JPWO2017122638A1 - 形質転換体、およびトランスフェリンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
該形質転換体としては、TF遺伝子がヒト・トランスフェリンをコードする遺伝子であることが好ましい。
また、該形質転換体としては、TF遺伝子が、哺乳動物が有する天然型のTFをコードする遺伝子に変異が導入された変異TF遺伝子であり、変異TF遺伝子が、天然型TFの少なくとも1箇所のN結合型糖鎖修飾部位であるアスパラギン残基が欠失または他のアミノ酸残基に置換された変異TFをコードする遺伝子であることが好ましい。
また、該形質転換体としては、宿主が本来有する少なくとも1種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されていることが好ましい。プロテアーゼ遺伝子としては、メタロプロテアーゼ遺伝子群、セリンプロテアーゼ遺伝子群、システインプロテアーゼ遺伝子群およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群からなる群から選ばれる遺伝子であることがより好ましい。削除または不活性化されるプロテアーゼ遺伝子としては、psp3遺伝子、isp6遺伝子、ppp53遺伝子、ppp16遺伝子、ppp22遺伝子、sxa2遺伝子、ppp80遺伝子およびppp20遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子であることがさらに好ましい。
また、該形質転換体としては、TF遺伝子が、分泌シグナルペプチドを含む分泌キャリア蛋白質をコードする遺伝子の下流に直接または間接的に連結されていることが好ましく、分泌キャリア蛋白質をコードする遺伝子が、宿主のPDI1の分泌シグナルペプチド部分をコードする遺伝子とヒトのPDI1のabドメイン部分をコードする遺伝子と宿主のPDI1のxドメイン部分をコードする遺伝子との融合遺伝子であることがより好ましい。
該TFの製造方法としては、形質転換体を、pH5.5〜6.5の液体培地中で培養することが好ましく、形質転換体を、アデニンを含有する液体培地中で培養することも好ましく、形質転換体を、菌体密度(OD660)が100以上になるまで培養した後、該液体培地からトランスフェリンを取得することも好ましい。
また、本発明に係るTFの製造方法により、S.ポンベを用いて、高い生産性でTFを分泌産生できる。
本発明において、「TF遺伝子」とは、成熟型のTF蛋白質をコードする構造遺伝子をいう。また、成熟型のTF蛋白質を、以下、「TF蛋白質」という。
本発明に係る形質転換体は、S.ポンベを宿主とし、TF遺伝子と、TF遺伝子の上流域に存在し、宿主内で機能する分泌シグナルペプチドが結合したTF蛋白質を発現させる、分泌シグナルペプチド遺伝子とを有し、宿主が本来有するGas2遺伝子が削除または不活性化されていることを特徴とする。
本発明に係る形質転換体が有するTF遺伝子が、N結合型糖鎖修飾部位を消失させる変異が導入された変異TF蛋白質をコードする変異TF遺伝子である場合には、該形質転換体を培養することにより、TFの機能が安定しており、かつ品質が均質な組換えTF蛋白質を分泌生産できる。たとえば、該変異TF遺伝子としては、天然型のhTF蛋白質が有する2箇所のN結合型糖鎖修飾部位(432番目および630番目のアスパラギン酸残基)のうち、少なくも1箇所のN結合型糖鎖修飾部位であるアスパラギン残基が欠失または他のアミノ酸に置換された変異TF蛋白質をコードする変異TF遺伝子が好ましく、2箇所のN結合型糖鎖修飾部位がいずれもアスパラギン残基以外のアミノ酸残基に置換された変異TF蛋白質をコードする変異TF遺伝子がより好ましく、2箇所のN結合型糖鎖修飾部位がいずれもグルタミン残基に置換された変異TF蛋白質をコードする変異TF遺伝子(配列番号2)がさらに好ましい。
本発明に係る形質転換体としては、TFの分泌産生能がより高められるため、該分泌キャリア蛋白質としては、上流側から順に、S.ポンベのPDI1の分泌シグナルペプチド遺伝子とヒトのPDI1のabxドメイン部分をコードする遺伝子またはヒトのPDI1のabb’xドメイン部分をコードする遺伝子とが直接または間接的に連結した融合遺伝子、S.ポンベのPDI1の分泌シグナルペプチド遺伝子とヒトのPDI1のabドメイン部分をコードする遺伝子またはヒトのPDI1のabb’ドメイン部分をコードする遺伝子とS.ポンベのPDI1のxドメイン部分をコードする遺伝子とが直接または間接的に連結した融合遺伝子が好ましい。
メタロプロテアーゼ遺伝子群:cdb4(SPAC23H4.09)、mas2(SPBC18E5.12c)、pgp1(SPCC1259.10)、ppp20(SPAC4F10.02)、ppp22(SPBC14C8.03)、ppp51(SPAC22G7.01c)、ppp52(SPBC18A7.01)、ppp53(SPAP14E8.04)。
セリンプロテアーゼ遺伝子群:isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006.01)、sxa2(SPAC1296.03c)。
システインプロテアーゼ遺伝子群:ppp80(SPAC19B12.08)、pca1(SPCC1840.04)、cut1(SPCC5E4.04)、gpi8(SPCC11E10.02c)。
アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群:sxa1(SPAC26A3.01)、yps1(SPCC1795. 09)、ppp81(SPAC25B8.17)。
該形質転換体の培養のための液体培地には、公知の酵母培養培地を用いることができ、シゾサッカロミセス属酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、シゾサッカロミセス属酵母の培養を効率良く行えるものであればよい。液体培地としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
液体培地としては、たとえば、MMA(Minimal medium with agar)、SDC(Synthetic dextrose complete medium)、TES(0.5% Bacto-yeast extract,3% glucose,supplemented with uracil,leucine, histidine,lysine,adenine)、YES(0.5% Bacto-yeast extract, 3% glucose, supplemented with uracil, leucine, histidine, lysine, adenine)、YPD(1% Bacto-yeast extract,2% Bactopeptone,2% glucose)等が挙げられる。
また、培養温度は、23〜37℃であることが好ましく、30〜32℃であることがさらに好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
S.ポンベを宿主とし、SP−TF遺伝子を有する形質転換体(TF発現株)を液体培地中で培養すると、培養後の該液体培地に分泌されたTF蛋白質を取得できる。TF発現株を培養する液体培地や培養方法は、本発明に係る形質転換体の培養と同様に、公知の酵母培養培地を用い、公知の培養方法で行うことができる。
TF蛋白質の分泌生産量をより高くできるため、TF発現株を培養する培養時間は、2日以上が好ましく、3〜6日間がより好ましく、3〜5日間がさらに好ましい。
TF発現株を培養する液体培地はアデニンを含有していることが好ましい。TF発現株が1コピー以上のSP−TF遺伝子を有する場合には、溶菌しやすく、TFの発現量が低下する傾向がある。アデニン含有液体培地中で培養することにより、1コピー以上のSP−TF遺伝子を有するTF発現株であっても、良好に増殖し、TFの分泌生産効率が高くなる。液体培地のアデニン含有量は、たとえば、菌体密度を示すOD660あたりで0.5〜200mg/L、好ましくは1〜100mg/Lにできる。
<hTF変異体の遺伝子の作製>
天然型のhTF遺伝子のORF(配列番号1)は、19残基の分泌シグナルペプチドの下流にhTF蛋白質が融合した全長698残基の蛋白質をコードしている。ヒトcDNAライブラリーを鋳型にして、プライマーペア(Forward primer #9220(配列番号3)およびReverse primer #9221(配列番号4))を用いたPCRを行い、hTF蛋白質をコードする遺伝子の5’末端側に制限酵素サイトAflIIとヒトPDI1のabxドメインのC末端部分の4残基(Leu−Lys−Lys−Arg)をコードする塩基配列を、3’末端側に制限酵素サイトXbaIをそれぞれ付加したDNA断片を得た。
pSL6P3−hTF(N413Q/N611Q)をAflIIとXbaIで二重消化したhTF(N413Q/N611Q)のコード領域を含むDNA断片を、hCMVプロモーター下流に、S.ポンベのPDI1の分泌シグナルペプチドとヒトのPDI1のabドメインとS.ポンベのPDI1のxドメインからなる分泌キャリア蛋白質(PDI1(SP)−Hsabx)をコードする遺伝子を配し、該遺伝子とLPIターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備える分裂酵母の染色体単座組込み型分泌発現ベクターpSL6PDI1(SP)Hsabx−AflIIのAflIIとXbaIの二重消化産物にライゲーションにより組込み、大腸菌DH5αへの形質転換を行うことによって、分泌キャリア蛋白質(PDI1(SP)−Hsabx)と変異型hTF(N413Q/N611Q)蛋白質の融合蛋白質の染色体単座組込み型発現ベクターであるpSL6PDI1(SP)Hsabx−hTF(N413QN611Q)(8749bp、図1)を作成した。
S.ポンベのロイシン・ウラシル要求性(leu1− ura4−)株(遺伝子型:h− leu1−32 ura4−D18)であるARC010株に対して、Latour法により、psp3遺伝子、isp6遺伝子、ppp53遺伝子、ppp16遺伝子、ppp22遺伝子、sxa2遺伝子、ppp80遺伝子、およびppp20遺伝子の8遺伝子を削除したA8株(遺伝子型:h−leu1−32 psp3−D13 isp6−D14 oma1−D10 ppp16−D20 fma2−D13 sxa2−D15 aap1−D17 ppp80−D11)を作製した。A8株は、ロイシン要求性株であった。より詳細には、Latour法は、遺伝子削除断片(Latour断片: 両末端の相同組換え領域、それで挟まれたura4+マーカー遺伝子とOL(オーバーラップ配列)領域からなる)を分裂酵母ゲノム上の削除対象領域の上流または下流に一旦相同組換えで組込み、潜在株を作製した。次いで、該潜在株を5’−FOAを含む培地で培養し、組込まれたOL間で相同組換えを起こし、ura4+マーカー遺伝子を含む削除標的領域が脱落した遺伝子削除株をコロニーとして形成させた。得られた遺伝子削除株は、目的の遺伝子が削除されていることをPCRにより確認した。該方法では、ura4+マーカー遺伝子を含む外来遺伝子が残らないため、外来遺伝子を組込むことなく目的の遺伝子のみを削除できる上、ura4+マーカー遺伝子をリサイクルしながら繰り返し遺伝子削除が行える。各遺伝子を削除するためのLatour断片をPCRにより作製する際に用いたプライマーの塩基配列を表1に示す。
A8株に対して、Latour法により、Gas2遺伝子を削除したA8−gas2Δ株(遺伝子型:h−leu1−32 psp3−D13 isp6−D14 oma1−D10 ppp16−D20 fma2−D13 sxa2−D15 aap1−D17
ppp80−D11 gas2−D15)を作製した。得られた遺伝子削除株は、目的の遺伝子が削除されていることをPCRにより確認した。A8−gas2Δ株は、ロイシン要求性株であった。Gas2遺伝子を削除するためのLatour断片をPCRにより作製する際に用いたプライマーの塩基配列を表2に示す。
pSL6PDI1(SP)Hsabx−hTF(N413QN611Q)を制限酵素NotIで切断して線状化したベクター断片(6993bp)を調製し、該ベクター断片を、酢酸リチウム法を用いて、ロイシン要求性S.ポンベであるA8株またはA8−gas2Δ株を宿主として形質転換を行なった。形質転換処理後の菌体を、MMAプレートに塗布し、ロイシン要求性が相補されて形成したコロニーを組換え体クローンとして取得した。その後、PCRにより目的遺伝子が正しく導入されたことが確認されたクローンをポジティブクローン(hTF(N413Q/N611Q)発現株)として選択した。A8株およびA8−gas2Δ株にpSL6PDI1(SP)Hsabx−hTF(N413QN611Q)を導入した形質転換体をそれぞれA8−hTF(1)株およびA8−gas2Δ−hTF(1)株と命名した。
A8−hTF(1)株およびA8−gas2Δ−hTF(1)株を培養し、hTF(N413Q/N611Q)を分泌発現させた。具体的には、ガラス試験管を用いて5mLのYES中で約24時間ずつ起こし培養と前培養を行なった後、ガラス試験管を用いて5mLのYPD+MES培地(YPDに0.3MのMESバッファーを含有させた液体培地)(pH6.0)中で、32℃、3日間または5日間振盪培養した。培養終了時点における菌体密度(最終到達OD660)は、30〜36であった。培養液から回収した培養液上清画分と菌体ペレットのそれぞれについて、SDS−PAGE解析を行い、hTF(N413Q/N611Q)が菌体内外に発現されたことを確認した(図示せず。)。また、A8−hTF(1)株およびA8−gas2Δ−hTF(1)株のいずれにおいても、3日間培養したものよりも5日間培養したもののほうが、菌体ペレット中のhTF(N413Q/N611Q)量が少なく、培養上清中のhTF(N413Q/N611Q)量が多かったことから、培養時間を延長することにより、hTF(N413Q/N611Q)の分泌量を増加させ、未分泌の菌体内に残留量を少なくできることがわかった。
A8−gas2Δ−hTF(1)株を培養し、hTF(N413Q/N611Q)を分泌発現させた。具体的には、ガラス試験管を用いて5mLのYES中で約24時間ずつ起こし培養と前培養を行なった後、24穴プレートを用いて5mLのアデニン含有YPD+MES培地(pH6.0)中で、32℃、3日間、4日間、または5日間振盪培養し、市販のキット(製品名:「Human Transferrin ELISA Quantitation Set」、Bethyl Laboratories社製)を用いてELISAを行い、培養終了後の培養上清中に分泌されたhTF(N413Q/N611Q)の蛋白質量を測定した。培養時間が長くなるほど、hTF(N413Q/N611Q)の分泌量は多くなった。また、培養5日間における培養上清当たりのhTF(N413Q/N611Q)の分泌量は、A8−gas2Δ−hTF(1)株が30〜40mg/Lであった。
A8−hTF(1)株およびA8−gas2Δ−hTF(1)株を培養し、hTF(N413Q/N611Q)を高密度培養し、分泌発現させた。具体的には、5Lの培養スケールで、培養槽の通気速度、撹拌速度、流加培地の添加速度を制御しながら、培養液のpHを5.5〜6.0に調節した条件で、初発培地と流加培養を行った。液体培地としては、アデニン含有の半合成培地(数%のBacto-yeast extract、グルコース、ビタミン類、ミネラル類、無機塩類など各合成成分)を用いた。グルコース濃度を2%に低く抑えながら、増殖速度や栄養消費速にあわせて培地を継続的に添加(流加)した。最終的には、菌体密度(OD660)は200〜800程度になった。
なお、2016年01月12日に出願された日本特許出願2016−003606号の明細書、特許請求の範囲、要約書および図面の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (15)
- シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、トランスフェリン遺伝子と、前記トランスフェリン遺伝子の上流域に存在し、前記宿主内で機能する分泌シグナルペプチドが結合したトランスフェリンを発現させる分泌シグナルペプチド遺伝子とを有し、前記宿主が本来有するGas2遺伝子が削除または不活性化されていることを特徴とする形質転換体。
- 前記トランスフェリン遺伝子が哺乳動物由来の天然型のTF蛋白質またはその改変蛋白質をコードする遺伝子である、請求項1に記載の形質転換体。
- 前記トランスフェリン遺伝子がヒト・トランスフェリンまたはその改変蛋白質をコードする遺伝子である、請求項1または2に記載の形質転換体。
- 前記トランスフェリン遺伝子が、哺乳動物が有する天然型のトランスフェリンをコードする遺伝子に変異が導入された変異トランスフェリン遺伝子であり、前記変異トランスフェリン遺伝子が、天然型トランスフェリンの少なくとも1箇所のN結合型糖鎖修飾部位であるアスパラギン残基が欠失または他のアミノ酸残基に置換された変異トランスフェリンをコードする遺伝子である、請求項1または2に記載の形質転換体。
- 前記トランスフェリン遺伝子が、ヒトが有する天然型のトランスフェリンをコードする遺伝子に変異が導入された変異トランスフェリン遺伝子である、請求項4に記載の形質転換体。
- 前記宿主が本来有する少なくとも1種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の形質転換体。
- 前記プロテアーゼ遺伝子が、メタロプロテアーゼ遺伝子群、セリンプロテアーゼ遺伝子群、システインプロテアーゼ遺伝子群およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項6に記載の形質転換体。
- 前記プロテアーゼ遺伝子が、psp3遺伝子、isp6遺伝子、ppp53遺伝子、ppp16遺伝子、ppp22遺伝子、sxa2遺伝子、ppp80遺伝子およびppp20遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項6または7に記載の形質転換体。
- 前記トランスフェリン遺伝子が、分泌シグナルペプチドを含む分泌キャリア蛋白質をコードする遺伝子の下流に直接または間接的に連結されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の形質転換体。
- 前記分泌キャリア蛋白質をコードする遺伝子が、前記宿主のPDI1の分泌シグナルペプチド部分をコードする遺伝子とヒトのPDI1のabドメイン部分をコードする遺伝子と前記宿主のPDI1のxドメイン部分をコードする遺伝子との融合遺伝子である、請求項9に記載の形質転換体。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の形質転換体を液体培地中で培養し、該液体培地からトランスフェリンを取得することを特徴とする、トランスフェリンの製造方法。
- 前記形質転換体を、pH5.5〜6.5の液体培地中で培養する、請求項11に記載のトランスフェリンの製造方法。
- 前記形質転換体を、アデニンを含有する液体培地中で培養する、請求項11または12に記載のトランスフェリンの製造方法。
- 前記形質転換体を、菌体密度(OD660)が100以上になるまで培養した後、該液体培地からトランスフェリンを取得する、請求項11〜13のいずれか一項に記載のトランスフェリンの製造方法。
- シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、前記宿主内で機能する分泌シグナルペプチド遺伝子と、前記分泌シグナルペプチド遺伝子の下流に位置するトランスフェリン遺伝子とを組込むこと、および、前記宿主が本来有するGas2遺伝子を削除または不活性化することを特徴とする形質転換体の製造方法。
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