HU208552B - Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts - Google Patents
Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts Download PDFInfo
- Publication number
- HU208552B HU208552B HU864480A HU448086A HU208552B HU 208552 B HU208552 B HU 208552B HU 864480 A HU864480 A HU 864480A HU 448086 A HU448086 A HU 448086A HU 208552 B HU208552 B HU 208552B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gene
- fragment
- pichia
- dna
- dna fragment
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 19
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 106
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 101
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 93
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 67
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 61
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 37
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims description 34
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 34
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 claims description 19
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 claims description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 claims 2
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 claims 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 38
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 38
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 28
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 16
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 13
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 6
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 6
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 5
- 108030001048 Secondary-alcohol oxidases Proteins 0.000 description 5
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 101150031623 aox gene Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 101100287651 Caenorhabditis elegans kbp-3 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000012143 dye reagent concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229940050929 polyethylene glycol 3350 Drugs 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás Pichia nembeli élesztők genomjának helyspecifíkus módosítására a genom előre meghatározott helyén, amelynél
- valamely, a Pichia nemhez tartozó élesztőtörzs genomiális DNS-ének szakaszaival homológ DNS fragmens belső szakaszát valamely, egy szelektálható marker gént és adott esetben egy szabályozó szakaszt és egy heterológ gént tartalmazó DNS fragmenssel helyettesítik oly módon, hogy beépített DNS fragmensként mind az 5’-végnél, mind a 3’-végnél legalább 200 nukleotidot megtartanak a Pichia nemhez tartozó élesztőtörzs genomiális DNS-ének szakaszaival homológ DNS fragmensből, és
- a fenti DNS fragmenssel egy Pichia nembeli élesztőtörzset transzformáinak.
A találmány további tárgya eljárás polipeptidek előállítására Pichia pastoris AOX 5 gazdasejtekben.
A leírás terjedelme: 30 oldal (ezen belül 19 lap ábra)
CQ
HU 208 552
HU 208 552 Β
A találmány tárgya eljárás Pichia nembeli élesztők genomjának helyspecifikus módosítására, és polipeptidek előállítására.
A találmány szerinti megoldás a rekombináns DNS-technológia területére vonatkozik. A találmány tárgya közelebbről élesztő integratív transzformációja, élesztő helyspecifikus mutációja.
A rekombináns DNS technológia az utóbbi években jelentős fejlődésen ment keresztül, mikroorganizmusok szabályozott termelésével nagyszámú hasznos polipeptid előállítása vált lehetővé. Számos eukariota polipeptid, például a humán növekedési hormon, a leukocita interferon, a humán inzulin és a humán proinzulin több mikroorganizmusból is előállítható. A technológia folyamatos fejlesztésével a jövőben lehetővé válik, hogy mikroorganizmusok számos további hasznos polipeptidet előállítsanak. A rekombináns technológiában gyakran alkalmazott alapelem a plazmid, amely extrakromoszomális, kétszálú DNS, amely számos mikroorganizmusban megtalálható. Természetes eredetű mikroorganizmusokban a plazmid általában több példányban fordul elő sejtenként. A természetes eredetű plazmidokon kívül számos mesterséges plazmidot és hibridvektort állítottak elő. A gazdasejt azonban nem mindig képes a plazmid megtartására. Ehelyett a sejt elveszti plazmidtermelő képességét, és néhány generáció múlva a plazmid eltűnik. Idegen DNS stabil beépítése megfelelő gazdaszervezetbe tehát nagy jelentőségű és fontos eljárás.
Polipeptidek előállítására alkalmazott rekombináns DNS technológiában gazdaszervezetként a mai napig általában az Escherichia coli-t alkalmazzák annak ellenére, hogy számos esetben az E. coli nem alkalmas gazdasejtként. Például az E. coli számos toxikus pirogenikus faktort tartalmaz, amelytől a gyógyászati célra termelt polipeptidet meg kell tisztítani. A szükséges tisztítás hatékonysága természetesen az adott polipeptidtől függ. Ezen túlmenően az E. coli proteolitikus aktivitása több hasznos termék kitermelését korlátozza. További hátrány, hogy az E. coli által termelt több heterogén géntermék oldhatatlan formában nyerhető ki. Ezen, és egyéb okok miatt az érdeklődés egyre inkább alternatív gazdaszervezetek felé fordult. Ennek következtében növekszik az eukarióta szervezetek alkalmazása polipeptidek termelésére.
Polipeptidek eukarióta rendszerek, például élesztő segítségével történő előállítása jelentős előnyökkel rendelkezik a rekombináns DNS-sel kódolt polipeptidek prokarióta rendszerek, például E, coli által történő előállításához képest. Az élesztőt fermentációk széles skálájához alkalmazzák évszázadok óta, viszonyítva az E. coli fermentációk újkeletű felhasználásához. Az élesztő általában nagyobb sejtsűrűségig tenyészthető, mind a baktérium, és könnyen alkalmazható folyamatos fermentációhoz. A 4414329 számú USA-beli szabadalmi leírás élesztők, így a Pichia pastoris tenyésztését ismerteti egészen magas, 100 g/1 feletti sejtsűrűségig. Az élesztők további előnye, hogy a szervezet számos életfunkciója, például az oxidatív foszforilezés, sejtszervecskéken belül játszódik le, és így nincs kitéve az eredeti gazdasejttől idegen polipeptid termelés által kiváltott esetleges káros tényezőknek. Mint eukarióta szervezet, az élesztő képes lehet a kifejezett polipeptid termék glikozilálására, amely fontos olyan esetekben, amikor a polipeptid termék bioaktivitását a glikozilálás biztosítja. Lehetséges továbbá az is, hogy az élesztő, mint eukarióta szervezet, ugyanazokat az előnyös kódokat tartalmazza, mint magasabb szervezetek, ami tovább növeli az emlős génekből, vagy' például emlős mRNS-sel végrehajtott reverz transzkripcióval nyert kiegészítő DNS-ből származó termékek termelésének hatékonyságát.
Kevéssé ismert élesztőfajták gazda/vektor rendszerként történő alkalmazását gyakran gátolja a transzformáció körülményeinek hiányos ismerete, valamint az idegen DNS gazdasejtbe történő stabil bevitelének nehézkessége. Ezen túlmenően, az auxotrofikus mutáció gyakran nem lehetséges, ami kizárja a transzformáit termékek közvetlen szelekcióját az auxotrofikus komplementáció segítségével. A rekombináns DNS technológia fejlesztésének feltétele, hogy olyan új gazda/vektor rendszereket kell találni, amelyek lehetővé teszik a DNS kezelését, a bevitt DNS szekvencia optimális kifejeződését és ezáltal a kívánt polipeptid termék nagy kitermeléssel történő szabályozott előállítását.
A találmány értelmében új eljárást fejlesztettünk ki Pichia nembeli élesztő genomjának helyspecifikus módosítására.
Ha az élesztőt olyan lineáris DNS fragmenssel transzformáljuk, amely mindkét végén inszertálható DNS szekvenciát, vagyis a gazda genomjával homológ szekvenciát tartalmaz, ahol mindegyik hossza legalább 200 nukleotid és legalább egy további DNS fragmenst, például szelektálható markert tartalmaz, a markert és az oldalról beépíthető DNS szekvenciát a gazda nagy gyakorisággal felveszi. A lineáris DNS-sel végrehajtott transzformáció eredményeként módosított élesztőtörzset kapunk, amelyben a DNS szekvencia a beépülés helyén szétroncsolódott és/vagy kitörlődött, és a szelektálható marker, valamint minden olyan DNS, amely a transzformált lineáris DNS ffagmens részét képezte, a gazdaélesztő genomjába beépült.
A gazdaélesztő genomjába a fenti módon beépített idegen DNS a gazdában több generáción keresztül stabilan fennmarad. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi az idegen DNS-nek a plazmid instabilitása miatt bekövetkező elvesztése kiküszöbölését, amikor az idegen DNS egy önmagában replikálódó extrakromoszomális fragmens részét képezi, vagy amikor az idegen DNS beépül a genomba a kör DNS molekula részeként. Ilyen kör DNS molekula beépülés akkor következik be, ha olyan idegen DNS szekvenciát építünk be, amelyet a gazda genom szekvenciák közvetlen ismétlődése vesz közre. Mivel az ilyen közvetlen ismétlődő szekvenciák a további rekombináció alapját képezik, a közé beépített idegen DNS nem eléggé stabil.
A genom találmány szerinti helyspecifikus módosítása lehetővé teszi olyan mutánsok előállítását, amelyben teljesen vagy adott szakaszában hiányzik a specifi2
HU 208 552 Β kus gén. Ha a mutációra kiszemelt gén lényeges részét elimináljuk, úgy gyakorlatilag nullára csökkentjük a mutáció reverziójának valószínűségét. így a találmány szerinti mutációval kapott törzsek nagyon stabil mutánst képeznek.
A genom találmány szerinti helyspecifikus módosítása a szakember számára ismert in vitro rekombináns DNS technikával együtt lehetővé teszi a gazdasejt genomjának tetszőleges és pontos módosítását, például egy vagy több idegen gén beépítését a gazda genomba, a natív gének kifejeződését szabályozó szekvenciák megváltoztatását, valamint a natív gének idegen génekre történő kicserélését.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a Pichia nembeli törzseknél idegen gének metanollal indukált kifejeződése jelentős mértékben fokozódik, ha a gén kifejeződéshez gazdasejtként olyan Pichia törzset alkalmazunk, amelyben a primer alkohol oxidáz gént szétroncsoljuk.
Azt találtuk továbbá, hogy a Pichia pastoris törzs egy második alkohol oxidáz génnel is rendelkezik, amely lehetővé teszi, hogy a gazdatörzs, amelynek primer alkohol oxidáz génjét elroncsoltuk, metanolon továbbra is növekedjék, bár a natív Pichia pastorishoz képest csökkentett mértékben.
Az ábrák rövid ismertetése:
1. ábra a pYMIl plazmid hasítási térképét ábrázolja,
2. ábra a pYMIl plazmid egy részének a Pichia kromoszóma HIS 4 helyére történő beépítését ábrázolja,
3. ábra a pYJ8 plazmid hasítási térképe,
4. ábra a pYMI3 A plazmid hasítási térképe,
5. ábra a pYHMI3A plazmid egy részének a Pichia kromoszóma HIS4 helyére történő beépítését ábrázolja,
6. ábra a pBPGl-1 plazmid hasítási térképe,
7. ábra a pYMI7 plazmid hasítási térképe,
8. ábra a pYMI7 plazmid egy részének a Pichia kromoszóma alkohol oxidáz helyére történő beépítését ábrázolja,
9. ábra a pYM39 plazmid előállítását ábrázolja pSAOH5 és pTHBS3 plazmidokból,
10. ábra a pYMI6 plazmid előállítását ábrázolja a pYM39 és pPG3.2 plazmidokból,
11. ábra a pBSAGI5I plazmid előállítását ábrázolja a pYMIó és pBSAG5I plazmidokból,
12. ábra all. ábrához viszonyítva nagyobb részletességgel a pBSAGI5I plazmid hasítási térképét,
13. ábra a pBSAGI5I plazmid egy részének a Pichia kromoszóma alkohol oxidáz helyére történő beépítését ábrázolja,
14. ábra a pXMI12A plazmid hasítási térképe,
15. ábra a pYMI12A plazmid egy részének a második Pichia alkohol oxidáz gén (A0X2) helyére történő beépítését ábrázolja,
16. ábra a Pichia beillesztések hasítási térképe a pBR322-n alapuló pPG4.0 és pPG3.0 plazmidokban,
16a ábrán lévő betoldás az első Pichia alkohol oxidáz gén (A0X1) helyéről származik, míg a
16b ábrán lévő betoldás a második Pichia alkohol oxidáz gén (AOX2) helyéről származik,
16c ábra az AOX1 génhely ismert alkohol oxidáz (AOX) kódoló részét tartalmazza (hivatkozva a 16a ábrára),
17. ábra a pXM25 plazmid hasítási térképe,
18. ábra a pT76H3 plazmid hasítási térképe,
19. ábra a KpnI hasítási hely BglII hellyé történő átalakítását mutatja,
20. ábra a BamHI hasítási hely „fiiing in” módszerrel történő roncsolását mutatja.
Az alkalmazott restrikciós enzimet a továbbiakban az alábbi rövidítésekkel jelöljük:
| Rövidítések | Restrikciós enzimek |
| As | AsuII |
| B | BamHI |
| b2 | BglII |
| C | Clal |
| Rí | EcoRI |
| r5 | EcoRV |
| h3 | HindlII |
| Hpi | Hpal |
| Kp | KpnI |
| Nr | Nrul |
| Ps | PstI |
| Pv2 | PvuII |
| Rs | Rsal |
| S | Sáli |
| s3 | Sau3Al |
| Sm | Smal |
| Sp | Sphl |
| St | Stul |
| Th | Thai |
| Xb | Xbal |
| Xh | Xhol |
A ligálási és klónozási eljárás során elroncsolt felismerő helyeket az ábrákon a zárójelbe tett fenti rövidítésekkel jelöljük. így például a 4. ábrán szereplő „(Rs/Pv2)” az Rsal és PvuII enzimekre utal, amelyek a GTAC és a CAGCGT szekvenciákat ismerik fel. Mindkét enzim szimmetrikusan hasítja a DNS-t, és tompa végű fragmenseket eredményez, ahol az 5’-vég szekvenciája AC és CTG, és a 3’-vég szekvenciája GT és CAG. Ezek a fragmensek keresztbe ligálhatók, és így az eredeti felismerő szekvenciák keverékét (CTCTG és/vagy CAGAC) kapjuk, melyek sem Rasl-gyel, sem PvuII-vel nem hasíthatok.
A találmány értelmében a Pichia nembe tartozó élesztőket a genom előre meghatározott helyén hely3
HU 208 552 Β specifikusan módosítjuk, amelynek során a Pichia nembeli törzseket olyan sorban elrendezett lineáris DNS fragmenssel transzformáljuk, amely egy első beépíthető DNS fragmenst, egy szelektálható marker gént és egy második beépíthető DNS fragmenst tartalmaz. Az első és második beépíthető DNS fragmens mindegyike legalább mintegy 200 nukleotid hosszú és nukleotid szekvenciája homológ a natív Pichia genom módosításra kiszemelt külön szakaszával. A szelektálható marker gén olyan gén, amely szelektálható fenotípust kölcsönöz a befogadó sejtnek, például antibiotikum rezisztencia gén, vagy olyan bioszintetikus gén, amely hatására a sejt fejlődéséhez szükséges tápanyagot szintetizál. Ha a szelektálható marker gén DNS vektoron található, akkor csak azok a sejtek növekednek a különleges fejlődési körülmények között, amelyek befogadták a vektor DNS-t. Fontos, hogy a szelektálható marker gén az első és második beépíthető DNS fragmens között helyezkedjen el, valamint, hogy a beépíthető DNS fragmensek egymáshoz viszonyítva ugyanolyan orientációban helyezkedjen el, mint a lineáris DNS fragmenssel módosítani kívánt gazdasejt genomjában található.
A Pichia-félék találmány szerinti transzformációjához alkalmazott alapelem tehát legalább három komponensből áll:
- első beépíthető DNS fragmens,
- második beépíthető DNS fragmens és
- szelektálható marker gén.
Az első és második beépíthető DNS fragmens hosszúsága legalább mintegy 200 nukleotid, általában mintegy 200-5000 nukleotid hosszúságú. A könnyű kezelhetőség érdekében előnyösen mintegy 5002000 nukleotid hosszúságú fragmenseket alkalmazunk.
Az első és második beépíthető DNS fragmens nukleotid szekvenciája homológ a genomos módosításra kiszemelt natív Pichia genom adott szakaszával. így például, ha a genomos módosítást az alkohol oxidáz gén helyén kívánjuk végrehajtani, úgy az első és második beépíthető DNS fragmens szekvenciája homológ az alkohol oxidáz gén külön szakaszával. A találmány szerinti genom módosítások a két beépíthető DNS fragmens orientációja a lineáris fragmensen belül azonos a Pichia genom relatív orientációjával.
A találmány értelmében a transzformáláshoz alkalmazott DNS három kötelező komponense sorban elrendezve egy lineáris DNS fragmenst képez, amelyben a szelektálható marker gén az első beépíthető fragmens és a második beépíthető fragmens között helyezkedik el. A szelektálható marker génre nem korlátozó jellegű példaként említhető a Pichia pastoris és Saccharomyces cerevisiae ARG4 génje, a Pichia pastoris és S. cerevisiae HIS4 génje, az E. coli TnóOl transzponálható elemjének G418 foszfor-transzferáz génje, valamint más hasonló gének. Szakember számára nyilvánvaló, hogy számos megfelelő közbezáró-szekvencia, vagyis első és második beépíthető DNS fragmens vezethető le azokból a génekből, amelyek a Pichia pastoris genomból izolálhatok. Ezekre a génekre nem korlátozó jellegű példaként említhető az alkohol oxidáz gén [(AOX1 és AOX2), a Pichia két alkohol oxidáz gént tartalmaz], a dihidroxiaceton szintáz gén (DA), az argininszukcináz liáz gén (ARG4), a hisztidinol dihidrogenáz gén (HIS4) és más hasonló gének.
A transzformáláshoz alkalmazott lineáris DNS fragmens számos más DNS szekvenciát, például heterológ géneket is tartalmazhat, vagyis olyan géneket vagy génszakaszokat, amelyek általában nem találhatók meg a gazdasejt genomjának beépítéséhez kiszemelt helyén, amely a P. pastorisban kifejeződik. A heterológ kifejezés általában olyan DNS-t jelöl, amely nem található meg a Pichia gazdasejtben. A heterológ gén kívánt esetben szabályozó szakasszal kombinálható, amely önállóan szabályozza a heterológ gén termékének termelését, vagy a heterológ gén kifejeződhet a transzformált sejtben a transzformálás folyamán szétroncsolt gén natív szabályozó szakaszának hatására is.
A találmány értelmében a transzformáláshoz alkalmazott lineáris DNS fragmens bakteriális plazmid DNS-t is tartalmazhat, például pBR322 vagy pBR325 szekvenciákat. Ezeket a bakteriális szekvenciákat a DNS szekvenciák E. coliban történő in vitro manipulálása és előállítása során alkalmazzák.
A transzformáláshoz különösen előnyösen alkalmazható egy zárt körplazmidba bevitt lineáris DNS, amely egy első beépíthető DNS fragmenst, egy második beépíthető DNS fragmenst, egy szelektálható marker gént és bakteriális plazmid DNS-t tartalmaz. Ez a plazmid további DNS szekvenciákat is tartalmazhat a fentiek szerint.
A zárt körplazmid előnyösen két részből áll, a „transzformáló” részből és a „bakteriális” részből. A transzformáló rész sorba rendezett első beépíthető DNS ffagmensből, szelektálható marker génből és második beépíthető DNS fragmensből áll, ahol az első és második beépíthető DNS fragmens egymáshoz viszonyított orientációja azonos a Pichia genombeli orientációval, a szelektálható marker gén az első beépíthető DNS fragmens és a második beépíthető DNS fragmens között helyezkedik el. A bakteriális rész úgy helyezkedik el, hogy kapcsolódik az első beépíthető DNS fragmenshez és a második beépíthető DNS fragmenshez, és ezáltal zárt, kör alakú vektort képez.
A zárt körvektort E. coliban nagy mennyiségű plazmid előállítására használhatjuk fel, majd a plazmidot izoláljuk és megfelelő restrikciós enzimekkel hasítjuk, és így a transzformáló részt elválasztjuk a bakteriális résztől. Az élesztő DNS lineáris transzformáló részével Pichia törzsek transzformálhatok a kívánt genomos módosítás érdekében.
Természetesen az ismertetett zárt körplazmid transzformáló része további DNS szekvenciákat is tartalmazhat. Például az E. coli segítségével DNS in vitro előállításához alkalmazott bakteriális szekvenciák felhasználhatók a transzformáló DNS-hez, vagyis a bakteriális szekvencia, a szelektálható marker gén szekvenciához hasonlóan, az első beépíthető DNS fragmens és a második DNS fragmens közé helyezhető. A fenti összetételű DNS komponens alkalmazása esetén a bakteriális szekvencia szintén beépül a genomos módosításhoz alkalmazott gazdaélesztő genomjába.
HU 208 552 Β
A Pichia pastoris transzformációját a 4 879 231 számú USA-beli szabadalmi leírás ismerteti. A Pichia pastoris transzformációjának kísérleti megvalósítását később ismertetjük (lásd az 1. példát). A Pichia törzsbeli élesztők transzformálásához a sejtfal enzimatikus hasításával szferoplasztot állítunk elő, amelyet a transzformáló DNS-sel keverünk, és kalcium-ionok és polietilénglikol jelenlétében inkubálunk. Ezután szelektív tápközegben regeneráljuk. A transzformáló DNS egy szelektív markergént tartalmaz, amelynek segítségével kiválaszthatók azok a sejtek, amelyek felvették a transzformáló DNS-t, mivel csak a transzformált sejtek képesek élni és fejlődni az alkalmazott különleges életkörülmények között (a különleges életkörülmények a transzformáló DNS részeként alkalmazott szelektív markeren alapulnak). Ha a heterológ gének kifejezéséhez olyan Pichia törzset alkalmazunk, amelyben a primer alkohol oxidáz gént (AOX1) elroncsoltuk, megfigyelhető, hogy néhány promoter (például AOX1 és/vagy DAS promoter) kontrollja alatt a heterológ géntermék kifejeződése többszörösére nőtt a teljes alkohol oxidázt tartalmazó gazda alkalmazásával elérhető kifejezéshez képest. A fenti jelenség közelebbi vizsgálata kimutatta, hogy heterológ gének gazdaszervezetben történő kifejeződése általánosan fokozható, ha az erős szubsztrátérzékeny promotert tartalmazó gazdatörzset, ahol ez az erős szubsztrátérzékeny promoter szabályozza a heterológ gént, korlátozott életkörülményeket biztosító körülmények között olyan szubsztráton tartjuk, amelyre a promoter érzékeny.
A fent említett korlátozott életlehetőségeket biztosító körülmények megvalósíthatók, ha a sejtet csökkentett mennyiségű tápanyaggal tápláljuk, vagy olyan gazdamutánst alkalmazunk, amelynek életképessége meghatározott körülmények között lecsökken. így például, ha a heterológ gén kifejeződésének fokozását a tápközegben lévő metanolra érzékeny erős alkohol oxidáz vagy dihidroxi-aceton-szintáz promoter segítségével akarjuk szabályozni, a csökkentett életlehetőségeket biztosító körülmények megvalósíthatók, és így a gén kifejeződése fokozható, ha olyan gazdát alkalmazunk, amelyben a metanol felvevőképességet lecsökkentettük, vagy teljes alkohol oxidáz gént tartalmazó gazdát, de kevés metanolt tartalmazó tápközeget alkalmazunk.
Feltehető, hogy a heterológ géntermékek kifejeződésének növelésére fent ismertetett eljárás általánosan használható minden olyan szervezetben, amely táplálkozási korlátokra visszaható promoterrel rendelkezik, így, ha a heterológ gént a promoter régió kontrollja alá helyezzük, majd a gazdaszervezetet olyan korlátozott életlehetőségek között tenyésztjük, amelyek bekapcsolják az erős promotert, a gén kifejeződésének növekednie kell. A korlátozott életlehetőségek előnyösen olyan mutáns gazdaszervezettel biztosíthatók, amelyből hiányzik azoknak a tápanyagoknak lebontási képessége, amelyek biztosítják néhány promoter nagyobb szinten történő kifejeződését, mint a nem mutáns gazdaszervezetben. A Pichia törzs vonatkozásában a fentieket az 5. példában mutatjuk be részletesen.
Ha egy olyan Pichia pastoris törzset, amelyben a primer alkohol oxidáz gént a találmány szerinti genom módosítással elroncsoltunk, szénforrásként metanolon tenyésztünk, meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a primer alkohol oxidáz hiányos törzs még mindig képes metanolon fejlődni, bár az eredeti Pichia sejtekhez képest csökkentett mértékben. Ez a megfigyelés azt mutatja, hogy a metanolt használó Pichia törzsek szekunder alkohol oxidáz génnel rendelkeznek.
A Pichia kromoszomális DNS-ének vizsgálata közben olyan 3 kbp fragmenst izoláltunk, amely feltehetően a szekunder alkohol oxidáz gén (AOX2) egy részét kódolja. A fragmenst pBR322-be építettük be (az egyedi BamHI helyen). A plazmidot pPG3.0 néven jelöljük, és az LE392 E. coli gazda hordozza. Ezt a törzset a Northern Régiónál Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois helyen az NRRL B-18 022 számon deponáltuk abból a célból, hogy a köz által hozzáférhető legyen.
A pPG3.0 hasítási térképét a 16b ábra ábrázolja a primer alkohol oxidáz géz pPG4.0 genom fragmensével összehasonlítva. Ez utóbbi fragmenst a 4808537 számú USA-beli szabadalmi leírás ismerteti részletesen. A két alkohol oxidáz gén (16. ábra) összehasonlítása kimutatja, hogy nem ugyanannak a genom helynek egymást átfedő szakaszairól van szó. Nyilvánvaló, hogy van némi homológia a két fragmens között, ami a két fragmens közös hasítási helyeiből adódik. Az AOX1 és AOX2 gének közös hasítási helyeit a 16. ábrán csillaggal jelöltük. Mindkét fragmensen találhatók azonban olyan hasítási helyek, amelyek nem fordulnak elő a másikban, és ezek a két fragmens nukleotid szintű különbségeire utalnak.
A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi nem korlátozó jellegű példákkal mutatjuk be.
A példákban az alábbi puffereket és oldatokat alkalmaztuk:
1M Trisz puffer 121,1 g Trisz bázis 800 ml vízben, a pH-t koncentrált (35 tömeg%-os) vizes sósavval a kívánt értékre állítjuk, az oldatot hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, mielőtt a végső pH-értékeket meghatározzuk, a végső térfogatot 1 1-re egészítjük ki.
TE puffer 1,0 mmól/1 EDTA, 0,01 mól/1 (pH = 7,4) Trisz pufferben.
LB (Luria-Bertani) közeg 5 g Bacto tripton, 5 g Bactoélesztő extraktum, 2,5 g NaCl, 1 liter vízben, NaOH-val pH = 7,5 értékre állítva.
2B közeg 0,2 tömeg% NH4PO4, 1,2 tömegbe Na2HPO4, 0,013 tömeg% MgSO4x7 H2O, 0,074 tömeg% CaCl2x2 H2O, 2 pg/ml biotin, 1 pg/ml tiamin, 100 pg/ml triptofán, 0,4 tömeg% dextróz, 0,2 tömegbe kazaminsav.
YPD közeg 1 tömeg% Bacto-élesztő extrak5
HU 208 552 Β
| SD közeg | tűm, 2 tömeg% Bacto pepton, 2 tömeg% dextróz. 6,75 g élesztő nitrogén bázis ami- |
| SÉD | nosavak nélkül (DIFCO), 2 tömegbe dextróz 1 liter vízben. 1 mól/1 szorbitol, 25 mmól/1 ED- |
| SCE puffer | TA, 50 mmól/1 DTT. 9,1 g szorbitol, 1,47 g nátrium- |
| CaS | citrát, 0,168 g EDTA, 50 ml víz, pH = 5,8-ra HCl segítségével. 1 mól/1 szorbitol, 10 mmól/1 |
| PEG oldat | CaCl2, szűrve sterilizáljuk. 20 tömeg% polietilénglikol 3350, |
| SOS | 10 mmól/1 CaCl2, 10 mmól/1 Trisz-HCl (pH = 7,4), szűrve sterilizáljuk. 1 mól/1 szorbitol, 0,3xYPD kö- |
| zeg, 10 mmól/1 CaCl2. |
A példákban az alábbi rövidítéseket használjuk:
EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav
SDS = nátrium-dodecil-szulfát
DTT = ditio-treitol.
A példákban az enzimes reakciókat a gyártó előírásai szerint végezzük.
Részleges emésztéskor a megfelelő emésztéshez szükséges időtartamot úgy határozzuk meg, hogy különböző idejű emésztéseket végzünk, gélelektroforézissel meghatározzuk a keletkezett fragmenseket, és kiválasztjuk azt az időt, amelynél a kívánt méretű fragmens keletkezik.
1. példa
Pichia pastoris transzformációs eljárás
A) Sejttenyészet
1. GS115 Pichia pastoris telepet (NRRL Y-15 851) mintegy 10 ml YPD közegre oltunk, és a tenyészetet 30 °C hőmérsékleten 12-20 órán keresztül rázzuk.
2. Mintegy 12-20 óra elteltével a sejteket OD^q = 0,01-0,1 értékre hígítjuk, majd YPD közegen 30 °C hőmérsékleten mintegy 6-8 órán keresztül logaritmikus fejlődési fázisban tartjuk.
3. Mintegy 6-8 óra elteltével 100 ml YPD közeget 0,5 ml OD600 = 0,1 értékű (vagy ezzel ekvivalens mennyiségű) sejttenyészettel inokulálunk, majd 30 °C hőmérsékleten mintegy 12-20 órán keresztül rázzuk.
4. A tenyészetet mintegy OD^ = 0,2-0,3 értéknél (megközelítőleg 16-20 óra) 1500 g/5 perc centrifugálással begyűjtjük.
B) A szferoplaszt kinyerése
1. A sejteket 10 ml steril vízzel mossuk (az 1-5. lépésekben a centrifugálást 1500 g mellett 5 percen keresztül végezzük).
2. A sejteket 10 ml frissen előállított SÉD oldattal mossuk.
3. A sejteket kétszer 10 ml steril 1 mól/1 szorbitol oldattal mossuk.
4. A sejteket 10 ml SÉD pufferben újból szuszpendáljuk.
5. 5-10 μΐ 4 mg/ml Zymolyase 60 000-t (Miles Laboratories) adagolunk, és a sejteket 30 °C hőmérsékleten 30-60 percen keresztül inkubáljuk.
Mivel a szferoplaszt képzés a transzformáció kritikus lépése, a szferoplaszt képződést az alábbi módon ellenőrizzük: 100 μΐ alikvot sejtet adunk 900 μΐ 5% SDS-hez vagy 900 μΐ 1 mól/1 szorbitol oldathoz, mielőtt adagoljuk a zimoliázt, vagy közvetlen az adagolás után és az inkubációs periódus különböző időpontjaiban. Az inkubációt megállítjuk azon a ponton, amikor a sejtek SDS-en roncsolódnak, de szorbitolban épen maradnak (általában 30-60 perc inkubálás között.)
6. A szferoplasztot kétszer 10 ml steril 1 mól/1 szorbitolban 1000 g/5-10 perc centrifugálással mossuk. (A centrifugálás idejét és sebességét változtathatjuk, addig centrifugáljuk, amíg a szferoplaszt pelletet képez, de még nem reped szét az erő hatására.)
7. A sejteket 10 ml steril CaS oldattal mossuk.
8. Az összes sejtet 0,6 ml CaS oldatban szuszpendáljuk.
C) Transzformáció
1. A DNS mintákat (legfeljebb 20 μΐ térfogatig) 12x75 mm méretű steril polipropilén csőbe helyezzük (a DNS-t vízben vagy TE pufferben alkalmazzuk, kis mennyiségű DNS maximális transzformálásához előnyös, ha mintegy 1 μΐ 5 mg/ml, ultrahanggal kezelt E. coli DNS-t adunk minden mintához).
2. 100 μΐ szferoplasztot adunk minden DNS mintához, és szobahőmérsékleten mintegy 20 percen keresztül inkubáljuk.
3. 1 ml PEG oldatot adunk minden mintához, és szobahőmérsékleten mintegy 15 percen keresztül inkubáljuk.
4. A mintákat 1000 g értéknél 5-10 percen keresztül centrifugáljuk, majd a PEG oldatot dekantáljuk.
5. A mintákat 150 μΐ SOS oldatban szuszpendáljuk, és szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk.
6. 850 μΐ steril 1 mól/1 szorbitolt adunk hozzá, és a minta alikvot részét az alább írt módon szétterítjük.
D) A szferoplaszt regenerálása
1. A regeneráló agar közeg összetétele:
a) agar 9 g Bacto-agar,
13,4 gKCl,
240 ml H2O, autokláv;
b) 10X glükóz: 20 g dextróz, ml H2O, autokláv;
c) 10X SC: 6,75 g élesztő nitrogénbázis aminosavak nélkül,
100 ml H2O autokláv (az autokláv előtt vagy után adagoljuk a kívánt aminosavat vagy nukleinsavat, legfeljebb 200 gg/ml koncentrációig);
d) 30 ml 10X glükózt és 30 ml 10X SC-t adunk 240 ml olvasztott agar KC1 oldathoz, 0,6 ml 0,2 mg/ml biotint és bármilyen más kívánt aminosavat vagy nukleinsavat adagolunk legfeljebb 20 μg/ml koncentrációig, a megolvasztott regenerációs agart 55-60 °C hőmérsékleten tartjuk.
2. Transzformált minták szétterítése:
HU 208 552 Β
Alsó agar rétegként 10 ml regenerációs agart öntünk minden lemezre legalább 30 perccel a transzformációs minták elkészülte előtt. 10 ml alikvot regenerációs agart 45-50 °C fürdőhőmérsékleten csövekbe osztunk szét, míg a transzformációs minta az SOS oldatban van. A fenti transzformációs minták alikvot részét a csövekben lévő regenerációs agárhoz adjuk, és a lemezeken lévő alsó agar rétegre öntjük.
3. A szferoplaszt készítmény minőségének meghatározása:
pg mintát százszorosára hígítunk 990 μΐ 1 mól/1 szorbitol segítségével. A százszoros hígítás 10 pl-es részét ismét százszorosára hígítjuk második rész 990 μΐ 1 mól/1 szorbitol segítségével. Mindkét hígítás 100 μΐes részét YPD közeget tartalmazó agarlemezeken terítjük szét a készítményben maradt szferoplaszt nélküli teljes sejtek koncentrációjának meghatározásához. Mindkét hígítás 100 μΐ-es részét 10 ml regenerációs agárhoz adjuk, amely 40 pg/ml hisztidint tartalmaz, a teljes visszanyerhető szferoplaszt meghatározásához. Transzformációhoz alkalmazható érték az l-3xl07 teljes visszanyerhető szferoplaszt/ml és mintegy lxlO3 össz-sejt/ml.
4. A lemezeket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 35 napon keresztül.
2. példa
Saccharomyces ARG4 gén és pBR322 helyspecifikus beépítése és Pichia HIS4 törlése GS190-ben (NRRL Y-18014)
Az 1. ábra a pYMIl plazmidot és a 2. ábra a plazmidnak a P. pastoris génbe történő helyspecifikus beépítésének folyamatát ábrázolja. A vektor a Saccharomyces ARG4 gént és a pBR322 DNS szekvenciát építi be a Pichia HIS4 helyre, és ezzel egyidejűleg törli a teljes HIS4 gén helyét a Pichia genomból. Más szekvenciák, például kifejeződő szakaszok, könnyen beépíthetők pYMIl-be, és vele együtt P. pastoris genomba.
A pYMIl plazmid előállításához az NRRL B15 889 számon deponált E. coli törzsben található pYJ8 plazmidot (3. ábra) EcoRI és Clal segítségével részlegesen hasítjuk, és így mintegy 400 bp EcoRI/Clal fragmenst kapunk. Ezzel párhuzamosan ugyanazt a plazmidot BamHI segítségével teljesen és EcoRI segítségével részlegesen hasítjuk, és így mintegy 400 bp EcoRI/BamHI fragmenst kapunk.
Ezt a két 400 bp fragmenst és EcoRI ragadós végeken keresztül egy 800 bp fragmenssé ligáljuk, amely a Pichia HIS4 gén 5’- és 3’-végeit tartalmazza.
Az E. coliból (NRRL B—18015) származó és a kereskedelemben hozzáférhető pYM25 plazmidot (17. ábra) HindlII és Sáli segítségével részlegesen emésztjük. A kapott 2,6 kb fragmenst, amely tartalmazza a Saccharomyces cerevisiae ARG4 génjét, izoláljuk. Az ARG4 gén az arginin-szukcinát liáz enzimet kódolja. Az izolált 2,6 kb fragmenst szelektálható markerként alkalmazzuk.
A 800 bp fragmenst és a 2,6 kb fragmenst a Clal/BamHI helyen és a HindlII/Sall helyen keresztül a pBR322 plazmidba ligáivá kapjuk a pYMIl plazmidot.
A P. pastoris arg4 törzset, GS190 (NRRL Y18014), EcoRI-val hasított pYMIl-gyel transzformálva arginin prototrófiát (Arg+) alakítunk ki. A regenerációs agar közeghez 40 pg/ml hisztidint adagolunk, hogy az olyan transzformánsokat kiválasszuk, amelyek a HIS4 gén tőrlése miatt hisztidint igényelnek.
Az Arg+ transzformánsok közül kiválogatjuk a HIS4 gén törlése következtében His~ jellegűeket. A His transzformánsok kiválogatásához a beágyazott Arg+ kolóniát tartalmazó regenerációs agart 50 ml-es steril csőbe visszük át, amely 25 ml steril vizet tartalmaz. Az agart Brinkman Instruments Polytron homogenizálóval 5-ös fokozatban mintegy 1 percen keresztül keverve porítjuk. Az élesztősejteket három réteg gézen keresztül szűrve elválasztjuk az agártól. Az élesztősejteket ezután ultrahanggal kezeljük, hígítjuk, és 40 pg/ml hisztidint tartalmazó SD közegű agar lemezre helyezzük.
Az ultrahangos kezeléshez a sejtek mintáját A^q = 0,1 értékre hígítjuk, és 10 másodpercen keresztül Sonifier Cell Disrupter 350 (Branson Sonic Power Co.) segítségével 4-es fokozatban kezeljük, amely elősegíti a sejtek szétválasztását, de nem csökkenti a sejtek életképességét. 2-3 nap elteltével az SD + hisztidin agar lemezeken fejlődő telepeket hisztidines és hisztidin nélküli SD lemezekre helyezzük rá.
Az Arg+ HIS' telepek aránya átlagosan 0,7% az ossz Arg+ transzformánshoz viszonyítva. 3 Arg+ HIS' törzs genom DNS-ét a Southern-féle folt hibridizáció segítségével vizsgáljuk. Mindhárom mintában hiányzik a teljes HIS4 gén és beépült a lineáris plazmid, amint ez a 2, ábra alján látható.
Amellett, hogy a GS190-pYMIl törzs fejlődéséhez hisztidint igényel, és nincs szüksége argininre, a táplálkozási igények és egyéb fejlődési mutatók változnak.
3. példa
A HIS4 gén törlése P. pastoris NRRL Y-ll 430 törzsből
A 4. ábra a pYMI3a plazmidot, az 5. ábra a plazmid fragmensének a P. pastoris NRRL Y-ll 430 törzs HIS4 helyére történő lineáris beépítésének folyamatát mutatja.
A pYMI3a plazmid előállításához az NRRL B18020 számon deponált E. coli törzsben található pBPGl-1 plazmidot (6. ábra) BamHI és BglII segítségével részlegesen hasítjuk, és a G418 rezisztencia gént tartalmazó 2,2 kb fragmenst izoláljuk.
A pYJ8 plazmidot BglII segítségével hasítjuk, és eltávolítjuk a HIS4 gén központi 2,7 kb szakaszát. A kapott fragmens BglII helyére a fenti 2,2 kb fragmenst ligáljuk.
A pYMI3a vektort EcoRI-val emésztve 2,9 kbp fragmenst kapunk, amely tartalmazza a G418R gént, amelyhez két végén mintegy 450 és 250 bp DNS kapcsolódik, amely a HIS4 gén 5’- és 3’-végéhez kapcsolódó szakaszból származik. Az EcoRI-val hasított plazmidot P. pastoris gazdába transzformáljuk. A transzformánsokat aszerint válogatjuk ki, hogy képesek-e 300 pg/ml antibiotikum jelenlétében fejlődni, ez a G418r transzformáns. A G418R kiválogatásához a re7
HU 208 552 B generációs agar közeget az alábbiak szerint módosítjuk az 1. példa d) pontjában leírtakhoz képest:
1. Regenerációs agar közeg összetétele:
a) agar szorbitol 9 g Bacto-agar,
54,6 g szorbitol,
240 ml H2O autokláv;
b) lOx glükóz, 20 g dextróz
100 ml H2O autokláv;
c) 10xYP“, 10 g élesztő extraktum, g pepton,
100mlH20, autokláv;
d) 30 ml lOx glükózt és 30 ml lOx YP-t adunk 240 ml olvasztott agar szorbitol oldathoz, a regenerációs agar közeget 55-60 °C hőmérsékleten olvadt állapotban tartjuk.
2. A transzformánsok terítése:
Legalább 30 perccel a transzformációs minták elkészülte előtt 600 pg/ml G418-at tartalmazó 10 ml regenerációs agar közeget terítünk a lemez aljára. Amíg a transzformációs minták az SOS közegben vannak, 10 ml alikvot regenerációs agar közeget (G418 nélkül) töltünk csövekbe 40-50 °C fürdőhőmérsékleten. A transzformációs minták elkészülte után a minták alikvot részét adjuk a csövekben lévő regenerációs agárhoz, és a G418-at tartalmazó 10 ml alsó agar rétegre öntjük. A lemezeket 30 °C hőmérsékleten 3-5 napig inkubáljuk.
Miután a G418-at tartalmazó regenerációs agar lemezen kifejlődnek a telepek, a sejteket megvizsgáljuk, hogy képesek-e hisztidin nélkül fejlődni. A sejteket extraháljuk a regenerációs agárról, ultrahanggal kezeljük, és a 2. példában leírt módon 40 pg/ml hisztidint tartalmazó SD közegű agar lemezre visszük fel. 30 °C hőmérsékleten 2-3 napon keresztül inkubáljuk, majd a telepeket hisztidint tartalmazó és hisztidin nélküli SD közegű agar lemezre visszük át.
A G418R telepek mintegy 0,1 %-a (2 mintegy 2000 vizsgált mintából) His jellegű. Southem-féle folt hibridizáció szerint mindkét His törzsből hiányzik a HIS4 gén, és mindkettő genomja tartalmazza a G418R gént, mint az az 5. ábrán látható. A His' törzsek egyike, amely KM31 laboratóriumi jelet kapja (United States Department of Agriculture, Northern Régiónál Research Center, Peoria, Illinois, NRRL Y—18 018) eredményesen transzformálható számos HIS4 tartalmú Pichia alapú plazmiddal, például pSAOH5-tel (előállítható NRRL B-15 862 E. coli gazdából), ami ismét arra mutat, hogy a KM31 a HIS4 gén kiiktatására alkalmas szervezet.
Ez az első eset, hogy „vad típusú” P. pastoris NRRL Y-11 430 közvetlenül transzformálható (vagyis auxotrofikus származék elsődleges izolálása és jellemzése nélkül). A HIS4 mutáns törzsek lehetséges előnye, hogy annak ellenére, hogy helyspecifikus beépítés/törlés módszerével lettek előállítva, mentesek azoktól a szekunder mutációktól, amelyek a például kémiai mutációval előállított Pichia auxotrofikus törzsekben jelentkeznek, például a GS115 (NRRL Y-15 851) és GS190 (NRRL Y-18 014) esetén.
Megjegyezzük, hogy a Pichia genomból a Pichia HIS4 génnek pYMI3a-ból származó EcoRI fragmenssel történő helyettesítése nem eredményezi nagy mennyiségű pBR322 beépülését (mint ez bekövetkezik a pYMIl esetén, 2. példa). Mivel a legtöbb ARS bázisú Pichia kifejező vektor, például a pSAOH5 (9. ábra) elsődlegesen a pBR322 szekvenciából és a Pichia HIS4 génből állítható elő, ezek az autonóm vektorok csekély homologitást mutatnak a Pichia HIS4 nélküli gazdákkal, és ezért nem integrálódnak gyakran.
4. példa
A primer alkohol oxidáz gén roncsolása
Az alkohol oxidáz gén nélküli Pichia törzsek (a primer alkohol oxidáz gént AOX1 és a szekunder alkohol oxidáz gént AOX2 jellel jelöljük) legalább két okból jelentősek. Először, elősegítik a gén metanol hatására történő kifejeződése szabályozásának tanulmányozását. Például az AOX1 és AOX2 gén nélküli mutáns törzs segítségével, amelyet részletesen a 7. példa ismertet, kimutatható, hogy a metanol vagy más metabolitjai (formaldehid, hangyasav stb.) indukálja-e a metanollal szabályozott géneket. Az AOX nélküli Pichia törzs második jelentősége az, hogy lehetővé teszik az 5. és 6. példákban ismertetett heterológ géntermékek nagy mennyiségű kifejeződését.
Az AOX gén roncsolására pYMI7 plazmidot (7. ábra) állítunk elő. Ehhez a pYM25 plazmidot (NRRL B-18015, 17. ábra) Sáli segítségével részlegesen és BamHI segítségével teljesen emésztjük. A kapott 2,9 kb BamHI/Sall fragmens a Saccharomyces cerevisiae ARG4 génjét tartalmazza.
A pPG4.0 plazmidot (NRRL B-15 868, 16a ábra, a plazmid Pichia részének hasítási térképe) BamHI segítségével hasítjuk és a fenti 2,9 kb fragmenssel ligáljuk. Mivel a 2,9 kb fragmens Sall-vége nem felel meg a BamHI-végnek, Klenow-enzimmel „betöltés”-t végzünk a BamHI-végek ligálása után, majd a fragmens korábbi Sáli helyének tompa végét és a vektor korábbi BamHI helyének betöltött részét ligáljuk.
A kapott pYMI7 plazmidban a beépítés hatására az AOX1 gén 5’ szakaszáról mintegy 600 bp rész (a gén mintegy 1/4-e) törlődik. A pYMI7 plazmidot PvuII-vel és EcoRI-val a szokásos körülmények között emésztjük, és az Arg+ prototrófia kiszelektálásával PPFl-be (arg4, his4, NRRL Y—18017) transzformáljuk. A transzformánsokat extraháljuk a regenerációs agárról, és a 2. példában leírt módon ultrahanggal kezeljük, végül 0,1 tömeg% glükózt (2 tömeg% helyett) és 40 pg/ml hisztidint tartalmazó SD közegű agar lemezekre visszük fel. A kapott telepeket (hisztidint tartalmazó) SD közegű agar lemezekre visszük át, amelyek a következő szénforrásokkal rendelkeznek:
1. szén nélkül,
2. 0,5 tömeg% metanol és
3.2 tömeg% glükóz.
Az Arg+ telepek mintegy 81,0%-a nem képes normálisan fejlődni metanolon. A metanolt nem használó
HU 208 552 Β telepek közül kettőn, KM71 és KM72, Southern-féle folt analízist végzünk a genom DNS-en, amellyel megállapítjuk, hogy az AOX1 gén roncsolódott, és a vektor beépült, mint ezt a 8. ábra alján láthatjuk.
A PPFl-pYMI7 alkohol oxidáz nélküli szerkezet genotípusa: (his4 aoxl: : SARG4), amely igen értékes. Például, mivel a törzs his4, az olyan Pichia vektor, amely szelektálható markerként HIS 4 gént tartalmaz, ilyen például a pSAOH5 (NRRL B-15 862, 9. ábra), az 5. példában leírt módon a fenti gazda szervezetbe transzformálható.
5. példa
A lacZ gén metanollal szabályozott kifejeződése alkohol oxidáz nélküli mutáns Pichia pastoris törzsben Ez a példa a lacZ gén 4. példa szerint előállított
KM71 Pichia gazdaszervezetben (PPFI-pYMI7 alkohol oxidáz nélküli szervezet) kifejezését ismerteti.
Az összehasonlító vizsgálatokhoz Aoxl gazdaként KM71-et (his4 aoxl : : SARG4) és Aoxl+ gazdaként PPFl-et (arg4, his4; NRRL Y-18017) alkalmazunk. Az AOX1 promoter-lacZ kifejező szakaszt mindkét törzsbe a pSAOH5 plazmidon (9. ábra, NRRL B15 862) transzformáljuk. Mindkét törzsből több stabil His+ transzformánst izolálunk. Ezek genomiális DNSeit Southern-féle folt analízissel vizsgáljuk, amelynek során az A0X1 promoter helyén kapcsolódó pSAOH5öt tartalmazó törzskészletet nyerünk. Élthez hasonlóan a dihidroxi-aceton-szintáz (DAS) promoter-lacZ génfúziót KM71-be és PPFÍ-be transzformáljuk pT76H3 plazmidon (18. ábra, NRRL B-18000) hisztidin prototrópia kiszelektálásával.
Mind a négy törzs fejlődik SD közegen, kivéve azt, amely 2 tömeg% glükóz helyett egyedüli szén- és energiaforrásként 2 tömeg% glicerint tartalmaz. A tenyészeteket centrifugáljuk, majd egyedüli szénforrásként 0,5 tömeg% metanolt tartalmazó SD közegre visszük át. A mintákat β-galaktozidázra vizsgáljuk, az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat β-galaktozidáz, egység/gg*
| Idő (h) | Aoxl + | gazda | Aoxl | gazda |
| promoter | AOX1 | DAS | AOX1 | DAS |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 3 | 2 | 5 | 4 |
| 4 | 11 | 8 | 7 | 7 |
| 10 | 18 | 9 | 12 | 11 |
| 16 | 17 | - | 26 | - |
| 20 | 21 | 12 | 38 | 18 |
| 25 | - | 16 | - | 24 |
| 30 | 18 | - | 43 | 27 |
| 32 | - | 22 | - | 37 |
| 42 | 14 | - | 72 | - |
| 50 | - | 22 | - | 48 |
| 54 | 14 | - | 48 | - |
- β-galaktozidáz vizsgálat
A) Alkalmazott oldószerek
| Z-puffer: | Végső koncentráció | |
| Na2HPO4x7 H2O | 16,1 g | 0,06 mól/1 |
| NaH2PO4 | 5,5 g | 0,04 mól/1 |
| KC1 | 0,75 g | 0,01 mól/1 |
| MgSO4x7 H2O | 0,246 g | 0,001 mól/1 |
| 2-merkapto-etanol | 2,7 ml | 0,05 mól/1. |
Az egészet 1 literre töltjük, a pH-t 7 értékre állítjuk.
2. O-Nitro-fenil^-D-galaktozid (ONPG)
400 mg ONPG-t (Sigma N-1127) 100 ml desztillált vízben oldva 4 mg/ml ONPG oldatot kapunk.
B) Vizsgálati eljárás
1. A tenyészközeg alikvot részét (20-50 OD600 élesztősejt) centrifugáljuk, és a sejteket hideg steril vízzel mossuk.
2. Hozzáadunk 1 μΐ 40 tömeg%-os Z-puffert, és 0,2 gg savval mosott 0,45-0,50 mm üvegszemcsét. A mintákat jégre helyezzük, majd kétszer 1 percen keresztül intenzíven kevertetjük. A kevertetési fázisok között a mintákat legalább 1 percen keresztül jégen tartjuk.
3. Akivonatokat mikrocentrifuga csövekbe helyezzük, és 4 °C hőmérsékleten 5 percen keresztül centrifugáljuk. A frissen centrifugált minták felülúszóját elválasztjuk, és az extraktumot jégen tartjuk.
4. Az extraktum teljes fehérjekoncentrációját a BioRad Laboratories (Bradford) fehérjevizsgálati módszerével határozzuk meg. Ehhez a Bio-Rad-festékreagens koncentrátumot 4 térfogat ionmentesített vízzel hígítjuk, és Whatman 3MM papíron szűrjük. A standard koncentrációgörbe felvételéhez 3, 10, 30 és 100 gg marhaszérum albumint (BSA) 100 gl Z-pufferben 13 db 100 mm-es üvegcsőbe adagolunk, amely 2,5 ml festékreagenst tartalmaz. A mintákat összekeverjük, és 5 percen keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd az optikai sűrűséget 595 nm-nél mérjük. Az extraktumból 3, 10 és 30 gl mintát 100 gl, Z-puffert tartalmazó oldatban a fent leírt módon analizálunk. Az extraktumok protein koncentrációját a BSA koncentrációs görbén interpolálással határozzuk meg.
5. A β-galaktozidáz vizsgálathoz 10 gl tízszeresen hígított extraktot adunk 1 ml Z-pufferhez, és az elegyet 5 percen keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
6. A reakciót 0,2 ml ONPG (4 mg/ml) hozzáadásával indítjuk, és kevertetjük.
7. A reakciót 0,5 ml 1 mól/1 Na2CO3 oldattal a kívánt időpontban (általában 1-30 perc között, A42O<1) megállítjuk.
8. A felülúszó abszorpcióját 420 nm-en vizsgáljuk.
C) A β-galaktozidáz aktivitásegység meghatározása
Egy egység (U) megfelel percenként 1 nmól ortonitrofenol (ONP) képződésének 30 °C hőmérsékleten és pH = 7 értéken.
nmól ONP abszorpciója 420 nm-en (A420) 0,0045 1 cm hosszon, vagyis 420 nm-en mért 1-es abszorpció, 222 nmól ONP/ml vagy 378 nmól/1,7 ml értéknek felel meg, mivel a felülúszó analizált térfogata 1,7 ml. Ennek megfelelően az egységet az alábbi képlet alapján számoljuk:
HU 208 552 Β
U = Á42-~ χ 378 t(perc)
Mind a 4 minta alig detektálható β-galaktozidáz aktivitást mutat a glicerol fejlődési fázisban. A metanol közegbe való áthelyezés után mintegy 10-20 órával az Aoxl+ gazdában AOXl-lacZ és DAS-lacZ kifejező szakaszt tartalmazó két tenyészet β-galaktozidáz aktivitást mutat mintegy 20 egység/pg fehérje szinten. Az Aoxlban AOXl-lacZ szakaszt tartalmazó minta aktivitása 60 egy ség/pg. Az Aoxl gazdában DAS-lacZ szakaszt tartalmazó minta β-galaktozidáz aktivitása szintén megnövekedett, vagyis a transzfomált Aoxl gazda, KM71, a β-galaktozidáz 2-3-szoros szintjén fejezi ki a transzformáit izogén Aoxl+ törzs, PPF1 viszonylatában.
6. példa
A Hepatitis B felületi antigén gén beépítése és az
AOX1 gén törlése
A helyspecifikus beépítés/törlésnek ebben a példájában az AOX1 gén teljes kódoló szekvenciáját töröljük, és a Hepatitis B felületi antigén (HBsAg) gént építjük be az AOX1 gén promoter felhasználásával, amely a genomban marad. Ehhez a P. pastoris gazdaszervezethez pBSAGI5I plazmidot állítunk elő (deponálva E. coli gazdaszervezetben a Northern Régiónál Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois helyen és a jelen bejelentésre vonatkozó szabadalom engedélyezése után a köz által korlátozás nélkül hozzáférhető, száma NRRL B—18 021, 12. ábra). A plazmid egy 1,0 kbp fragmenst tartalmaz és AOX1 gén 5 ’ végéhez kapcsolódó szekvenciából, ezután egy Hepatitis B felületi antigén (HBsAg) szekvenciát és 300 bp AOXI1 terminátor fragmenst (9., 10. és 11. ábra). A kifejeződő szakaszt 2,7 kbp fragmens követi, amely a Pichia HIS4 gént kódolja, valamint egy 1,5 kbp PvuII fragmens, amely tartalmazza az AOX1 gén 3’ szekvenciáját. Ha a pBSAGI5I-et BglII-vel emésztjük, egy 7,2 kbp lineáris vektort kapunk, amely 0,85 kbp 5’-AOXl génszekvenciát tartalmaz az egyik végén, és 1,1 kbp 3’-AOXl szekvenciát tartalmaz a másik végén. A BglII-vel hasított pBSAGI5I-et GS 115-be transzformáljuk hisztidin prototrófia kiszelektálásával, a transzformánsokat a regenerációs agárról extraháljuk, és a 2. példában leírt módon ultrahanggal kezeljük, végül 0,1 tömeg% glükózt (2,0 tömeg% helyett) tartalmazó SD közegű agarlemezre visszük fel. A kapott telepeket minimál agar lemezekre visszük át, amelyek szénforrásként a következőket tartalmazzák:
1. szén nélkül,
2. 0,5 tömeg% metanol,
3. 2 tömeg% glükóz.
A vizsgált telepek átlag 32%-a nem képes normálisan fejlődni metanolon.
A metanolt nem használó telepek közül kettőn Southem-féle folt analízist hajtunk végre a genom DNSen, amely azt mutatja, hogy az AOX1 gén törlődött, és a vektor szekvencia beépült (13. ábra).
Metanolon növekedve a GS115-pBSAGI5I törzs (AOX1 : : HBsAg-HIS4) a HBsAg-t magasabb szinten fejezi ki, mint a hasonlóan transzformált teljes alkohol oxidázt tartalmazó sejtek.
7. példa
A P. pastoris szekunder alkohol oxidáz génjének azonosítása a helyspecifikus módosítás módszerével
A szekunder alkohol oxidáz gén jelenlétére az alábbi megfigyelésekből lehet következtetni:
1. Azok a Southern-foltok, amelyekben az AOX cDNS vagy a genom DNS mintáit korlátozott Pichia genom DNS-sel hibridizáltuk, mindig legalább 2 sávot mutatnak.
2. Két Pichia genom DNS fragmenst izoláltunk, amelyek hasonlóak, de nem azonosak (16. ábra).
3. Mutáns Pichia törzsek, így KM71 és GS115pBSAGI5I, amelyekben a primer AOX gént (AOX1) töröljük vagy roncsoljuk, továbbfejlődnek metanolon és alkohol oxidáz aktivitást mutatnak.
Az AOX törzsek metanolon fejlődő sejtjeinek fejlődési aránya az AOX aktivitása sokkal alacsonyabb, mint az izogén Aoxl+ törzseknél. Úgy tűnik tehát, hogy a szekunder AOX gén (AOX2) sokkal alacsonyabb szinten fejlődik ki, vagy termékei kevésbé aktívak metanolon. A
4. példában bemutatjuk, hogy a Pichia DNS fragmens pPG4.0-ben tartalmazza az AOX1 gént.
A legmeggyőzőbb eljárás annak bemutatására, hogy a pPG3.0 genom DNS fragmense az AOX2 gén legalább egy részét tartalmazza, ha olyan mutáns törzset állítunk elő, amelyben az eredeti AOX2 gént roncsoljuk vagy töröljük. Ehhez helyspecifikus pXMI12a vektort (14. ábra) állítunk elő. A plazmid elsődlegesen pPG3.0-ból (16b ábra) áll, amely eredeti AOX2 gént tartalmaz egy 3,0 kbp BamHI fragmensen. A 2,7 kbp BglII fragmenst, amely tartalmazza a Pichia HIS4 gént, pYJ8-ból (3. ábra, NRRL B—15 889) izoláljuk, és a pPG3.0 BglII és bal oldali KpnI helyei között elhelyezkedő szekvencia helyére építjük be. (A KpnI helyet BglII hellyé alakítjuk át egy oligonukleotid adapter segítségével a beépítés előtt.
Az alakításhoz szükséges adaptert a területen jártas szakember a régi (KpnI) és az új (BglII) hasítóhely ismeretében könnyen ki tudja választani. Az eljárás megvalósítható például a 19. ábra szerint.
HIS4 gén BamHI helyét „filling in” módszerrel roncsoljuk a 20. ábra szerint a pPG3.0-ba történő beépítés előtt.) Az AOX1 és az eredeti AOX2 gének (16. ábra) összehasonlítása azt mutatja, hogy ezt a szerkezetet mintegy 800 bp törlésével kapjuk az AOX2 közepén. Ha pXMI12a-t BamHI-vel emésztjük, 4,5 kbp lineáris vektort kapunk, amely olyan HIS4 gén fragmenst tartalmaz, amelyhez az eredeti AOX2 helyről származó 1,1 és 0,7 kbp szekvenciák kapcsolódnak (15. ábra).
Ezt a lineáris vektort AOX1 törzsbe, KM71 (AOX1 HSI4 : : SARG4) transzformáljuk, és a transzformánsokat hisztidin prototrófia kiszelektálásával izoláljuk. A transzformánsokon agar lemezre történő átültetéssel megvizsgáljuk a metanol felhasználási képességet.
A KM71 transzformálatlan Aoxl törzs metanol lemezeken olyan lassan növekszik, hogy az agárból a me10
HU 208 552 Β tanol elpárolog, mielőtt jelentős növekedés figyelhető meg. A probléma megoldásához a sejteket gőzfázisban metanollal tápláljuk. Ehhez mintegy 0,2 ml 100%-os metanolt helyezünk a lemezek alá, amelyek az agar közegben nem tartalmaznak szénforrást. A lemezeket szobahőmérsékleten állni hagyjuk, és az alsó részben minden 24 napban pótoljuk a friss metanolt. Mintegy 1-2 hét után nyilvánvalóvá válik a különbség a vad típus (Aoxl+, Aox2+) és a mutáns törzsek [(Aoxl- Aox2+) és Aoxl Aox2“] metanolos fejlődése között.
A gőzfázisú táplálás után azt tapasztaljuk, hogy az Aoxl törzsek His+ transzformánsának mintegy 0,1 %-a képtelen metanolon fejlődni. 8 Aoxl-Aox2- His- transzformáns DNS-ét Southem-féle hibridizációs módszerrel analizáljuk. 3 DNS tartalmazza a beépült lineáris pXMI12a vektort (15. ábra). Egy Aoxl-Aox2- dupla mutáns KM7121 (NRRL Y—18 019) analízise azt mutatja, hogy a törzs egyáltalán nem fejlődik metanolon, és nem mutat detektálható AOX aktivitást. A KM7121 fenti tulajdonsága alapján nyilvánvaló, hogy a Pichia ffagmens pPG3.0-ban szekunder AOX gén szekvenciáját tartalmazza, és hogy a fenti két alkohol oxidázon kívül a P. pastoris nem mutat egyéb metanol oxidáló aktivitást.
A fenti példák csupán illusztrálják a találmány alkalmazhatóságát, és nem jelentik az oltalmi kör korlátozását. A találmány lényegét nem érintő lehetséges variációk és módosítások a találmány oltalmi körén belül maradnak.
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás mutáns Pichia szervezet létrehozására egy Pichia nembeli élesztő genomjának helyspecifikus módosításával a genom előre meghatározott helyén, azzal jellemezve, hogy- valamely, a Pichia nemhez tartozó élesztőtörzs genomiális DNS-ének szakaszaival homológ DNS fragmens belső szakaszát valamely, egy szelektálható marker gént és adott esetben egy szabályozó szakaszt és egy heterológ gént tartalmazó DNS fragmenssel helyettesítjük oly módon, hogy mind az 5’-végnél, mind a 3’-végnél legalább 200 nukleotidot megtartunk a Pichia nemhez tartozó élesztőtörzs genomiális DNSének szakaszaival homológ DNS fragmensből, és- a fenti DNS fragmenssel egy Pichia nembeli élesztőtörzset transzformálunk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy homológ DNS fragmensként 200-5000 bázispár hosszúságú alkohol-oxidáz gént, dihidroxi-acetonszintáz gént és/vagy hisztidinol-dihidrogénáz gént alkalmazunk.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként pYMIl-gyel transzformálunk.
- 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként a pYMI3a-nak a G418 gént tartalmazó EcoRI/EcoRI fragmensével transzformálunk.
- 5. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként a pYMI7-nek a Saccharomyces cerevisiae ARG4 gént tartalmazó EcoRI/PvuII fragmensével transzformálunk.
- 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként a pBSAGI5I-nek a Pichia HIS4 gént tartalmazó BglII/BglII fragmensével transzformálunk.
- 7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS fragmensként a pYMI12a-nak a Pichia HIS4 gént tartalmazó BamHI/BamHI fragmensével transzformálunk.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Pichia nembeli élesztőtörzsként Pichia pastoris törzset transzformálunk.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris GS115-pBSAGI5I létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris GS115 törzset a pBSAGI5I plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk,
- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris GS190-pXMIl létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris GS190 törzset a pXMIl plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk.
- 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris NRRL Y-18018 (NRRL Y-ll430-pYMI3a; KM31) létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris NRRL Y-ll 430 törzset a pXMI3A plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk.
- 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris PPFl-pXMI7 (KM71) létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris PPF1 törzset a pXMI7 plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk.
- 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris NRRL Y-18019 (PPFl-pYMI7-pYMI12a; KM7121) létrehozására, azzal jellemezve, hogy gazdatörzsként Pichia pastoris PPF1 törzset a pYMI7-pYMI12a plazmidnak a homológ DNS fragmenst és a szelektálható marker gént tartalmazó fragmensével transzformálunk.
- 14. Az 1., 2. vagy 8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy homológ DNS fragmensként a Pichia pastoris A0X2 génjét kódoló DNS fragmenst alkalmazzuk.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 16b ábra szerinti hasítási térképpel jellemezhető AOX2 gént alkalmazzuk.
- 16. Eljárás polipeptidek előállítására Pichia pastoris AOX1- gazdasejtekben, azzal jellemezve, hogy egy alkohol oxidáz promotert vagy dihidroxi-aceton-szintáz promotert és ehhez működőképesen kapcsolt heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS vektorral Pichia pastoris AOX1- törzset transzformálunk, a sejteket szénforrásként metanolt tartalmazó táptalajon tenyésztjük, és a polipeptidet kinyerjük.HU 208 552 B Int. Cl 5 C 12 N 15/81HIS 4Ha or pYMIl 8.0 KbpZZ2HU 208 552 B
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/791,013 US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1985-10-25 | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT44612A HUT44612A (en) | 1988-03-28 |
| HU208552B true HU208552B (en) | 1993-11-29 |
Family
ID=25152397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU864480A HU208552B (en) | 1985-10-25 | 1986-10-24 | Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4882279A (hu) |
| EP (2) | EP0560401B1 (hu) |
| JP (1) | JP2614215B2 (hu) |
| KR (1) | KR930002738B1 (hu) |
| CN (1) | CN86107108A (hu) |
| AT (2) | ATE98695T1 (hu) |
| AU (2) | AU581107B2 (hu) |
| CA (1) | CA1339209C (hu) |
| DD (1) | DD255544A5 (hu) |
| DE (2) | DE3650749T2 (hu) |
| DK (1) | DK510786A (hu) |
| EG (1) | EG17985A (hu) |
| ES (2) | ES2152233T3 (hu) |
| FI (1) | FI98931C (hu) |
| HU (1) | HU208552B (hu) |
| IE (1) | IE68454B1 (hu) |
| IL (1) | IL80286A (hu) |
| IN (1) | IN166443B (hu) |
| MX (1) | MX168390B (hu) |
| NO (1) | NO176923C (hu) |
| NZ (1) | NZ217809A (hu) |
| PH (1) | PH25990A (hu) |
| PL (1) | PL154843B1 (hu) |
| PT (1) | PT83618B (hu) |
| YU (1) | YU46758B (hu) |
| ZA (1) | ZA867650B (hu) |
Families Citing this family (166)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| IL89993A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts |
| IL90021A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Process for the production of interferon |
| IL89991A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of hepatitis b pres2 protein in methylotrophic yeasts |
| IL89989A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts |
| IL89992A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
| AT390267B (de) * | 1988-06-08 | 1990-04-10 | Vogelbusch Gmbh | Verfahren zum markieren und identifizieren von industriell eingesetzten mikroorganismen, vorzugsweise hefestaemmen |
| US5102789A (en) * | 1989-03-15 | 1992-04-07 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells |
| US5204252A (en) * | 1989-02-08 | 1993-04-20 | Henkel Research Corporation | Candida tropicalis transformation system |
| WO1990009434A1 (en) * | 1989-02-13 | 1990-08-23 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells |
| CA2017176A1 (en) * | 1989-05-22 | 1990-11-22 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. | Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin |
| JPH0669365B2 (ja) * | 1989-05-22 | 1994-09-07 | 株式会社ミドリ十字 | アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法 |
| US5369028A (en) * | 1990-04-03 | 1994-11-29 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same |
| US6440681B1 (en) | 1990-04-03 | 2002-08-27 | Merck & Co., Inc. | Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors |
| US5258302A (en) * | 1990-07-03 | 1993-11-02 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| EP0548267A4 (en) * | 1990-09-04 | 1994-11-23 | Salk Inst Biotech Ind | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
| EP0578746B1 (en) * | 1991-04-01 | 2002-07-03 | Merck & Co., Inc. | GENES WHICH INFLUENCE $i(PICHIA) PROTEOLYTIC ACTIVITY, AND USES THEREFOR |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
| US5665600A (en) * | 1991-09-18 | 1997-09-09 | Research Corporation Technologies, Inc. | Pichia pastoris linear plasmids and DNA fragments thereof |
| CA2158017C (en) * | 1993-03-03 | 2005-05-17 | David Leroy Anton | Production of glycolate oxidase in methylotrophic yeast |
| CA2155330C (en) * | 1993-03-08 | 2002-01-29 | Kathryn J. Elliott | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same |
| GB2286188B (en) * | 1993-04-20 | 1997-11-12 | Salk Inst Biotech Ind | Human N-methyl-D-aspartate receptor subunits,nucleic acids encoding same and uses therefor |
| BR9406888A (pt) * | 1993-05-28 | 1996-03-26 | Du Pont | Processo de preparaçao de uma mistura de glioxilato e de aminometilfosfonato de dialquila processo de preparaçao de um intermediário para de produçao de n-(fosfonometil)glicina e processo de preparaçao de n-(fosfonometil)glicina |
| US6001581A (en) | 1993-06-04 | 1999-12-14 | Sibia Neurosciences, Inc. | Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors |
| US5521297A (en) | 1993-06-04 | 1996-05-28 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates | Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors |
| US5912122A (en) * | 1993-06-04 | 1999-06-15 | Sibia Neurosciences, Inc. | Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6 |
| US6495343B1 (en) | 1993-06-18 | 2002-12-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CRF receptor(s) |
| US6638905B2 (en) * | 1993-06-18 | 2003-10-28 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CFR receptor(s) |
| GB2287941B (en) * | 1993-11-08 | 1998-01-28 | Salk Inst Biotech Ind | Human alpha2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same |
| WO1995015972A1 (en) * | 1993-12-09 | 1995-06-15 | Thomas Jefferson University | Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells |
| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| DE69535317T2 (de) * | 1994-10-18 | 2007-06-21 | Dendreon Corp., Seattle | Aus nematoden extrahierte serinprotease-inhibitoren und die koagulation hemmende proteine |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| CN102080070B (zh) | 1995-03-17 | 2016-01-20 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 新的内切葡聚糖酶 |
| US6485967B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-11-26 | Merck & Co., Inc. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid |
| AU7719696A (en) * | 1995-10-18 | 1997-05-07 | New York Blood Center, Inc., The | Recombinant alpha-n-acetylgalactosaminidase enzyme |
| CA2237120C (en) * | 1995-11-09 | 2005-03-01 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica |
| US6001597A (en) * | 1995-11-09 | 1999-12-14 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
| EP1975177B1 (en) | 1996-03-01 | 2011-04-13 | Novo Nordisk A/S | An appetite-suppressing peptide, its compositions and use |
| US5731181A (en) * | 1996-06-17 | 1998-03-24 | Thomas Jefferson University | Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides |
| KR100611063B1 (ko) | 1996-10-16 | 2006-08-09 | 지모제넥틱스, 인코포레이티드 | 섬유아세포 성장인자 상동체 |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| DK1115862T3 (da) | 1998-09-23 | 2009-11-16 | Zymogenetics Inc | Cytokinreceptor Zalpha11 |
| DE69939330D1 (de) | 1998-12-07 | 2008-09-25 | Zymogenetics Inc | Wachstumsfaktor-homologe zvegf-3 |
| US6780615B1 (en) | 1998-12-31 | 2004-08-24 | Genway Biotech Inc. | Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system |
| US7833529B1 (en) | 1999-01-07 | 2010-11-16 | Zymogenetics, Inc. | Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor |
| ES2338661T3 (es) | 1999-01-07 | 2010-05-11 | Zymogenetics, Inc. | Usos terapeuticos de receptores solubles br43x2. |
| CN101575377B (zh) | 1999-03-09 | 2012-12-26 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | 作为zalpha受体之配体的人细胞因子及其用途 |
| US7504253B2 (en) * | 1999-06-11 | 2009-03-17 | The Burnham Institute For Medical Research | Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof |
| AU6069800A (en) | 1999-07-07 | 2001-01-30 | Zymogenetics Inc. | Human cytokine receptor |
| DE60043944D1 (de) | 1999-12-23 | 2010-04-15 | Zymogenetics Inc | Zytokin zcyt018 |
| DE60142511D1 (de) | 2000-05-11 | 2010-08-19 | Zymogenetics Inc | Zsig33-ähnliche peptide |
| JP2004501628A (ja) | 2000-06-26 | 2004-01-22 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | サイトカイン受容体ｚｃｙｔｏｒ１７ |
| MXPA03000105A (es) * | 2000-06-28 | 2004-09-13 | Glycofi Inc | Metodo para producir glicoproteinas modificadas. |
| US7863020B2 (en) * | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
| US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
| US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
| MXPA02012688A (es) | 2000-06-30 | 2004-09-10 | Flanders Interuniversity Inst | Modificacion de glicosilacion de proteina en pichia pastoris. |
| US6927040B2 (en) | 2000-06-30 | 2005-08-09 | Zymogenetics, Inc. | Interferon-like protein Zcyto21 |
| US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
| EP1736545A3 (en) | 2000-08-08 | 2007-03-28 | ZymoGenetics, Inc. | Soluble zcytor 11 cytokine receptors |
| JP2004533997A (ja) | 2001-02-20 | 2004-11-11 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | Ｂｃｍａ及びｔａｃｉの両者を結合する抗体 |
| AU2002249096B2 (en) | 2001-03-22 | 2007-06-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Coagulation factor VII derivatives |
| AU2002307504B2 (en) | 2001-04-05 | 2006-10-26 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Alcohol oxidase 1 regulatory nucleotide sequences for heterologous gene expression in yeast |
| PL403488A1 (pl) | 2001-05-24 | 2013-07-08 | Zymogenetics, Inc. | Zastosowanie bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, bialko fuzyjne, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca bialko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina |
| WO2003040313A2 (en) | 2001-11-05 | 2003-05-15 | Zymogenetics, Inc | Il-21 antagonists |
| US7087418B2 (en) * | 2001-12-19 | 2006-08-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor |
| AU2003280410B8 (en) | 2002-01-18 | 2009-04-23 | Zymogenetics, Inc. | Cytokine receptor zcytor17 multimers |
| ES2310660T3 (es) | 2002-01-18 | 2009-01-16 | Zymogenetics, Inc. | Citoquina (ligando zcytor17). |
| US20060088834A1 (en) * | 2002-04-15 | 2006-04-27 | Gretchen Bain | Matrix analysis of gene expression in cells (magec) |
| WO2003089603A2 (en) | 2002-04-19 | 2003-10-30 | Zymogenetics, Inc. | Cytokine receptor |
| US7252933B2 (en) | 2002-06-26 | 2007-08-07 | Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology | Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast |
| ATE494367T1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-01-15 | Hoffmann La Roche | Rekombinante desoxyribonuclease i aus rinder- pankreas mit hoher spezifischer aktivität |
| ATE387494T1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-03-15 | Hoffmann La Roche | Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten |
| US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
| EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
| EP1927600A1 (en) | 2003-08-07 | 2008-06-04 | Zymogenetics, Inc. | Homogeneous preparations of IL-28 and IL-29 |
| ATE547519T1 (de) | 2003-09-09 | 2012-03-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Gerinnungsfaktor-vii-polypeptide |
| ATE455849T1 (de) * | 2003-12-05 | 2010-02-15 | Hoffmann La Roche | Rekombinante carboxypeptidase b und ihre aufreinigung |
| JP2007521823A (ja) | 2004-02-13 | 2007-08-09 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ変異型 |
| CA2558811A1 (en) | 2004-03-08 | 2005-09-22 | Zymogenetics, Inc. | Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them |
| EP2389944A1 (en) | 2004-07-29 | 2011-11-30 | ZymoGenetics, L.L.C. | Use of IL-28 and IL-29 to treat cancer |
| EP1781784A2 (en) | 2004-08-02 | 2007-05-09 | BASF Plant Science GmbH | Method for isolation of transcription termination sequences |
| JP2008532931A (ja) | 2005-02-08 | 2008-08-21 | ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド | 抗ｉｌ−２０、抗ｉｌ−２２および抗ｉｌ−２２ｒａ抗体ならびに結合パートナー、ならびに炎症における使用法 |
| MX2007012887A (es) | 2005-04-18 | 2007-12-10 | Novo Nordisk As | Variantes il-21. |
| ATE515512T1 (de) | 2005-05-12 | 2011-07-15 | Zymogenetics Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur modulierung von immunreaktionen |
| WO2006130657A2 (en) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Stereoselective reduction process for the preparation of pyrrolotriazine compounds |
| AU2006278227B2 (en) | 2005-08-09 | 2011-10-20 | Ares Trading S.A. | Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules |
| US7842292B2 (en) * | 2005-08-09 | 2010-11-30 | Ares Trading S.A. | Methods for treating B-cell malignancies using a TACI-Ig fusion molecule |
| US9056921B2 (en) | 2005-08-16 | 2015-06-16 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| JP5690047B2 (ja) | 2005-09-14 | 2015-03-25 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | ヒト凝固第ｖｉｉ因子ポリペプチド |
| BRPI0616054B8 (pt) * | 2005-09-14 | 2021-05-25 | Sanofi Aventis Deutschland | processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, tripsina porcina, método para sua produção, dna e vetor |
| US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
| PT1931697E (pt) | 2005-09-28 | 2010-12-06 | Zymogenetics Inc | Antagonistas de il-17a e il-17f e processos para a sua utilização |
| MX2008014365A (es) * | 2006-05-15 | 2008-11-27 | Ares Trading Sa | Metodos para tratar enfermedades autoinmunitarias utilizando una molecula de fusion del activador de transmembrana-inmunoglobulina. |
| JP5503968B2 (ja) | 2006-09-27 | 2014-05-28 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | 成熟インスリンポリペプチドの作製方法 |
| EP2508613A3 (en) | 2007-04-03 | 2012-11-28 | Oxyrane UK Limited | Glycosylation of molecules |
| US20100240597A1 (en) | 2007-06-15 | 2010-09-23 | Arkansas State University | Methods of delivery of molecules to cells using a ricin subunit and compositions relating to same |
| DK2225267T3 (en) | 2007-11-21 | 2015-04-27 | Roskilde Uni | Polypeptides comprising a isbindende activity |
| CN101952309A (zh) * | 2007-12-21 | 2011-01-19 | Ifxa有限公司 | 蛋白酶抑制剂 |
| WO2009092806A2 (en) * | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Aarhus Universitet | Selective exosite inhibition of papp-a activity against igfbp-4 |
| CA2717128A1 (en) * | 2008-03-03 | 2009-09-17 | Chung-Ming Hsieh | Methods for transforming yeast |
| PL2274008T3 (pl) | 2008-03-27 | 2014-07-31 | Zymogenetics Inc | Kompozycje i sposoby hamowania PDGFRbeta i VEGF-A |
| JPWO2009139349A1 (ja) * | 2008-05-14 | 2011-09-22 | Ｂｉｏ−ｅｎｅｒｇｙ株式会社 | 酵母細胞に遺伝子を導入する方法およびそのためのベクター |
| US8658766B2 (en) | 2008-06-27 | 2014-02-25 | Zymogenetics, Inc. | Soluble hybrid Fcγ receptors and related methods |
| WO2010069913A1 (en) | 2008-12-16 | 2010-06-24 | Novartis Ag | Yeast display systems |
| NZ606427A (en) | 2009-02-03 | 2014-10-31 | Amunix Operating Inc | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
| WO2010103038A1 (en) | 2009-03-11 | 2010-09-16 | Novo Nordisk A/S | Interleukin-21 variants having antagonistic binding to the il-21 receptor |
| EP2454281B1 (en) | 2009-07-17 | 2018-11-14 | Omeros Corporation | Masp isoforms as inhibitors of complement activation |
| WO2011028228A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same |
| CN104651428A (zh) | 2009-09-29 | 2015-05-27 | 根特大学 | 水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖 |
| EP2501805B1 (en) | 2009-11-19 | 2019-02-20 | Oxyrane UK Limited | Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans |
| WO2011064282A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Novo Nordisk A/S | Method for making polypeptides |
| EP2507258B1 (en) | 2009-12-01 | 2016-04-20 | Novo Nordisk A/S | Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases |
| US9815876B2 (en) | 2010-03-05 | 2017-11-14 | Omeros Corporation | Chimeric inhibitor molecules of complement activation |
| CA2802017A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Zymogenetics, Inc. | Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods |
| JP6151183B2 (ja) | 2010-09-29 | 2017-06-21 | オキシレイン ユーケー リミテッド | マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合からキャップを外すことおよびリン酸化ｎ−グリカンを脱マンノシル化することができるマンノシダーゼならびに哺乳動物細胞による糖タンパク質の取り込みを促進する方法 |
| CA2812872C (en) | 2010-09-29 | 2021-08-03 | Oxyrane Uk Limited | De-mannosylation of phosphorylated n-glycans |
| BR112014015933A2 (pt) | 2011-12-30 | 2019-09-24 | Oxyrane Uk Ltd | métodos e materiais para reduzir a degradação das proteínas recombinantes |
| SG11201404332RA (en) | 2012-02-01 | 2014-08-28 | Synthetic Genomics Inc | Materials and methods for the synthesis of error-minimized nucleic acid molecules |
| ES2676029T3 (es) | 2012-02-09 | 2018-07-16 | Var2 Pharmaceuticals Aps | Direccionamiento de glicanos de sulfato de condroitina |
| ES2935489T3 (es) | 2012-02-15 | 2023-03-07 | Bioverativ Therapeutics Inc | Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas |
| CA2864126A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Recombinant factor viii proteins |
| EP2825193B1 (en) | 2012-03-15 | 2019-11-13 | Oxyrane UK Limited | Methods and materials for treatment of pompe's disease |
| KR101958234B1 (ko) * | 2012-05-09 | 2019-03-14 | 엘지이노텍 주식회사 | 보이스 코일 모터 |
| EP2906693A1 (en) | 2012-10-15 | 2015-08-19 | Novo Nordisk Health Care AG | Coagulation factor vii polypeptides |
| WO2014136065A2 (en) | 2013-03-05 | 2014-09-12 | Oxyrane Uk Limited | Production of catalytically active type i sulfatase |
| KR102351839B1 (ko) | 2013-03-21 | 2022-01-18 | 에보닉 오퍼레이션스 게엠베하 | 삼중 나선 단백질의 정제 |
| CN105308067B (zh) | 2013-06-07 | 2020-07-24 | 诺和诺德股份有限公司 | 制备成熟胰岛素多肽的方法 |
| WO2014202089A2 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Roskilde Universitet | Variants of anti-freeze polypeptides |
| US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
| US10155793B2 (en) | 2013-09-09 | 2018-12-18 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Modified bacterial collagen-like proteins |
| EP3196304B1 (en) | 2014-07-30 | 2021-10-06 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Method for improved high-level secretory production of proteins |
| MX2018001497A (es) | 2015-08-03 | 2018-05-15 | Bioverativ Therapeutics Inc | Proteinas de fusion de factor ix y metodos para producirlas y usarlas. |
| AU2016321146C1 (en) | 2015-09-08 | 2021-10-28 | Theripion, Inc. | ApoA-1 fusion polypeptides and related compositions and methods |
| CN108367004B (zh) | 2015-09-21 | 2022-09-13 | 阿帕特夫研究和发展有限公司 | Cd3结合多肽 |
| IL319473A (en) | 2016-12-02 | 2025-05-01 | Bioverativ Therapeutics Inc | Methods for treating hemophilic arthritis using chimeric blood clotting factors |
| WO2018136163A2 (en) | 2016-12-09 | 2018-07-26 | Theripion, Inc. | Tandem apoa-1 fusion polypeptides |
| JP7012663B2 (ja) * | 2016-12-15 | 2022-02-14 | 株式会社カネカ | 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 |
| US11725060B2 (en) | 2017-07-20 | 2023-08-15 | Aptevo Reserch and Development LLC | Antigen binding proteins binding to 5T4 and 4-1BB and related compositions and methods |
| PL3710484T3 (pl) | 2017-12-20 | 2024-03-25 | Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd | Przeciwciała wiążące ctla-4 i ich zastosowania |
| US10150801B1 (en) | 2017-12-27 | 2018-12-11 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
| AU2017444998B2 (en) | 2017-12-27 | 2024-05-16 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
| DE202019005554U1 (de) * | 2018-03-06 | 2021-01-18 | Joywell Foods, Inc. | Rekombinant exprimierte geschmacksmodifizierende Polypeptide und Präparate und Formulierungen, die diese enthalten |
| DK3793588T3 (da) | 2018-05-18 | 2025-06-16 | Bioverativ Therapeutics Inc | Fremgangsmåder til behandling af hæmofili a |
| EP3821244A1 (en) | 2018-07-13 | 2021-05-19 | Varct Diagnostics ApS | Isolation of circulating cells of fetal origin using recombinant malaria protein var2csa |
| CN111378585B (zh) * | 2018-12-28 | 2023-06-16 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株 |
| BR112021019477A2 (pt) * | 2019-04-01 | 2022-02-08 | Univ Wien Bodenkultur | Uma célula hospedeira de levedura metilotrófica deficiente de via de utilização de metanol recombinante, um método de produção de uma proteína de interesse, e uso de uma célula hospedeira em um método de produção de um produto de fermentação |
| US10675332B1 (en) | 2019-08-26 | 2020-06-09 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
| EP4021512A1 (en) | 2019-08-26 | 2022-07-06 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
| CA3182917A1 (en) | 2020-06-22 | 2021-12-30 | Ya-Huei Chen | Recombinant polypeptides and combinations for use in the treatment of cancer |
| AU2022223409A1 (en) | 2021-02-19 | 2023-09-21 | Theripion, Inc. | Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods |
| CN120584137A (zh) | 2023-01-06 | 2025-09-02 | 阿帕特夫研究和发展有限公司 | 双特异性pd-l1和cd40结合分子以及其用途 |
| WO2024259220A1 (en) | 2023-06-15 | 2024-12-19 | Theripion, Inc. | Pon3 and evolved pon1 fusion polypeptides |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| US4414329A (en) * | 1980-01-15 | 1983-11-08 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
| JPS57206699A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Plasmid patm 3 and its preparation |
| US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
-
1985
- 1985-10-25 US US06/791,013 patent/US4882279A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-29 CA CA000514838A patent/CA1339209C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-06 IE IE263786A patent/IE68454B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-06 NZ NZ217809A patent/NZ217809A/en unknown
- 1986-10-07 ZA ZA867650A patent/ZA867650B/xx unknown
- 1986-10-08 MX MX003971A patent/MX168390B/es unknown
- 1986-10-08 IN IN731/CAL/86A patent/IN166443B/en unknown
- 1986-10-09 PH PH34343A patent/PH25990A/en unknown
- 1986-10-10 IL IL80286A patent/IL80286A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 AU AU63882/86A patent/AU581107B2/en not_active Expired
- 1986-10-20 JP JP61249403A patent/JP2614215B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-20 KR KR1019860008825A patent/KR930002738B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1986-10-22 EG EG659/86A patent/EG17985A/xx active
- 1986-10-23 DE DE3650749T patent/DE3650749T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 ES ES93105818T patent/ES2152233T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 AT AT86114700T patent/ATE98695T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 DE DE3689411T patent/DE3689411T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 EP EP93105818A patent/EP0560401B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 ES ES86114700T patent/ES2061433T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 YU YU180386A patent/YU46758B/sh unknown
- 1986-10-23 EP EP86114700A patent/EP0226752B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 AT AT93105818T patent/ATE197962T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 CN CN198686107108A patent/CN86107108A/zh active Pending
- 1986-10-24 HU HU864480A patent/HU208552B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 PL PL1986262030A patent/PL154843B1/pl unknown
- 1986-10-24 DD DD29558586A patent/DD255544A5/de unknown
- 1986-10-24 PT PT83618A patent/PT83618B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 NO NO864275A patent/NO176923C/no unknown
- 1986-10-24 FI FI864319A patent/FI98931C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 DK DK510786A patent/DK510786A/da not_active Application Discontinuation
-
1988
- 1988-04-15 AU AU14699/88A patent/AU593436B2/en not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU208552B (en) | Process for producing polypeptides and for place-specific modification of genom ofpichia yeasts | |
| JP2873012B2 (ja) | 酵母ベクター | |
| US4885242A (en) | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof | |
| EP0226846B1 (en) | Yeast production of hepatitis b surface antigen | |
| US4855231A (en) | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast | |
| JP2572952B2 (ja) | 置換されたプロモーターを使用する宿主による異種起源蛋白質の製造方法 | |
| US5166329A (en) | DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia | |
| EP0123811A2 (en) | The use of the GAL 1 yeast promoter | |
| US5650296A (en) | Expression of hepatitis B S and preS2 proteins in Pichia pastoris | |
| HU209150B (en) | Method for expressing proteines of foreign origin by means of transformated varieties of yarrowia lipolytica and method for producing said varieties | |
| HU204097B (en) | Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species | |
| HUT51673A (en) | Process for producing second regulating phase of pichia pastoris alcohol oxydase | |
| HU218731B (hu) | Élesztőtörzs és eljárás az élesztőre heterológ fehérjék előállítására | |
| US5135868A (en) | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification | |
| WO1984001153A1 (en) | Production of interferon in yeast by use of invertase promoter | |
| JP2001501475A (ja) | カンジダ・ウチリスにおけるトランスフォーメーション系 | |
| US5310660A (en) | Method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription | |
| JPH08500014A (ja) | Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）トランスアルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびその使用 | |
| US20040241829A1 (en) | Vector for site-specific integration of heterologous dna sequences into metilotrophic yeasts | |
| EP0339567A1 (en) | Expression of Hepatitis B PreS 2 Protein in Methylotrophic Yeasts | |
| JP2752092B2 (ja) | Ｄｅｏプロモーターを有する発現プラスミド及び該プラスミドを含む細菌宿主 | |
| US5270180A (en) | Method for the production of salmon growth hormone using a synthetic gene | |
| CA1273883A (en) | Recombinant dna material comprising bovine growth hormone nucleotide sequence | |
| CA2111709A1 (en) | The specific genetic modification of ashbya gossypii | |
| GB2217332A (en) | Expression of salmon growth hormone in methylotrophic yeast of genus pichia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |