HU208552B - Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts - Google Patents

Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts Download PDF

Info

Publication number
HU208552B
HU208552B HU864480A HU448086A HU208552B HU 208552 B HU208552 B HU 208552B HU 864480 A HU864480 A HU 864480A HU 448086 A HU448086 A HU 448086A HU 208552 B HU208552 B HU 208552B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
pichia
fragment
dna
dna fragment
Prior art date
Application number
HU864480A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44612A (en
Inventor
James Michael Cregg
Original Assignee
Phillips Petroleum Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Phillips Petroleum Co filed Critical Phillips Petroleum Co
Publication of HUT44612A publication Critical patent/HUT44612A/hu
Publication of HU208552B publication Critical patent/HU208552B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás Pichia nembeli élesztők genomjának helyspecifíkus módosítására a genom előre meghatározott helyén, amelynél
- valamely, a Pichia nemhez tartozó élesztőtörzs genomiális DNS-ének szakaszaival homológ DNS fragmens belső szakaszát valamely, egy szelektálható marker gént és adott esetben egy szabályozó szakaszt és egy heterológ gént tartalmazó DNS fragmenssel helyettesítik oly módon, hogy beépített DNS fragmensként mind az 5’-végnél, mind a 3’-végnél legalább 200 nukleotidot megtartanak a Pichia nemhez tartozó élesztőtörzs genomiális DNS-ének szakaszaival homológ DNS fragmensből, és
- a fenti DNS fragmenssel egy Pichia nembeli élesztőtörzset transzformáinak.
A találmány további tárgya eljárás polipeptidek előállítására Pichia pastoris AOX 5 gazdasejtekben.
A leírás terjedelme: 30 oldal (ezen belül 19 lap ábra)
CQ
HU 208 552
HU 208 552 Β
A találmány tárgya eljárás Pichia nembeli élesztők genomjának helyspecifikus módosítására, és polipeptidek előállítására.
A találmány szerinti megoldás a rekombináns DNS-technológia területére vonatkozik. A találmány tárgya közelebbről élesztő integratív transzformációja, élesztő helyspecifikus mutációja.
A rekombináns DNS technológia az utóbbi években jelentős fejlődésen ment keresztül, mikroorganizmusok szabályozott termelésével nagyszámú hasznos polipeptid előállítása vált lehetővé. Számos eukariota polipeptid, például a humán növekedési hormon, a leukocita interferon, a humán inzulin és a humán proinzulin több mikroorganizmusból is előállítható. A technológia folyamatos fejlesztésével a jövőben lehetővé válik, hogy mikroorganizmusok számos további hasznos polipeptidet előállítsanak. A rekombináns technológiában gyakran alkalmazott alapelem a plazmid, amely extrakromoszomális, kétszálú DNS, amely számos mikroorganizmusban megtalálható. Természetes eredetű mikroorganizmusokban a plazmid általában több példányban fordul elő sejtenként. A természetes eredetű plazmidokon kívül számos mesterséges plazmidot és hibridvektort állítottak elő. A gazdasejt azonban nem mindig képes a plazmid megtartására. Ehelyett a sejt elveszti plazmidtermelő képességét, és néhány generáció múlva a plazmid eltűnik. Idegen DNS stabil beépítése megfelelő gazdaszervezetbe tehát nagy jelentőségű és fontos eljárás.
Polipeptidek előállítására alkalmazott rekombináns DNS technológiában gazdaszervezetként a mai napig általában az Escherichia coli-t alkalmazzák annak ellenére, hogy számos esetben az E. coli nem alkalmas gazdasejtként. Például az E. coli számos toxikus pirogenikus faktort tartalmaz, amelytől a gyógyászati célra termelt polipeptidet meg kell tisztítani. A szükséges tisztítás hatékonysága természetesen az adott polipeptidtől függ. Ezen túlmenően az E. coli proteolitikus aktivitása több hasznos termék kitermelését korlátozza. További hátrány, hogy az E. coli által termelt több heterogén géntermék oldhatatlan formában nyerhető ki. Ezen, és egyéb okok miatt az érdeklődés egyre inkább alternatív gazdaszervezetek felé fordult. Ennek következtében növekszik az eukarióta szervezetek alkalmazása polipeptidek termelésére.
Polipeptidek eukarióta rendszerek, például élesztő segítségével történő előállítása jelentős előnyökkel rendelkezik a rekombináns DNS-sel kódolt polipeptidek prokarióta rendszerek, például E, coli által történő előállításához képest. Az élesztőt fermentációk széles skálájához alkalmazzák évszázadok óta, viszonyítva az E. coli fermentációk újkeletű felhasználásához. Az élesztő általában nagyobb sejtsűrűségig tenyészthető, mind a baktérium, és könnyen alkalmazható folyamatos fermentációhoz. A 4414329 számú USA-beli szabadalmi leírás élesztők, így a Pichia pastoris tenyésztését ismerteti egészen magas, 100 g/1 feletti sejtsűrűségig. Az élesztők további előnye, hogy a szervezet számos életfunkciója, például az oxidatív foszforilezés, sejtszervecskéken belül játszódik le, és így nincs kitéve az eredeti gazdasejttől idegen polipeptid termelés által kiváltott esetleges káros tényezőknek. Mint eukarióta szervezet, az élesztő képes lehet a kifejezett polipeptid termék glikozilálására, amely fontos olyan esetekben, amikor a polipeptid termék bioaktivitását a glikozilálás biztosítja. Lehetséges továbbá az is, hogy az élesztő, mint eukarióta szervezet, ugyanazokat az előnyös kódokat tartalmazza, mint magasabb szervezetek, ami tovább növeli az emlős génekből, vagy' például emlős mRNS-sel végrehajtott reverz transzkripcióval nyert kiegészítő DNS-ből származó termékek termelésének hatékonyságát.
Kevéssé ismert élesztőfajták gazda/vektor rendszerként történő alkalmazását gyakran gátolja a transzformáció körülményeinek hiányos ismerete, valamint az idegen DNS gazdasejtbe történő stabil bevitelének nehézkessége. Ezen túlmenően, az auxotrofikus mutáció gyakran nem lehetséges, ami kizárja a transzformáit termékek közvetlen szelekcióját az auxotrofikus komplementáció segítségével. A rekombináns DNS technológia fejlesztésének feltétele, hogy olyan új gazda/vektor rendszereket kell találni, amelyek lehetővé teszik a DNS kezelését, a bevitt DNS szekvencia optimális kifejeződését és ezáltal a kívánt polipeptid termék nagy kitermeléssel történő szabályozott előállítását.
A találmány értelmében új eljárást fejlesztettünk ki Pichia nembeli élesztő genomjának helyspecifikus módosítására.
Ha az élesztőt olyan lineáris DNS fragmenssel transzformáljuk, amely mindkét végén inszertálható DNS szekvenciát, vagyis a gazda genomjával homológ szekvenciát tartalmaz, ahol mindegyik hossza legalább 200 nukleotid és legalább egy további DNS fragmenst, például szelektálható markert tartalmaz, a markert és az oldalról beépíthető DNS szekvenciát a gazda nagy gyakorisággal felveszi. A lineáris DNS-sel végrehajtott transzformáció eredményeként módosított élesztőtörzset kapunk, amelyben a DNS szekvencia a beépülés helyén szétroncsolódott és/vagy kitörlődött, és a szelektálható marker, valamint minden olyan DNS, amely a transzformált lineáris DNS ffagmens részét képezte, a gazdaélesztő genomjába beépült.
A gazdaélesztő genomjába a fenti módon beépített idegen DNS a gazdában több generáción keresztül stabilan fennmarad. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi az idegen DNS-nek a plazmid instabilitása miatt bekövetkező elvesztése kiküszöbölését, amikor az idegen DNS egy önmagában replikálódó extrakromoszomális fragmens részét képezi, vagy amikor az idegen DNS beépül a genomba a kör DNS molekula részeként. Ilyen kör DNS molekula beépülés akkor következik be, ha olyan idegen DNS szekvenciát építünk be, amelyet a gazda genom szekvenciák közvetlen ismétlődése vesz közre. Mivel az ilyen közvetlen ismétlődő szekvenciák a további rekombináció alapját képezik, a közé beépített idegen DNS nem eléggé stabil.
A genom találmány szerinti helyspecifikus módosítása lehetővé teszi olyan mutánsok előállítását, amelyben teljesen vagy adott szakaszában hiányzik a specifi2
HU 208 552 Β kus gén. Ha a mutációra kiszemelt gén lényeges részét elimináljuk, úgy gyakorlatilag nullára csökkentjük a mutáció reverziójának valószínűségét. így a találmány szerinti mutációval kapott törzsek nagyon stabil mutánst képeznek.
A genom találmány szerinti helyspecifikus módosítása a szakember számára ismert in vitro rekombináns DNS technikával együtt lehetővé teszi a gazdasejt genomjának tetszőleges és pontos módosítását, például egy vagy több idegen gén beépítését a gazda genomba, a natív gének kifejeződését szabályozó szekvenciák megváltoztatását, valamint a natív gének idegen génekre történő kicserélését.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a Pichia nembeli törzseknél idegen gének metanollal indukált kifejeződése jelentős mértékben fokozódik, ha a gén kifejeződéshez gazdasejtként olyan Pichia törzset alkalmazunk, amelyben a primer alkohol oxidáz gént szétroncsoljuk.
Azt találtuk továbbá, hogy a Pichia pastoris törzs egy második alkohol oxidáz génnel is rendelkezik, amely lehetővé teszi, hogy a gazdatörzs, amelynek primer alkohol oxidáz génjét elroncsoltuk, metanolon továbbra is növekedjék, bár a natív Pichia pastorishoz képest csökkentett mértékben.
Az ábrák rövid ismertetése:
1. ábra a pYMIl plazmid hasítási térképét ábrázolja,
2. ábra a pYMIl plazmid egy részének a Pichia kromoszóma HIS 4 helyére történő beépítését ábrázolja,
3. ábra a pYJ8 plazmid hasítási térképe,
4. ábra a pYMI3 A plazmid hasítási térképe,
5. ábra a pYHMI3A plazmid egy részének a Pichia kromoszóma HIS4 helyére történő beépítését ábrázolja,
6. ábra a pBPGl-1 plazmid hasítási térképe,
7. ábra a pYMI7 plazmid hasítási térképe,
8. ábra a pYMI7 plazmid egy részének a Pichia kromoszóma alkohol oxidáz helyére történő beépítését ábrázolja,
9. ábra a pYM39 plazmid előállítását ábrázolja pSAOH5 és pTHBS3 plazmidokból,
10. ábra a pYMI6 plazmid előállítását ábrázolja a pYM39 és pPG3.2 plazmidokból,
11. ábra a pBSAGI5I plazmid előállítását ábrázolja a pYMIó és pBSAG5I plazmidokból,
12. ábra all. ábrához viszonyítva nagyobb részletességgel a pBSAGI5I plazmid hasítási térképét,
13. ábra a pBSAGI5I plazmid egy részének a Pichia kromoszóma alkohol oxidáz helyére történő beépítését ábrázolja,
14. ábra a pXMI12A plazmid hasítási térképe,
15. ábra a pYMI12A plazmid egy részének a második Pichia alkohol oxidáz gén (A0X2) helyére történő beépítését ábrázolja,
16. ábra a Pichia beillesztések hasítási térképe a pBR322-n alapuló pPG4.0 és pPG3.0 plazmidokban,
16a ábrán lévő betoldás az első Pichia alkohol oxidáz gén (A0X1) helyéről származik, míg a
16b ábrán lévő betoldás a második Pichia alkohol oxidáz gén (AOX2) helyéről származik,
16c ábra az AOX1 génhely ismert alkohol oxidáz (AOX) kódoló részét tartalmazza (hivatkozva a 16a ábrára),
17. ábra a pXM25 plazmid hasítási térképe,
18. ábra a pT76H3 plazmid hasítási térképe,
19. ábra a KpnI hasítási hely BglII hellyé történő átalakítását mutatja,
20. ábra a BamHI hasítási hely „fiiing in” módszerrel történő roncsolását mutatja.
Az alkalmazott restrikciós enzimet a továbbiakban az alábbi rövidítésekkel jelöljük:
Rövidítések Restrikciós enzimek
As AsuII
B BamHI
b2 BglII
C Clal
Rí EcoRI
r5 EcoRV
h3 HindlII
Hpi Hpal
Kp KpnI
Nr Nrul
Ps PstI
Pv2 PvuII
Rs Rsal
S Sáli
s3 Sau3Al
Sm Smal
Sp Sphl
St Stul
Th Thai
Xb Xbal
Xh Xhol
A ligálási és klónozási eljárás során elroncsolt felismerő helyeket az ábrákon a zárójelbe tett fenti rövidítésekkel jelöljük. így például a 4. ábrán szereplő „(Rs/Pv2)” az Rsal és PvuII enzimekre utal, amelyek a GTAC és a CAGCGT szekvenciákat ismerik fel. Mindkét enzim szimmetrikusan hasítja a DNS-t, és tompa végű fragmenseket eredményez, ahol az 5’-vég szekvenciája AC és CTG, és a 3’-vég szekvenciája GT és CAG. Ezek a fragmensek keresztbe ligálhatók, és így az eredeti felismerő szekvenciák keverékét (CTCTG és/vagy CAGAC) kapjuk, melyek sem Rasl-gyel, sem PvuII-vel nem hasíthatok.
A találmány értelmében a Pichia nembe tartozó élesztőket a genom előre meghatározott helyén hely3
HU 208 552 Β specifikusan módosítjuk, amelynek során a Pichia nembeli törzseket olyan sorban elrendezett lineáris DNS fragmenssel transzformáljuk, amely egy első beépíthető DNS fragmenst, egy szelektálható marker gént és egy második beépíthető DNS fragmenst tartalmaz. Az első és második beépíthető DNS fragmens mindegyike legalább mintegy 200 nukleotid hosszú és nukleotid szekvenciája homológ a natív Pichia genom módosításra kiszemelt külön szakaszával. A szelektálható marker gén olyan gén, amely szelektálható fenotípust kölcsönöz a befogadó sejtnek, például antibiotikum rezisztencia gén, vagy olyan bioszintetikus gén, amely hatására a sejt fejlődéséhez szükséges tápanyagot szintetizál. Ha a szelektálható marker gén DNS vektoron található, akkor csak azok a sejtek növekednek a különleges fejlődési körülmények között, amelyek befogadták a vektor DNS-t. Fontos, hogy a szelektálható marker gén az első és második beépíthető DNS fragmens között helyezkedjen el, valamint, hogy a beépíthető DNS fragmensek egymáshoz viszonyítva ugyanolyan orientációban helyezkedjen el, mint a lineáris DNS fragmenssel módosítani kívánt gazdasejt genomjában található.
A Pichia-félék találmány szerinti transzformációjához alkalmazott alapelem tehát legalább három komponensből áll:
- első beépíthető DNS fragmens,
- második beépíthető DNS fragmens és
- szelektálható marker gén.
Az első és második beépíthető DNS fragmens hosszúsága legalább mintegy 200 nukleotid, általában mintegy 200-5000 nukleotid hosszúságú. A könnyű kezelhetőség érdekében előnyösen mintegy 5002000 nukleotid hosszúságú fragmenseket alkalmazunk.
Az első és második beépíthető DNS fragmens nukleotid szekvenciája homológ a genomos módosításra kiszemelt natív Pichia genom adott szakaszával. így például, ha a genomos módosítást az alkohol oxidáz gén helyén kívánjuk végrehajtani, úgy az első és második beépíthető DNS fragmens szekvenciája homológ az alkohol oxidáz gén külön szakaszával. A találmány szerinti genom módosítások a két beépíthető DNS fragmens orientációja a lineáris fragmensen belül azonos a Pichia genom relatív orientációjával.
A találmány értelmében a transzformáláshoz alkalmazott DNS három kötelező komponense sorban elrendezve egy lineáris DNS fragmenst képez, amelyben a szelektálható marker gén az első beépíthető fragmens és a második beépíthető fragmens között helyezkedik el. A szelektálható marker génre nem korlátozó jellegű példaként említhető a Pichia pastoris és Saccharomyces cerevisiae ARG4 génje, a Pichia pastoris és S. cerevisiae HIS4 génje, az E. coli TnóOl transzponálható elemjének G418 foszfor-transzferáz génje, valamint más hasonló gének. Szakember számára nyilvánvaló, hogy számos megfelelő közbezáró-szekvencia, vagyis első és második beépíthető DNS fragmens vezethető le azokból a génekből, amelyek a Pichia pastoris genomból izolálhatok. Ezekre a génekre nem korlátozó jellegű példaként említhető az alkohol oxidáz gén [(AOX1 és AOX2), a Pichia két alkohol oxidáz gént tartalmaz], a dihidroxiaceton szintáz gén (DA), az argininszukcináz liáz gén (ARG4), a hisztidinol dihidrogenáz gén (HIS4) és más hasonló gének.
A transzformáláshoz alkalmazott lineáris DNS fragmens számos más DNS szekvenciát, például heterológ géneket is tartalmazhat, vagyis olyan géneket vagy génszakaszokat, amelyek általában nem találhatók meg a gazdasejt genomjának beépítéséhez kiszemelt helyén, amely a P. pastorisban kifejeződik. A heterológ kifejezés általában olyan DNS-t jelöl, amely nem található meg a Pichia gazdasejtben. A heterológ gén kívánt esetben szabályozó szakasszal kombinálható, amely önállóan szabályozza a heterológ gén termékének termelését, vagy a heterológ gén kifejeződhet a transzformált sejtben a transzformálás folyamán szétroncsolt gén natív szabályozó szakaszának hatására is.
A találmány értelmében a transzformáláshoz alkalmazott lineáris DNS fragmens bakteriális plazmid DNS-t is tartalmazhat, például pBR322 vagy pBR325 szekvenciákat. Ezeket a bakteriális szekvenciákat a DNS szekvenciák E. coliban történő in vitro manipulálása és előállítása során alkalmazzák.
A transzformáláshoz különösen előnyösen alkalmazható egy zárt körplazmidba bevitt lineáris DNS, amely egy első beépíthető DNS fragmenst, egy második beépíthető DNS fragmenst, egy szelektálható marker gént és bakteriális plazmid DNS-t tartalmaz. Ez a plazmid további DNS szekvenciákat is tartalmazhat a fentiek szerint.
A zárt körplazmid előnyösen két részből áll, a „transzformáló” részből és a „bakteriális” részből. A transzformáló rész sorba rendezett első beépíthető DNS ffagmensből, szelektálható marker génből és második beépíthető DNS fragmensből áll, ahol az első és második beépíthető DNS fragmens egymáshoz viszonyított orientációja azonos a Pichia genombeli orientációval, a szelektálható marker gén az első beépíthető DNS fragmens és a második beépíthető DNS fragmens között helyezkedik el. A bakteriális rész úgy helyezkedik el, hogy kapcsolódik az első beépíthető DNS fragmenshez és a második beépíthető DNS fragmenshez, és ezáltal zárt, kör alakú vektort képez.
A zárt körvektort E. coliban nagy mennyiségű plazmid előállítására használhatjuk fel, majd a plazmidot izoláljuk és megfelelő restrikciós enzimekkel hasítjuk, és így a transzformáló részt elválasztjuk a bakteriális résztől. Az élesztő DNS lineáris transzformáló részével Pichia törzsek transzformálhatok a kívánt genomos módosítás érdekében.
Természetesen az ismertetett zárt körplazmid transzformáló része további DNS szekvenciákat is tartalmazhat. Például az E. coli segítségével DNS in vitro előállításához alkalmazott bakteriális szekvenciák felhasználhatók a transzformáló DNS-hez, vagyis a bakteriális szekvencia, a szelektálható marker gén szekvenciához hasonlóan, az első beépíthető DNS fragmens és a második DNS fragmens közé helyezhető. A fenti összetételű DNS komponens alkalmazása esetén a bakteriális szekvencia szintén beépül a genomos módosításhoz alkalmazott gazdaélesztő genomjába.
HU 208 552 Β
A Pichia pastoris transzformációját a 4 879 231 számú USA-beli szabadalmi leírás ismerteti. A Pichia pastoris transzformációjának kísérleti megvalósítását később ismertetjük (lásd az 1. példát). A Pichia törzsbeli élesztők transzformálásához a sejtfal enzimatikus hasításával szferoplasztot állítunk elő, amelyet a transzformáló DNS-sel keverünk, és kalcium-ionok és polietilénglikol jelenlétében inkubálunk. Ezután szelektív tápközegben regeneráljuk. A transzformáló DNS egy szelektív markergént tartalmaz, amelynek segítségével kiválaszthatók azok a sejtek, amelyek felvették a transzformáló DNS-t, mivel csak a transzformált sejtek képesek élni és fejlődni az alkalmazott különleges életkörülmények között (a különleges életkörülmények a transzformáló DNS részeként alkalmazott szelektív markeren alapulnak). Ha a heterológ gének kifejezéséhez olyan Pichia törzset alkalmazunk, amelyben a primer alkohol oxidáz gént (AOX1) elroncsoltuk, megfigyelhető, hogy néhány promoter (például AOX1 és/vagy DAS promoter) kontrollja alatt a heterológ géntermék kifejeződése többszörösére nőtt a teljes alkohol oxidázt tartalmazó gazda alkalmazásával elérhető kifejezéshez képest. A fenti jelenség közelebbi vizsgálata kimutatta, hogy heterológ gének gazdaszervezetben történő kifejeződése általánosan fokozható, ha az erős szubsztrátérzékeny promotert tartalmazó gazdatörzset, ahol ez az erős szubsztrátérzékeny promoter szabályozza a heterológ gént, korlátozott életkörülményeket biztosító körülmények között olyan szubsztráton tartjuk, amelyre a promoter érzékeny.
A fent említett korlátozott életlehetőségeket biztosító körülmények megvalósíthatók, ha a sejtet csökkentett mennyiségű tápanyaggal tápláljuk, vagy olyan gazdamutánst alkalmazunk, amelynek életképessége meghatározott körülmények között lecsökken. így például, ha a heterológ gén kifejeződésének fokozását a tápközegben lévő metanolra érzékeny erős alkohol oxidáz vagy dihidroxi-aceton-szintáz promoter segítségével akarjuk szabályozni, a csökkentett életlehetőségeket biztosító körülmények megvalósíthatók, és így a gén kifejeződése fokozható, ha olyan gazdát alkalmazunk, amelyben a metanol felvevőképességet lecsökkentettük, vagy teljes alkohol oxidáz gént tartalmazó gazdát, de kevés metanolt tartalmazó tápközeget alkalmazunk.
Feltehető, hogy a heterológ géntermékek kifejeződésének növelésére fent ismertetett eljárás általánosan használható minden olyan szervezetben, amely táplálkozási korlátokra visszaható promoterrel rendelkezik, így, ha a heterológ gént a promoter régió kontrollja alá helyezzük, majd a gazdaszervezetet olyan korlátozott életlehetőségek között tenyésztjük, amelyek bekapcsolják az erős promotert, a gén kifejeződésének növekednie kell. A korlátozott életlehetőségek előnyösen olyan mutáns gazdaszervezettel biztosíthatók, amelyből hiányzik azoknak a tápanyagoknak lebontási képessége, amelyek biztosítják néhány promoter nagyobb szinten történő kifejeződését, mint a nem mutáns gazdaszervezetben. A Pichia törzs vonatkozásában a fentieket az 5. példában mutatjuk be részletesen.
Ha egy olyan Pichia pastoris törzset, amelyben a primer alkohol oxidáz gént a találmány szerinti genom módosítással elroncsoltunk, szénforrásként metanolon tenyésztünk, meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a primer alkohol oxidáz hiányos törzs még mindig képes metanolon fejlődni, bár az eredeti Pichia sejtekhez képest csökkentett mértékben. Ez a megfigyelés azt mutatja, hogy a metanolt használó Pichia törzsek szekunder alkohol oxidáz génnel rendelkeznek.
A Pichia kromoszomális DNS-ének vizsgálata közben olyan 3 kbp fragmenst izoláltunk, amely feltehetően a szekunder alkohol oxidáz gén (AOX2) egy részét kódolja. A fragmenst pBR322-be építettük be (az egyedi BamHI helyen). A plazmidot pPG3.0 néven jelöljük, és az LE392 E. coli gazda hordozza. Ezt a törzset a Northern Régiónál Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois helyen az NRRL B-18 022 számon deponáltuk abból a célból, hogy a köz által hozzáférhető legyen.
A pPG3.0 hasítási térképét a 16b ábra ábrázolja a primer alkohol oxidáz géz pPG4.0 genom fragmensével összehasonlítva. Ez utóbbi fragmenst a 4808537 számú USA-beli szabadalmi leírás ismerteti részletesen. A két alkohol oxidáz gén (16. ábra) összehasonlítása kimutatja, hogy nem ugyanannak a genom helynek egymást átfedő szakaszairól van szó. Nyilvánvaló, hogy van némi homológia a két fragmens között, ami a két fragmens közös hasítási helyeiből adódik. Az AOX1 és AOX2 gének közös hasítási helyeit a 16. ábrán csillaggal jelöltük. Mindkét fragmensen találhatók azonban olyan hasítási helyek, amelyek nem fordulnak elő a másikban, és ezek a két fragmens nukleotid szintű különbségeire utalnak.
A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi nem korlátozó jellegű példákkal mutatjuk be.
A példákban az alábbi puffereket és oldatokat alkalmaztuk:
1M Trisz puffer 121,1 g Trisz bázis 800 ml vízben, a pH-t koncentrált (35 tömeg%-os) vizes sósavval a kívánt értékre állítjuk, az oldatot hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, mielőtt a végső pH-értékeket meghatározzuk, a végső térfogatot 1 1-re egészítjük ki.
TE puffer 1,0 mmól/1 EDTA, 0,01 mól/1 (pH = 7,4) Trisz pufferben.
LB (Luria-Bertani) közeg 5 g Bacto tripton, 5 g Bactoélesztő extraktum, 2,5 g NaCl, 1 liter vízben, NaOH-val pH = 7,5 értékre állítva.
2B közeg 0,2 tömeg% NH4PO4, 1,2 tömegbe Na2HPO4, 0,013 tömeg% MgSO4x7 H2O, 0,074 tömeg% CaCl2x2 H2O, 2 pg/ml biotin, 1 pg/ml tiamin, 100 pg/ml triptofán, 0,4 tömeg% dextróz, 0,2 tömegbe kazaminsav.
YPD közeg 1 tömeg% Bacto-élesztő extrak5
HU 208 552 Β
SD közeg tűm, 2 tömeg% Bacto pepton, 2 tömeg% dextróz. 6,75 g élesztő nitrogén bázis ami-
SÉD nosavak nélkül (DIFCO), 2 tömegbe dextróz 1 liter vízben. 1 mól/1 szorbitol, 25 mmól/1 ED-
SCE puffer TA, 50 mmól/1 DTT. 9,1 g szorbitol, 1,47 g nátrium-
CaS citrát, 0,168 g EDTA, 50 ml víz, pH = 5,8-ra HCl segítségével. 1 mól/1 szorbitol, 10 mmól/1
PEG oldat CaCl2, szűrve sterilizáljuk. 20 tömeg% polietilénglikol 3350,
SOS 10 mmól/1 CaCl2, 10 mmól/1 Trisz-HCl (pH = 7,4), szűrve sterilizáljuk. 1 mól/1 szorbitol, 0,3xYPD kö-
zeg, 10 mmól/1 CaCl2.
A példákban az alábbi rövidítéseket használjuk:
EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav
SDS = nátrium-dodecil-szulfát
DTT = ditio-treitol.
A példákban az enzimes reakciókat a gyártó előírásai szerint végezzük.
Részleges emésztéskor a megfelelő emésztéshez szükséges időtartamot úgy határozzuk meg, hogy különböző idejű emésztéseket végzünk, gélelektroforézissel meghatározzuk a keletkezett fragmenseket, és kiválasztjuk azt az időt, amelynél a kívánt méretű fragmens keletkezik.
1. példa
Pichia pastoris transzformációs eljárás
A) Sejttenyészet
1. GS115 Pichia pastoris telepet (NRRL Y-15 851) mintegy 10 ml YPD közegre oltunk, és a tenyészetet 30 °C hőmérsékleten 12-20 órán keresztül rázzuk.
2. Mintegy 12-20 óra elteltével a sejteket OD^q = 0,01-0,1 értékre hígítjuk, majd YPD közegen 30 °C hőmérsékleten mintegy 6-8 órán keresztül logaritmikus fejlődési fázisban tartjuk.
3. Mintegy 6-8 óra elteltével 100 ml YPD közeget 0,5 ml OD600 = 0,1 értékű (vagy ezzel ekvivalens mennyiségű) sejttenyészettel inokulálunk, majd 30 °C hőmérsékleten mintegy 12-20 órán keresztül rázzuk.
4. A tenyészetet mintegy OD^ = 0,2-0,3 értéknél (megközelítőleg 16-20 óra) 1500 g/5 perc centrifugálással begyűjtjük.
B) A szferoplaszt kinyerése
1. A sejteket 10 ml steril vízzel mossuk (az 1-5. lépésekben a centrifugálást 1500 g mellett 5 percen keresztül végezzük).
2. A sejteket 10 ml frissen előállított SÉD oldattal mossuk.
3. A sejteket kétszer 10 ml steril 1 mól/1 szorbitol oldattal mossuk.
4. A sejteket 10 ml SÉD pufferben újból szuszpendáljuk.
5. 5-10 μΐ 4 mg/ml Zymolyase 60 000-t (Miles Laboratories) adagolunk, és a sejteket 30 °C hőmérsékleten 30-60 percen keresztül inkubáljuk.
Mivel a szferoplaszt képzés a transzformáció kritikus lépése, a szferoplaszt képződést az alábbi módon ellenőrizzük: 100 μΐ alikvot sejtet adunk 900 μΐ 5% SDS-hez vagy 900 μΐ 1 mól/1 szorbitol oldathoz, mielőtt adagoljuk a zimoliázt, vagy közvetlen az adagolás után és az inkubációs periódus különböző időpontjaiban. Az inkubációt megállítjuk azon a ponton, amikor a sejtek SDS-en roncsolódnak, de szorbitolban épen maradnak (általában 30-60 perc inkubálás között.)
6. A szferoplasztot kétszer 10 ml steril 1 mól/1 szorbitolban 1000 g/5-10 perc centrifugálással mossuk. (A centrifugálás idejét és sebességét változtathatjuk, addig centrifugáljuk, amíg a szferoplaszt pelletet képez, de még nem reped szét az erő hatására.)
7. A sejteket 10 ml steril CaS oldattal mossuk.
8. Az összes sejtet 0,6 ml CaS oldatban szuszpendáljuk.
C) Transzformáció
1. A DNS mintákat (legfeljebb 20 μΐ térfogatig) 12x75 mm méretű steril polipropilén csőbe helyezzük (a DNS-t vízben vagy TE pufferben alkalmazzuk, kis mennyiségű DNS maximális transzformálásához előnyös, ha mintegy 1 μΐ 5 mg/ml, ultrahanggal kezelt E. coli DNS-t adunk minden mintához).
2. 100 μΐ szferoplasztot adunk minden DNS mintához, és szobahőmérsékleten mintegy 20 percen keresztül inkubáljuk.
3. 1 ml PEG oldatot adunk minden mintához, és szobahőmérsékleten mintegy 15 percen keresztül inkubáljuk.
4. A mintákat 1000 g értéknél 5-10 percen keresztül centrifugáljuk, majd a PEG oldatot dekantáljuk.
5. A mintákat 150 μΐ SOS oldatban szuszpendáljuk, és szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk.
6. 850 μΐ steril 1 mól/1 szorbitolt adunk hozzá, és a minta alikvot részét az alább írt módon szétterítjük.
D) A szferoplaszt regenerálása
1. A regeneráló agar közeg összetétele:
a) agar 9 g Bacto-agar,
13,4 gKCl,
240 ml H2O, autokláv;
b) 10X glükóz: 20 g dextróz, ml H2O, autokláv;
c) 10X SC: 6,75 g élesztő nitrogénbázis aminosavak nélkül,
100 ml H2O autokláv (az autokláv előtt vagy után adagoljuk a kívánt aminosavat vagy nukleinsavat, legfeljebb 200 gg/ml koncentrációig);
d) 30 ml 10X glükózt és 30 ml 10X SC-t adunk 240 ml olvasztott agar KC1 oldathoz, 0,6 ml 0,2 mg/ml biotint és bármilyen más kívánt aminosavat vagy nukleinsavat adagolunk legfeljebb 20 μg/ml koncentrációig, a megolvasztott regenerációs agart 55-60 °C hőmérsékleten tartjuk.
2. Transzformált minták szétterítése:
HU 208 552 Β
Alsó agar rétegként 10 ml regenerációs agart öntünk minden lemezre legalább 30 perccel a transzformációs minták elkészülte előtt. 10 ml alikvot regenerációs agart 45-50 °C fürdőhőmérsékleten csövekbe osztunk szét, míg a transzformációs minta az SOS oldatban van. A fenti transzformációs minták alikvot részét a csövekben lévő regenerációs agárhoz adjuk, és a lemezeken lévő alsó agar rétegre öntjük.
3. A szferoplaszt készítmény minőségének meghatározása:
pg mintát százszorosára hígítunk 990 μΐ 1 mól/1 szorbitol segítségével. A százszoros hígítás 10 pl-es részét ismét százszorosára hígítjuk második rész 990 μΐ 1 mól/1 szorbitol segítségével. Mindkét hígítás 100 μΐes részét YPD közeget tartalmazó agarlemezeken terítjük szét a készítményben maradt szferoplaszt nélküli teljes sejtek koncentrációjának meghatározásához. Mindkét hígítás 100 μΐ-es részét 10 ml regenerációs agárhoz adjuk, amely 40 pg/ml hisztidint tartalmaz, a teljes visszanyerhető szferoplaszt meghatározásához. Transzformációhoz alkalmazható érték az l-3xl07 teljes visszanyerhető szferoplaszt/ml és mintegy lxlO3 össz-sejt/ml.
4. A lemezeket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 35 napon keresztül.
2. példa
Saccharomyces ARG4 gén és pBR322 helyspecifikus beépítése és Pichia HIS4 törlése GS190-ben (NRRL Y-18014)
Az 1. ábra a pYMIl plazmidot és a 2. ábra a plazmidnak a P. pastoris génbe történő helyspecifikus beépítésének folyamatát ábrázolja. A vektor a Saccharomyces ARG4 gént és a pBR322 DNS szekvenciát építi be a Pichia HIS4 helyre, és ezzel egyidejűleg törli a teljes HIS4 gén helyét a Pichia genomból. Más szekvenciák, például kifejeződő szakaszok, könnyen beépíthetők pYMIl-be, és vele együtt P. pastoris genomba.
A pYMIl plazmid előállításához az NRRL B15 889 számon deponált E. coli törzsben található pYJ8 plazmidot (3. ábra) EcoRI és Clal segítségével részlegesen hasítjuk, és így mintegy 400 bp EcoRI/Clal fragmenst kapunk. Ezzel párhuzamosan ugyanazt a plazmidot BamHI segítségével teljesen és EcoRI segítségével részlegesen hasítjuk, és így mintegy 400 bp EcoRI/BamHI fragmenst kapunk.
Ezt a két 400 bp fragmenst és EcoRI ragadós végeken keresztül egy 800 bp fragmenssé ligáljuk, amely a Pichia HIS4 gén 5’- és 3’-végeit tartalmazza.
Az E. coliból (NRRL B—18015) származó és a kereskedelemben hozzáférhető pYM25 plazmidot (17. ábra) HindlII és Sáli segítségével részlegesen emésztjük. A kapott 2,6 kb fragmenst, amely tartalmazza a Saccharomyces cerevisiae ARG4 génjét, izoláljuk. Az ARG4 gén az arginin-szukcinát liáz enzimet kódolja. Az izolált 2,6 kb fragmenst szelektálható markerként alkalmazzuk.
A 800 bp fragmenst és a 2,6 kb fragmenst a Clal/BamHI helyen és a HindlII/Sall helyen keresztül a pBR322 plazmidba ligáivá kapjuk a pYMIl plazmidot.
A P. pastoris arg4 törzset, GS190 (NRRL Y18014), EcoRI-val hasított pYMIl-gyel transzformálva arginin prototrófiát (Arg+) alakítunk ki. A regenerációs agar közeghez 40 pg/ml hisztidint adagolunk, hogy az olyan transzformánsokat kiválasszuk, amelyek a HIS4 gén tőrlése miatt hisztidint igényelnek.
Az Arg+ transzformánsok közül kiválogatjuk a HIS4 gén törlése következtében His~ jellegűeket. A His transzformánsok kiválogatásához a beágyazott Arg+ kolóniát tartalmazó regenerációs agart 50 ml-es steril csőbe visszük át, amely 25 ml steril vizet tartalmaz. Az agart Brinkman Instruments Polytron homogenizálóval 5-ös fokozatban mintegy 1 percen keresztül keverve porítjuk. Az élesztősejteket három réteg gézen keresztül szűrve elválasztjuk az agártól. Az élesztősejteket ezután ultrahanggal kezeljük, hígítjuk, és 40 pg/ml hisztidint tartalmazó SD közegű agar lemezre helyezzük.
Az ultrahangos kezeléshez a sejtek mintáját A^q = 0,1 értékre hígítjuk, és 10 másodpercen keresztül Sonifier Cell Disrupter 350 (Branson Sonic Power Co.) segítségével 4-es fokozatban kezeljük, amely elősegíti a sejtek szétválasztását, de nem csökkenti a sejtek életképességét. 2-3 nap elteltével az SD + hisztidin agar lemezeken fejlődő telepeket hisztidines és hisztidin nélküli SD lemezekre helyezzük rá.
Az Arg+ HIS' telepek aránya átlagosan 0,7% az ossz Arg+ transzformánshoz viszonyítva. 3 Arg+ HIS' törzs genom DNS-ét a Southern-féle folt hibridizáció segítségével vizsgáljuk. Mindhárom mintában hiányzik a teljes HIS4 gén és beépült a lineáris plazmid, amint ez a 2, ábra alján látható.
Amellett, hogy a GS190-pYMIl törzs fejlődéséhez hisztidint igényel, és nincs szüksége argininre, a táplálkozási igények és egyéb fejlődési mutatók változnak.
3. példa
A HIS4 gén törlése P. pastoris NRRL Y-ll 430 törzsből
A 4. ábra a pYMI3a plazmidot, az 5. ábra a plazmid fragmensének a P. pastoris NRRL Y-ll 430 törzs HIS4 helyére történő lineáris beépítésének folyamatát mutatja.
A pYMI3a plazmid előállításához az NRRL B18020 számon deponált E. coli törzsben található pBPGl-1 plazmidot (6. ábra) BamHI és BglII segítségével részlegesen hasítjuk, és a G418 rezisztencia gént tartalmazó 2,2 kb fragmenst izoláljuk.
A pYJ8 plazmidot BglII segítségével hasítjuk, és eltávolítjuk a HIS4 gén központi 2,7 kb szakaszát. A kapott fragmens BglII helyére a fenti 2,2 kb fragmenst ligáljuk.
A pYMI3a vektort EcoRI-val emésztve 2,9 kbp fragmenst kapunk, amely tartalmazza a G418R gént, amelyhez két végén mintegy 450 és 250 bp DNS kapcsolódik, amely a HIS4 gén 5’- és 3’-végéhez kapcsolódó szakaszból származik. Az EcoRI-val hasított plazmidot P. pastoris gazdába transzformáljuk. A transzformánsokat aszerint válogatjuk ki, hogy képesek-e 300 pg/ml antibiotikum jelenlétében fejlődni, ez a G418r transzformáns. A G418R kiválogatásához a re7
HU 208 552 B generációs agar közeget az alábbiak szerint módosítjuk az 1. példa d) pontjában leírtakhoz képest:
1. Regenerációs agar közeg összetétele:
a) agar szorbitol 9 g Bacto-agar,
54,6 g szorbitol,
240 ml H2O autokláv;
b) lOx glükóz, 20 g dextróz
100 ml H2O autokláv;
c) 10xYP“, 10 g élesztő extraktum, g pepton,
100mlH20, autokláv;
d) 30 ml lOx glükózt és 30 ml lOx YP-t adunk 240 ml olvasztott agar szorbitol oldathoz, a regenerációs agar közeget 55-60 °C hőmérsékleten olvadt állapotban tartjuk.
2. A transzformánsok terítése:
Legalább 30 perccel a transzformációs minták elkészülte előtt 600 pg/ml G418-at tartalmazó 10 ml regenerációs agar közeget terítünk a lemez aljára. Amíg a transzformációs minták az SOS közegben vannak, 10 ml alikvot regenerációs agar közeget (G418 nélkül) töltünk csövekbe 40-50 °C fürdőhőmérsékleten. A transzformációs minták elkészülte után a minták alikvot részét adjuk a csövekben lévő regenerációs agárhoz, és a G418-at tartalmazó 10 ml alsó agar rétegre öntjük. A lemezeket 30 °C hőmérsékleten 3-5 napig inkubáljuk.
Miután a G418-at tartalmazó regenerációs agar lemezen kifejlődnek a telepek, a sejteket megvizsgáljuk, hogy képesek-e hisztidin nélkül fejlődni. A sejteket extraháljuk a regenerációs agárról, ultrahanggal kezeljük, és a 2. példában leírt módon 40 pg/ml hisztidint tartalmazó SD közegű agar lemezre visszük fel. 30 °C hőmérsékleten 2-3 napon keresztül inkubáljuk, majd a telepeket hisztidint tartalmazó és hisztidin nélküli SD közegű agar lemezre visszük át.
A G418R telepek mintegy 0,1 %-a (2 mintegy 2000 vizsgált mintából) His jellegű. Southem-féle folt hibridizáció szerint mindkét His törzsből hiányzik a HIS4 gén, és mindkettő genomja tartalmazza a G418R gént, mint az az 5. ábrán látható. A His' törzsek egyike, amely KM31 laboratóriumi jelet kapja (United States Department of Agriculture, Northern Régiónál Research Center, Peoria, Illinois, NRRL Y—18 018) eredményesen transzformálható számos HIS4 tartalmú Pichia alapú plazmiddal, például pSAOH5-tel (előállítható NRRL B-15 862 E. coli gazdából), ami ismét arra mutat, hogy a KM31 a HIS4 gén kiiktatására alkalmas szervezet.
Ez az első eset, hogy „vad típusú” P. pastoris NRRL Y-11 430 közvetlenül transzformálható (vagyis auxotrofikus származék elsődleges izolálása és jellemzése nélkül). A HIS4 mutáns törzsek lehetséges előnye, hogy annak ellenére, hogy helyspecifikus beépítés/törlés módszerével lettek előállítva, mentesek azoktól a szekunder mutációktól, amelyek a például kémiai mutációval előállított Pichia auxotrofikus törzsekben jelentkeznek, például a GS115 (NRRL Y-15 851) és GS190 (NRRL Y-18 014) esetén.
Megjegyezzük, hogy a Pichia genomból a Pichia HIS4 génnek pYMI3a-ból származó EcoRI fragmenssel történő helyettesítése nem eredményezi nagy mennyiségű pBR322 beépülését (mint ez bekövetkezik a pYMIl esetén, 2. példa). Mivel a legtöbb ARS bázisú Pichia kifejező vektor, például a pSAOH5 (9. ábra) elsődlegesen a pBR322 szekvenciából és a Pichia HIS4 génből állítható elő, ezek az autonóm vektorok csekély homologitást mutatnak a Pichia HIS4 nélküli gazdákkal, és ezért nem integrálódnak gyakran.
4. példa
A primer alkohol oxidáz gén roncsolása
Az alkohol oxidáz gén nélküli Pichia törzsek (a primer alkohol oxidáz gént AOX1 és a szekunder alkohol oxidáz gént AOX2 jellel jelöljük) legalább két okból jelentősek. Először, elősegítik a gén metanol hatására történő kifejeződése szabályozásának tanulmányozását. Például az AOX1 és AOX2 gén nélküli mutáns törzs segítségével, amelyet részletesen a 7. példa ismertet, kimutatható, hogy a metanol vagy más metabolitjai (formaldehid, hangyasav stb.) indukálja-e a metanollal szabályozott géneket. Az AOX nélküli Pichia törzs második jelentősége az, hogy lehetővé teszik az 5. és 6. példákban ismertetett heterológ géntermékek nagy mennyiségű kifejeződését.
Az AOX gén roncsolására pYMI7 plazmidot (7. ábra) állítunk elő. Ehhez a pYM25 plazmidot (NRRL B-18015, 17. ábra) Sáli segítségével részlegesen és BamHI segítségével teljesen emésztjük. A kapott 2,9 kb BamHI/Sall fragmens a Saccharomyces cerevisiae ARG4 génjét tartalmazza.
A pPG4.0 plazmidot (NRRL B-15 868, 16a ábra, a plazmid Pichia részének hasítási térképe) BamHI segítségével hasítjuk és a fenti 2,9 kb fragmenssel ligáljuk. Mivel a 2,9 kb fragmens Sall-vége nem felel meg a BamHI-végnek, Klenow-enzimmel „betöltés”-t végzünk a BamHI-végek ligálása után, majd a fragmens korábbi Sáli helyének tompa végét és a vektor korábbi BamHI helyének betöltött részét ligáljuk.
A kapott pYMI7 plazmidban a beépítés hatására az AOX1 gén 5’ szakaszáról mintegy 600 bp rész (a gén mintegy 1/4-e) törlődik. A pYMI7 plazmidot PvuII-vel és EcoRI-val a szokásos körülmények között emésztjük, és az Arg+ prototrófia kiszelektálásával PPFl-be (arg4, his4, NRRL Y—18017) transzformáljuk. A transzformánsokat extraháljuk a regenerációs agárról, és a 2. példában leírt módon ultrahanggal kezeljük, végül 0,1 tömeg% glükózt (2 tömeg% helyett) és 40 pg/ml hisztidint tartalmazó SD közegű agar lemezekre visszük fel. A kapott telepeket (hisztidint tartalmazó) SD közegű agar lemezekre visszük át, amelyek a következő szénforrásokkal rendelkeznek:
1. szén nélkül,
2. 0,5 tömeg% metanol és
3.2 tömeg% glükóz.
Az Arg+ telepek mintegy 81,0%-a nem képes normálisan fejlődni metanolon. A metanolt nem használó
HU 208 552 Β telepek közül kettőn, KM71 és KM72, Southern-féle folt analízist végzünk a genom DNS-en, amellyel megállapítjuk, hogy az AOX1 gén roncsolódott, és a vektor beépült, mint ezt a 8. ábra alján láthatjuk.
A PPFl-pYMI7 alkohol oxidáz nélküli szerkezet genotípusa: (his4 aoxl: : SARG4), amely igen értékes. Például, mivel a törzs his4, az olyan Pichia vektor, amely szelektálható markerként HIS 4 gént tartalmaz, ilyen például a pSAOH5 (NRRL B-15 862, 9. ábra), az 5. példában leírt módon a fenti gazda szervezetbe transzformálható.
5. példa
A lacZ gén metanollal szabályozott kifejeződése alkohol oxidáz nélküli mutáns Pichia pastoris törzsben Ez a példa a lacZ gén 4. példa szerint előállított
KM71 Pichia gazdaszervezetben (PPFI-pYMI7 alkohol oxidáz nélküli szervezet) kifejezését ismerteti.
Az összehasonlító vizsgálatokhoz Aoxl gazdaként KM71-et (his4 aoxl : : SARG4) és Aoxl+ gazdaként PPFl-et (arg4, his4; NRRL Y-18017) alkalmazunk. Az AOX1 promoter-lacZ kifejező szakaszt mindkét törzsbe a pSAOH5 plazmidon (9. ábra, NRRL B15 862) transzformáljuk. Mindkét törzsből több stabil His+ transzformánst izolálunk. Ezek genomiális DNSeit Southern-féle folt analízissel vizsgáljuk, amelynek során az A0X1 promoter helyén kapcsolódó pSAOH5öt tartalmazó törzskészletet nyerünk. Élthez hasonlóan a dihidroxi-aceton-szintáz (DAS) promoter-lacZ génfúziót KM71-be és PPFÍ-be transzformáljuk pT76H3 plazmidon (18. ábra, NRRL B-18000) hisztidin prototrópia kiszelektálásával.
Mind a négy törzs fejlődik SD közegen, kivéve azt, amely 2 tömeg% glükóz helyett egyedüli szén- és energiaforrásként 2 tömeg% glicerint tartalmaz. A tenyészeteket centrifugáljuk, majd egyedüli szénforrásként 0,5 tömeg% metanolt tartalmazó SD közegre visszük át. A mintákat β-galaktozidázra vizsgáljuk, az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat β-galaktozidáz, egység/gg*
Idő (h) Aoxl + gazda Aoxl gazda
promoter AOX1 DAS AOX1 DAS
0 0 0 0 0
2 3 2 5 4
4 11 8 7 7
10 18 9 12 11
16 17 - 26 -
20 21 12 38 18
25 - 16 - 24
30 18 - 43 27
32 - 22 - 37
42 14 - 72 -
50 - 22 - 48
54 14 - 48 -
- β-galaktozidáz vizsgálat
A) Alkalmazott oldószerek
Z-puffer: Végső koncentráció
Na2HPO4x7 H2O 16,1 g 0,06 mól/1
NaH2PO4 5,5 g 0,04 mól/1
KC1 0,75 g 0,01 mól/1
MgSO4x7 H2O 0,246 g 0,001 mól/1
2-merkapto-etanol 2,7 ml 0,05 mól/1.
Az egészet 1 literre töltjük, a pH-t 7 értékre állítjuk.
2. O-Nitro-fenil^-D-galaktozid (ONPG)
400 mg ONPG-t (Sigma N-1127) 100 ml desztillált vízben oldva 4 mg/ml ONPG oldatot kapunk.
B) Vizsgálati eljárás
1. A tenyészközeg alikvot részét (20-50 OD600 élesztősejt) centrifugáljuk, és a sejteket hideg steril vízzel mossuk.
2. Hozzáadunk 1 μΐ 40 tömeg%-os Z-puffert, és 0,2 gg savval mosott 0,45-0,50 mm üvegszemcsét. A mintákat jégre helyezzük, majd kétszer 1 percen keresztül intenzíven kevertetjük. A kevertetési fázisok között a mintákat legalább 1 percen keresztül jégen tartjuk.
3. Akivonatokat mikrocentrifuga csövekbe helyezzük, és 4 °C hőmérsékleten 5 percen keresztül centrifugáljuk. A frissen centrifugált minták felülúszóját elválasztjuk, és az extraktumot jégen tartjuk.
4. Az extraktum teljes fehérjekoncentrációját a BioRad Laboratories (Bradford) fehérjevizsgálati módszerével határozzuk meg. Ehhez a Bio-Rad-festékreagens koncentrátumot 4 térfogat ionmentesített vízzel hígítjuk, és Whatman 3MM papíron szűrjük. A standard koncentrációgörbe felvételéhez 3, 10, 30 és 100 gg marhaszérum albumint (BSA) 100 gl Z-pufferben 13 db 100 mm-es üvegcsőbe adagolunk, amely 2,5 ml festékreagenst tartalmaz. A mintákat összekeverjük, és 5 percen keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd az optikai sűrűséget 595 nm-nél mérjük. Az extraktumból 3, 10 és 30 gl mintát 100 gl, Z-puffert tartalmazó oldatban a fent leírt módon analizálunk. Az extraktumok protein koncentrációját a BSA koncentrációs görbén interpolálással határozzuk meg.
5. A β-galaktozidáz vizsgálathoz 10 gl tízszeresen hígított extraktot adunk 1 ml Z-pufferhez, és az elegyet 5 percen keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
6. A reakciót 0,2 ml ONPG (4 mg/ml) hozzáadásával indítjuk, és kevertetjük.
7. A reakciót 0,5 ml 1 mól/1 Na2CO3 oldattal a kívánt időpontban (általában 1-30 perc között, A42O<1) megállítjuk.
8. A felülúszó abszorpcióját 420 nm-en vizsgáljuk.
C) A β-galaktozidáz aktivitásegység meghatározása
Egy egység (U) megfelel percenként 1 nmól ortonitrofenol (ONP) képződésének 30 °C hőmérsékleten és pH = 7 értéken.
nmól ONP abszorpciója 420 nm-en (A420) 0,0045 1 cm hosszon, vagyis 420 nm-en mért 1-es abszorpció, 222 nmól ONP/ml vagy 378 nmól/1,7 ml értéknek felel meg, mivel a felülúszó analizált térfogata 1,7 ml. Ennek megfelelően az egységet az alábbi képlet alapján számoljuk:
HU 208 552 Β
U = Á42-~ χ 378 t(perc)
Mind a 4 minta alig detektálható β-galaktozidáz aktivitást mutat a glicerol fejlődési fázisban. A metanol közegbe való áthelyezés után mintegy 10-20 órával az Aoxl+ gazdában AOXl-lacZ és DAS-lacZ kifejező szakaszt tartalmazó két tenyészet β-galaktozidáz aktivitást mutat mintegy 20 egység/pg fehérje szinten. Az Aoxlban AOXl-lacZ szakaszt tartalmazó minta aktivitása 60 egy ség/pg. Az Aoxl gazdában DAS-lacZ szakaszt tartalmazó minta β-galaktozidáz aktivitása szintén megnövekedett, vagyis a transzfomált Aoxl gazda, KM71, a β-galaktozidáz 2-3-szoros szintjén fejezi ki a transzformáit izogén Aoxl+ törzs, PPF1 viszonylatában.
6. példa
A Hepatitis B felületi antigén gén beépítése és az
AOX1 gén törlése
A helyspecifikus beépítés/törlésnek ebben a példájában az AOX1 gén teljes kódoló szekvenciáját töröljük, és a Hepatitis B felületi antigén (HBsAg) gént építjük be az AOX1 gén promoter felhasználásával, amely a genomban marad. Ehhez a P. pastoris gazdaszervezethez pBSAGI5I plazmidot állítunk elő (deponálva E. coli gazdaszervezetben a Northern Régiónál Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois helyen és a jelen bejelentésre vonatkozó szabadalom engedélyezése után a köz által korlátozás nélkül hozzáférhető, száma NRRL B—18 021, 12. ábra). A plazmid egy 1,0 kbp fragmenst tartalmaz és AOX1 gén 5 ’ végéhez kapcsolódó szekvenciából, ezután egy Hepatitis B felületi antigén (HBsAg) szekvenciát és 300 bp AOXI1 terminátor fragmenst (9., 10. és 11. ábra). A kifejeződő szakaszt 2,7 kbp fragmens követi, amely a Pichia HIS4 gént kódolja, valamint egy 1,5 kbp PvuII fragmens, amely tartalmazza az AOX1 gén 3’ szekvenciáját. Ha a pBSAGI5I-et BglII-vel emésztjük, egy 7,2 kbp lineáris vektort kapunk, amely 0,85 kbp 5’-AOXl génszekvenciát tartalmaz az egyik végén, és 1,1 kbp 3’-AOXl szekvenciát tartalmaz a másik végén. A BglII-vel hasított pBSAGI5I-et GS 115-be transzformáljuk hisztidin prototrófia kiszelektálásával, a transzformánsokat a regenerációs agárról extraháljuk, és a 2. példában leírt módon ultrahanggal kezeljük, végül 0,1 tömeg% glükózt (2,0 tömeg% helyett) tartalmazó SD közegű agarlemezre visszük fel. A kapott telepeket minimál agar lemezekre visszük át, amelyek szénforrásként a következőket tartalmazzák:
1. szén nélkül,
2. 0,5 tömeg% metanol,
3. 2 tömeg% glükóz.
A vizsgált telepek átlag 32%-a nem képes normálisan fejlődni metanolon.
A metanolt nem használó telepek közül kettőn Southem-féle folt analízist hajtunk végre a genom DNSen, amely azt mutatja, hogy az AOX1 gén törlődött, és a vektor szekvencia beépült (13. ábra).
Metanolon növekedve a GS115-pBSAGI5I törzs (AOX1 : : HBsAg-HIS4) a HBsAg-t magasabb szinten fejezi ki, mint a hasonlóan transzformált teljes alkohol oxidázt tartalmazó sejtek.
7. példa
A P. pastoris szekunder alkohol oxidáz génjének azonosítása a helyspecifikus módosítás módszerével
A szekunder alkohol oxidáz gén jelenlétére az alábbi megfigyelésekből lehet következtetni:
1. Azok a Southern-foltok, amelyekben az AOX cDNS vagy a genom DNS mintáit korlátozott Pichia genom DNS-sel hibridizáltuk, mindig legalább 2 sávot mutatnak.
2. Két Pichia genom DNS fragmenst izoláltunk, amelyek hasonlóak, de nem azonosak (16. ábra).
3. Mutáns Pichia törzsek, így KM71 és GS115pBSAGI5I, amelyekben a primer AOX gént (AOX1) töröljük vagy roncsoljuk, továbbfejlődnek metanolon és alkohol oxidáz aktivitást mutatnak.
Az AOX törzsek metanolon fejlődő sejtjeinek fejlődési aránya az AOX aktivitása sokkal alacsonyabb, mint az izogén Aoxl+ törzseknél. Úgy tűnik tehát, hogy a szekunder AOX gén (AOX2) sokkal alacsonyabb szinten fejlődik ki, vagy termékei kevésbé aktívak metanolon. A
4. példában bemutatjuk, hogy a Pichia DNS fragmens pPG4.0-ben tartalmazza az AOX1 gént.
A legmeggyőzőbb eljárás annak bemutatására, hogy a pPG3.0 genom DNS fragmense az AOX2 gén legalább egy részét tartalmazza, ha olyan mutáns törzset állítunk elő, amelyben az eredeti AOX2 gént roncsoljuk vagy töröljük. Ehhez helyspecifikus pXMI12a vektort (14. ábra) állítunk elő. A plazmid elsődlegesen pPG3.0-ból (16b ábra) áll, amely eredeti AOX2 gént tartalmaz egy 3,0 kbp BamHI fragmensen. A 2,7 kbp BglII fragmenst, amely tartalmazza a Pichia HIS4 gént, pYJ8-ból (3. ábra, NRRL B—15 889) izoláljuk, és a pPG3.0 BglII és bal oldali KpnI helyei között elhelyezkedő szekvencia helyére építjük be. (A KpnI helyet BglII hellyé alakítjuk át egy oligonukleotid adapter segítségével a beépítés előtt.
Az alakításhoz szükséges adaptert a területen jártas szakember a régi (KpnI) és az új (BglII) hasítóhely ismeretében könnyen ki tudja választani. Az eljárás megvalósítható például a 19. ábra szerint.
HIS4 gén BamHI helyét „filling in” módszerrel roncsoljuk a 20. ábra szerint a pPG3.0-ba történő beépítés előtt.) Az AOX1 és az eredeti AOX2 gének (16. ábra) összehasonlítása azt mutatja, hogy ezt a szerkezetet mintegy 800 bp törlésével kapjuk az AOX2 közepén. Ha pXMI12a-t BamHI-vel emésztjük, 4,5 kbp lineáris vektort kapunk, amely olyan HIS4 gén fragmenst tartalmaz, amelyhez az eredeti AOX2 helyről származó 1,1 és 0,7 kbp szekvenciák kapcsolódnak (15. ábra).
Ezt a lineáris vektort AOX1 törzsbe, KM71 (AOX1 HSI4 : : SARG4) transzformáljuk, és a transzformánsokat hisztidin prototrófia kiszelektálásával izoláljuk. A transzformánsokon agar lemezre történő átültetéssel megvizsgáljuk a metanol felhasználási képességet.
A KM71 transzformálatlan Aoxl törzs metanol lemezeken olyan lassan növekszik, hogy az agárból a me10
HU 208 552 Β tanol elpárolog, mielőtt jelentős növekedés figyelhető meg. A probléma megoldásához a sejteket gőzfázisban metanollal tápláljuk. Ehhez mintegy 0,2 ml 100%-os metanolt helyezünk a lemezek alá, amelyek az agar közegben nem tartalmaznak szénforrást. A lemezeket szobahőmérsékleten állni hagyjuk, és az alsó részben minden 24 napban pótoljuk a friss metanolt. Mintegy 1-2 hét után nyilvánvalóvá válik a különbség a vad típus (Aoxl+, Aox2+) és a mutáns törzsek [(Aoxl- Aox2+) és Aoxl Aox2“] metanolos fejlődése között.
A gőzfázisú táplálás után azt tapasztaljuk, hogy az Aoxl törzsek His+ transzformánsának mintegy 0,1 %-a képtelen metanolon fejlődni. 8 Aoxl-Aox2- His- transzformáns DNS-ét Southem-féle hibridizációs módszerrel analizáljuk. 3 DNS tartalmazza a beépült lineáris pXMI12a vektort (15. ábra). Egy Aoxl-Aox2- dupla mutáns KM7121 (NRRL Y—18 019) analízise azt mutatja, hogy a törzs egyáltalán nem fejlődik metanolon, és nem mutat detektálható AOX aktivitást. A KM7121 fenti tulajdonsága alapján nyilvánvaló, hogy a Pichia ffagmens pPG3.0-ban szekunder AOX gén szekvenciáját tartalmazza, és hogy a fenti két alkohol oxidázon kívül a P. pastoris nem mutat egyéb metanol oxidáló aktivitást.
A fenti példák csupán illusztrálják a találmány alkalmazhatóságát, és nem jelentik az oltalmi kör korlátozását. A találmány lényegét nem érintő lehetséges variációk és módosítások a találmány oltalmi körén belül maradnak.

Claims (16)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás mutáns Pichia szervezet létrehozására egy Pichia nembeli élesztő genomjának helyspecifikus módosításával a genom előre meghatározott helyén, azzal jellemezve, hogy
    - valamely, a Pichia nemhez tartozó élesztőtörzs genomiális DNS-ének szakaszaival homológ DNS fragmens belső szakaszát valamely, egy szelektálható marker gént és adott esetben egy szabályozó szakaszt és egy heterológ gént tartalmazó DNS fragmenssel helyettesítjük oly módon, hogy mind az 5’-végnél, mind a 3’-végnél legalább 200 nukleotidot megtartunk a Pichia nemhez tartozó élesztőtörzs genomiális DNSének szakaszaival homológ DNS fragmensből, és
    - a fenti DNS fragmenssel egy Pichia nembeli élesztőtörzset transzformálunk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy homológ DNS fragmensként 200-5000 bázispár hosszúságú alkohol-oxidáz gént, dihidroxi-acetonszintáz gént és/vagy hisztidinol-dihidrogénáz gént alkalmazunk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként pYMIl-gyel transzformálunk.
  4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként a pYMI3a-nak a G418 gént tartalmazó EcoRI/EcoRI fragmensével transzformálunk.
  5. 5. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként a pYMI7-nek a Saccharomyces cerevisiae ARG4 gént tartalmazó EcoRI/PvuII fragmensével transzformálunk.
  6. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként a pBSAGI5I-nek a Pichia HIS4 gént tartalmazó BglII/BglII fragmensével transzformálunk.
  7. 7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként a pYMI12a-nak a Pichia HIS4 gént tartalmazó BamHI/BamHI fragmensével transzformálunk.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Pichia nembeli élesztőtörzsként Pichia pastoris törzset transzformálunk.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris GS115-pBSAGI5I létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris GS115 törzset a pBSAGI5I plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk,
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris GS190-pXMIl létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris GS190 törzset a pXMIl plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris NRRL Y-18018 (NRRL Y-ll430-pYMI3a; KM31) létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris NRRL Y-ll 430 törzset a pXMI3A plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris PPFl-pXMI7 (KM71) létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris PPF1 törzset a pXMI7 plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris NRRL Y-18019 (PPFl-pYMI7-pYMI12a; KM7121) létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris PPF1 törzset a pYMI7-pYMI12a plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk.
  14. 14. Az 1., 2. vagy 8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy homológ DNS fragmensként a Pichia pastoris A0X2 génjét kódoló DNS fragmenst alkalmazzuk.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 16b ábra szerinti hasítási térképpel jellemezhető AOX2 gént alkalmazzuk.
  16. 16. Eljárás polipeptidek előállítására Pichia pastoris AOX1- gazdasejtekben, azzal jellemezve, hogy egy alkohol oxidáz promotert vagy dihidroxi-aceton-szintáz promotert és ehhez működőképesen kapcsolt heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS vektorral Pichia pastoris AOX1- törzset transzformálunk, a sejteket szénforrásként metanolt tartalmazó táptalajon tenyésztjük, és a polipeptidet kinyerjük.
    HU 208 552 B Int. Cl 5 C 12 N 15/81
    HIS 4
    Ha or pYMIl 8.0 Kbp
    ZZ2
    HU 208 552 B
HU864480A 1985-10-25 1986-10-24 Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts HU208552B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/791,013 US4882279A (en) 1985-10-25 1985-10-25 Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44612A HUT44612A (en) 1988-03-28
HU208552B true HU208552B (en) 1993-11-29

Family

ID=25152397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU864480A HU208552B (en) 1985-10-25 1986-10-24 Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts

Country Status (26)

Country Link
US (1) US4882279A (hu)
EP (2) EP0226752B1 (hu)
JP (1) JP2614215B2 (hu)
KR (1) KR930002738B1 (hu)
CN (1) CN86107108A (hu)
AT (2) ATE197962T1 (hu)
AU (2) AU581107B2 (hu)
CA (1) CA1339209C (hu)
DD (1) DD255544A5 (hu)
DE (2) DE3650749T2 (hu)
DK (1) DK510786A (hu)
EG (1) EG17985A (hu)
ES (2) ES2061433T3 (hu)
FI (1) FI98931C (hu)
HU (1) HU208552B (hu)
IE (1) IE68454B1 (hu)
IL (1) IL80286A (hu)
IN (1) IN166443B (hu)
MX (1) MX168390B (hu)
NO (1) NO176923C (hu)
NZ (1) NZ217809A (hu)
PH (1) PH25990A (hu)
PL (1) PL154843B1 (hu)
PT (1) PT83618B (hu)
YU (1) YU46758B (hu)
ZA (1) ZA867650B (hu)

Families Citing this family (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032516A (en) * 1985-10-25 1991-07-16 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
IL89993A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts
IL89992A0 (en) 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts
NZ228774A (en) * 1988-04-25 1991-05-28 Phillips Petroleum Co Hbv particles containing pres 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
IL89989A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts
AT390267B (de) * 1988-06-08 1990-04-10 Vogelbusch Gmbh Verfahren zum markieren und identifizieren von industriell eingesetzten mikroorganismen, vorzugsweise hefestaemmen
US5102789A (en) * 1989-03-15 1992-04-07 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
US5204252A (en) * 1989-02-08 1993-04-20 Henkel Research Corporation Candida tropicalis transformation system
WO1990009434A1 (en) * 1989-02-13 1990-08-23 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells
CA2017176A1 (en) * 1989-05-22 1990-11-22 Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin
JPH0669365B2 (ja) * 1989-05-22 1994-09-07 株式会社ミドリ十字 アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5258302A (en) * 1990-07-03 1993-11-02 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
JPH06500470A (ja) * 1990-09-04 1994-01-20 メルク　エンド　カンパニー　インコーポレーテッド メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生
US5268273A (en) * 1990-12-14 1993-12-07 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
CA2063890C (en) * 1991-03-27 2007-03-13 Masami Miura Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism
AU661844B2 (en) * 1991-04-01 1995-08-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Genes which influence (pichia) proteolytic activity, and uses therefor
CA2058820C (en) * 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5330901A (en) * 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
US5665600A (en) * 1991-09-18 1997-09-09 Research Corporation Technologies, Inc. Pichia pastoris linear plasmids and DNA fragments thereof
WO1994020631A2 (en) * 1993-03-03 1994-09-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Production of glycolate oxidase in methylotrophic yeast
EP0688361B1 (en) * 1993-03-08 2004-10-13 Merck &amp; Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
EP0696320B1 (en) * 1993-04-20 2002-09-25 Merck &amp; Co., Inc. Human n-methyl-d-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor
JP3937445B2 (ja) * 1993-05-28 2007-06-27 ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン グリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸ジアルキル混合物の製造法
US5912122A (en) * 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
US6001581A (en) 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US6495343B1 (en) 1993-06-18 2002-12-17 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
US6638905B2 (en) * 1993-06-18 2003-10-28 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CFR receptor(s)
GB2287941B (en) * 1993-11-08 1998-01-28 Salk Inst Biotech Ind Human alpha2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
CN1048254C (zh) * 1993-12-09 2000-01-12 托马斯杰弗逊大学 用于将预定的改变引入靶基因中的化合物
US5863894A (en) * 1995-06-05 1999-01-26 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5866542A (en) * 1994-10-18 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5866543A (en) * 1995-06-05 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
AU711405B2 (en) * 1994-10-18 1999-10-14 Dendreon Corporation Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
US5872098A (en) * 1995-06-05 1999-02-16 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
CA2202351A1 (en) * 1994-10-18 1996-04-25 George Phillip Vlasuk Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
US5945275A (en) * 1994-10-18 1999-08-31 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
JP3360830B2 (ja) 1995-03-17 2003-01-07 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規なエンドグルカナーゼ
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
AU7719696A (en) * 1995-10-18 1997-05-07 New York Blood Center, Inc., The Recombinant alpha-n-acetylgalactosaminidase enzyme
JP2000500014A (ja) * 1995-11-09 2000-01-11 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ピヒア・メタノリカ中で異種ポリペプチドを生産するための組成物と方法
US6001597A (en) * 1995-11-09 1999-12-14 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica
CA2246733C (en) 1996-03-01 2010-07-20 Novo Nordisk A/S Use of a pharmaceutical composition comprising an appetite-suppressing peptide
US5731181A (en) * 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
DK1632574T3 (da) 1996-10-16 2011-02-28 Zymogenetics Inc Fibroblast-vækstfaktor homologer
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
DK1115862T3 (da) 1998-09-23 2009-11-16 Zymogenetics Inc Cytokinreceptor Zalpha11
WO2000034474A2 (en) 1998-12-07 2000-06-15 Zymogenetics, Inc. Growth factor homolog zvegf3
US6780615B1 (en) 1998-12-31 2004-08-24 Genway Biotech Inc. Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system
NZ512753A (en) 1999-01-07 2003-10-31 Zymogenetics Inc Soluble receptor BR43x2 related proteins useful for inhibiting ztnf4
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
ATE377076T1 (de) 1999-03-09 2007-11-15 Zymogenetics Inc Humanes cytokin als ligand des zalpha rezeptors und dessen verwendungen
US7504253B2 (en) * 1999-06-11 2009-03-17 The Burnham Institute For Medical Research Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof
ES2364086T3 (es) 1999-07-07 2011-08-24 Zymogenetics, Inc. Receptor de citoquina humana.
EP1242600B1 (en) 1999-12-23 2010-03-03 ZymoGenetics, Inc. Cytokine zcyto18
EP1278852B1 (en) 2000-05-11 2010-07-07 ZymoGenetics, Inc. Zsig33-like peptides
EP2258725A3 (en) 2000-06-26 2014-09-17 ZymoGenetics, L.L.C. Cytokine receptor zcytor17
US7625756B2 (en) * 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
EP2322644A1 (en) 2000-06-28 2011-05-18 GlycoFi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7863020B2 (en) * 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
EP1717316B1 (en) 2000-06-30 2008-08-13 ZymoGenetics, Inc. Allelic variant of the Interferon-like protein ZCYTO21
JP4092194B2 (ja) 2000-06-30 2008-05-28 フランダース インターユニバーシティ インスティテュート フォア バイオテクノロジー （ヴィーアイビー） ピキアパストリス（ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ）におけるタンパク質糖鎖修飾
US7009045B2 (en) * 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
EP1736545A3 (en) 2000-08-08 2007-03-28 ZymoGenetics, Inc. Soluble zcytor 11 cytokine receptors
JP2004533997A (ja) 2001-02-20 2004-11-11 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド Ｂｃｍａ及びｔａｃｉの両者を結合する抗体
JP2004529640A (ja) 2001-03-22 2004-09-30 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 第ｖｉｉ凝固因子誘導体
EP1385866A4 (en) 2001-04-05 2006-03-29 Univ Nebraska ALCOHOL OXIDASE-1 REGULATING NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR HETEROLOGIC GENE EXPRESSION IN YEAST
EP2116259B1 (en) 2001-05-24 2012-01-25 ZymoGenetics, Inc. TACI-immunoglobulin fusion proteins
DK1451322T3 (da) 2001-11-05 2010-02-01 Zymogenetics Inc Il-21-antagonister
WO2003054155A2 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor
US7494804B2 (en) 2002-01-18 2009-02-24 Zymogenetics, Inc. Polynucleotide encoding cytokine receptor zcytor17 multimer
RU2360923C2 (ru) 2002-01-18 2009-07-10 Займоджинетикс, Инк. Новый лиганд рецептора цитокина zcytor17
US20060088834A1 (en) * 2002-04-15 2006-04-27 Gretchen Bain Matrix analysis of gene expression in cells (magec)
WO2003089603A2 (en) 2002-04-19 2003-10-30 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor
IL165717A0 (en) 2002-06-26 2006-01-15 Flanders Interuniversity Inst A strain of methylotrophic yeast for producing proteins
DE60335602D1 (de) * 2002-12-18 2011-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Desoxyribonuclease I aus Rinder-Pankreas mit hoher spezifischer Aktivität
DE60319333D1 (de) * 2002-12-20 2008-04-10 Roche Diagnostics Gmbh Hitzelabile Desoxyribonuklease I-Varianten
US7332299B2 (en) * 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
EP2251353B1 (en) 2003-08-07 2013-03-06 ZymoGenetics, Inc. Homogeneous preparations of IL-29
CN1863908B (zh) 2003-09-09 2010-08-04 诺和诺德医疗保健公司 凝固因子ⅶ多肽
CA2486195C (en) * 2003-12-05 2012-03-06 Stephan Glaser Recombinantly expressed carboxypeptidase b and purification thereof
WO2005078074A2 (en) 2004-02-13 2005-08-25 Novozymes A/S Protease variants
EP1732946B1 (en) 2004-03-08 2011-07-27 ZymoGenetics, Inc. Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them
WO2006012644A2 (en) 2004-07-29 2006-02-02 Zymogenetics, Inc. Use of il-28 and il-29 to treat cancer
AU2005268917B2 (en) 2004-08-02 2010-05-20 Basf Plant Science Gmbh Method for isolation of transcription termination sequences
AU2006212807A1 (en) 2005-02-08 2006-08-17 Zymogenetics, Inc. Anti-IL-20, anti-IL-22 and anti-IL-22RA antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
DE602006020032D1 (de) 2005-04-18 2011-03-24 Novo Nordisk As Il-21-varianten
EP3214095B1 (en) 2005-05-12 2019-12-11 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
US7393667B2 (en) * 2005-05-31 2008-07-01 Bristol-Myers Squibb Company Stereoselective reduction process for the preparation of pyrrolotriazine compounds
AU2006278227B2 (en) 2005-08-09 2011-10-20 Ares Trading S.A. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules
UA93516C2 (ru) * 2005-08-09 2011-02-25 Займоджинетикс, Инк. Способы лечения b-клеточных злокачественных образований c помощью слитой молекулы taci-ig
ES2368500T3 (es) 2005-08-16 2011-11-17 Novo Nordisk A/S Método para producir polipéptidos de insulina maduros.
US20090055942A1 (en) 2005-09-14 2009-02-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Human Coagulation Factor VII Polypeptides
US7981635B2 (en) * 2005-09-14 2011-07-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP1931697B1 (en) 2005-09-28 2010-09-15 ZymoGenetics, Inc. Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same
NZ572373A (en) * 2006-05-15 2012-02-24 Ares Trading Sa Methods for treating rheumatoid arthritis using a taci-ig fusion molecule
ES2464282T3 (es) 2006-09-27 2014-06-02 Novo Nordisk A/S Método para preparar polipéptidos de insulina madura
JP5967861B2 (ja) 2007-04-03 2016-08-10 オキシレイン ユーケー リミテッド 分子のグリコシル化
EP2164863A4 (en) 2007-06-15 2010-07-28 Univ Arkansas METHOD FOR THE ADMINISTRATION OF MOLECULES IN CELLS USING A RICIN SUB-UNIT AND RELATED COMPOSITIONS THEREOF
JP5474809B2 (ja) 2007-11-21 2014-04-16 ロスキレ ユニバーシティ 氷結合活性を備えたポリペプチド
CN101952309A (zh) * 2007-12-21 2011-01-19 Ifxa有限公司 蛋白酶抑制剂
DK2245052T3 (en) * 2008-01-25 2017-09-11 Univ Aarhus SELECTIVE EXOSITE INHIBITATION OF PAPP-A ACTIVITY AGAINST IGFBP-4
WO2009114093A2 (en) 2008-03-03 2009-09-17 Abbott Laboratories Methods for transforming yeast
WO2009120922A2 (en) 2008-03-27 2009-10-01 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for inhibiting pdgfrbeta and vegf-a
WO2009139349A1 (ja) * 2008-05-14 2009-11-19 Ｂｉｏ－ｅｎｅｒｇｙ株式会社 酵母細胞に遺伝子を導入する方法およびそのためのベクター
EP2623112B1 (en) 2008-06-27 2015-03-04 Zymogenetics, Inc. Soluble hybrid Fc gamma receptors and related methods
EA201100943A1 (ru) 2008-12-16 2012-05-30 Новартис Аг Системы дрожжевого дисплея
CA2748314C (en) 2009-02-03 2018-10-02 Amunix Operating Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
WO2010103038A1 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Novo Nordisk A/S Interleukin-21 variants having antagonistic binding to the il-21 receptor
AU2010272483B2 (en) 2009-07-17 2016-07-21 Omeros Corporation MASP isoforms as inhibitors of complement activation
AU2010290131C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
JP5990102B2 (ja) 2009-09-29 2016-09-07 ユニフェルシテイト ヘント ホスホ−６−マンノースへのマンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合の加水分解
US20130053550A1 (en) 2009-11-19 2013-02-28 Oxyrane Uk Limited Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans
JP5850848B2 (ja) 2009-11-25 2016-02-03 ノヴォ ノルディスク アー／エス ポリペプチドの製造方法
WO2011067283A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Novo Nordisk A/S Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases
CA2791841C (en) 2010-03-05 2023-01-03 Rigshospitalet Chimeric inhibitor molecules of complement activation
EP2580238A1 (en) 2010-06-09 2013-04-17 Zymogenetics, Inc. Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods
JP6131190B2 (ja) 2010-09-29 2017-05-17 オキシレイン ユーケー リミテッド リン酸化ｎ−グリカンの脱マンノシル化
SG189108A1 (en) 2010-09-29 2013-05-31 Oxyrane Uk Ltd Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins
WO2013098651A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Oxyrane Uk Limited Methods and materials for reducing degradation of recombinant proteins
CN104220602B (zh) 2012-02-01 2018-10-30 合成基因组股份有限公司 用于合成错误最小化核酸分子的材料和方法
US11787844B2 (en) 2012-02-09 2023-10-17 Var2 Pharmaceuticals Aps Targeting of chondroitin sulfate glycans
DK2822577T3 (en) 2012-02-15 2019-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc RECOMBINANT FACTOR VIII PROTEINS
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
AU2013234042B2 (en) 2012-03-15 2017-11-02 Oxyrane Uk Limited Methods and materials for treatment of Pompe's disease
KR101958234B1 (ko) * 2012-05-09 2019-03-14 엘지이노텍 주식회사 보이스 코일 모터
US20150307865A1 (en) 2012-10-15 2015-10-29 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
US20190040368A1 (en) 2013-03-05 2019-02-07 Oxyrane Uk Limited Production of catalytically active type i sulfatase
AU2014234962C1 (en) 2013-03-21 2019-01-17 Evonik Operations Gmbh Purification of triple helical proteins
EP3004156A1 (en) 2013-06-07 2016-04-13 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
WO2014202089A2 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Roskilde Universitet Variants of anti-freeze polypeptides
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
CN105764920B (zh) 2013-09-09 2020-07-24 联邦科学工业研究组织 修饰的细菌胶原蛋白样蛋白
WO2016017693A1 (ja) * 2014-07-30 2016-02-04 第一三共株式会社 タンパク質の改良高分泌生産方法
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
EP3328881B1 (en) 2015-09-08 2019-08-28 Theripion, Inc. Apoa-1 fusion polypeptides and related compositions and methods
WO2018136163A2 (en) 2016-12-09 2018-07-26 Theripion, Inc. Tandem apoa-1 fusion polypeptides
JP7012663B2 (ja) * 2016-12-15 2022-02-14 株式会社カネカ 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法
CA3070272A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Aptevo Research And Development Llc Antigen binding proteins binding to 5t4 and 4-1bb and related compositions and methods
RU2756100C1 (ru) 2017-12-20 2021-09-28 Харбор Байомед (Шанхай) Ко., Лтд Антитела, связывающие ctla-4, и их применение
US10150801B1 (en) 2017-12-27 2018-12-11 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and methods of use thereof
WO2019132765A1 (en) 2017-12-27 2019-07-04 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and methods of use thereof
DE202019005554U1 (de) * 2018-03-06 2021-01-18 Joywell Foods, Inc. Rekombinant exprimierte geschmacksmodifizierende Polypeptide und Präparate und Formulierungen, die diese enthalten
NZ769677A (en) 2018-05-18 2024-07-05 Bioverativ Therapeutics Inc Methods of treating hemophilia a
US20210278406A1 (en) 2018-07-13 2021-09-09 Varct Diagnostic Aps Isolation of circulating cells of fetal origin using recombinant malaria protein var2csa
CN111378585B (zh) * 2018-12-28 2023-06-16 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株
WO2021040610A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and methods of use thereof
US10675332B1 (en) 2019-08-26 2020-06-09 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and methods of use thereof
WO2021262081A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Imunami Laboratories Pte. Ltd. Recombinant polypeptides and combinations for use in the treatment of cancer
WO2022178090A2 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Theripion, Inc. Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods
WO2024148328A2 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Aptevo Research And Development Llc Bispecific pd-l1 and cd40 binding molecules and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4414329A (en) * 1980-01-15 1983-11-08 Phillips Petroleum Company Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities
JPS57206699A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Plasmid patm 3 and its preparation
US4837148A (en) * 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4855231A (en) * 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia

Also Published As

Publication number Publication date
PH25990A (en) 1992-01-13
PL262030A1 (en) 1987-09-07
ES2152233T3 (es) 2001-02-01
ATE98695T1 (de) 1994-01-15
AU593436B2 (en) 1990-02-08
IN166443B (hu) 1990-05-12
IE940325L (en) 1987-04-25
ZA867650B (en) 1987-05-27
DK510786A (da) 1987-04-26
ATE197962T1 (de) 2000-12-15
FI98931C (fi) 1997-09-10
US4882279A (en) 1989-11-21
NZ217809A (en) 1991-07-26
FI864319A0 (fi) 1986-10-24
DD255544A5 (de) 1988-04-06
IE862637L (en) 1987-04-25
JP2614215B2 (ja) 1997-05-28
EP0560401B1 (en) 2000-12-06
NO864275L (no) 1987-04-27
AU581107B2 (en) 1989-02-09
NO864275D0 (no) 1986-10-24
JPS62104585A (ja) 1987-05-15
DE3689411D1 (de) 1994-01-27
DE3650749T2 (de) 2001-04-05
CA1339209C (en) 1997-08-05
PT83618A (en) 1986-11-01
KR930002738B1 (ko) 1993-04-09
PT83618B (pt) 1988-10-14
EG17985A (en) 1991-11-30
YU180386A (sh) 1992-12-21
ES2061433T3 (es) 1994-12-16
MX168390B (es) 1993-05-21
CN86107108A (zh) 1987-06-03
NO176923C (no) 1995-06-21
AU1469988A (en) 1988-07-21
IL80286A0 (en) 1987-01-30
DE3650749D1 (de) 2001-01-11
HUT44612A (en) 1988-03-28
EP0226752A1 (en) 1987-07-01
KR870004141A (ko) 1987-05-07
EP0560401A1 (en) 1993-09-15
AU6388286A (en) 1987-04-30
FI864319A (fi) 1987-04-26
PL154843B1 (en) 1991-09-30
IL80286A (en) 1991-12-12
FI98931B (fi) 1997-05-30
NO176923B (no) 1995-03-13
IE68454B1 (en) 1996-06-26
YU46758B (sh) 1994-05-10
DE3689411T2 (de) 1994-07-21
EP0226752B1 (en) 1993-12-15
DK510786D0 (da) 1986-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU208552B (en) Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts
JP2873012B2 (ja) 酵母ベクター
US4885242A (en) Genes from pichia histidine pathway and uses thereof
EP0226846B1 (en) Yeast production of hepatitis b surface antigen
US4855231A (en) Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
JP2572952B2 (ja) 置換されたプロモーターを使用する宿主による異種起源蛋白質の製造方法
EP0263311A2 (en) Yeast production of human tumor necrosis factor
US5166329A (en) DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia
EP0123811A2 (en) The use of the GAL 1 yeast promoter
US5650296A (en) Expression of hepatitis B S and preS2 proteins in Pichia pastoris
HU204097B (en) Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species
HU209150B (en) Method for expressing proteines of foreign origin by means of transformated varieties of yarrowia lipolytica and method for producing said varieties
HUT51673A (en) Process for producing second regulating phase of pichia pastoris alcohol oxydase
HU218731B (hu) Élesztőtörzs és eljárás az élesztőre heterológ fehérjék előállítására
US5135868A (en) Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification
WO1984001153A1 (en) Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
JP2001501475A (ja) カンジダ・ウチリスにおけるトランスフォーメーション系
US5310660A (en) Method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription
JPH08500014A (ja) Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）トランスアルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびその使用
EP0339567A1 (en) Expression of Hepatitis B PreS 2 Protein in Methylotrophic Yeasts
US20040241829A1 (en) Vector for site-specific integration of heterologous dna sequences into metilotrophic yeasts
JP2752092B2 (ja) Ｄｅｏプロモーターを有する発現プラスミド及び該プラスミドを含む細菌宿主
JPS63501767A (ja) 短縮化されたホスホグリセリン酸キナ−ゼプロモ−タ−
CA1273883A (en) Recombinant dna material comprising bovine growth hormone nucleotide sequence
CA2111709A1 (en) The specific genetic modification of ashbya gossypii

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee