BR112020009920A2

BR112020009920A2 - Agonistas parciais de interleucina-2

Info

Publication number: BR112020009920A2
Application number: BR112020009920-1A
Authority: BR
Inventors: Kenan Christopher Garcia; Sonia S. MAJRI; Caleb R. GLASSMAN; Leon Lih-Reh Su
Original assignee: The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University
Priority date: 2017-11-21
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2020-12-15
Also published as: US20210269498A1; KR20200086722A; SG11202004581PA; JP2024079749A; IL274723A; EP3713592A1; AU2018372167B2; AU2018372167A1; RU2020120145A; MX2020005041A; JP7464278B2; US20200299349A1; EP3713592A4; CA3082904A1; AU2024200355A1; CN111615396A; WO2019104092A1; JP2021508252A

Abstract

a presente invenção refere-se a, entre outros, muteínas de interleucina-2 (il-2) humana ou suas variantes. em particular, são aqui fornecidas as muteínas de il-2 que têm uma capacidade de ligação reduzida para il-2r¿. tais muteínas de il-2 são úteis, por exemplo, como agonista parcial de il-2 em aplicações em que a redução ou inibição de uma ou mais funções de il-2 e/ou il-15 é útil (por exemplo, no tratamento de doenças ou condições autoimunes) também são fornecidos ácidos nucleicos que codificam essas muteínas de il-2, métodos para produzir essas muteínas de il-2, composições farmacêuticas que incluem essas muteínas de il-2, e métodos de tratamento utilizando essas composições farmacêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGONISTAS PARCIAIS DE INTERLEUCINA-2".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de Patente Provisória US Nº. 62/589.497, depositado em 21 de novembro de 2017. As descrições dos pedidos mencionados acima são aqui expressamente incorporadas por referência em sua totalidade, incluindo quaisquer desenhos.

DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL

[0002] A invenção foi feita com o apoio do governo sob R37 AI051321 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na presente invenção.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0003] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de sequências é fornecida como um arquivo intitulado "Sequence_Listing_078430-503001WO.txt", criado em 14 de novembro de 2018, com aproximadamente 32 KB de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de Sequências são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO

[0004] São aqui descritas, entre outras, as muteínas de interleucina- 2 que exibem as propriedades de agonismo parcial do sinal do receptor de IL-2, bem como métodos para usá-las no tratamento de doenças autoimunes.

ANTECEDENTE

[0005] A interleucina 2 (IL-2) é uma citocina pluripotente produzida principalmente por células T CD4+ ativadas, que desempenha um papel crucial na produção de uma resposta imune normal. A IL-2 promove a proliferação e expansão de linfócitos T ativados, potencializa o crescimento de células B, e ativa monócitos e células exterminadoras naturais.

[0006] Além de seu papel fisiológico na resposta imune normal, a IL-2 pode promover respostas patológicas, e um objetivo terapêutico é manter as ações desejadas dessa citocina enquanto bloqueia respostas autoimunes ou imunossupressoras indesejadas. Dois anticorpos monoclonais (mAbs) para IL-2Rα humana, Daclizumab e Basiliximab, são aprovados pela FDA e exibem eficácia na rejeição de transplante renal (Vincenti e outros, N Engl J Med 338: 161 (1998)), transplante cardíaco (Hershberger e outros, N Engl J Med 352: 2705 (2005)), esclerose múltipla (Gold e outros, Lancet 381: 2167 (2013)) e asma (Bielekova e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101: 8705 (2004); e Busse e outros, Am J Respir Crit Care Med 178: 1002 (2008)), mas não bloqueiam a sinalização de IL-2 por meio de receptores de IL-2Rγ de afinidade intermediária expressos em células NK e CD8+ de memória (Tkaczuk e outros, Am J. Transplant 2: 31 (2002)). Embora o IL-2Rβ mAb Mikβ1 anti-humano possa bloquear a transapresentação de IL-2 e IL-15 para células expressando receptores de IL-2Rγ (Morris e outros, Proc. Natl. Acad. Scad. Sci. USA 103: 401 (2006)), ele é relativamente ineficaz no bloqueio da sinalização cis por IL-2 ou IL-15 por meio de seus complexos receptores heterotriméricos de alta afinidade (Morris e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 401 (2006); e Waldmann e outros, Blood 121: 476 (2013)). Consequentemente, são necessárias novas muteínas de IL-2 que possam promover os efeitos terapeuticamente benéficos desta citocina, mas que também bloqueiem uma ou mais funções de IL-2 que estão associadas a respostas autoimunes ou imunossupressoras indesejadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A presente descrição refere-se geralmente ao campo da imunologia e medicina, incluindo composições e métodos para modular a via de transdução de sinal mediada pela interleucina 2 (IL-2) em um sujeito em necessidade de tratamento. Mais particularmente, em algumas modalidades, a descrição fornece novas muteínas de IL-2 com afinidade modulada para pelo menos um dos receptores de IL-2, por exemplo, receptor alfa de interleucina 2 (IL-2Rα), receptor beta de interleucina 2 (IL-2Rβ), receptor gama de interleucina-2 (IL-2Rγ). Algumas modalidades da descrição fornecem agonistas parciais de IL- 2 que não promovem a ativação de células imunes responsáveis por eventos autoimunes adversos indesejados, tal como inflamação. Algumas modalidades da descrição referem-se a composições e métodos úteis para a produção de tais muteínas de IL-2, bem como métodos para o tratamento de condições e distúrbios de saúde associados a perturbações da transdução de sinal mediadas pela via de sinalização de IL-2.

[0008] Em um aspecto, é fornecida uma muteína de interleucina 2 (IL-2) tendo: (a) afinidade de ligação reduzida para o receptor γ de interleucina 2 (IL-2Rγ) em comparação com um polipeptídeo IL-2 codificado pela SEQ ID Nº: 2; e (b) 15 a 95% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui: (i) uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a afinidade de ligação a IL-2Rβ em comparação ao polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionado a partir de L80F, R81D, L85V, I86V e I92F, numerado de acordo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 1; e/ou (ii) uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ e resultam em 15 a 95% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2, selecionado a partir de (A)

L18R e Q22E; e (B) a posição de aminoácido 126, numerado de acordo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácidos na posição 126 da SEQ ID Nº: 2 é selecionada a partir do grupo que consiste em Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S ou Q126T. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui a substituição de aminoácidos Q126H, Q126K ou Q126M. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui uma substituição de aminoácido Q126H.

[0009] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 é estruturalmente modificada para aumentar a meia-vida. Em algumas modalidades, a modificação inclui uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em fusão com um fragmento de anticorpo Fc humano, fusão com albumina, e PEGuilação. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 causa expansão das células Treg e não promove a expansão de células T potencialmente inflamatórias e células exterminadoras naturais (NK) ou granulócitos. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 induz menos proliferação de células T potencialmente inflamatórias em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 aumenta a proliferação de células Treg por pelo menos 3 vezes e/ou induz menos secreção de IFNγ em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, as células T potencialmente inflamatórias são células T CD4+ IFNγ+ ou células T CD8+ IFNγ+. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a muteína não induz a secreção de IFNγ das células T CD8+ e/ou outros subconjuntos de células imunes inflamatórias. Em algumas modalidades, a muteína tem 70 a 95% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1.

[0010] Em um aspecto, é aqui fornecida uma muteína de interleucina 2 (IL-2) tendo (a) afinidade de ligação reduzida para o receptor γ de interleucina 2 (IL-2Rγ); e (b) 15 a 95% de Emax em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a muteína inclui uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ e resultam em 15 a 95% de Emax em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionados a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui uma substituição de aminoácidos na posição 126 da SEQ ID Nº: 1 selecionada a partir do grupo que consiste em Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S ou Q126T.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui uma substituição de aminoácido Q126H, Q126K ou Q126M.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui uma substituição de aminoácido Q126H.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 é estruturalmente modificada para aumentar a meia-vida.

Em algumas modalidades, a modificação inclui uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em fusão com um fragmento de anticorpo Fc humano, fusão com albumina, e PEGuilação.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 da descrição aumenta a proliferação de células T reguladoras (Treg) e/ou induz a proliferação mínima de células T potencialmente inflamatórias.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 da descrição causa expansão das células Treg e não promove a expansão de células T potencialmente inflamatórias e células exterminadoras naturais (NK) ou granulócitos.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 induz menos proliferação de células T potencialmente inflamatórias em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, as células T potencialmente inflamatórias são células T CD4+ IFNγ+ ou são células T CD8+ IFNγ+. Em algumas modalidades, as células T potencialmente inflamatórias são células T CD4+ IFNγ+ ou são células T CD8+ IFNγ+. Em algumas modalidades, a muteína de IL- 2 aumenta a proliferação de células Treg em pelo menos 3 vezes e/ou induz menos secreção de IFNγ em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a muteína não induz a secreção de IFNγ a partir de células T CD8+ e/ou outros subconjuntos de células imunes inflamatórias. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 da descrição tem 70 a 95% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1.

[0011] Em aspectos adicionais, são aqui fornecidos (i) ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas, (ii) vetores incluindo os ácidos nucleicos, (iii) células hospedeiras incluindo os vetores ou ácidos nucleicos, e (iv) composições farmacêuticas estéreis incluindo qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas, e/ou qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores aqui descritos e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0012] Em aspectos adicionais, também são aqui fornecidos seringas e cateteres, incluindo uma seringa incluindo qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas, qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores aqui descritos e/ou qualquer das composições farmacêuticas aqui descritas.

[0013] Em ainda outros aspectos, são aqui fornecidos kits que incluem: (i) qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas, (ii) qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores aqui descritos, (iii) qualquer uma das seringas ou cateteres aqui descritos, e/ou qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas, bem como instruções escritas para o uso dos mesmos.

[0014] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para o tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade de tratamento, o método incluindo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de (i) qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas, (ii) qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores aqui descritos, e/ou (iii) qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas ao indivíduo. Em algumas modalidades, a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, diabetes mellitus dependente de insulina, anemias hemolíticas, febre reumática, tireoidite, doença de Crohn, miastenia grave, glomerulonefrite, hepatite autoimune, esclerose múltipla, alopecia areata, psoríase, vitiligo, epidermólise bolhosa distrófica, lúpus eritematoso sistêmico, e doença do enxerto contra hospedeiro. Em algumas modalidades, a doença autoimune é doença do enxerto contra hospedeiro. Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, o método inclui ainda administrar qualquer uma das muteínas de IL-2 ou composições farmacêuticas aqui descritas em combinação com um anticorpo que tem como alvo a muteína para um tipo de célula específico. Em algumas modalidades, o tipo de célula é uma célula T reguladora (Treg). Em algumas modalidades, o anticorpo é covalente ou não covalentemente ligado à muteína de IL-2.

[0015] Em outros aspectos, são aqui fornecidos métodos para produzir qualquer uma das muteínas aqui descritas, o método incluindo cultivar qualquer uma das células hospedeiras aqui descritas em condições adequadas para a produção da muteína. Em outras modalidades, o método inclui ainda isolar e/ou purificar a muteína. Em algumas modalidades, o método inclui ainda modificar estruturalmente a muteína para aumentar a meia-vida. Em outras modalidades, o método inclui ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em fusão com um fragmento de anticorpo Fc humano, fusão com albumina, e PEGuilação.

[0016] Também são aqui fornecidos, em alguns aspectos, métodos para impedir a proliferação de células T potencialmente inflamatórias e/ou impedir a secreção de IFNγ a partir de células T CD8+ ou outros subconjuntos de células imunes inflamatórias, os métodos incluindo colocar em contato uma célula que expressa um receptor γ de interleucina 2 (IL-2Rγ) com qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas. Em outras modalidades, as células T potencialmente inflamatórias são células T CD4+ CD44+ IFNγ+ ou são células T CD8+ CD44+ IFNγ+. Em algumas modalidades, o método é realizado in vitro, in vivo ou ex vivo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui descritas, a muteína de IL-2 é estruturalmente modificada para aumentar a meia-vida. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui descritas, a modificação é uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em fusão com um fragmento de anticorpo Fc humano, fusão com albumina, e PEGuilação.

[0017] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para diminuir a proliferação de células T reguladoras (Treg), incluindo colocar em contato uma célula Treg com uma muteína de interleucina 2 (IL-2) tendo: (i) afinidade de ligação reduzida ao receptor γ de interleucina 2 (IL-2Rγ) em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2; e (ii) 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui: (i) uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a afinidade de ligação a IL-2Rβ em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionado a partir de L80F, R81D, L85V, I86V e I92F, numerado de acordo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 1; e (ii) uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ e resultam em 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2,

selecionadas a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) a posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2.

[0018] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para diminuir a proliferação de células T reguladoras (Treg), incluindo colocar em contato uma célula Treg com uma muteína de IL-2 tendo: (i) afinidade de ligação reduzida para IL-2Rγ em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1; e (ii) 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ e resultam em 0 a 50% de Emax em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionadas a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácidos na posição 126 da SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2 é selecionada a partir do grupo que consiste em Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S ou Q126T. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui a substituição de aminoácidos Q126H, Q126K ou Q126M. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui uma substituição de aminoácido Q126H. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades descritas neste documento, o método inclui ainda administrar muteínas de IL2 com um anticorpo que tem como alvo a muteína para uma célula Treg. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui descritas, o anticorpo é covalente ou não covalentemente ligado à muteína. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades descritas neste documento, o método é realizado in vitro, in vivo ou ex vivo.

[0019] Cada um dos aspectos e modalidades descritos neste documento são capazes de serem usados juntos, a menos que excluídos explícita ou claramente do contexto da modalidade ou aspecto.

[0020] O sumário anterior é apenas ilustrativo e não pretende ser de forma alguma limitante. Além das modalidades e características ilustrativas descritas neste documento, outros aspectos, modalidades, objetivos e recursos da descrição se tornarão totalmente evidentes a partir dos desenhos e da descrição detalhada e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] A Figura 1 descreve as sequências de aminoácidos de IL-2 de ocorrência natural e muteínas construídas usando o background H9.

[0022] A Figura 2 descreve as sequências de aminoácidos de IL-2 de ocorrência natural e muteínas construídas usando o background de ocorrência natural.

[0023] A Figura 3 representa os resultados de um ensaio de sinalização fosfo-STAT5 com dose/resposta de variantes de IL-2. As células YT similares a NK humanas foram estimuladas por 15 min com várias variantes de IL-2 humanas fundidas à albumina sérica de camundongo (MSA) em diferentes concentrações, conforme indicado no gráfico (de 1 µM a 0 µM, diluição de 10 vezes). O eixo Y mostra a razão de sinal p-STAT5 de cada variante de IL-2 normalizada para o sinal p-STAT5 de WT IL-2 para cada concentração.

[0024] As Figuras 4A-B representam o curso do tempo para o ensaio de sinalização fosfo-STAT5. A Figura 4A representa os resultados de um ensaio de sinalização p-STAT5 em células YT estimuladas por 15 min com concentração indicada de agonistas parciais de IL-2. O eixo Y mostra a razão de sinal p-STAT5 de cada variante de IL-2 normalizada para sinal p-STAT5 de WT IL-2 para cada concentração. A Figura 4A mostra que as células YT foram estimuladas em vários momentos com 1 µM de diferentes variantes de IL-2, como indicado no gráfico. O eixo Y indica a intensidade de fluorescência média (MFI) para o sinal p-STAT5.

[0025] A Figura 5A representa o protocolo experimental para a administração de agonistas de IL2 em camundongos. A Figura 5B, a Figura 5C e a Figura 5D representam a frequência do subconjunto de células imunes indicado para cada condição normalizada para a respectiva frequência em camundongos tratados com PBS. As células B foram identificadas por células ativadas em CD3-CD19+. As células NK foram identificadas em CD3-NK1.1+. As células identificadas em Ly6g(Gr1)+ CD3+ CD11b+ foram definidas como granulócitos.

[0026] As Figuras 6A-B representam os resultados de um ensaio de sinalização fosfo-STAT5 com dose/resposta de variantes de IL-2. A Figura 6A representa células YT humanas similares a NK, enquanto a Figura 6B representa blastos (B) de células T de camundongo famintos estimulados por 15 min com várias variantes de IL-2 humanas fundidas à albumina sérica de camundongo (MSA) em diferentes concentrações, conforme indicado no gráfico (de 5 µM a 0 µM). O eixo Y mostra a razão de sinal p-STAT5 de cada variante de IL-2 normalizada para o sinal p- STAT5 de WT IL-2 para cada concentração.

[0027] As Figuras 7A-E representam os resultados da administração de variantes de IL-2 em um modelo de camundongo de melanoma B16. A Figura 7A mostra alterações no volume do tumor. A Figura 7B, a Figura 7C, a Figura 7D e a Figura 7E representam a frequência do subconjunto de células imunes indicado para cada condição normalizada para a respectiva frequência em camundongos WT.

[0028] As Figuras 8A-8G resumem graficamente os resultados de experimentos realizados para demonstrar que vários agonistas parciais de IL-2R exemplificativos podem provocar respostas específicas ao tipo de célula in vivo.

[0029] As Figuras 9A-9C resumem graficamente os resultados experimentais realizados para ilustrar que o agonista parcial de IL-2R REH aumenta a frequência de células T reguladoras FoxP3+.

[0030] A Figura 10 é um resumo gráfico dos resultados de experimentos realizados para demonstrar que Tregs de camundongos tratados com o agonista parcial de IL-2R REH suprimem a proliferação de células T convencionais CD4+.

[0031] A Figura 11 é um resumo gráfico dos resultados de experimentos realizados para ilustrar que o agonista parcial de IL-2R REH suporta a proliferação de células T CD8+, mas não a produção de IFNγ.

[0032] A Figura 12 é um resumo gráfico dos resultados dos experimentos realizados para demonstrar que o pré-tratamento e o co- tratamento do agonista parcial de IL-2R REH são protetores de vários sintomas autoimunes no modelo EAE de roedores (um modelo animal de inflamação cerebral). Os escores de doenças foram os seguintes: 0 - saudável; 1 - cauda mole; 2 - paralisia parcial dos membros posteriores; 3 - paralisia completa dos membros posteriores; 4 - paralisia do corpo inteiro; 5 - morte.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO

[0033] A presente descrição refere-se geralmente ao campo da imunologia e medicina, incluindo composições e métodos para modular a via de transdução de sinal mediada pela interleucina 2 (IL-2) em um sujeito em necessidade de tratamento. Mais particularmente, em algumas modalidades, a descrição fornece novas muteínas de IL-2 com afinidade modulada para pelo menos um dos receptores de IL-2, por exemplo, receptor alfa de interleucina 2 (IL-2Rα), receptor beta de interleucina 2 (IL-2Rβ), receptor gama de interleucina-2 (IL-2Rγ), pelo qual antagoniza completa ou parcialmente a transdução de sinal à jusante mediada pelos respectivos receptores IL-2Rα, IL-2Rβ e/ou IL-

2Rγ. Algumas modalidades da descrição fornecem agonistas parciais de IL-2 que não promovem a ativação de células imunes responsáveis por eventos autoimunes adversos indesejados, tal como inflamação. Algumas modalidades da descrição referem-se a composições e métodos úteis para a produção de tais muteínas de IL-2, bem como métodos para o tratamento de condições e distúrbios de saúde associados a perturbações da transdução de sinal mediada pela via de sinalização de IL-2.

[0034] A IL-2 exerce um amplo espectro de efeitos no sistema imunológico e desempenha papéis cruciais na regulação da ativação imune e da homeostase. Como um estimulador do sistema imunológico, a IL-2 encontrou uso no tratamento de câncer e infecções virais crônicas. No entanto, os efeitos estimuladores de IL-2 também podem causar estragos, mediando autoimunidade e rejeição de transplantes. Devido ao seu papel instrumental na regulação imune e na doença, a identificação de novas moléculas de IL-2, tal como os agonistas parciais de IL-2, continua sendo uma área ativa de pesquisa.

[0035] Na maioria das circunstâncias, a IL-2 funciona através de três receptores diferentes: IL-2Rα, IL-2Rβ e IL-2Rγ. A maioria das células, tal como as células T em repouso, não responde à IL-2, pois expressa apenas IL-2Rβ e IL-2Rγ, que têm baixa afinidade para IL-2. Após estimulação, as células T em repouso expressam afinidade relativamente alta para IL-2Rα. A ligação de IL-2 a IL-2Rα faz com que este receptor ative sequencialmente IL-2Rβ e IL-2Rγ, provocando a ativação das células T.

[0036] A descrição aqui descrita fornece, entre outros, novas composições de IL-2 que são baseadas em novas ideias sobre como a IL-2 interage com seus receptores cognatos, em particular, IL-2Rγ. Os inventores descobriram surpreendentemente que mutações no sítio de ligação de IL-2 para IL-2Rγ resultam em agonistas parciais capazes de ativar células T reguladoras (Tregs). Além disso, esses agonistas parciais de IL-2 não ativam células T CD8+ e outros subconjuntos de células imunes potencialmente inflamatórias e não induzem células inflamatórias a secretar interferon-gama (IFNγ). Como tal, essas moléculas podem ser usadas para tratar distúrbios e condições autoimunes. I. TÉCNICAS GERAIS

[0037] A prática da presente descrição empregará, a menos que seja indicado o contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, biologia celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos, e imunologia, que são bem conhecidas dos versados na técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, quarta edição (Sambrook e outros, 2012) e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição (Sambrook e Russel, 2001), (conjuntamente chamadas aqui de "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel e outros, Eds., 1987, incluindo suplementos até 2014); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis e outros, Eds., 1994); Beaucage e outros eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, 2000 (incluindo suplementos até 2014), Gene Transfer and Expresssion in Mammalian Cells (Makrides, ed., Elsevier Sciences BV, Amsterdã, 2003), e Current Protocols in Immunology (Horgan K e S. Shaw (1994) (incluindo suplementos até 2014). Como apropriado, procedimentos envolvendo o uso de kits e reagentes comercialmente disponíveis são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, a menos que indicado de outra forma. II. DEFINIÇÃO

[0038] A menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outros termos ou terminologia científica usados neste documento têm o significado comumente entendido pelos versados na técnica a que esta descrição se refere. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são aqui definidos para maior clareza e/ou referência imediata, e a inclusão de tais definições aqui não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido na técnica. Muitas das técnicas e procedimentos aqui descritos ou referenciados são bem entendidos e comumente empregues usando a metodologia convencional pelos versados na técnica.

[0039] A forma singular "um", "uma" e "o", "a" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma ou mais células, incluindo misturas das mesmas. "A e/ou B" é usado aqui para incluir todas as seguintes alternativas: "A", "B", "A ou B" e "A e B".

[0040] O termo "cerca de", como usado aqui, tem seu significado comum de aproximadamente. Se o grau de aproximação não estiver claro do contexto, "cerca de" significa dentro de mais ou menos 10% do valor fornecido, ou arredondado para o valor significativo mais próximo, em todos os casos, inclusive do valor fornecido. Quando faixas são fornecidas, elas incluem os valores limites.

[0041] Como usado aqui, o termo "IL-2" significa IL-2 de ocorrência natural, nativo ou recombinante. Como tal, um polipeptídeo IL-2 refere- se a qualquer polipeptídeo IL-2, incluindo, mas não limitado a, um polipeptídeo IL-2 produzido recombinante, polipeptídeo IL-2 produzido sinteticamente, IL-2 extraído de células ou tecidos. A IL-2 humana madura ocorre como uma sequência de 133 aminoácidos (menos o peptídeo sinal, consistindo de mais 20 aminoácidos N terminais), como descrito por Fujita, e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7437 a 7441 (1983). A sequência de aminoácidos de IL-2 humana (SEQ ID Nº: 17) é encontrada no Genbank sob o localizador de acesso NP_000577.2. A sequência de aminoácidos de IL-2 humana madura é representada na SEQ ID Nº: 1. A sequência de aminoácidos de IL-2 de murino (Mus musculus) é encontrada no Genbank sob o localizador de acesso (SEQ ID Nº: 18). A sequência de aminoácidos de IL-2 murina madura está representada na SEQ ID Nº: 19.

[0042] Como usado aqui, "muteína de IL-2" significa um polipeptídeo IL-2 em que foram feitas substituições específicas à proteína interleucina-2. As muteínas de IL-2 são caracterizadas por inserções, deleções, substituições e modificações de aminoácidos em um ou mais sítios nos outros resíduos da cadeia polipeptídica de IL-2 nativa. De acordo com esta descrição, essas inserções, deleções, substituições e modificações resultam em uma muteína de IL-2 que retém a atividade de ligação a IL-2R. Por exemplo, as muteínas aqui descritas podem ter alta ou baixa afinidade para IL-2Rα e/ou IL-2Rβ ou podem ter uma afinidade para esses receptores idêntica ou semelhante a de IL-2 de ocorrência natural. Muteínas exemplificativas podem incluir substituições de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos. As muteínas também podem incluir modificações e substituições conservativas em outras posições de IL-2 (isto é, aquelas que têm um efeito mínimo na estrutura secundária ou terciária da muteína). Tais substituições conservadoras incluem as descritas por Dayhoff em The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), e por Argos em EMBO J, 8: 779 a 785 (1989). Por exemplo, os aminoácidos pertencentes a um dos seguintes grupos representam alterações conservativas: Grupo I: Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; Grupo II: Cys, Ser, Tyr, Thr; Grupo III: Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; Grupo IV: Lys, Arg, His; Grupo V: Phe, Tyr, Trp, His; e Grupo VI: Asp, Glu.

[0043] A frase "numerada de acordo com" significa identificar um aminoácido escolhido com referência à posição em que esse aminoácido ocorre normalmente em uma determinada sequência de aminoácidos, tal como, por exemplo, a sequência de aminoácidos de IL- 2 de ocorrência natural. Por exemplo, R81 refere-se ao octogésimo primeiro aminoácido, arginina, que ocorre em SEQ ID Nº: 1.

[0044] O termo "identidade", como usado aqui em referência a sequências polipeptídicas ou de DNA, refere-se à identidade de sequência de subunidade entre duas moléculas. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica (isto é, o mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo), então as moléculas são idênticas nessa posição. A similaridade entre duas sequências de aminoácidos ou duas sequências de nucleotídeos é uma função direta do número de posições idênticas. Em geral, as sequências são alinhadas para que seja obtida a correspondência de ordem mais alta. Se necessário, a identidade pode ser calculada usando técnicas publicadas e programas de computador amplamente disponíveis, tal como o pacote de programas GCS (Devereux e outros, Nucleic Acids Res. 12: 387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul e outros, J. Molecular Biol. 215: 403, 1990). A identidade de sequência pode ser medida usando um software de análise de sequência, tal como o Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group no Centro de Biotecnologia da Universidade de Wisconsin (1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705), com os seus parâmetros padrão.

[0045] Como usado aqui, os termos "proteína" e "polipeptídeo" se referem a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a um comprimento mínimo do produto. Assim, polipeptídeos, peptídeos, fragmentos de polipeptídeos, polipeptídeos de fusão, oligopeptídeos e similares estão incluídos na definição. Tanto as proteínas de comprimento total quanto os seus fragmentos estão abrangidas pela definição. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação e similares. Além disso, para os propósitos da presente descrição, um "polipeptídeo" refere-se a uma proteína que inclui modificações, tal como deleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa), na sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Essas modificações podem ser deliberadas, como por meio de mutagênese sítio-direcionada, ou podem ser acidentais, tal como por meio de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR. Assim, o termo "polipeptídeo IL-2" refere- se a sequências nativas de IL-2, bem como a análogos de IL-2, muteínas e fragmentos de IL-2, a menos que excluídos explícita ou claramente do contexto da modalidade ou aspecto.

[0046] Como usado aqui, "células T potencialmente inflamatórias" ou "subconjuntos de células imunes inflamatórias" refere-se a uma ou mais células T que produzem, secretam ou são capazes de produzir ou secretar interferon gama. Em algumas modalidades, as células T potencialmente inflamatórias expressam CD44 em sua superfície celular e produzem ou secretam interferon gama. Em outras modalidades, as células T potencialmente inflamatórias expressam CD44 e CD4 em sua superfície celular e produzem ou secretam interferon gama. Em outras modalidades, as células T potencialmente inflamatórias expressam CD44 e CD8 em sua superfície celular e produzem ou secretam interferon gama. Em ainda outras modalidades, as células T potencialmente inflamatórias expressam CD4 e CD8 em sua superfície celular e produzem ou secretam interferon gama.

[0047] Como usado aqui, "células T reguladoras" ou "células Treg" se refere a células T (linfócitos T) que regulam a atividade de outras células T e/ou outras células imunes, geralmente suprimindo sua atividade. Em algumas modalidades, as células Treg são células CD4+ e FoxP3+ (mas será apreciado por versados na técnica que as células Treg não estão totalmente restritas a esse fenótipo).

[0048] "Emax", como referido neste documento, é o sinal p-STAT5 máximo que pode ser gerado por muteínas de IL-2 medidas em uma concentração mais alta. O Emax de WT IL-2 é usado como uma referência para calcular uma razão do sinal p-STAT5 a partir das muteínas de IL-2 normalizadas para o sinal p-STAT5 a partir de WT IL- 2 na concentração mais alta.

[0049] Um "agonista" é um composto que interage com um alvo para causar ou promover um aumento na ativação do alvo.

[0050] Um "agonista parcial" é um composto que interage com o mesmo alvo que um agonista, mas não produz uma magnitude tão grande de um efeito bioquímico e/ou fisiológico quanto o agonista, mesmo aumentando a dosagem do agonista parcial.

[0051] Um "superagonista" é um tipo de agonista que é capaz de produzir uma resposta máxima maior do que o agonista endógeno para o receptor alvo e, portanto, tem uma eficácia de mais de 100%.

[0052] Um "antagonista" é um composto que se opõe às ações de um agonista, por exemplo, prevenindo, reduzindo, inibindo ou neutralizando a atividade de um agonista. Um "antagonista" também pode prevenir, inibir ou reduzir a atividade constitutiva de um alvo, por exemplo, um receptor alvo, mesmo quando não há agonista identificado.

[0053] "Operacionalmente ligado" pretende significar que a sequência nucleotídica de interesse (isto é, uma sequência que codifica uma muteína de IL-2) está ligada à(s) sequência(s) reguladora(s) de uma maneira que permita a expressão da sequência nucleotídica (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). "Sequências reguladoras" incluem promotores, potenciadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Ver, por exemplo, Goeddel (1990) em Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol. 185 (Academic Press, San

Diego, Califórnia). As sequências reguladoras incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência nucleotídica em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem a expressão da sequência nucleotídica apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras específicas de tecido). Será apreciado pelos versados na técnica que o modelo do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, e similares. Os construtos de expressão da presente descrição podem ser introduzidos nas células hospedeiras para produzir assim as muteínas de IL-2 humanas aqui descritas ou para produzir variantes biologicamente ativas das mesmas.

[0054] Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados aqui de forma intercambiável. Entende-se que tais termos se referem não apenas à célula em questão, mas também à progênie ou potencial progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, essa progênie pode não ser de fato idêntica à célula de origem, mas ainda está incluída no escopo do termo como usado aqui.

[0055] O termo "vetor" é usado aqui para se referir a uma molécula ou sequência de ácido nucleico capaz de transferir ou transportar outra molécula de ácido nucleico. O ácido nucleico transferido é geralmente ligado, por exemplo, inserido na molécula de ácido nucleico do vetor. Um vetor pode incluir sequências que dirigem a replicação autônoma em uma célula, ou pode incluir sequências suficientes para permitir a integração no DNA da célula hospedeira. Os vetores úteis incluem, por exemplo, plasmídeos (por exemplo, plasmídeos de DNA ou plasmídeos de RNA), transposons, cosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos, e vetores virais. Os vetores virais úteis incluem, por exemplo, retrovírus e lentivírus com defeito de replicação. Em um aspecto, um vetor é um vetor de entrega de genes. Em um aspecto, um vetor é usado como um veículo de entrega de genes para transferir um gene para uma célula.

[0056] Como usado aqui, os termos "transformação" e "transfecção" se referem a uma variedade de técnicas reconhecidas para introduzir ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo coprecipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, bombardeamento de partículas, ou eletroporação.

[0057] Como usado aqui, um "sujeito" ou "indivíduo" ou "paciente" inclui animais, tal como humanos (por exemplo, seres humanos) e animais não humanos. O termo "animais não humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos, por exemplo, roedores, por exemplo, camundongos, e não mamíferos, tal como primatas não humanos, por exemplo, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

[0058] Como usado aqui, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui, mas não está limitado a, solução salina, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção, e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Compostos ativos suplementares (por exemplo, antibióticos) também podem ser incorporados nas composições.

[0059] Entende-se que os aspectos e as modalidades da descrição aqui descrita incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo essencialmente de" aspectos e modalidades.

[0060] Como será entendido por um versado na técnica, para todo e qualquer objetivo, tal como em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas descritas neste documento também abrangem todas e quaisquer possíveis subfaixas e combinações de subfaixas das mesmas. Qualquer faixa listado pode ser facilmente reconhecida como descrevendo suficientemente e permitindo que a mesma faixa seja dividida em pelo menos metades iguais, terços, quartos, quintos, décimos, etc. Como um exemplo não limitante, cada faixa discutida aqui pode ser facilmente dividida em um terço inferior, um terço médio e um terço superior, etc. Como também será entendido por um versado na técnica, toda a linguagem tal como "até", "pelo menos", "maior do que", "menor do que" e similares inclui o número citado e refere-se a faixas que podem ser posteriormente divididas em subfaixas, conforme discutido acima. Finalmente, como será entendido por um versado na técnica, uma faixa inclui cada elemento individual. Assim, por exemplo, um grupo tendo 1 a 3 artigos refere-se a grupos tendo 1, 2 ou 3 artigos. Da mesma forma, um grupo tendo 1 a 5 artigos refere-se a grupos com 1, 2, 3, 4 ou 5 artigos, e assim por diante.

[0061] Os tópicos, por exemplo, (a), (b), (i) etc., são apresentados apenas para facilitar a leitura da especificação e reivindicações. O uso de tópicos nas especificações ou reivindicações não exige que as etapas ou elementos sejam executados em ordem alfabética ou numérica ou na ordem em que são apresentados. III. COMPOSIÇÕES DA DESCRIÇÃO

[0062] Alguns aspectos da descrição referem-se a novas muteínas de IL-2 com afinidade modulada, por exemplo, afinidade de ligação aumentada ou reduzida para um ou mais receptores de IL-2 (por exemplo, IL-2Rα, IL-2Rβ e/ou IL- 2Rγ) em comparação com um polipeptídeo IL-2 de ocorrência natural. Em particular, algumas modalidades da descrição se referem às muteínas de L-2, nas quais uma ou mais alterações moleculares conferem afinidade de ligação reduzida para IL-2Rα, IL-2Rβ e/ou IL-2Rγ. Em outras palavras, algumas das novas muteínas de IL-2 descritas aqui são agonistas parciais da via de sinalização mediada por IL-2. Em algumas modalidades, os agonistas parciais de IL-2 aqui descritos não promovem a ativação de células imunes responsáveis por eventos autoimunes adversos indesejados, tal como inflamação. A. Agonistas Parciais de IL-2

[0063] Em um aspecto, algumas modalidades da descrição fornecem muteínas de IL-2 que são agonistas parciais. Em algumas modalidades, são fornecidas aqui muteínas de IL-2 que contêm uma ou mais mutações que reduzem a afinidade de ligação da muteína de IL-2 para o receptor IL-2Rγc em comparação com a IL-2 de ocorrência natural (por exemplo, IL-2 humana, SEQ ID Nº: 2). Conforme usado aqui, os termos "cadeia gama comum", "γc", "IL-2Rγc", "Yc", "IL-2Rγ", "receptor de IL-2 subunidade gama" e "IL-2RG" (números de acesso ao Genbank: NM_000206 e NP_000197 (humano) e NM_013563 e NP_038591 (camundongo)) todos se referem a um membro da família de receptores de citocina tipo I que é uma subunidade de receptor de citocina para os complexos receptores para pelo menos seis receptores de interleucina diferentes, incluindo, mas não limitados a receptores de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. IL-2Rγc interage com IL-2Rβ para formar um receptor de IL-2 de afinidade intermediária principalmente em células T de memória e células exterminadoras naturais (NK) e interage com IL-2Rα e IL-2Rβ para formar um receptor de IL-2 de alta afinidade em células T ativadas e Tregs.

[0064] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2, conforme aqui descritas, muteínas de IL-2 recombinantes artificiais, podem ser, por exemplo, qualquer polipeptídeo recombinante de IL-2, polipeptídeo IL-2 modificado, ou polipeptídeo IL-2 de ocorrência natural que tem uma afinidade de ligação modulada com um receptor de IL-2 (por exemplo, IL-2Rα, IL-2Rβ e/ou IL-2Rγ).

[0065] As muteínas de IL-2 em questão exemplificativas são pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de

70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% idênticas à correspondente IL-2 de ocorrência natural (WT IL- 2). A mutação pode consistir de uma alteração no número ou no teor de resíduos de aminoácidos. Por exemplo, a IL-2 mutante pode ter um número maior ou menor de resíduos de aminoácidos que a correspondente IL-2 de ocorrência natural. Alternativamente, ou em adição, um polipeptídeo mutante exemplificativo pode conter uma substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos que estão presentes na IL-2 de ocorrência natural. Em várias modalidades, o polipeptídeo IL-2 mutante pode diferir da IL-2 de ocorrência natural pela adição, deleção ou substituição de um único resíduo de aminoácido.

[0066] A título de ilustração não limitante, uma muteína de IL-2 que inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de referência SEQ ID Nº: 1 é um polipeptídeo que inclui uma sequência que é idêntica à sequência de referência, exceto pela inclusão de até cinco alterações da sequência de aminoácidos de referência da SEQ ID Nº: 2. Consequentemente, em algumas modalidades, a muteína de IL-2 da descrição inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de referência SEQ ID Nº: 1 é um polipeptídeo que inclui uma sequência idêntica à sequência de referência, exceto pela inclusão de 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações na sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, até 5% dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro aminoácido, ou um número de aminoácidos até 5% do total de resíduos de aminoácidos na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais amino (N-) ou carboxi (C-) da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[0067] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 da descrição se liga a IL-2Rγ com uma afinidade que é pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% menor do que a de IL-2 de ocorrência natural, inclusive qualquer valor que esteja entre essas porcentagens. A afinidade de ligação da muteína de IL-2 também pode ser expressa como uma afinidade 1,2, 1,4, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250 ou mais vezes menor para IL-2γ do que para IL-2 de ocorrência natural. A afinidade de ligação de uma muteína de IL-2 em questão a IL-2Rγ pode ser medida usando qualquer método adequado conhecido na técnica. Os métodos adequados para medir a ligação a IL-2Rγ incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação a ligandos radioativos (por exemplo, ligação de saturação, gráfico de dispersão, programas de ajuste de curvas não lineares, e ensaios de ligação de competição); ensaios de ligação a ligandos não radioativos (por exemplo, polarização de fluorescência (FP), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e ensaios de ressonância plasmônica de superfície (ver, por exemplo, Drescher e outros, Methods Mol Biol 493: 323 a 343 (2009)); ensaios de ligação ao ligando de fase líquida (por exemplo, reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) e imunoprecipitação); e ensaios de ligação ao ligando de fase sólida (por exemplo, ensaios com placas de vários poços, ensaios de ligação ao ligando em microesfera, ensaios de ligação ao ligando em coluna, e ensaios de filtro). Sem estar vinculado à teoria, acredita-se que agonistas parciais construídos através de mutações no sítio de ligação ao receptor IL-2Rγ seriam menos dose- dependentes em comparação com o de ocorrência natural ou outras variantes de IL-2.

[0068] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 rompe a associação de IL-2Rβ com IL-2Rγ, de modo que essa interação IL- 2Rβ/IL-2Rγ é reduzida em cerca de 2%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 50%, cerca de 75%, cerca de 90%, cerca de 95% ou mais (inclusive qualquer valor entre essas porcentagens) em relação à IL-2 de ocorrência natural.

[0069] Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações que reduzem a afinidade de ligação da muteína de IL-2 com o receptor IL- 2Rγ são uma substituição de aminoácidos. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 em questão consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos em comparação com uma IL-2 de ocorrência natural (SEQ ID Nº: 1). O(s) resíduo(s) de aminoácido substituído(s) pode ser (mas não necessariamente) substituições conservativas, que normalmente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Em modalidades particulares, as substituições estão nos resíduos de aminoácidos de IL- 2 que entram em contato com a interface de ligação a IL-2Rγ.

[0070] Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são substituições em uma ou mais posições de aminoácidos de IL-2 de ocorrência natural, selecionadas a partir das posições: 18, 22 e 126, numeradas de acordo com a hIL-2 de ocorrência natural (por exemplo, SEQ ID Nº: 1). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos que diminuem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ incluem substituições de aminoácidos Leu-para-Arg (L18R), Gln-para-

Glu (Q22E) e/ou Gln-para-His (Q126H), Gln-para-Met (Q126M) ou Gln- para-Lys (Q126K), ou combinações das mesmas.

[0071] Em outras modalidades, a substituição de aminoácidos que diminui a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ inclui L18R e Q22E e qualquer uma de Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S ou Q126T. Em ainda outras modalidades, a muteína de IL-2 pode ter substituições adicionais de aminoácidos em uma ou mais posições de aminoácidos de IL-2 de ocorrência natural, selecionadas a partir das posições: 80, 81, 85, 86 e 192, numeradas de acordo com a hIL-2 de ocorrência natural (por exemplo, SEQ ID Nº: 1). Em outra modalidade, a muteína de IL-2 pode ter substituições de aminoácidos adicionais selecionadas a partir de uma ou mais de L80F, R81D, L85V, I86V e/ou I92F.

[0072] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 pode ainda ter uma afinidade de ligação aumentada ao receptor de IL-2Rβ e pode incluir ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais mutações que aumentam a afinidade de ligação a IL-2Rβ. Conforme usado aqui, os termos "IL-2Rβ" e "CD122" (número de acesso ao Genbank NM_000878 e NP_000869 (humano)) ambos se referem a um membro da família de receptores de citocinas tipo I que interage com IL-2Rγ para formar um receptor de IL-2 de afinidade intermediária principalmente em células T de memória e células exterminadoras naturais (NK) e interage com IL-2Rα e IL-2Rγ para formar um receptor de IL-2 de alta afinidade em células T ativadas e células T reguladoras (Tregs). Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 em questão inclui pelo menos uma mutação (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais resíduos de aminoácidos) em relação a uma IL-2 de ocorrência natural (por exemplo, SEQ ID Nº: 1) e se liga a IL-2Rβ com maior afinidade do que uma IL-2 de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a muteína de

IL-2 se liga a IL-2Rβ com uma afinidade que é pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99 % maior do que a de IL-2 de ocorrência natural (incluindo qualquer valor entre essas porcentagens). A afinidade de ligação da muteína de IL-2 também pode ser expressa como uma afinidade 1,2, 1,4, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250 ou mais vezes maior com IL-2Rβ do que com IL-2 de ocorrência natural. A ligação da muteína de IL-2 em questão a IL-2Rβ pode ser avaliada por qualquer método adequado conhecido dos versados na técnica, incluindo, mas não limitado aos métodos descritos acima. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação que aumenta a afinidade de ligação a IL-2Rβ é uma substituição de aminoácidos. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos que aumentam a afinidade de ligação a IL-2Rβ incluem substituições nas posições de aminoácidos I24, P65, Q74, L80, R81, L85, I86, I89, I92 e/ou V93 numeradas de acordo com a hIL-2 de ocorrência natural (SEQ ID Nº: 1): Em algumas modalidades, as substituições incluem I24V, P65H, Q74R, Q74 H, Q74N, Q74S, L80F, L80V, R81I, R81T, R81D, L85V, I86V, I89V, I92F e/ou V93I, ou combinações das mesmas. Em algumas modalidades, as substituições incluem Q74N, Q74H, Q74S, L80F, L80V, R81D, R81T, L85V, I86V, I89V e/ou I93V ou combinações das mesmas.

[0073] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 pode ainda ter uma afinidade de ligação reduzida ao receptor de IL-2Rβ e pode incluir ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais mutações que diminuem a afinidade de ligação a IL-2Rβ. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 em questão inclui pelo menos uma mutação (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais resíduos de aminoácidos) em relação a uma IL-2 de ocorrência natural (por exemplo, SEQ ID Nº: 1) e se liga a IL-2Rβ com afinidade reduzida em comparação com uma IL-2 de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 se liga a IL-2Rβ com uma afinidade que é pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% menor do que com IL-2 de ocorrência natural (incluindo qualquer valor entre essas porcentagens). A afinidade de ligação da muteína de IL-2 também pode ser expressa como uma afinidade 1,2, 1,4, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250 ou mais vezes menor com IL-2Rβ do que com IL- 2 de ocorrência natural.

[0074] Em outras modalidades, qualquer uma das muteínas de IL-2 descritas neste documento pode se ligar ao receptor de IL-2Rβ com uma afinidade similar (por exemplo, variando em menos de um por cento) ou idêntica a uma IL-2 de ocorrência natural (por exemplo, SEQ ID Nº: 1).

[0075] Em modalidades adicionais, a muteína de IL-2 pode ainda ter uma afinidade de ligação aumentada com o receptor IL-2Rα e pode incluir ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais mutações que aumentam a afinidade de ligação com IL-2Rα. Conforme usado neste documento, os termos "IL-2Rα" e "CD25" (número de acesso ao Genbank NM_000417 e NP_000408 (humano)) se referem a um membro da família de receptores de citocina tipo I que interage com IL- 2Rβ e IL-2Rγ para formar um receptor de IL-2 de alta afinidade em células T ativadas e células T reguladoras (Tregs). Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 em questão inclui pelo menos uma mutação (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais resíduos de aminoácidos) em relação a uma IL-2 de ocorrência natural (por exemplo, SEQ ID Nº: 1) e se liga a IL-2Rα com maior afinidade do que uma IL-2 de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 se liga a IL-2Rα com uma afinidade que é pelo menos 1%, 2%, 3%,

4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% maior do que a IL-2 de ocorrência natural (incluindo qualquer valor entre essas porcentagens). A afinidade de ligação da muteína de IL-2 também pode ser expressa como uma afinidade 1,2, 1,4, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250 ou mais vezes maior com IL-2Rβ do que com IL- 2 de ocorrência natural. A ligação da muteína de IL-2 em questão a IL- 2Rα pode ser avaliada por qualquer método adequado conhecido dos versados na técnica, incluindo, mas não limitado aos métodos descritos acima. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação que aumenta a afinidade de ligação com IL-2Rβ é uma substituição de aminoácidos.

[0076] Em ainda outras modalidades, a muteína de IL-2 pode ainda ter uma afinidade de ligação reduzida com o receptor IL-2Rα e pode incluir ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais mutações que diminuem a afinidade de ligação a IL-2Rα. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 em questão inclui pelo menos uma mutação (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais resíduos de aminoácidos) em relação a uma IL-2 de ocorrência natural (por exemplo, SEQ ID Nº: 1) e liga a IL-2Rα com menos afinidade do que uma IL-2 de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 se liga a IL-2Rα com uma afinidade que é pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% menor do que a IL-2 de ocorrência natural (incluindo qualquer valor entre essas porcentagens). A afinidade de ligação da muteína de IL-2 também pode ser expressa como uma afinidade 1,2, 1,4, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 250 ou mais vezes menor com IL-2Rα do que com IL-2 de ocorrência natural.

[0077] Em outras modalidades, qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas pode se ligar ao receptor IL-2Rα com uma afinidade similar (por exemplo, variando em menos de um por cento) ou idêntica a uma IL-2 de ocorrência natural (por exemplo, SEQ ID Nº: 1).

[0078] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui substituições de aminoácidos L80F, R81D, L85V, I86V, I92F, L18R, Q22E e Q126H. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 tem a seguinte sequência de aminoácidos:

[0079] APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTF

KFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVF VLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCHSIISTLT (SEQ ID Nº: 8)

[0080] Em outras modalidades, a muteína de IL-2 inclui substituições de aminoácidos L80F, R81D, L85V, I86V, I92F, L18R, Q22E e Q126K. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 tem a seguinte sequência de aminoácidos:

[0081] APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLT

FKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNI NVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCKSIISTLT (SEQ ID Nº: 10)

[0082] Em outras modalidades, a muteína de IL-2 inclui substituições de aminoácidos L80F, R81D, L85V, I86V, I92F, L18R, Q22E e Q126M. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 tem a seguinte sequência de aminoácidos:

[0083] APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLT

FKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNI NVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCMSIISTLT (SEQ ID Nº: 11).

[0084] Em outra modalidade, a muteína de IL-2 inclui substituições de aminoácidos L18R, Q22E e Q126H. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 tem a seguinte sequência de aminoácidos:

[0085] APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLT

FKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI NVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCHSIISTLT (SEQ ID Nº: 15)

[0086] Em outra modalidade, a muteína de IL-2 inclui substituições de aminoácidos L18R, Q22E e Q126M. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 tem a seguinte sequência de aminoácidos:

[0087] APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLT

FKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI NVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCMSIISTLT (SEQ ID Nº: 16).

[0088] Em várias modalidades, a muteína de IL-2 em questão tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a fórmula:

[0089] A-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-(X1)n-L-D-L-(X2)n-M-I- L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-R-M-L-T-F-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L- Q-C-L-E-E-E-L-K-P-L-E-E-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-(X3)n-(X4)n-P-R-D- (X5)n-(X6)n-S-N-I-N-V-(X7)n-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T- A-T-I-V-E-F-L-N-RW-I-T-F-C-(X13)n-S-I-I-S-T-L-T, em que: cada n é selecionado individualmente a partir de 0 ou 1; X1 é L (ocorrência natural) ou R; X2 é Q (ocorrência natural) ou E; X3 é L (ocorrência natural), F ou V; X4 é R (ocorrência natural), I, T ou D; X5 é L (ocorrência natural) ou V; X6 é I (ocorrência natural) ou V; X7 é I (ocorrência natural) ou F; X13 é Q (ocorrência natural) ou H, M, K, C, D, E, G, I, R, S ou T (SEQ ID Nº: 20).

[0090] Em algumas modalidades da muteína de IL-2, de acordo com a SEQ ID Nº: 20, um aminoácido pelo menos em um de X1, X2, X3,

X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, ou X13 não é um aminoácido de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um aminoácido pelo menos em dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze ou quatorze de X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, ou X13 não é um aminoácido de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 tem pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% de homologia com a muteína de IL-2 de SEQ ID Nº: 20.

[0091] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 em questão que são agonistas parciais têm uma ou mais funções reduzidas, em comparação com IL-2 de ocorrência natural, tal como (i) Emax reduzido, (ii) capacidade reduzida de estimular as vias de sinalização que dependem da heterodimerização de IL-2Rβ/IL-2Rγ, (iii) produção reduzida e/ou secreção de interferon-gama (IFNγ) a partir de células imunes potencialmente inflamatórias; (iv) proliferação reduzida de células T potencialmente inflamatórias.

[0092] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 tem capacidade reduzida para estimular uma ou mais vias de sinalização que são dependentes da heterodimerização de IL-2Rβ/IL-2Rγ. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 em questão tem uma capacidade reduzida para estimular a fosforilação de STAT5 em uma célula T em comparação com hIL-2 de ocorrência natural (ver, por exemplo, Exemplo 1 e Figuras 4A-4B). Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 estimula a fosforilação de STAT5 em uma célula T em um nível de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% (incluindo valores entre essas porcentagens) do nível em que IL-2 de ocorrência natural estimula a fosforilação de STAT5 na mesma célula. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula exterminadora natural (NK). A sinalização de

STAT5 pode ser medida, por exemplo, por fosforilação de STAT5 usando qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a fosforilação de STAT5 pode ser medida usando anticorpos específicos para a versão fosforilada desta molécula em combinação com a análise por citometria de fluxo.

[0093] Em modalidades adicionais, as muteínas de IL-2 descritas neste documento têm um Emax reduzido em comparação com o Emax de IL-2 de ocorrência natural. Em algumas modalidades, as muteínas têm cerca de 15 a 95%, tal como cerca de 20 a 95%, cerca de 30 a 95%, cerca de 40 a 95%, cerca de 50 a 95%, cerca de 60 a 95%, cerca de 70 a 95%, cerca de 80 a 95% ou cerca de 90 a 95% de Emax em comparação com IL-2 de ocorrência natural (tal como, o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1). Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 descritas aqui têm 15 a 95% de Emax em comparação com o Emax da IL-2 de ocorrência natural. Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 descritas aqui têm 70 a 95% de Emax em comparação com o Emax da IL-2 de ocorrência natural. Em outra modalidade, as muteínas de IL- 2 descritas aqui têm cerca de 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43 %, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94% ou 95% de Emax em comparação com IL-2 de ocorrência natural (tal como o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1). Em uma modalidade não limitante, o Emax é calculado com base na razão do nível máximo de fosforilação de STAT5 (pSTAT5) induzido em uma célula imune pela muteína de IL-2 em relação ao sinal máximo de p-STAT5 gerado pela IL-2 de ocorrência natural.

[0094] Em ainda outras modalidades, as muteínas de IL-2 descritas neste documento podem resultar em menor produção e/ou secreção de interferon-gama (IFNγ) a partir de células imunes potencialmente inflamatórias em comparação com a quantidade de produção e/ou secreção de IFNγ induzida por IL-2 de ocorrência natural (tal como o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1) (ver, por exemplo, Exemplo 2 e Figuras 5A-5D). A redução na produção e/ou secreção de IFNγ pode estar em um nível de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% (inclusive valores entre essas porcentagens) do nível que a IL-2 de ocorrência natural estimula em células imunes potencialmente inflamatórias em concentrações comparáveis e sob condições similares. Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 aqui descritas não induzem a secreção de IFNγ a partir de células imunes potencialmente inflamatórias. Em uma modalidade não limitante, a célula imune potencialmente inflamatória é uma célula T CD8+ e/ou outro subconjunto de células imunes inflamatórias. Em outra modalidade não limitante, a célula imune potencialmente inflamatória é uma célula T CD4+ IFNγ+ ou uma célula T CD8+ IFNγ+.

[0095] Em modalidades adicionais, as muteínas de IL-2 descritas neste documento podem resultar em menor proliferação de células T potencialmente inflamatórias em comparação com a proliferação de células T potencialmente inflamatórias induzidas por IL-2 de ocorrência natural (tal como o polipeptídeo codificado por SEQ ID Nº: 1). As exemplificações não limitantes de células T potencialmente inflamatórias incluem células T CD4+ IFNγ+ ou células T CD8+ IFNγ+. Em algumas modalidades, a redução na proliferação de células T potencialmente inflamatórias pode estar em um nível de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% (incluindo valores entre essas porcentagens) ou menos do nível que a IL-2 de ocorrência natural estimula em concentrações comparáveis e sob condições similares. Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 aqui descritas não induzem qualquer proliferação de células imunes potencialmente inflamatórias. Em uma modalidade não limitante, a célula imune potencialmente inflamatória é uma célula T CD8+ e/ou outro subconjunto de células imunes inflamatórias. Em outra modalidade não limitante, a célula imune potencialmente inflamatória é uma célula T CD4+ IFNγ+ ou uma célula T CD8+ IFNγ+.

[0096] Ainda em outras modalidades, as muteínas de IL-2 descritas neste documento podem ter funções aumentadas, tal como, por exemplo, proliferação aumentada de células Treg. Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 descritas neste documento podem aumentar a proliferação de células Treg em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes em comparação com a quantidade de proliferação de Treg células induzidas por IL-2 de ocorrência natural (tal como o polipeptídeo codificado por SEQ ID Nº: 1). Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 descritas neste documento podem aumentar a proliferação de células Treg em cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14 %, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% em comparação com a quantidade de proliferação de células Treg induzidas por IL-2 de ocorrência natural (tal como o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1). Em algumas modalidades, a célula Treg é uma célula CD4+ Foxp3+.

[0097] Como descrito em mais detalhes abaixo, em algumas modalidades da descrição, as muteínas de IL-2 descritas neste documento e os ácidos nucleicos que codificam essas muteínas de IL- 2 podem ser incorporados em composições, incluindo composições farmacêuticas. Tais composições incluem tipicamente a molécula polipeptídica ou de ácido nucleico e um carreador farmaceuticamente aceitável. B. Ácidos Nucleicos

[0098] Em um aspecto, algumas modalidades descritas neste documento referem-se a moléculas de ácido nucleico que codificam a muteína de IL-2 da descrição, incluindo cassetes de expressão, e vetores de expressão contendo essas moléculas de ácido nucleico operacionalmente ligadas a sequências heterólogas de ácido nucleico, tal como, por exemplo, sequências reguladoras que permitem a expressão in vivo da muteína de IL-2 em uma célula hospedeira ou em um sistema de expressão livre de células ex vivo.

[0099] Em várias modalidades, os polipeptídeos utilizados na prática da presente descrição são sintéticos ou são produzidos pela expressão de uma molécula de ácido nucleico recombinante. Caso o polipeptídeo seja uma quimera (por exemplo, uma proteína de fusão contendo pelo menos um polipeptídeo mutante de IL-2 e um polipeptídeo heterólogo), ele pode ser codificado por uma molécula híbrida de ácido nucleico contendo uma sequência que codifica todo ou parte da IL-2 mutante, e uma segunda sequência que codifica todo ou parte do polipeptídeo heterólogo. Por exemplo, as muteínas de IL-2 em questão aqui descritas podem ser fundidas a uma etiqueta de hexa- histidina para facilitar a purificação de proteínas expressas bacterianamente, ou com uma etiqueta de hemaglutinina para facilitar a purificação de proteínas expressas em células eucarióticas.

[0100] Os termos "molécula de ácido nucleico" e "polinucleotídeo"

são usados aqui de forma intercambiável e se referem a moléculas de RNA e DNA, incluindo moléculas de ácido nucleico compreendendo cDNA, DNA genômico, DNA sintético e moléculas de DNA ou RNA contendo análogos de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita dupla ou de fita simples (por exemplo, uma fita senso ou uma fita antissenso). Uma molécula de ácido nucleico pode conter nucleotídeos não convencionais ou modificados. Os termos "sequência polinucleotídica" e "sequência de ácido nucleico", conforme usado aquis, referem-se indiferentemente à sequência de uma molécula de polinucleotídeo. A nomenclatura para bases nucleotídicas, conforme estabelecido em 37 CFR §1.822, é aqui utilizada.

[0101] As moléculas de ácido nucleico da presente descrição podem ser moléculas de ácido nucleico de qualquer comprimento, incluindo moléculas de ácido nucleico que estão preferencialmente entre cerca de 0,5 Kb e cerca de 50 Kb, ou, por exemplo, entre cerca de 0,5 Kb e cerca de 10 Kb, entre cerca de 1 Kb e cerca de 8 Kb, entre cerca de 2 Kb e cerca de 7 Kb, ou entre cerca de 2 Kb e cerca de 20 Kb, por exemplo, entre cerca de 2 Kb e 10 Kb, entre cerca de 3 Kb e cerca de 15 Kb, entre cerca de 4 Kb e cerca de 10 Kb, cerca de 5 Kb e cerca de 15 Kb, ou cerca de 3 Kb e cerca de 9 Kb. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico da presente descrição podem estar entre 5 Kb e 50 Kb, por exemplo, entre cerca de 5 Kb e cerca de 40 Kb, entre cerca de 5 Kb e cerca de 30 Kb, entre cerca de 5 Kb e cerca de 20 Kb, ou entre cerca de 10 Kb e cerca de 50 Kb, por exemplo, entre cerca de 15 Kb e 30 Kb, entre cerca de 20 Kb e cerca de 50 Kb, entre cerca de 20 Kb e cerca de 40 Kb, cerca de 5 Kb e cerca de 25 Kb ou cerca de 30 Kb e cerca de 50 Kb.

[0102] Os métodos para construir uma sequência de DNA que codifica as muteínas de IL-2 e expressa essas sequências em um hospedeiro adequadamente transformado incluem, mas não estão limitados ao uso de uma técnica de mutagênese assistida por PCR. Mutações que consistem em deleções ou adições de resíduos de aminoácidos a um polipeptídeo IL-2 também podem ser feitas com técnicas recombinantes padrão. No caso de uma deleção ou adição, a molécula de ácido nucleico que codifica IL-2 é opcionalmente digerida com uma endonuclease de restrição apropriada. O fragmento resultante pode ser expresso diretamente ou manipulado ainda mais, por exemplo, ligando-o a um segundo fragmento. A ligação pode ser facilitada se as duas extremidades das moléculas de ácido nucleico contêm nucleotídeos complementares que se sobrepõem, mas fragmentos de extremidade cega também podem ser ligados. Os ácidos nucleicos gerados por PCR também podem ser utilizados para gerar várias sequências mutantes.

[0103] A sequência de aminoácidos completa pode ser usada para construir um gene retrotraduzido. Um oligômero de DNA contendo uma sequência nucleotídica que codifica a muteína de IL-2 pode ser sintetizado. Por exemplo, vários pequenos oligonucleotídeos que codificam porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e depois ligados. Os oligonucleotídeos individuais contêm tipicamente cadeias secundárias 5’ ou 3’ para montagem complementar.

[0104] Além de gerar polipeptídeos mutantes via expressão de moléculas de ácido nucleico que foram alteradas por técnicas de biologia molecular recombinantes, as muteínas de IL-2 em questão podem ser sintetizadas quimicamente. Polipeptídeos quimicamente sintetizados são gerados rotineiramente por aqueles versados na técnica.

[0105] Depois de montadas (por síntese, mutagênese sítio- direcionada ou outro método), as sequências de DNA que codificam uma muteína de IL-2 serão inseridas em um vetor de expressão e ligadas operacionalmente a uma sequência de controle de expressão apropriada para a expressão da muteína de IL-2 no hospedeiro transformado desejado. A montagem adequada pode ser confirmada por sequenciamento de nucleotídeos, mapeamento de restrição, e expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um hospedeiro adequado. Como é bem conhecido na técnica, de modo a obter altos níveis de expressão de um gene transfectado em um hospedeiro, o gene deve estar operacionalmente ligado a sequências de controle de expressão de transcrição e tradução que são funcionais no hospedeiro de expressão escolhido.

[0106] A sequência de DNA codificando a muteína de IL-2, seja preparada por mutagênese sítio-direcionada, síntese química ou outros métodos, também pode incluir sequências de DNA que codificam uma sequência sinal. Essa sequência sinal, se presente, deve ser uma reconhecida pela célula escolhida para a expressão da muteína de IL-

2. Ela pode ser procariótica, eucariótica ou uma combinação das duas. Ela também pode ser a sequência sinal de IL-2 nativa. A inclusão de uma sequência sinal depende se é desejado secretar a muteína de IL-2 a partir das células recombinantes em que é feita. Se as células escolhidas são procarióticas, é geralmente preferencial que a sequência de DNA não codifique uma sequência sinal. Se as células escolhidas são eucarióticas, é geralmente preferencial que uma sequência sinal seja codificada e mais preferencialmente que a sequência sinal de IL-2 de ocorrência natural seja utilizada.

[0107] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 em questão, isoladamente ou como parte de um polipeptídeo quimérico, tal como os descritos acima, pode ser obtida por expressão de uma molécula de ácido nucleico. Assim como as muteínas de IL-2 podem ser descritas em termos de sua identidade com polipeptídeos IL-2 de ocorrência natural, as moléculas de ácido nucleico que os codificam terão necessariamente uma certa identidade com as que codificam IL-2 de ocorrência natural. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico que codifica uma muteína de IL-2 em questão pode ser pelo menos 50%, pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 85% e mais preferencialmente pelo menos 95% (por exemplo, 99%) idêntica ao ácido nucleico que codifica IL-2 de ocorrência natural. Assim, em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica uma muteína de IL-2 em questão aqui descrita é pelo menos 50%, pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 85% e mais preferencialmente pelo menos 95% (por exemplo, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica ao ácido nucleico que codifica uma IL-2 de ocorrência natural tendo o aminoácido estabelecido em SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica uma muteína de IL-2 em questão aqui descrita é pelo menos 50%, pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 85% e mais preferencialmente pelo menos 95% (por exemplo, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica ao ácido nucleico que codifica uma IL-2 de ocorrência natural tendo o aminoácido estabelecido em SEQ ID Nº: 2.

[0108] As moléculas de ácido nucleico fornecidas podem conter sequências que ocorrem naturalmente, ou que diferem daquelas que ocorrem naturalmente, mas, devido à degeneração do código genético, codificam o mesmo polipeptídeo. Essas moléculas de ácido nucleico podem consistir de RNA ou DNA (por exemplo, DNA genômico, cDNA ou DNA sintético, tal como aquele produzido pela síntese baseada em fosforamidita), ou combinações ou modificações dos nucleotídeos dentro desses tipos de ácidos nucleicos. Além disso, as moléculas de ácido nucleico podem ser de fita dupla ou de fita simples (isto é, uma fita senso ou antissenso).

[0109] As moléculas de ácido nucleico não estão limitadas a sequências que codificam polipeptídeos; algumas ou todas as sequências não codificantes que se encontram a montante ou à jusante de uma sequência de codificação (por exemplo, a sequência de codificação de IL-2) também podem ser incluídas. Aqueles versados na técnica de biologia molecular estão familiarizados com procedimentos de rotina para isolar moléculas de ácido nucleico. Elas podem, por exemplo, ser gerados por tratamento de DNA genômico com endonucleases de restrição ou por desempenho da reação em cadeia da polimerase (PCR). No caso de a molécula de ácido nucleico ser um ácido ribonucleico (RNA), as moléculas podem ser produzidas, por exemplo, por transcrição in vitro.

[0110] As moléculas de ácido nucleico isoladas exemplificativas da presente descrição podem incluir fragmentos não encontrados como tal no estado natural. Assim, esta descrição abrange moléculas recombinantes, como aquelas nas quais uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência que codifica uma IL-2 mutante) é incorporada em um vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vetor viral) ou no genoma de uma célula heteróloga (ou no genoma de uma célula homóloga, em uma posição diferente da localização cromossômica natural).

[0111] Como descrito acima, a muteína de IL-2 em questão pode existir como parte de um polipeptídeo quimérico. Além de, ou no lugar dos polipeptídeos heterólogos descritos acima, uma molécula de ácido nucleico em questão pode conter sequências que codificam um "marcador" ou "repórter". Exemplos de genes marcadores ou repórteres incluem β-lactamase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), adenosina deaminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase (neoR, G418), di- hidrofolato redutase (DHFR), higromicina-B-fosfotransferase (HPH), timidina quinase (TK), lacz (que codifica a β-galactosidase), e xantina guanina fosforibosiltransferase (XGPRT). Um versado na técnica estará ciente de reagentes úteis adicionais, por exemplo, de sequências adicionais que podem servir a função de um marcador ou repórter.

[0112] As moléculas de ácido nucleico em questão podem ser obtidas através da introdução de uma mutação no DNA que codifica IL- 2, obtido a partir de qualquer célula biológica, tal como a célula de um mamífero. Assim, os ácidos nucleicos em questão (e os polipeptídeos que eles codificam) podem ser os de um camundongo, rato, porquinho- da-índia, vaca, ovelha, cavalo, porco, coelho, macaco, babuíno, cachorro ou gato. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico serão as de um humano. C. Vetores e Células Hospedeiras

[0113] Também são aqui fornecidos vetores, plasmídeos ou vírus contendo uma ou mais das moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer um dos polipeptídeos muteína de IL-2 aqui descritos. As moléculas de ácido nucleico descritas acima podem estar contidas dentro de um vetor que é capaz de dirigir sua expressão em, por exemplo, uma célula que foi transduzida com o vetor. Por conseguinte, além das muteínas de IL-2 em questão, os vetores de expressão que contêm uma molécula de ácido nucleico codificando uma muteína de IL- 2 em questão e as células transfectadas com esses vetores estão entre as modalidades preferenciais. Os vetores adequados para uso em células eucarióticas e procarióticas são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente ou prontamente preparados por um versado na técnica. Vetores adicionais também podem ser encontrados, por exemplo, em Ausubel, F.M., e outros, Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocol, 1994) e Sambrook e outros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2ª ED. (1989).

[0114] Naturalmente, dever-se-ia entender que nem todos os vetores e sequências de controle de expressão funcionarão igualmente bem para expressar as sequências de DNA descritas neste documento.

Nem todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. No entanto, um versado na técnica pode fazer uma seleção entre esses vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros sem experimentação indevida. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro deve ser considerado porque o vetor deve replicar nele. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar esse número de cópias, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tal como marcadores de antibióticos, também devem ser considerados. Por exemplo, os vetores que podem ser usados incluem aqueles que permitem que o DNA codificando as muteínas de IL-2 seja amplificado em número de cópias. Tais vetores amplificáveis são bem conhecidos na técnica. Eles incluem, por exemplo, vetores capazes de serem amplificados por amplificação DHFR (ver, por exemplo, Kaufman, Patente US 4.470.461, Kaufman e Sharp, "Construction of a Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pág. 1304-19 (1982)) ou amplificação de glutamina sintetase ("GS") (ver, por exemplo, Patente US No. 5.122.464 e pedido publicado europeu 338.841).

[0115] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 humana da presente descrição serão expressas a partir de vetores, preferencialmente vetores de expressão. Os vetores são úteis para replicação autônoma em uma célula hospedeira ou podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma hospedeiro (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais). Os vetores de expressão são capazes de dirigir a expressão de sequências de codificação às quais estão operacionalmente ligadas. Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos (vetores). No entanto,

outras formas de vetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados) também estão incluídos.

[0116] Os vetores de expressão recombinantes exemplificativos podem incluir uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, ligadas operacionalmente à sequência de ácido nucleico a ser expressa.

[0117] Os construtos ou vetores de expressão podem ser projetados para a expressão de uma muteína de IL-2 ou variante da mesma em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas.

[0118] O DNA do vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Métodos adequados para transformar ou transfectar células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) e outros manuais de laboratório de biologia molecular padrão.

[0119] A expressão de proteínas em procariontes é mais frequentemente realizada em Escherichia coli com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis. Estratégias para maximizar a expressão de proteínas recombinantes em E. coli podem ser encontradas, por exemplo, em Gottesman (1990) em Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol. 185 (Academic Press, San Diego, Califórnia), pág. 119 a 128 e Wada e outros (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111 a 2118. Os processos para cultivar, colher, romper ou extrair a muteína de IL-2 ou sua variante das células são substancialmente descritos em, por exemplo, Patentes 4.604.377,

4.738.927, 4.656.132, 4.569.790, 4.748.234, 4.530.787, 4.572.798,

4.748.234, e 4.931.543, aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[0120] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 recombinantes ou suas variantes biologicamente ativas também podem ser produzidas em eucariontes, tal como levedura ou células humanas. As células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem células de inseto (exemplos de vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo, células Sf9) incluem a série pAc (Smith e outros (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156 a 2165) e a série pVL (Lucklow e Summers (1989) Virology 170: 31 a 39)); células de levedura (exemplos de vetores para expressão em levedura S. cerevisiae incluem pYepSec1 (Baldari e outros (1987) EMBO J. 6: 229 a 234), pMFa (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30: 933 a 943), pJRY88 (Schultz e outros (1987) Gene 54: 113 a 123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Califórnia) e pPicZ (Invitrogen Corporation, San Diego, Califórnia)); ou células de mamífero (os vetores de expressão em mamífero incluem pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) e pMT2PC (Kaufman e outros (1987) EMBO J. 6: 187: 195)). As células de mamífero adequadas incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS. Nas células de mamíferos, as funções de controle do vetor de expressão são frequentemente fornecidas por elementos reguladores virais. Por exemplo, os promotores comumente usados são derivados de polioma, adenovírus 2, citomegalovírus e vírus Simian 40. Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, consultar os capítulos 16 e 17 de Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). Ver Goeddel (1990, acima).

[0121] As sequências que codificam as muteínas de IL-2 humana da presente descrição podem ser otimizadas para expressão na célula hospedeira de interesse. O conteúdo G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular,

conforme calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Os métodos para otimização de códons são bem conhecidos na técnica. Os códons dentro da sequência de codificação da muteína de IL-2 podem ser otimizados para melhorar a expressão na célula hospedeira, de modo que cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 25%, cerca de 50%, cerca de 50%, cerca de 75% ou até 100% dos codões na sequência de codificação foram otimizados para expressão em uma célula hospedeira específica.

[0122] Os vetores adequados para uso incluem vetores baseados em T7 para uso em bactérias (ver, por exemplo, Rosenberg e outros, Gene 56: 125, 1987), o vetor de expressão pMSXND para uso em células de mamíferos (Lee e Nathans, J Biol. Chem. 263: 3521, 1988) e vetores derivados de baculovírus (por exemplo, o vetor de expressão pBacPAK9 de Clontech, Palo Alto, Califórnia) para uso em células de insetos.

[0123] Em algumas modalidades, as inserções de ácido nucleico, que codificam as muteínas de IL-2 em tais vetores, podem ser operacionalmente ligadas a um promotor, que é selecionado com base, por exemplo, no tipo de célula em que a expressão é procurada.

[0124] Ao selecionar uma sequência de controle de expressão, uma variedade de fatores também deve ser considerada. Estes incluem, por exemplo, a força relativa da sequência, a sua controlabilidade e a sua compatibilidade com a sequência de DNA real codificando a muteína de IL-2 em questão, particularmente no que diz respeito a potenciais estruturas secundárias. Os hospedeiros devem ser selecionados considerando sua compatibilidade com o vetor escolhido, a toxicidade do produto codificado pelas sequências de DNA desta descrição, suas características de secreção, sua capacidade de dobrar os polipeptídeos corretamente, seus requisitos de fermentação ou cultura, e a facilidade de purificação dos produtos codificados pelas sequências de DNA.

[0125] Dentro desses parâmetros, um versado na técnica pode selecionar várias combinações de vetor/sequência de controle de expressão/hospedeiro que expressarão as sequências de DNA desejadas na fermentação ou em cultura animal em larga escala, por exemplo, usando células CHO ou células COS 7.

[0126] A escolha da sequência de controle de expressão e do vetor de expressão, em algumas modalidades, dependerá da escolha do hospedeiro. Pode ser utilizada uma grande variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, por exemplo, vetores com sequências de controle de expressão a partir de SV40, vírus do papiloma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, tal como os plasmídeos de E. coli, incluindo col El, pCRI, pER32z, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de maior variedade de hospedeiros, tal como RP4, DNAs de fagos, por exemplo, os numerosos derivados de fago lambda, por exemplo, NM989 e outros fagos de DNA, tal como M13 e fagos filamentosos de DNA de fita simples. Os vetores de expressão úteis para células de levedura incluem o plasmídeo 2μ e seus derivados. Os vetores úteis para células de inseto incluem pVL 941 e pFastBac™ 1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland). Cate e outros, Cell, 45, pág. 685-98 (1986).

[0127] Além disso, qualquer uma de uma ampla variedade de sequências de controle de expressão pode ser usada nesses vetores. Tais sequências de controle de expressão úteis incluem as sequências de controle de expressão associadas aos genes estruturais dos vetores de expressão anteriores. Exemplos de sequências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores iniciais e tardios de SV40 ou adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, as principais regiões operadoras e promotoras do fago lambda,

por exemplo PL, as regiões de controle da proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida, por exemplo, PhoA, os promotores do sistema de correspondência de leveduras, o promotor de poliedrina de baculovírus, e outras sequências conhecidas por controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações dos mesmos.

[0128] Um promotor T7 pode ser usado em bactérias, um promotor de poliedrina pode ser usado em células de insetos, e um promotor de citomegalovírus ou metalotioneína pode ser usado em células de mamíferos. Além disso, no caso de eucariontes superiores, estão amplamente disponíveis promotores específicos para tecidos e específicos para tipos de células. Esses promotores são assim chamados por sua capacidade de dirigir a expressão de uma molécula de ácido nucleico em um determinado tipo de tecido ou célula dentro do corpo. Os versados na técnica conhecem bem numerosos promotores e outros elementos reguladores que podem ser usados para dirigir a expressão de ácidos nucleicos.

[0129] Além de sequências que facilitam a transcrição da molécula de ácido nucleico inserida, os vetores podem conter origens de replicação, e outros genes que codificam um marcador selecionável. Por exemplo, o gene de resistência à neomicina (neoR) confere resistência a G418 às células nas quais ele é expresso e, portanto, permite a seleção fenotípica das células transfectadas. Os versados na técnica podem determinar rapidamente se um determinado elemento regulador ou marcador selecionável é adequado para uso em um contexto experimental específico.

[0130] Os vetores virais que podem ser utilizados na descrição incluem, por exemplo, vetores retrovirais, adenovirais e adenoassociados, vetores de herpes vírus, vírus símio 40 (SV40), e vírus do papiloma bovino (ver, por exemplo, Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

[0131] As células procarióticas ou eucarióticas que contêm e expressam uma molécula de ácido nucleico que codifica uma muteína de IL-2 em questão descrita neste documento também são características da descrição. Uma célula da descrição é uma célula transfectada, isto é, uma célula na qual uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IL-2 mutante, foi introduzida por meio de técnicas de DNA recombinante. A progênie dessa célula também é considerada dentro do escopo da descrição.

[0132] Os componentes precisos do sistema de expressão não são críticos. Por exemplo, uma muteína de IL-2 pode ser produzida em um hospedeiro procariótico, tal como a bactéria E. coli, ou em um hospedeiro eucariótico, tal como uma célula de inseto (por exemplo, uma célula Sf21) ou células de mamíferos (por exemplo, células COS, células NIH 3T3 ou células HeLa). Essas células estão disponíveis em várias fontes, incluindo a American Type Culture Collection (Manassas, Virgínia). Ao selecionar um sistema de expressão, é importante apenas que os componentes sejam compatíveis entre si. Os versados na técnica são capazes de fazer essa determinação. Além disso, se orientação for necessária na seleção de um sistema de expressão, os versados na técnica podem consultar Ausubel e outros (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nova Iorque, NY, 1993) e Pouwels e outros (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987).

[0133] Os polipeptídeos expressos podem ser purificados a partir do sistema de expressão usando procedimentos bioquímicos de rotina e podem ser usados, por exemplo, como agentes terapêuticos, como aqui descrito.

[0134] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 obtidas serão glicosiladas ou não glicosiladas, dependendo do organismo hospedeiro usado para produzir a muteína. Se as bactérias forem escolhidas como hospedeiras, a muteína de IL-2 produzida será não glicosilada. As células eucarióticas, por outro lado, glicosilam as muteínas de IL-2, embora talvez não da mesma maneira que a IL-2 nativa é glicosilada. A muteína de IL-2 produzida pelo hospedeiro transformado pode ser purificada de acordo com qualquer método adequado. São conhecidos vários métodos para purificar a IL-2. Ver, por exemplo, Current Protocols in Protein Science, Vol 2. Eds: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, Unidade 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc). As muteínas de IL -2 podem ser isoladas a partir de corpos de inclusão gerados em E. coli, ou a partir de meio condicionado ou de culturas de mamíferos ou de leveduras que produzem uma dada muteína usando troca catiônica, filtração em gel, ou cromatografia líquida de fase reversa.

[0135] Outro método exemplificativo de construção de uma sequência de DNA que codifica as muteínas de IL-2 é por síntese química. Isto inclui a síntese direta de um peptídeo por meios químicos da sequência de proteína que codifica uma muteína de IL-2 exibindo as propriedades descritas. Este método pode incorporar aminoácidos naturais e não naturais em posições que afetam as interações de IL-2 com IL-2Rα, IL-2Rβ e/ou IL-2Rγ. Alternativamente, um gene que codifica a muteína de IL-2 desejada pode ser sintetizado por meios químicos usando um sintetizador de oligonucleotídeo. Tais oligonucleotídeos são projetados com base na sequência de aminoácidos da muteína de IL-2 desejada e, de preferência, selecionando os códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual a muteína recombinante será produzida. Nesse sentido, é bem reconhecido que o código genético é degenerado – que um aminoácido pode ser codificado por mais de um códon. Por exemplo, Phe (F) é codificado por dois códons, TIC ou TTT, Tyr (Y) é codificado por TAC ou TAT e his (H) é codificado por CAC ou CAT. Trp (W) é codificado por um único códon, TGG. Por conseguinte, será apreciado que, para uma dada sequência de DNA que codifica uma muteína de IL-2 específica, haverá muitas sequências degeneradas de DNA que codificarão para essa muteína de IL-2. Por exemplo, será apreciado que, além da sequência de DNA preferencial para a muteína 5-2 mostrada na Figura 2, haverá muitas sequências de DNA degeneradas que codificam a muteína de IL-2 mostrada. Essas sequências de DNA degeneradas são consideradas dentro do escopo desta descrição. Portanto, variantes degeneradas das mesmas no contexto desta descrição significa todas as sequências de DNA que codificam e, assim, permitem a expressão de uma muteína específica.

[0136] A atividade biológica das muteínas de IL-2 pode ser testada por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais ensaios incluem proliferação de PHA-blastos e proliferação de células NK. D. Proteínas de Fusão

[0137] Qualquer uma das muteínas de IL-2 descritas neste documento pode ser preparada como polipeptídeos de fusão ou quiméricos que incluem uma muteína de IL-2 em questão e um polipeptídeo heterólogo (isto é, um polipeptídeo que não é IL-2 ou um mutante do mesmo) (consultar, por exemplo, Patente US No.

6.451.308). Polipeptídeos heterólogos exemplificativos podem aumentar a meia-vida em circulação do polipeptídeo quimérico in vivo e, portanto, podem melhorar ainda mais as propriedades dos polipeptídeos IL-2 mutantes. Em várias modalidades, o polipeptídeo que aumenta a meia-vida em circulação pode ser uma albumina sérica, tal como albumina sérica humana, ou a região Fc da subclasse de anticorpos IgG que não tem a região variável de cadeia pesada de IgG.

As regiões Fc exemplificativas podem incluir uma mutação que inibe a fixação do complemento e a ligação ao receptor Fc, ou pode ser lítica, isto é, capaz de se ligar ao complemento ou lisar células por outro mecanismo, tal como a lise do complemento dependente de anticorpos (ADCC; US No. 08/355.502 depositado em 12 de dezembro de 1994).

[0138] A "região Fc" pode ser um polipeptídeo ocorrendo naturalmente ou sintético que é homólogo ao domínio C-terminal de IgG produzido pela digestão de IgG com papaína. A Fc de IgG tem um peso molecular de aproximadamente 50 kDa. Os polipeptídeos IL-2 mutantes podem incluir toda a região Fc, ou uma porção menor que retém a capacidade de estender a meia-vida em circulação de um polipeptídeo quimérico do qual faz parte. Além disso, as regiões Fc de comprimento total ou fragmentadas podem ser variantes da molécula de ocorrência natural. Ou seja, elas podem conter mutações que podem ou não afetar a função dos polipeptídeos; conforme descrito abaixo, a atividade nativa não é necessária ou desejada em todos os casos. Em algumas modalidades, a proteína de fusão com muteína de IL-2 (por exemplo, um agonista ou antagonista parcial de IL-2 como descrito aqui) inclui uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

[0139] A região Fc pode ser "lítica" ou "não lítica", mas é tipicamente não lítica. Uma região Fc não lítica tipicamente não tem um sítio de ligação ao receptor de Fc de alta afinidade e um sítio de ligação a C’1q. O sítio de ligação ao receptor de Fc de alta afinidade de Fc de IgG murino inclui o resíduo Leu na posição 235 de IgG Fc. Assim, o sítio de ligação ao receptor de Fc pode ser destruído por mutação ou deleção de Leu 235. Por exemplo, a substituição de Glu por Leu 235 inibe a capacidade da região Fc de se ligar ao receptor de Fc de alta afinidade. O sítio de ligação a C’1q murino pode ser funcionalmente destruído por mutação ou deleção dos resíduos Glu 318, Lys 320 e Lys 322 de IgG. Por exemplo, a substituição de resíduos Ala por Glu 318, Lys 320 e Lys

322 torna Fc de IgG1 incapaz de dirigir a lise do complemento dependente de anticorpo. Em contraste, uma região Fc de IgG lítica tem um sítio de ligação ao receptor de Fe de alta afinidade e um sítio de ligação a C’1q. O sítio de ligação ao receptor de Fc de alta afinidade inclui o resíduo Leu na posição 235 de Fc de IgG, e o sítio de ligação C’1q inclui os resíduos Glu 318, Lys 320 e Lys 322 de IgG1. A Fc de IgG lítica tem resíduos de ocorrência natural ou substituições conservativas de aminoácidos nesses sítios. A Fc de IgG lítica pode ter como alvo as células para citotoxicidade celular dependente de anticorpo ou citólise dirigida por complemento (CDC). Também são conhecidas mutações apropriadas para IgG humana (ver, por exemplo, Morrison e outros, The Immunologist 2: 119 a 124, 1994; e Brekke e outros, The Immunologist 2: 125, 1994).

[0140] Em outras modalidades, o polipeptídeo quimérico pode incluir uma muteína de IL-2 em questão e um polipeptídeo que funciona como uma etiqueta antigênica, tal como uma sequência FLAG. As sequências FLAG são reconhecidas por anticorpos anti-FLAG biotinilados, altamente específicos, como descrito aqui (ver também Blanar e outros, Science 256: 1014, 1992; LeClair e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8145, 1992). Em algumas modalidades, o polipeptídeo quimérico inclui ainda uma etiqueta de epítopo c-myc C- terminal.

[0141] Em outras modalidades, o polipeptídeo quimérico inclui o polipeptídeo mutante de IL-2 e um polipeptídeo heterólogo que funciona para melhorar a expressão ou a localização celular direta do polipeptídeo IL-2mutante, tal como a subunidade Aga2p de aglutinina (ver, por exemplo, Boder e Wittrup, Nature Biotechnol. 15: 553-7, 1997).

[0142] Em outras modalidades, um polipeptídeo quimérico incluindo uma IL-2 mutante e um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo podem ser gerados. O anticorpo ou componente de ligação ao antígeno da proteína quimérica pode servir como uma porção de direcionamento. Por exemplo, ele pode ser usado para localizar a proteína quimérica em um subconjunto específico de células ou molécula alvo. Os métodos para gerar polipeptídeos quiméricos de citocina-anticorpo são descritos, por exemplo, na Patente US 6.617.135.

[0143] Em algumas modalidades, a IL-2 mutante pode ser modificada com uma ou mais moléculas de polietileno glicol (PEG) para aumentar sua meia-vida. O termo "PEG" como usado aqui significa uma molécula de polietileno glicol. Na sua forma típica, o PEG é um polímero linear com grupos hidroxila terminais e tem a fórmula HO-CH2CH2- (CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, em que n é de cerca de 8 a cerca de 4000.

[0144] Normalmente, n não é um valor discreto, mas constitui uma faixa com distribuição aproximadamente Gaussiana em torno de um valor médio. O hidrogênio terminal pode ser substituído por um grupo de cobertura, tal como um grupo alquila ou alcanol. O PEG pode ter pelo menos um grupo hidroxi, mais preferencialmente é um grupo hidroxi terminal. Este grupo hidroxi pode ser ligado a uma porção ligante que pode reagir com o peptídeo para formar uma ligação covalente. Existem numerosos derivados de PEG na técnica. (Ver, por exemplo, Patentes US. Nos: 5.445.090, 5.900.461, 5.932.462, 6.436.386, 6.448.369,

6.437.025, 6.448.369, 6.495.659, 6.515, 100 e 6.514.491 e Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6: 150 a 165, 1995). A molécula de PEG ligada covalentemente às muteínas de IL-2 da presente descrição pode ser de aproximadamente 10.000, 20.000, 30.000 ou 40.000 daltons de peso molecular médio. Os reagentes de PEGuilação podem ser moléculas lineares ou ramificadas e podem estar presentes singularmente ou em conjunto. Os peptídeos de muteína de IL-2 PEGuilados da presente descrição podem ter moléculas de PEG em conjunto ligadas ao C terminal e/ou ao N terminal do peptídeo. O termo "PEGuilação", conforme usado aqui, significa a ligação covalente de uma ou mais moléculas de PEG, como descrito acima, a uma molécula tal como as muteínas de IL-2 da presente descrição. E. Composições Farmacêuticas

[0145] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersões. Para administração intravenosa, os carreadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL™. (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista facilidade de usar em seringa. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e similares) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos, por exemplo, dodecil sulfato de sódio. A prevenção da ação de micro- organismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tal como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0146] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são a secagem a vácuo e a liofilização, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada anteriormente estéril do mesmo.

[0147] As composições orais, se utilizadas, geralmente incluem um diluente inerte ou um carreador comestível. Para fins de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. As composições orais também podem ser preparadas usando um carreador fluido para uso como enxaguatório bucal. Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e similares podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de natureza similar: um ligante tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel™ ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes™; um glidante tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou um agente flavorizante tal como hortelã- pimenta, metil salicilato ou flavorizante de laranja.

[0148] No caso de administração por inalação, as muteínas de IL-2 em questão, ou os ácidos nucleicos que as codificam, são entregues na forma de uma aspersão em aerossol a partir de um recipiente ou distribuidor pressurizado que contém um propelente adequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador. Tais métodos incluem aqueles descritos na Patente US. No. 6.468.798.

[0149] A administração sistêmica das muteínas de IL-2 ou ácidos nucleicos em questão também pode ser por meios transmucosa ou transdérmicos. Para administração transmucosa ou transdérmica, são utilizados na formulação penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosa, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusídico. A administração transmucosa pode ser realizada através do uso de aspersões nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em unguentos, pomadas, géis ou cremes, como geralmente conhecido na técnica.

[0150] Em algumas modalidades, os compostos (polipeptídeos IL-2 mutantes ou ácidos nucleicos) também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositórios convencionais, tal como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para entrega retal.

[0151] Em algumas modalidades, os compostos (muteínas de IL-2 ou ácidos nucleicos em questão) também podem ser administrados por transfecção ou infecção usando métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados aos métodos descritos por McCaffrey e outros (Nature 418: 6893, 2002), Xia e outros (Nature Biotechnol. 20: 1006 a 1010, 2002) ou Putnam (Am. J. Health Syst. Pharm. 53: 151 a 160, 1996, errata em Am. J. Health Syst. Pharm. 53: 325, 1996).

[0152] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 ou ácidos nucleicos em questão são preparados com carreadores que protegerão os polipeptídeos IL-2 mutantes contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tal como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Tais formulações podem ser preparadas usando técnicas padrão. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente a partir de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões lipossômicas (incluindo lipossomas direcionados para células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais) também podem ser usadas como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, como descrito na Patente US. Nº. 4.522.811. IV. MÉTODOS DA DESCRIÇÃO

[0153] Alguns aspectos da descrição referem-se a métodos e materiais relacionados úteis para produzir as muteínas de IL-2, por exemplo, os agonistas parciais de IL-2 aqui descritos, bem como métodos para o tratamento de condições e distúrbios de saúde associados a perturbações de transdução de sinal mediada pela via de sinalização de IL-2. Mais particularmente, algumas modalidades da descrição referem-se à modulação da via de transdução de sinal mediada pela interleucina 2 (IL-2) em um sujeito em necessidade de tratamento. Em algumas modalidades da descrição, a sinalização mediada por IL-2 é modulada via redução seletiva da ligação de IL-2 a um, dois ou três de seus receptores, por exemplo, receptor alfa de interleucina 2 (IL-2Rα), receptor beta de interleucina 2 (IL-2Rβ), receptor gama de interleucina-2 (IL-2Rγ).

[0154] Em um aspecto, algumas modalidades da descrição referem-se a composições e métodos úteis para produzir a muteína de IL-2 descrita neste documento, o método inclui cultivar a célula hospedeira conforme descrito aqui em condições adequadas para a produção das muteínas de IL-2.

[0155] Em algumas modalidades, o método inclui ainda isolar a muteína produzida. Em algumas modalidades, o método inclui ainda purificar a muteína produzida. Técnicas, sistemas e materiais relacionados adequados para isolamento e purificação de proteínas recombinantes produzidas em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas são conhecidos na técnica.

[0156] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 produzidas podem ser modificadas ainda mais para prolongar sua meia-vida in vivo e/ou ex vivo. Exemplos não limitantes de estratégias e metodologias conhecidas adequadas para modificar as muteínas de IL-2 da descrição incluem (1) modificação química de um polipeptídeo muteína de IL-2 aqui descrito com macromoléculas altamente solúveis, tal como polietileno glicol ("PEG") que impede que os polipeptídeos entrem em contato com proteases; (2) ligar ou conjugar covalentemente uma muteína de IL-2 aqui descrita com anticorpo ou fragmento de anticorpo, tal como, por exemplo, um fragmento de anticorpo Fc humano; e (3) ligar ou conjugar covalentemente uma muteína de IL-2 aqui descrita com uma proteína estável tal como, por exemplo, albumina. Por conseguinte, em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 da descrição podem ser fusionadas com uma proteína estável, tal como albumina. Por exemplo, a albumina humana é conhecida como uma das proteínas mais eficazes para melhorar a estabilidade dos polipeptídeos fusionados com ela e há muitas dessas proteínas de fusão relatadas.

[0157] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 produzidas da descrição são quimicamente modificadas com uma ou mais porções de polietileno glicol, por exemplo, PEGuiladas; ou com modificações similares, por exemplo, PASiladas. Em algumas modalidades, a molécula de PEG ou molécula de PAS é conjugada com um ou mais aminoácidos da muteína de IL-2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 PEGuilada ou PASilada contém uma fração PEG ou PAS em apenas um aminoácido. Em outras modalidades, a muteína de IL-2 PEGuilada ou PASilada contém uma fração PEG ou PAS em dois ou mais aminoácidos, por exemplo, ligada a dois ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais, vinte ou mais diferentes resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a cadeia PEG ou PAS é 2.000, superior a 2.000, 5.000, superior a 5.000, 10.000, superior a 10.000,

20.000, superior a 20.000, e 30.000 Da. A muteína de IL-2 produzida pode ser acoplada diretamente ao PEG ou PAS (por exemplo, sem um grupo de ligação) através de um grupo amino, um grupo sulfidrila, um grupo hidroxila ou um grupo carboxila.

[0158] Em um aspecto, algumas modalidades da descrição referem-se a composições e métodos úteis para o tratamento de condições e distúrbios de saúde associados a perturbações da transdução de sinal mediada pela via de sinalização de IL-2. Mais particularmente, algumas modalidades da descrição referem-se à modulação da via de transdução de sinal mediada pela interleucina 2 (IL-2) em um sujeito em necessidade de tratamento.

[0159] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 da descrição e/ou ácidos nucleicos que as expressam são administrados a um sujeito para tratar um distúrbio associado a respostas autoimunes ou imunossupressoras indesejadas. No tratamento de tais doenças, as muteínas de IL-2 descritas neste documento podem ter propriedades vantajosas, tal como estimular células T reguladoras e ao mesmo tempo ativar minimamente ou não ativar células imunes potencialmente inflamatórias.

[0160] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 da descrição podem ser usadas para tratar pacientes que têm, que são suspeitos de ter, ou que podem estar em alto risco de desenvolver uma doença autoimune. O método incluindo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de (i) qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas, (ii) qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores aqui descritos, e/ou (iii) qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas ao indivíduo. Em algumas modalidades, a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, diabetes mellitus dependente de insulina, anemias hemolíticas, febre reumática, tireoidite, doença de Crohn, miastenia grave, glomerulonefrite, hepatite autoimune, esclerose múltipla, alopecia areata, psoríase, vitiligo, epidermólise bolhosa distrófica, lúpus eritematoso sistêmico e doença do enxerto contra hospedeiro. Em algumas modalidades, a doença autoimune é doença do enxerto contra hospedeiro.

[0161] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2, ácidos nucleicos ou vetores e/ou composições farmacêuticas são administrados ao sujeito como um único agente terapêutico ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, os um ou mais agentes terapêuticos adicionais incluem um anticorpo que tem como alvo a muteína para um tipo de célula específico. Em algumas modalidades, o tipo de célula é uma célula T reguladora (Treg). Em algumas modalidades, o anticorpo é covalente ou não covalentemente ligado à muteína de IL-2.

[0162] Em um aspecto, também são fornecidos neste documento métodos para impedir a proliferação de células T potencialmente inflamatórias e/ou impedir a secreção de IFNγ a partir de células T CD8+ ou outros subconjuntos de células imunes inflamatórias, os métodos incluindo colocar em contato uma célula que expressa um receptor de interleucina 2 γ (IL-2Rγ) com qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas. Em outras modalidades, as células T potencialmente inflamatórias são células T CD4+ CD44+ IFNγ+ ou são células T CD8+

CD44+ IFNγ+. Em algumas modalidades, o método é realizado in vitro, in vivo ou ex vivo.

[0163] Como discutido acima, em algumas modalidades, a muteína de IL-2 é estruturalmente modificada para aumentar a meia-vida. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui descritas, a modificação é uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em fusão a um fragmento de anticorpo Fc humano, fusão à albumina, e PEGuilação.

[0164] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para diminuir a proliferação de células T reguladoras (Treg), incluindo colocar em contato uma célula Treg com uma muteína de interleucina 2 (IL-2) tendo: (i) afinidade de ligação reduzida com o receptor γ de interleucina 2 (IL- 2Rγ) em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2; e (ii) 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui: (i) uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a afinidade de ligação a IL-2Rβ em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionadas a partir de L80F, R81D, L85V, I86V e I92F, numeradas de acordo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 1; e (ii) uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação com o receptor IL-2Rγ e resultam em 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2, selecionadas a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) a posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2.

[0165] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para diminuir a proliferação de células T reguladoras (Treg), incluindo colocar em contato uma célula Treg com uma muteína de IL-2 tendo: (i) afinidade de ligação reduzida com IL-2Rγ em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1; e (ii) 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação com o receptor IL-2Rγ e resulta em 0 a 50% de Emax em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionadas a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácidos na posição 126 da SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2 é selecionada a partir do grupo que consiste em Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S ou Q126T. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui a substituição de aminoácidos Q126H, Q126K ou Q126M. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 inclui uma substituição de aminoácido Q126H. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades descritas neste documento, o método inclui ainda administrar as muteínas de IL2 com um anticorpo que tem como alvo a muteína para uma célula Treg. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui descritas, o anticorpo é covalente ou não covalentemente ligado à muteína. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades descritas neste documento, o método é realizado in vitro, in vivo ou ex vivo.

[0166] Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com a via de administração pretendida. Os termos "administração" e "administrar", como usado aquis, referem-se à entrega de uma composição ou formulação bioativa por uma via de administração compreendendo, mas não limitada à administração oral, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular e tópica, ou combinações das mesmas. O termo inclui, mas não está limitado, à administração por um profissional médico e autoadministração. Em algumas modalidades, os polipeptídeos IL-2 mutantes da descrição podem ser administrados por via oral ou por inalação, mas é mais provável que eles sejam administrados por uma via parentérica. Exemplos de vias de administração parentérica incluem, por exemplo, administração intravenosa, intradérmica, subcutânea, transdérmica (tópica), transmucosa e retal. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parentérica podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como benzil álcool ou metil parabenos; antioxidantes tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tal como ácido etileno diamino tetra-acético; tampões tal como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tal como fosfato de sódio mono- e/ou di- básico, ácido clorídrico ou hidróxido de sódio (por exemplo, para um pH de cerca de 7,2 a 7,8, por exemplo, 7,5). A preparação parentérica pode ser colocada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos para doses múltiplas de vidro ou plástico.

[0167] A dosagem, toxicidade e eficácia terapêutica de tais muteínas de IL-2 ou compostos de ácidos nucleicos em questão podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Os compostos que exibem altos índices terapêuticos são preferenciais. Embora os compostos que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser utilizados, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de entrega que direcione esses compostos para o sítio do tecido afetado, a fim de minimizar possíveis danos às células não infectadas e, assim, reduzir os efeitos colaterais.

[0168] Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais compostos encontra-se preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa, dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método da descrição, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição de sintomas até a metade), conforme determinado na cultura de células. Essa informação pode ser usada para determinar com mais precisão doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.

[0169] Como aqui definido, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma muteína de IL-2 em questão (isto é, uma dosagem eficaz) depende do polipeptídeo selecionado. Por exemplo, podem ser administradas quantidades de dose única na faixa de aproximadamente 0,001 a 0,1 mg/kg de peso corporal do paciente; em algumas modalidades, podem ser administrados cerca de 0,005, 0,01, 0,05 mg/kg. Em algumas modalidades, 600.000 IU/kg são administrados (IU pode ser determinado por um bioensaio de proliferação de linfócitos e é expressos em Unidades Internacionais (IU) conforme estabelecido pelo Word Health Organization 1st International Standard for Interleukin-2 (humana). A dosagem pode ser similar, mas espera-se que seja menor do que a prescrita para PROLEUKIN®. As composições podem ser administradas de uma ou mais vezes por dia a uma ou mais vezes por semana; incluindo uma vez a cada dois dias. O versado na técnica apreciará que certos fatores podem influenciar a dosagem e o tempo necessário para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, entre outros, a gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou a idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um sujeito com uma quantidade terapeuticamente eficaz das muteínas de IL-2 em questão pode incluir um único tratamento ou pode incluir uma série de tratamentos. Em algumas modalidades, as composições são administradas a cada 8 horas por cinco dias, seguidas por um período de descanso de 2 a 14 dias, por exemplo, 9 dias, seguido de cinco dias adicionais de administração a cada 8 horas.

[0170] Também são aqui fornecidos métodos para prevenir, reduzir ou não promover a proliferação de células T potencialmente inflamatórias e/ou impedir a secreção de IFNγ a partir de células T CD8+ ou outros subconjuntos de células imunes inflamatórias. O método é realizado colocando em contato uma célula que expressa um receptor γ de interleucina 2 (IL-2Rγ) com qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas. A proliferação das células T potencialmente inflamatórias e/ou a prevenção da secreção de IFNγ a partir das células T CD8+ ou de outros subconjuntos de células imunes inflamatórias pode ser diminuída em cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30. %, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% (incluindo valores entre estas percentagens) em comparação com a proliferação e/ou secreção de IFNγ que a IL-2 de ocorrência natural estimula em concentrações comparáveis e sob condições similares. Em algumas modalidades, as células T potencialmente inflamatórias são células T CD4+ CD44+ IFNγ+ ou são células T CD8+ CD44+ IFNγ+. O método também pode ser realizado in vitro, in vivo ou ex vivo.

V. SISTEMAS E KITS

[0171] Os sistemas e/ou kits da presente descrição incluem uma ou mais de qualquer das muteínas de IL-2, ácidos nucleicos, vetores ou composições farmacêuticas aqui descritas, bem como seringas (incluindo seringas pré-carregadas) e/ou cateteres (incluindo seringas pré-carregadas) usadas para administrar qualquer uma das muteínas de IL-2, ácidos nucleicos, vetores ou composições farmacêuticas a um indivíduo. Os kits também incluem instruções escritas para o uso de qualquer uma das muteínas de IL-2, ácidos nucleicos, vetores ou composições farmacêuticas descritas neste documento, bem como seringas e/ou cateteres para uso em sua administração.

[0172] Pretende-se que todas as limitações numéricas máximas fornecidas através desta especificação incluam todas as limitações numéricas inferiores, como se essas limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas aqui. Toda limitação numérica mínima dada ao longo desta especificação incluirá toda limitação numérica superior, como se essas limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas aqui. Toda faixa numérica fornecida através desta especificação incluirá toda faixa numérica mais estreita que se enquadre em uma faixa numérica mais ampla, como se essas faixas numéricas mais estreitas fossem todas expressamente escritas aqui.

[0173] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta descrição são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[0174] Não é admitido que qualquer referência aqui citada constitua técnica anterior. A discussão das referências afirma o que seus autores afirmam, e os inventores se reservam o direito de contestar a precisão e a pertinência dos documentos citados. Será claramente entendido que, embora várias fontes de informação, incluindo artigos de periódicos científicos, documentos de patentes e livros didáticos, sejam mencionadas neste documento; esta referência não constitui uma admissão de que qualquer um desses documentos faça parte do conhecimento geral comum na técnica.

[0175] A discussão dos métodos gerais aqui apresentados destina- se apenas a fins ilustrativos. Outros métodos alternativos e alternativas serão evidentes para os versados na técnica após a revisão desta descrição, e devem ser incluídos no espírito e alcance deste pedido.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[0176] Este exemplo mostra a capacidade de várias variantes de IL- 2 humanas de estimular a fosforilação de STAT5. As células YT semelhantes a NK humanas foram estimuladas por 15 min com várias variantes de IL-2 humanas fusionadas à albumina sérica de camundongo (MSA) em diferentes concentrações, como indicado no gráfico representado na Figura 3 (de 1 µM a 0 µM, diluição de 10 vezes). Todas as variantes de IL-2 foram purificadas a partir de células HEK 293 transduzidas, exceto IL-2 REK (SEQ ID Nº: 10) que foi purificada a partir de células de inseto. O eixo Y no gráfico representado na Figura 3 mostra a razão de sinal p-STAT5 de cada variante de IL-2 normalizada para sinal p-STAT5 de WT IL-2 para cada concentração. Como mostrado, a substituição do resíduo Q126 por aminoácidos específicos no background de IL-2 H9 (SEQ ID Nº: 2) resulta em uma ampla faixa de eficácias de IL-2.

[0177] Em seguida, foi realizado um ensaio de sinalização de fosfo- STAT5 ao longo do tempo, estimulando células YT por 15 min com a concentração de agonistas parciais de IL-2 indicada no gráfico representado na Figura 4A. O eixo Y do gráfico na Figura 4A mostra a razão de sinal p-STAT5 de cada variante de IL-2 normalizado para o sinal p-STAT5 de WT IL-2 para cada concentração. Como mostrado na Figura 4B, as células YT foram estimuladas em vários momentos com 1 µM de diferentes variantes de IL-2, como indicado no gráfico. Nesta figura, o eixo Y indica a intensidade de fluorescência média (MFI) para o sinal p-STAT5.

[0178] Estes dados na Figura 4B demonstram que a magnitude do sinal p-STAT5 para WT (SEQ ID Nº: 1), H9 (SEQ ID Nº: 2) e novos agonistas parciais REE (SEQ ID Nº: 6), REH (SEQ ID Nº: 8) e REK (SEQ ID Nº: 10) (todos no background H9) são constantes ao longo do tempo com REE, REK e REH sinalizando a 25%, 50% e 75%, respectivamente. EXEMPLO 2

[0179] Este exemplo mostra a administração in vivo de variantes de IL-2 em camundongos. No dia 0, os camundongos WT C57BL/6c fêmeas receberam 30 µg de cada variante de IL-2 fusionada a MSA por injeção intraperitoneal (IP). No dia 6, os baços foram colhidos e analisados por citometria de fluxo quanto à expressão do marcador na superfície celular e citocina intracelular (n = 3/grupo) (ver Figura 5A). Os gráficos representados na Figura 5B, Figura 5C e Figura 5D representam a frequência do subconjunto de células indicado para cada condição normalizada para a respectiva frequência em camundongos tratados com PBS. As células B foram definidas por células identificadas em CD3-CD19+. As células NK foram identificadas em CD3-NK1.1+. As células identificadas em Ly6g (Gr1)+ CD3+ CD11b+ foram definidas como granulócitos.

[0180] Como mostrado nas Figuras 5B a 5D, a administração da variante de IL-2 resultou em alteração leve em outros tipos de células imunes; IL-2 H9_REH (REH; SEQ ID Nº: 8) iniciou uma expansão preferencial das células T de memória (TEM) efetoras CD4. Notavelmente, enquanto o tratamento com WT (SEQ ID Nº: 1) e H9 IL- 2 (SEQ ID Nº: 2) resultou em um aumento significativo na frequência de células T CD8 secretando IFNγ, esse aumento não foi observado quando os camundongos foram tratados com REE (SEQ ID Nº: 6), REH (SEQ ID Nº: 8) e REK (SEQ ID Nº: 10). EXEMPLO 3

[0181] Este exemplo descreve a geração e a caracterização de muteínas de IL-2 em um background de ocorrência natural. A capacidade destas variantes de estimular a fosforilação de STAT5 foi medida usando um ensaio de sinalização de Fosfo-STAT5. Células YT semelhantes a NK humanas (Figura 6A) ou blastos de células T de camundongos famintos (Figura 6B) foram estimuladas por 15 min com várias variantes de IL-2 humanas fusionadas à albumina sérica de camundongo (MSA) em diferentes concentrações, conforme indicado no gráfico (de 5 µM a 0 µM). Todas as variantes de IL-2 foram purificadas a partir de células de insetos. O eixo Y dos gráficos representados na Figura 6A e Figura 6B mostra a razão de sinal p- STAT5 de cada variante de IL-2 normalizada para sinal p-STAT5 de WT IL-2 para cada concentração. Como mostrado, o novo agonista parcial WT_REH (SEQ ID Nº: 15) parece exibir uma EC50 mais baixa e um Emax mais alto em comparação com H9_REH (SEQ ID Nº: 8). Ambos os novos agonistas parciais WT_REH (SEQ ID Nº: 1) e H9_REH (SEQ ID Nº: 8) mostram eficácias mais baixas (Emax) do que WT ou H9 IL-2.

[0182] As muteínas de IL-2 de background de ocorrência natural foram então administradas a um modelo de camundongo de melanoma B16. Em D0, 106 células B16F10 foram injetadas por via subcutânea em camundongos C57BL/6 fêmeas. Em D5, D9 e D14, os camundongos foram tratados com 30 µg de cada uma das variantes de MSA-IL2 por injeção IP. O tamanho do tumor foi medido em dias alternados a partir de D5 usando um paquímetro. O volume do tumor em mm3 foi calculado da seguinte forma: (comprimento * (largura)2)/2. Em D19, os baços foram colhidos e analisados por citometria de fluxo quanto à expressão na superfície celular e do marcador intracelular (n = 5/grupo).

[0183] Como representado na Figura 7A, os tamanhos dos tumores foram substancialmente menores em camundongos tratados com WT (SEQ ID Nº: 1) ou H9 (SEQ ID Nº: 2) em comparação com camundongos tratados com PBS. A administração de H9_REH (SEQ ID Nº: 8) e H9_REM (REM) (SEQ ID Nº: 11) resultou em um aumento do tamanho do tumor comparável ao de camundongos tratados com PBS. Os camundongos tratados com WT_REH (SEQ ID Nº: 15) exibem um tamanho de tumor maior em comparação com os camundongos tratados com WT (SEQ ID Nº: 1) ou H9 (SEQ ID Nº: 2). Foi observada uma frequência aumentada nas células T reguladoras (Treg) Foxp3+ em camundongos tratados com REM (SEQ ID Nº: 11) e um aumento de 3 vezes no número de células Treg Foxp3+ foi observado quando os camundongos foram tratados com WT_REH (SEQ ID Nº: 15) em comparação com camundongos tratados com PBS (Figura 7B). Os camundongos tratados com WT e H9 exibiram uma expansão de células de memória CD44+ CD8 secretando IFNγ, mas não com novos agonistas parciais WT_REH (SEQ ID Nº: 15), H9_REH (SEQ ID Nº: 8) ou REM (SEQ ID Nº: 11). A Figura 7C representa o efeito nas células NK e granulócitos. A mesma tendência foi observada com as células T de memória CD4 CD44+ secretando IFNγ (Figura 7D). Finalmente, enquanto o WT IL-2 (SEQ ID Nº: 1) desencadeou a proliferação de células T efetoras CD4+ (células Teff Ki67+) e células Treg, WT_REH (SEQ ID Nº: 1) induziu uma expansão específica das células Treg, mas não de células Teff (Figura 7E). EXEMPLO 4

[0184] Este exemplo descreve experimentos realizados para demonstrar que agonistas parciais de IL-2R no background de ocorrência natural podem provocar respostas específicas de tipo de célula in vivo.

[0185] Nesses experimentos, os camundongos fêmeas C57/BL6 receberam doses intraperitoneais de 3 x 30 µg (dias 0, 3 e 6) de IL-2 de ocorrência natural (WT) (SEQ ID Nº: 1), agonista parcial WT_REH (SEQ ID Nº: 15), agonista parcial WT_RETR (SEQ ID Nº: 21), agonista parcial WT_REK (SEQ ID Nº: 22) ou controle de PBS. Todas as citocinas foram formatadas como uma fusão N-terminal com albumina sérica de camundongo (MSA). No Dia 7, o baço e os linfonodos periféricos foram colhidos e analisados por citometria de fluxo e expressos como proteínas secretadas em células de insetos.

[0186] As muteínas de IL-2 WT_ RETR e WT_REK usadas nesses experimentos incluíram as seguintes sequências de aminoácidos:

[0187] APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLT

FKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI NVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT (WT_ RETR; SEQ ID Nº: 21).

[0188] APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLT

FKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI NVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCKSIISTLT (WT_ REK; SEQ ID Nº: 22).

[0189] Observou-se que os agonistas parciais de IL-2R que induzem o aumento dos órgãos linfoides estavam de acordo com sua atividade agonista (foram fotografados os baços e os linfonodos inguinais). Como mostrado nas Figuras 8A a 8B, verificou-se que a administração dos agonistas parciais induzia um aumento dos órgãos linfoides. A IL-2 e os agonistas parciais mostraram pouco efeito sobre a frequência das células NK (CD3-NK1.1+) enquanto a IL-2, mas não os agonistas parciais, mostrou uma redução na frequência das células B (CD3-CD19+). Também foi observado que a IL-2 e agonistas parciais não alteraram a frequência das células T (CD3+); no entanto, a IL-2 resultou em uma diminuição na relação de células T CD4 para CD8 enquanto um agonista parcial, REH, causou um aumento da relação de células T CD4 para CD8. EXEMPLO 5

[0190] Este exemplo descreve experimentos realizados para demonstrar que o tratamento com um agonista parcial de IL-2R exemplificativo, REH, aumentou a frequência de células T reguladoras FoxP3+ com ativação reduzida de células T CD4+ convencionais.

[0191] Nesses experimentos, camundongos fêmeas C57/BL6 receberam doses intraperitoneais de 3 x 30 µg (dias 0, 3 e 6) de WT IL- 2 de ocorrência natural (SEQ ID Nº: 1), agonista parcial WT_REH (SEQ ID Nº: 15), agonista parcial agonista parcial WT_RETR (SEQ ID Nº: 21), agonista parcial WT_REK (SEQ ID Nº: 22) ou controle de PBS. Todas as citocinas foram formatadas como uma fusão N-terminal à albumina sérica de camundongo (MSA) e expressas como proteínas secretadas em células de insetos. No Dia 7, o baço e os linfonodos periféricos foram colhidos e analisados por citometria de fluxo para avaliar a frequência de Tregs (CD25+ FoxP3+) e a ativação de células T CD4+ convencionais (CD25+ FoxP3-).

[0192] Foi observado que o agonista parcial de IL-2R REH aumentou a frequência de células T reguladoras CD25+ FoxP3+ sem induzir células convencionais CD25+. EXEMPLO 6

[0193] Este exemplo descreve experimentos realizados para demonstrar que Tregs de camundongos tratados com o agonista parcial de IL-2R REH suprimem a proliferação de células T convencionais CD4+.

[0194] Nesses experimentos, os camundongos fêmeas B6.FoxP3 GFP receberam 3 × 30 µg de doses intraperitoneais (dias 0, 3 e 6) de WT de ocorrência natural (SEQ ID Nº: 1), agonista parcial WT_REH (SEQ ID Nº: 15) ou controle dePBS. No Dia 7, o baço e os linfonodos foram colhidos e as células T CD4 foram isoladas por separação magnética (MACS). As células T CD4+ purificadas foram classificadas por separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com base na expressão de GFP para isolar Tregs (GFP+) e Tcons (GFP-). As células FoxP3 GFP+ de camundongos tratados com citocinas foram co- cultivadas com Tcons marcados com CellTrace Violet a partir de camundongos tratados com PBS e microesferas revestidas com aCD3aCD28 (relação de 1:1 microesfera para Tcon). A proliferação de Tcons carregados com CTV foi avaliada após 72 horas.

[0195] Foi observado que as células FoxP3+ de camundongos tratados com REH foram capazes de suprimir a proliferação de células efetoras FoxP3-. EXEMPLO 7

[0196] Este exemplo descreve experimentos realizados para ilustrar que o agonista parcial de IL-2R REH suporta a proliferação de células T CD8+, mas não a produção de IFNγ.

[0197] Nesses experimentos, as células T CD8+ foram isoladas a partir do baço e dos linfonodos de camundongos C57/BL6 por isolamento magnético (MACS), carregadas com CellTrace Violet e co- cultivadas com microesferas revestidas com aCD3aCD28 na presença ou ausência de 20 nM de WT (SEQ ID Nº: 1) ou WT_REH (SEQ ID Nº: 15) por três dias. Quatro horas antes da colheita, GolgiStop foi adicionado às células para impedir a secreção adicional de citocinas. Às 72 horas, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com anticorpos contra interferon gama (IFNγ).

[0198] Observou-se que tanto o agonista parcial de IL-2R REH quanto a IL-2 podiam suportar a proliferação, mas apenas a IL-2 podia induzir a produção robusta de IFNγ por células em proliferação. EXEMPLO 8

[0199] Este exemplo descreve os experimentos realizados para demonstrar que o tratamento e o co-tratamento do agonista parcial de IL-2R REH são protetores de vários sintomas autoimunes no modelo de EAE de roedores (um modelo animal de inflamação cerebral).

[0200] Nesses experimentos, os camundongos B6 foram pré- tratados (Dia -7, -4, -1) ou co-tratados (Dia 0, 3 e 7) com 10 µg de WT_REH fusionado a MSA (SEQ ID Nº: 15). No Dia 0, os camundongos foram imunizados com glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG 35-55) em adjuvante completo de Freund (CFA) e toxina pertussis (PTX), seguida de um reforço de PTX no Dia 2. A progressão do escore da doença foi verificada pela perda de peso e escore da doença. Os escores da doença foram os seguintes: 0 - saudável; 1 - cauda mole; 2 - paralisia parcial dos membros posteriores; 3 - paralisia completa dos membros posteriores; 4 - paralisia do corpo inteiro; 5 - morte.

[0201] Observou-se que o pré-tratamento com agonista parcial de IL-2R REH era protetor enquanto o co-tratamento com REH retarda o início da doença de maneira consistente com os experimentos anteriores que examinam a cinética de Tregs em camundongos tratados com REH.

[0202] Embora alternativas particulares da presente descrição tenham sido descritas, deve-se entender que várias modificações e combinações são possíveis e são consideradas dentro do verdadeiro espírito e escopo das reivindicações em anexo. Portanto, não há intenção de limitar o resumo e a descrição exatos aqui apresentados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Muteína de interleucina 2 (IL-2), caracterizada pelo fato de que tem: (a) afinidade de ligação reduzida para o receptor γ da interleucina 2 (IL-2Rγ) em comparação com um polipeptídeo IL-2 codificado pela SEQ ID Nº: 2; e (b) 15 a 95% de Emax em comparação com um polipeptídeo IL-2 codificado pela SEQ ID Nº: 2.

2. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a muteína compreende: (i) uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a afinidade de ligação a IL-2Rβ em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionadas a partir de L80F, R81D, L85V, I86V e I92F, numeradas de acordo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e/ou (ii) uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ e resultam em 15 a 95% de Emax em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2, selecionadas a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) a posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2.

3. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácidos na posição 126 da SEQ ID Nº: 2 é selecionada a partir do grupo que consiste em Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S ou Q126T.

4. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a muteína compreende a substituição de aminoácidos Q126H, Q126K ou Q126M.

5. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a muteína compreende uma substituição de aminoácido Q126H.

6. Muteína da interleucina 2 (IL-2) caracterizada pelo fato de que tem (a) afinidade de ligação reduzida ao receptor γ da interleucina 2 (IL-2Rγ); e (b) 15 a 95% de Emax em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1.

7. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a muteína compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ e resulta em 15 a 95% de Emax em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionadas a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

8. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a muteína compreende uma substituição de aminoácidos na posição 126 da SEQ ID Nº: 1 selecionada a partir do grupo que consiste em Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S ou Q126T.

9. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a muteína compreende uma substituição de aminoácido Q126H, Q126K ou Q126M.

10. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a muteína compreende uma substituição de aminoácido Q126H.

11. Muteína de IL-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a muteína é estruturalmente modificada para aumentar a meia-vida.

12. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita modificação compreende uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em fusão com um fragmento de anticorpo Fc humano, fusão com albumina, e PEGuilação.

13. Muteína de IL-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a dita muteína aumenta a proliferação de células T reguladoras (Treg) e/ou induz a proliferação mínima de células T potencialmente inflamatórias.

14. Muteína de IL-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a dita muteína causa a expansão das células Treg e não promove a expansão de células T potencialmente inflamatórias e de células exterminadoras naturais (NK) ou granulócitos.

15. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a muteína induz menos proliferação de células T potencialmente inflamatórias em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2.

16. Muteína de IL-2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que as ditas células T potencialmente inflamatórias são células T CD4+ IFNγ+ ou células T CD8+ IFNγ+.

17. Muteína de IL-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a muteína aumenta a proliferação de células Treg em pelo menos 3 vezes e/ou induz menos secreção de IFNγ em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2.

18. Muteína de IL-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a dita muteína não induz a secreção de IFNγ a partir das células T CD8+ e/ou outros subconjuntos de células imunes inflamatórias.

19. Muteína de IL-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a muteína tem 70 a 95% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1.

20. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica a muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

19.

21. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico com definido na reivindicação 20.

22. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 20, ou o vetor como definid na reivindicação 21.

23. Composição farmacêutica estéril, caracterizada pelo fato de que compreende a muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

24. Seringa, caracterizada pelo fato de que compreende (a) a muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19; (b) o ácido nucleico como definido na reivindicação 20; (c) o vetor como deifnido na reivindicação 21; (d) a célula hospedeira como definida na reivindicação 22; e/ou (e) a composição farmacêutica como definida na reivindicação 23.

25. Cateter, caracterizado pelo fato de que compreende (a) a muteína de IL-2 como deifnida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19; (b) o ácido nucleico como definido na reivindicação 20; (c) o vetor como definido na reivindicação 21; (d) a célula hospedeira como definida na reivindicação 22; e/ou (e) a composição farmacêutica como definida na reivindicação 23.

26. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um ou mais de (i) a muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19; (ii) o ácido nucleico como definido na reivindicação 20; (iii) o vetor como definido na reivindicação 21; (iv) a célula hospedeira como definida na reivindicação 22; e/ou (v)

a composição farmacêutica estéril como definida na reivindicação 23; (vi) a seringa como definida na reivindicação 24; e/ou (vii) o cateter como definido na reivindicação 25; e (b) instruções escritas para usar (i) a muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19; (ii) o ácido nucleico como definido na reivindicação 20; (iii) o vetor como definido na reivindicação 21; (iv) a célula hospedeira como definida na reivindicação 22; (v) a composição farmacêutica estéril como definida na reivindicação 23; (vi) a seringa como definida na reivindicação 24; e/ou (vii) o cateter como definido na reivindicação 25.

27. Método para tratar uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade de tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz da muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19; (b) o ácido nucleico como definido na reivindicação 20; (c) o vetor como definido na reivindicação 21; (d) a célula hospedeira como definida na reivindicação 22; e/ou (e) a composição farmacêutica como definida na reivindicação 23, ao indivíduo.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, diabetes mellitus dependente de insulina, anemias hemolíticas, febre reumática, tireoidite, doença de Crohn, miastenia grave, glomerulonefrite, hepatite autoimune, esclerose múltipla, alopecia areata, psoríase, vitiligo, epidermólise bolhosa distrófica, lúpus eritematoso sistêmico, e doença do enxerto contra hospedeiro.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que que a doença autoimune é doença do enxerto contra hospedeiro.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar a muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 23, em combinação com um anticorpo que tem como alvo a muteína para um tipo de célula específico.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o tipo de célula é uma célula T reguladora (Treg).

32. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é covalente ou não covalentemente ligado à muteína de IL-2.

33. Método para produzir a muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 22, em condições adequadas para a produção da muteína.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar e/ou purificar a muteína de IL-2 produzida.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente modificar estruturalmente a muteína de IL-2 para aumentar a meia-vida.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dita modificação compreende uma ou mais alterações selecionadas a partir do grupo que consiste em fusão com um fragmento de anticorpo Fc humano, fusão com albumina, e PEGuilação.

37. Método para impedir a proliferação de células T potencialmente inflamatórias e/ou impedir a secreção de IFNγ a partir de células T CD8+ ou outros subconjuntos de células imunes inflamatórias, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato uma célula que expressa um receptor γ da interleucina 2 (IL- 2Rγ) com a muteína de IL-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que as ditas células T potencialmente inflamatórias são células T CD4+ CD44+ IFNγ+ ou são células T CD8+ CD44+ IFNγ+.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que é realizado in vitro, in vivo ou ex vivo.

40. Método para diminuir a proliferação de células T reguladoras (Treg), caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato uma célula Treg com uma muteína da interleucina 2 (IL-2) tendo: (i) afinidade de ligação reduzida com o receptor γ da interleucina 2 (IL-2Rγ) em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2; e (ii) 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a muteína de IL-2 compreende: (i) uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a afinidade de ligação a IL-2Rβ em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionadas a partir de L80F, R81D, L85V, I86V e I92F, numeradas de acordo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (ii) uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ e resultam em 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 2, selecionadas a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) a posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2.

42. Método para diminuir a proliferação de células T reguladoras (Treg) caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato uma célula Treg com uma muteína de IL-2 tendo: (i) afinidade de ligação reduzida a IL-2Rγ em comparação com o polipeptídeo codificado por SEQ ID Nº: 1; e (ii) 0 a 50% de Emax em comparação com o polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a muteína compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao receptor IL-2Rγ e resulta em 0 a 50% de Emax em comparação com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID Nº: 1, selecionadas a partir de (A) L18R e Q22E; e (B) posição de aminoácido 126, numerada de acordo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

44. Método, de acordo com a reivindicação 41 ou 43, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácidos na posição 126 da SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2 é selecionada a partir do grupo que consiste em Q126A, Q126C, Q126D, Q126E, Q126G, Q126H, Q126I, Q126K, Q126M, Q126R, Q126S ou Q126T.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a muteína compreende a substituição de aminoácidos Q126H, Q126K ou Q126M.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a muteína compreende uma substituição de aminoácido Q126H.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 46, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar as muteínas com um ou mais anticorpos que têm como alvo a muteína para uma célula Treg.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é covalente ou não covalentemente ligado à muteína.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 48, caracterizado pelo fato de que é realizado in vitro, in vivo ou ex vivo.