KR20170020519A

KR20170020519A - 항―ｉｌ４―ｉｌ１３２특이성 항체

Info

Publication number: KR20170020519A
Application number: KR1020177002123A
Authority: KR
Inventors: 꼬리느 에스쁘레; 알렉상드르 쟈쥬흐슈미에; 슈히스티나 수브라느; 아룬 수브라마니암
Original assignee: 사노피
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2017-02-22
Also published as: US11136388B2; TW201628647A; EA201692495A8; CL2016003317A1; KR102558891B1; PH12016502569A1; TWI745962B; WO2015198146A2; TN2016000569A1; CA2952902A1; BR112016030568A2; MX2017000171A; CN106573975A; EP3160502A2; JP2017530089A; US20170145089A1; BR112016030568B8; SG11201610594WA; CR20170022A; AU2015278829B2

Abstract

이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편의 안전 용량과, 이중-V-영역 항체-유사 단백질 또는 이의 단편의 그의 표적에의 결합을 평가하는 방법, 및 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편의 안전 용량을 투여함으로써 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시 양태에서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 IL-4 및 IL-13 둘 모두에 결합한다.

Description

항―ＩＬ４―ＩＬ１３２특이성 항체{ANTI-IL4-IL13 BISPECIFIC ANTIBODIES}

인터루킨-4 (IL-4)은 림프구양 B 및 T 세포와, 단핵구, 내피 세포 및 섬유아세포를 포함하는 많은 비-림프구양 세포에 넓은 스펙트럼의 생물학적 영향을 주는 다면발현성 사이토카인이다. 예를 들어, IL-4는 휴지 B 세포 (resting B cell) 상에서의 클래스 (class) II 주요 조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex) 분자의 발현을 유도하며, 인간 B 세포에 의한 IgG4 및 IgE의 분비를 향상시킨다. IL-4는 Th2형 면역 반응과 연관되며, Th2 세포에 의해 생성되고 Th2 세포의 분화를 촉진한다. IL-4는 다수의 장애, 예컨대 알러지 및 천식에 연루되었다.

IL-13은 활성화 후 비만 세포, B 림프구 및 활성화 T 림프구에 의해 분비되는 112개 아미노산의 사이토카인이다 (문헌[Minty, A. et al., Nature, 1993, 362, 248-250], 및 문헌[McKenzie, A. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1993, 90, 3735-3739]). IL-13은, IL-4와 공유되는 그의 많은 생물학적 특성 덕분에 IL-4-유사 사이토카인으로 기술되어 왔다. 그의 활성은 B 세포 (문헌[Defrance, T. et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 135-143], 문헌[Punnonen, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 3730-3734], 문헌[Fior, R. et al., Eur. Cytokine Network, 1994, 5, 593-600), 단핵구 (문헌[Muzio, M. R. F. et al., Blood, 1994, 83, 1738-1743], 문헌[De Waal Malefyt, R. et al., J. Immunol, 1993, 151, 6370-6381], 문헌[Doyle, A. et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1441-1445], 문헌[Montaner, L. J. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 743-747], 문헌[Sozzani, P. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088]) 및 기타 비-조혈 세포 (문헌[Herbert, J. M. et al., Febs Lett., 1993, 328, 268-270], 및 문헌[Derocq, J. M. et al., Febs Lett. 1994, 343, 32-36])에 대하여 정말로 IL-4의 것과 유사하다. 반면에, IL-4와는 대조적으로, 이것은 휴지 또는 활성화 T 세포에 대해서는 특정한 효과를 발휘하지 않는다 (문헌[Zurawuki, G. et al., Immunol. Today, 1994, 15, 19-26]).

단핵구/대식 세포, B 림프구 및 특정한 조혈 전구체에 대한 IL-13의 다양한 생물학적 활성이 IL-13에 대한 리뷰 논문뿐만 아니라 에이. 제이. 민티 (A. J. Minty)에 의해서도 상세하게 기술되었다. 게다가, 몇몇 데이터는 이러한 사이토카인이 다른 세포 유형에 대하여 다면발현적 영향을 줌을 나타낸다. IL-13의 영향을 직접적으로 받는 이러한 비-조혈 세포로는 내피 및 소교 세포, 케라티노사이트 (keratinocyte) 및 신장 및 결장 암종이 있다.

세포 내에서 생물학적 분자 (biological molecule)에 의해 전달되는 신호의 분석에 있어서의 단계들 중 하나는 그의 막 수용체의 확인에 있다. 이것을 위하여 IL-13 수용체 상에서 실시된 조사 연구에 의하면 IL-13 및 IL-4가 공통 수용체, 또는 공통 수용체 복합체의 구성 요소들 중 적어도 일부와, 공통 신호 전달 요소를 가짐이 밝혀졌다 (문헌[Zurawski S. M. et al., EMBO J., 1993, 12, 2663-2670], 문헌[Aversa, G. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 2213-2218], 문헌[Vita, N. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517], 문헌[Lefort, S. et al., Febs Lett., 1995, 366, 122-126]). 이 수용체는 고려되는 세포 유형에 따라 가변적인 수로 다양한 세포 유형의 표면에 존재한다. IL-13 및 IL-4 수용체의 상대적인 분포가 문헌[A. J. Minty, Interleukin-13 for Cytokines in Health and Disease. Eds D. G. Remick and J. S. Frie, Marcel Decker, N.Y. 1996]에 의해 나타내어졌다.

세포 표면 수용체 및 수용체 복합체는 IL-4 및/또는 IL-13에 상이한 친화도로 결합한다. IL-4 및/또는 IL-13에 결합하는 수용체 및 수용체 복합체의 본원적 구성 요소로는 IL-4Rα, IL-13Rαl 및 IL-13Rα2가 있다. 이러한 사슬들은 IL- 4Rα/IL-13Rαl (제II형 IL-4R) 또는 IL-4Rα/c (제I형 IL-4R)의 헤테로이량체 또는 단량체로서 세포의 표면 상에서 발현된다. IL-4Rα 단량체 및 IL-4Rα/c 헤테로이량체는 IL-4에는 결합하지만 IL-13에는 결합하지 않는다. IL-13Rα1 및 IL-13Rα2 단량체는 IL-13에는 결합하지만 IL-4에는 결합하지 않는다. IL-4Rα/IL-13Rα1 헤테로이량체는 IL-4 및 IL-13 둘 모두에 결합한다 (문헌[Murata et al., Int. J. Hematol., 1999, 69, 13-20]).

Th2형 면역 반응은 항체 생성 및 체액성 면역을 촉진하며, 세포외 병원체와 싸워서 격퇴하도록 다듬어진다. Th2 세포는 Ig 생성 (체액성 면역)의 매개체이며 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13을 생성한다 (문헌[Tanaka, et al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251- 272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)]). Th2형 면역 반응은 특정한 사이토카인 (예를 들어, IL-4, IL-13) 및 특정한 유형의 항체 (IgE, IgG4)의 생성을 특징으로 하며, 알러지 반응을 대표하는데, 이는 누안 및 천식 증상, 예컨대 폐에서의 기도 근육 세포의 수축 및 기도 염증으로 이어질 수 있다.

IL-4 및 IL-13 둘 모두는 그의 생물학적 기능을 기반으로 하면 치료적으로 중요한 사이토카인이며, 많은 질환에서 중요한 역할을 한다. IL-4는 자가 면역 질환을 저해할 수 있는 것으로 밝혀졌으며, IL-4 및 IL-13 둘 모두는 항-종양 면역 반응을 향상시키는 잠재력을 나타냈다. IL-4 및 IL-13과 이들의 수용체의 증가는 특발성 폐 섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis; IPF)의 병인과 연관되었다 (문헌[Jakubzick et al., Am J Pathol. (2004) 164:1989-2001]; 문헌[Murray et al. Int J Biochem Cell Biol. (2008) 40:2174-82]). 문헌에서의 증거는 TH2 사이토카인 IL-4 및 IL-13이 이러한 폐조직 리모델링 (remodeling) 및 섬유증의 매개체로서 IPF의 병인에서 많은 역할을 함을 입증한다. 폐에서의 Th2형 CD4+ T 세포는 IL-4 및 IL-13의 주된 소스 (source)일 가능성이 있으며, 세포외 매트릭스 리모델링의 중요한 조절자로서 연루되어 있지만 (문헌[Wynn, Nat. Rev. Immunol, (2004) 4:583-594]), 비만 세포, 호염기구, 호산구, 대식 세포 및 상피 세포를 포함하는 다른 세포 유형도 이러한 사이토카인의 잠재적인 소스일 수 있다 (문헌[Gordon and Martinez, Immunity Rev. (2010) 32: 593-604]). IPF 환자에 있어서, 기관지 폐포 세척액 중 IL-13 및 IL-4의 수준은 정상 대조구와 비교하여 상승된다. 그러한 증거는 이러한 사이토카인의 억제 또는 중화가 가능한 치료법이 IPF 환자에 있어서 섬유증의 진행을 지연시키는 잠재력을 가짐을 시사한다. 상기 둘 모두의 사이토카인이 알러지성 질환 또는 섬유증 질환의 병인에 연루되어 있기 때문에, 이러한 사이토카인들의 저해제는 치료적 유익성 (therapeutic benefit)을 제공할 수 있다.

따라서, IL-4를 저해하고, IL-13을 저해하는 개선된 에이전트, 및 인간에서 사용하기에 안전하고 비-면역원성인, IL-4 및 IL-13 둘 모두를 저해하는 단일 에이전트에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 종래 기술에 비하여 특정한 강점 및 진보성을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 인간 대상체에 있어서 IL-4 및 IL-13에 특이적으로 결합하는 이중-V-영역 항체-유사 단백질 또는 이의 단편의 안전 용량을 제공하며, 여기서, 상기 용량은 상기 항체-유사 단백질 또는 이의 단편 약 200 mg 이하를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인간 대상체는 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 상기 항체-유사 단백질 또는 이의 단편 약 200 mg을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 상기 항체-유사 단백질 또는 이의 단편 약 100 mg을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 상기 항체-유사 단백질 또는 이의 단편 약 50 mg을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 주 1회 투여된다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 피하 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 대상체에게 투여된 이중-V-영역 항체-유사 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 용량이 인간 대상체 내에서 IL-4 또는 IL-13에 특이적으로 결합하는지를 결정하는 방법을 제공하며, 본 방법은 (a) 상기 용량을 인간 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 인간 대상체로부터 취해진 혈액, 혈장, 또는 혈청 샘플 중 TARC/CCL17 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 용량을 투여하기 전 측정한 대상체에서의 TARC/CCL17의 양과 대비하여 혈액 샘플 중 TARC/CCL17의 양의 감소는 이중-V-영역 항체-유사 단백질 또는 이의 단편의 IL-4 또는 IL-13에의 결합을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 본 방법은 (c) 단계 (b)에서 측정된 TARC/CCL17의 감소의 크기에 따라 용량을 증가시키거나 감소시키는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시 양태에서, 단계 (c)는 단계 (b)에서 측정된 TARC/CCL17의 감소가 역치 (threshold value) 미만일 경우 용량을 증가시키거나, 단계 (b)에서 측정된 TARC/CCL17의 감소가 역치 초과일 경우 용량을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 단계 (c)의 역치는 상기 용량을 투여하기 전 측정된 대상체에서의 TARC/CCL17의 양과 대비하여 TARC/CCL17의 양의 약 20% 내지 약 60%의 감소이다. 일부 실시 양태에서, 역치는 상기 용량을 투여하기 전 측정된 대상체에서의 TARC/CCL17의 양과 대비하여 TARC/CCL17의 양의 약 40% 내지 약 50%의 감소이다. 일부 실시 양태에서, 역치는 상기 용량을 투여하기 전 측정된 대상체에서의 TARC/CCL17의 양과 대비하여 TARC/CCL17의 양의 약 43%의 감소이다.

결정 방법의 일부 실시 양태에서, 상기 용량은 피하 투여된다. 일부 실시 양태에서, 단계 (b)에서 TARC/CCL17의 양은 효소 결합 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)에 의해 탐지된다. 일부 실시 양태에서, 인간 대상체는 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 항체 또는 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편이 IL-4 또는 IL-13 또는 이들 둘 모두에 결합하는 것에 대한 단백질 바이오마커 (biomarker)를 제공하며, 여기서, 바이오마커는 TARC/CCL17이다. 일부 실시 양태에서, 항체 또는 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 실시 양태에서, 인간 대상체는 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 특발성 폐 섬유증 (IPF)의 치료 방법을 제공하며, 이는 IPF를 갖는 인간 대상체에게 200 mg 이하의 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 IL-4, IL-13, 또는 IL-4와 IL-13 둘 모두에 결합한다. 일부 실시 양태에서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 주 1회 투여된다. 일부 실시 양태에서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 피하 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 특발성 폐 섬유증 (IPF)의 치료에 있어서의 안전 용량의 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편 200 mg 이하이다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편 약 50 mg, 또는 약 100 mg, 또는 약 200 mg이다. 일부 실시 양태에서, 상기 안전 용량은 피하 투여된다. 일부 실시 양태에서, 상기 안전 용량은 주 1회 투여된다. 일부 실시 양태에서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 IL-4, IL-13, 또는 IL-4와 IL-13 둘 모두에 결합한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 특발성 폐 섬유증 (IPF)의 치료를 위한 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편의 안전 용량들을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편 200 mg 이하이다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편 약 50 mg, 또는 약 100 mg, 또는 약 200 mg이다. 일부 실시 양태에서, 상기 안전 용량은 피하 투여된다. 일부 실시 양태에서, 상기 안전 용량은 주 1회 투여된다. 일부 실시 양태에서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 IL-4, IL-13, 또는 IL-4와 IL-13 둘 모두에 결합한다.

본 발명의 실시 양태의 하기의 상세한 설명은 하기 도면과 함께 읽을 때 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 IL-4 및 IL-13과 TARC/CCL17 시그널링 (signaling)의 관계를 나타낸다.
도 2는 증가하는 용량의 SAR156597에 의한 인간 대상체의 혈액에서의 감소된 TARC/CCL17 발현의 추세를 나타낸다.
도 3은 SAR156597을 첫 번째로 투여한 지 18주 후 인간 대상체의 혈액에서의 TARC/CCL17 발현의 지속적 감소를 나타낸다. 그래프는 50 mg, 100 mg, 또는 200 mg의 SAR156597을 주 1회 피하 투여한 환자의 혈액에서의 TARC/CCL17의 평균적인 양 대 시간을 나타낸다.
도 4는 용량 수준에 의한 시간이 지남에 따른 SAR156597 최저 농도를 나타낸다 (n=6, 100 mg에서 n=5는 제외).
도 5a 내지 도 5c는 시간이 지남에 따른 FRA-2 과다발현 트랜스제닉 (transgenic) 마우스의 폐에서의 섬유성 변화를 나타낸다. 도 5a. 발달 동안의 폐 중량의 증가; 도 5b. 제16주에서의 폐 크기의 증가; 도 5c. Tg (FRA2) 및 야생형 (Wt) 대조 마우스의 폐에서의 히드록시프롤린 함량의 증가.
도 6은 9주, 14주 및 17주에서의 FRA-2 과다발현 마우스의 폐 샘플의 영상을 나타낸다.
도 7은 히드록시프롤린에 의해 측정할 때 야생형 대조구와 비교하여 13주 및 16주에서의 FRA2 마우스의 피부에서의 콜라겐 함량을 나타낸다.
도 8은 야생형 대조구와 비교하여 8주, 13주 및 16주에서의 FRA2 마우스로부터의 샘플에서의 증가된 피부 두께를 나타낸다.
도 9는 발달 중이고 섬유화 중인 폐 및 피부의 사이토카인 프로파일 분석을 나타낸다.
도 10은 핵심 시그너토리 섬유성 마커 (signatory fibrotic marker)의 증가를 나타내는, FRA2 마우스로부터의 폐 및 피부의 유전자 발현 분석을 나타낸다.
도 11은 IL-13 Ab 처리된 FRA2 마우스 폐에서의 히드록시프롤린 수준을 나타낸다.
도 12는 FRA2 및 동복자 (littermate) 대조 폐의 조직 병리학적 분석을 나타내며, 이의 결과는 도 13에서 정량화되어 있다.
도 14는 IPF 바이오마커인 FN1, SPDEF, 및 MUC5B에 대한 실시간 PCR에 의한 전사체 분석을 나타낸다.
도 15는 전섬유성 (profibrotic) 마커인 CCL2, CCL11, 및 CCL22에 대한 실시간 PCR에 의한 전사체 분석을 나타낸다.
도 16은 IL-6, ARG1, 및 IL13Ra2에 대한 실시간 PCR에 의한 전사체 분석을 나타낸다.
도 17은 ELISA에 의해 분석되는 바와 같은, 폐 균질화물 중 IL-13, IL-4, 및 IL-17 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 18은 ELISA에 의해 분석되는 바와 같은, 폐 균질화물 중 MCP-1 (CCL2), CCL17, 및 YKL-40 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 19a는 문헌[Eferl et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (30): 10525-10530]에서 사용되는 바와 같은 생체 내에서의 Fra-2의 이소성 발현을 위한 트랜스제닉 구성물을 나타내며; 도 19b는 실시예 5에 기술된 바와 같은, 본원에서 사용되는 Fra-2 트랜스제닉 벡터를 나타낸다.
당업자라면 도면에서의 요소가 간단 명료함을 위하여 예시되며 반드시 축척대로 도시된 것은 아님을 알 것이다. 예를 들어, 도면에서의 요소들 중 일부의 치수는 본 발명의 실시 양태(들)의 이해의 개선을 돕기 위하여 다른 요소에 비해 과장될 수 있다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에서 인용된 각각의 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고 문헌은 이것이 본 발명의 개시 내용과 상반되지 않는다면 그 전체가 명백하게 참고로 포함된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용될 때, 단수형 ("a", "an", 및 "the")은 그 문맥이 명백히 달리 진술하지 않으면 복수의 언급 대상을 포함함이 본원에서 주지된다.

본원에서 "바람직하게는", "일반적으로" 및 "전형적으로"와 같은 용어는 청구된 발명의 범주를 제한하기 위하여 또는 특정한 특징이 청구된 발명의 구조 또는 기능에 결정적이거나, 필수적이거나, 또는 심지어 중요하다는 것을 의미하기 위하여 이용되는 것이 아님이 주지된다. 오히려, 이러한 용어는 단지 본 발명의 특정 실시 양태에서 이용될 수 있거나 이용될 수 없는 대안적인 또는 추가의 특징을 강조하기 위한 것이다.

본 발명을 기술하고 정의할 목적으로, 본원에서 "실질적으로"라는 용어는 임의의 정량적 비교, 값, 측정, 또는 다른 묘사에 기인할 수 있는 내재하는 불확실성의 정도를 나타내기 위하여 이용됨이 주지된다. 본원에서 "실질적으로"라는 용어는 또한 정량적 묘사가 논쟁 중인 주제의 기본적인 기능을 변화시키지 않고서 진술된 언급 대상에서 벗어날 수 있는 정도를 나타내기 위하여 이용된다.

더욱이, 본 발명에 따르면, 본 기술 분야의 기술 이내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] (본원에서 "Sambrook et al., 1989"]; 문헌[DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]]; 문헌[Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]]; 문헌[Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]]; 문헌[Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]]; 문헌[B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; 문헌[F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)]을 참조한다.

일부 용어 및 어구의 하기 비제한적 정의가 당업자를 가이드하기 위해 제공된다.

본원에서 사용될 때, "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"라는 용어는 상호교환가능하며, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체들의 사슬을 나타낸다. 전형적으로, 폴리펩티드 사슬은 비분지형이다. 본원에서 사용될 때, "잔기" 및 "단백질 잔기"라는 용어는 상호교환가능하며, 단백질 내에서 1개 이상의 펩티드 결합에 의해 다른 아미노산과 결합되는 아미노산을 나타낸다.

"인터루킨-4" (IL-4)는 천연 발생, 또는 내인성 포유류 IL-4 단백질 및 천연 발생 또는 내인성의 상응하는 포유류 IL-4 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질, 합성 단백질 (즉, 합성 유기 화학 방법을 이용하여 생성됨))과 관련된다. 따라서, 본원에서 정의되는 바와 같이, 상기 용어는 성숙 IL-4 단백질, 다형성 또는 대립유전자 변이체와, IL-4의 다른 이소형 (isoform) 및 전술한 것의 변형 또는 비변형 형태 (예를 들어, 지질화된 것, 글리코실화된 것)를 포함한다. 천연 발생 또는 내인성 IL-4는 야생형 단백질, 예컨대 성숙 IL-4, 다형성 또는 대립유전자 변이체 및 포유류 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류)에서 천연적으로 나타나는 다른 이소형 및 돌연변이 형태를 포함한다. 그러한 단백질은 예를 들어 천연적으로 IL-4를 생성하는 소스로부터 회수되거나 단리될 수 있다. 이러한 단백질과, 천연 발생 또는 내인성의 상응하는 IL-4와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 상응하는 포유류의 이름으로 지칭된다. 예를 들어, 상응하는 포유류가 인간일 경우, 그 단백질은 인간 IL-4로 표기된다. 몇몇 돌연변이 IL-4 단백질, 예컨대 국제 공개 제03/038041호에 개시된 것이 본 기술 분야에 공지되어 있다.

"인터루킨-13" (IL-13)은 천연 발생 또는 내인성 포유류 IL-13 단백질 및 천연 발생 또는 내인성의 상응하는 포유류 IL-13 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질, 합성 단백질 (즉, 합성 유기 화학 방법을 이용하여 생성됨))을 나타낸다. 따라서, 본원에서 정의되는 바와 같이, 상기 용어는 성숙 IL-13 단백질, 다형성 또는 대립유전자 변이체와, IL-13의 다른 이소형 (예를 들어, 대안적인 스플라이싱 (splicing) 또는 다른 세포 공정에 의해 생성됨) 및 전술한 것의 변형 또는 비변형 형태 (예를 들어, 지질화된 것, 글리코실화된 것)를 포함한다. 천연 발생 또는 내인성 IL-13은 야생형 단백질, 예컨대 성숙 IL-13, 다형성 또는 대립유전자 변이체 및 포유류 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류)에서 천연적으로 나타나는 다른 이소형 및 돌연변이 형태를 포함한다. 예를 들어, 본원에서 사용될 때, IL-13은 성숙 인간 IL-13의 위치 110의 Arg가 Gin (성숙 IL-13의 위치 110은 그 전구체 단백질의 위치 130에 상응함)으로 대체된 인간 IL-13 변이체 (이는 천식 (아토피성 및 비아토피성 천식)과 연관됨) 및 IL-13의 다른 변이체를 포함한다. (문헌[Heinzmann el al, Hum MoI Genet. (2000) 9:549-559]). 그러한 단백질은 예를 들어 천연적으로 IL-13을 생성하는 소스로부터 회수되거나 단리될 수 있다. 이러한 단백질과, 천연 발생 또는 내인성의 상응하는 IL-13과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 상응하는 포유류의 이름으로 지칭된다. 예를 들어, 상응하는 포유류가 인간일 경우, 그 단백질은 인간 IL-13으로 표기된다. 몇몇 돌연변이 IL-13 단백질, 예컨대 국제 공개 제03/035847호에 개시된 것이 본 기술 분야에 공지되어 있다.

일부 양태에서, 본 발명은 특발성 폐 섬유증 (IPF)의 치료에 관한 것이다. IL-4 및 IL-13은 그의 생물학적 기능을 기반으로 하면 치료적으로 중요한 사이토카인이며, 천식을 포함하는 많은 질환에서 중요한 역할을 한다 (문헌[Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vo. 5, 161-166]). IL-4는 자가 면역 질환을 저해할 수 있는 것으로 밝혀졌으며, IL-4 및 IL-13 둘 모두는 항-종양 면역 반응을 향상시키는 잠재력을 나타냈다. IL-4 및 IL-13과 이들의 수용체의 증가는 특발성 폐 섬유증 (IPF)의 병인과 연관되었다 (문헌[Jakubzick C. et al., Am J Pathol. 2004:164(6):1989-2001]; 문헌[Murray LA et al. Int J Biochem Cell Biol. 2008:40(10):2174-82]). 문헌에서의 증거는 TH2 사이토카인 IL-4 및 IL-13이 이러한 폐조직 리모델링 및 섬유증의 매개체로서 IPF의 병인에서 많은 역할을 하며 (문헌[Wynn, TA, Naat. Rev. Immunol, 4:583-594, 2004]), 비만 세포, 호염기구, 호산구, 대식 세포 및 상피 세포를 포함하는 다른 세포 유형도 이러한 사이토카인의 잠재적인 소스일 수 있음 (문헌[Gordon S and Martinez FO, Immunity Rev. 32:593-604, 2010])을 입증한다. IPF 환자에 있어서, 기관지 폐포 세척액 중 IL-13 및 IL-4의 수준은 정상 대조구와 비교하여 상승된다. 그러한 증거는 이러한 사이토카인의 억제 또는 중화가 가능한 치료법이 IPF 환자에 있어서 섬유증의 진행을 지연시키는 잠재력을 가짐을 시사한다. 상기 둘 모두의 사이토카인이 알러지성 질환 또는 섬유증 질환의 병인에 연루되어 있기 때문에, 이러한 사이토카인들의 저해제는 치료적 유익성을 제공할 수 있다.

항체 사슬 폴리펩티드 서열과 관련하여 "실질적으로 동일한"이라는 어구는 기준 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 나타내는 항체 사슬로서 해석될 수 있다. 핵산 서열과 관련하여 상기 용어는 기준 핵산 서열에 대하여 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드의 서열로서 해석될 수 있다. 동일성은 당업자가 이용가능한 임의의 생물정보학 툴 (bioinformatics tool)을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)가 일반적으로 서열 동일성 결정에 이용된다 (문헌[Altschul et al., JournaJ. Mol. Biol. (1990) 215:403-410]).

"동일성" 또는 "상동성"이라는 용어는 서열들을 정렬하고 필요할 경우 전체 서열에 있어서의 최대 동일성 퍼센트를 달성하도록 갭 (gap)을 도입한 후, 그리고 서열 동일성의 파트로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고서, 비교되는 상응하는 서열의 잔기와 동일한 후보 서열에서의 뉴클레오티드 염기 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미할 수 있다. N-말단 또는 C-말단 연장도 삽입도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되지 않는다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 이용가능하며 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정될 수 있다.

"치환형" 변이체는 천연 서열에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 그 자리에 동일 위치에 삽입되는 상이한 아미노산으로 대체된 것이다. 치환은 그 분자에서의 단지 하나의 아미노산이 치환된 단일 치환일 수 있거나, 2개 이상의 아미노산이 동일 분자에서 치환된 다중 치환일 수 있다. 복수의 치환들이 연접 부위에 있을 수 있다. 또한, 하나의 아미노산이 복수의 잔기로 대체될 수 있으며, 이 경우, 그러한 변이체는 치환 및 삽입 둘 모두를 포함한다. "삽입형" 변이체는 하나 이상의 아미노산이 천연 서열에서 특정 위치에서 소정의 아미노산에 바로 인접하여 삽입된 것이다. 소정의 아미노산에 바로 인접한이라는 것은 그 아미노산의 α-카르복실 또는 α-아미노 작용기 중 어느 하나에 연결됨을 의미한다. "결실형" 변이체는 천연 아미노산 서열에서의 하나 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 보통, 결실형 변이체는 분자의 특정 영역에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결실될 것이다.

"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 단클론 항체 (전장 단클론 항체를 포함함), 다클론 항체, 다중특이성 (multispecific) 항체 (예를 들어, 2특이성 (bispecific) 항체), 항체 단편 또는 하나 이상의 CDR 또는 CDR-유래된 서열을 지닌 합성 폴리펩티드 (이 폴리펩티드가 요망되는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면)를 포함한다. 항체 (Ab) 및 면역글로불린 (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 일반적으로, 항체는 규정되거나 인식된 특이성을 갖는 Ig로 간주된다. 따라서, 항체는 특정 표적에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체와, 표적 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 항체는 임의의 클래스 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 등) 또는 하위클래스 (subclass) (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG₃, IgG₄, IgA₁, IgA₂ 등)의 것일 수 있다 ("유형" 및 "클래스"와, "하위유형 (subtype)" 및 "하위클래스"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다). 천연 또는 야생형 항체 및 면역글로불린, 즉, 집단의 인공적으로 조작되지 않은 구성원으로부터 수득된 항체 및 면역글로불린은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L chain) 및 2개의 동일한 중쇄 (H chain)로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로사량체형 당단백질이다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 하나의 가변 도메인 (V_H), 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (V_L)을 갖고 다른 하나의 말단에 불변 도메인을 갖는다. "인공적으로 조작되지 않은"이라는 것은 외래 항원 결합 분자를 포함하거나 발현하도록 처리되지 않은 것을 의미한다. 야생형은 대립 유전자 또는 다형성과 비교하여, 집단에서 발견되는 가장 우세한 대립 유전자 또는 종 또는 비조작된 동물로부터 수득되는 항체, 또는 소정 형태의 조작, 예컨대 돌연변이 유발, 재조합적 방법의 사용 등에 의해 항원-결합 분자의 아미노산을 변화시키는 것에 의해 수득되는 변이체 또는 유도체를 나타낼 수 있다.

본원에서 사용될 때, "항-IL-4-항체"는 IL-4가 그의 수용체에 결합하는 것을 저해하거나 실질적으로 감소시키는 또는 IL-4 활성을 저해하는 분자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 본원에 정의된 바와 같이 IL-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이로부터 유도되는 폴리펩티드 (유도체)를 의미한다.

본원에서 사용될 때, "항-IL-13-항체"는 IL-13이 그의 수용체에 결합하는 것을 저해하거나 실질적으로 감소시키는 또는 IL-13 활성을 저해하는 분자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 본원에 정의된 바와 같이 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이로부터 유도되는 폴리펩티드 (유도체)를 의미한다.

항체의 가변 도메인의 맥락에서 "가변"이라는 용어는 항체들간에 서열이 광범위하게 상이하고 특정 항체의 그의 특정 표적에 대한 특이적인 인식 및 결합에서 이용되는 관련 분자의 특정한 부분을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인을 관통하여 고르게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서의 초가변 영역으로도 공지된 상보성 결정 영역 (complementarity determining region) (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)으로 칭해지는 3개의 세그먼트 (segment)에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (framework; FR) 영역 또는 서열로 칭해진다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 대체로 β-시트 배열 (configuration)을 채용하고, 3개의 CDR로 연결되는 4개의 FR 영역을 포함하는데, 상기 CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부의 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서의 CDR들은 흔히 FR 영역에 의해 근접한 상태로, 그리고 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 규합되며, 항체의 표적 (에피토프 또는 결정자) 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌[Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)] 참조). 본원에서 사용될 때, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링 (numbering)은 달리 표시되지 않으면 카바트 (Kabat) 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따라 행해진다. 하나의 CDR이 동계 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지닐 수 있다.

본 발명에서 사용될 때, "힌지 (hinge)" 또는 "힌지 영역"이라는 용어는 항체의 제1 불변 도메인과 제2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩티드를 나타낸다.

항체, 항원, 또는 항원-결합 단백질의 "단편", "기능성 단편", "변이체", "유도체", 또는 "유사체" 등과, 이의 형태라는 어구 및 용어는 관심 대상의 전장 항체 또는 항원과 공통인 정성적 생물학적 활성을 갖는 화합물 또는 분자이다. 예를 들어, 항-IL-4 항체의 기능성 단편 또는 유사체는 IL-4 분자에 결합할 수 있거나 리간드, 또는 작동 또는 길항 항체가 IL-4에 결합하는 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 것이다.

게다가, "단편" 및 "항체 단편"이라는 영역은 온전한 또는 전장의 사슬 또는 항체의 일부, 일반적으로 표적 결합 또는 가변 영역을 나타낸다. 항체 단편의 예는 F_ab, F_ab _', F_(ab')2 및 F_v 단편을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 항-IL-4 및/또는 IL-13 항체의 단편 또는 유사체는 수용체가 리간드에 결합하거나 시그널링을 개시하는 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 것이다. 본원에서 사용될 때, 항체와 관련하여 "단편", "기능성 단편" 및 "항체 단편"은 일반적으로 동의어이며, 수용체가 리간드에 결합하거나 시그널링을 개시하는 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 단편, 예컨대 F_v, F_ab, F_(ab')2 등을 나타낼 수 있다.

"F_v" 단편은 비-공유적 회합 상태의 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체 (V_H-V_L 이량체)로 이루어진다. 상기 배열에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 온전한 항체에서와 같이, V_H-V_L 이량체의 표면 상에서 표적 결합 부위를 규정하도록 상호작용한다. 총체적으로, 6개의 CDR이 표적 결합 특이성을 온전한 항체에 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 표적에 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 F_v의 하프 (half))도 표적을 인식하여 표적에 결합하는 능력을 가질 수 있다.

"단쇄 F_v", "sF_v" 또는 "scAb" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하며, 여기서, 이러한 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, F_v 폴리펩티드는 V_H 도메인과 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커 (linker), 흔히 가요성 분자를 추가로 포함하는데, 이는 sFv가 표적 결합에 요망되는 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다.

"디아바디 (diabody)"라는 용어는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타내는데, 이는 동일 폴리펩티드 사슬 내에 중쇄 가변 도메인 (V_H)이 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 것을 포함할 수 있다. 너무 짧아서 동일 사슬 상의 2개의 가변 도메인 사이에서는 쌍 형성을 허용할 수 없는 링커를 사용함으로써, 다이아바디 도메인은 또 다른 펩티드 사슬 상의 결합 도메인과 강제로 쌍이 형성되어 2개의 항원-결합 부위가 생성되게 된다.

"F_ab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인 (C_H1)을 포함한다. F_ab _' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하도록 C_H1 도메인의 카르복실 말단에서 몇 개의 잔기가 부가된다는 것이 F_ab 단편과는 다르다. F_ab _' 단편은 F_(ab')2 펩신 절단 생성물의 힌지 시스테인에서의 디술피드 결합의 절단에 의해 생성될 수 있다. 항체의 추가의 효소적 및 화학적 처리는 관심 대상의 다른 기능성 단편을 생성할 수 있다.

"선형 Fab"라는 용어는 문헌[Miller et al. (2003), J Immunol. 170: 4854-4861]에 기술된 바와 같이, 4가 (tetravalent) 항체를 나타낸다. 선형 Fab는 각각의 CH1-VH 위치에서 동일 경쇄와 쌍을 형성한, 동일 CH1-VH의 탠덤 (tandem)으로 구성된다. 이러한 분자는 결합활성 (avidity) 효과를 통하여 그의 기능적 친화도를 향상시키도록 항체가를 증가시키기 위하여 개발되었지만, 이것은 1특이성 (monospecific)이다.

구체적으로 본원에서 단클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스 (유형 또는 하위유형)에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이며, 이때 상기 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체와, 그러한 항체의 단편을 포함하며, 이는 이들이 IL-4 및/또는 IL-13에 결합하거나 IL-4 및/또는 IL-13 활성 또는 대사에 영향을 주는 요망되는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 그러하다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al. (1984), Proc Natl Acad Sci USA 81:6851]). 따라서, 하나의 항체 클래스로부터의 CDR이 상이한 클래스 또는 하위클래스의 항체의 FR 내로 그래프팅될 수 있다.

단클론 항체는 단일 표적 부위, 에피토프 또는 결정자에 대하여 유도되어 고도로 특이적이다. 더욱이, 항원의 상이한 결정자들 (에피토프들)에 대하여 유도된 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 통상적인 (다클론) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 표적 상의 단일 결정자에 대하여 유도된다. 단클론 항체는, 그의 특이성에 더하여, 숙주 세포에 의해 합성되고 다른 면역글로불린으로 오염되지 않아 유리하며, 이의 사슬들의 항체를 코딩하는 관련 유전자 및 mRNA의 클로닝을 제공한다. "단클론"이라는 수식어는 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특질을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 단클론 항체는 잘 알려진 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리 (library)로부터 단리될 수 있거나 다클론 제제로부터 정제될 수 있다. 본 발명에 따라 이용될 모 (parent) 단클론 항체는 문헌[Kohler et　al. (1975), Nature 256:495]에 기술된 하이브리도마 (hybridoma)법에 의해 제조될 수 있거나 본 기술 분야에 잘 알려진 재조합적 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용될 때, "다가 항체"라는 용어는 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함함으로써 동일하거나 상이한 구조를 가질 수 있는 2가지 이상의 항원에 동시에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. "2가"라는 용어는 항체가 2개의 항원 결합 부위를 포함함을 의미한다. "4가"라는 용어는 항체가 4개의 항원 결합 부위를 포함함을 의미한다.

본 발명에서 사용될 때, "항원 결합 부위"라는 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 대하여 상보성인 영역을 포함하는 항체의 부분을 나타낸다. 항원이 클 경우, 항체는 단지 항원의 특정 부분에 결합할 수 있으며, 상기 부분은 에피토프에 관해 칭해진다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인 (VH)의 회합으로 만들어진다.

본 발명에서 사용될 때, "항원"이라는 용어는 본 발명의 항체가 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 나타낸다. 항원은 하나 또는 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 본 발명의 항체에 의해 인식되는 항원의 예는 혈청 단백질, 예를 들어 사이토카인, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13, 생물활성 펩티드, 세포 표면 분자, 예를 들어 수용체, 수송자, 이온 채널, 바이러스 및 박테리아 단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용될 때, "1특이성"이라는 용어는 본 발명의 다가 항체가 단지 하나의 항원을 인식하며, 모든 항원 결합 부위가 동일함을 의미한다.

본 발명에서 사용될 때, "2특이성"이라는 용어는 본 발명의 다가 항체가 동일한 항원 또는 2가지의 상이한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프를 인식함을 의미한다.

"2특이성 항체" (BsAb)라는 용어는 단일 분자 내에서 2가지 항체의 항원-결합 부위들이 조합된 분자를 나타낸다. 따라서, 2특이성 항체는 2가지 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있다. 진단 목적을 위한 응용 외에, BsAb는 강한 이펙터 (effector) 시스템을 질환에 걸린 영역으로 다시 보냄으로써 또는 항체의 활성의 중화 또는 촉진을 증가시킴으로써 새로운 치료적 응용을 위한 길을 연다.

단일 분자 내에서 2가지 항체의 항원-결합 부위들이 조합된 2특이성 항체 (BsAb)를 생성하는 것은 흥미로운 것이었다. 따라서, 그러한 분자는 2가지 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있을 것이다. 진단 목적을 위한 응용 외에, 상기 분자는 예를 들어 강한 이펙터 시스템을 질환에 걸린 영역 (여기서, 암성 세포는 흔히 단클론 항체에 의해 트리거링되는 (triggered) 정상 면역 반응을 억제하는 메커니즘, 예컨대 항체-의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity; CDC)를 발달시킴)으로 다시 보냄으로써 또는 항체의 활성의 중화 또는 촉진을 증가시킴으로써 새로운 치료적 응용을 위한 길을 연다. 치료 목적을 위해 상이한 표적 항원에 대한 2가지 전체 항체의 결합 특이성들을 커플링시키려는 처음의 시도에서는 화학적으로 융합된 헤테로콘쥬게이트 (heteroconjugate) 분자가 이용되었다 (문헌[Staerz et al. (1985), Nature 314: 628-631]).

원래 2특이성 항체는 각각이 상이한 면역글로불린을 생성할 수 있는 두 하이브리도마의 융합에 의해 제조되었지만 (문헌[Milstein and Cuello, 1983, 1984]), 세포 배양에서 생성된 종 (10가지 이하의 상이한 종)의 복잡성은 정제를 어렵고 비용이 많이 들게 만든다 (문헌[George and Huston, 1997]). 상기에 인용된 바와 같이 세포 융합물로부터 생성된 2특이성 항체 또는 헤테로콘쥬게이트를 사용하여 수득되는 유망한 결과에도 불구하고, 몇몇 요인은 이것이 대규모의 치료적 응용에 있어서 비실용적이게 만들었다. 그러한 요인은 하기를 포함한다: 생체 내에서의 헤테로콘쥬게이트의 빠른 제거, 어느 하나의 유형의 분자의 생성에 요구되는 실험실 집약형 기술, 호모콘쥬게이트 (homoconjugate) 또는 1특이성 항체로부터의 헤테로콘쥬게이트의 광범위한 정제에 대한 필요성 및 일반적으로 낮은 수율.

유전 공학을 증가하는 빈도로 이용하여, 결합 특성 및 이펙터 기능의 요망되는 세트를 갖는 항체 또는 항체 유도체를 설계하고, 변형시키고, 생성하였다. 다양한 재조합적 방법이 항체 단편 (문헌[Carter et al. (1995), J. Hematotherapy 4: 463-470]; 문헌[Pluckthun et al. (1997) Immunotechology 3: 83-105]; 문헌[Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248: 47-66]) 및 전장 IgG 포맷 (format) (문헌[Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15]) 둘 모두로서의 BsAb의 효율적인 생성을 위하여 개발되었다.

애보트 (Abbott)는 미국 특허 제7612181호에서 쥐과 이중-가변 도메인 IgG (Dual-Variable-Domain IgG; DVD-IgG) 2특이성 항체를 기술하였는데, 이는 유니레버 (Unilever)의 특허 (미국 특허 제5989830호)에 기술된 이중-Fv 포맷을 기반으로 한다. 인간화 2특이성 포맷이 국제 공개 제2009/052081호 (TBTI)에 기술되었는데, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 이중-Fv의 각각의 사슬에의 불변 도메인의 부가 (중쇄에의 CH1-Fc 및 경쇄에의 카파 또는 람다 불변 도메인의 부가)는 기능성 2특이성 이중-V-영역 항체 유사 결합 단백질을 초래하였다.

IL-4 및 IL-13에 특이적으로 결합하는 4개의 결합 부위를 갖는 2특이성 이중-가변-영역 (이중-V-영역) 항체-유사 결합 단백질이 국제 특허 출원 제PCT/US2008/079787호 (국제 공개 제2009/052081호) 및 국제 특허 출원 제PCT/US2012/029147호 (국제 공개 제2012/125775호)에 보고되었으며, 이들 둘 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 실시 양태는 동일한 항원 상의 또는 2가지의 상이한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 이중-V-영역 항체-유사 단백질 또는 이의 단편을 포함하도록 엔지니어링된 (engineered) 2특이성 항체이다. 본 발명의 실시 양태는 IL-13 및 IL-4에 특이적으로 결합하는 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편으로서, 여기서, 상기 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하고, 상기 가변 경쇄 도메인은 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시 양태는 IL-13 및 IL-4에 특이적으로 결합하는 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편으로서, 여기서, 상기 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하고, 상기 가변 중쇄 도메인은 서열 번호 2 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 양태는 IL-13 및 IL-4에 특이적으로 결합하는 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편으로서, 여기서, 상기 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하고, 상기 가변 중쇄 도메인은 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 일 실시 양태는 IL-13 및 IL-4에 특이적으로 결합하는 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편으로서, 여기서, 상기 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편은 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도베인, 및 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시 양태는 IL-13 및 IL-4에 특이적으로 결합하는 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편으로서, 여기서, 상기 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편은 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인, 및 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함하고, 펩티드 링커가 서열 번호 1의 서열을 서열 번호 3의 서열에 연결시키며, 펩티드 링커가 서열 번호 2의 서열을 서열 번호 4의 서열에 연결시킨다.

본 발명의 일 실시 양태는 (a) 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인; (b) 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인; (c) 서열 번호 1의 서열을 서열 번호 3의 서열에 연결시키는 펩티드 링커 및 서열 번호 2의 서열을 서열 번호 4의 서열에 연결시키는 펩티드 링커 (여기서, 펩티드 링커는 서열 번호 6의 서열로 이루어진 아미노산 서열을 가짐); 및 (d) 불변 영역 도메인을 포함하는, IL-13 및 IL-4에 특이적으로 결합하는 2특이성 항체 또는 이의 2특이성 항체 단편을 포함하는 huTBTI3_2_1 또는 SAR156597이다.

본 발명에서 사용될 때, "다중특이성"이라는 용어는 본 발명의 다가 항체가 동일한 항원 또는 다수의 상이한 항원 상의 다수의 상이한 에피토프를 인식함을 의미한다.

본 발명에서 사용될 때, "링커"라는 용어는 본 발명의 항체 구성물의 가변 도메인들을 연결시키도록 맞춰진 펩티드를 나타낸다. 펩티드 링커는 임의의 아미노산을 포함할 수 있으며, 아미노산은 글리신 (G) 및 세린 (S)이 바람직하다. 링커는 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드 사이에서 그리고 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드 내에서 서로와 동일하거나 서로와 상이할 수 있다. 더욱이, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 경쇄 도메인에 대해서와 같이 중쇄 도메인에 대해 바람직한 펩티드 링커 단위는 GGGGS이다. 중쇄의 링커 단위 및 경쇄의 링커 단위의 수는 서로 동일하거나 (대칭적인 질서) 서로와 상이할 수 있다 (비대칭적 질서).

바람직하게는 펩티드 링커는 항체 모이어티 (moiety)가 예를 들어 입체 장애에 의해 서로의 활성을 간섭하는 것을 방지하도록 적당한 정도의 가요성을 제공하고, 적당한 단백질 폴딩 (folding)을 허용하고, 필요할 경우, 항체 분자가 동일 세포 상의 2개 이상의, 가능하게는 넓게 이격된 수용체와 상호작용하게 하기에 충분히 길지만; 이것은 바람직하게는 항체 모이어티가 세포 내에서 여전히 안정한 채로 있게 하기에 충분히 짧다.

따라서, 펩티드 링커의 길이, 조성 및/또는 배좌는 다가 항체의 요망되는 특성을 최적화하기 위하여 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다.

비-인간 (예를 들어, 쥐과) 항체의 "인간화" 형태는 인간 항체와 비교하여 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이들의 단편 (예컨대 F_v, F_ab, F_ab _', F_(ab')2 또는 항체의 다른 표적-결합 하위서열 (subsequence))이다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 전부의 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서, 전부의 또는 실질적으로 전부의 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 전부의 또는 실질적으로 전부의 FR 영역은 인간 면역글로불린 주형 서열의 것이다. 인간화 항체는 적어도 일부분의 면역글로불린 불변 영역 (F_c), 전형적으로, 선택된 인간 면역글로불린 주형의 것을 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 그 목표는 인간에서 최소의 면역원성을 갖는 항체 분자를 갖는 것이다. 따라서, 하나 이상의 CDR에서의 하나 이상의 아미노산을 또한 상기 하나 이상의 CDR이 IL-4 및/또는 IL-13에 특이적으로 결합하는 기능을 실질적으로 최소화시키지 않고서 인간 숙주에 대하여 덜 면역원성인 것으로 바꿀 수 있다는 것이 가능하다. 대안적으로, FR은 비-인간 FR일 수 있지만, 가장 면역원성이 큰 그러한 아미노산은 덜 면역원성인 것으로 대체된다. 그럼에도 불구하고, 상기에 논의된 바와 같은 CDR 그래프팅이 인간화 항체를 수득하는 유일한 방법은 아니다. 예를 들어, 단지 CDR 영역을 변형시키는 것은 불충분할 수 있으며, 그 이유는 프레임워크 잔기가 CDR 루프의 삼차원 구조 및 항체의 그의 리간드에 대한 전체 친화도를 결정하는 역할을 맡는 것이 흔하기 때문이다. 따라서, 비-인간 모 항체 분자가 인간에게 덜 면역원성인 것이 되게 변형되도록 임의의 수단이 실행될 수 있으며, 전반적인 인간 항체와의 서열 동일성이 항상 필요한 것은 아니다. 그래서, 인간화는 또한 예를 들어 단지 몇 개의 잔기, 특히 항체 분자 상에 노출되고 분자 내에 묻혀 있지 않으며 따라서 숙주 면역계에 쉽게 접근가능하지 않은 잔기의 단순한 치환에 의해 달성될 수 있다. 그러한 방법이 항체 분자 상에서의 "이동성" 또는 "가요성" 잔기의 치환과 관련하여 본원에 교시되어 있으며, 그 목표는 항체의 그의 에피토프 또는 결정자에 대한 특이성을 포함하지 않고서 생성된 분자의 면역원성을 감소시키거나 약화시키는 것이다. 예를 들어, 문헌[Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007]; 문헌[Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993)]; 문헌[Chothia et　al., J Mol Biol 196:901 (1987)]; 문헌[Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992)]; 문헌[Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993)], 국제 공개 제2006/042333호 및 미국 특허 제5,869,619호를 참조한다.

"항체 상동체" 또는 "상동체"는 본원에 교시된 바와 같이 IL-4 및/또는 IL-13에 특이적으로 결합하는 임의의 분자를 나타낸다. 따라서, 항체 상동체는 변형되든지 변형되지 않든지 간에 천연 또는 재조합 항체, 관심 대상의 생물학적 특성, 예컨대 IL-4 또는 IL-13에의 결합성을 보유하는 항체의 일부, 예컨대 F_ab 또는 F_v 분자, 단쇄 항체, 하나 이상의 CDR 영역을 지닌 폴리펩티드 등을 포함한다. 상동체의 아미노산 서열은 천연 발생 항체의 것과 동일할 필요는 없지만, 향상된 특성 또는 다른 유익한 특성을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위하여 치환 아미노산, 삽입 아미노산, 결실 아미노산, 단백질에서 정상적으로 발견되는 20개 이외의 아미노산 등을 지니도록 변경되거나 변형될 수 있다.

상동 서열을 갖는 항체는 본 발명의 IL-4, IL-13 또는 2특이성 IL-4/IL-13 항체의 아미노산 서열과 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직하게는, 상동성은 본 발명의 항체의 가변 영역의 아미노산 서열과의 상동성이다. 본원에서 아미노산 서열에 적용될 때 "서열 상동성"은 예를 들어 문헌[Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988)]에 따른 FASTA 검색법에 의해 결정할 때 또 다른 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 갖는 서열로서 정의된다.

키메라 항체는 상이한 소스, 예컨대 상이한 항체, 상이한 클래스의 항체, 상이한 동물 종으로부터 유래된 항체의 상이한 부분을 갖는 것, 예를 들어 쥐과 단클론 항체로부터 유래된 가변 영역이 인간 면역글로불린 불변 영역과 쌍을 형성한 항체 등이다. 따라서, 인간화 항체는 일종의 키메라 항체이다. 키메라 항체의 생성 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Morrison, 1985, Science 229:1202]; 문헌[Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214]; 문헌[Gillies et　al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202]; 및 미국 특허 제5,807,715호, 미국 특허 제4,816,567호, 및 미국 특허 제4,816,397호를 참조한다.

인공 항체는 각각이 항원-결합 또는 에피토프-결합 능력을 갖는 scFv 단편, 키메라 항체, 다이아바디, 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 및 분자 인식 단위 (molecular recognition unit; mru)를 포함한다 (문헌[Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299] 및 문헌[Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:548-557]의 리뷰를 참조). 단쇄 F_v 단편 (scF_v)에서, 항체의 V_H 및 V_L 도메인은 가요성 펩티드에 의해 연결된다. 전형적으로, 링커는 약 15개의 아미노산의 펩티드이다. 링커가 훨씬 더 작을 경우, 예를 들어, 5개의 아미노산일 경우, 다이아바디가 형성된다. 항체의 최소 결합 단위는 CDR, 전형적으로, 중쇄의 CDR2인데, 이는 충분한 특이적 인식 및 결합 능력을 갖는다. 그러한 단편은 분자 인식 단위 또는 mru로 칭해진다. 몇몇의 그러한 mru는 짧은 링커 펩티드와 함께 연결되고 그에 따라 단일 mru보다 더 높은 결합활성을 갖는 인공 결합 단백질을 형성할 수 있다.

본 발명의 범주 내에 또한 포함되는 것은 관심 대상의 항체의 기능성 등가물이다. "기능성 등가물"이라는 용어는 예를 들어 상동 서열을 갖는 항체, 항체 상동체, 키메라 항체, 인공 항체 및 변형 항체를 포함하며, 여기서, 각각의 기능성 등가물은 IL-4 및/또는 IL-13에 결합하여, IL-4 및/또는 IL-13 시그널링 능력 또는 기능을 저해하거나, 또는 IL-4 및/또는 IL-13의 그의 수용체에의 결합을 저해하는 능력에 의해 정의된다. 당업자라면, "항체 단편"으로 칭해지는 분자군과 "기능성 등가물"로 칭해지는 군에서 중첩이 있음을 이해할 것이다. IL-4 및/또는 IL-13 결합 능력을 보유하는 기능성 등가물의 생성 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 국제 공개 제93/21319호, EPO Ser. No. 239,400, 국제 공개 제89/09622호, EPO Ser. No. 338,745 및 EPO Ser. No. 332,424에 개시되어 있다.

본 출원의 기능성 등가물은 변형된 항체, 예를 들어, 임의의 유형의 분자의 항체에의 공유적 부착에 의해 변형된 항체를 또한 포함한다. 예를 들어, 변형된 항체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화 (pegylation), 탈아미드화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 분해적 절단, 세포 리간드에의 연결, 독소 또는 세포독성 모이어티 또는 다른 단백질에의 연결 등에 의해 변형된 항체를 포함한다. 공유적 부착은 항-이디오타입 (anti-idiotypic) 반응을 생성하는 것에 의해 면역성이 있게 되는 항체를 생성할 필요는 없다. 변형은 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 대사 합성 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다. 부가적으로, 변형된 항체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 포함할 수 있다.

치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 동물, 비인간 영장류, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 나타낸다.

본 발명에서 사용될 때, "치료"라는 용어는 치료 과정으로서의 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 나타낸다. 이것은 질환 상태, 질환의 진행, 질환의 원인이 되는 에이전트 (agent) (예를 들어, 박테리아 또는 바이러스) 또는 기타 비정상적 병태의 유해한 영향을 예방하거나, 치유하거나, 역전시키거나, 약화시키거나, 완화시키거나, 최소화하거나, 억제하거나, 중단시키는 것을 나타낸다.

"단리된" 또는 "정제된" 항체에는 그 단백질이 유래된 배지 또는 세포 또는 조직 소스로부터의 세포 물질 또는 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다. "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 용어는 항체 제제로서, 그 폴리펩티드/단백질이 단리되거나 재조합적으로 생성되는 세포의 세포 성분으로부터 상기 폴리펩티드/단백질이 분리된 항체 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만의 오염 단백질을 갖는 항체 제제를 포함한다. 항체가 재조합적으로 생성될 경우, 이것에는 또한 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% 미만을 나타낸다. 항체가 화학적 합성에 의해 생성될 경우, 이것에는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질 및 시약이 바람직하게는 실질적으로 없으며, 즉, 관심 대상의 항체는 단백질의 합성에 연루된 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 항체의 그러한 제제는 관심 대상의 항체 이외의, 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만의 화학적 전구체 또는 화합물을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 항체는 단리되거나 정제된다.

본원에서 사용될 때, "치료제" 및 "치료제들"이라는 용어는 이상 IL-4 및/또는 IL-13 대사 및 활성과 연관된 질환, 장애, 병 등의 치료, 관리 또는 개선에서 사용될 수 있는 임의의 에이전트(들)를 나타낸다.

본원에서 사용될 때, "용량"은 이상 IL-4 및/또는 IL-13 대사 및 활성과 연관된 질환, 장애, 병 등의 치료, 관리 또는 개선에서 사용될 수 있는 임의의 에이전트(들)의 양을 나타낸다.

본원에서 사용될 때, "안전 용량"은 임상적으로 허용가능한 유익성/위험 프로파일을 유지하면서 이상 IL-4 및/또는 IL-13 대사 및 활성과 연관된 질환, 장애, 병 등의 치료, 관리 또는 개선에서 사용될 수 있는 임의의 에이전트 (들) 또는 임의의 에이전트 (들)의 용량을 나타낸다. 본원에 개시된 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편의 안전 용량은 10 mg, 20 mg, 40 mg, 50 mg, 80 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 및 300 mg으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 안전 용량의 일 실시 양태는 약 10 mg 내지 약 300 mg이다. 안전 용량의 추가의 실시 양태는 200 mg, 약 200 mg, 200 mg까지, 또는 약 200 mg 이하인 임의의 용량이다. 다른 실시 양태에서, 안전 용량은 약 50 mg, 또는 약 100 mg, 또는 약 200 mg이다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 주 1회 투여된다. 일부 실시 양태에서, 안전 용량은 피하 (SC) 투여된다.

IL-4 및 IL-13의 그의 세포 표면 수용체와의 라이게이션 (ligation) 후 세포내 시그널링은 부분적으로는 시그널링 분자인 신호 전달자 및 전사 활성화 인자 6 (Stat6)의 포스포릴화에 의해 매개된다.

케모카인 (C-C 모티프) 리간드 17 (CCL17)은 CC 케모카인 패밀리에 속하는 소형 사이토카인이다. CCL17은 흉선 및 활성화 조절되는 케모카인 (thymus and activation regulated chemokine; TARC)으로도 공지되어 있다. TARC는 Stat6 포스포릴화를 통하여 IL-4 및/또는 IL-13에 의해 유도된다 (문헌[Wirnsberger et al., (2006) Eur J Immunol. 36: 1882-91]; 문헌[Liddiard et al., (2006) BMC Mol Biol. 29　: 7:45]; 문헌[Monick et al., (2007) J Immunol. 179:1648-58]). 따라서, 예를 들어, IL-4/IL-13-결합 항체-유사 단백질에 의한 IL-4 및/또는 IL-13-매개된 시그널링의 저해는 TARC 유도의 저해와 상관된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 투여된 항체 또는 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편의 IL-4 및/또는 IL-13에의 결합을 탐지하는 방법을 포함하며, 본 방법은 (a) 항체 또는 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 대상체로부터 대상체로부터 취해진 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 내의 CCL17/TARC의 양을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서, 항체 또는 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편의 투여 전 대상체로부터 취해진 샘플에 비하여 샘플 중 CCL17/TARC의 양이 감소하는 것은 항체 또는 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편의 IL-4 및/또는 IL-13에의 결합을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 실시 양태에서, 항체 또는 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 실시 양태에서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 IL-4 또는 IL-13에 대하여 특이적이거나, 또는 IL-4 및 IL-13에 대하여 2특이성이다. 일부 실시 양태에서, 단계 (c)는 단계 (b)에서 측정된 TARC/CCL17의 감소가 역치 미만일 경우 (즉, TARC/CCL17 수준이 충분히 감소하지 않을 경우) 용량을 증가시키거나, 단계 (b)에서 측정된 TARC/CCL17의 감소가 역치 초과일 경우 (즉, TARC/CCL17이 너무 많이 감소한 경우) 용량을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 단계 (c)의 역치는 당해 용량을 투여하기 전에 측정된 대상체에서의 TARC/CCL17의 양에 비하여 TARC/CCL17의 양의 대략 10% 감소, 또는 대략 15% 감소, 또는 대략 20% 감소, 또는 대략 25% 감소, 또는 대략 30% 감소, 또는 대략 35% 감소, 또는 대략 40% 감소, 또는 대략 45% 감소, 또는 대략 50% 감소, 또는 대략 55% 감소, 또는 대략 60% 감소, 또는 대략 65% 감소이다. 일부 실시 양태에서, 상기 역치는 당해 용량을 투여하기 전에 측정된 대상체에서의 TARC/CCL17의 양에 비하여 TARC/CCL17의 양의 대략 20% 내지 대략 60% 감소, 또는 대략 40% 내지 대략 50% 감소이다. 일부 실시 양태에서, 상기 역치는 당해 용량을 투여하기 전에 측정된 대상체에서의 TARC/CCL17의 양에 비하여 TARC/CCL17의 양의 대략 43% 감소이다. 예를 들어, 200 mg 용량에 있어서의 43% 감소는 200 mg 용량의 2특이성 항-IL-4/IL-13 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질의 IL-4/IL-13에의 결합을 나타낸다.

수치 값과 관련하여 사용될 때 "약"이라는 용어는 표시된 수치 값보다 5%, 10%, 또는 15% 더 작은 하한치를 갖고 표시된 수치 값보다 5%, 10%, 또는 15% 더 큰 상한치를 갖는 범위 내의 수치 값을 포함함을 의미한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 특정 실시 양태 및 이의 다양한 용도를 예시하는 것이다. 본 실시예는 단지 설명 목적으로 개시되며, 본 발명을 한정하는 것으로 취해져서는 안된다.

"huTBTI3_2_1" 및 "SAR156597"이라는 용어는 상호교환가능하며, 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 상기 이중-V-영역 항체-유사 단백질을 나타낸다.

실시예 1: 임상 연구 포맷

다기관, 무작위, 이중 맹검, 위약-대조 임상 연구를 행하여 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는 환자의 3가지 이하의 순차적 증가 용량의 코호트에서 6주의 기간에 걸쳐 주 1회 피하 (SC) 투여한 SAR156597의 반복 용량의 안전성 및 내용성을 평가하였다. IPF는 한결같이 치명적인 비공지된 원인의 진행성, 미만성의 특유한 만성 섬유화 간질성 폐렴이며, 이때 중간 생존 기간은 2년 내지 3년이다.

각각의 용량 코호트에서, 8명의 환자 (6명은 SAR156597을 받고, 2명은 위약을 받음)는 반복된 SC, 주 1회의 용량의 SAR156597 또는 매칭되는 위약 대조구를 받았다. 제2 코호트를 DMC에 의한 제1 코호트의 안전성의 재검토 후 개시하였다. 200 mg의 용량의 제3 코호트를 상기 2가지의 이전의 코호트의 안전성의 재검토 후 개시하였다.

각각의 환자에 있어서, 연구의 지속 시간은 하기와 같이 22주였다: 4주의 스크리닝, 6주의 치료 기간 (7회의 투여); 및 12주의 추적 관찰 (follow-up).

제12주에서, 면역원성과 관련된 항-약물 항체 (anti-drug antibody; ADA)가 존재할 경우, 제1 용량 후 추가의 추적 관찰 방문을 최소 6개월에 하여서 상승된 파라미터를 조사하였다. 임상 실험의 마지막을 마지막 환자가 이 프로토콜에서 계획된 자신의 마지막 방문을 완료한 날로 정의하였다.

연구 집단의 선택. 환자를 하기 기준에 따라 연구에 포함시켰다.

포함 기준

- 성인 (18세 초과) 남성 또는 여성 환자.

- 현재의 미국 흉부 학회 (AMERICAN THORACIC SOCIETY; ATS) / 유럽 호흡기 학회 (THE EUROPEAN RESPIRATORY SOCIETY; ERS) / 일본 호흡기 학회 (THE JAPANESE RESPIRATORY SOCIETY; JRS) / 라틴 아메리카 흉부 협회 (THE LATIN AMERICAN THORACIC ASSOCIATION; ALAT) 지침에 따른 문서화된 IPF의 진단, 즉, 간질성 폐질환의 다른 공지된 원인 (예를 들어, 가정적 및 직업적 환경적 노출, 결합 조직 질환, 및 약물 독성)의 배제; 및 (1) 수술적 폐 생검을 하지 않은 환자에서의 고해상도 전산화 단층 촬영 (high-resolution computed tomography; HRCT)에서의 일반적인 간질성 폐렴 패턴의 존재; 또는 (2) 수술적 폐 생검을 한 환자에 있어서 HRCT와 수술적 생검 패턴의 특정한 조합 중 어느 하나.

- 본 연구에 관련된 임의의 절차 전에 얻어진, 서면으로 된, 서명되고 날짜가 적힌 고지에 입각한 동의서.

배제 기준

- 노력성 폐활량: 예상값의 <50%.

- 일산화탄소 폐 확산능 (헤모글로빈에 대하여 보정됨): 예상값의 <35%.

- 휴식시 (10분 동안 앉은 자세) 주위 공기를 호흡하는 동안 맥박 산소 측정법에 의한 산소 포화도: <90%.

- IPF 이외의 유의한 호흡기 장애 (예를 들어, 과다반응성 기도 질환, 결핵, 유육종증, 아스페르길루스증, 기종 또는 만성 폐쇄성 폐질환 [chronic obstructive pulmonary disease; COPD], 또는 낭포성 섬유증)의 공지된 진단.

- 활성 혈관병증 또는 혈관 작용약 (vasoactive drug) (예를 들어, 포스포디에스테라아제 4 저해제, 칼시뉴린 (calcineurin) 저해제, 타크로리무스 (tacrolimus), 시클로스포린)의 사용.

- 공지된 HIV 또는 만성 바이러스성 간염.

- 활성 결핵 또는 잠복 결핵 감염을 갖는 환자 (결핵과 관련된 배제: 활성 결핵 또는 불완전하게 치료된 결핵의 이력; (이전의 치료 상태와는 관계 없이) 스크리닝에서 양성 퀀티페론 (QuantiFERON)-TB 골드 (Gold)^® 검사; 적어도 전후상을 포함하는 흉부 방사선 사진 (방사선 사진은 스크리닝 방문 전 12주 내에 또는 스크리닝 기간 동안 촬영되어야 함)을 기반으로 하여 이전/활성 결핵 감염과 일치하는 임상적으로 유의한 이상. 추가의 측면상이 권고되지만, 필요한 것은 아니다. 후속적인 적절한 항-결핵 치료와는 관계 없이, 이전의 종양 괴사 인자-α (TNF-α)-길항제 또는 다른 비-항-TNF-α 바이오DMARD 치료 동안 잠재성 결핵 감염이 재활성화된 환자. 의심되는 폐외 결핵 감염; 활성 또는 잠재성 결핵을 갖는 개체와의 밀접한 접촉과 같은 결핵에 걸릴 위험이 높은 환자.).

- 임의의 임상적으로 유의하거나, 중증이거나, 불안정한, 급성 또는 만성적 진행성의 의학적 장애 (IPF 이외의 것) 또는 외과적 장애, 또는 조사관의 판단에서 환자 안전성에 영향을 줄 수 있는 임의의 병태의 증거.

- 스크리닝에서 임상적으로 유의한 비정상적인 심전도 (ECG) (QTc ≥500 ms를 포함함).

- 스크리닝에서 임상적으로 유의한 실험실 검사: 알라닌 트랜스아미나아제 (ALT) 또는 아스파르테이트 트랜스아미나아제 (AST): 정상 범위의 상한치 (upper limit of normal range; ULN)의 2배 초과; 남성의 경우 헤모글로빈: <12 g/100 mL 및 여성의 경우: <11 g/100 mL; 호중구: <1500/mm³ ⁽아프리카 출신의 경우의 <1000/mm³를 제외함); 혈소판: <150 000/mm³; 크레아티닌 ≥150 μmol/L.

- 현재의 물질 및/또는 알코올 남용 이력.

- 수유 중이거나 임신한 여성.

- 스크리닝에서 소변중 베타-인간 융모성 성선 자극 호르몬 (β-HGC) 임신 검사가 양성이고 허용가능한 형태의 피임법 (예를 들어, 피임약 (birth control pill), 자궁내 기구, 임플란트 (implant), 데포-프로베라 (Depo-Provera)™의 주사, 이중-장벽법 (double-barrier method), 금욕, 정관 절제 수술을 한 파트너 - 지역 보건 당국이 허용한다면)을 이용하지 않는, 가임 잠재력의 여성 (폐경기후 2년 미만이거나 외과적으로 불임인 것이 아님).

- 스크리닝 전 4주 내에 IPF를 치료하도록 표적화된 임의의 등록된 치료법의 사용.

- 스크리닝 전 4주 내에 아자티오프린 (azathioprine), 시클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 시클로스포린을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 세포독성제/면역억제제의 사용.

- 스크리닝의 5 반감기 또는 12주 (리툭시맙의 경우 24주 및 알레파셉트 (alefacept)의 경우 24개월) 내에 임의의 사이토카인 조절제 (에타너셉트 (etanercept), 아달리무맙 (adalimumab), 에팔리주맙 (efalizumab), 인플릭시맙 (infliximab), 골리무맙 (golimumab), 세르톨리주맙 (certolizumab), 리툭시맙 (rituximab))의 사용.

- (어느 쪽이 더 긴지) 공지된 경우, 스크리닝의 1개월, 또는 5 반감기 내에 임의의 임상시험용 약물 (investigational drug)의 사용.

임상시험용 의약품 (investigational medicinal product; IMP)를 SC 투약 용액의 제조를 위하여 동결건조 형태의 SAR156597로서 제공하였다. 185 mg의 SAR156597 + 부형제를 포함하는 각각의 바이알을 2℃ 내지 8℃ (36℉ 내지 46℉)에서 보관하였다. IMP를 실온에서 1.7 mL의 살균, 비발열성 증류수를 이용하여 투약하는 아침에 (SC 주사 전 1시간 이하의 시간에) 재구성하였다. 주사를 위한 재구성 후의 용액 중 구성 성분의 농도는 다음과 같았다: 6.3 mmol/L의 제1인산나트륨 중 100 mg/mL의 SAR156597, 3.7 mmol/L의 트로메타민 (tromethamine), 5% (중량/부피)의 수크로스, 3% (w/V)의 프롤린 및 0.2% (w/V)의 폴리소르베이트 80, 이때 최종 pH는 7.0임.

위약에 있어서, 재구성된 SAR156597 제형에 대한 것과 동일한 농도의 동일 부형제를 포함하는 액체 2 mL를 포함하는 각각의 바이알을 제공하였다.

1 mL 시린지를 1.0 mL 이하의 부피를 전달하는 데 사용하였으며; 2 내지 3 mL를 전달하도록 눈금이 매겨진 시린지를 1 mL보다 더 큰 부피를 전달하는 데 사용하였다. 다양한 계획 용량 수준에 필요한 요구되는 부피에 대한 요약을 표 1에 나타낸다.

[표 1]

IMP (SAR156597 또는 위약)를 배꼽 주위 SC 주사로서 투여하였다. 재구성한지 1시간 내에, 허리선 위의 좌측 또는 우측 사분면 내의 배꼽으로부터 4 내지 10 cm의 구역 내에 당해 용량을 투여하였다.

연구에서의 용량의 선택

SAR156597은 IL-4 및 IL-13 둘 모두에 결합하여 이를 중화시키는 엔지니어링된 인간화 2특이성 면역글로불린 G (IgG)-4 항체이다. SAR156597은 인간 및 시노몰구스 원숭이 둘 모두로부터의 IL-4 및 IL-13에 대하여 높은 친화도를 나타낸다.

각각의 환자에 있어서, 6주 동안의 주 1회 SC 용량을 투여하고 (총 7회의 투여), 코호트 1 내지 3에서의 용량 증가를 하기와 같이 수행하였다: 코호트 1에 있어서 50　mg　 (0.5　mL)의 SAR156597, 코호트 2에 있어서 100 mg (1 mL)의 SAR156597, 및 코호트 3에 있어서 200　mg　 (2.0 mL)의 SAR156597, 이들 전부는 매칭 위약과 함께임.

실시예 2: 약력학적 특성 ( Pharmacodynamics ; PD)의 평가

반복된 상승하는 용량의 SAR156597의 영향을 폐기능 검사 (pulmonary function test; PFT), 호흡기 증상에 대하여, 그리고 선택된 바이오마커에 대하여 평가하였다. 더 구체적으로, 하기 PD 변수를 평가하였다:

1. 폐기능 검사 (PFT): 헤모글로빈에 대하여 보정된 일산화탄소 확산능 (DLCO); 강제 (호기) 폐활량 (Forced (expiratory) vital capacity; FVC); 1초에 걸친 강제 호기량 (Forced expiratory volume over 1 second; FEV1); 총 폐용량 (Total lung capacity) (체부 체적 변동 기록법 (body plethysmography)) (TLC); 잔기량 (Residual volume) (체부 체적 변동 기록법) (RV). 2회의 PFT를 투약 전 3주 내에 수행하였다. 제1 PFT를 수행하여 환자를 스크리닝하고, 제2 PFT (무작위 방문시에)로부터의 데이터를 첫 번째의 것과 평균하여 기저선 값을 확립하였으며; 이러한 검사들을 별도의 날에 수행하였다. 또한 PFT를 방문 8 (제6주)/치료 종료시에 (end-of-treatment; EOT) 그리고 방문 14 (제18주/연구 치료의 마지막 용량 후 12주)에 수행하였다.

2. 산소 포화도를 스크리닝시에, 기저선에서, 제6주/EOT에서, 그리고 제18주 (연구 치료의 마지막 용량 후 12주)에서 SpO2를 이용하여 평가하였다. 제1 SpO2 측정을 스크리닝시에 수행하고, 제2 측정으로부터의 데이터를 첫 번째의 것과 평균하여 기저선 값을 확립하였으며; 이러한 검사를 별도의 날에 수행하였다.

3. 삶의 질 (quality of life; QoL)에 대한 IPF의 영향을 기저선에서, 제6주/EOT에서, 그리고 제18주 (연구 치료의 마지막 용량 후 12주)에서 세인트 조지 호흡기 설문 (St. George's Respiratory Questionnaire ; SGRQ)을 이용하여 평가하였다.

4. 전혈로부터의 선택된 바이오마커를 스크리닝시에, 기저선에서, 제6주/EOT에서, 그리고 추적 관찰 기간의 마지막에 (제18주) 평가하였다. 혈청 및 혈장 샘플을 스크리닝시에, 기저선에서 (제1 투약 전), 제6주/EOT에서, 그리고 추적 관찰 기간의 마지막에 (제18주) 수집하였다. 샘플의 준비 및 분석을 위한 방법은 하기와 같았다: 각각의 혈청 샘플에 있어서, 3 mL의 혈액을 응고 촉진제 (clot activator)를 포함하지 않는 건조 튜브 내에 수집하였다. 실온에서 1시간 후, 상기 튜브를 +4℃에서 3000 g에서 15분 동안 원심분리하고, 혈청을 분취하고, 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 각각의 혈장 샘플에 있어서, 4.5 mL의 혈액을 시트르산나트륨 튜브 내에 수집하고, 상기 튜브를 10분 동안 온화하게 뒤집음으로써 즉시 혼합하였다. 튜브를 2000 g에서 15분 동안 원심분리하고, 혈장을 분취하고, 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. TARC를 알앤디 시스템즈 (R&D Systems)로부터의 인간 CCL17/TARC 퀀티카인 (Quantikine) ELISA 키트를 이용하여 키트 매뉴얼의 설명에 따라 정량화하였다. 이 분석법에 있어서, 정량화의 하한치는 31.2 pg/mL이며, 정량화의 상한치는 2000 pg/mL이었다. 일부의 기록 샘플을 준비하고, 본 연구의 완료 후 나올 수 있는 분석법의 이용에 의한 바이오마커에 대한 더 많은 지식의 수득에서의 미래의 사용을 위하여 보관하였다. 단백질 바이오마커는 케모카인 [C-C 모티프] 리간드 18 [CCL-18], 크렙스 본 덴 룬드겐 (Krebs　von　den　Lundgen)-6 [KL-6], 표면 활성 단백질 (surfactant protein) A [SP-A], 표면 활성 단백질 D　[SP-D], 포유류 키티나아제-유사 단백질 [YKL-40], IL-4, IL-13, IL-8, 면역글로불린 E [IgE], 에오탁신 (eotaxin), 세포간 유착 분자 (inter-cellular adhesion molecule) 1 [ICAM1], 페리오스틴 (periostin), 흉선 및 활성화-조절 케모카인 [TARC] CCL-17, 매트릭스 메탈로프로테이나아제 (matrix metalloproteinase)-7 [MMP7]), 및 RNA (mRNA, 마이크로-RNA) 발현을 포함하였다.

약력학적 특성의 결과

PD 종점: 5가지의 PFT (FVC, FEV1, TLC, DLCO, 및 RV)에서의 기저선으로부터의 변화를 분석하였다. 치료의 종료시에 (EOT, 방문 8, 제6주에), 환자의 폐기능은 주요 파라미터 (예상 FVC 퍼센트 및 예상 DLCO 퍼센트)에 있어서의 기저선으로부터의 평균 변화에 의해 명백한 바와 같이 전반적으로 변경되지 않았으며, 이는 치료군들간에 비견되었다. EOT한지 12주 후, 예상 FVC % 및 예상 DLCO %에 있어서의 기저선으로부터의 평균 변화는 모든 치료군에서 폐기능이 여전히 변화되지 않은 채로 있음을 나타냈다.

이차 PD 종점: 이차 PD 변수 (SpO2, 단백질/RNA 바이오마커, 및 SGRQ)를 6주 치료의 종료시에 그리고 치료 후 추적 관찰 기간에 측정하였다. 이러한 PD 결과는 연구의 작은 샘플 크기 및 짧은 치료 지속 기간으로 인하여 결론에 이르지 못하였다.

증가하는 용량의 SAR156597에 의한 혈액에서의 TARC (CCL-17) 발현의 감소 추세가 있었다 (도 2). 감소된 TARC 발현은 EOT 후 지속되었다 (도 3).

실시예 3: 안전성 데이터의 분석

안전성 평가는 개별 값의 재검토 (임상적으로 유의한 이상), 기술 통계학 (요약 표, 그래픽)을 기반으로 하였다. 모든 안전성 분석을 안전성 집단을 이용하여 수행하였다.

모든 안전성 데이터에 있어서, 관찰 기간을 3개의 시기로 나누었다:

- 환자가 고지에 입각한 동의서를 제공할 때와, 제1 용량의 IMP 투여 사이의 시간으로 정의되는 치료 전 시기.

- 제1 용량의 IMP 투여로부터 제18주까지의 방문 (포함됨)까지의 시간으로 정의되는 치료 중 시기.

- 제18주 방문 (배제됨) 후 시간으로 정의되는 치료 후 시기.

유해 사례 (adverse event)를 버전 16.1을 이용하여 규제 의약 용어집 (Medical Dictionary for Regulatory Activities; MedDRA)에 따라 암호화하였다.

임상 검사실에 있어서, 활력 징후, 및 ECG 파라미터와, 잠재적으로 임상적으로 유의한 이상 (potentially clinically significant abnormality; PCSA)을 표 2에 나타낸 PCSA 목록을 이용하여 분석하였다.

[표 2]

유해 사례

유해 사례 (AE)를 시간 순서대로의 기준에 따라 미리 정해진 표준 카테고리로 분류하였다:

치료 전 유해 사례: 치료 전 시기 동안 나타나거나 악화된 AE;

치료-발현 유해 사례 (treatment-emergent adverse event; TEAE): 치료 중 시기 동안 나타나거나 악화된 AE;

치료 후 유해 사례: 치료 후 시기 동안 나타나거나 악화된 AE.

TEAE를 AE 발병시에 받은 IMP에 할당하였다.

적어도 1가지의 TEAE, 중증 TEAE, 심각한 TEAE, 사망을 초래하는 TEAE, 및 영구적 치료 중단을 초래하는 TEAE를 갖는 환자의 수 및 백분율을 치료군에 의해 요약하였다.

모든 TEAE를 일차 기관별 대분류 (system organ class; SOC) 및 우선어 (preferred term; PT)에 의해 요약하고 열거하였다. 게다가, 모든 AE를 환자 및 발병일 및 발병 시간에 의해 분류하고 열거하였다.

임상 검사실의 평가

생화학적 특성 및 혈액학적 특성

이 연구에서의 기저선 값은 제1일 용량 전 (predose) 평가 동안 수집된 값이었다.

검사실 범위 및/또는 이상 기준 (PCSA)에서의 파라미터에 있어서, 재검토된 값을 포함하여, 치료 중 시기 동안 행해지는 모든 기저선 후 평가를 이용하여 "치료 중" 분석을 수행하였다.

맥관염, 혈청 테스트 (serology), 및 소변 검사에 대한 보충 검사

모든 개별 데이터를 치료군, 환자 및 방문에 의해 열거하였다.

중량 및 체질량 지수: 체중을 미가공 파라미터 값 및 기저선으로부터의 변화 퍼센트로서 분석하였다. 개별 체질량 지수를 미가공 값으로서 분석하였다. 기저선 값은 제1일에 수집한 용량 전 값이었다. 모든 파라미터에 있어서, 모든 재검토된 값을 포함하여, 치료 중 시기 동안 수집된 모든 기저선 후 값을 이용하여 "치료 중" 분석을 수행하였다.

활력 징후:

심박수 및 혈압. 심박수 및 혈압 (수축기 및 이완기 혈압)을 미가공 파라미터 값 (이용가능한 앙와위 및 기립 자세에 대하여), 기저선으로부터의 변화 (단지 앙와위에 대하여)로서, 그리고 기립 파라미터 (기립-앙와 파라미터 값)로서 분석하였다. 기저선 값은 제1일에 수집된 용량 전 값이었다. 모든 파라미터에 있어서, 모든 계획되지 않은 그리고 재검토된 값을 포함하여, 치료 중 시기 동안 수집된 모든 기저선 후 값을 이용하여 "치료 중" 분석을 수행하였다.

체온: 체온을 미가공 파라미터 값 및 기저선으로부터의 변화로서 분석하였다. 기저선 값은 제1일에 수집된 용량 전 값이었다.

심전도: 심박수, PR-, QRS-, QT-, 및 보정된 QT-간격 (QTc)을 미가공 파라미터 값 및 기저선으로부터의 변화로서 분석하였다. 기저선 값은 제1일에 수집된 용량 전 값이었다. 모든 파라미터에 있어서, 모든 재검토된 값을 포함하여, 치료 중 시기 동안 수집된 모든 기저선 후 값을 이용하여 "치료 중" 분석을 수행하였다.

다른 관련된 안전성 파라미터 (IMP 주사 부위에서의 국소 내용성): 홍반 크기 및 부종 크기를 파라미터, 치료군, 및 시점에 의해 기술 통계학으로 요약하였다. 현재의 통증 강도, 홍반, 부종, 가려움, 구진, 소수포 형성, 및 농포의 등급의 가장 극단적인 정성적 평가를 갖는 환자의 수 (%)를 전체 연구에 걸쳐 치료군에 의해 요약하였다.

노출의 정도

대부분의 환자는 각각의 치료군에서 모든 7회의 IMP 주사를 받았다. 각각의 SAR156597 용량군에서의 1명의 환자는 모든 7가지 용량의 연구 약물을 받지 않았다. SAR156597 50 mg 및 200 mg 용량군 각각에서의 1명의 환자는 증가된 hsCRP에 대한 평가와 관련된 용량 일시 중지가 있었으며, SAR156597 100 mg 용량군에서의 1명의 환자는 결핵의 SAE로 인하여 연구 치료를 중단하였다.

유해 사례

전반적으로, 치료-발현 유해 사례 (TEAE)의 수는 치료군들을 가로질러서 균형이 맞추어졌다. 대부분의 TEAE는 강도 면에서 경도 또는 중등도였으며, 하기의 단지 3가지 사례가 중증으로 보고되었다: 위약 용량군에서 1가지의 귀 감염 사례, SAR156597 50 mg 용량군에서 1가지의 대퇴부 골절 사례, 및 SAR156597 200 mg 용량군에서 1가지의 IPF 사례. 3명의 환자는 적어도 1가지의 심각한 유해 사례 (SAE)를 경험하였으며; 1명의 환자가 SAR156597 처리군 각각에 있었다 (표 3).

[표 3]

가장 일반적으로 보고된 AE는 감염이었으며, 이의 빈도는 처리군들 사이에서 비견되었다 (위약, SAR156597 50　mg 및 SAR156597 100 mg 용량군 각각에서 6명의 환자 중 3명; SAR156597 200 mg 용량군에서 6명의 환자 중 2명) (표 4). 4가지의 우연한 낙상 사례가 TEAE로 보고되었다. SAR156597 50 mg 용량군에서 심각한 것으로 보고된 1가지의 낙상 사례는 후속적으로 대퇴부 골절의 SAE로 이어졌으며, SAR156597 200 mg 용량군에서 보고된 3가지의 다른 사례는 강도 면에서 경도였다.

[표 4]

3명의 환자가 하기의 적어도 1가지의 SAE (SAR156597 처리군 각각에서 1가지)를 경험하였다: SAR156597 50 mg 용량군에서 낙상 및 대퇴부 골절의 SAE를 갖는 1명의 환자, SAR156597 100 mg 용량군에서 결핵의 SAE를 갖는 1명의 환자, 및 SAR156597 200 mg 용량군에서 세균성 폐렴 및 악화성 IPF의 SAE를 갖는 1명의 환자. 1명의 환자는 결핵의 치료-발현 SAE로 인하여 SAR156597 100　mg 용량군에서 연구 치료를 중단하였다.

특별한 관심 대상의 유해 사례 (adverse events of special interest; AESI): >10 mg/L이고 기저선 값의 >2X인 hsCRP의 지속된 상승 (적어도 72시간 동안)을 또는 다른 임상적 발견 중 어느 하나를 기반으로 한 맥관염의 의심이 이 연구에서 AESI였다. 이 연구에서 보고된 증가된 C-반응성 단백질의 3가지 사례가 있었다. 잠재적인 맥관염에 대한 처음의 의심으로서 보고된 상승된 hsCRP의 이러한 사례에서, 어떠한 것도 맥관염인 것으로 확인되지 않았으며, 대부분의 이러한 hsCRP 증가는 감염이 또한 일어났을 때의 (hsCRP에 의해 트리거링된 1가지의 AESI는 부고환 감염과 연관되었으며, 1가지 사례는 세균성 폐렴과 연관되었으며, 1가지 사례는 전염성 결막염과 연관되었음) 또는 조사관에 의해 임상적으로 유의하지 않은 것으로 간주될 때의 시간틀 내에 있었다.

SAR156597 200 mg 용량군에서, 조사관에 의해 잠재적으로 맥관염과 관련된 것으로 의심되는 선상 출혈이 1명의 환자에게서 처음 보고되었다. 추가의 평가시에, 이러한 사례는 후속적으로, 조갑 이영양증으로 진단되었으며, 맥관염의 의심은 결국 무시되었다.

혈액학적 파라미터: SAR156597 처리군에서의 좀 더 많은 환자에서 위약군과 비교하여 0.1 Giga/L 초과의 호염기구 카운트의 PCSA가 있다는 것을 제외하고는, 혈액학적 파라미터의 어떠한 유의한 변화도 탐지되지 않았다.

생화학적 파라미터: 이 연구 동안 3개의 SAR156597 처리군 각각에서의 1명의 환자에서 hsCRP의 일시적 증가가 있었다.

활력 징후: 기립 SBP 및 기립 DBP를 갖는 환자의 수는 위약군과 비교하여 SAR156597 처리군에서 더 많았다.

심전도: QTcB 연장을 갖는 환자의 수는 위약군과 비교하여 처리군에서 더 많았다. 이 연구 동안 QTcB 연장을 갖는 4명의 환자 (SAR156597 50 mg 군에서의 1명의 환자, SAR156597 100　mg 군에서의 2명의 환자, 및 SAR156597 200　mg 군에서의 1명의 환자)가 있었다.

주사 부위 내용성: 보고된 국소 주사 부위 반응이 거의 없었으며, 대부분의 사례는 중증도 면에서 경도였다.

개별적인 임상적 관련 이상: PCSA의 기준을 충족시키는 활력 징후 중 어떠한 것도 4가지의 기립 SBP 사례 및 5가지의 기립 DBP 사례를 포함하여 임의의 임상적 관련 증후와 연관되지 않았는데, 이들 모두는 다른 확인가능한, 잠재적인 기여 요인을 가졌다. PCSA의 기준을 충족시키는 ECG 결과 중 어떠한 것도 교정 치료를 요구하는 임의의 임상적 관련 증후와 연관되지 않았다.

안전성의 결론

모든 환자는 결핵의 SAE로 인하여 연구 약물의 3가지의 용량의 투여 후 연구 치료를 중단해야 했던 SAR156597 100 mg SC 매주 용량군에서의 1명의 환자를 제외하고는 6주 치료 기간을 완료하였다.

적어도 1가지의 TEAE를 갖는 환자의 수는 처리군 사이에서 비견되었으며 (위약 및 200 mg 군에서 6명의 환자 중 5명, 50 mg 및 100 mg 군에서 6명의 환자 중 6명), 대부분의 TEAE는 강도 면에서 경도 내지 중등도였다. 가장 일반적인 보고된 TEAE는 감염이었으며, 이는 처리군들 사이에서 균형이 맞추어졌다 (위약, 50 mg, 및 200 mg 군에서 6명의 환자 중 3명, 100 mg 군에서 6명의 환자 중 2명).

심각한 유해 사례 (SAE)가 3명의 환자에서 보고되었으며, 3가지의 SAR156597 용량군 각각에서 1명이었다 (50 mg 용량군에서 낙상 및 대퇴부 골절의 SAE를 갖는 1명의 환자, 100 mg 용량군에서 결핵의 SAE를 갖는 1명의 환자, 및 200 mg 용량군에서 세균성 폐렴의 SAE를 갖는 1명의 환자).

연구 기간의 어떠한 시점에서도 사망이 보고되지 않았다.

혈액학 및 생화학 검사실 결과로부터의 PCSA, 활력 징후, 및 ECG 중 어떠한 것도 임의의 임상 증후와 연관되지 않았다. hsCRP의 일시적 증가를 갖는 모든 환자는 임상 사례, 예컨대 감염과 연관되었거나, 조사관에 의해 임상적으로 관련되지 않은 것으로 판단되었다. 이 연구에서 확인된 맥관염 사례는 없었다.

전반적으로, 3가지 (50, 100, 및 200 mg SC)의 상이한 용량 수준으로 6주 동안 매주 SC 투여된 SAR156597은 일반적으로 안전하였으며, 잘 견디어졌다.

실시예 4: 약동학적 특성 (Pharmacokinetics; PK)의 평가

PK 분석을 위한 샘플을 방문 2 내지 방문 8 동안 용량 전에 (각각의 용량 투여 전 2시간 내에) 수집하였다. 방문 9/조기 종결 (early termination; ET), 방문 11 및 방문 14 동안 약동학적 특성 샘플을 아침에 수집하였다. 항-SAR156597 항체 (ADA) 샘플을 방문 2, 방문 9/ET, 방문 11 및 방문 14에서 PK 샘플과 대략적으로 동일한 시점에 수집하였다. 제12주에서 면역원성에 관련된 ADA가 존재할 경우, 상승된 파라미터를 조사하기 위하여 제1 용량 후 최소 6개월에 추가의 추적 관찰 방문이 일어났다.

SAR156597 혈장중 농도를 버틴 파르마 (Bertin Pharma) (L.E.M.M.

DSV/iBiTec-S/SPI, CEA-사클레이 (Saclay), 기프 수르 이베테 세덱스 (Gif sur Yvette Cedex), 프랑스)의 책임 하에 0.05　μg/mL (DOH0850)의 정량화 하한치 (LLOQ)를 이용하여 인증된 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA) 방법을 이용하여 결정하였다. 생물분석 연구로부터의 모든 미가공 데이터를 검사 장소에서 사용 중인 절차에 따라 버틴 파르마에 저장하였다.

혈장중 ADA를 디스포지션, 세이프티 앤드 애니멀 리서치 오퍼레이셔널 센터 오브 몽펠리에 (Disposition, Safety & Animal Research Operational Center of Montpellier) (바이오마커 및 생물학적 분석 그룹 (Biomarker and Biological Assays group)), 사노피 (Sanofi)의 책임 하의 인증된 ELISA 방법 (DOH0851)을 이용하여 분석하였다. 모든 샘플을 먼저 스크리닝 분석법을 이용하여 평가하였다. 그 후, 스크리닝 분석법에서 양성으로 밝혀진 샘플을 확인 분석법에서 검사하였다. 역가를 양성인 것으로 확인된 샘플에 대해서만 보고하였다. 생물분석 연구로부터의 모든 미가공 데이터를 시험 장소에서 사용 중인 절차에 따라 프랑스 몽펠리에 소재의 사노피-아벤티스 (sanofi-aventis)에 저장하였다.

약동학적 파라미터를 집단 PK (베이즈 (Bayesian)) 접근법을 이용하여 추정하였으며, 이는 표 5에 제시되어 있다.

[표 5]

베이즈 분석을 다중프로세서 (multi-processor) 컴퓨터의 리눅스 클러스터 (LINUX cluster)에서 실행되는 논멤 (NONMEM)^® 컴퓨터 프로그램 (버전 7.1.2)을 이용하여 수행하였다.

베이즈 데이터 세트를 3개의 코호트 (50, 100, 및 200 mg의 용량)의 데이터를 이용하여 구성하였다. 논멤 소프트웨어 (버전 7.1.2)를 이용하여 상기 데이터를 분석하였다. POH0338 연구 (더 빠른 연구로부터의 PK 데이터를 이용하여 구성함)에서 수득된 최종 집단 PK 모델을 베이즈 데이터 세트에 적용하였으며, 그의 파라미터 추정치를 이전의, 개별 파라미터 평가 추정치 및 농도 예상치로서 이용하였다. 추정 단계를, 최종 집단 PK 모델에서 수득되는 θ (상기 모델의 고정된 효과, 즉, PK 파라미터), ω (개체간 가변성), 및 σ (개체내 가변성)의 최종 집단 추정치를 기반으로 하여 개별 추정치를 계산하기 위하여 옵션 MAXEVAL=0을 이용하여 생략하였다.

약동학적 데이터의 분석

모든 PK 분석을 집단 PK 접근법을 이용하여 수행하였다. 하기 PK 파라미터를 이 연구에서 결정하였다:

관찰된 SAR156597의 혈장중 최저 농도 (C_최저);

제1 및 마지막 용량 후 개별 예상 C_max, 및 예상 AUC₀ _-168h;

마지막 용량 후 개별 예상 t_1/2z.

통계학적 분석

분석된 SAR156597 C_최저 농도 및 예상 C_max, AUC₀ _-168h, 및 t_1/2z를 디스포지션, 세이프티 앤드 애니멀 리서치, 사노피의 책임 하에 각각의 처리군에 대하여 기술 통계학 (이용가능한 관찰의 수, 중간값, 최대, 최소, 변동 계수 [CV%], SD, 중간값 및 산술 및 기하 평균)에 의해 요약하였다. 다른 통계학적 분석법, 예컨대 정상 상태 평가, t_1/2z에 대한 용량의 영향 및 용량 비례를 바이오스터티스틱스 (Biostatistics), 사노피의 책임 하에 수행하였다.

모든 통계학적 분석 전에, C_max, AUC₀ _-168h, 및 t_1/2z를 로그-변환시켰다.

정상 상태의 출현을 SAS NLMIXED 절차를 이용하여 비-선형 혼합 효과 모델을 이용하여 C_최저 값을 피팅 (fitting)함으로써 평가하였다.

t_1/ _2z에 있어서의 용량의 영향을 선형 고정 효과 모델을 이용하여 평가하였다.

C_max 및 AUC₀ _- _168h에 있어서의 용량 비례를 멱급수 모델을 이용하여 평가하였다.

약동학적 데이터 취급 및 데이터 품질 보증: SAR156597에 있어서의 0.05 μg/mL의 LLOQ보다 더 낮은 혈장중 약물 농도를 평균값의 계산에서 0으로 처리하였다. 평균 및 이의 연관된 통계 자료를 반올림하지 않은 수로부터 생성하였으며, 이는 반올림한 수를 이용하여 결정된 값과는 약간 다를 수 있다. 일단 최종 PK 분석이 수행되면, PK 파라미터를 추가의 통계학적 분석을 위하여 바이오스터티스틱스 부서로 전자 전달하였다. 농도 및 PK 파라미터 값을 3개의 유효 숫자까지 반올림하였다.

약동학적 특성의 평가

혈장중 농도: SAR156597에 대하여 무작위화된 모든 18명의 환자를 SAR156597에 노출시켰다. 6명의 위약 환자로부터의 혈장에서는 어떠한 SAR156597도 검출되지 않았다. 100 mg에서의 1명의 환자를 받은 용량의 불충분한 수로 인하여 PK 분석으로부터 배제시켰다. SAR156597 최저 농도는 도 4에 그래프로 제시되어 있다.

주 1회 주어진 SAR156597의 100 mg 및 200 mg 용량에 있어서, 정상 상태의 90%에 도달하는 중간 시점은 대략 제34일이었다. 주 1회 주어진 SAR156597의 50 mg 용량에 있어서, 통계학적 분석은 대략 101일에 정상 상태에 도달하는 예상치 못한 중간 시점을 제공한다. 50 mg 용량군에서의 정상 상태까지의 상기 시점의 추정치는 낮은 혈장중 최저 농도 때문에 신뢰가능한 것이 아닐 수 있다. 그 결과, 비-선형 혼합 효과 모델은 겉보기에는 50 mg 용량군의 초기 기울기 파라미터를 적당하게 평가하지 못하였으며, 이는 이러한 용량 수준에서 정상 상태까지의 시점의 과대 평가를 초래하였다.

게다가, 베이즈 PK 분석에 의하면, AUC₀ _- _168ss에 있어서의 정상 상태는 제6주에 SAR156597의 제7 용량 후 50 mg 용량군에 있어서 89%에서 도달되었고, 100 mg 용량군에 있어서 94.8%에서 도달되었고, 200 mg 용량군에 있어서 93.7%에서 도달되었다.

약동학적 파라미터: 제1주에서의 SAR156597의 단회 SC 투여 후 수득되는 SAR156597의 PK 파라미터의 기술 통계학적 특성이 표 6에 요약되어 있다.

[표 6]

제6주에 SAR156597의 매주 반복된 SC 투여 후 수득된 SAR156597의 PK 파라미터의 기술 통계학적 특성이 표 7에 요약되어 있다.

[표 7]

CI를 90%로 한 SAR156597 t_1/2z 추정치가 표 8에 제시되어 있다. t_1/2z는 t_1/ _2z에 대한 예상치 못한 유의한 용량 효과를 가지고서 (p=0.049) 260시간 (대략 11일) 내지 348시간 (대략 15일)의 범위였다.

[표 8]

용량 비례 평가를 제1주 및 제6주에 수행하였으며, 이는 각각 표 9 및 표 10에 제시되어 있다.

[표 9]

[표 10]

제1주 및 제6주에, SAR156597 노출은 용량 비례적인 것보다 약간 더 많이 증가하였다. SAR156597 용량의 4배 증가는 C_max의 5.21배에서 5.92배까지의 증가 및 AUC_0-168의 5.17에서 5.83배까지의 증가를 나타냈다.

면역원성: 혈장중 ADA의 결정. ADA 결과의 요약이 표 11에 설명되어 있다.

[표 11]

2명의 환자는 ADA 양성 샘플을 가졌다. SAR156597 200 mg 처리군에서 1명의 환자 (환자 번호: 152003002)는 제1일에서의 처리 전 샘플에서 ADA 반응성을 나타냈지만, ADA 반응성은 제18주까지는 모든 샘플에서 음성이었다. 두 번째 환자 (환자 번호: 484002003)가 위약 처리 중이었으며, 상기 환자는 제12주 및 제18주에 ADA 양성이었다. 따라서, ADA는 SAR156597 PK 파라미터 추정에 어떠한 영향도 주지 않는 것으로 간주되었다.

200　mg 처리군에서 1명의 환자 (환자 번호: 124003001)에 있어서, 처리 후 ADA 분석을 샘플의 이용불가능 (샘플을 수집하지 않음)으로 인하여 수행하지 않았다.

약동학적 특성의 결론

SAR156597에 대하여 무작위화한 모든 17명의 환자를 SAR156597에 노출시켰다. 6명의 위약 환자로부터의 혈장에서 어떠한 SAR156597도 검출되지 않았다.

베이즈 PK 분석에 의하면 정상 상태의 89% 내지 94.7%가 제6주에서의 SAR156597의 7회의 용량 후 도달됨이 예상되었다.

t_1/2z는 t_1/ _2z에 대한 예상치 못한 유의한 용량 효과를 가지고서 (p=0.049) 260시간 (대략 11일) 내지 348시간 (대략 15일)의 범위였다.

SAR156597를 이용한 처리의 결과로서 어떠한 유의한 치료-발현 ADA 반응성도 나타나지 않았다.

실시예 5: IL-13은 FRA -2 트랜스제닉 마우스 모델에서 폐 섬유증의 드라이버 (driver)이다

간질성 폐질환 (ILD)은 간질에 발생하는 200가지 초과의 폐질환의 큰 군을 나타낸다. 상당한 하위세트 (subset)의 경피증 환자는 폐 실질이 연루된 폐 증후를 나타내는데, 이는 간질성 폐 이상 및 폐 기능의 손상으로 이어진다. 이러한 치명적인 말기 병태는 간질성 폐렴 및 반흔을 특징으로 한다.

AP-1 패밀리의 전사 인자는 다양한 세포 기능을 제어하는 다수의 표적 유전자의 발현을 조절한다. AP-1 복합체는 Jun 및 Fos 단백질로 구성된다. Fos 패밀리의 단백질의 구성원인 Fos-유사 항원 2, FRA-2는 조절 기능을 갖는 AP-1 복합체 형성에 참여한다.

이전에 에페를 (Eferl) 등은 트랜스제닉 마우스에서의 FRA-2의 과다발현이 몇몇 기관에서 섬유증을 야기하지만 주로 폐조직 및 피부에 영향을 줌을 입증하였다 (문헌[Eferl et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. 105(30): 10525-10530]).

이 실시예는 Fra-2 유전자를 과다발현하는 새로운 트랜스제닉 마우스 주 (line)의 특성화를 설명한다. 이러한 마우스는 13주에서 출발하여 발달 동안 폐의 섬유증을 나타냈다. 섬유증의 발병은 순환 중인 폐의 Th2 사이토카인의 수준의 상승과 동시에 일어난다.

에페를 등에 의해 생성된 트랜스진 (transgene)에서, EGFP 유전자는 트랜스진 발현의 가시화를 가능하게 하도록 구성물로 엔지니어링되었다. 전장 FRA2 유전자는 H2kb 프로모터에 의해 구동되어 상기 트랜스진의 편재적 발현으로 이어졌다. 에페를의 트랜스제닉 구성물이 도 19a에 예시되어 있으며, 이는 H2Kb 프로모터, 게놈 Fra-2 유전자좌, 리포터 IRES-EGFP 서열, 및 폴리아데닐화 신호 (pA)를 보유한 LTR 서열로 이루어진다. E1-E4는 Fra-2의 엑손 1-4이며; 서던 블롯 (Southern blot) 분석에 이용되는 HindIII (H) 제한효소 부위 및 프로브 위치 (P)가 표시되어 있다.

이와는 대조적으로, 도 19b는 여기서 이용되는 트랜스제닉 벡터의 개략도를 나타내는데, 이는 마우스 Fra-2 유전자를 구동시키는 마우스 H2Kb 프로모터 및 T2A-EGFP-polyA-loxP-hUBp-EM7-Neo-loxP 카세트 (4,898 bp)를 포함한다. 상기 트랜스진의 4개 내지 8개 카피 (copy)를 숙주 염색체 내로 무작위로 통합시켰다. FRA2를 과다발현하는 5가지의 기원 (founder) 트랜스제닉 주를 생성하였으며; 3가지의 주를 트랜스진 발현을 기반으로 하여 추가의 특성화를 위하여 분류하였다. 단편들의 게놈 좌표는 하기와 같았다: H2Kb (H2-K1) 프로모터: Chr17: 34,137,222 - 34,139,244 (-) (문헌[Morello et al., 1986, EMBO J. 5(8): 1877-83]을 따름); Fra-2 (FosI2) 유전자 (종결자를 포함하지 않음): Chr5: 32,438,859 - 32,455,559.

예비 관찰 연구에서, 발달 동안의 트랜스진의 영향을 제8주, 제14주 및 제16주에서 연구하였다. 이 기간 동안 야생형 대조구와 FRA2 마우스 사이에는 체중 또는 사망률의 차이가 전혀 없었다. 이러한 관찰은 에페를 등에 의한 제16주에서의 50% 사망률의 관찰과는 대조적이었다.

FRA-2 과다발현 트랜스제닉 마우스는 히드록시프롤린 함량에 의해 측정할 경우 콜라겐 침적의 증가를 동반한 나이가 들어감에 따른 폐 중량의 증가를 나타냈다 (도 5).

이 모델에서, 염증성 세포의 폐 내로의 유입이 있는 초기 염증기가 있었다 (도 6). 조직학적 분석은 또한 폐 샘플에서 시간이 지남에 따른 콜라겐 침적의 증가를 나타냈으며, 이는 하기와 같이 행하였다. 안락사 후, 고정 압력 하에 고정제를 폐에 흡입시켰다. 그 후, 폐를 제거하고, 고정제 내에 넣었다. 고정이 완료된 후, 폐를 1% 한천 용액 내에 매립시키고, 3 mm 두께의 스텝 섹션 (step section)으로 시상면으로 슬라이스하였다. 프로세싱 후, 모든 섹션을 파라핀 블록 내에 매립시켰다. 모든 파라핀 블록을 4 μm로 박편화하고, 매슨 트리크롬 (Masson's Trichrome) 염색제를 이용하여 염색하여 콜라겐 침적 (청색)을 입증하고, 에이치앤이 (H&E) 염색제에 의해 전체 형상을 나타냈다 (도 6).

이와 유사하게, 피부에서, 야생형 대조구와 비교하여, 시간이 지남에 따라 FRA2 마우스의 피부 두께의 증가가 있었으며, 이는 피부에서의 콜라겐 침적과 병행되었다 (도 7 및 도 8).

이 모델에서, 폐 내로의 염증성 세포의 유입 및 Th2 사이토카인, 예컨대 IL-4 및 IL-13의 상향 조절이 있는 초기 염증기가 있었다. 후기 섬유화기가 뒤따르며, 여기서, 폐 및 피부에서의 섬유화 유전자 (ECM 단백질 및 매개자)의 상향 조절이 있다.

발달 중인 그리고 섬유화 중인 폐의 사이토카인 프로파일 분석에 의하면 Th2 사이토카인 프로파일 (IL-4, IL-5 및 IL-13)의 증가가 나타났다 (도 9). IL-4 및 IL-13 수준의 유의한 증가가 제13주의 발달까지 관찰되었으며, 이는 제17주까지 여전히 상승된 채로 있는데, 이것은 이러한 동물에서의 폐 섬유증의 발병과 병행된다.

발달 유전자 조절 연구에서의 에서의 FRA2 마우스로부터의 폐 및 피부의 유전자 발현 분석은 TGF-b 경로 전사체, IL-4, IL-13, STAT6, 전섬유화 (profibrotic) 케모카인, 및 LOX를 포함하는 핵심 시그너토리 (signatory) 섬유화 마커의 증가를 나타냈다 (도 10).

이러한 발달 폐 섬유증 마우스 모델을 이용하여 섬유증에서의 IL-4 및 IL-13의 역할을 연구하였다. 먼저, 섬유증 촉진에서의 IL-13의 역할을 FRA2 마우스 모델에서 중화 활성을 갖는 인증된 대리 마우스 IL-13 항체를 이용하여 평가하였다 (그 이유는 설치류에서 SAR156597의 교차 반응성이 없기 때문임). 13주령 FRA2 마우스에게 10 mpk의 대리 마우스 IL-13 항체를 투약하였으며, 이는 29일 동안 주 2회 복강내 경로에 의해 투여되었다. 10 mpk의 래트 IgG1 이소타입 (isotype)을 대조구로서 FRA2 마우스와 병행하여 투약하였다. 이와 유사하게, FRA2 마우스의 세 번째 군은 제2 대조군으로서 염수를 받았다. 하기 표는 본 연구에서 사용한 상이한 처리군을 나타낸다.

[표 12]

연구의 종료시에 마우스를 안락사시키고, 이의 폐를 제거하고, 프로세싱하여 (1) 단백질 분석을 위한 폐 균질화물, (2) RNA 제제를 제공하고, (3) 하나의 폐엽을 묶고 흡입시키고, 잘라 내고, 조직학적 분석을 위하여 고정시켰다. 폐 균질화물을 이용하여 콜라겐의 양을 정량화하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, FRA2 마우스 폐의 히드록시프롤린 함량은 야생형 동배 대조구와 비교하여 증가하였다. IL-13 Ab 처리된 FRA2 마우스 폐에서의 히드록시프롤린 수준은 유의하게 감소하였다.

이러한 관찰을 FRA2 및 동배 대조 폐의 조직병리학적 분석에 의해 세포 수준에서 확인하였다 (도 12). 트리크롬 블루 염색된 폐 섹션은 상응하는 야생형 마우스와 비교하여 FRA2 마우스 대조군 (염수 및 이소타입 대조구 처리됨)에서 콜라겐 침적의 증가를 나타냈다. 콜라겐 함량의 감소를 반영하는 트리크롬 블루 염색의 감소가 항-IL-13 Ab 처리된 마우스 폐에서 관찰되었다 (도 13에 정량화되어 있음). 이러한 결과는 콜라겐 침적을 통한 폐 섬유증의 촉진에서의 IL-13의 역할 및 대리 항-IL-13 Ab가 콜라겐 침적을 저해하는 능력을 명백하게 입증한다.

실시간 PCR에 의한 전사체 분석을 이용하여 IL-13에 의해 조절되는 다양한 섬유화 마커, 전섬유화 매개자 및 유전자의 발현을 추적하였다. IPF 바이오마커인 FN1, SPDEF, 및 MUC5B에 대한 결과가 도 14에 예시되어 있다. 전섬유성 마커인 CCL2 및 CCL11에 대한 결과가 도 15에 예시되어 있다. IL-6, ARG1, 및 IL13Ra2에 대한 결과가 도 16에 예시되어 있다.

IL-13-조절되는 단백질 발현을 ELISA에 의해 폐 균질화물에서 추가로 연구하였다. IL-13, IL-4 및 IL-17 수준은 야생형 폐와 비교하여 FRA2 폐 균질화물에서 증가하였으며, 이러한 사이토카인 수준은 항-IL-13 Ab 처리 후 약화되었다 (도 17). 감소된 IL-13 수준은 4주 처리 후 폐에서의 항체 로딩을 확인해 주었다 (도 17).

MCP-1 (CCL2)은 폐 섬유증과 연관된 잘 특성화된 케모카인이며, IL-13에 의해 조절된다. 이와 유사하게, CCL17/TARC 및 YKL-40은 IL-13 조절되는 단백질이다. 대리 Ab 처리 후, CCL2, CCL17 및 YKL-40은 유의하게 저해되었다 (도 18).

전반적으로, 이러한 결과는 FRA2 마우스 모델에서 폐 섬유증의 촉진에서의 IL-13의 역할을 보여준다. IL-13 발현의 저해는 폐 콜라겐 함량 및 폐 섬유증 관련 바이오마커의 감소와 연관된다.

본 발명을 상세하게 그리고 이의 특정 실시 양태를 참고로 하여 기술하였지만, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않고서 변형 및 변화가 가능함이 명백하다. 더 구체적으로, 본원에서 본 발명의 일부 양태가 특히 유리한 것으로 확인되지만, 본 발명은 본 발명의 이러한 특정 양태에 반드시 한정될 필요는 없음이 고려된다.

SEQUENCE LISTING <110> Sanofi Esperet, Corinne Jagerschmidt, Alexandre Soubrane, Christina Subramaniam, Arun <120> Anti-IL4-IL13 Bispecific Antibodies <130> 14-1111-WO <150> US 62/018,253 <151> 2014-06-27 <150> EP 14306477.2 <151> 2014-09-24 <150> US 62/102,097 <151> 2015-01-11 <150> US 62/102,555 <151> 2015-01-12 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/ mouse VL3 region <400> 1 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala 85 90 95 Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/mouse VH2 region <400> 2 Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/mouse VL1 region <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/mouse VH1 region <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/mouse VH2 region <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Ala Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggaggcggag ggtccggagg cggaggatcc 30

Claims

IL-4 및 IL-13에 특이적으로 결합하는 이중-V-영역 항체-유사 단백질 또는 이의 단편의 인간 대상체에서의 안전 용량으로서, 상기 용량은 상기 항체-유사 단백질 또는 이의 단편 약 200 mg 이하를 포함하는 안전 용량.
제1항에 있어서, 상기 항체-유사 단백질 또는 이의 단편 약 200 mg을 포함하는 안전 용량.
제1항에 있어서, 상기 항체-유사 단백질 또는 이의 단편 약 100 mg을 포함하는 안전 용량.
제1항에 있어서, 상기 항체-유사 단백질 또는 이의 단편 약 50 mg을 포함하는 안전 용량.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체는 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는 안전 용량.
인간 대상체에게 투여된 이중-V-영역 항체-유사 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 용량이 인간 대상체 내에서 IL-4 또는 IL-13에 특이적으로 결합하는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 상기 용량을 인간 대상체에게 투여하는 단계;
(b) 인간 대상체로부터 취해진 혈액, 혈장, 또는 혈청 샘플 중 TARC/CCL17 단백질의 양을 측정하는 단계 (여기서, 상기 용량을 투여하기 전 측정한 대상체에서의 TARC/CCL17의 양과 대비하여 혈액 샘플 중 TARC/CCL17의 양의 감소는 이중-V-영역 항체-유사 단백질 또는 이의 단편의 IL-4 또는 IL-13에의 결합을 나타냄); 및
(c) 단계 (b)에서 측정된 TARC/CCL17의 감소에 따라 용량을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 단계 (c)는 단계 (b)에서 측정된 TARC/CCL17의 감소가 역치 미만일 경우 용량을 증가시키거나, 단계 (b)에서 측정된 TARC/CCL17의 감소가 역치 초과일 경우 용량을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 역치는 용량을 투여하기 전에 측정된 대상체에서의 TARC/CCL17의 양에 비하여 TARC/CCL17의 양의 대략 43% 감소인 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 용량을 피하 투여하는 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, TARC/CCL17의 양을 효소 결합 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)에 의해 탐지하는 방법.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체는 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는 방법.
인간 대상체에서 항체 또는 항체-유사 결합 단백질의 IL-4 또는 IL-13 또는 이들 둘 모두에의 결합에 대한 단백질 바이오마커 (biomarker)로서, TARC/CCL17인 단백질 바이오마커.
제12항에 있어서, 항체 또는 항체-유사 결합 단백질은 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질인 단백질 바이오마커.
제12항 또는 제13항에 있어서, 인간 대상체는 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는 단백질 바이오마커.
특발성 폐 섬유증 (IPF)을 치료하는 방법으로서, IPF를 갖는 인간 대상체에게 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편 200 mg 이하를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편은 IL-4, IL-13, 또는 이들 둘 모두에 결합하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 이중-V-영역 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 단편을 주 1회 투여하는 방법.