WO2017122638A1 - 形質転換体、およびトランスフェリンの製造方法 - Google Patents

形質転換体、およびトランスフェリンの製造方法 Download PDF

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WO2017122638A1
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transferrin
transformant
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アリムジャン イディリス
博道 熊谷
千明 小島
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旭硝子株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing transferrin using a transformant incorporating a transferrin gene using Schizosaccharomyces pombe (hereinafter referred to as “S. pombe”) as a host.
  • S. pombe Schizosaccharomyces pombe
  • Transferrin (hereinafter also referred to as “TF”) is a type of glycoprotein that binds to Fe 3+ ions and is deeply involved in iron metabolism.
  • human serum transferrin (hereinafter also referred to as “human transferrin” or “hTF”) belongs to the in vivo iron-binding protein family and is involved in in vivo iron transport and metabolism. It is used as an additive to culture media, pharmaceuticals, and DDS transport carriers.
  • TF is a glycoprotein of about 80 kDa having two domains, N-lobe and C-lobe, and is synthesized by translation as an immature protein having a secretory signal peptide at the N-terminus. Thereafter, the secretory signal peptide is secreted outside the cell as a cleaved mature glycoprotein.
  • a method of producing a full-length recombinant protein using a cultured cell line of a mammalian cell such as a hamster kidney cell (BHK cell) is known.
  • S. is a fission yeast.
  • a method using a pombe is known.
  • S. Pombe unlike Saccharomyces cerevisiae, which is a budding yeast, is close to human cells in cell division and transcription, and does not contain substances that adversely affect the human body. Therefore, S. The method of producing a full-length recombinant protein of TF in pombe is an excellent method for producing TF that is ingested by humans such as pharmaceuticals.
  • S.A A method is disclosed in which a transformant having a pombe as a host and having the hTF gene introduced is cultured in a liquid medium containing casamino acid, and hTF is efficiently produced and secreted into the liquid medium for recovery.
  • Patent Document 2 discloses S.I. In Pombe, it is described that the production efficiency of heterologous proteins can be improved by using an improved host in which at least one gene selected from genes encoding a specific protease (protease gene group) is deleted or inactivated. ing.
  • the hTF protein can be secreted and produced by producing it with the secretion signal (endoplasmic reticulum transfer signal) peptide added to the N-terminus of the hTF protein.
  • secretion signal endoplasmic reticulum transfer signal
  • S.M secretion signal
  • P-factor mating pheromone
  • Patent Document 3 discloses that a secretory signal peptide, a domain, and b domain of PDI1 (Protein disulfide isomerase 1), which is a protein having a molecular chaperone function and localized in the endoplasmic reticulum on the N-terminal side of a target foreign protein.
  • PDI1 Protein disulfide isomerase 1
  • PDI1 has a c domain including an ER transition signal, a domain, b domain, b ′ domain, x domain, a ′ domain, and ER localization signal (ADEL) in this order from the N-terminus.
  • ADDL ER localization signal
  • CGHC active center of molecular chaperone activity in each of the a domain and the a 'domain, and all four of the a domain, b domain, b' domain, and a 'domain form a thioredoxin fold.
  • JP 2011-125281 A International Publication No. 2007/015470 International Publication No. 2013/111754
  • the object of the present invention is S.I. It is an object of the present invention to provide a method for secreting and producing TF with high productivity using a transformant of pombe, and a transformant suitable for the method.
  • the transformant according to the present invention is S. cerevisiae. Pombe is used as a host, and has a TF gene and a secretory signal peptide gene that is present in the upstream region of the TF gene and expresses a TF to which a secretory signal peptide that functions in the host is bound.
  • the Gas2 gene that the host originally has is deleted. Or it is inactivated.
  • the TF gene is preferably a gene encoding human transferrin.
  • the TF gene is a mutant TF gene in which a mutation is introduced into a gene encoding a natural TF possessed by a mammal, and the mutant TF gene is at least one site of the natural TF.
  • the transformant preferably has at least one protease gene originally possessed by the host deleted or inactivated.
  • the protease gene is more preferably a gene selected from the group consisting of a metalloprotease gene group, a serine protease gene group, a cysteine protease gene group, and an aspartic protease gene group.
  • the protease gene to be deleted or inactivated is at least one gene selected from the group consisting of psp3 gene, isp6 gene, ppp53 gene, ppp16 gene, ppp22 gene, sxa2 gene, ppp80 gene and ppp20 gene Further preferred.
  • the TF gene is preferably linked directly or indirectly downstream of the gene encoding the secretory carrier protein containing the secretory signal peptide, and the gene encoding the secretory carrier protein is More preferably, it is a fusion gene of a gene encoding the secretory signal peptide portion of the host PDI1, a gene encoding the ab domain portion of human PDI1, and a gene encoding the x domain portion of the host PDI1.
  • the method for producing TF according to the present invention is characterized in that the transformant according to the present invention is cultured in a liquid medium, and transferrin is obtained from the liquid medium.
  • the transformant is preferably cultured in a liquid medium having a pH of 5.5 to 6.5, and the transformant is preferably cultured in a liquid medium containing adenine. It is also preferable to obtain transferrin from the liquid medium after culturing the transformant until the cell density (OD 660 ) reaches 100 or more.
  • the method for producing a transformant according to the present invention is described in S.A. It is characterized by incorporating a secretory signal peptide gene functioning in the host with a pombe and a TF gene located downstream of the secretory signal peptide gene, and deleting or inactivating the Gas2 gene inherent in the host And
  • TF By culturing the transformant according to the present invention, TF can be produced efficiently.
  • S.I. Pombe can be used to secrete and produce TF with high productivity.
  • FIG. 1 shows the structure of the secretory expression vector pSL6PDI1 (SP) Hsabx-hTF (N413QN611Q).
  • FIG. 2 is an SDS-PAGE CBB-stained image of the culture solution of the A8-hTF (1) strain and the A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain.
  • FIG. 3 is a graph showing changes over time in the amount of secreted hTF (N413Q / N611Q) protein in the A8-hTF (1) strain and the A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain.
  • FIG. 1 shows the structure of the secretory expression vector pSL6PDI1 (SP) Hsabx-hTF (N413QN611Q).
  • FIG. 2 is an SDS-PAGE CBB-stained image of the culture solution of the A8-hTF (1) strain and the A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain.
  • FIG. 3 is a graph showing changes over time in the amount of secreted
  • TF gene refers to a structural gene encoding a mature TF protein.
  • the mature TF protein is hereinafter referred to as “TF protein”.
  • a fusion protein in which a protein containing a secretory signal peptide (secretory carrier protein) and the TF protein are linked is expressed, and the fusion protein is secreted by the endoplasmic reticulum or the Golgi apparatus.
  • the protein is cut off and the TF protein is secreted outside the cell.
  • secretory signal peptide and secretory carrier protein in the present invention are preferably secretory signal peptides and secretory carrier proteins other than those originally possessed on the N-terminal side of the TF protein, which function sufficiently in the host.
  • “functioning in the host” means having a function of secreting a fusion protein expressed in the host as a TF protein outside the host cell.
  • the TF protein and the secretory signal peptide or secretory carrier protein may be directly linked or indirectly linked by a linker consisting of a peptide having 1 to several tens of amino acid residues.
  • the transformant according to the present invention is S. cerevisiae.
  • Gas2 gene inherently possessed by the host, comprising a TF gene as a host, a TF gene, and a secretory signal peptide gene that is present in the upstream region of the TF gene and expresses a TF protein bound to a secretory signal peptide that functions in the host. Is deleted or inactivated.
  • the TF protein encoded by the TF gene of the transformant according to the present invention is a natural TF protein derived from any species (a TF encoded by a TF gene present in the chromosome of a wild-type organism). Protein) or a modified protein of a natural TF protein. Examples of the modified protein include a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence of a natural TF protein are substituted, added, or deleted, and having a TF function.
  • a polymorphism comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more with the amino acid sequence of a natural TF protein, and having a TF function Peptides are mentioned.
  • the function of TF means a function of binding to Fe 3+ ions and binding to a TF receptor on the cell surface to be taken into a cell.
  • Examples of the TF protein encoded by the TF gene of the transformant according to the present invention include natural TF proteins derived from mammals such as humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, horses, dogs and cats, or modifications thereof. Proteins are preferred, and hTF or modified proteins thereof are particularly preferred.
  • the TF protein encoded by the TF gene possessed by the transformant according to the present invention is a modified protein of a natural TF protein
  • the modification includes, for example, asparagine which is an N-linked sugar chain modification site after translation. Preference is given to point mutations in the amino acid sequence in which at least one or more of the acid residues are deleted or substituted with other amino acid residues.
  • the resulting recombinant protein is modified with a high-mannose sugar chain with a non-uniform length, resulting in reduced uniformity and quality. There is a risk.
  • the TF gene possessed by the transformant according to the present invention is a mutant TF gene encoding a mutant TF protein into which a mutation that eliminates the N-linked sugar chain modification site is introduced
  • the transformant is cultured.
  • the mutant TF gene includes at least one N-linked sugar chain among the two N-linked sugar chain modification sites (432th and 630th aspartic acid residues) of the natural hTF protein.
  • a mutant TF gene encoding a mutant TF protein in which the asparagine residue as a chain modification site has been deleted or replaced with another amino acid is preferred, and the two N-linked sugar chain modification sites are amino acids other than asparagine residues.
  • a mutant TF gene encoding a mutant TF protein substituted with a residue is more preferable, and a mutant TF gene (sequence) encoding a mutant TF protein in which two N-linked sugar chain modification sites are substituted with glutamine residues. Number 2) is more preferred.
  • the secretory signal peptide gene possessed by the transformant according to the present invention is a structural gene encoding a secretory signal peptide that functions in the cells of the transformant.
  • the secretory signal peptide gene may be part of a structural gene that encodes a secretory carrier protein. That is, the structural gene encoding the secretory carrier protein may have a structural gene portion encoding a secretory carrier protein other than the secretory signal peptide gene portion downstream of the secretory signal peptide gene.
  • the secretory signal peptide is Anything that functions within the pombe can be used. Those described in International Publication No.
  • a secretory signal peptide of a secretory protein possessed by Pombe and a P3 secretion signal (34 amino acid residues) can be used.
  • Pombe's PDI1 secretion signal peptide is preferred.
  • the secretory carrier protein that functions in the pombe is preferably a full-length protein of PDI1, a partial protein of PDI1, or a protein in which these mutant proteins are fused, including a secretory signal peptide.
  • a protein containing the a domain of PDI1 or a protein containing the a ′ domain of PDI1 is preferred, and a protein containing at least one of the a domain or a ′ domain of PDI1 and at least one of the b domain or b ′ domain is more preferred. More preferred is a protein comprising at least one of the a domain or a ′ domain, at least one of the b domain or b ′ domain, and the x domain (see Patent Document 3).
  • Each domain of PDI1 contained in the protein fused downstream of the secretory signal peptide may be derived from the same species or a combination of domains derived from two or more species.
  • the ability to produce TF is further enhanced.
  • the transformant according to the present invention is S. cerevisiae.
  • a TF gene derived from an organism other than Pombe is obtained by genetic engineering. It is obtained by introducing it into Pombe.
  • the base sequence of the TF gene possessed by the transformant according to the present invention may be the gene sequence itself of the biological species from which the TF protein is derived. It may be modified to a codon frequently used in pombe.
  • the gene in which the secretory signal peptide gene and the TF gene of the transformant are directly or indirectly linked may be 1 copy or 2 copies or more. Good.
  • the SP-TF gene is S. cerevisiae. It may be introduced as a plasmid outside the pombe chromosome. It may be introduced into the pombe chromosome. By introducing a foreign gene into the chromosome, a transformant having excellent passage stability can be obtained.
  • various expression systems particularly expression vectors, secretion signals, gene transfer expression vectors, and the like have been developed in order to more stably and efficiently express heterologous proteins. These can be widely applied in the production of transformants according to the above.
  • S.M. Examples of expression systems using pombe as a host include Japanese Patent No. 2776085, Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-163373, Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-215867, Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-215867, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-192094, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-192094. -1919944, JP-A-2000-262284, WO96 / 023890, etc. are known, and these expression systems can be widely used for the production of transformants according to the present invention.
  • S. host The introduction of the SP-TF gene into Pombe is, for example, the SP-TF gene and S. cerevisiae.
  • An expression cassette containing a promoter and terminator that functions in a pombe can be introduced into the host cell as it is, or an integrated vector can be introduced into the host cell.
  • the expression cassette may contain any one or more of 5'-untranslated region and 3'-untranslated region, and may contain an auxotrophic complementary marker such as ura4 gene.
  • promoters that function in pombe include alcohol dehydrogenase gene promoter, nmt1 gene promoter, fructose-1, 6-bisphosphatase gene promoter, invertase gene promoter (see International Publication No. 99/23223), heat shock protein gene Promoters (see International Publication No. 2007/26617, International Publication No. 2014/030644), etc.
  • promoters derived from animal cell viruses such as Pombe's inherent promoter, hCMV promoter, and SV40 promoter.
  • the terminator that functions in the pombe include an LPI (human lipocortin I) terminator.
  • plasmids derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, and pUC19 are preferably used.
  • the vector preferably has a marker for selecting a transformant. Examples of the marker include ura4 gene (auxotrophic complementary marker) and isopropylmalate dehydrogenase gene (leu1 gene).
  • the expression cassette containing the SP-TF gene When integrating into the pombe chromosome by homologous recombination, the target site into which the expression cassette is incorporated is S. cerevisiae. It may be present only at one location in the pombe chromosome, or may be present at two or more locations. When two or more target sites exist, S.P.
  • the vector can be integrated at two or more positions on the pombe chromosome.
  • the target site described in the method described in JP-A No. 2000-262284 can be used. Two or more vectors having different integration sites can be used to integrate the vectors into different target sites.
  • a vector into which an expression cassette containing an SP-TF gene is incorporated for example, a vector into which a secretory signal peptide gene and an hTF gene described in Patent Document 1, Patent Document 3, etc. are incorporated can be used.
  • the transformant according to the present invention is a host of S. cerevisiae.
  • the Gas2 gene (SPBC29A10.08.1) inherent in Pombe has been deleted or inactivated.
  • S. cerevisiae into which the SP-TF gene was introduced was introduced.
  • the Pombe transformant is cultured at a high density where the cell density (optical density at 660 nm measured by a turbidimeter: OD 660 ) is 100 or more, Gas2 (1,3- ⁇ -glucanosyl transferase) is combined with TF. Increased protein expression level.
  • the Gas2 protein is a glycoprotein that is localized in the cell wall and is involved in the biosynthesis of the cell wall of fission yeast, and is not considered to be directly involved in the expression and secretion of TF. Nevertheless, in the high-density cell culture process of the TF expression strain (transformant introduced with the SP-TF gene), the Gas2 protein is secreted in a large amount in the liquid medium simultaneously with the TF protein, and the production of TF Efficiency is reduced. Strangely, the increase in expression and secretion amount of Gas2 protein observed during high-density culture of TF-expressing strains is not clearly observed during general batch culture with an OD 660 of 20-30. Since the Gas2 gene is deleted or inactivated in the transformant according to the present invention, the Gas2 protein is not expressed even during high-density culture, and the amount of TF secreted into the liquid medium is also increased.
  • the transformant according to the present invention is preferably one in which at least one of the protease genes (genes encoding the protease) has been deleted or inactivated. S. By inhibiting the protease activity of at least one protease gene inherently possessed by Pombe, the production efficiency of TF protein is improved and the production amount of TF protein is further increased.
  • the transformant according to the present invention includes serine protease gene group (group of genes encoding serine protease), aminopeptidase gene group (group of genes encoding aminopeptidase), carboxypeptidase gene group (encodes carboxypeptidase). Preferably, one or more genes selected from the group consisting of a group of genes) and a dipeptidase gene group (a group of genes encoding dipeptidase) have been deleted or inactivated.
  • protease gene group group of genes encoding metalloprotease
  • serine protease gene group group of genes encoding cysteine protease
  • cysteine protease gene group group of genes encoding cysteine protease
  • aspartic protease gene group encoding aspartic protease
  • a transformant in which at least one gene selected from the group consisting of genes is deleted is preferable, and at least one gene selected from the group consisting of metalloprotease gene group and serine protease gene group and cysteine
  • a transformant in which at least one gene selected from the group consisting of a protease gene group and an aspartic protease gene group is deleted is also preferable.
  • protease gene groups of Pombe include the following. Metalloprotease gene group: cdb4 (SPAC23H4.09), mas2 (SPBC18E5.12c), pgp1 (SPCC1259.10), ppp20 (SPAC4F10.02), ppp22 (SPBC14C8.03), ppp51 (SPAC22G7.01c), ppp52 (SPBC18A7 .01), ppp53 (SPAP14E8.04).
  • Serine protease gene group isp6 (SPAC4A8.04), ppp16 (SPBC1711.12), psp3 (SPAC1006.01), sxa2 (SPAC1296.03c).
  • Cysteine protease gene group ppp80 (SPAC19B12.08), pca1 (SPCC1840.04), cut1 (SPCC5E4.04), gpi8 (SPCC11E10.02c).
  • Aspartic protease gene group sxa1 (SPAC26A3.01), yps1 (SPCC1795.09), ppp81 (SPAC25B8.17).
  • the transformant according to the present invention is a host of S. cerevisiae. It can be produced by deleting or inactivating the Gas2 gene of a transformant in which an expression cassette containing the SP-TF gene has been introduced into Pombe, and the Gas2 gene has been deleted or inactivated in advance. It can also be produced by introducing an expression cassette containing the SP-TF gene into pombe. As a host used in this case, at least one protease gene has been deleted or inactivated. By using the Pombe mutant, a transformant in which the SP-TF gene has been introduced, the Gas2 gene has been deleted or inactivated, and at least one protease gene has been deleted or inactivated can be obtained. It is done. S.
  • mutant strains in which at least one protease gene originally possessed by Pombe is deleted or inactivated include psp3 gene, isp6 gene, ppp53 gene, ppp16 gene, such as A8 strain described in Patent Document 2, The ppp22 gene, the sxa2 gene, the ppp80 gene, and the ppp20 gene have been deleted. Pombe mutants are preferably used.
  • the gene can be deleted by using the Latour method (described in Nucreic Acids Research magazine, 2006, 34, e11, International Publication No. 2007/063919).
  • mutation isolation methods using mutants Yeast Molecular Genetics Experiment Method, 1996, Society Publishing Center
  • random mutation methods using PCR PCR Methods Application, Vol. 2, pages 28-33, 1992
  • the gene can be inactivated by introducing a mutation into a part of the gene.
  • the part where a specific gene is deleted or inactivated may be an ORF (open reading frame) part or an expression regulatory sequence part.
  • a particularly preferable method is a method of deletion or inactivation by a PCR-mediated homologous recombination method (Yeast, Vol. 14, pages 943-951, 1998) in which the ORF portion of the structural gene is replaced with a marker gene.
  • transformation method Any known transformation method may be used as the transformation method.
  • the transformation method include conventionally known methods such as lithium acetate method, electroporation method, spheroplast method, glass bead method, and the method described in JP-A-2005-198612.
  • a commercially available yeast transformation kit may also be used.
  • the transformant according to the present invention can be cultured in the same manner as natural Schizosaccharomyces yeasts.
  • a liquid medium for culturing the transformant a known yeast culture medium can be used, which contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by a yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces. What is necessary is just to be able to culture genus yeast efficiently.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as the liquid medium.
  • liquid medium examples include MMA (Minimal medium with agar), SDC (Synthetic dextrose complete medium), TES (0.5% Bacto-yeast extract, 3% glucose, supplemented with uracil, leucine, histidine, lysine, adenine), YES (0.5% Bacto-yeast extract, 3% glucose, supplemented with uracil, leucine, histidine, lysine, adenine), YPD (1% Bacto-yeast extract, 2% Bactopeptone, 2% glucose) and the like.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, and sucrose.
  • Examples of the nitrogen source include inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, and ammonium acetate, ammonium salts of inorganic acids, peptone, and casamino acids.
  • examples of inorganic salts include magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • nutrient media such as YPD medium (MDRose et al., “Methods In Yeast Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)) or minimal media such as MB medium (K.Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-6489 (1990)) can be used.
  • a well-known yeast culture method can be used for culture
  • the culture temperature is preferably 23 to 37 ° C, more preferably 30 to 32 ° C.
  • the culture time can be determined as appropriate.
  • the culture may be batch culture or continuous culture.
  • TF expression strain TF expression strain having a SP-TF gene with pombe as a host
  • the TF protein secreted in the liquid medium after the culture can be obtained.
  • the liquid medium and culture method for cultivating the TF expression strain can be carried out by a known culture method using a known yeast culture medium, similarly to the culture of the transformant according to the present invention.
  • the pH condition of the liquid medium in which the TF-expressing strain is cultured is preferably pH 5.5 or more, more preferably pH 5.5 to 6.5.
  • the culture time for culturing the TF-expressing strain is preferably 2 days or more, more preferably 3 to 6 days, and even more preferably 3 to 5 days.
  • the liquid medium for culturing the TF expression strain contains adenine.
  • the TF expression strain has one or more copies of the SP-TF gene, it tends to lyse and the expression level of TF tends to decrease.
  • the adenine content of the liquid medium can be, for example, 0.5 to 200 mg / L, preferably 1 to 100 mg / L per OD 660 indicating the cell density.
  • the initial medium and fed-batch culture are performed under the conditions of pH 5.5 to 6.5, preferably pH 5.5 to 6.0, while controlling the aeration rate of the culture tank, the agitation rate, and the addition rate of the fed-batch medium. Preferably it is done. Since the medium is continuously added (fed) according to the growth rate and nutrient consumption rate while keeping the glucose concentration of the medium low at a certain level, the bacterial cell density is finally adjusted in a test tube or flask.
  • a high cell density can be achieved, and a larger amount of TF can be secreted and produced.
  • the transformant according to the present invention is preferable.
  • the transformant according to the present invention has no expression of the host-derived Gas2 protein and has a high efficiency of secretory expression of TF.
  • the TF protein is purified from the liquid medium after high-density culture, separation and purification from the Gas2 protein is not required, and purification can be performed more simply.
  • a known method is used to obtain the TF protein from the liquid medium after culturing. For example, a method in which bacterial cells are separated and removed from a liquid medium after completion of culture by centrifugation, and the resulting culture supernatant is adsorbed on an affinity column and washed and then eluted, a dye using activated carbon, etc. A method for removing impurities, a method for separation using a separation membrane, and the like are performed. When a TF expression strain having a Gas2 gene is cultured at high density, a large amount of Gas2 protein is contained in the collected culture supernatant, so an anion using DEAE resin is used for the culture supernatant.
  • the fraction containing TF protein also contains Gas2 protein. Therefore, the TF protein can be purified by separation from the Gas2 protein only after the fraction containing the TF protein is further subjected to hydrophobic interaction chromatography or gel filtration chromatography. On the other hand, the TF protein can be purified by performing only one anion exchange chromatography using DEAE resin on the culture supernatant after the high-density culture of the transformant according to the present invention.
  • the ORF (SEQ ID NO: 1) of the natural hTF gene encodes a protein having a total length of 698 residues in which an hTF protein is fused downstream of a 19-residue secretory signal peptide.
  • Perform PCR using a primer pair (Forward primer # 9220 (SEQ ID NO: 3) and Reverse primer # 9221 (SEQ ID NO: 4)) using the human cDNA library as a template, and 5 'end of the gene encoding the hTF protein.
  • a double digestion product of AflII and XbaI of the obtained DNA fragment is arranged with a gene encoding a P3 secretion signal peptide downstream of the hCMV promoter, and a chromosomal single locus of fission yeast having a multiple cloning site between the gene and the LPI terminator
  • an integrative secretion expression vector by ligation and transformation into E. coli DH5 ⁇ , 4 residues of the C-terminal part of the abx domain are left at the N-terminus.
  • Plasmid DNA of an expression vector pSL6P3-hTF in which a gene encoding a natural type hTF protein containing a group was cloned was prepared.
  • the vector fragment that has been linearized by cutting with the restriction enzyme NotI is adjacent to the fission yeast chromosome by chromosome homologous recombination.
  • the pSL6P3 vector also complements the point mutation (leu1-32) portion of the mutant (leu1 ⁇ ) gene (the gene in which the leucine synthesis gene (leu1) is inactivated by the point mutation (leu1-32)).
  • a leucine marker gene fragment (leu1 + ) is incorporated.
  • a transformant in which the linearized fragment of the pSL6P3 vector is integrated into the chromosome recovers from the leucine requirement.
  • Clones can be selected on a minimal medium (MMA plate) that does not contain leucine.
  • hTF (N413Q / N611Q) expression vector A DNA fragment containing the coding region of hTF (N413Q / N611Q) obtained by double digesting pSL6P3-hTF (N413Q / N611Q) with AflII and XbaI was placed downstream of the hCMV promoter.
  • a chromosomal single locus integration secretory expression vector of fission yeast comprising a gene encoding a secretory carrier protein (PDI1 (SP) -Hsabx) consisting of the x domain of Pombe's PDI1 and having a multicloning site between the gene and the LPI terminator pSL6PDI1 (SP) Hsabx-AflII is incorporated into a double digestion product of AflII and XbaI by ligation and transformed into E.
  • PDI1 secretory carrier protein
  • coli DH5 ⁇ to produce a secreted carrier protein (PDI1 (SP) -Hsabx) and a mutant hTF (N413Q / PSL6PDI1 (SP) Hsabx-hTF (N413QN611Q) (8749 bp, FIG. 1), which is a chromosomal single locus integration expression vector of a fusion protein of N611Q) protein, was prepared.
  • PDI1 (SP) -Hsabx secreted carrier protein
  • SP mutant hTF
  • N413QN611Q mutant hTF
  • N413QN611Q mutant hTF
  • S. Leucine uracil auxotrophic S. pombe (leu1 - ura4 -) strain (genotype: h- leu1-32 ura4-D18) with respect to a is ARC010 strain by Latour method, PSP3 gene, ISP 6 gene, Ppp53 gene, PPP 16 gene A8 strain from which 8 genes of ppp22 gene, sxa2 gene, ppp80 gene and ppp20 gene have been deleted (genotype: h-leu1-32 psp3-D13 isp6-D14 oma1-D10 ppp16-D20 fma2-D13 sxa2-D15 aap1- D17 ppp80-D11) was prepared.
  • the A8 strain was a leucine-requiring strain. More specifically, the Latour method deletes a gene deletion fragment (Latour fragment: a homologous recombination region at both ends, a ura4 + marker gene sandwiched between it and an OL (overlapping sequence) region) on the fission yeast genome.
  • a latent strain was produced by integrating the gene in the upstream or downstream of the target region by homologous recombination. Subsequently, the latent strain was cultured in a medium containing 5′-FOA, homologous recombination was caused between the incorporated OLs, and a gene-deleted strain in which the deletion target region containing the ura4 + marker gene was dropped was formed as a colony. .
  • the obtained gene-deleted strain was confirmed by PCR that the target gene was deleted.
  • the target gene was deleted.
  • Table 1 shows the base sequences of the primers used in preparing a Latour fragment for deleting each gene by PCR.
  • the A8-gas2 ⁇ strain (genotype: h-leu1-32 psp3-D13 isp6-D14 oma1-D10 ppp16-D20 fma2-D13 sxa2-D15 aap1-D17 was deleted from the A8 strain by the Latour method. ppp80-D11 gas2-D15) was prepared. The obtained gene-deleted strain was confirmed by PCR that the target gene was deleted.
  • the A8-gas2 ⁇ strain was a leucine-requiring strain. Table 2 shows the base sequences of the primers used in preparing a Latour fragment for deleting the Gas2 gene by PCR.
  • the prepared A8 strain and A8-gas2 ⁇ strain were evaluated for growth (measurement of ⁇ max and growth curve) at a test tube level (inoculated in 5 mL of YES and cultured at 30 ° C. for 68 hours).
  • the maximum specific growth rate ( ⁇ max relative value) indicating the first rise of the cell growth is slightly decreased (about 8 to 12) as compared with the wild strain (ARC001) having the same auxotrophy (leu1 ⁇ ).
  • the final cell density (OD 660 ) slightly increased (increased by about 9 to 17%), and both strains were confirmed to be able to grow in the same manner as the leucine-requiring wild strain. (Not shown). In particular, no changes in growth and phenotype were observed for the A8 strain and the A8-gas2 ⁇ strain.
  • hTF (N413Q / N611Q) expression strain.
  • Transformants obtained by introducing pSL6PDI1 (SP) Hsabx-hTF (N413QN611Q) into the A8 strain and the A8-gas2 ⁇ strain were designated as A8-hTF (1) strain and A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain, respectively.
  • the A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain was cultured to secrete and express hTF (N413Q / N611Q). Specifically, after culturing for about 24 hours in 5 mL of YES using a glass test tube and performing pre-culture, in a 5 mL of adenine-containing YPD + MES medium (pH 6.0) using a 24-well plate, Cultured at 32 ° C for 3 days, 4 days, or 5 days with shaking, and subjected to ELISA using a commercially available kit (product name: “Human Transferrin ELISA Quantitation Set”, manufactured by Bethyl Laboratories).
  • hTF N413Q / N611Q
  • the A8-hTF (1) strain and A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain were cultured, and hTF (N413Q / N611Q) was cultured at high density for secretory expression.
  • the pH of the culture solution was adjusted to 5.5 to 6.0 while controlling the aeration rate of the culture tank, the stirring rate, and the feeding rate of the fed-batch medium.
  • Medium and fed-batch culture were performed.
  • an adenine-containing semi-synthetic medium (several percent of Bacto-yeast extract, each synthetic component such as glucose, vitamins, minerals and inorganic salts) was used. While suppressing the glucose concentration to 2%, the medium was continuously added (fed) according to the growth rate and nutrient consumption rate. Eventually, the cell density (OD 660 ) was about 200 to 800.
  • hTF indicates a band of hTF (N413Q / N611Q).
  • the expression of gas2 was suppressed in the A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain at any of the culture times 48, 72 and 96 hours, and the A8- It was confirmed that the gas2 ⁇ -hTF (1) strain has a higher secretion amount of hTF (N413Q / N611Q).
  • ELISA was performed in the same manner as described above using the sampled culture solution, and the protein amount of hTF (N413Q / N611Q) secreted into the culture supernatant was measured. As shown in FIG. 3, there is no difference in the amount of secretion between the two strains for about 48 hours from the start of the culture, but after that, the A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain was clearly more than the A8-hTF (1) strain. The amount of hTF (N413Q / N611Q) secreted was large.
  • Table 3 shows the final amount of secretion of both strains (A8-hTF (1) strain is 168 hours after the start of culture, and A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain is 96 hours after the start of culture).
  • the A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain has a hTF secretion amount of 4.8 times or more per culture medium and a hTF secretion amount per microbial cell (per OD 660 ) than the A8-hTF (1) strain. It was more than 1 time.
  • the fraction size was 30.3 mL.
  • FIG. 4 shows the result of SDS-PAGE performed by collecting fractions containing the hTF (N413Q / N611Q) protein (the third to sixth fractions) together.
  • “After Gas2 deletion” is a CBB-stained image of the purified fraction of the culture solution of A8-gas2 ⁇ -hTF (1) strain
  • “Before Gas2 deletion” is the culture solution of A8-hTF (1) strain. It is a CBB dyeing

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Abstract

シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体を用いて、高い生産性でトランスフェリンを分泌産生する方法、および該方法に好適な形質転換体の提供。　シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、トランスフェリン遺伝子と、トランスフェリン遺伝子の上流域に存在し、宿主内で機能する分泌シグナルペプチドが結合したトランスフェリンを発現させる分泌シグナルペプチド遺伝子とを有し、宿主が本来有するＧａｓ２遺伝子が削除または不活性化されていることを特徴とする形質転換体、および形質転換体を液体培地中で培養し、該液体培地からトランスフェリンを取得することを特徴とする、トランスフェリンの製造方法。

Description

形質転換体、およびトランスフェリンの製造方法
　本発明は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（以下、「Ｓ．ポンベ」という。）を宿主とし、トランスフェリン遺伝子を組込んだ形質転換体を用いて、トランスフェリンを製造する方法に関する。
　トランスフェリン（以下、「ＴＦ」ともいう。）は、Ｆｅ３＋イオンと結合する糖蛋白質の１種であり、鉄の代謝に深く関わっている。特に、ヒト血清トランスフェリン（以下、「ヒト・トランスフェリン」または「ｈＴＦ」ともいう。）は、ヒト生体内の鉄結合タンパク質ファミリーに属し、生体内の鉄輸送・代謝に関与しており、動物細胞の培養用培地への添加剤、医薬品、ＤＤＳの輸送担体として用いられている。ＴＦは、Ｎローブ（N-lobe）とＣローブ（C-lobe）の２つのドメインを有する約８０ｋＤａの糖蛋白質であり、翻訳により、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドを有する未成熟型蛋白質として合成された後、分泌シグナルペプチドが切断された成熟型の糖蛋白質として細胞外へ分泌される。
　ＴＦ生産の最も一般的な方法としては、全長組換え蛋白質をハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）等の哺乳細胞の培養株を用いて生産させる方法が知られている。また、分裂酵母であるＳ．ポンベを用いる方法が知られている。Ｓ．ポンベは、出芽酵母であるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）とは異なり、細胞分裂および転写形態がヒト細胞に近く、人体に悪影響を及ぼす物質を含まない。そのため、Ｓ．ポンベにＴＦの全長組換え蛋白質を生産させる方法は、医薬品等のヒトへ摂取させるＴＦの生産方法として優れている。たとえば、特許文献１には、Ｓ．ポンベを宿主とし、ｈＴＦ遺伝子を導入した形質転換体を、カザミノ酸を含む液体培地中で培養し、ｈＴＦを効率よく生産させ、液体培地中に分泌させて回収する方法が開示されている。
　一方で、酵母などの真核細胞微生物を用いた異種タンパク質生産系においては、目的の異種蛋白質の生産効率を向上させるべく、異種タンパク質生産に不要または不利な宿主のゲノム部分の一部または全部を削除または不活性化した改良宿主を用いることが知られている。たとえば、特許文献２には、Ｓ．ポンベにおいて、特定のプロテアーゼをコードする遺伝子（プロテアーゼ遺伝子群）から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を削除または不活性化した改良宿主を用いることにより、異種タンパク質の生産効率を向上させられることが記載されている。
　また、ｈＴＦ蛋白質のＮ末端に分泌シグナル（小胞体移行シグナル）ペプチドを付加した状態で生産させることによって、ｈＴＦ蛋白質を分泌生産できる。たとえば、Ｓ．ポンベの接合に関与する接合フェロモン（Ｐ－ファクター）の前駆体の分泌シグナルに由来するポリペプチドのようにＳ．ポンベによって認識される分泌シグナルペプチドをｈＴＦ蛋白質のＮ末端に融合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子が導入されたＳ．ポンベの形質転換体を培養すると、生産された該融合蛋白質はゴルジ装置や小胞体中において分泌シグナルペプチドが切断され、ｈＴＦ蛋白質が培地中に分泌される。たとえば特許文献３には、目的の外来蛋白質のＮ末端側に、分子シャペロン機能を持ち、小胞体に局在する蛋白質であるＰＤＩ１（Protein　disulfide　isomerase　１）の分泌シグナルペプチドとａドメインとｂドメインとｘドメインとから構成される部分蛋白質、またはＰＤＩ１の小胞体移行シグナルペプチドとａドメインとｂドメインとｂ’ドメインとｘドメインとから構成される部分蛋白質を融合させた状態で発現させることにより、S．ポンベにおいて外来蛋白質を分泌生産させる量を増大させられることが記載されている。なお、ＰＤＩ１はＮ末端から順に、ＥＲ移行シグナル、ａドメイン、ｂドメイン、ｂ’ドメイン、ｘドメイン、ａ’ドメイン、およびＥＲ局在シグナル（ＡＤＥＬ）を含むｃドメインを有する。ａドメインおよびａ’ドメインに１つずつ分子シャペロン活性の活性中心（ＣＧＨＣ）があり、ａドメイン、ｂドメイン、ｂ’ドメイン、およびａ’ドメインの４つともチオレドキシンフォールドを形成している。
特開２０１１－１２５２８１号公報 国際公開第２００７／０１５４７０号 国際公開第２０１３／１１１７５４号
　本発明の目的は、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いて、高い生産性でＴＦを分泌産生する方法、および該方法に好適な形質転換体を提供することを目的とする。
　本発明に係る形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とし、ＴＦ遺伝子と、ＴＦ遺伝子の上流域に存在し、宿主内で機能する分泌シグナルペプチドが結合したＴＦを発現させる分泌シグナルペプチド遺伝子とを有し、宿主が本来有するＧａｓ２遺伝子が削除または不活性化されていることを特徴とする。
　該形質転換体としては、ＴＦ遺伝子がヒト・トランスフェリンをコードする遺伝子であることが好ましい。
　また、該形質転換体としては、ＴＦ遺伝子が、哺乳動物が有する天然型のＴＦをコードする遺伝子に変異が導入された変異ＴＦ遺伝子であり、変異ＴＦ遺伝子が、天然型ＴＦの少なくとも１箇所のＮ結合型糖鎖修飾部位であるアスパラギン残基が欠失または他のアミノ酸残基に置換された変異ＴＦをコードする遺伝子であることが好ましい。
　また、該形質転換体としては、宿主が本来有する少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されていることが好ましい。プロテアーゼ遺伝子としては、メタロプロテアーゼ遺伝子群、セリンプロテアーゼ遺伝子群、システインプロテアーゼ遺伝子群およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群からなる群から選ばれる遺伝子であることがより好ましい。削除または不活性化されるプロテアーゼ遺伝子としては、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子およびｐｐｐ２０遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子であることがさらに好ましい。
　また、該形質転換体としては、ＴＦ遺伝子が、分泌シグナルペプチドを含む分泌キャリア蛋白質をコードする遺伝子の下流に直接または間接的に連結されていることが好ましく、分泌キャリア蛋白質をコードする遺伝子が、宿主のＰＤＩ１の分泌シグナルペプチド部分をコードする遺伝子とヒトのＰＤＩ1のａｂドメイン部分をコードする遺伝子と宿主のＰＤＩ１のｘドメイン部分をコードする遺伝子との融合遺伝子であることがより好ましい。
　本発明に係るＴＦの製造方法は、本発明に係る形質転換体を液体培地中で培養し、該液体培地からトランスフェリンを取得することを特徴とする。
　該ＴＦの製造方法としては、形質転換体を、ｐＨ５．５～６．５の液体培地中で培養することが好ましく、形質転換体を、アデニンを含有する液体培地中で培養することも好ましく、形質転換体を、菌体密度（ＯＤ６６０）が１００以上になるまで培養した後、該液体培地からトランスフェリンを取得することも好ましい。
　本発明に係る形質転換体の製造方法は、Ｓ．ポンベを宿主とし、宿主内で機能する分泌シグナルペプチド遺伝子と、分泌シグナルペプチド遺伝子の下流に位置するＴＦ遺伝子とを組込むこと、および、宿主が本来有するＧａｓ２遺伝子を削除または不活性化することを特徴とする。
　本発明に係る形質転換体を培養することにより、効率よくＴＦを製造できる。
　また、本発明に係るＴＦの製造方法により、Ｓ．ポンベを用いて、高い生産性でＴＦを分泌産生できる。
図１は、分泌発現ベクターｐＳＬ６ＰＤＩ１（ＳＰ）Ｈｓａｂｘ－ｈＴＦ（Ｎ４１３ＱＮ６１１Ｑ）の構造を示した図である。 図２は、Ａ８－ｈＴＦ（１）株およびＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株の培養液のＳＤＳ－ＰＡＧＥのＣＢＢ染色像である。 図３は、Ａ８－ｈＴＦ（１）株およびＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株のｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）蛋白質の分泌量の経時的変化を示した図である。 図４は、Ａ８－ｈＴＦ（１）株およびＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株の培養上清中のｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）蛋白質をＤＥＡＥクロマトグラフィーで精製した精製画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのＣＢＢ染色像である。
［ＴＦ遺伝子、分泌シグナルペプチド遺伝子］
　本発明において、「ＴＦ遺伝子」とは、成熟型のＴＦ蛋白質をコードする構造遺伝子をいう。また、成熟型のＴＦ蛋白質を、以下、「ＴＦ蛋白質」という。
　本来ＴＦ遺伝子を有している生物種の細胞では、分泌シグナルペプチドを含む蛋白質（分泌キャリア蛋白質）とＴＦ蛋白質が連結した融合蛋白質が発現し、該融合蛋白質は、小胞体やゴルジ装置で分泌キャリア蛋白質が切り離され、ＴＦ蛋白質が細胞外へ分泌される。
　一方、本発明における宿主であるＳ．ポンベは本来ＴＦ遺伝子を有していないことより、分泌キャリア蛋白質とＴＦ蛋白質が連結した融合蛋白質が宿主内で発現しても、その分泌キャリア蛋白質が宿主細胞内で切り離されるとは限らない。したがって、本発明における分泌シグナルペプチドや分泌キャリア蛋白質としては、宿主において充分に機能する、ＴＦ蛋白質のＮ末端側に本来有していたもの以外の分泌シグナルペプチドや分泌キャリア蛋白質が好ましい。本発明における「宿主内で機能する」（分泌シグナルペプチド）とは、宿主内において発現した融合蛋白質をＴＦ蛋白質として宿主細胞外に分泌させる機能を有することをいう。
　また、本発明において、ＴＦ蛋白質と分泌シグナルペプチドまたは分泌キャリア蛋白質とは、直接連結されていてもよく、１～数十アミノ酸残基のペプチドからなるリンカーにより間接的に連結されていてもよい。
［形質転換体］
　本発明に係る形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とし、ＴＦ遺伝子と、ＴＦ遺伝子の上流域に存在し、宿主内で機能する分泌シグナルペプチドが結合したＴＦ蛋白質を発現させる、分泌シグナルペプチド遺伝子とを有し、宿主が本来有するＧａｓ２遺伝子が削除または不活性化されていることを特徴とする。
　本発明に係る形質転換体が有するＴＦ遺伝子がコードするＴＦ蛋白質は、いずれの生物種由来の天然型のＴＦ蛋白質（野生型の生物の染色体中に存在しているＴＦ遺伝子がコードしているＴＦ蛋白質）であってもよく、天然型のＴＦ蛋白質の改変蛋白質であってもよい。該改変蛋白質としては、たとえば、天然型のＴＦ蛋白質のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＴＦの機能を有するポリペプチドが挙げられる。天然型のＴＦ蛋白質のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＦの機能を有するポリペプチドが挙げられる。ＴＦの機能とは、Ｆｅ３＋イオンと結合し、かつ細胞表面のＴＦ受容体と結合して細胞内に取り込まれる機能を意味する。本発明に係る形質転換体が有するＴＦ遺伝子がコードするＴＦ蛋白質としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等の哺乳動物由来の天然型のＴＦ蛋白質またはその改変蛋白質が好ましく、ｈＴＦまたはその改変蛋白質が特に好ましい。
　本発明に係る形質転換体が有するＴＦ遺伝子がコードするＴＦ蛋白質が、天然型のＴＦ蛋白質の改変蛋白質である場合、該改変としては、たとえば、翻訳後のＮ結合型糖鎖修飾部位であるアスパラギン酸残基の少なくとも１以上を、欠失または他のアミノ酸残基に置換させるアミノ酸配列の点変異が好ましい。Ｎ結合型糖鎖修飾部位を有する蛋白質を分泌発現させた場合には、得られる組換え蛋白質は長さが不均一なハイマンノース型糖鎖の修飾を受けているため、均一性や品質が低下するおそれがある。
　本発明に係る形質転換体が有するＴＦ遺伝子が、Ｎ結合型糖鎖修飾部位を消失させる変異が導入された変異ＴＦ蛋白質をコードする変異ＴＦ遺伝子である場合には、該形質転換体を培養することにより、ＴＦの機能が安定しており、かつ品質が均質な組換えＴＦ蛋白質を分泌生産できる。たとえば、該変異ＴＦ遺伝子としては、天然型のｈＴＦ蛋白質が有する２箇所のＮ結合型糖鎖修飾部位（４３２番目および６３０番目のアスパラギン酸残基）のうち、少なくも１箇所のＮ結合型糖鎖修飾部位であるアスパラギン残基が欠失または他のアミノ酸に置換された変異ＴＦ蛋白質をコードする変異ＴＦ遺伝子が好ましく、２箇所のＮ結合型糖鎖修飾部位がいずれもアスパラギン残基以外のアミノ酸残基に置換された変異ＴＦ蛋白質をコードする変異ＴＦ遺伝子がより好ましく、２箇所のＮ結合型糖鎖修飾部位がいずれもグルタミン残基に置換された変異ＴＦ蛋白質をコードする変異ＴＦ遺伝子（配列番号２）がさらに好ましい。
　本発明に係る形質転換体が有する分泌シグナルペプチド遺伝子は、該形質転換体の細胞内で機能する分泌シグナルペプチドをコードする構造遺伝子である。分泌シグナルペプチド遺伝子は、分泌キャリア蛋白質をコードする構造遺伝子の一部分であってもよい。すなわち、分泌キャリア蛋白質をコードする構造遺伝子は、分泌シグナルペプチド遺伝子の下流に、分泌シグナルペプチド遺伝子部分以外の分泌キャリア蛋白質をコードする構造遺伝子部分を有していてもよい。分泌シグナルペプチドは、Ｓ．ポンベ内で機能するものであればよく、たとえば、Ｓ．ポンベが本来有する分泌蛋白質の分泌シグナルペプチド、Ｐ３分泌シグナル（３４アミノ酸残基）等の国際公開第１９９６／２３８９０号に記載のものが使用でき、Ｓ．ポンベのＰＤＩ１の分泌シグナルペプチドが好ましい。
　Ｓ．ポンベ内で機能する分泌キャリア蛋白質としては、分泌シグナルペプチドを含む、ＰＤＩ１の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、またはこれらの変異蛋白質が融合された蛋白質であることが好ましい。特に、ＰＤＩ１のａドメインを含む蛋白質またはＰＤＩ１のａ’ドメインを含む蛋白質が好ましく、ＰＤＩ１のａドメインまたはａ’ドメインの少なくとも一方とｂドメインまたはｂ’ドメインの少なくとも一方を含む蛋白質がより好ましく、ＰＤＩ１のａドメインまたはａ’ドメインの少なくとも一方とｂドメインまたはｂ’ドメインの少なくとも一方とｘドメインとを含む蛋白質がさらに好ましい（特許文献３参照。）。分泌シグナルペプチドの下流に融合される蛋白質が含むＰＤＩ１の各ドメインは、全てが同種の生物種由来であってもよく、２種以上の生物種由来のドメインの組み合わせであってもよい。
　本発明に係る形質転換体としては、ＴＦの分泌産生能がより高められるため、該分泌キャリア蛋白質としては、上流側から順に、Ｓ．ポンベのＰＤＩ１の分泌シグナルペプチド遺伝子とヒトのＰＤＩ1のａｂｘドメイン部分をコードする遺伝子またはヒトのＰＤＩ1のａｂｂ’ｘドメイン部分をコードする遺伝子とが直接または間接的に連結した融合遺伝子、Ｓ．ポンベのＰＤＩ１の分泌シグナルペプチド遺伝子とヒトのＰＤＩ1のａｂドメイン部分をコードする遺伝子またはヒトのＰＤＩ1のａｂｂ’ドメイン部分をコードする遺伝子とＳ．ポンベのＰＤＩ１のｘドメイン部分をコードする遺伝子とが直接または間接的に連結した融合遺伝子が好ましい。
　Ｓ．ポンベは本来ＴＦ遺伝子を有していない。したがって、本発明に係る形質転換体は、Ｓ．ポンベ以外の生物由来のＴＦ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して得られる。本発明に係る形質転換体が有するＴＦ遺伝子の塩基配列は、ＴＦ蛋白質が由来する生物種の遺伝子配列そのものであってもよく、該遺伝子配列をＳ．ポンベにおいて使用頻度の高いコドンに改変してもよい。
　該形質転換体が有する分泌シグナルペプチド遺伝子とＴＦ遺伝子とが直接または間接的に連結した遺伝子（以下、ＳＰ－ＴＦ遺伝子という。）は、１コピーであってもよく、２コピー以上であってもよい。ＳＰ－ＴＦ遺伝子は、Ｓ．ポンベの染色体外にプラスミドとして導入されてもよく、Ｓ．ポンベの染色体に導入されてもよい。染色体に外来遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。
　酵母を宿主として用いた遺伝子組換え法に関しては、異種タンパク質をより安定に効率よく発現させるために種々の発現システム、特に発現ベクター、分泌シグナル、遺伝子導入発現ベクター等が開発されており、本発明に係る形質転換体の製造においては、これらを広く応用可能である。たとえば、Ｓ．ポンベを宿主とした発現システムとしては、特許２７７６０８５号公報、特開平０７－１６３３７３号公報、特開平１０－２１５８６７号公報、特開平１０－２１５８６７号公報、特開平１１－１９２０９４号公報、特開１１－１９２０９４号公報、特開２０００－２６２２８４号公報、国際公開第９６／０２３８９０号等が知られており、本発明に係る形質転換体の製造には広くこれら発現システムが利用できる。
　宿主となるＳ．ポンベへのＳＰ－ＴＦ遺伝子の導入は、たとえば、ＳＰ－ＴＦ遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターを含む発現カセットをそのまま宿主細胞に導入する、または組み込まれたベクターを宿主細胞に導入することにより行える。該発現カセットには、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよく、ｕｒａ４遺伝子等の栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。
　Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ｎｍｔ１遺伝子プロモーター、フルクトース－１、６－ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、インベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照、国際公開第２０１４／０３０６４４号）等のＳ．ポンベが本来有するプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等の動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられる。Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、たとえば、ＬＰＩ（ヒトリポコルチンＩ）ターミネーター等が挙げられる。
　該発現カセットを組込むベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いられる。該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
　ＳＰ－ＴＦ遺伝子を含む発現カセットをＳ．ポンベの染色体に相同組換え法により組込む場合、該発現カセットを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体の２箇所以上に該ベクターを組み込める。１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、たとえば特開２０００－２６２２８４号公報に記載の方法記載の標的部位を使用できる。異なる組込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込める。
　ＳＰ－ＴＦ遺伝子を含む発現カセットが組み込まれたベクターとしては、たとえば、特許文献１、特許文献３等に記載されている分泌シグナルペプチド遺伝子とｈＴＦ遺伝子が組み込まれたベクターを用いることができる。
　本発明に係る形質転換体は、宿主であるＳ．ポンベが本来有するＧａｓ２遺伝子（SPBC29A10.08.1）が削除または不活性化されている。後記実施例で示すように、ＳＰ－ＴＦ遺伝子を導入したＳ．ポンベの形質転換体を菌体密度（濁度計で測定した６６０ｎｍにおける光学密度：ＯＤ６６０）が１００以上となる高密度培養した場合には、ＴＦと共にＧａｓ２（1,3-β-glucanosyl transferase）蛋白質の発現量が増大する。Ｇａｓ２蛋白質は、細胞壁に局在し、分裂酵母の細胞壁の生合成に関与する糖蛋白質であり、ＴＦの発現や分泌には直接関与するとは考えられていない。にもかかわらず、ＴＦ発現株（ＳＰ－ＴＦ遺伝子が導入された形質転換体）の高密度菌体培養プロセスにおいて、Ｇａｓ２蛋白質がＴＦ蛋白質と同時に液体培地中に大量に分泌され、かつＴＦの産生効率が低下する。不思議なことに、ＴＦ発現株の高密度培養時に観察されるＧａｓ２蛋白質の発現および分泌量の増大は、ＯＤ６６０が２０～３０である一般的なバッチ培養時には明確に観察されない。本発明に係る形質転換体は、Ｇａｓ２遺伝子が削除または不活性化されているため、高密度培養時にもＧａｓ２蛋白質が発現せず、ＴＦの液体培地中への分泌量も増大する。
　なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Schizosaccharomyces pombe Gene DB （http://www.genedb.org/genedb/pombe/）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは前記データベースから遺伝子名や系統名で検索して、入手できる。
　本発明に係る形質転換体としては、プロテアーゼ遺伝子（プロテアーゼをコードする遺伝子）のうちの少なくとも１種が削除または不活性化されているものが好ましい。形質転換体内においてＳ．ポンベが本来有する少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子のプロテアーゼ活性が阻害されていることにより、ＴＦ蛋白質の生産効率が向上し、ＴＦ蛋白質の生産量がより高まる。本発明に係る形質転換体としては、セリンプロテアーゼ遺伝子群（セリンプロテアーゼをコードする遺伝子の群）、アミノペプチダーゼ遺伝子群（アミノペプチダーゼをコードする遺伝子の群）、カルボキシペプチダーゼ遺伝子群（カルボキシペプチダーゼをコードする遺伝子の群）およびジペプチダーゼ遺伝子群（ジペプチダーゼをコードする遺伝子の群）からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子が削除または不活性化されているものが好ましい。
　本発明に係る形質転換体としては、１種類のプロテアーゼ遺伝子のみが削除等されたものであってもよく、２種類以上のプロテアーゼ遺伝子が削除等されたものであってもよい。なかでも、メタロプロテアーゼ遺伝子群（メタロプロテアーゼをコードする遺伝子の群）、セリンプロテアーゼ遺伝子群、システインプロテアーゼ遺伝子群（システインプロテアーゼをコードする遺伝子の群）およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群（アスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子の群）からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が削除等された形質転換体が好ましく、メタロプロテアーゼ遺伝子群およびセリンプロテアーゼ遺伝子群からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子とシステインプロテアーゼ遺伝子群およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子とが削除等された形質転換体も好ましい。
　Ｓ．ポンベの該４種のプロテアーゼ遺伝子群としては、たとえば以下のものが挙げられる。
　メタロプロテアーゼ遺伝子群：ｃｄｂ４（SPAC23H4.09）、ｍａｓ２（SPBC18E5.12c）、ｐｇｐ１（SPCC1259.10）、ｐｐｐ２０（SPAC4F10.02）、ｐｐｐ２２（SPBC14C8.03）、ｐｐｐ５１（SPAC22G7.01c）、ｐｐｐ５２（SPBC18A7.01）、ｐｐｐ５３（SPAP14E8.04）。
　セリンプロテアーゼ遺伝子群：ｉｓｐ６（SPAC4A8.04）、ｐｐｐ１６（SPBC1711.12）、ｐｓｐ３（SPAC1006.01）、ｓｘａ２（SPAC1296.03c）。
　システインプロテアーゼ遺伝子群：ｐｐｐ８０（SPAC19B12.08）、ｐｃａ１（SPCC1840.04）、ｃｕｔ１（SPCC5E4.04）、ｇｐｉ８（SPCC11E10.02c）。
　アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群：ｓｘａ１（SPAC26A3.01）、ｙｐｓ１（SPCC1795. 09）、ｐｐｐ８１（SPAC25B8.17）。
　本発明に係る形質転換体は、宿主となるＳ．ポンベにＳＰ－ＴＦ遺伝子を含む発現カセットを導入した形質転換体のＧａｓ２遺伝子を削除または不活性化することにより製造でき、Ｇａｓ２遺伝子を予め削除または不活性化したＳ．ポンベにＳＰ－ＴＦ遺伝子を含む発現カセットを導入することによっても製造できる。この際に用いる宿主として、少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されているＳ．ポンベの変異株を用いることにより、ＳＰ－ＴＦ遺伝子が導入され、Ｇａｓ２遺伝子が削除または不活性化されており、かつ少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されている形質転換体が得られる。Ｓ．ポンベが本来有する少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されている変異株としては、たとえば、特許文献２に記載のＡ８株のような、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子が削除等されているＳ．ポンベの変異株を用いることが好ましい。
　Ｇａｓ２遺伝子の削除または不活性化や、プロテアーゼ遺伝子の削除または不活性化を行う方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Nucreic Acids Research誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲを利用したランダム変異法（PCR　Methods　Application誌、第２巻、２８～３３ページ、１９９２年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第１４巻、９４３～９５１ページ、１９９８年）による削除または不活性化の方法である。
　形質転換方法は、公知の形質転換方法がいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５－１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
　本発明に係る形質転換体は、天然のシゾサッカロミセス属酵母と同様に培養できる。
　該形質転換体の培養のための液体培地には、公知の酵母培養培地を用いることができ、シゾサッカロミセス属酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、シゾサッカロミセス属酵母の培養を効率良く行えるものであればよい。液体培地としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
　液体培地としては、たとえば、ＭＭＡ（Minimal medium with agar）、ＳＤＣ（Synthetic dextrose complete medium）、ＴＥＳ（0.5% Bacto-yeast extract，3% glucose，supplemented with uracil，leucine, histidine，lysine，adenine）、ＹＥＳ（0.5% Bacto-yeast extract, 3% glucose, supplemented with uracil, leucine, histidine, lysine, adenine）、ＹＰＤ（1% Bacto-yeast extract，2% Bactopeptone，2% glucose）等が挙げられる。
　炭素源としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。具体的には、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Labolatory Press(1990) ）またはＭＢ培地等の最少培地（K.Okazaki et al., Nucleic AcidsRes.,18,6485-6489(1990)）等を使用できる。
　培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。
　また、培養温度は、２３～３７℃であることが好ましく、３０～３２℃であることがさらに好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
　また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
［ＴＦの製造方法］
　Ｓ．ポンベを宿主とし、ＳＰ－ＴＦ遺伝子を有する形質転換体（ＴＦ発現株）を液体培地中で培養すると、培養後の該液体培地に分泌されたＴＦ蛋白質を取得できる。ＴＦ発現株を培養する液体培地や培養方法は、本発明に係る形質転換体の培養と同様に、公知の酵母培養培地を用い、公知の培養方法で行うことができる。
　ＴＦ蛋白質は酸性条件では分解されやすい。そこで、ＴＦの製造においては、ＴＦ発現株を培養する液体培地のｐＨ条件は、ｐＨ５．５以上であることが好ましく、ｐＨ５．５～６．５がより好ましい。培養時間が長くなるにつれて、培養液のｐＨは低下する傾向にあるため、ＴＦの製造のための培養では、培養液のｐＨが５．５～６．５の範囲内に維持されるように適宜ｐＨを調整することが好ましい。
　ＴＦ蛋白質の分泌生産量をより高くできるため、ＴＦ発現株を培養する培養時間は、２日以上が好ましく、３～６日間がより好ましく、３～５日間がさらに好ましい。
　ＴＦ発現株を培養する液体培地はアデニンを含有していることが好ましい。ＴＦ発現株が１コピー以上のＳＰ－ＴＦ遺伝子を有する場合には、溶菌しやすく、ＴＦの発現量が低下する傾向がある。アデニン含有液体培地中で培養することにより、１コピー以上のＳＰ－ＴＦ遺伝子を有するＴＦ発現株であっても、良好に増殖し、ＴＦの分泌生産効率が高くなる。液体培地のアデニン含有量は、たとえば、菌体密度を示すＯＤ６６０あたりで０．５～２００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～１００ｍｇ／Ｌにできる。
　また、ＴＦの生産性を高くするために、ＴＦ発現株を高密度培養することが好ましい。なかでも、培養槽の通気速度、撹拌速度、流加培地の添加速度を制御しながら、ｐＨ５．５～６．５、好ましくはｐＨ５．５～６．０の条件で初発培地と流加培養を行うことが好ましい。培地のグルコース濃度を一定レベルで低く抑えながら、増殖速度や栄養消費速にあわせて培地を継続的に添加（流加）していくため、菌体密度が最終的に試験管やフラスコなどでのバッチ培養に比べて数十倍も向上し、高い菌体密度が達成でき、より多量のＴＦを分泌生産できる。ＴＦ発現株の高密度培養では、ＯＤ６６０が１００以上になるまで、好ましくはＯＤ６６０が２００～８００になるまで培養することが好ましい。
　ＴＦ発現株としては、本発明に係る形質転換体が好ましい。本発明に係る形質転換体は、宿主由来Ｇａｓ２蛋白質の発現がなく、ＴＦの分泌発現の効率が高い。加えて、高密度培養後の液体培地からＴＦ蛋白質を精製する際に、Ｇａｓ２蛋白質からの分離精製を必要とせず、より簡便に精製できる。
　培養後の液体培地からのＴＦ蛋白質の取得は、公知の方法を用いられる。たとえば、培養終了後の液体培地から遠心分離により菌体を分離除去した後、得られた培養上清に対して、アフィニティーカラム等に吸着させて洗浄した後に溶出させる方法、活性炭を用いて色素など不純物を除去する方法、分離膜を用いて分離する方法等を行う。Ｇａｓ２遺伝子を有するＴＦ発現株を高密度培養した場合には、回収された培養上清中には大量のＧａｓ２蛋白質が含まれているため、該培養上清に対してＤＥＡＥ樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを行った場合には、ＴＦ蛋白質を含む画分にはＧａｓ２蛋白質も含まれてしまう。このため、該ＴＦ蛋白質を含む画分に対して、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーを行ってはじめて、Ｇａｓ２蛋白質から分離してＴＦ蛋白質を精製できる。これに対して、本発明に係る形質転換体の高密度培養後の培養上清に対しては、ＤＥＡＥ樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを１度行うだけで、ＴＦ蛋白質を精製できる。
　以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例においては特に断りのない限り「％」は「質量％」を意味する。
［実施例１］
＜ｈＴＦ変異体の遺伝子の作製＞
　天然型のｈＴＦ遺伝子のＯＲＦ（配列番号１）は、１９残基の分泌シグナルペプチドの下流にｈＴＦ蛋白質が融合した全長６９８残基の蛋白質をコードしている。ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、プライマーペア（Forward primer #9220（配列番号３）およびReverse primer #9221（配列番号４））を用いたＰＣＲを行い、ｈＴＦ蛋白質をコードする遺伝子の５’末端側に制限酵素サイトＡｆｌＩＩとヒトＰＤＩ１のａｂｘドメインのＣ末端部分の４残基（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ）をコードする塩基配列を、３’末端側に制限酵素サイトＸｂａＩをそれぞれ付加したＤＮＡ断片を得た。
　得られたＤＮＡ断片のＡｆｌＩＩとＸｂａＩの二重消化産物を、ｈＣＭＶプロモーター下流にＰ３分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子を配し、該遺伝子とＬＰＩターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備える分裂酵母の染色体単座組込み型分泌発現ベクターであるｐＳＬ６Ｐ３（特許文献３）のＡｆｌＩＩとＸｂａＩの二重消化産物にライゲーションにより組込み、大腸菌ＤＨ５αへの形質転換を行うことによって、Ｎ末端にａｂｘドメインのＣ末端部分の４残基を含む天然型のｈＴＦ蛋白質をコードする遺伝子がクローニングされた発現ベクターｐＳＬ６Ｐ３－ｈＴＦのプラスミドＤＮＡを調製した。
　なお、ｐＳＬ６Ｐ３ベクターのマルチクローニングサイトに目的蛋白質の発現カセットを組込んだ分泌発現ベクターは、制限酵素ＮｏｔＩで切断して線状化したベクター断片が、染色体相同組換えにより、分裂酵母染色体上に隣接して存在する２つの遺伝子座ｌｅｕ１－３２とｔｏｐ２の間に１コピー組込まれる。また、ｐＳＬ６Ｐ３ベクターには、変異型（ｌｅｕ１－）遺伝子（ロイシン合成系遺伝子（ｌｅｕ１）が点変異（ｌｅｕ１－３２）で不活性化されている遺伝子）の点変異（ｌｅｕ１－３２）部分を相補するロイシンマーカー遺伝子断片（ｌｅｕ１＋）が組み込まれている。このため、変異型（ｌｅｕ１－）遺伝子を含むロイシン要求性酵母を宿主株とした場合には、ｐＳＬ６Ｐ３ベクターの線状化断片が染色体に組み込まれた形質転換体はロイシン要求性から回復するため、ロイシンを含まない最少培地（ＭＭＡプレート）でクローンを選抜できる。
　ＰＣＲ法によって、ｐＳＬ６Ｐ３－ｈＴＦ中のｈＴＦ遺伝子に、天然型のｈＴＦ蛋白質の４１３番目と６１１番目（配列番号１の４３２番目と６３０番目）のアスパラギン残基をグルタミン残基に置換する変異を導入し、ｐＳＬ６Ｐ３－ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）を作成した。具体的には、各アスパラギン残基をコードするコドンの１番目の塩基をシトシン（Ｃ）に、３番目の塩基をアデニン（Ａ）にそれぞれ置換する４箇所の点変異を導入した。変異を導入したｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の配列を配列番号２に示す。
＜ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の発現ベクターの作製＞
　ｐＳＬ６Ｐ３－ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）をＡｆｌＩＩとＸｂａＩで二重消化したｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）のコード領域を含むＤＮＡ断片を、ｈＣＭＶプロモーター下流に、Ｓ．ポンベのＰＤＩ１の分泌シグナルペプチドとヒトのＰＤＩ１のａｂドメインとＳ．ポンベのＰＤＩ１のｘドメインからなる分泌キャリア蛋白質（ＰＤＩ１（ＳＰ）－Ｈｓａｂｘ）をコードする遺伝子を配し、該遺伝子とＬＰＩターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備える分裂酵母の染色体単座組込み型分泌発現ベクターｐＳＬ６ＰＤＩ１（ＳＰ）Ｈｓａｂｘ－ＡｆｌＩＩのＡｆｌＩＩとＸｂａＩの二重消化産物にライゲーションにより組込み、大腸菌ＤＨ５αへの形質転換を行うことによって、分泌キャリア蛋白質（ＰＤＩ１（ＳＰ）－Ｈｓａｂｘ）と変異型ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）蛋白質の融合蛋白質の染色体単座組込み型発現ベクターであるｐＳＬ６ＰＤＩ１（ＳＰ）Ｈｓａｂｘ－ｈＴＦ（Ｎ４１３ＱＮ６１１Ｑ）（８７４９ｂｐ、図１）を作成した。
＜Ａ８株の作製＞
　Ｓ．ポンベのロイシン・ウラシル要求性（ｌｅｕ１－　ｕｒａ４－）株（遺伝子型：ｈ－　ｌｅｕ１－３２　ｕｒａ４－Ｄ１８）であるＡＲＣ０１０株に対して、Ｌａｔｏｕｒ法により、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子の８遺伝子を削除したＡ８株（遺伝子型：ｈ－ｌｅｕ１－３２　ｐｓｐ３－Ｄ１３　ｉｓｐ６－Ｄ１４　ｏｍａ１－Ｄ１０　ｐｐｐ１６－Ｄ２０　ｆｍａ２－Ｄ１３　ｓｘａ２－Ｄ１５　ａａｐ１－Ｄ１７　ｐｐｐ８０－Ｄ１１）を作製した。Ａ８株は、ロイシン要求性株であった。より詳細には、Ｌａｔｏｕｒ法は、遺伝子削除断片（Ｌａｔｏｕｒ断片: 両末端の相同組換え領域、それで挟まれたｕｒａ４＋マーカー遺伝子とＯＬ（オーバーラップ配列）領域からなる）を分裂酵母ゲノム上の削除対象領域の上流または下流に一旦相同組換えで組込み、潜在株を作製した。次いで、該潜在株を５’－ＦＯＡを含む培地で培養し、組込まれたＯＬ間で相同組換えを起こし、ｕｒａ４＋マーカー遺伝子を含む削除標的領域が脱落した遺伝子削除株をコロニーとして形成させた。得られた遺伝子削除株は、目的の遺伝子が削除されていることをＰＣＲにより確認した。該方法では、ｕｒａ４＋マーカー遺伝子を含む外来遺伝子が残らないため、外来遺伝子を組込むことなく目的の遺伝子のみを削除できる上、ｕｒａ４＋マーカー遺伝子をリサイクルしながら繰り返し遺伝子削除が行える。各遺伝子を削除するためのＬａｔｏｕｒ断片をＰＣＲにより作製する際に用いたプライマーの塩基配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜Ａ８－ｇａｓ２Δ株の作製＞
　Ａ８株に対して、Ｌａｔｏｕｒ法により、Ｇａｓ２遺伝子を削除したＡ８－ｇａｓ２Δ株（遺伝子型：ｈ－ｌｅｕ１－３２　ｐｓｐ３－Ｄ１３　ｉｓｐ６－Ｄ１４　ｏｍａ１－Ｄ１０　ｐｐｐ１６－Ｄ２０　ｆｍａ２－Ｄ１３　ｓｘａ２－Ｄ１５　ａａｐ１－Ｄ１７
　ｐｐｐ８０－Ｄ１１　ｇａｓ２－Ｄ１５）を作製した。得られた遺伝子削除株は、目的の遺伝子が削除されていることをＰＣＲにより確認した。Ａ８－ｇａｓ２Δ株は、ロイシン要求性株であった。Ｇａｓ２遺伝子を削除するためのＬａｔｏｕｒ断片をＰＣＲにより作製する際に用いたプライマーの塩基配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　作製されたＡ８株およびＡ８－ｇａｓ２Δ株について、試験管レベル（５ｍＬのＹＥＳに植菌し、３０℃、６８時間培養する条件）で生育評価（μmaxと増殖曲線の測定）を行った。この結果、両株とも、同じ栄養要求性（ｌｅｕ１―）の野生株（ＡＲＣ００１）に比べて、菌体増殖の最初の立ち上がりを示す最大比増殖速度（μmax相対値）が微減（約８～１２％低下）したものの、最終到達の菌体密度（ＯＤ６６０）は逆に微増（約９～１７％増加）し、両株ともロイシン要求性野生株と同様に生育可能であることが確認された（図示せず。）。特に、Ａ８株とＡ８－ｇａｓ２Δ株は、生育および表現型に変化は観察されなかった。
＜ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）遺伝子の１コピー発現株の作製＞
　ｐＳＬ６ＰＤＩ１（ＳＰ）Ｈｓａｂｘ－ｈＴＦ（Ｎ４１３ＱＮ６１１Ｑ）を制限酵素ＮｏｔＩで切断して線状化したベクター断片（６９９３ｂｐ）を調製し、該ベクター断片を、酢酸リチウム法を用いて、ロイシン要求性Ｓ．ポンベであるＡ８株またはＡ８－ｇａｓ２Δ株を宿主として形質転換を行なった。形質転換処理後の菌体を、ＭＭＡプレートに塗布し、ロイシン要求性が相補されて形成したコロニーを組換え体クローンとして取得した。その後、ＰＣＲにより目的遺伝子が正しく導入されたことが確認されたクローンをポジティブクローン（ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）発現株）として選択した。Ａ８株およびＡ８－ｇａｓ２Δ株にｐＳＬ６ＰＤＩ１（ＳＰ）Ｈｓａｂｘ－ｈＴＦ（Ｎ４１３ＱＮ６１１Ｑ）を導入した形質転換体をそれぞれＡ８－ｈＴＦ（１）株およびＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株と命名した。
＜ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の１コピー発現株の分泌発現＞
　Ａ８－ｈＴＦ（１）株およびＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株を培養し、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）を分泌発現させた。具体的には、ガラス試験管を用いて５ｍＬのＹＥＳ中で約２４時間ずつ起こし培養と前培養を行なった後、ガラス試験管を用いて５ｍＬのＹＰＤ＋ＭＥＳ培地（ＹＰＤに０．３ＭのＭＥＳバッファーを含有させた液体培地）（ｐＨ６．０）中で、３２℃、３日間または５日間振盪培養した。培養終了時点における菌体密度（最終到達ＯＤ６６０）は、３０～３６であった。培養液から回収した培養液上清画分と菌体ペレットのそれぞれについて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を行い、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）が菌体内外に発現されたことを確認した（図示せず。）。また、Ａ８－ｈＴＦ（１）株およびＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株のいずれにおいても、３日間培養したものよりも５日間培養したもののほうが、菌体ペレット中のｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）量が少なく、培養上清中のｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）量が多かったことから、培養時間を延長することにより、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の分泌量を増加させ、未分泌の菌体内に残留量を少なくできることがわかった。
＜ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の１コピー発現株の結果＞
　Ａ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株を培養し、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）を分泌発現させた。具体的には、ガラス試験管を用いて５ｍＬのＹＥＳ中で約２４時間ずつ起こし培養と前培養を行なった後、２４穴プレートを用いて５ｍＬのアデニン含有ＹＰＤ＋ＭＥＳ培地（ｐＨ６．０）中で、３２℃、３日間、４日間、または５日間振盪培養し、市販のキット（製品名：「Human Transferrin ELISA Quantitation Set」、Bethyl Laboratories社製）を用いてＥＬＩＳＡを行い、培養終了後の培養上清中に分泌されたｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の蛋白質量を測定した。培養時間が長くなるほど、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の分泌量は多くなった。また、培養５日間における培養上清当たりのｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の分泌量は、Ａ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株が３０～４０ｍｇ／Ｌであった。
＜ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の１コピー発現株の高密度培養＞
　Ａ８－ｈＴＦ（１）株およびＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株を培養し、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）を高密度培養し、分泌発現させた。具体的には、５Ｌの培養スケールで、培養槽の通気速度、撹拌速度、流加培地の添加速度を制御しながら、培養液のｐＨを５．５～６．０に調節した条件で、初発培地と流加培養を行った。液体培地としては、アデニン含有の半合成培地（数％のBacto-yeast extract、グルコース、ビタミン類、ミネラル類、無機塩類など各合成成分）を用いた。グルコース濃度を２％に低く抑えながら、増殖速度や栄養消費速にあわせて培地を継続的に添加（流加）した。最終的には、菌体密度（ＯＤ６６０）は２００～８００程度になった。
　経時的に培養液をサンプリングし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を図２に示す。各レーンには、培養液を５μＬずつアプライした。図中、「ｈＴＦ」はｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）のバンドを示す。図２のＣＢＢ染色像に示す通り、培養時間４８、７２および９６時間のいずれでも、Ａ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株でｇａｓ２の発現が抑制され、Ａ８－ｈＴＦ（１）株よりもＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株のほうがｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の分泌量が多いことが確認された。
　また、サンプリングした培養液を用いて前記と同様にしてＥＬＩＳＡを行い、培養上清中に分泌されたｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の蛋白質量を測定した。図３に示す通り、培養開始から４８時間程度は両株の分泌量に差はないが、それ以降は、Ａ８－ｈＴＦ（１）株よりもＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株のほうが明らかにｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の分泌量が多かった。両株の最終到達分泌量（Ａ８－ｈＴＦ（１）株は培養開始から１６８時間後、Ａ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株は培養開始から９６時間後の分泌量）を表３に示す。Ａ８－ｈＴＦ（１）株よりもＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株のほうが、培養液当たりのｈＴＦ分泌量が４．８倍以上、菌体当たり（ＯＤ６６０当たり）のｈＴＦ分泌量が２．１倍以上であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　高密度培養後の培養液から遠心分離処理により菌体を除去し、回収した培養上清に対して、ＤＥＡＥクロマトグラフィーを行い、ｈＴＦを精製した。ＤＥＡＥカラムは、ＤＥＡＥ樹脂（DEAE Sepharose FF（Fast Flow））を充填したカラム（製品名：「ＸＫ２６」、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。具体的には、９００ｍＬの培養上清を、平衡化バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）により平衡化したＤＥＡＥカラム（１ＣＶ＝６０．６ｍＬ）にアプライした後、溶出バッファーＢ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）を０％（１５ＣＶ）から１００％（５ＣＶ）までのグラジエント条件でアプライして溶出させた。フラクションサイズは３０．３ｍＬとした。
　ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）蛋白質が含まれているフラクション（３～６番目のフラクション）をまとめて回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を図４に示す。図４中、「Ｇａｓ２削除後」がＡ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株の培養液の精製画分のＣＢＢ染色像であり、「Ｇａｓ２削除前」がＡ８－ｈＴＦ（１）株の培養液の精製画分のＣＢＢ染色像である。図４のＣＢＢ染色像に示す通り、Ａ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株の培養液の精製画分では、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）蛋白質のバンドのみが検出され、１回のＤＥＡＥクロマトグラフィーのみでｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）蛋白質を他の蛋白質から分離して高純度に精製可能であることが確認できた。一方で、Ａ８－ｈＴＦ（１）株の培養液の精製画分では、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）蛋白質に加えてより高分子側に複数のバンドが検出された。このうち１１５ｋＤａ付近のバンドは、切り出してＮ末端配列解析を行ったところ、Ｇａｓ２であることが確認された。Ｇａｓ２の分泌は、通常の菌体密度での培養では明確に確認されなかったことから、高密度培養特有の現象と考えられた。Ａ８－ｈＴＦ（１）株では、ｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）に加えてＧａｓ２の分泌生産量も増大することから、Ａ８－ｇａｓ２Δ－ｈＴＦ（１）株よりもｈＴＦ（Ｎ４１３Ｑ／Ｎ６１１Ｑ）の分泌生産量が低く抑えられてしまっていることが示唆された。
　なお、２０１６年０１月１２日に出願された日本特許出願２０１６－００３６０６号の明細書、特許請求の範囲、要約書および図面の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (15)

  1. 　シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、トランスフェリン遺伝子と、前記トランスフェリン遺伝子の上流域に存在し、前記宿主内で機能する分泌シグナルペプチドが結合したトランスフェリンを発現させる分泌シグナルペプチド遺伝子とを有し、前記宿主が本来有するＧａｓ２遺伝子が削除または不活性化されていることを特徴とする形質転換体。
  2. 　前記トランスフェリン遺伝子が哺乳動物由来の天然型のＴＦ蛋白質またはその改変蛋白質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　前記トランスフェリン遺伝子がヒト・トランスフェリンまたはその改変蛋白質をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の形質転換体。
  4. 　前記トランスフェリン遺伝子が、哺乳動物が有する天然型のトランスフェリンをコードする遺伝子に変異が導入された変異トランスフェリン遺伝子であり、前記変異トランスフェリン遺伝子が、天然型トランスフェリンの少なくとも１箇所のＮ結合型糖鎖修飾部位であるアスパラギン残基が欠失または他のアミノ酸残基に置換された変異トランスフェリンをコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の形質転換体。
  5. 　前記トランスフェリン遺伝子が、ヒトが有する天然型のトランスフェリンをコードする遺伝子に変異が導入された変異トランスフェリン遺伝子である、請求項４に記載の形質転換体。
  6. 　前記宿主が本来有する少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の形質転換体。
  7. 　前記プロテアーゼ遺伝子が、メタロプロテアーゼ遺伝子群、セリンプロテアーゼ遺伝子群、システインプロテアーゼ遺伝子群およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　前記プロテアーゼ遺伝子が、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子およびｐｐｐ２０遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項６または７に記載の形質転換体。
  9. 　前記トランスフェリン遺伝子が、分泌シグナルペプチドを含む分泌キャリア蛋白質をコードする遺伝子の下流に直接または間接的に連結されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の形質転換体。
  10. 　前記分泌キャリア蛋白質をコードする遺伝子が、前記宿主のＰＤＩ１の分泌シグナルペプチド部分をコードする遺伝子とヒトのＰＤＩ1のａｂドメイン部分をコードする遺伝子と前記宿主のＰＤＩ１のｘドメイン部分をコードする遺伝子との融合遺伝子である、請求項９に記載の形質転換体。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の形質転換体を液体培地中で培養し、該液体培地からトランスフェリンを取得することを特徴とする、トランスフェリンの製造方法。
  12. 　前記形質転換体を、ｐＨ５．５～６．５の液体培地中で培養する、請求項１１に記載のトランスフェリンの製造方法。
  13. 　前記形質転換体を、アデニンを含有する液体培地中で培養する、請求項１１または１２に記載のトランスフェリンの製造方法。
  14. 　前記形質転換体を、菌体密度（ＯＤ６６０）が１００以上になるまで培養した後、該液体培地からトランスフェリンを取得する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のトランスフェリンの製造方法。
  15. 　シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、前記宿主内で機能する分泌シグナルペプチド遺伝子と、前記分泌シグナルペプチド遺伝子の下流に位置するトランスフェリン遺伝子とを組込むこと、および、前記宿主が本来有するＧａｓ２遺伝子を削除または不活性化することを特徴とする形質転換体の製造方法。
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