 공동형질주입된 세포의 세포 용해물에서 세포 내 VEGF-C 폴리펩티드가 80%만큼 줄어든 것과 같이 CCBE1과 공동형질주입은 VEGF-C의 분비를 촉진한다(5, 6 과 7, 8번 줄을 비교해 보라). 도 2B는 CCBE1 및 VEGF-C를 모두 발현시키는 배양물로부터 얻은 조건화 배지(conditioned media)는 쥐(m) 또는 인간(h)의 VEGFR-2/EcoR 키메라를 발현시키는 Ba/F3 세포의 성장을 촉진시키는데 있어 VEGF-C만 발현시키는 배양물로부터 얻은 상층액에서 보다 높은 활성을 갖는 것을 보여준다.
도 3은 콜라겐-도메인-절단된, Fc-융합 CCBE1은 VEGF-C의 VEGFR-3 자극 활성에 영향을 미치지 못하는 것을 보여준다. 잘린 CCBE1-Fc ("A") 또는 Fc 부분("B")으로만 구성되는 음성 대조군 단백질의 일정한 용량 (5ug/ml)의 존재하에 인간의 VEGF-C△N△C (성숙한 VEGF-C; 도 3A) 또는 전장 VEGF-C (VEGF-C의 전구체; 도 3B)의 농도를 증가시킴에 따라 hVEGFR-3/EpoR-Ba/F3 세포가 인큐베이션되었다. 세포는 총 3일간 자극 조건에서 배양되었다. 이 기간의 말미에서, 티아졸릴 블루 테트라졸리움 브로미드 (MTT, Sigma-Aldrich)가 세포 배양물에 첨가되고 각 배양물에 살아있는 세포의 양 (세포 증식의 직접적 점수)은 OD540 광학 밀도(노랑 MTT는 진한 파란색 물질을 생성하는 살아있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 줄어든다)에 의해 측정되었다.
도 4는 VEGF-C 절단이 트란스로 CCBE1을 발현시키는 세포에 의해서 증진된다는 것을 보여준다. 각각의 세포 집단은 VEGF-C 또는 CCBE1로 형질주입 된 후 지정된 대로 물질 대사 표지 기간동안 혼합되었다. CCBE1이 (공동)형질주입된 경우 상층액 중에 성숙한 VEGF-C (21kDa)의 양이 증가하고 전장 (58kDa) VEGF-C 또는 부분적으로 절단된 VEGF-C (29/31kDa)은 줄어드는 반면 (도 4A), 세포 용해물 중에 그 양은 변하지 않고 남은 것을 주목하라(도 4B). 또한 안정하게 형질주입된 293S GnTI 세포 (stably transfected 293S GnTI-cells)에 의해서 생산된 VEGF-C의 다른 당화 패턴으로부터 야기되는, 안정하게 형질주입된 세포와 일시적으로 형질주입된 세포 사이의 VEGF-C의 이동에 있어 작은 차이를 주목하라(Chaudhary et al, 2012, Nature Protocols 7: 453-466).
도 5는 CCBE1의 VEGF-C 절단-증진 활성이 배지로 분비되는 것 즉, CCBE1을 생산하는 293T 세포의 조건화 배지 상등액 중 가용성 성분이라는 것을 보여준다. 이는 상기 활성이 세포 표면이나 세포 외 기질에 제한되지 않고, 예를 들어 치료적으로, 가용성 단백질로서 투여될 수 있다는 것을 보여준다. 더욱이, 상기 절단-증진 활성은 10% FCS 첨가에 의해 저해되지 않거나, 유의하게 저해되지 않는다. 그러나, CCBE1의 모든 형태가 VEGF-C의 절단을 증가시키는 것은 아니다. 예를 들어 DU-4475에 의해 생산된 CCBE1는 VEGF-C의 절단을 증가시키지 않는다.
도 6은 CCBE1이 생체 내에서 림프관신생을 증가시키는 것을 보여준다. 쥐의 앞정강근 (tibialis anterior muscle)의 면역염색은 상기 지정된 인자를 코딩하는 AAV9에 의해서 형질도입하고 지정된 항원에 대하여 염색하였다. 림프관의 LYVE-1과 Prox-1 염색에 의하여 검출된 바와 같이 전장 VEGF-C 단독은 경미한 림프관신생 반응을 유도시킬 뿐이었으나, CCBE1과 함께 공동-형질도입된 경우 강한 반응을 야기시키는 것에 주목하라. 양성 대조군으로서, ΔNΔC-VEGF-C (완전히 가공된 것과 성숙한 VEGF-C의 등가물)를 코딩한 AAV9가 사용되었다. 혈장 알부민에 대한 반응은 CCBE1 단독의 반응과 비교될만하였다. 통계적으로 유의한 차이의 것으로 P<0.05는 *, P<0.01는 **, 및 P<0.001는 ***로 표시되고, n.s.는 통계적으로 유의한 차이가 없음을 나타낸다; n≥5.
도 7은 VEGF-C와 함께 CCBE1 공동-형질전환이 혈관신생을 자극하는 것을 보여준다. 앞정강근 중의 혈관내피세포 (PECAM-1), 및 평활근 세포(SMA)에 대한 면역조직화학. 염색된 구역의 정량은 오른쪽에 표시되어 있다. 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 P<0.05는 *, P<0.01는 **, 및 P<0.001는 ***로 표시된다; n≥5.
도 8은 CCBE1/ VEGF-C 공동-형질주입에 의한 CD45+ 백혈구의 모집을 보여준다. Prox1 전사 인자는 림프관 내피세포의 표시자(marker)로서 사용되었다. 분석은 도 7에 제시된 대로 하였다.
도 9는 상기 지정된 AAV9 벡터가 앞정강근에 주사된 쥐에서 VEGFR-3 루시퍼라제 리포터 신호를 보여준다. VEGF-C 및 CCBE1 공동-형질도입은 강한 림프관신생 반응을 나타내는 강한 루시퍼라제 신호를 야기하는 반면, 전장 VEGF-C 및 CCBE1은 오직 경미한 루시퍼라제 활성을 야기시키는 것에 주목하라.
도 10은 펄스-추적(pulse-chase)에서, 야생-타입 VEGF-C 분비가 2시간에 절정에 달하는 반면, C-말단 프로펩티드가 없는 VEGF-C(ΔC-VEGF-C) 돌연변이체는 이미 15분과 45분 사이에 절정에 도달한다.
도 11은 성장 인자 가공에 대한 VEGF-C의 N-말단 및 C-말단 프로펩티드의 영향을 보여준다. 여기서 C-말단 및 N-말단 프로펩티드와 경쟁에 의하여 VEGF-C의 성숙한 21kDa 형태 및 14kDa의 N-말단 프로펩티드의 양이 모두 감소한 것을 주목하라(도 11A). 도 11B는 CCBE1 공동형질주입의 존재 또는 부재하에 VEGF-D 및 VEGF-D/VEGF-C 키메라(CDC)의 단백질분해 가공을 보여준다. C-pp는 C-말단 프로펩티드; N-pp는 N-말단 프로펩티드; HSA는 인간 혈청 알부민; ΔNΔC는 성숙한 VEGF-C에 비교될만한 VEGF-C의 C-말단과 N-말단이 절단된 형태.

<실시예>

클로닝 (cloning).

재조합 아데노 관련 바이러스(recombinant adeno-associated virus: rAAV9) 벡터를 통해 발현될 유전자는 psubCAG-WPRE 플라스미드에 클로닝되는데(Paterna et al, 2000, Gene Therapy 7: 1304-1311), 이 플라스미드는 CMV 프로모터가 닭의 베타-액틴 프로모터, 시토메갈로바이러스 엔핸서(cytomegalovirus enhancer), 및 베타-액틴 인트론으로 구성되는 복합 CAG 프로모터로 대체된 psubCMV-WPRE의 유도체이다(Okabe et al, 1997, FEBS Letters 407: 313-319). 전장 mVEGF-C, ΔNΔC-mVEGF-C 및 HSA의 AAV 벡터(psubCAG-WPRE)로의 클로닝 방법은 종래에 알려져 있다(Anisimov et al, 2009, ibid.). V5 태그(mCCBE1-V5)에 융합된 mCCBE1은 다음과 같이 클로닝되었다: 부분적인 CCBE1을 코딩하는 DNA 서열(CDS; Genebank #BC152322, Image clone ID 40140631)은 SacI/XbaI 조각으로서 pVK1 (a pUC19-derived vector (Anisimov et al, 2007, Molecular Breeding 19: 241-253))에 클로닝되었다. 누락된 뉴클레오티드를 프라이머 5'-GCCGCTAGCGCCACCATGGTGCCGCCGCCT-3' (서열번호 5) 및 5'-GGAGCTTGGGCACAAATGTC-3' (서열번호 6)를 이용하여 갈색 지방조직 mRNA로부터 증폭시킨 후, 상기 CDS는 NheI/SacI 조각을 삽입함으로써 완성되어 pVK1-CCBE1 벡터를 얻었다. PCR로 증폭된 V5-태그(5'-ACCAGGAGCACCAGGAAGAC-3' (서열번호 7) 및 5'-GCCTCTAGAACGCGTCTAGGTGCTGTCCAGGCCCAGCAGAGGGTTAGGGATAGGCTTGCCTGGATAAAAATTTCTTGGGG-3' (서열번호 8) 프라이머에 의하여 얻어진 것)는 Eco81I/XbaI 조각으로서 상기 CDS에 부가되었다. 상기 얻어진 벡터로부터 완전한 CDS는 MluI 조각으로서 잘라내고 psubCAG-WPRE에 클로닝되었다.

인비트로 연구를 위하여, 쥐의 CCBE1 CDS가 인간 CCBE1 CDS (Genebank #NM_133459)에 의하여 치환된 동일한 벡터를 만들었으며, 공동-면역침전 연구를 위하여, StrepIII 태그 (Junttila et al, 2005, PROTEOMICS 5: 1199-1203)를 CCBE1 CDS 바로 다음(immediately following)에 삽입시켰다. VEGF-C 및 ΔC-VEGF-C 구조체를 위한 포유동물 발현 구조체는 이전에 기술되었다(Jooukov et al, 1997, ibid.). 키메라 VEGF-C/VEGF-D (CDC) 발현 구조체는 오버랩핑 PCR에 의하여 pMosaic 벡터에 조립되었다(Jeltsch et al, 2006, J. Biol. Chem. 281: 12187-12195). 상기 삽입물은 인간 VEGF-C의 Phe32-Ala111 및 Ser228-Ser419 아미노산 잔기 및 인간 VEGF-D의 Thr92 내지 Arg206의 개재잔기(intervening residues)를 코딩하는 서열을 포함한다.

S2 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 구조체는 pMT-Ex 벡터(pMT-BiP-V5His-C의 변형된 버전(Krpnen et al, 2006, The FASEB Journal 20: 1462-1472))을 채택하였고, N-말단 프로펩티드의 Phe32 내지 Ala111, C-말단 프로펩티드의 Ser228 내지 Ser419, 및 VEGF-C의 ΔNΔC 형태를 위한 Thr112 내지 Arg227 아미노산 잔기를 코딩하는 서열을 포함하며, 6개 히스티딘(hexahistidine) 태그를 코딩하는 서열이 이어진다.

rAAV 생산.

rAAV9 바이러스는 기술된 바와 같이, 세 개-플라스미드 형질주입(transfection) 방법으로 만들고, 불연속적 이오딕사놀(iodixanol) 구배를 이용한 초원심 분리법에 의하여 정제되었다(Anisimov et al, 2009, ibid.). AAV9의 혈청형을 생성하기 위해, p5E18-VP2/8 대신 혈청형-결정 헬퍼 플라스미드 (serotype-determining helper plasmid)인 p5E18-VP2/9를 이용하였다(Michelfelder et al, 2011, PLoS ONE 6: e23101).

단백질 발현 및 정제 .

S2 세포는 Effectene (Qiagen, Venlo, The Netherlands)을 이용하여 형질주입되었다. 안정한 세포 풀은 형질주입 후 이틀 뒤를 시작으로 400 ㎍/ml의 히그로마이신에 의하여 3주간 선택되었다. 단백질 생산을 위해, 상기 세포들은 현탁 배양액에 적응되었고 1 mM CuSO₄에 의하여 4-5일간 유도되었다. pH-조정된 조건화 상층액으로부터 Ni^{2 +}NTA 세파로스에 배치-결합시킨 후, 상기 Ni^{2 +}NTA 세파로스를 컬럼에 넣고, 20 mM 이미다졸로 씻고, 250 mM 이미다졸의 계단-구배(step-gradient)에 의하여 용출하였다. 상기 단백질은 러닝 버퍼(running buffer)로서 PBS를 이용하여 수퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200 column)상에서 크기에 따라 분리되었다.

세포배양 .

293T, 293S GnTI- 및 NIH-3T3 세포는 10% FCS의 D-MEM에서 성장되었다. PC-3 세포는 10% FCS의 Ham's F-12, DU-4475 세포는 20% FCS의 RPMI 1640, 그리고 S2 세포는 HyClone SFX-Insect (ThermoScientific, Rockford, IL) 또는 Insect-Xpress (Lonza Group, Basel, Switzerland)에서 성장되었다.

형질주입, 물질 대사 표지 및 단백질 분석.

293T 및 293S GnTI- 세포는, 상기 지정된 단백질을 코딩하는 발현 구조체에 의하여 (공동)형질주입되었다. 형질주입 후 24시간에, 세포를 [³⁵S]-시스테인/[³⁵S]-메티오닌 (PerkinElmer, Waltham, MA)으로 물질 대사 표지하고 48시간 후, 조건화된 세포 배양 배지와 세포 용해물을 수확하였다. 단시간 표지 실험을 위하여, 24시간 후 미리 수확하였다. 대안적으로, 웨스턴블럿을 위한 표지되지 않은 단백질을 생산하기 위하여, 세포의 배양 배지는 0.2% BSA의 D-MEM로 교체하였고, 48시간 후 상층액과 세포 용해물을 수확하였다.

면역 침전하기 전에, 시료들은 단백질 A 세파로스(다중클론 항체 및 토끼 항 혈청) 또는 단백질 G 세파로스(단일클론 항체)에 의하여 선택적으로 예비세척(preclearing)하였다. 항-VEGF-C 항혈청 (Baluk et al, 2005, J. Clin. Invest. 115: 247-257), 항-V5 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, #46-0705), 항-hCCBE1 항체 (Atlas Antibodies AB, Stockholm, Sweden, #HPA041374), 항-VEGF-D 항체 VD1 (Achen et al, 2000, Eur. J. Biochem. 267: 2505-2515) 또는 VEGFR-3/IgGFc 키메라 (Makinen et al, 2001, Nature Medicine 7: 199-205)가 면역 침전에 사용되었다.

시료들은 세척 후 4 내지 20 % SDS-PAGE에 의하여 해상(resolved)되었다. 오토라디오그라피를 하기 위하여, 겔을 말린 후 포스포이미저(phosphoimager) 플레이트 또는 X-ray 필름에 노출시켰다. 면역검출법을 하기 위하여, 단백질을 니트로셀룰로스에 이동시켰다. ECL과 조합된 항-VEGF-C 항혈청, 항-V5 항체 또는 항-hCCBE1 항체에 의하여 특이적 신호를 검출하였다. 오토라디오그라피와 웨스턴블럿의 정량은 ImageJ software (NIH, Bethesda, MD)를 이용하여 레이저 스캐너 해독 또는 스캔된 X-ray로부터 수행되었다.

Ba /F3- VEGFR / EpoR 분석법.

Ba/F3-hVEGFR-3/EpoR (Achen et al, 2000, ibid.)과 Ba/F3-mVEGFR-2/EpoR (Stacker et al, 1999b) 생물학적 분석은 실질적으로 기술된 바 대로, 조건화 세포 배양 배지에 의하여 수행되었다(Makinen et al, 2001, ibid.). Ba/F3-hVEGFR-2/EpoR 세포주는 상기 세포주와 비슷하게 생성되었으나, pCI-neo가 pEF-BOS 대신 사용되었다. 상기 키메라의 연결부의 아미노산 서열은 FFIIEGAQEKTNLEGS (VEGFR-2 부분의 말미) - (mEpoR 부분의 시작) LILTLSLILVLISLLLTVLALLSHRRTLQQKIWPGIPSPESEFE (각각, 서열번호 9 및 10)이었다. 이 키메라 구조체는 한 30 ms 1400V 펄스(Neon transfection device, Invitrogen)에 의하여 Ba/F3 세포로 전기천공되었다. 세포를 2 ng/ml의 mIL-3를 포함한 배지에 36 시간동안 성장시키고, 그 후 나누어, 1.2 mg/ml G418에 의하여 선택을 시작하여 3주간 선택되었다. 세포는 서브-최적(sub-optimal) mIL-3 농도 (0.4 ng/ml) 및 최적 VEGF-A 및 VEGF-C 농도 (각각, 200 및 300 ng/ml)에 의하여 유지되었다.

펄스 추적법

293T 세포를 형질주입하고 36 시간 동안 서로 접해질 때까지 6 cm 접시상에서 성장시켰다. 세포는 투석된 5 % FCS 및 met과 cys이 없는 D-MEM (met-/cys-deficient D-MEM) 중에서 30 분 굶긴 후에, 2시간 동안 [³⁵S]-시스테인/[³⁵S]-메티오닌으로 물질 대사 표지하였다. 이후 세포를 따뜻한 PBS로 씻은 후, 5 ml의 추적 배지(D-MEM, 10 % FCS + 2 mM cold L-methionine + 2 mM cold L-Cysteine)를 첨가하였다. 지정된 시점에 접시를 얼음에 놓아두고, 분석을 위하여 상기 배지를 제거하였다.

VEGF -C 프로펩티드에 대한 VEGF -C 절단의 경쟁.

정제된 히스티딘-태그 단백질을 25 ㎍/ml 농도에서 VEGF-C/CCBE1가 공동-형질주입된 293T 세포의 표지 배지 중에 포함시켰다. 상기 표지 배지는 형질주입 후, 30 내지 72 시간 조건화되었고, Ni^{2 +}NTA 세파로스로 히스티딘-태그에 의하여 히스티딘-태그 단백질로부터 없앤 후, VEGF-C는 면역침강시키고, PAGE로 분리시켜 X-ray 필름에 노출시킴으로써 가시화하였다. VEGF-C의 N-말단 절단의 억제는 레이저-스캐너 해독으로부터 14 kD의 N-말단 절단 산물을 정량함으로써 추정되었다.

스트렙 (strep)-태그 CCBE1의 공동- 면역침강 분석.

293T 세포를 CCBE1-strepIII 또는 전장 VEGF-C 구조체로 형질주입하였다. 조건화된 배지를 Strep-Tactin (Qiagen) 풀-다운(pull-down) 중에 별개로 또는 CCBE1 및 전장 VEGF-C의 혼합물(mix)로서 사용되었다. 혼합된 배지를 상기 풀-다운에 적용하기 전에 실온에 10 분간 인큐베이션 하였다. 침강물은 SDS-PAGE와 웨스턴블럿팅 후, 항-CCBE1 항체 및 항-VEGF-C 항혈청에 의하여 분석되었다. 투입은 전장 VEGF-C 조건화 배지 25㎕를 나타내고, 이는 양성 대조군으로 넣었다.

인비보 실험.

FVB/N 수컷 쥐의 앞정강근을 m(mouse)CCBE1-V5, 전장 mVEGF-C 또는 HSA를 코딩하는 rAAV9s의 1:1로 섞은 용액으로 주사하였다. AAV9-HSA와 AAV9-ΔNΔC-mVEGF-C 단일 벡터는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용되었다. 단일 주사된 용량 중 벡터 입자의 전체 농도는 6x10¹⁰이었다. 쥐에 형질도입하고 3주 후 CO₂ 과다 주입으로 희생시켰다. 앞정강근을 분리한 다음, O.C.T.에 고정한 후(Sakura Finetek Europe, Alphen aan den Rijn, The Netherlands), 절편화 하고 (10 ㎛ 두께) 림프관 (LYVE-1 및 Prox-1), 혈관 (PECAM-1), 및 평활근 세포/혈관주위 세포 (평활근 액틴(smooth muscle actin: SMA)) 및 백혈구 표지 (CD45)에 대하여 염색하고, 그 후 Alexa-접합 2차 항체 (Molecular Probes, Invitrogen)에 대하여 염색하였다. 형광 이미지는 Axioplan 2 현미경 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)에서 얻었다; 대물렌즈는 : 10x NA=0.3 WD 5.6 및 20x NA=0.5 WD 2.0; 카메라는 Zeiss AxioCamHRm 14-bit greyscale CCD; 획득 소프트웨어는 Zeiss AxioVision 4.6이었다. 염색된 구역의 정량은 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 이루어졌다. Prox-1 양성 핵은 직접 개수를 세었다. EGFP/Luc Vegfr3EGFP/Luc 쥐의 루시퍼라제 활성의 검출은 이전에 기술된 대로 수행하였다(Martanez-Corral et al, 2012, PNAS 109: 6223-6228). 남핀란드 주립 사무소의 동물 실험에 대한 국가 위원회(The National Board for Animal Experiments of the Provincial State Office of Southern Finland)는 이 연구에서 수행된 모든 동물 실험을 승인하였다.

통계적 분석

차이의 유의성은 일원변량분석(one way-ANOVA)을 이용하여 결정하였다. 같은 변이가 추정되는 경우, Tukey 테스트가 사후 검증(post-hoc test)으로서 사용되었다. 변이가 동일하지 않는 것으로 추정되는 경우, Games-Howell 테스트가 사후 검증으로서 사용되었다. Ba/F3 분석의 EC50은 로지스틱 회귀분석법(logistic regression)을 이용하여 계산되었다. 도면 중 오차 바(error bar)는 표준 편차를 의미한다.

<결과>

CCBE1은 증가된 VEGFR -3 활성을 야기시키는 , VEGF -C 가공 및 분비를 증진시킨다.

CCBE1은 CCBE1 발현 벡터로 형질주입된 293T 세포의 세포 용해물 및 조건화 배지 모두에서 40 내지 55 kDa의 분자량의 단백질로써 검출되었다(도 1A). 상층액에서, 상기 CCBE1의 부분이 잠정적 CCBE1 디머에 해당하는 분산된(diffuse), 당화된 밴드로서 이동하였다. 형질주입된 VEGF-C는 절단되지 않은 58 kDa 전구체, C-말단 가공된 29/31 kDa 및 완전히 가공된 21 kDa 성숙한 형태로서 발현되었다 (도 1D, 1번 줄). 그러나, VEGF-C 및 CCBE1이 공동형질주입 된 경우, 상기 절단되지 않은 VEGF-C 및 29/31 kDa 폴리펩티드의 양이 현격하게 줄어들었고 상기 성숙한, 완전히 활성화된 VEGF-C의 양이 주요한 종이 되었다(도 1D, 1 줄과 3 줄을 비교하라). 이들 결과는 CCBE1이 VEGF-C의 N-말단 및 C-말단 단백질분해적 가공 모두를 촉진시키는 것을 나타내었다.

세포 내 VEGF-C 형태에 대한 CCBE1 공동형질주입의 영향을 분석하기 위하여, 더 짧은 표지 기간을 사용하였다. 상기 공동형질주입한 세포의 세포 용해물 중에서 상기 세포내 양은 80%까지 감소되었기 때문에, CCBE1과 공동형질주입은 VEGF-C의 분비를 촉진하였다(도 2A, 5, 6 내지 7, 8 번 줄을 비교하라).

CCBE1/VEGF-C를 공동형질주입한 배양물로부터의 조건화 배지는 VEGF-C만 형질주입된 세포의 상층액보다 Ba/F3-VEGFR-3/EpoR 및 Ba/F3-VEGFR-2/EpoR 세포의 성장과 생존을 더 잘 자극시켰으나, CCBE1만은 매우 작은 활성을 보여주었다. 이는 상기 증가된 분비 및 절단이 배양물 내 활성인 VEGF-C 단백질의 증가된 수준을 야기하였다는 것을 확인해주었다(도 1C 및 도 2B). 특히, 짐작건대 세포에 의해서 생산된 내재적 VEGF-C의 증가된 가공 및 활성화 때문에, CCBE1 단독을 발현하는 세포의 상층액 또한 Ba/F3-VEGFR-3/EpoR 세포의 생존에서 약간의 증가를 야기시켰다.

절단된 CCBE1는 VEGF -C에 의해 자극된 VEGFR -3 활성을 증가시키지 못한다.

CCBE1은 종래 Bos et al. (2011, ibid.)에 알려진 대로 즉, 콜라겐-결합 도메인은 제거되도록 절단되었고 상기 CCBE1 분자 나머지는 더 좋은 단백질 안정성을 위하여 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합되었다. 상기 절단된 CCBE1은 균질하게 될 때까지 정제되었고 확립된 인비트로 시스템에서 정제된 전장 또는 성숙된 VEGF-C 단백질과 함께 테스트 되었다. 상기 실험은 아래와 같이 진행되었다. hVEGFR-3/EpoR-Ba/F3 세포는 절단된 CCBE1-Fc 또는 음성 대조군 단백질인 Fc 부분의 일정한 용량(5 ㎍/ml) 존재하 인간 VEGF-C△N△C (성숙된 VEGF-C) (도 3A) 또는 전장 VEGF-C (VEGF-C 전구체) (도 3B)의 농도를 증가시킴으로써 자극되었다. 세포는 총 3일간 자극 조건 중에 인큐베이션되었다. 이 기간의 말미에, 티아졸릴 블루 테트라졸리움 브로미드(MTT, Sigma-Aldrich)가 세포 배양물에 첨가되었고, 각 배양물 중에 살아있는 세포의 수(세포 증식의 직접적인 점수)는 OD450 광학 밀도(노랑 MTT는 짙은 파랑색 물질을 생산하는 살아있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해서 줄어든다)로 측정되었다. 이 결과는 절단된 CCBE1이 VEGF-C의 FGFR-3 자극 활성을 증가시키지 못한다는 것을 분명하게 보여준다.

CCBE1은 트란스로 VEGF -C 가공을 증가시킬 수 있다.

쥐의 배아와 제브라피시(zebrafish) 발생에서, CCBE1은 림프 구조 발생과 인접해서 발현되나, 내피세포 그 자체에 의하지 않는다(Hogan et al, 2009, Nature Genetics 41: 396-398). 따라서, 다른 세포에 의한 트란스로 CCBE1 생산이 VEGF-C 가공 또한 증진시킬 수 있는지를 결정하고자 하였다. 각각의 293T 세포의 배양물을 VEGF-C 또는 CCBE1으로 형질주입시켰고, 상기 세포 집단을 형질주입 24시간 후에 섞었다. 대안적으로, CCBE1-형질주입 세포를 안정적으로 VEGF-C를 발현하는 세포와 섞었다. 상기 공동-형질주입 실험에서처럼, CCBE1은 VEGF-C의 세포 외 가공 효율을 증가시켰다(도 4A). 대조적으로, VEGF-C의 세포 내 가공과 분비는 인접한 세포가 과량의 CCBE1를 생산하였을 때 영향을 받지 않았다(도 4B).

CCBE1은 인비보에서 VEGF-C의 림프관 신생 활성을 증가시킨다.

CCBE1이 인비보에서 림프관 신생을 증가시키는지 알아보기 위하여, 쥐의 앞정강근에 CCBE1를 발현시키는 AAV 벡터(AAV9-CCBE1) 단독, AAV9-VEGF-C 벡터와 함께 1:1 비율로, 또는 음성 대조군으로서 AAV9-인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HSA) 벡터로 형질도입하였다. VEGF-C의 활성화된 형태(△N△C-VEGF-C)를 코딩하는 AAV9는 VEGF-C의 완전히 단백질분해적으로 가공된 (성숙한) 형태를 모사하기 위하여 양성 대조군으로 이용되었다.

AAV 형질도입 2주 뒤, 골격근이 내피세포(PECAM-1), 림프 내피세포(LYVE-1, Prox1) 및 백혈구(CD45)에 대한 표지자들을 이용하여 면역조직화학에 의하여 분석되었다. 상기 분석에서, 비록 후자(“성숙한“ 형태)가 동일한 바이러스 용량에서 상당히 더 강한 반응을 보였을지라도, 전장 VEGF-C 및 △N△C-VEGF-C 모두 림프관 신생반응을 자극하고, 반면 오직 △N△C-VEGF-C 만이 혈관 신생을 자극하였다(도 6 및 도 7, 아랫줄). 이것은 전장 VEGF-C의 단백질분해적 가공이 상기 AAV9 형질도입된 근육 중에 비효율적이었음을 암시하였다.

그러나, 전장 VEGF-C가 CCBE1과 공동-형질도입 되었을 때, 림프관 신생이 LYVE-1 및 Prox-1 염색에 의해 보여지듯이, 상당히 증가되었다(도 6). 또한 CCBE1이 VEGF-C의 단백질분해적 가공을 인비보에서 또한 증가시킨다는 것을 나타내는, 훨씬 더 많은 혈관 신생이 관찰되었다(도 7). CD45+ 백혈구 수의 증가가 전장 VEGF-C/CCBE1의 공동-형질도입 후에 관찰되었는데, 이는 VEGF-C 활성화가 VEGFR-3를 통한 백혈구 모집 또한 증가시킨다는 것을 시사한다.

이러한 발견을 확증하고자, 인비보에서 광학 생체발광 이미지화(optical bioluminescent imaging)에 의하여 림프관 신생을 모니터링하기 위하여 AAV9-형질도입된 이형접합체 Vegfr3EGFP/Luc 쥐 (Martinez-Corral et al, 2012, ibid.)를 사용하였다. VEGF-C 및 CCBE1을 코딩하는 AAV로 공동-형질도입된 쥐에서 강한 루시퍼라제 신호가 검출된 반면, VEGF-C 또는 CCBE1만 단독으로 형질도입된 쥐에서는 더 약한 신호가 검출되었고, HSA로 형질도입된 쥐에서는 아무런 생체 발광 신호가 검출되지 않았다(도 9)

VEGF -C 프로펩티드는 CCBE1 매개된 단백질분해에 관여한다.

VEGF-C와 CCBE1의 물리적 상호작용을 증명하려는 우리의 시도는 성공적이지 않았다. 따라서 CCBE1-VEGF-C 상호작용은 약하고, 짧게 지속되고(short-lived) 아마도 간접적일 것으로 추정하였다. CCBE1-매개된 자극된 분비 및 절단에 관여하는 VEGF-C 중의 구조적 요소를 확인하려고 하였다. 펄스-추적 실험에서 야생-타입 VEGF-C와 C-말단 프로펩티드가 없는 VEGF-C 돌연변이체 사이에 분비 속도(secretion kinetics)를 비교하였을 때, 상기 표지된 VEGF-C 돌연변이체는 15분 내지 45분 사이에 이미 분비 절정에 도달한 반면, 야생-타입 VEGF-C는 2시간 후에나 분비 절정에 도달하였다(도 10). 이는 C-말단 프로펩티드가 그 분비 효율을 조절한다는 것을 시사하였다. 정제된 VEGF-C의 N-말단 또는 C-말단 프로펩티드 또는 VHD를 고농도를 첨가함으로써 VEGF-C의 CCBE1-증진된 가공을 저해하려 하였다. C-말단 프로펩티드에 의해 약 79%의 VEGF-C 가공 저해, 및 N-말단 프로펩티드에 의해 약 43% 저해가 관찰되었으나, VHD의 경우나 BSA 대조군은 상기 형질주입된 세포에 의해 생산된 단백질분해 단편의 비율을 바꾸지 못했는데(도 11A), 이는 VEGF-C 프로펩티드가 상기 CCBE1 매개된 절단에 관여한다는 것을 확인하여 주는 것이다. VEGF-D는 VEGF-C와 구조 및 단백질분해적 가공에서 매우 비슷할지라도(Leppanen et al, 2011, Blood 117: 15071515; Stacker et al, 1999a, J. Biol. Chem. 274: 3212732136), CCBE1 공동형질주입해도 인간의 전장 VEGF-D 또는 VEGF-D VHD가 VEGF-C의 N-말단 및 C-말단 프로펩티드 측면에 배치되는 키메라 인자의 단백질분해 가공을 촉진시키지 않았다 (도 11B, 3 내지 6번째 줄).

SEQUENCE LISTING <110> Laurantis Pharma Oy <120> THERAPEUTIC USE OF VEGF-C AND CCBE1 <130> 2122047PC <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Pro Pro Pro Pro Ser Arg Gly Gly Ala Ala Arg Gly Gln Leu 1 5 10 15 Gly Arg Ser Leu Gly Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly His Thr 20 25 30 Trp Thr Tyr Arg Glu Glu Pro Glu Asp Gly Asp Arg Glu Ile Cys Ser 35 40 45 Glu Ser Lys Ile Ala Thr Thr Lys Tyr Pro Cys Leu Lys Ser Ser Gly 50 55 60 Glu Leu Thr Thr Cys Tyr Arg Lys Lys Cys Cys Lys Gly Tyr Lys Phe 65 70 75 80 Val Leu Gly Gln Cys Ile Pro Glu Asp Tyr Asp Val Cys Ala Glu Ala 85 90 95 Pro Cys Glu Gln Gln Cys Thr Asp Asn Phe Gly Arg Val Leu Cys Thr 100 105 110 Cys Tyr Pro Gly Tyr Arg Tyr Asp Arg Glu Arg His Arg Lys Arg Glu 115 120 125 Lys Pro Tyr Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser Ser Asn Gly Thr 130 135 140 Leu Cys Ala His Ile Cys Ile Asn Thr Leu Gly Ser Tyr Arg Cys Glu 145 150 155 160 Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Arg Glu Asp Asp Gly Lys Thr Cys Thr Arg 165 170 175 Gly Asp Lys Tyr Pro Asn Asp Thr Gly His Glu Lys Ser Glu Asn Met 180 185 190 Val Lys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Thr Cys Lys Glu Phe Tyr Gln Met 195 200 205 Lys Gln Thr Val Leu Gln Leu Lys Gln Lys Ile Ala Leu Leu Pro Asn 210 215 220 Asn Ala Ala Asp Leu Gly Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Lys Val Leu Ala 225 230 235 240 Ser Asn Thr Tyr Leu Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Gly Gln Gly 245 250 255 Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Phe Pro Gly Met 260 265 270 Pro Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly Pro Arg Gly Ser Met Gly Pro Met 275 280 285 Gly Pro Ser Pro Asp Leu Ser His Ile Lys Gln Gly Arg Arg Gly Pro 290 295 300 Val Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Ser Lys Gly Glu Arg 305 310 315 320 Gly Ala Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ser Phe Asp 325 330 335 Phe Leu Leu Leu Met Leu Ala Asp Ile Arg Asn Asp Ile Thr Glu Leu 340 345 350 Gln Glu Lys Val Phe Gly His Arg Thr His Ser Ser Ala Glu Glu Phe 355 360 365 Pro Leu Pro Gln Glu Phe Pro Ser Tyr Pro Glu Ala Met Asp Leu Gly 370 375 380 Ser Gly Asp Asp His Pro Arg Arg Thr Glu Thr Arg Asp Leu Arg Ala 385 390 395 400 Pro Arg Asp Phe Tyr Pro 405 <210> 2 <211> 6276 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cggccgcgga ggagcaggac gcttggtccg gacggagctc ggcgctggga agaagccggg 60 agcttccctg atggtgccgc cgcctccgag ccggggagga gctgccaggg gccagctggg 120 caggagcctg ggtccgctgc tgctgctcct ggcgttggga cacacgtgga cctacagaga 180 ggagccggag gacggcgaca gagaaatctg ctcagagagc aaaatcgcga cgactaaata 240 cccgtgtctg aagtcttcag gcgagctcac cacatgctac aggaaaaagt gctgcaaagg 300 atataaattt gttcttggac aatgcatccc agaagattac gacgtttgtg ccgaggctcc 360 ctgtgaacag cagtgcacgg acaactttgg ccgagtgctg tgtacttgtt atccgggata 420 ccgatatgac cgggagagac accggaagcg ggagaagcca tactgtctgg atattgatga 480 gtgtgccagc agcaatggga cgctgtgtgc ccacatctgc atcaatacct tgggcagcta 540 ccgctgcgag tgccgggaag gctacatccg ggaagatgat gggaagacat gtaccagggg 600 agacaaatat cccaatgaca ctggccatga gaagtctgag aacatggtga aagccggaac 660 ttgctgtgcc acatgcaagg agttctacca gatgaagcag 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tcctccttct 4080 ctctgcaaaa ttcaacattc atgacagagg gccacaccaa ccacgggttt atagagagag 4140 gaactgaaca gctgttgatt cccatctgga atatatttaa tgtttgcctg cttgtggagc 4200 atggtattta aagggtgtgg atggatgaat gtttaaaaaa aaacacacaa aactatgcac 4260 aagctgtatg agagatggct aggtccatct atgatttttt ttaaaagaag aattttaata 4320 ccttttcttt gacagtgaac tgtatttaga aatatgatct ttattgtgaa atgctcataa 4380 aatgcaacca aactgcatgt ttggccatag gctagaataa tatattaaaa gaattaatgg 4440 aaagtagtat tgtctgggtt tcatgaaact attccagata atattctcca gcaaaactta 4500 tggtaacctg tattttataa tgtcaatctg ctggaccaag ttaatttaga aaataatttt 4560 taatcctcag attttcaaaa cttggactac tgcaagactg atatgtactt tttatgccca 4620 aatcatattt ttcaaagata ggacatcata aggcatcatt atttctaatg tatcttttaa 4680 ctagatagaa aaagctttac tgtctaaaca ggacttctgc tcaaaaccta atgggaaagc 4740 tatttctggg gtaagatttg taacagtgct tctaggtcat ttcatgtttt atagggaaaa 4800 agatctttgt acacctcctc aacctgttag tagaaatgtt gacttcgatt ttttgcaccc 4860 tcttcacagg acctcataag ttgcctctgt tcttggaaag caatgggaat aaaaatatgc 4920 tgttgaaaat agtgcatggg gccaggcaca gtggttatgc ctgtaatccc aacactttgg 4980 gaggctgagg cgggcgcatc atgaggtcag gagatcaaga ccatcctgac caacacgtgg 5040 tgaaacccca tctctactaa aataaataaa aaaaaaaatt agccaggcgt ggtggtgcac 5100 gcctgtagtc tcagctactc gggaagctga gacacaagaa ttgcttgaac ccgggaggtg 5160 gaggttgcag tgagccaaga ttgcgccact gcactccagc ctggctacag agtgagactc 5220 cgtctcgaaa aaagaaaata gtacatggag ggcatgcatt ttagtttagg aaacccccct 5280 cccttcccag ttccagaggg agaaattata agctatactg tgccaaaagt gagtggggct 5340 gcagagagaa tggtgccttt tctcaccttc tgagttaatg cccgacatct gccattggat 5400 tcattgacca aaggaagtca tttctactgt ataaactcag gagtatcata gcccaacaag 5460 taaataataa atgttcattg gttttggaag gaaggaaagg tgagtattac cccaccaaat 5520 accagcgaag agcaccctgg ctttggccat ctttccaagg ttcataattg ctgtgggcct 5580 ggtgagccct gttcccaggt atgcaaggga gggcttctcc aggccagaca tttctgtagg 5640 ttttcaggta gcaactcccc catcatattt tgggtgtcat tccccactct ctctccccac 5700 ttctcagcct gtgccccaga aacaaccaca gcagcctcat tctgcagact taacatctgt 5760 caaataacct tcctgaaaag gaaagttatt ggaggaatcc aggccaaaca acaagtagaa 5820 tagagccatc taaagttatt aataatgagt tcagggaaat agatgaattt tttcctggca 5880 tagtcaatat ttatatctca caacaagtca aaaataattt tccatttgga aaacaaaaca 5940 caccatgact gtaattgtta aggcatataa tcatgaactt cacatgctcc ctcaacaaac 6000 gttactgctc tagggaaatc atagaaaagg accctcttac tccccagggg atcaaagcaa 6060 gtccccttag gaatttcatg tgtgccgtgg gtctgttttt atttcacagt gactagtcat 6120 atactggagt agctctgttg ttcattattt gtaacaggtc catgtaacag tcaagttagc 6180 attcaagcaa ttatggatgt gatactatga tgtacttttg ttatgattgt atatgcttaa 6240 taacaaagtt atttttctta aaaaaaaaaa aaaaaa 6276 <210> 3 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe 20 25 30 Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala 35 40 45 Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser 50 55 60 Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala 100 105 110 His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys 115 120 125 Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe 130 135 140 Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr 145 150 155 160 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr 165 170 175 Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu 180 185 190 Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser 195 200 205 Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile 210 215 220 Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn 225 230 235 240 Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys 245 250 255 Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser 260 265 270 Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu 275 280 285 Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys 290 295 300 Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys 305 310 315 320 Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu 325 330 335 Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro 340 345 350 Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys 355 360 365 Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr 370 375 380 Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro 405 410 415 Gln Met Ser <210> 4 <211> 2076 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cggggaaggg gagggaggag ggggacgagg gctctggcgg gtttggaggg gctgaacatc 60 gcggggtgtt ctggtgtccc ccgccccgcc tctccaaaaa gctacaccga cgcggaccgc 120 ggcggcgtcc tccctcgccc tcgcttcacc tcgcgggctc cgaatgcggg gagctcggat 180 gtccggtttc ctgtgaggct tttacctgac acccgccgcc tttccccggc actggctggg 240 agggcgccct gcaaagttgg gaacgcggag ccccggaccc gctcccgccg cctccggctc 300 gcccaggggg ggtcgccggg aggagcccgg gggagaggga ccaggagggg cccgcggcct 360 cgcaggggcg cccgcgcccc cacccctgcc cccgccagcg gaccggtccc ccacccccgg 420 tccttccacc atgcacttgc tgggcttctt ctctgtggcg tgttctctgc tcgccgctgc 480 gctgctcccg ggtcctcgcg aggcgcccgc cgccgccgcc gccttcgagt ccggactcga 540 cctctcggac gcggagcccg acgcgggcga ggccacggct tatgcaagca aagatctgga 600 ggagcagtta cggtctgtgt ccagtgtaga tgaactcatg actgtactct acccagaata 660 ttggaaaatg tacaagtgtc agctaaggaa aggaggctgg caacataaca gagaacaggc 720 caacctcaac tcaaggacag aagagactat aaaatttgct gcagcacatt ataatacaga 780 gatcttgaaa agtattgata atgagtggag aaagactcaa tgcatgccac gggaggtgtg 840 tatagatgtg gggaaggagt ttggagtcgc gacaaacacc ttctttaaac ctccatgtgt 900 gtccgtctac agatgtgggg gttgctgcaa tagtgagggg ctgcagtgca tgaacaccag 960 cacgagctac ctcagcaaga cgttatttga aattacagtg cctctctctc aaggccccaa 1020 accagtaaca atcagttttg ccaatcacac ttcctgccga tgcatgtcta aactggatgt 1080 ttacagacaa gttcattcca ttattagacg ttccctgcca gcaacactac cacagtgtca 1140 ggcagcgaac aagacctgcc ccaccaatta catgtggaat aatcacatct gcagatgcct 1200 ggctcaggaa gattttatgt tttcctcgga tgctggagat gactcaacag atggattcca 1260 tgacatctgt ggaccaaaca aggagctgga tgaagagacc tgtcagtgtg tctgcagagc 1320 ggggcttcgg cctgccagct gtggacccca caaagaacta gacagaaact catgccagtg 1380 tgtctgtaaa aacaaactct tccccagcca atgtggggcc aaccgagaat ttgatgaaaa 1440 cacatgccag tgtgtatgta aaagaacctg ccccagaaat caacccctaa atcctggaaa 1500 atgtgcctgt gaatgtacag aaagtccaca gaaatgcttg ttaaaaggaa agaagttcca 1560 ccaccaaaca tgcagctgtt acagacggcc atgtacgaac cgccagaagg cttgtgagcc 1620 aggattttca tatagtgaag aagtgtgtcg ttgtgtccct tcatattgga aaagaccaca 1680 aatgagctaa gattgtactg ttttccagtt catcgatttt ctattatgga aaactgtgtt 1740 gccacagtag aactgtctgt gaacagagag acccttgtgg gtccatgcta acaaagacaa 1800 aagtctgtct ttcctgaacc atgtggataa ctttacagaa atggactgga gctcatctgc 1860 aaaaggcctc ttgtaaagac tggttttctg ccaatgacca aacagccaag attttcctct 1920 tgtgatttct ttaaaagaat gactatataa tttatttcca ctaaaaatat tgtttctgca 1980 ttcattttta tagcaacaac aattggtaaa actcactgtg atcaatattt ttatatcatg 2040 caaaatatgt ttaaaataaa atgaaaattg tattat 2076 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gccgctagcg ccaccatggt gccgccgcct 30 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggagcttggg cacaaatgtc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 accaggagca ccaggaagac 20 <210> 8 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcctctagaa cgcgtctagg tgctgtccag gcccagcaga gggttaggga taggcttgcc 60 tggataaaaa tttcttgggg 80 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Junctional amino acids of chimeric hVEGFR-3/EpoR (end of VEGFR-2 part) <400> 9 Phe Phe Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Junctional amino acids of chimeric hVEGFR-3/EpoR (start of mEpoR part) <400> 10 Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Thr Leu Gln Gln Lys Ile 20 25 30 Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro Glu Ser Glu Phe Glu 35 40

Claims (13)

1. 림프부종 치료에 사용하기 위한 전장 CCBE1 및 VEGF-C의 조합.
2. 청구항 1항에 있어서, 상기 CCBE1는 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열, 서열번호 1에 개시된 35 내지 406 번 아미노산, 또는 이들과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 형태인 것인 조합.
3. 청구항 1항에 있어서, 상기 CCBE1은 서열번호 2에 개시된 핵산 서열 또는 이와 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 형태인 것인 조합.
4. 청구항 1항에 있어서, 상기 VEGF-C는 서열번호 3의 32 내지 419 번 아미노산; 서열번호 3의 228 내지 419 번 아미노산에 공유적으로 연결된 32 내지 227 번 아미노산; 서열번호 3의 112 내지 227 번 아미노산; 서열번호 3의 103 내지 227 번 아미노산; 및 이들 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 형태인 것인 조합.
5. 청구항 1항에 있어서, 상기 VEGF-C는 서열번호 4의 524 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 737 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 764 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 737 내지 1111 번 핵산; 서열번호 4의 764 내지 1111 번 핵산; 및 이들 핵산 서열과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 형태인 것인 조합.
6. 청구항 1항에 있어서, 상기 림프부종은 일차성 림프부종, 밀로이병, 메이지 림프부종, 만발성 림프부종, 이차성 림프부종, 및 지방부종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조합.
7. 청구항 1항 내지 청구항 6항 중 어느 한 항에 정의된 조합, 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학적 조성물.
8. 전장 CCBE1 및 VEGF-C의 조합을 그를 필요로 하는 환자에게 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 투여함으로써 림프부종을 치료하는 방법.
9. 청구항 8항에 있어서, 상기 CCBE1은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열, 서열번호 1에 개시된 35 내지 405 번 아미노산, 또는 이들 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 형태인 것인 방법.
10. 청구항 8항에 있어서, 상기 CCBE1은 서열번호 2에 개시된 핵산 서열, 또는 이 핵산 서열과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 형태인 것인 방법.
11. 청구항 8항에 있어서, 상기 VEGF-C는 서열번호 3의 32 내지 419 번 아미노산; 서열번호 3의 228 내지 419 번 아미노산에 공유적으로 연결된 32 내지 227 번 아미노산; 서열번호 3의 112 내지 227 번 아미노산; 서열번호 3의 103 내지 227 번 아미노산; 및 이들 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 형태인 것인 방법.
12. 청구항 8항에 있어서, 상기 VEGF-C는 서열번호 4의 524 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 737 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 764 내지 1687 번 핵산; 서열번호 4의 737 내지 1111 번 핵산; 서열번호 4의 764 내지 1111 번 핵산; 및 이들 핵산 서열과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 형태인 것인 방법.
13. 청구항 8항에 있어서, 상기 림프부종은 일차성 림프부종, 밀로이병, 메이지 림프부종, 만발성 림프부종, 이차성 림프부종, 및 지방부종으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.

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