JP2614215B2 - ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾 - Google Patents

ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は組換えDNA技術の分野に関する。１つの面に
おいて、本発明は酵母の組込み形質転換（integrative
transformation）に関する。他の面において、本発明は
酵母の部位特異的突然変異（site−directed mutatio
n）に関する。さらに他の面において、本発明は新規なD
NA配列に関する。さらに他の面において、本発明は新規
な生物に関する。
従来技術 組換えDNA技術が近年開発されるにつれて、種々の有
用なポリペプチドが微生物によつて制御下に生産できる
ようになつた。多くの真核生物のポリペプチド類、例え
ばヒト成長ホルモン、白血球インターフエロン、ヒトイ
ンシユリンおよびヒトプロインシユリンは種々の微生物
によつてすでに生産されている。すでに開発された技術
の連続使用は、多くの他の有用なポリペプチド産物の微
生物による生産を可能にすることが将来期待される。
組換え技術においてしばしば用いられる基本要素はプ
ラスミドであり、このプラスミドは数種の微生物に見い
出せる染色体外性の二本鎖DNAである。プラスミドが自
然界で微生物中に存在する場合に、それらは往々にして
１個の細胞当たり多くのコピー数で存在することが知ら
れている。自然界に存在するプラスミドのほかに、種々
の人工プラスミドすなわちハイブリツドベクターも構築
された。都合の悪いことに、宿主細胞はそのプラスミド
を常に保持できるとは限らない。それどころか、微生物
が増殖して数世代を経過するにつれてプラスミドは失わ
れる。従つて、外来性DNAを適当な宿主生物内に安定に
導入する方法が非常に興味をもたれ、また大いに重要に
なつてくる。
現在までのところ、種々のポリペプチドを生産するた
めに組換えDNA技術を用いる商業的努力は宿主生物とし
ての大腸菌（Escherichia coli）に集中していた。しか
しながら、いくつかの場合において大腸菌は宿主として
不適当であることがわかつている。例えば、大腸菌は多
くの発熱性毒性因子を含有しており、これらの因子は医
薬品として有用なポリペプチドから除去しなければなら
ない。この精製を達成するための効率は、もちろん個々
のポリペプチドにより変化するであろう。さらに、大腸
菌のタンパク質分解作用はいくつかの有用な生産物の収
量をかなり制限する。その上、大腸菌により生産された
異種遺伝子産物の多くは不溶性であることが知られてい
る。これらおよび他の考察から別の宿主への興味が高ま
つている。とりわけ、ポリペプチド産物の生産用として
真核生物の使用が関心をもたれている。
酵母のような真核生物系をポリペプチド産物の生産手
段として利用することは、組換えDNAによつてコードさ
れるポリペプチドの生産のために大腸菌のような原核生
物系を使用することに比べて、明らかに有利であるだろ
う。大規模な大腸菌発酵が比較的最近になつて出現した
のに対して、酵母は何世紀にもわたつて大規模発酵にお
いて利用されてきた。酵母は一般に細菌よりも高い細胞
密度へと増殖することができ、そして連続発酵法へ容易
に適合させることができる。実際に、ピチア・パストリ
ス（Pichia pastoris）のような酵母の超高細胞密度
（すなわち100g/以上の細胞密度）への増殖はウエグ
ナー（Wegner）の米国特許第4414329号（フイリツプス
・ペトロレウム社に譲渡）に開示されている。酵母宿主
のその他の利点には、この生物の多くの重要な機能（例
えば酸化的リン酸化）がオルガネラの内部に存在し、そ
のために野生型宿主細胞にとつて外来性のポリペプチド
の生産が原因で起こりうる有害作用にさらされることが
ないという事実が含まれる。真核生物としての酵母は発
現されたポリペプチド産物をグリコシル化しうることが
立証されており、このようなグリコシル化がポリペプチ
ド産物の生物活性にとつて重要である場合に酵母は価値
を有する。また、真核生物としての酵母は高等生物と同
じコドン優先性を示すと考えられ、こうして酵母は哺乳
動物遺伝子からの発現産物または例えば哺乳動物mRNAか
ら逆転写により得られる相補的DNA（cDNA）からの発現
産物のより一層効率のよい生産に役立つであろう。
同定が不十分な酵母菌種を宿主／ベクター系として開
発することは、形質転換条件および外来性DNAを宿主細
胞内に安定に導入するための適当な技法に関する知識が
欠乏しているためにかなり妨げられる。さらに、栄養要
求変異株は栄養要求の相補性により形質転換細胞の直接
選択を妨げるために、しばしば利用することができな
い。組換えDNA技術がその約束を完全に保持するなら
ば、DNA操作を容易にし且つ挿入されたDNA配列の発現を
最適化し、それにより制御された条件下で目的とするポ
リペプチド産物を高収量で生産しうる新しい宿主／ベク
ター系が考案されるであろう。
発明の目的 本発明の目的は、酵母ゲノムの所定の位置にDNAを挿
入する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、本質的に復帰し得ない酵母の安
定な栄養要求変異株を作る方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、本質的に復帰し得ない安
定な栄養要求変異株を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、酵母の形質転換に有用な
新規DNA配列を提供することである。
本発明のさらに他に目的は、酵母による異種タンパク
質の増産に有用なアルコールオキシダーゼマイナス変異
株宿主を作る方法を提供することである。
本発明のこれらの目的および他の目的は以下の記述お
よびここに添付の特許請求の範囲から明らかになるであ
ろう。
発明の構成 本発明によれば、ピチア属酵母のゲノムを部位特異的
に修飾するための新規な方法が開発された。各末端に挿
入可能なDNA配列（すなわち宿主ゲノムと相同の配列で
あつて、それぞれが少なくとも約200のヌクレオチド長
を有するもの）を含み且つそれらの間に少なくとも１つ
の追加DNAフラグメント（例えば選択可能なマーカー遺
伝子）を含む線状DNAフラグメントを用いて酵母を形質
転換することにより、そのマーカー遺伝子とその両側に
存在する挿入可能なDNA配列とが高い頻度で宿主に取り
込まれる。この線状DNAによる形質転換の結果として、
組込み部位のDNA配列が破壊および／または欠失され、
選択可能なマーカー遺伝子および形質転換用線状DNAフ
ラグメントの一部として含まれる他のDNAが宿主酵母の
ゲノム内に組み込まれた斯く修飾された酵母菌株が作ら
れる。
上記方法で宿主酵母のゲノム内に挿入された外来性DN
Aは、多くの増殖世代を通して宿主により安定に保持さ
れる。従つて、本発明方法は外来性DNAが自律的複製を
続ける染色体外性フラグメントの一部として提供される
場合、または外来性DNAが環状DNA分子の一部としてゲノ
ム内に組み込まれる場合のプラスミドの不安定性による
外来性DNAの欠失の問題を排除することができる。この
ような環状DNA分子の組込みは宿主ゲノム配列の直接反
復配列によつてはさまれた外来性DNA配列の宿主ゲノム
内への挿入をもたらす。この種の直接反復配列はその後
の組換えのための基質であるから、直接反復配列の間に
挿入された外来性DNAは不安定である。
本発明の部位特異的ゲノム修飾は特定遺伝子の全部ま
たは選ばれた部分を欠失した変異体をもたらすことがで
きる。突然変異が望まれる遺伝子の実質的部分を排除す
ることによつて、突然変異の復帰の可能性は本質的にな
くなる。従つて、本発明により得られた変異体は非常に
安定である。
また、本発明の部位特異的ゲノム修飾は、当分野で知
られたin vitro組換えDNA技術と共にいろいろな宿主ゲ
ノムの正確な修飾、例えば１つまたはそれ以上の異種遺
伝子の宿主ゲノムへの付加、天然遺伝子の発現を制御す
る調節配列の変更、天然遺伝子と非天然源の遺伝子との
交換などを可能にする。
驚くべきことに、ピチアでの異種遺伝子のメタノール
誘導発現は、ピチアの第一アルコールオキシダーゼ遺伝
子が破壊されたピチア菌株を遺伝子発現用宿主として使
用することにより劇的に高められることが見い出され
た。
さらに、ピチア・パストリスの菌株は第一アルコール
オキシダーゼ遺伝子を破壊された宿主菌株に天然のピチ
ア・パストリスに対して遅い速度とはいえメタノール上
で生長する能力を保持させる第二のアルコールオキシダ
ーゼ遺伝子を有することが判明した。
添付の図面において、 第１図はプラスミドpYMI1の制限地図であり； 第２図はプラスミドpYMI1の一部をピチア染色体のHIS
4位置へ挿入することを示し； 第３図はプラスミドpYJ8の制限地図であり； 第４図はプラスミドpYMI3aの制限地図であり； 第５図はプラスミドpRMI3aの一部をピチア染色体のHI
S4位置へ挿入することを示し； 第６図はプラスミドpBPG1−１の制限地図であり； 第７図はプラスミドpY MI7の制限地図であり； 第８図はプラスミドpYMI7の一部をピチア染色体のア
ルコールオキシダーゼ位置へ挿入することを示し； 第９図はプラスミドpSAOH5およびpTHBS3からのプラス
ミドpYM39の作製を示し； 第10図はプラスミドpYM39およびpPG3.2からのプラス
ミドpYMI6の作製を示し； 第11図はプラスミドpYMI6およびpBSAG5Iからのプラス
ミドpBSAGI5Iの作製を示し； 第12図は第11図よりも詳細なプラスミドpBSAGI5Iを示
す制限地図であり； 第13図はプラスミドpBSAGI5Iの一部をピチア染色体の
アルコールオキシダーゼ位置へ挿入することを示し； 第14図はプラスミドpYMI12aの制限地図であり； 第15図はプラスミドpYMI12aの一部を第二ピチアアル
コールオキシダーゼ遺伝子（AOX2）の位置へ挿入するこ
とを示し； 第16図はpBR322をベースとするプラスミドpPG4.0およ
びpPG3.0中のピチア挿入物の制限地図である。第16a図
に示す挿入物は第一ピチアアルコールオキシダーゼ遺伝
子（AOX1）の位置からのものであり、第16b図に示す挿
入物は第二ピチアアルコールオキシダーゼ遺伝子（AOX
2）の位置からのものである。第16c図はAOX1遺伝子位置
（第16a図と関連）の既知アルコールオキシダーゼ（AO
X）コーデイング部分を示す； 第17図はプラスミドpYM25の制限地図であり；そし
て、 第18図はプラスミドpT76H3の制限地図である。
本明細書で用いる次の略号は制限酵素を表わす：略号 制限酵素 As Asu II Ｂ BamH I B2 Bgl II Ｃ Cla I R1 EcoR I R5 EcoR V H3 Hind III Hp1 Hpa I Kp Kpn I Nr Nru I Ps Pst I Pv2 Pvu II Rs Rsa I Ｓ Sal I S3 Sau3A I Sm Sma I Sp Sph I St Stu I Th Tha I Xb Xba I Xh Xho I 添付の図面において、DNAフラグメント操作のために
使用されるが、連結の際に破壊される制限部位は、破壊
された部位の記号をかつこ内に記入することによつて示
される。
本発明によれば、第一の挿入可能なDNAフラグメン
ト、選択可能なマーカー遺伝子、および第二の挿入可能
なDNAフラグメントを含む直列配置の線状DNAフラグメン
トを用いてピチア属の宿主菌株を形質転換することから
成る、ピチア属酵母を予め定められたゲノム部位で部位
選択的にゲノム修飾する方法が提供される。第一および
第二の挿入可能なDNAフラグメントはそれぞれ少なくと
も約200ヌクレオチド長であり、ゲノム修飾がおこり天
然ピチアゲノム部位の分離された各部位と相同なヌクレ
オチド配列を有する。選択可能なマーカー遺伝子は遺伝
子産物がその遺伝子を受けとる細胞に選択可能な表現型
を与える遺伝子であつて、例えば抗生物質耐性遺伝子ま
たは生長に必要な栄養素を細胞に合成させる生合成遺伝
子であり得る。選択可能なマーカー遺伝子は、それがDN
Aベクター上に存在する場合、そのベクターDNAを受け取
つた細胞のみを選択的増殖条件下で増殖させる。選択可
能なマーカー遺伝子は第一および第二の挿入可能なDNA
フラグメントの間に位置づけることが重要であり、また
挿入可能なDNAフラグメントはそれらが線状DNAフラグメ
ントによるゲノム修飾を受ける宿主細胞のゲノム内に存
在するときと同じ向きで互いに対して方向づけることが
大切である。
さらに、本発明によれば、第一の挿入可能なDNAフラ
グメント、選択可能なマーカー遺伝子および第二の挿入
可能なDNAフラグメントを含む直列配置の線状DNAフラグ
メントが提供される。第一および第二の挿入可能なDNA
フラグメントはそれぞれ少なくとも約200のヌクレオチ
ド長であり、ピチア属菌種のゲノムDNAの各部分と相同
なヌクレオチド配列を有し、そしてそれらがピチアのゲ
ノム中に存在するのと同じ向きで線状フラグメント中に
互いに対して方向づけられる。マーカー遺伝子は第一お
よび第二の挿入可能なDNAフラグメントの間に位置づけ
られる。
本発明に従つてピチア属を形質転換する際に使用する
基本要素は最小の３つの成分：すなわち 第一の挿入可能なDNAフラグメント、 第二の挿入可能なDNAフラグメント、および 選択可能なマーカー遺伝子 を含有する。
第一および第二の挿入可能なDNAフラグメントはそれ
ぞれ少なくとも約200のヌクレオチド長であるべきであ
り、一般には約200〜5000ヌクレオチドの範囲の長さが
用いられる。好ましくは、操作および取扱いを簡単にす
るために、約500〜2000ヌクレオチドの範囲のフラグメ
ントが使用される。
第一および第二の挿入可能なDNAフラグメントとして
有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾がおこる天然ピ
チアゲノム部位の分離された各部分と相同なヌクレオチ
ド配列である。従つて、例えばゲノム修飾がアルコール
オキシダーゼ遺伝子の位置でおこる場合、使用する第一
および第二の挿入可能なDNAフラグメントはアルコール
オキシダーゼ遺伝子位置の分離された各部分と相同な配
置であるだろう。本発明によるゲノム修飾がおこるため
には、２つの挿入可能なDNAフラグメントは、それらが
ピチアゲノム中に存在するのと同じ相対的方向で、線状
フラグメント中に互いに対して方向づけられねばならな
い。
本発明の実施に際して使用する形質転換DNAの３つの
最小成分は直列に配置され、それにより選択可能なマー
カー遺伝子が第一および第二の挿入可能なフラグメント
の間に位置づけられた線状DNAフラグメントを形成す
る。選択可能なマーカー遺伝子の例にはピチア・パスト
リスおよびサツカロミセス・セレビシエ（Saccharmyces
cerevisiae）由来のARG4遺伝子、ピチア・パストリス
およびS.セレビシエ由来のHIS4遺伝子、大腸菌転位因子
Tn601由来のG418ホスホトランスフエラーゼ遺伝子など
が含まれる。当業者はまた多数の適当な側面配列（すな
わち第一および第二の挿入可能なDNAフラグメント）が
ピチア・パストリスのゲノムから単離された遺伝子より
誘導され得ることを認めるであろう。その遺伝子の例に
はアルコールオキシダーゼ遺伝子（AOX1およびAOX2;ピ
チアは２種のアルコールオキシダーゼ遺伝子を含む）、
ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（DAS）、アル
ギニノコハク酸リアーゼ遺伝子（ARG4）、ヒスチジノー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子（HIS4）などが含まれるが、
これらに限定されない。
形質転換用線状DNAフラグメントは種々の他のDNA配
列、例えば異種遺伝子（すなわち宿主細胞内の挿入がお
こるゲノムのその位置に通常は存在しない遺伝子または
その一部であつて、ピチア・パストリス内でのその発現
が望まれるもの）を含むことができる。一般に“異種”
という用語は宿主のピチア細胞に本来存在しないDNAを
意味する。異種遺伝子は、場合により、その異種遺伝子
産物の生産を独立して制御する調節領域と組物わされる
か、または形質転換過程で破壊された遺伝子の天然調節
領域の影響下に形質転換細胞中でその異種遺伝子を発現
させることができる。
さらに、本発明の実施に際して用いられる形質転換用
線状DNAフラグメントは、例えばpBR322やpBR325配列の
ような細菌のプラスミドDNAをも含み得る。この種の細
菌配列はこれらのDNA配列の大腸菌内での増幅によるin
vitro操作および生産のために有用である。
形質転換用線状DNAとして特に有用な形は、 第一の挿入可能なDNAフラグメント、 第二の挿入可能なDNAフラグメント、 選択可能なマーカー遺伝子、および 細菌のプラスミドDNA を含む閉環状プラスミドのようなものである。このプラ
スミドはまた先に述べたような追加のDNA配列を含みう
る。
好適な実施態様において、閉環状プラスミドは２つの
部分、すなわち“形質転換”部分と“細菌”部分から構
成される。形質転換部分は直列に配置された第一の挿入
可能なDNAフラグメント、選択可能なマーカー遺伝子、
および第二の挿入可能なDNAフラグメントから成り、そ
の際第一および第二の挿入可能なDNAフラグメントはそ
れらがピチアゲノム内に存在するときと同じ向きで互い
に対して方向づけられ、そして選択可能なマーカー遺伝
子は第一および第二の挿入可能なDNAフラグメントの間
に位置づけられる。その後、細菌部分は第一の挿入可能
なDNAフラグメントと第二の挿入可能なDNAフラグメント
とを接続して閉環状ベクターを形成するように位置づけ
られる。
上記のようにして作製された閉環状ベクターは大腸菌
内で大量のプラスミドをつくるために使用され、その後
このプラスミドを単離し、適切な制御酵素で消化して形
質転換部分を細菌部分から切り離す。次に、酵母DNAの
線状形質転換部分を用いてピチア属の菌株を形質転換
し、それにより目的のゲノム修飾を行うことができる。
もちろん、当分野で通常の知識を有する者は上記の閉
環状プラスミドの“形質転換”部分が追加のDNA配列を
含みうることを認めるであろう。例えば、大腸菌内での
増幅によるDNAの操作および生産のためにin vitroで使
用される細菌配列は形質転換DNAの一部であり得、すな
わち、細菌配列は選択可能なマーカー遺伝子配列と同様
に、第一および第二の挿入可能なDNAフラグメントの間
に位置づけることが可能である。DNA成分のこのような
構成配置を用いる場合は、その細菌配列も本発明のゲノ
ム修飾法に付される宿主酵母のゲノム内に組み込まれる
ことになろう。
ピチア・パストリスの形質転換はストローマン（Stro
man）らの係属中の特許出願第666579号（フイリツプス
・ペトロレウム・カンパニーに譲渡）に開示されてい
る。ピチア・パストリスの形質転換のために用いられる
実験方法は以下に詳し述べる（実施例Ｉを参照）。ピチ
ア属の酵母菌株はその細胞壁を酵素により消化してセフ
エロプラストを得、そのスフエロプラストを形質転換DN
Aと混合し、カルシウムイオンおよびポリエチレングリ
コールの存在下でインキユベートし、その後選択増殖培
地で再生することにより形質転換することができる。形
質転換DNAは選択可能なマーカー遺伝子を含み、この遺
伝子は形質転換細胞のみが用いた選択増殖条件（選択増
殖条件は形質転換DNAの一部として使用した選択可能な
マーカー遺伝子に関係する）のもとで生き残つて生長す
ることができるので、形質転換DNAを取り込んだ細胞の
選択を可能にする。
第一アルコールオキシダーゼ遺伝子（AOX1）が破壊さ
れたピチア菌株を異種遺伝子発現用の宿主として使用す
る場合、驚いたことに、異種遺伝子産物の発現レベル
は、ある種のプロモーター（例えばAOX1またはDASプロ
モーター）の制御下にあるとき、完全なアルコールオキ
シダーゼ感応宿主を使用する場合に得られる発現レベル
よりも数倍増加することが観察された。この観察および
この現象のその後の研究の結果として、異種遺伝子の宿
主生物内での発現レベルを高める一般的方法が存在し、
その方法は宿主菌株を栄養摂取制限条件下に基質（強力
な基質応答性プロモーター領域が存在し、異種遺伝子は
このプロモーターの調節制御下にある）上で増殖させる
ことから成ることが判明した。
本発明の高められた遺伝子発現にとつて必要な栄養摂
取制限条件”は、細胞に限定量の栄養素を与えるか、ま
たは突然変異の結果としてある種の増殖条件下で栄養摂
取を制限された変異株宿主を使用することによりもたら
される。従つて、例えば強力なアルコールオキシダーゼ
プロモーターまたはジヒドロキシアセトンシンターゼプ
ロモーター（これらのプロモーターは両方とも生長培地
中のメタノールの存在に応答する）の制御下にある異種
遺伝子の発現レベルを高めたいと思う場合メタノールを
利用する能力が一部欠けている宿主を使用するか、また
は完全なアルコールオキシダーゼ感応宿主と共にメタノ
ール制限増殖条件を使用することにより、必要とする栄
養摂取制限条件が得られ、こうして高められた遺伝子発
現が達成されるであろう。
ここに記載の異種遺伝子産物の発現増進方法は栄養摂
取制限に応答するプロモーターを含む全ての生物に有用
な一般的方法であると考えられる。従つて、異種遺伝子
をこのようなプロモーター領域の制御下におき、次にそ
の強力プロモーターを作動させる栄養素に関して栄養摂
取制限条件下でその宿主生物を培養することにより、増
大した遺伝子発現が起こるであろう。栄養摂取を制限さ
れた増殖条件を与える目下の好適な手段は、非変異株宿
主よりも一層高い発現レベルでプロモーターに発現させ
る栄養素を代謝する能力が一部欠損している変異株宿主
を使用することである。これは実施例Ｖに詳しく述べる
ようにピチアにおいて実証された。
本発明のゲノム修飾法によつて第一アルコールオキシ
ダーゼ遺伝子が破壊されたピチア・パストリスの菌株を
炭素源としてのメタノールと共に培養すると、驚いたこ
とに、第一アルコールオキシダーゼ遺伝子を欠いたこの
種の菌株は野生型のピチア細胞に対して低下した速度と
はいえ、まだメタノール上で生長できることが観察され
た。この観察はピチアのメタノール利用性菌株中に第二
のアルコールオキシダーゼ遺伝子が存在しうることを示
した。
ピチア染色体DNAのライブラリーのスクリーニングは3
Kbpフラグメント（このフラグメントは第二アルコール
オキシダーゼ（AOX2）の一部をコードすると思われる）
の単離へと導いた。このフラグメントはpBR322（唯一の
BamH I部位）に挿入物として組み入れた。このプラスミ
ドはpPG3.0と命名され、大腸菌宿主LE392によつて保有
される。この菌株はこの出願が特許として公布される際
に一般の人々が利用できるように、イリノイ州ピオーリ
アの米国農業省、ノザン・リージヨナル・リサーチ・セ
ンター（Northern Regional Research Center）に寄託
番号NRRL B−18022として寄託された。
pPG3.0の制限地図は第16b図に示され、ここにおいて
それは第一アルコールオキシダーゼ遺伝子のゲノムフラ
グメント、pPG4.0と比較される。後者のフラグメントは
ストローマンらの係属中の特許出願第666391号（フイリ
ツプス・ペトロレウム・カンパニーに譲渡）に詳しく開
示されている。２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子の
比較（第16図参照）は、これら２つのフラグメントが単
に同一ゲノム位置の重複部分でないことを明らかにし
た。２つのフラグメントにはいくつかの共通の制限部位
が存在することから証明されるように、２つのフラグメ
ントの間に若干の相同が存在することは明白である。２
つの遺伝子（AOX1およびAOX2）に共通する制限部位には
第16図において星印がつけられている。しかしながら、
他方のフラグメントに存在しない制限部位が各フラグメ
ントに数個存在することは、これらの２つのフラグメン
ト間にヌクレオチドレベルでの差異が若干存在すること
を示している。
本発明は今や以下の非限定的実施例によりさらに詳し
く説明されるであろう。
実施例 以下の実施例で用いる緩衝液および溶液は下記の組成
を有する： 1Mトリス緩衝液 H2O800ml中のトリス塩基121.1g;濃HCl水溶液（35％）を
加えてpHを所望の値に調整する；最終pHの調整前に溶液
を室温まで冷却させる； 希釈して最終容量を１とする。
TE緩衝液 0.01M（pH7.4）トリス緩衝液中1.0mM EDTA LB（Luria−Bertani）培地 バクト−トリプトン 5g バクト−酵母エキス 5g NaCl 2.5g を水１に加え、NaOHでpH7.5に調製する。
2B培地 0.2％ NH4PO4 1.2％ Na2HPO4 0.013％ MgSO4・7H2O 0.074％ CaCl2・2H2O ２μg/mlビチオン １μg/mlチアミン 100μg/mlトリプトフアン 0.4％ デキストロース 0.2％ カザミノ酸 YPD培地 １％ バクト−酵母エキス ２％ バクト−ペプトン ２％ デキストロース SD培地 6.75g アミノ酸不含酵母窒素塩基（ジフコ） 水１中の２％デキストロース SED 1M ソルビトール 25mM EDTA 50mM DTT SCE緩衝液 9.1g ソルビトール 1.47g クエン酸ナトリウム 0.168g EDTA 50ml H2O HClでpH5.8とする。
CaS 1M ソルビトール 10mM CaCl2 過滅菌する。
PEG溶液 20％ポリエチレングリコール−3350 10mM CaCl2 10mM トリス−HCl（pH7.4） 過滅菌する。
SOS 1M ソルビトール 0.3X YPD培地 10mM CaCl2 実施例において用いられる以下の略号は次の意味を有
する： EDTA エチレンジアミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム DTT ジチオトレイトール 実 施 例 Ｉ ピチア・パストリスの形質転換法 A.細胞増殖 1. ピチア・パストリスGS115（NRRL Y−15851）のコロ
ニーを約10mlのYPD培地に接種し、培養物を30℃で12〜2
0時間振とうする。
2. 約12〜20時間後、約0.01〜0.1のOD600へ細胞を希釈
し、対数増殖期の細胞をYPD培地中に30℃で約６〜８時
間維持する。
3. 約６〜８時間後、OD600が約0.1の種培養物0.5ml
（または等量）をYPD培地100mlに接種する。30℃で約12
〜20時間振とうする。
4. OD600が約0.2〜0.3になつたとき（約16〜20時間
後）、1500xgで５分間遠心することにより培養物を回収
する。
B.スフエロプラストの調製 1. 細胞を滅菌水10mlで１回洗う。（工程１〜５の遠心
は1500xgで５分間行う。） 2. 細胞を新しく調製したSED10mlで１回洗う。
3. 細胞を滅菌1Mソルビトール10mlで２回洗う。
4. 細胞をSCE緩衝液10ml中に懸濁する。
5. 4mg/mlチモリアーゼ60,000（Zymolyase;マイルズラ
ボラトリーズ）５〜10μを加える。細胞を30℃で約30
〜60分間インキユベートする。
スフエロプラストの調製は形質転換法において重要な
工程であるので、スフエロプラストの形成を次のように
して監視すべきである：チモリアーゼの添加前または添
加直後およびインキユベーシヨンのいろいろな時期に細
胞の100μアリコートを５％SDS900μおよび1Mソル
ビトール900μに加える。細胞がSDSに溶解するがソル
ビトールに溶解しない時点（通常30〜60分のインキユベ
ーシヨン）でインキユベーシヨンを停止する。
6. スフエロプラストを1000xgで５〜10分遠心すること
により滅菌1Mソルビトール10mlで２回洗う。（遠心の時
間および速度は変化しうる；スフエロプラストを沈殿さ
せるのに十分であるが、それらを遠心力によつて破裂さ
せない程度に遠心する。） 7. 細胞を滅菌CaS10mlで１回洗う。
8. 細胞をCaS0.6mlの全体に懸濁する。
C.形質転換 1. DNA試料（20μ容量以下）を12×75mmの滅菌ポリ
プロピレン管に加える。（DNAは水またはTE緩衝液中に
含まれるだろう；少量のDNAで最大の形質転換頻度を得
るために、5mg/ml超音波処理大腸菌DNA約１μを各試
料に加えることが適切である。） 2. スフエロプラスト100μを各DNA試料に加えて、室
温で約20分間インキユベートする。
3. PEG溶液1mlを各試料に加えて、室温で約15分間イン
キユベートする。
4. 試料を1000xgで５〜10分遠心し、PEG溶液をデカン
トする。
5. 試料をSOS150μに再懸濁し、室温で30分間インキ
ユベートする。
6. 滅菌1Mソルビトール850μを加え、試料のアリコ
ートを以下のようにして平板培養する。
D.スフエロプラストの再生 1. 再生寒天培地の処方： a.寒天−KCl−バクト−寒天9g、KCl13.4g、H2O240ml、
加圧滅菌。
b.10×グルコース−デキストロース20g、H2O100ml、加
圧滅菌。
c.10×SC−アミノ酸不含の酵母窒素塩基6.75g、H2O100m
l、加圧滅菌。（加圧滅菌前または後に200μg/mlの濃度
までの所望アミノ酸または核酸を加える。） d.溶融した寒天−KCl溶液240mlに10×グルコース30mlお
よび10×SC30mlを加える。0.2mg/mlビチオン0.6mlおよ
びその他の所望アミノ酸または核酸を20μg/mlの濃度で
加える。溶融した再生寒天を55〜60℃に保持する。
2. 形質転換試料の平板培養： 形質転換試料を用意する少なくとも30分前にプレート
当たり10mlの再生寒天の底部寒天層を注入する。形質転
換試料がSOS中に存在する間に、45〜50℃の浴中で試験
管に再生寒天の10mlアリコートを分注する。再生寒天を
含む試験管に上記の形質転換試料のアリコートを加え、
プレートの底部寒天層の上に注入する。
3. スフエロプラストの調製物の品質測定： １つの試料10μを取り出し、1Mソルビトール990μ
に加えて100倍に希釈する。その100倍希釈物の10μ
を取り出し、1Mソルビトールの第二の990μアリコー
トに加えてさらに100倍に希釈する。両方の希釈物100μ
をYPD倍地を含む寒天平板上に塗り、調製物中に残存
する非スフエロプラスト化完全細胞の濃度を測定する。
40μg/mlヒスチジンを補足した再生寒天10mlに各希釈物
100μを加え、再生可能な完全スフエロプラストを測
定する。形質転換実現において良好な値は再生可能な完
全スフエロプラストが１〜３×107個/mlであり、完全細
胞が約１×103個/mlである。
4. 平板を30℃で３〜５日間インキユベートする。
実 施 例 II サツカロミセスARG4遺伝子およびpBR322の票位特異的挿
入およびGS190（NRRL Y−18014）中のピチアHIS4の欠失 第１図はプラスミドpYMI1を示し、第２図はP.パスト
リスのゲノム内へのプラスミドの部位特異的挿入をもた
らす現象の模式図である。ベクターはサツカロミセスAR
G4遺伝子とpBR322由来のDNA配列とをピチアHIS4位置へ
挿入し、同時にピチアゲノムから全HIS4遺伝子位置を欠
失するようにデサインされる。発現カセツトのような他
の配列もpYMI1内に容易に挿入され、同様にP.パストリ
スゲノム内に組み込まれるだろう。
プラスミドpYMI1はピチアHIS4遺伝子の５′末端にin
situにおいて位置するEcoR I−BamH Iフラグメント、お
よびピチアHIS4遺伝子の３′末端に位置するEcoR I−Cl
a Iフラグメントを含む。両方のHIS4遺伝子−側面フラ
グメントはプラスミドpYJ8（イリノイ州ピオーリアの米
国農業省、イザン・リージヨナル・リサーチ・センター
からNRRL B−15889として大腸菌宿主より入手可能；第
３図参照）から得ることができ、約400bpの長さを有
し、そしてpYMI1においてそれらのEcoR I末端で連結さ
れる。選択可能なマーカーとして、pRMI1ベクターはサ
ツカロミセスアルギニノコハク酸リアーゼ（ARG4遺伝子
産物）をコードするpYM25（NRRL B−18015として大腸菌
宿主より入手可能；第17図参照）由来の2.6Kbp Hind II
I−Sal Iフラグメントを含む。EcoR Iで切断すると、pY
MI1は線状になり、その両末端にHIS4遺伝子−側面フラ
グメントを有する。
P.パストリスarg4菌株、GS190（NRRL Y−18014）はEc
oR I切断pYMI1でアルギニン原栄養株（Arg+）へと形質
転換した。再生寒天培地はHIS4遺伝子の欠失の結果とし
てヒスチジンを必要とする形質転換細胞に対し選択圧力
が加わるのを避けるために、40μg/mlのヒスチジンを補
足した。
Arg+形質転換細胞はその後HIS4遺伝子の欠失の結果と
してHis-になつたものについてスクリーニングした。Hi
s-形質転換細胞についてスクリーニングするために、Ar
g+コロニーを埋め込んだ再生寒天を滅菌水25ml含有の50
ml滅菌試験管に移した。その後ブリンクマン・インスツ
ルメンツ・ポリトロン・ホモジナイザー（Brinkman Ins
truments Polytron homogenizer）を５にセツトして約
１分間混合することにより寒天を微粉砕した。３層の滅
菌ガーゼを通して過することにより酵母細胞を寒天か
ら分離した。その後、酵母細胞の一部を超音波処理し、
希釈し、そして40μg/mlのヒスチジンを補足したSD培地
寒天平板上に塗り付けた。
超音波処理のために、細胞試料をA600＝0.1へ希釈
し、ソニフアイアー・セル・デイスラプター350（Sonif
ier Cell Disrupter 350;ブランソン・ソニツク・パワ
ー・カンパニー）を４にパワーセツトして10秒間超音波
処理した（この処理は細胞をばらばらに分離するのに十
分であるが、細胞の生存能力を低下させないものであ
る）。２〜３日後、SD＋ヒスチジン寒天平板上で増殖し
たコロニーはヒシチジン含有およびヒスチジン不含の数
組のSD平板上でレプリカ培養した。
Arg+His-コロニーの割合はArg+形質転換細胞全体の平
均0.7％であつた。３つのArg+His-菌株由来のゲノムDNA
はサザンブロツトハイブリダイゼーシヨンにより試験し
た。完全なHIS4遺伝子は３つの菌株すべてにおいて欠失
しており、そして第２図の一番下に示すような線状プラ
スミドが挿入されていた。
GS190−pYMI1菌株は生長のためにヒスチジンを必要と
するがもはやアルギニンを必要としないという事実のほ
かに、栄養接種上の必要条件または生長速度におけるそ
の他の変化は観察されなかつた。
実 施 例 III P.パストリスNRRL Y−11430からのHIS4遺伝子の欠失 第４図はプラスミドpYMI3aを示し、第５図はP.パスト
リス菌株NRRL Y−11430のHIS4位置へのプラスミド由来
フラグメントの線状挿入をもたらす現象を示している。
上記ベクターは選択可能なマーカーとしてpBRG1−１
（イリノイ州ピオーリアの米国農業省、ノザン・リージ
ヨナル・リサーチ・センターから菌株NRRL B−18020と
して大腸菌宿主より入手可能；第６図参照）に由来する
G418耐性遺伝子（G418R）を含む。G418R遺伝子は約2.2K
bpのBamH I（pBR322部位）/Bgl II（PARS1部位）フラグ
メントとしてpBRG1−１から移され、ピチアHIS4遺伝子
を含む2.7Kbp Bgl IIフラグメントの代わりにpYJ8（NRR
L B−15889;第３図参照）のBgl II部位へ挿入された。
ベクターpYMI3aをEcoR Iで消化して、HIS4遺伝子のち
ようど５′末端と３′末端にそれぞれ位置する領域から
の約450bpDNAと約250bpDNAによつてはさまれたG418R遺
伝子を含む2.9Kbpフラグメントを生成した。このEcoR I
切断プラスミドを用いてP.パストリス宿主を形質転換し
た。
形質転換細胞は300μg/mlのG418抗生物質の存在下で
増殖するそれらの能力により選択した。G418選択のため
に、再生寒天培地は実施例ＩのパートＤに記載のものか
ら次のように変更した： 1. 再生寒天培地の処方： a.寒天−ソルビトール−バクト−寒天9g、ソルビトール
54.6g、H2O240ml、加圧滅菌。
b.10×グルコース−デキストロース20g、H2O100ml、加
圧滅菌。
c.10×YP−酵母エキス10g、ペプトン20g、H2O100ml、加
圧滅菌。
d.10×グルコース30mlおよび10×YP30mlを溶融した寒天
−ソルビトール溶液240mlに加える。溶融した再生寒天
培地は55〜60℃に保持する。
2. 形質転換試料の平板培養： 形質転換試料を用意する少なくとも30分前に600μg/m
lのG418を補足した再生寒天培地の底部寒天層を10ml/プ
レートの量で注入した。形質転換試料がSOS中に存在す
る間に、再生寒天培地（G418を含まない）の10mlアリコ
ートを45〜50℃の浴中で試験管に分注した。形質転換試
料が用意されたとき、その試料のアリコートを再生寒天
含有試験管に加え、そしてG418を含む10mlの底部寒天層
の上に注入した。平板は30℃で３〜５日間インキユベー
トした。
コロニーがG418を含む再生寒天平板上に形成された
後、ヒシチジンなしで増殖するそれらの能力について細
胞をスクリーニングした。細胞を再生寒天から抽出し、
超音波処理し、そして実施例IIに記載したように40μg/
mlのヒスチジンを補足したSD培地寒天平板上に塗り付け
た。30℃で２〜３日間インキユベーシヨン後、コロニー
はヒスチジン含有およびヒスチジン不含のSD培地寒天平
板上でレプリカ培養した。
G418Rコロニーの約0.1％がHis-であつた（スクリーニ
ングした約2000個のうち２個）。サザンブロツトハイブ
リダイゼーシヨン実験は、HIS4遺伝子が両方のHis-菌株
のゲノムから欠失され且つ両方のゲノムが第５図に示す
ようにG418R遺伝子を含有することを示した。これらのH
is-菌株の１つ（実験室にてKM31と命名した；イリノイ
州ピオーリアの米国農業省、ノザン・リージヨナル・リ
サーチ・センターからNRRL Y−18018として入手可能）
はpSAOH5（NRRL B−15862として大腸菌宿主より入手可
能）のようなHIS4含有ピチアをベースとするプラスミド
により首尾よく形質転換され、このことはKM31が特異的
にHIS4遺伝子欠失生物であることをさらに証明するもの
である。
“野生型"P.パストリスNRRL Y−11430が直接に（すな
わち、初めに栄養要求変異誘導株を単離および同定する
ことなしに）形質転換されたのはこれが初めてである。
これらのHIS4変異株の利点は、それらが部位特異的挿入
／欠失法によつて作られたので、例えばGS115（NRRL Y
−15851）やGS190（NRRL Y−18014）のように化学的突
然変異誘発によつて作られたピチア栄養要求変異株宿主
に起こりうる二次突然変異をそれらが受けないというこ
とである。
pYMI3aの由来のEcoR Iフラグメントの挿入によるピチ
アゲノムからのピチアHIS4遺伝子の欠失はpBR322の主要
部分が付加されない（pYMI1を挿入した時には付加され
る；実施例II参照）ということに注意されたい。例えば
pSAOH5（第９図参照）のような大部分の自律的なARSを
ベースとするピチア発現ベクターは主にpBR322由来の配
列とピチアHIS4遺伝子から構成されるので、これらの自
律的ベクターはこれらのピチアHIS4欠失宿主のゲノムと
の相同性がほとんどなく、それ故にしばしば組込みがお
こらないであろう。
実 施 例 IV 第一アルコールオキシダーゼ遺伝子の破壊 アルコールオキシダーゼ遺伝子（ここでは第一アルコ
ールオキシダーゼ遺伝子をAOX1と呼び、第二アルコール
オキシダーゼ遺伝子をAOX2と呼ぶ）を欠くピチア菌株は
少なくとも２つの理由で興味が持たれる。第一には、メ
タノールによる遺伝子発現の調節に関する研究を助ける
ために。例えば、実施例VIIに詳述するような、AOX1お
よびAOX2遺伝子が欠失した変異株を用いることにより、
メタノールまたはその他の中間代謝物（ホルムアルデヒ
ド、ホルメートなど）がメタノール調節遺伝子の実際の
誘発分子であるかどうかについて解明することができ
る。AOX欠損ピチア菌株における第二の興味は、この種
の菌株が実施例ＶおよびVIに詳しく述べるように異種遺
伝子産物を高レベルで発現しうるという可能性にある。
AO遺伝子を破壊するために、プラスミドpYMI7を作つ
た（第７図参照）。このプラスミドはサツカロミセスAR
G4遺伝子を含むプラスミドpYM25（NRRL B−18015;第17
図参照）由来の2.9Kbp BamH I−Sal IフラグメントをBa
mH I切断pPG4.0（NRRL B−15868;このプラスミドのピチ
ア部分の制限地図については第16a図参照）に挿入する
ことによつて作製した。この挿入はAOX1遺伝子の５′−
部分から約600bp（この遺伝子の約1/4）の欠失をもたら
す。プラスミドpYMI7はPvu IIおよびEcoR Iで消化する
ことにより線状となし、Arg+原栄養株について選択する
ことによりPPF1（arg4 his4,NRRL Y−18017）を形質転
換した。形質転換細胞を再生寒天から抽出し、実施例II
に記載のように超音波処理し、そして0.1％グルコース
（２％の代わり）および40μg/mlヒスチジンを含むSD培
地寒天平板上に塗り付けた。その後得られたコロニーは
次の炭素源:1）炭素源なし;2）0.5％メタノール；およ
び３）２％グルコースを含む１組のSD培地寒天平板（ヒ
スチジン含有）上でレプリカ培養した。Arg+コロニーの
約81.0％はメタノール上で通常増殖できなかつた。これ
らのメタノール非利用株のうち２つの菌株（すなわちKM
71およびKM72）からのゲノムDNAのサザンブロツト分析
は、これらの菌株らおいてAOX1遺伝子が破壊されて、第
８図の一番下に示すようにベクターが挿入されたことを
示した。
遺伝子型：（his4 aox1::SARG4）を有するPPF1−pYMI7
アルコールオキシダーゼ欠損構築物は非常に価値がある
と思われる。例えば、この菌株はhis4であるので、pSAO
H（NRRL B−15862;第９図参照）のように選択可能なマ
ーカーとしてHIS4遺伝子を含むピチアベクターは、下記
の実施例Ｖに詳述するように、この宿主を形質転換する
ことができる。
実 施 例 Ｖ ピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼ欠損変異
株によるlacZ遺伝子のメタノール調節発現 本実施例は実施例IVに記載されるようにして作つたピ
チア宿主KM71（PPF1−pYMI7アルコールオキシダーゼ欠
損菌株）によるlacZ遺伝子の発現に関する実験を示す。
これらの比較実験のためのAox1-宿主はKM71（his4 ao
x1::SARG4）であり、Aox1+宿主はPPF1（arg4 his4;NRRL
Y−18017）であつた。両方の菌株を形質転換したAOX1
プロモーター−lacZ発現カセツトはプラスミドpSAOH5
（第９図参照;NRRL B−15862）に含まれていた。いくつ
かのHis+形質転換細胞を両菌株から単離した。それらの
ゲノムDNAをサザンブロツト分析により試験して、それ
ぞれがAOX1プロモーター位置にpSAOH5を組み込んだ１組
の対抗した菌株を得た。同様に、KM71およびPPF1をプラ
スミドpT76H3（第18図参照;NRRL B−18000）上のジヒド
ロキシアセトンシンターゼ（DAS）プロモーター−lacZ
遺伝子融合物で形質転換し、ヒスチジン原栄養株につい
て選択した。
４種の菌株のそれぞれは初めにSD培地（但し２％グル
コースの代わりに唯一の炭素およびエネルギー源として
２％グリセロールを含む）で増殖させた。次に、各培養
物を遠心により集めて、別の培地（すなわち、唯一の炭
素源として0.5％メタノールを含むSD培地）に移した。
これらの培養物の試料はβ−カラクトシダーゼについて
検定した。その結果を表１に示す。
＊ガラクトシダーゼ検定 A.必要な溶液： 1.Z−緩衝液 最終濃度 Na2HPO4・7H2O 16.1g 0.06M NaH2PO4 5.5g 0.04M KCl 0.75g 0.01M MgSO4・7H2O 0.246g 0.001M ２−メルカプトエタノール 2.7ml 0.05M 全量１としてpH7に調整 2.O−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ONPG） 蒸留水100mlにONPG（シグマＮ−1127）400mgを溶解し
て4mg/mlONPG溶液を調製する。
B.検定法： 1.培地（OD600が20〜50の酵母細胞）からアリコートを
採取し、遠心し、そして冷滅菌水で細胞沈殿物を洗う。
2.細胞沈澱物および酸洗浄した0.45〜0.50mmガラスビー
ズ0.2μｇに40％Ｚ緩衝液１μを加える。全ての試料
を氷の上におく。その混合物をボルテツクス混合機を最
高にセツトして１分間ずつ４回混合する。ボルテツクス
混合の間少なくとも１分間試料を氷の上におくべきであ
る。
3.溶菌液をミクロ遠心管に移し、ミクロ遠心分離機を用
いて４℃で５分遠心する。上清を新しいミクロ遠心管に
移し、その抽出物を氷の上におく。
4.抽出物中に含まれる全タンパク質の濃度はバイオ−ラ
ツド・ラボラトリーズ（ブラツドフオード）のタンパク
質検定法を用いて評価した。このためにバイ−ラツド色
素試薬濃厚液（Bio−Rad Dye Reagent Concentrate）を
４倍容量の脱イオン水で希釈し、ワツトマン3MM紙を
通して過した。その後、１組の13×100mmガラス試験
管（各試験管は2.5mlの色素試薬を含む）にＺ緩衝液100
μ中の3,10,30および100μｇのウシ血清アルブミン
（BSA）を加えることにより標準濃度曲線を作成した。
試料を混合して室温で５分間保ち、そして595nmでのそ
れらの光学密度を測定した。抽出物については、3,10お
よび30μの試料をＺ緩衝液含有溶液で100μとな
し、上記のようにしてタンパク質含量を検定した。各抽
出物についてのタンパク質濃度の値はBSA濃度曲線を用
いて内挿した。
5.β−ガラクトシダーゼ検定については、抽出物の10倍
希釈液10μを1mlのＺ緩衝液に加え、その混合物を30
℃で５分間インキユベートした。
6.0.2mlのONPG（4mg/ml）を加えることにより反応を開
始させ、ボルテツクス混合する。
7.適当な時点（通常１〜30分、A420＜１）で1M Na2CO3
溶液0.5mlを加えることにより反応を停止させる。
8.420nmで上清の吸光度を読み取る。
C.β−ガラクトシダーゼ活性単位の計算： 1Uは30℃、pH7において１分当たりに形成されたオル
トニトロフエノール（ONP）が1nmoleであることを表わ
す。
1nmoleのONPは1cmの経路において420nmでの吸光度（A
420）が0.0045である。従つて、420nmでの吸光度１は22
2nmoleONP/mlを表わし、すなわち分析すべき上清の総容
量は1.7mlであるから378nmoleONP/1.7mlを表わす。それ
故、表に示される単位は次式により計算される： ４種の培養物のそれぞれはグリセロール増殖期の間に
は検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性をほとんど示さ
なかつた。メタノール培地に移行させて約10〜20時間後
に、Aox1＊宿主内にAOX1−lacZおよびDAS−lacZ発現カ
セツトを含む２種の培養物は、タンパク質１μｇ当たり
β−ガラクトシダーゼ活性約20単位で横ばい状態になる
β−ガラクトシダーゼ活性を示した。しかしながら、Ao
x1-宿主内のAOX1−lacZカセツトは約60単位／μｇに達
する活性を示した。Aox-宿主内のDAS−lacZカセツトも
β−ガラクトシダーゼ活性レベルの増加を示した。従つ
て形質転換されたAox1-宿主（KM71）は形質転換された
同質遺伝子のAox+菌株（PPF1）よりも２〜３倍高い発現
レベルでβ−ガラクトシダーゼを発現した。
実 施 例 VI Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の挿入およびAOX1遺伝子の欠失 部位特異的挿入／欠失の本実施例では、AOX1遺伝子の
全コーデイング配列が欠失され、Ｂ型肝炎表面抗原（HB
sAg）遺伝子がゲノムに残存するAOX1遺伝子プロモータ
ーの制御下に挿入された。このP.パストリス宿主株菌の
ために、プラスミドpBSAGI5Iが作製された（イリノイ州
ピオーリア、米国農業省のノザン・リージヨナル・リサ
ーチ・センターに寄託番号NRRL B−18021として大腸菌
宿主内に寄託され、この出願から特許が公布される際に
制限なしで一般の人々に利用可能である；第12図参
照）。このプラスミドはAOX1遺伝子の５′末端の側面に
位置する配列からの1.0Kbpフラグメント、その後に続く
Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）配列および300bpAOX1ターミ
ネーターフラグメントを含み、これら全ては第9,10およ
び11図に示すように構築された。発現カセツトの後には
ピチアHIS4遺伝子をコードする2.7Kbpフラグメントが存
在し、最後にAOX1遺伝子の３′側の配列を含む1.5Kbp P
vu IIフラグメントが存在していた。
pBSAGI5IをBgl IIで消化すると、7.2Kbp線状ベクター
が放出され、これは一方の末端に0.85Kbpの５′−AOX1
遺伝子配列を、そして他方の末端に1.1Kbpの３′−AOX1
配列を含んでいた。
Bgl II切断pBSAGI5Iを用いて、ヒスチジン原栄養株に
ついて選択することによりGS115を形質転換し、形質転
換細胞を再生寒天から抽出して実施例IIのように超音波
処理し、そして0.1％グルコース（2.0％の代わり）を含
むSD培地寒天平板上に塗り付けた。次いで、生じたコロ
ニーは次の炭素源:1）炭素源なし、２）0.5％メタノー
ル、および３）２％グルコースを含む最小寒天平板上で
レプリカ培養した。試験したコロニーの平均32％が通常
メタノール上で生長できなかつた。
２つのメタノール非利用株からのゲノムDNAのサザン
ブロツト分析は、AOX1遺伝子が欠失されて、ベクター配
列が第13図に示すように挿入されたことを立証した。
メタノール中で増殖させると、GS115−pBSAGI5I菌株
（aox1::HBsAg−HIS4）は、同様に形質転換された完全
なアルコールオキシダーゼ感応細胞よりも高いレベルで
HBsAgを発現した。
実 施 例 VII 部位特異的挿入法によるP.パストリスの第二アルコール
オキシダーゼ遺伝子の同定 第二アルコールオキシダーゼ遺伝子の存在は次の観察
から推定することができる:1）AOXcDNAまたはゲノムDNA
に由来するプローブと限られたピチアゲノムDNAとをハ
イブリダイズさせるサザンブロツト法が少なくとも２つ
のバンドを常に示した;2）類似するが互いに同一でない
２種のピチアゲノムDNAフラグメントが初めに単離され
た（第16図参照）；および３）第一AOX遺伝子（AOX1）
を欠失または破壊したKM71およびGS115−pBSAGI5Iのよ
うなピチア変異株がそれでもなおメタノール上で生長す
ることができ、アルコールオキシダーゼ活性を有してい
た。これらのAox1-株のメタノール生長細胞における生
長速度は同質遺伝子のAox1+株よりもかなり遅かつた。
それゆえ、第二AOX遺伝子（AOX2）は比較的低いレベル
で発現されるか、あるいはその産物のメタノールに対す
る活性がより少ないと考えられる。実施例IVにおいて、
pPG4.0中のピチアDNAフラグメントはAOX1遺伝子を含む
ことが立証された。
pPG3.0由来のゲノムDNAフラグメントがAOX2遺伝子の
少なくとも一部を含むということを立証するための最も
納得のいく方法は、この推定上のAOX2遺伝子を破壊また
は欠失させた変異株を作ることである。そのために、部
位特異的ベクターpYMI12aが作製された（第14図参
照）。このプラスミドは推定上のAOX2遺伝子を3.0Kbp B
amH Iフラグメント上に含むpPG3.0（第16b図参照）から
主に構成される。ピチアHIS4遺伝子を含む2.7Kbp Bgl I
IフラグメントがpYJ8（第３図;NRRL B−15889）から単
離され、そしてpPG3.0のBgl II部位と一番左のKpn I部
位の間に存在する配列の代わりに挿入された。（Kpn I
部位は挿入に先立つてオリゴヌクレオチドアダプターに
よりBgl IIに変換され；そしてHIS4遺伝子のBamH I部位
はpPG3.0に挿入する前に“修復”することにより破壊さ
れた。）AOX1遺伝子と推定上のAOX2遺伝子の比較（第16
図参照）は、この作製がAOX2の中央部から約800bpを欠
失させることを示している。pYMI12aをBamH Iで消化す
ることにより、それぞれ1.1Kbpと0.7Kbpの推定上のAOX2
位置からの配列によつてはさまれたHIS4遺伝子フラグメ
ントを含む4.5Kbp線状ベクターが得られた。
この線状ベクターによりAox1-株、KM71（aox1 his4::
SARG4）を形質転換し、ヒスチジン原栄養株について選
択することにより形質転換細胞を単離した。その後形質
転換細胞は数組の寒天平板上でレプリカ培養することに
より、メタノール利用能力についてスクリーニングし
た。
非形質転換Aox1-株KM71はメタノール平板上で非常に
ゆつくり生長するので、たとえ寒天中にメタノールが含
まれたとしても有意な生長が観察される前にそれは蒸発
してしまつた。この問題は蒸気相中の細胞にメタノール
を供給することにより解決された。この方法のために、
100％メタノール約0.2mlが寒天培地中に炭素源を含まな
いプレートのふたの下に加えられた。このプレートを室
温に放置し、そしてふたを新しいメタノール含有ふたと
２〜４日おきに取りかえた。約１〜２週間後に、野生型
（Aox1＊ Aox2＊）、および変異株（Aox1- Aox2+）と
（Aox1- Aox2-）のメタノール生長における差異がはつ
きりした。
蒸気相供給法に従つて、Aox1-株からのHis+形質転換
細胞に約0.1％がメタノール上で生育できなかつた、８
個のAox1- Aox2- His+形質転換細胞からのDNAをサザン
フイルターハイブリダイゼーシヨン法により分析した。
これらのDNAのうち３個は第15図のように挿入された線
状pYMI12aを含んでいた。Aox1- Aox2-二重変異株、KM71
21（NRRL Y−18019）を用いた分析は、この菌株がメタ
ノール上で全く生育できず、また検出可能なAOX活性を
もたないことを示した。KM7121に関するこれらの結果か
ら、pPG3.0中にピチアフラグメントが第二AOX遺伝子由
来の配列を含み、これらの２種のアルコールオキシダー
ゼ以外の他のメタノール酸化活性がP.パストリスに存在
しないことは明らかである。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpYMI1の制限地図であり； 第２図はプラスミドpYMI1の一部をピチア染色体のHIS4
位置へ挿入することを示し； 第３図はプラスミドpYJ8の制限地図であり； 第４図はプラスミドpYMI3aの制限地図であり； 第５図はプラスミドpYMI3aの一部をピチア染色体のHIS4
位置へ挿入することを示し； 第６図はプラスミドpBRG1−１の制限地図であり； 第７図はプラスミドpYMI7の制限地図であり； 第８図はプラスミドpYMI7の一部をピチア染色体のアル
コールオキシダーゼ位置へ挿入することを示し； 第９図はプラスミドpSAOH5およびpTHBS3からのプラスミ
ドpYM39の作製を示し； 第10図はプラスミドpYM39およびpPG3.2からのプラスミ
ドpYMI6の作製を示し； 第11図はプラスミドpYMI6およびpBSAG5Iからのプラスミ
ドpBSAGI5Iの作製を示し； 第12図は第11図よりも詳細なプラスミドpBSAGI5Iを示す
制限地図であり； 第13図はプラスミドpBSAGI5Iの一部をピチア染色体のア
ルコールオキシダーゼ位置へ挿入することを示し； 第14図はプラスミドpYMI12aの制限地図であり； 第15図はプラスミドpYMI12aの一部を第二ピチアアルコ
ールオキシダーゼ遺伝子（AOX2）の位置へ挿入すること
を示し； 第16図はpBR322をベースとするプラスミドpPG4.0および
pPG3.0中のピチア挿入物の制限地図である。第16a図に
示す挿入物は第一ピチアアルコールオキシダーゼ遺伝子
（AOX1）の位置からのものであり、第16b図に示す挿入
物は第二ピチアアルコールオキシダーゼ遺伝子（AOX2）
の位置からのものである。第16c図はAOX1遺伝子位置
（第16a図と関連）の既知アルコールオキシダーゼ（AO
X）コーデイング部分を示す； 第17図はプラスミドpYM25の制限地図であり；そして、 第18図はプラスミドpT76H3の制限地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84）

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アルコールオキシダーゼ遺伝子、ジヒドロ
    キシアセトンシンターゼ遺伝子、アルギニノコハク酸リ
    アーゼ遺伝子、またはヒスチジノールデヒドロゲナーゼ
    遺伝子部分のいずれかにおける予め定められたゲノム部
    位でのピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾法であっ
    て、 第一の挿入可能なDNAフラグメント、 選択可能なマーカー遺伝子、および 第二の挿入可能なDNAフラグメント； を含む直列に配置された線状DNAフラグメントによりピ
    チア属の宿主菌株を形質転換することからなり、その際
    上記の第一および第二の挿入可能なDNAフラグメントは
    それぞれ、アルコールオキシダーゼ遺伝子、ジヒドロオ
    キシアセトンシンターゼ遺伝子、アルギニノコハク酸リ
    アーゼ遺伝子、またはヒスチジノールデヒドロゲナーゼ
    遺伝子の約200〜5000塩基対の長さを有するフラグメン
    トであり、且つゲノム修飾を施す天然ピチアゲノム部位
    の物理的に離れた各部分と相同なヌクレオチド配列を有
    し；また第一および第二の挿入可能なDNAフラグメント
    はそれらがピチアゲノム内で方向付けられるように線状
    DNAフラグメント内で互いに対して方向付けられ；そし
    て上記のマーカー遺伝子は第一の挿入可能なDNAフラグ
    メントと第二の挿入可能なDNAフラグメントの間に位置
    していることを特徴とするゲノム修飾法。
  2. 【請求項２】第一および第二の挿入可能なDNAフラグメ
    ントがアルコールオキシダーゼ遺伝子のフラグメントで
    ある、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】線状DNAフラグメントがさらに異種遺伝子
    を含み、その際、異種遺伝子は選択可能なマーカー遺伝
    子と同様に第一の挿入可能なDNAフラグメントと第二の
    挿入可能なDNAフラグメントの間に位置している、特許
    請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】線状DNAフラグメントがさらに調節領域を
    含み、その際、異種遺伝子は該調節領域の制御下にあ
    り、そして選択可能なマーカー遺伝子に加えて調節領域
    −異種遺伝子構築物も第一の挿入可能なDNAフラグメン
    トと第二の挿入可能なDNAフラグメントの間に位置して
    いる、特許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】NRRL Y−15851として寄託されているピチ
    ア・パストリス株GS115を、NRRL B−18021として寄託さ
    れている組換えプラスミドpBSAGI5Iで形質転換すること
    により得られる形質転換体の純粋培養物。
  6. 【請求項６】NRRL Y−18014として寄託されているピチ
    ア・パストリス株S190を、組換えプラスミドpYMI1で形
    質転換することにより得られる形質転換体であって、そ
    の際、組換えプラスミドpYMI1は、2.6kbpのサッカロミ
    セスセレビシエ由来のアルギニノコハク酸リアーゼ遺伝
    子、および各々約400bpのピチアパストリス由来のヒス
    チジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５′および３′末
    端に位置するEcoR I−Hind IIIフラグメントおよびEcoR
    I−Cla Iフラグメントを含み、そして以下の制限地
    図： により示されるが、但し、C,R1,B,H3,PsおよびＳはそれ
    ぞれCla I,EcoR I,BamH I,Hind III,Pst IおよびSal I
    を示し、そしてARG4およびHIS4はそれぞれアルギニノコ
    ハク酸リアーゼおよびヒスチジノールデヒドロゲナーゼ
    を示すことを特徴とする、上記形質転換体の純粋培養
    物。
  7. 【請求項７】NRRL Y−18018として寄託されているピチ
    ア・パストリスの形質転換体の純粋培養物。
  8. 【請求項８】NRRL Y−18017として寄託されているピチ
    ア・パストリス株PPF1を、組換えプラスミドpYMI7で形
    質転換することにより得られる、遺伝子型Arg+を示す形
    質転換体であって、但し、組換えプラスミドpYM17は、
    2.9kbpのサッカロミセスセレビシエ由来のアルギニノコ
    ハク酸リアーゼ遺伝子、およびNRRL B−15868として寄
    託されている組換えプラスミドpPG4.0中のピチアパスト
    リス由来のアルコールオキシダーゼ遺伝子のEcoR I−Ba
    mH IフラグメントおよびSal I−Pvu IIフラグメントを
    含み、そして以下の制限地図： により示されるが、但し、R1,H3,B,Ps,SおよびPv2はそ
    れぞれEcoR I,Hind III,BamH I,Pst I,Sal IおよびPvu
    IIを示し、そしてARG4およびAOはそれぞれアルギニノコ
    ハク酸リアーゼおよびアルコールオキシダーゼを示すこ
    とを特徴とする、上記形質転換体の純粋培養物。
  9. 【請求項９】NRRL Y−18019として寄託されているピチ
    ア・パストリスの形質転換体の純粋培養物。
  10. 【請求項１０】第一の挿入可能なDNAフラグメント、 選択可能なマーカー遺伝子、および 第二の挿入可能なDNAフラグメント； を含む直列に配置された線状DNAフラグメントであっ
    て、上記の第一および第二の挿入可能なDNAフラグメン
    トはそれぞれ、アルコールオキシダーゼ遺伝子、ジヒド
    ロキシアセトンシンターゼ遺伝子、アルギニノコハク酸
    リアーゼ遺伝子、またはヒスチジノールデヒドロゲナー
    ゼ遺伝子の約200〜5000塩基対の長さを有するフラグメ
    ントであり、且つアルコールオキシダーゼ遺伝子、ジヒ
    ドロキシアセトンシンターゼ遺伝子、アルギニノコハク
    酸リアーゼ遺伝子、またはヒスチジノールデヒドロゲナ
    ーゼ遺伝子部分のいずれかにおいてゲノム修飾を施す天
    然ピチアゲノム部位の物理的に離れた各部分と相同なヌ
    クレオチド配列を有し；また第一および第二の挿入可能
    なDNAフラグメントはそれらがピチアゲノム内で方向付
    けられるように線状DNAフラグメント内で互いに対して
    方向付けられ；そして上記のマーカー遺伝子は第一の挿
    入可能なDNAフラグメントと第二の挿入可能なDNAフラグ
    メントの間に位置していることを特徴とする線状DNAフ
    ラグメント。
  11. 【請求項１１】第一および第二の挿入可能なDNAフラグ
    メントがアルコールオキシダーゼ遺伝子のフラグメント
    である、特許請求の範囲第10項記載の線状DNAフラグメ
    ント。
  12. 【請求項１２】線状DNAフラグメントがさらに異種遺伝
    子を含むが、但し、異種遺伝子は選択可能なマーカー遺
    伝子と同様に第一の挿入可能なDNAフラグメントと第二
    の挿入可能なDNAフラグメントの間に位置している、特
    許請求の範囲第10項または第11項記載の線状DNAフラグ
    メント。
  13. 【請求項１３】線状DNAフラグメントがさらに調節領域
    を含むが、但し、異種遺伝子は該調節領域の制御下にあ
    り、そして選択可能なマーカー遺伝子に加えて調節領域
    −異種遺伝子構築物も第一の挿入可能なDNAフラグメン
    トと第二の挿入可能なDNAフラグメントの間に位置して
    いる、特許請求の範囲第12項記載の線状DNAフラグメン
    ト。
  14. 【請求項１４】線状DNAフラグメントがさらに細菌のプ
    ラスミドDNAを含む、特許請求の範囲第10〜13項のいず
    れか１項に記載の線状DNAフラグメント。
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Families Citing this family (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032516A (en) * 1985-10-25 1991-07-16 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
IL89993A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts
IL89992A0 (en) 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts
NZ228774A (en) * 1988-04-25 1991-05-28 Phillips Petroleum Co Hbv particles containing pres 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
IL89989A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts
AT390267B (de) * 1988-06-08 1990-04-10 Vogelbusch Gmbh Verfahren zum markieren und identifizieren von industriell eingesetzten mikroorganismen, vorzugsweise hefestaemmen
US5102789A (en) * 1989-03-15 1992-04-07 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
US5204252A (en) * 1989-02-08 1993-04-20 Henkel Research Corporation Candida tropicalis transformation system
WO1990009434A1 (en) * 1989-02-13 1990-08-23 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells
CA2017176A1 (en) * 1989-05-22 1990-11-22 Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin
JPH0669365B2 (ja) * 1989-05-22 1994-09-07 株式会社ミドリ十字 アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5258302A (en) * 1990-07-03 1993-11-02 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
JPH06500470A (ja) * 1990-09-04 1994-01-20 メルク　エンド　カンパニー　インコーポレーテッド メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生
US5268273A (en) * 1990-12-14 1993-12-07 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
CA2063890C (en) * 1991-03-27 2007-03-13 Masami Miura Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism
AU661844B2 (en) * 1991-04-01 1995-08-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Genes which influence (pichia) proteolytic activity, and uses therefor
CA2058820C (en) * 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5330901A (en) * 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
US5665600A (en) * 1991-09-18 1997-09-09 Research Corporation Technologies, Inc. Pichia pastoris linear plasmids and DNA fragments thereof
WO1994020631A2 (en) * 1993-03-03 1994-09-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Production of glycolate oxidase in methylotrophic yeast
EP0688361B1 (en) * 1993-03-08 2004-10-13 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
EP0696320B1 (en) * 1993-04-20 2002-09-25 Merck & Co., Inc. Human n-methyl-d-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor
JP3937445B2 (ja) * 1993-05-28 2007-06-27 ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン グリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸ジアルキル混合物の製造法
US5912122A (en) * 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
US6001581A (en) 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US6495343B1 (en) 1993-06-18 2002-12-17 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
US6638905B2 (en) * 1993-06-18 2003-10-28 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CFR receptor(s)
GB2287941B (en) * 1993-11-08 1998-01-28 Salk Inst Biotech Ind Human alpha2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
CN1048254C (zh) * 1993-12-09 2000-01-12 托马斯杰弗逊大学 用于将预定的改变引入靶基因中的化合物
US5863894A (en) * 1995-06-05 1999-01-26 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5866542A (en) * 1994-10-18 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5866543A (en) * 1995-06-05 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
AU711405B2 (en) * 1994-10-18 1999-10-14 Dendreon Corporation Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
US5872098A (en) * 1995-06-05 1999-02-16 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
CA2202351A1 (en) * 1994-10-18 1996-04-25 George Phillip Vlasuk Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
US5945275A (en) * 1994-10-18 1999-08-31 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
JP3360830B2 (ja) 1995-03-17 2003-01-07 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規なエンドグルカナーゼ
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
AU7719696A (en) * 1995-10-18 1997-05-07 New York Blood Center, Inc., The Recombinant alpha-n-acetylgalactosaminidase enzyme
JP2000500014A (ja) * 1995-11-09 2000-01-11 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ピヒア・メタノリカ中で異種ポリペプチドを生産するための組成物と方法
US6001597A (en) * 1995-11-09 1999-12-14 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica
CA2246733C (en) 1996-03-01 2010-07-20 Novo Nordisk A/S Use of a pharmaceutical composition comprising an appetite-suppressing peptide
US5731181A (en) * 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
DK1632574T3 (da) 1996-10-16 2011-02-28 Zymogenetics Inc Fibroblast-vækstfaktor homologer
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
DK1115862T3 (da) 1998-09-23 2009-11-16 Zymogenetics Inc Cytokinreceptor Zalpha11
WO2000034474A2 (en) 1998-12-07 2000-06-15 Zymogenetics, Inc. Growth factor homolog zvegf3
US6780615B1 (en) 1998-12-31 2004-08-24 Genway Biotech Inc. Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system
NZ512753A (en) 1999-01-07 2003-10-31 Zymogenetics Inc Soluble receptor BR43x2 related proteins useful for inhibiting ztnf4
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
ATE377076T1 (de) 1999-03-09 2007-11-15 Zymogenetics Inc Humanes cytokin als ligand des zalpha rezeptors und dessen verwendungen
US7504253B2 (en) * 1999-06-11 2009-03-17 The Burnham Institute For Medical Research Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof
ES2364086T3 (es) 1999-07-07 2011-08-24 Zymogenetics, Inc. Receptor de citoquina humana.
EP1242600B1 (en) 1999-12-23 2010-03-03 ZymoGenetics, Inc. Cytokine zcyto18
EP1278852B1 (en) 2000-05-11 2010-07-07 ZymoGenetics, Inc. Zsig33-like peptides
EP2258725A3 (en) 2000-06-26 2014-09-17 ZymoGenetics, L.L.C. Cytokine receptor zcytor17
US7625756B2 (en) * 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
EP2322644A1 (en) 2000-06-28 2011-05-18 GlycoFi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7863020B2 (en) * 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
EP1717316B1 (en) 2000-06-30 2008-08-13 ZymoGenetics, Inc. Allelic variant of the Interferon-like protein ZCYTO21
JP4092194B2 (ja) 2000-06-30 2008-05-28 フランダース インターユニバーシティ インスティテュート フォア バイオテクノロジー （ヴィーアイビー） ピキアパストリス（ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ）におけるタンパク質糖鎖修飾
US7009045B2 (en) * 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
EP1736545A3 (en) 2000-08-08 2007-03-28 ZymoGenetics, Inc. Soluble zcytor 11 cytokine receptors
JP2004533997A (ja) 2001-02-20 2004-11-11 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド Ｂｃｍａ及びｔａｃｉの両者を結合する抗体
JP2004529640A (ja) 2001-03-22 2004-09-30 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 第ｖｉｉ凝固因子誘導体
EP1385866A4 (en) 2001-04-05 2006-03-29 Univ Nebraska ALCOHOL OXIDASE-1 REGULATING NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR HETEROLOGIC GENE EXPRESSION IN YEAST
EP2116259B1 (en) 2001-05-24 2012-01-25 ZymoGenetics, Inc. TACI-immunoglobulin fusion proteins
DK1451322T3 (da) 2001-11-05 2010-02-01 Zymogenetics Inc Il-21-antagonister
WO2003054155A2 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor
US7494804B2 (en) 2002-01-18 2009-02-24 Zymogenetics, Inc. Polynucleotide encoding cytokine receptor zcytor17 multimer
RU2360923C2 (ru) 2002-01-18 2009-07-10 Займоджинетикс, Инк. Новый лиганд рецептора цитокина zcytor17
US20060088834A1 (en) * 2002-04-15 2006-04-27 Gretchen Bain Matrix analysis of gene expression in cells (magec)
WO2003089603A2 (en) 2002-04-19 2003-10-30 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor
IL165717A0 (en) 2002-06-26 2006-01-15 Flanders Interuniversity Inst A strain of methylotrophic yeast for producing proteins
DE60335602D1 (de) * 2002-12-18 2011-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Desoxyribonuclease I aus Rinder-Pankreas mit hoher spezifischer Aktivität
DE60319333D1 (de) * 2002-12-20 2008-04-10 Roche Diagnostics Gmbh Hitzelabile Desoxyribonuklease I-Varianten
US7332299B2 (en) * 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
EP2251353B1 (en) 2003-08-07 2013-03-06 ZymoGenetics, Inc. Homogeneous preparations of IL-29
CN1863908B (zh) 2003-09-09 2010-08-04 诺和诺德医疗保健公司 凝固因子ⅶ多肽
CA2486195C (en) * 2003-12-05 2012-03-06 Stephan Glaser Recombinantly expressed carboxypeptidase b and purification thereof
WO2005078074A2 (en) 2004-02-13 2005-08-25 Novozymes A/S Protease variants
EP1732946B1 (en) 2004-03-08 2011-07-27 ZymoGenetics, Inc. Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them
WO2006012644A2 (en) 2004-07-29 2006-02-02 Zymogenetics, Inc. Use of il-28 and il-29 to treat cancer
AU2005268917B2 (en) 2004-08-02 2010-05-20 Basf Plant Science Gmbh Method for isolation of transcription termination sequences
AU2006212807A1 (en) 2005-02-08 2006-08-17 Zymogenetics, Inc. Anti-IL-20, anti-IL-22 and anti-IL-22RA antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
DE602006020032D1 (de) 2005-04-18 2011-03-24 Novo Nordisk As Il-21-varianten
EP3214095B1 (en) 2005-05-12 2019-12-11 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
US7393667B2 (en) * 2005-05-31 2008-07-01 Bristol-Myers Squibb Company Stereoselective reduction process for the preparation of pyrrolotriazine compounds
AU2006278227B2 (en) 2005-08-09 2011-10-20 Ares Trading S.A. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules
UA93516C2 (ru) * 2005-08-09 2011-02-25 Займоджинетикс, Инк. Способы лечения b-клеточных злокачественных образований c помощью слитой молекулы taci-ig
ES2368500T3 (es) 2005-08-16 2011-11-17 Novo Nordisk A/S Método para producir polipéptidos de insulina maduros.
US20090055942A1 (en) 2005-09-14 2009-02-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Human Coagulation Factor VII Polypeptides
US7981635B2 (en) * 2005-09-14 2011-07-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP1931697B1 (en) 2005-09-28 2010-09-15 ZymoGenetics, Inc. Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same
NZ572373A (en) * 2006-05-15 2012-02-24 Ares Trading Sa Methods for treating rheumatoid arthritis using a taci-ig fusion molecule
ES2464282T3 (es) 2006-09-27 2014-06-02 Novo Nordisk A/S Método para preparar polipéptidos de insulina madura
JP5967861B2 (ja) 2007-04-03 2016-08-10 オキシレイン ユーケー リミテッド 分子のグリコシル化
EP2164863A4 (en) 2007-06-15 2010-07-28 Univ Arkansas METHOD FOR THE ADMINISTRATION OF MOLECULES IN CELLS USING A RICIN SUB-UNIT AND RELATED COMPOSITIONS THEREOF
JP5474809B2 (ja) 2007-11-21 2014-04-16 ロスキレ ユニバーシティ 氷結合活性を備えたポリペプチド
CN101952309A (zh) * 2007-12-21 2011-01-19 Ifxa有限公司 蛋白酶抑制剂
DK2245052T3 (en) * 2008-01-25 2017-09-11 Univ Aarhus SELECTIVE EXOSITE INHIBITATION OF PAPP-A ACTIVITY AGAINST IGFBP-4
WO2009114093A2 (en) 2008-03-03 2009-09-17 Abbott Laboratories Methods for transforming yeast
WO2009120922A2 (en) 2008-03-27 2009-10-01 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for inhibiting pdgfrbeta and vegf-a
WO2009139349A1 (ja) * 2008-05-14 2009-11-19 Ｂｉｏ－ｅｎｅｒｇｙ株式会社 酵母細胞に遺伝子を導入する方法およびそのためのベクター
EP2623112B1 (en) 2008-06-27 2015-03-04 Zymogenetics, Inc. Soluble hybrid Fc gamma receptors and related methods
EA201100943A1 (ru) 2008-12-16 2012-05-30 Новартис Аг Системы дрожжевого дисплея
CA2748314C (en) 2009-02-03 2018-10-02 Amunix Operating Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
WO2010103038A1 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Novo Nordisk A/S Interleukin-21 variants having antagonistic binding to the il-21 receptor
AU2010272483B2 (en) 2009-07-17 2016-07-21 Omeros Corporation MASP isoforms as inhibitors of complement activation
AU2010290131C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
JP5990102B2 (ja) 2009-09-29 2016-09-07 ユニフェルシテイト ヘント ホスホ−６−マンノースへのマンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合の加水分解
US20130053550A1 (en) 2009-11-19 2013-02-28 Oxyrane Uk Limited Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans
JP5850848B2 (ja) 2009-11-25 2016-02-03 ノヴォ ノルディスク アー／エス ポリペプチドの製造方法
WO2011067283A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Novo Nordisk A/S Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases
CA2791841C (en) 2010-03-05 2023-01-03 Rigshospitalet Chimeric inhibitor molecules of complement activation
EP2580238A1 (en) 2010-06-09 2013-04-17 Zymogenetics, Inc. Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods
JP6131190B2 (ja) 2010-09-29 2017-05-17 オキシレイン ユーケー リミテッド リン酸化ｎ−グリカンの脱マンノシル化
SG189108A1 (en) 2010-09-29 2013-05-31 Oxyrane Uk Ltd Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins
WO2013098651A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Oxyrane Uk Limited Methods and materials for reducing degradation of recombinant proteins
CN104220602B (zh) 2012-02-01 2018-10-30 合成基因组股份有限公司 用于合成错误最小化核酸分子的材料和方法
US11787844B2 (en) 2012-02-09 2023-10-17 Var2 Pharmaceuticals Aps Targeting of chondroitin sulfate glycans
DK2822577T3 (en) 2012-02-15 2019-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc RECOMBINANT FACTOR VIII PROTEINS
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
AU2013234042B2 (en) 2012-03-15 2017-11-02 Oxyrane Uk Limited Methods and materials for treatment of Pompe's disease
KR101958234B1 (ko) * 2012-05-09 2019-03-14 엘지이노텍 주식회사 보이스 코일 모터
US20150307865A1 (en) 2012-10-15 2015-10-29 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
US20190040368A1 (en) 2013-03-05 2019-02-07 Oxyrane Uk Limited Production of catalytically active type i sulfatase
AU2014234962C1 (en) 2013-03-21 2019-01-17 Evonik Operations Gmbh Purification of triple helical proteins
EP3004156A1 (en) 2013-06-07 2016-04-13 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
WO2014202089A2 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Roskilde Universitet Variants of anti-freeze polypeptides
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
CN105764920B (zh) 2013-09-09 2020-07-24 联邦科学工业研究组织 修饰的细菌胶原蛋白样蛋白
WO2016017693A1 (ja) * 2014-07-30 2016-02-04 第一三共株式会社 タンパク質の改良高分泌生産方法
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
EP3328881B1 (en) 2015-09-08 2019-08-28 Theripion, Inc. Apoa-1 fusion polypeptides and related compositions and methods
WO2018136163A2 (en) 2016-12-09 2018-07-26 Theripion, Inc. Tandem apoa-1 fusion polypeptides
JP7012663B2 (ja) * 2016-12-15 2022-02-14 株式会社カネカ 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法
CA3070272A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Aptevo Research And Development Llc Antigen binding proteins binding to 5t4 and 4-1bb and related compositions and methods
RU2756100C1 (ru) 2017-12-20 2021-09-28 Харбор Байомед (Шанхай) Ко., Лтд Антитела, связывающие ctla-4, и их применение
US10150801B1 (en) 2017-12-27 2018-12-11 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and methods of use thereof
WO2019132765A1 (en) 2017-12-27 2019-07-04 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and methods of use thereof
DE202019005554U1 (de) * 2018-03-06 2021-01-18 Joywell Foods, Inc. Rekombinant exprimierte geschmacksmodifizierende Polypeptide und Präparate und Formulierungen, die diese enthalten
NZ769677A (en) 2018-05-18 2024-07-05 Bioverativ Therapeutics Inc Methods of treating hemophilia a
US20210278406A1 (en) 2018-07-13 2021-09-09 Varct Diagnostic Aps Isolation of circulating cells of fetal origin using recombinant malaria protein var2csa
CN111378585B (zh) * 2018-12-28 2023-06-16 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株
WO2021040610A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and methods of use thereof
US10675332B1 (en) 2019-08-26 2020-06-09 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and methods of use thereof
WO2021262081A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and combinations for use in the treatment of cancer
WO2022178090A2 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Theripion, Inc. Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods
WO2024148328A2 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Aptevo Research And Development Llc Bispecific pd-l1 and cd40 binding molecules and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4414329A (en) * 1980-01-15 1983-11-08 Phillips Petroleum Company Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities
JPS57206699A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Plasmid patm 3 and its preparation
US4837148A (en) * 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4855231A (en) * 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"蛋白質 核酸 酵素，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１４，Ｐ．７４−７６，Ｐ．８３−８４（１９８３）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（７８），Ｐ．６３５４（１９８１）

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