FI98931C - Menetelmä polypeptidien korkeatasoiseksi ilmentämiseksi Pichia-suvun hiivassa - Google Patents
Menetelmä polypeptidien korkeatasoiseksi ilmentämiseksi Pichia-suvun hiivassa Download PDFInfo
- Publication number
- FI98931C FI98931C FI864319A FI864319A FI98931C FI 98931 C FI98931 C FI 98931C FI 864319 A FI864319 A FI 864319A FI 864319 A FI864319 A FI 864319A FI 98931 C FI98931 C FI 98931C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gene
- dna
- pichia
- host
- fragments
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
Description
- 98931
Menetelmä polypeptidien korkeatasoiseksi ilmentämiseksi Pichia-suvun hiivassa Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-tekniikan aluetta. Yhdeltä näkökannalta, tämä keksintö koskee hiivan integroivaa transformaatiota. Toiselta näkökannalta tämä keksintö koskee hiivan paikkakohdistettua mutaatiota. Vielä toiselta näkökannalta tämä keksintö koskee uusia DNA-sekvenssejä. Lisänäkö-kannalta tämä keksintö koskee uusia organismeja.
Koska yhdistelmä-DNA-tekniikka on kehittynyt viime vuosina, on tullut mahdolliseksi tuottaa hallitusti mikro-organismien avulla valtava määrä hyödyllisiä polypeptidejä. Monia eukari-oottisia polypeptidejä, kuten esimerkiksi ihmisen kasvuhormoni, leukosyytti-interferonit, ihmisen insuliini ja ihmisen proinsuliini, on jo tuotettu eri mikro-organismien avulla. Jo käytössä olevien menetelmien jatkuvan käytön odotetaan tulevaisuudessa antavan mahdollisuuden tuottaa mikro-organismien avulla suuri määrä muita hyödyllisiä polypeptidituotteita.
Peruselementti, jota usein käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikassa, on plasmidi, joka on ekstrakromosomaalista, kaksijuos-teista DNA:ta, jota tavataan joillakin mikro-organismeilla.
·; Siellä missä plasmidien on todettu esiintyvän luonnollisina mikro-organismeissa, niiden todetaan usein esiintyvän moninaisina kopioina per solu. Luonnossa esiintyvien plasmidien lisäksi suuri määrä ihmisen tekemiä plasmideja eli hybridi-vektoreita on valmistettu. Valitettavasti ei isäntäsolun aina ole mahdollista säilyttää plasmidia. Sen sijaan plasmidi menetetään, kun organismi lisääntyy ja käy läpi usean kasvu-sukupolven. Menetelmät vieraan DNA:n pysyväksi sisällyttämiseksi sopiviin isäntäorganismeihin ovat sen tähden suuren kiinnostuksen kohteena ja mahdollisesti suuriarvoisia.
Tähän mennessä kaupalliset ponnistelut, joissa käytetään yhdistelmä-DNA- tekniikkaa erilaisten polypeptidien tuottamiseksi, ovat keskittyneet Escherichia coliin isäntäorganismina.
2 - 98931
Kuitenkin, joissakin tilanteissa E. coli voi osoittautua sopimattomasti isäntänä. Esimerkiksi, E. coli sisältää joukon toksisia pyrogeenisia tekijöitä, jotka on eliminoitava kaikista polypeptideistä, jotka ovat hyödyllisiä farmaseuttisina tuotteina. Tehokkuus, jolla tämä puhdistaminen voidaan saada aikaan, vaihtelee tietenkin tietyn polypeptidin mukaan.
Lisäksi, E. colin proteolyyttiset aktiivisuudet voivat vakavasti rajoittaa joidenkin hyödyllisten tuotteiden saantoja. Edelleen, suuren määrän heterologisia geenituotteita, joita on tuotettu E. colissa, on todettu tuotetun liukenemattomassa muodossa. Nämä ja muut näkökohdat ovat johtaneet lisääntyneeseen kiinnostukseen vaihtoehtoisiin isäntiin. Erityisesti, eukarioottisten organismien käyttäminen polypeptidituotteiden tuotantoon on houkuttelevaa.
Se, että on käytettävissä keinoja polypeptidituotteiden tuottamiselle eukarioottisissa systeemeissä, esim. hiivassa, voisi antaa käyttöön merkittäviä etuja verrattuna prokarioottisten systeemien käyttämiseen, kuten E. coli, polypeptidien tuottamiseen, joita yhdistelmä-DNA koodaa. Hiivaa on käytetty suuren mitan fermentointeihin vuosisatojen ajan, verrattuna suhteellisen viimeaikaiseen, suuren mitan E. coli-fermentointien tulemiseen. Hiivaa voidaan yleensä kasvattaa suurempiin solu-tiheyksiin kuin bakteereita, ja ne ovat helposti sovellettavissa jatkuvaan fermentointiprosessiin. Tosiasiassa, hiivan kasvu, kuten Pichia pastoriksen, äärimmäisen suuriin solu-tiheyksiin, so., solutiheyksiin yli 100 g/1, tuodaan esille US-patenttijulkaisussa 4 414 329. Hiivaisäntien lisäetuihin kuuluu se tosiasia, että organismin monet kriittiset toiminnat, esim. oksidatiivinen fosforylaatio, sijaitsevat orga-nellien sisällä, eivätkä tästä johtuen ole alttiina organismin polypeptidituotannolle, jotka polypeptidit ovat vieraita villi-tyypin isäntäsoluille. Eukarioottisena organismina hiiva voi osoittautua kykeneväksi glykosyloimaan ilmentyneitä polypepti-dituotteita, mikä voi osoittautua hyödyksi silloin, kuin sellainen glykosylaatio on merkityksellinen polypeptidituotteen bioaktiivisuudelle. On myös mahdollista, että eukarioottisena 98931 3 organismina, hiiva suosii samoja geneettisiä koodeja kuin korkeammat organismit, pyrkien näin ollen ekspressiotuottei-den tehokkaampaan tuotantoon, jotka tuotteet ovat nisäkäsgee-nien tuotteita, tai komplementaarisen DNA:n (cDNA) tuotteita, jota saadaan esimerkiksi nisäkkään mRNArn käänteiskopioinnin kautta.
Huonosti karakterisoitujen hiivalajien kehittämistä isäntä/-vektorisysteemeinä vaikeuttaa tuntuvasti tiedon puute transformaatio-olosuhteista ja sopivista keinoista vieraan DNA:n pysyväksi sijoittamiseksi isäntäsoluun. Lisäksi auksotrofisiä mutantteja ei usein ole saatavilla, mikä sulkee pois trans-formanttien suoran valinnan auksotrofisen komplementaation kautta. Jos yhdistelmä-DNA-tekniikka on täysin toteuttava lupauksensa, on suunniteltava uusia isäntä/vektorisysteemejä, jotka helpottavat DNA:n manipulointia ja optimoivat liitettyjen DNA-sekvenssien ilmenemistä siten, että haluttuja polypeptidituotteita voidaan valmistaa hallituissa olosuhteissa ja suurella saannolla.
Eräs keksinnön kohde on sen vuoksi menetelmä DNA:n liittämiseksi hiivan genomiin, sen ennalta valittuihin paikkoihin.
Toinen keksinnön kohde on menetelmä hiivan pysyvien aukso-·: trofisten mutanttien valmistaminen, jotka ovat oleellisesti kykenemättömiä takaisinmutaatioon.
Vielä toisena keksinnön kohteena ovat uudet DNA-sekvenssit, jotka ovat hyödyllisiä hiivan transformaatiossa.
Esillä olevan keksinnön kohteena on lisäksi alkoholioksidaa-sinegatiivisen mutantti-isännän tuottaminen heterologisten proteiinien lisääntynyttä tuotantoa varten hiivan avulla.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista .
- 98931 4
Esillä olevan keksinnön mukaisesti on kehitetty uusi menetelmä Pichia-suvun hiivan genomin paikkakohdistettuun modifiointiin. Transformoimalla hiiva lineaarisella DNA-palasella, joka käsittää, kummassakin, päässä, liitettävissä olevia DNA-sekvens-sejä, so. sekvenssejä, jotka ovat homologisia isännän genomin suhteen, kummankin ollessa vähintään noin 200 nukleotidin pituisia, ja vähintään yhden lisäpalan DNA:ta, esim. valittavissa olevan markkerigeenin, niiden välissä, ottaa isäntä sisäänsä markkerigeenin ja sitä ympäröivät liitettävissä olevat DNA-sekvenssit suurella frekvenssillä. Seurauksena transformaatiosta tällä lineaarisella DNA:11a, muodostuu modifioituja hiivakan-toja, joissa kiinnittymiskohdassa oleva DNA-sekvenssi on saatettu useaan osaan ja/tai lyhennetty, ja valittavissa oleva markkerigeeni, kuin myös kaikki muu DNA, joka sisältyy osana transformoivaan lineaariseen DNA-palaseen, on liitetty isäntä-hiivan genomiin.
Vieras DNA, joka on liitetty isäntähiivan genomiin edellä kuvaillulla tavalla, säilyy stabiilina isännän monen kasvu-polven yli. Tämän keksinnön mukainen käytäntö eliminoi sen vuoksi vieraan DNA:n menettämisestä aiheutuvan ongelman, joka johtuu plasmidin epävakaisuudesta silloin kun vieras DNA sen asemesta tuodaan osana itsenäisesti replikoivaa ekstrakromo-somaalista palasta tai kun vieras DNA sen sijaan integroidaan genomiin osana renkaanmuotoista DNA-molekyyliä. Sellaisista rengasmaisista DNA-molekyylin integraatioista on seurauksena vieraiden DNA-sekvenssien liittyminen isännän genomiin, joita sekvenssejä ympäröivät isännän genomin suorat kerrannaissek-venssit. Koska sellaiset suorat kerrannaissekvenssit ovat substraatteja uudelle rekombinaatiolle, ovat vieraat DNA:t, jotka on liitetty suorien kerrannaissekvenssien väliin, epästabiileja.
Esillä olevan keksinnön mukainen paikkakohdistettu genomin modifikaatio mahdollistaa mutanttien tuottamisen, joilta puuttuu spesifisten geenien kaikki osat tai valikoituja osia. Eliminoimalla huomattavia geenin osia, jossa geenissä mutaatiota - 98931 5 toivotaan, eliminoituu mutaation takaisin muuttumisen todennäköisyys oleellisesti. Keksinnön mukaisesti muodostuvat mutanttikannat ovat siten hyvin pysyviä mutantteja.
Esillä olevan keksinnön mukainen paikkakohdistettu genomin modifikaatio, yhdessä in vitro yhdistelmä-DNA-menetelmien kanssa, jotka ovat alaa tuntevien tiedossa, tekee myös mahdolliseksi suuren joukon tarkkoja isännän genomin modifikaatioita, esim. yhden tai useamman heterologisen geenin lisäämisen isännän genomiin, säätelevien sekvenssien muuttamisen, jotka säätelevät luonnollisen geenin ilmenemistä, luonnollisen geenin korvaamisen geenillä, joka on vierasta alkuperää, ja niiden kaltaiset modifikaatiot.
On yllättäen havaittu, että metanolin indusoima heterologisten geenien ilmeneminen Pichiassa lisääntyy dramaattisesti käyttämällä isäntänä geenin ilmenemiselle Pichia-kantaa, jossa Pichian primäärinen alkoholioksidaasigeeni on saatettu useaan osaan.
On edelleen havaittu, että Pichia pastoris-organismin kannoilla on toinen alkoholioksidaasigeeni, joka antaa isäntäkannalle, jossa primäärinen alkoholioksidaasigeeni on saatettu useaan osaan, mahdollisuuden säilyttää kyvyn kasvaa metanolilla, vaikkakin pienemmällä nopeudella verrattuna natiiviin Pichia pastorikseen.
Keksintöä kuvataan seuraavassa kuvioiden avulla.
Kuvio 1 on plasmidin pYMI1 restriktiokartta.
Kuvio 2 kuvaa plasmidin pYMI1 yhden osan liittämistä Pichian kromosomin HIS4-lokukseen.
Kuvio 3 on plasmidin pYJ8 restriktiokartta.
Kuvio 4 on plasmidin pYMI3a restriktiokartta.
Kuvio 5 kuvaa plasmidin pYMI3a yhden osan liittämistä Pichian kromosomin HIS4-lokukseen.
Kuvio 6 on plasmidin pBPG1-1 restriktiokartta.
Kuvio 7 on plasmidin pYMI7 restriktiokartta.
- 98931 6
Kuvio 8 kuvaa plasmidin pYMI7 yhden osan liittämistä Pichian kromosomin alköholioksidaasilokukseen.
Kuvio 9 kuvaa plasmidin pYM39 konstruointia plasmideista pSA0H5 ja pTHBS3.
Kuvio 10 kuvaa plasmidin pYMI6 konstruointia plasmideista pYM39 ja pPG3. 2.
Kuvio 11 kuvaa plasmidin pBSAGI5I konstruoimista plasmideista pYMI6 ja pBSAG5I.
Kuvio 12 on restriktiokartta, joka esittää yksityiskohtaisemmin plasmidia pBSAGI5I kuin kuviossa 11 on esitetty.
Kuvio 13 kuvaa plasmidin pBSAGI5I yhden osan liittämistä Pichian kromosomin alkoholioksidaasilokukseen.
Kuvio 14 on plasmidin pYMI12a restriktiokartta.
Kuvio 15 kuvaa plasmidin pYMI12a yhden osan liittämistä Pichian toisen alkoholioksidaasigeenin (A0X2) lokukseen.
Kuvio 16 on Pichian pBR322-peräisissä plasmideissa pPG4.0 ja pPG3.0 olevien inserttien restriktiokartta. Kuviossa 16a esitetty insertti on Pichian ensimmäisen alkoholioksidaasigeenin (A0X1) lokuksesta, kun taas kuviossa 16b esitetty insertti on Pichian toisen alkoholioksidaasigeenin (A0X2) lokuksesta.
Kuvio 16c esittää A0X1-geenilokuksen (viittauksella kuvioon 16a) tunnettua alkoholioksidaasia koodaavaa osaa.
Kuvio 17 on plasmidin pYM25 restriktiokartta.
Kuvio 18 on plasmidin pT76H3 restriktiokartta.
Seuraavia lyhenteitä käytetään tässä selostuksessa käytetyistä restriktioentsyymeistä:
Lyhenne Restriktioentsyymi
As AsuII
B BamHI
B2 Bglll c Clal
R1 EcoRI
R,. EcoRV
D --- H3 Hindlll HPl Hpal
Kp Kpnl - 98931 7
Lyhenne Restriktioentsyymi
Nr NruI
Ps PstI
PV2 PvuII
Rs RsaI
S Sali
Sau3AI
Sm Smal
Sp Sphl
St Stul
Th Thai
Xb Xbal
Xh XhoI
Oheisissa kuvioissa, on restriktiopaikat, joita käytetään DNA-palasten manipulointiin, mutta jotka tuhoutuvat liittämisen yhteydessä, merkitty panemalla tuhoutuneen paikan lyhenne sulkuihin.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti, annetaan käyttöön menetelmä Pichia-suvun hiivojen genomin paikkaselektiiviseen modifikaatioon ennalta määrätyssä genomin paikassa, joka menetelmä käsittää Pichia-suvun isäntäkannan transformoinnin jaksottaisesti järjestäytyneellä lineaarisella DNA-palasella, joka käsittää ensimmäisen liitettävissä olevan DNA-palasen, valittavissa olevan markkerigeenin, ja toisen liitettävissä olevan DNA-pala-sen. Ensimmäinen ja toinen liitettävissä oleva DNA-palanen ovat kumpikin vähintään noin 200 nukleotidia pitkiä, ja niissä on nukleotidisekvenssejä, jotka ovat homologisia alkuperäisen Pichian genomin erillisten osien kanssa paikassa, jossa genomin modifikaation on määrä tapahtua. Valittavissa oleva mark-kerigeeni on geeni, jonka tuote antaa valittavissa olevan fenotyypin soluille, jotka ottavat geenin vastaan, esim. antibioottiresistenssin geeni tai biosynteettinen geeni, joka antaa solulle mahdollisuuden syntetisoida kasvuun tarvittavaa ravinnetta. Valittavissa oleva markkerigeeni, ollessaan läsnä DNA-vektorissa, sallii vain niiden solujen, jotka vastaan- - 98931 8 ottavat vektori-DNA:n, kasvaa selektiivisissä kasvuolosuhteissa. On oleellista, että valittavissa oleva markkerigeeni on sijoittunut ensimmäisen ja toisen liitettävissä olevan DNA-palasen väliin, ja että liitettävissä olevat DNA-palaset sijaitsevat samassa asemassa toisiinsa nähden kuin missä ne ovat isäntäsolun genomissa, joka läpikäy genomin modifikaation lineaarisen DNA-palasen välityksellä.
Edelleen, esillä olevan keksinnön mukaisesti, annetaan käyttöön jaksottaisesti järjestäytynyt lineaarinen DNA-palanen, joka käsittää ensimmäisen liitettävissä olevan DNA-palasen, valittavissa olevan markkerigeenin ja toisen liitettävissä olevan DNA-palasen. Ensimmäinen ja toinen liitettävissä oleva DNA-palanen ovat kumpikin vähintään noin 200 nukleotidia pitkiä, niissä on nukleotidisekvenssejä, jotka ovat homologisia Pichia-suvun lajien genomien DNA:n osien kanssa, ja sijaitsevat toisiinsa nähden lineaarisessa palasessa, kuten ne sijaitsevat Pichian genomissa. Markkerigeeni on sijoittunut ensimmäisen ja toisen liitettävissä olevan DNA-palasen väliin.
Peruselementti, jolla Pichia-suvun lajit transformoidaan tämän keksinnön mukaisesti, käsittää vähintään kolme komponenttia: ensimmäisen liitettävissä olevan DNA-palasen, toisen liitettävissä olevan DNA-palasen, ja valittavissa olevan markkerigeenin.
Ensimmäisen ja toisen liitettävissä olevan DNA-palasen tulisi kummankin olla vähintään noin 200 nukleotidia pitkiä, tavallisesti käytössä olevien pituuksien vaihdellessa yleensä alueella noin 200:sta 5000:een nukleotidiin asti. Edul-. lisesti, manipuloinnin ja käsittelyn helpottamiseksi, käyte- tään palasia alueella noin 500-2000 nukleotidia.
Nukleotidisekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia ensimmäisenä ja toisena liitettävissä olevina DNA-palasina, ovat nukleotidisekvenssit, jotka ovat homologisia alkuperäisen Pichian genomin paikan erillisten osien kanssa, jossa pai kassa genomin modifikaation on määrä tapahtua. Näin ollen, - 98931 9 esim. jos genomin modifikaatio on tapahtuva alkoholioksidaa-sigeenin lokuksessa, ovat ensimmäinen ja toinen liitettävissä olevat DNA-palaset, joita käytetään, sekvenssejä, jotka ovat homologisia alkoholioksidaasigeenin lokuksen erillisten osien kanssa. Jotta genomin modifikaatio tämän keksinnön mukaisesti tapahtuisi, on kahden liitettävissä olevan DNA-pa-lasen sijaittava toisiinsa nähden lineaarisessa palasessa samassa suhteellisessa asemassa, kuin missä ne ovat Pichian genomissa.
Transformoivan DNA:n kolme vähintään tarvittavaa komponenttia, joita käytetään tämän keksinnön käytäntöön soveltamisessa, ovat jaksottaisesti järjestäytyneet, muodostaen lineaarisen DNA-palasen, jossa valittavissa oleva markkerigeeni on sijoittunut ensimmäisen liitettävissä olevan palasen ja toisen liitettävissä olevan palasen väliin. Esimerkkeihin valittavissa olevista markkerigeeneistä kuuluvat, mutta eivät ole niihin rajoittuneita, Pichia pastoriksen ja Saccha-romvces cerevisiaen ARG4-geeni, Pichia pastoriksen ja S. cerevisiaen HIS4-geeni, G418-fosfotransferaasigeeni E. colin siirrettävissä olevasta elementistä Tn601, ja niiden kaltaiset. Ne, jotka tuntevat alaa, käsittävät myös, että lukuisia sopivia ympärillä olevia sekvenssejä, so. ensimmäinen ja toinen liitettävissä oleva DNA-palanen, voidaan saada gee-neistä, jotka on eristetty Pichia pastoriksen genomista. Esimerkkigeeneihin kuuluvat, mutteivät ole rajoittavia, al-koholioksidaasigeenit (A0X1 ja A0X2; Pichialla on kaksi al-koholioksidaasigeeniä), dihydroksiasetonisyntetaasigeeni (DAS), arginiinisukkinaattilyaasigeeni ARG4), histidinolide-hydrogenaasigeeni (HIS4), ja niiden kaltaiset.
Transformoivat lineaariset DNA-palaset voivat sisältää joukon muita DNA-sekvenssejä, kuten esimerkiksi heterologisia geenejä, so. mikä tahansa geeni tai geenin osa, jota ei tavallisesti tavata siinä genomin lokuksessa, jossa liittämisen isäntäsoluun on määrä tapahtua, joiden ilmenemistä toivotaan - 98931 10 P. pastoriksessa. Yleensä, termi heterologinen viittaa DNA:han, joka ei luonnostaan kuulu isäntä-Pichia-soluun. Heterologinen geeni voi valinnaisesti olla liittyneenä säätelevään alueeseen, joka säätelee itsenäisesti heterologisen geenituotteen tuotantoa, tai heterologinen geeni voidaan ilmentää transformoidussa solussa geenin alkuperäisen säätelevän alueen vaikutuksen alaisena, joka geeni on saatettu useaan osaan transformaatioprosessissa .
Lisäksi transformoiva lineaarinen DNA-palanen, jota käytetään esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisessa, voi myös sisältää bakteriaalista plasmidi-DNA:ta, kuten esimerkiksi pBR322- tai pBR325-sekvenssejä. Sellaiset bakteriaaliset sekvenssit ovat hyödyllisiä in vitro manipuloinnissa ja tuotannossa näiden DNA-sekvenssien monistamisen kautta E. colissa.
Erityisen käyttökelpoisena muotona transformoinnin kannalta, lineaarinen DNA on suljettuna renkaanmuotoisena plasmidina, joka käsittää: ensimmäisen liitettävissä olevan DNA-palasen, toisen liitettävissä olevan DNA-palasen, valittavissa olevan markkerigeenin, ja bakteriaalisen plasmidi-DNA:n. Tämä plas-midi voi myös lisäksi sisältää DNA-sekvenssejä, kuten tässä yhteydessä edellä kuvailtiin.
Edullisessa suoritusmuodossa, suljettu, renkaanmuotoinen plas-midi on konstruoitu muodostuen kahdesta osasta, "transformoivasta" osasta ja "bakteriaalisesta" osasta. Transformoiva osa käsittää, jaksottaisesti järjestäytyneenä, ensimmäisen liitettävissä olevan DNA-palasen, valittavissa olevan markkerigeenin, ja toisen liitettävissä olevan DNA-palasen, jossa ensimmäinen ja toinen liitettävissä oleva DNA-palanen ovat sijoittuneet toisiinsa nähden, siten kuin ne sijaitsevat Pichian genomissa, valittavissa olevan markkerigeenin sijaitessa ensimmäisen liitettävissä olevan DNA-palasen ja toisen liitettävissä olevan DNA-palasen välissä. Bakteriaalinen osa on sitten sijoittunut siten, että se yhdistää ensimmäisen liitettävissä olevan DNA-palasen ja toisen liitettävissä olevan - 98931 1 1 DNA-palasen, muodostaen siinä yhteydessä suljetun, renkaan-muotoisen vektorin.
Suljettua, renkaanmuotoista vektoria, valmistettuna kuten edellä on kuvailtu, voidaan käyttää tuottamaan suuria määriä plasmidia E. colissa, joka plasmidi sitten eristetään, ja liuotetaan sopivilla restriktioentsyymeillä transformoivan osan katkaisemiseksi bakteriaalisesta osasta. Hiivan DNA:n lineaarista, transformoivaa osaa voidaan sitten käyttää transformoimaan Pichia-suvun kantoja halutun genomin modifikaation aikaansaamiseksi.
Asiantuntijoille on tietenkin selvää, että suljetun, renkaan-muotoisen plasmidin "transformoiva" osa, jota edellä on kuvailtu, voi sisältää lisäksi muita DNA-sekvenssejä. Esimerkiksi bakteriaaliset sekvenssit, joita käytetään in vitro manipulointiin ja DNA:n tuotantoon monistamalla E. colissa, voivat olla osa transformoivaa DNA:ta, so. bakteriaaliset sekvenssit voivat, valittavissa olevien markkerigeenisekvenssien tavoin, myös olla sijoittuneina ensimmäisen liitettävissä olevan DNA-palasen ja toisen liitettävissä olevan DNA-palasen välissä.
Kun sellaista DNA-komponenttien konfiguraatiota käytetään, liittyvät bakteriaaliset sekvenssit myös isäntähiivan geno-miin, joka saatetaan tämän keksinnön mukaiseen genomin modi-fikaatioprosessiin.
Pichia pastoriksen transformaatiota on aikaisemmin kuvailtu. Käytettyjä koemenetelmiä Pichia pastoriksen transformoimi-seksi esitetään yksityiskohtaisemmin jäljempänä (katso esimerkki 1). Pichia-suvun hiivakantoja voidaan transformoida liuottamalla entsymaattisesti soluseinät, jolloin saadaan sferoplasteja; sferoplastit sekoitetaan sitten transformoivan DNA:n kanssa ja inkuboidaan kalsiumionien ja polyetyleeni-glykolin kanssa, regeneroidaan sitten selektiivisessä kasvualustassa. Transformoiva DNA sisältää valittavissa olevan markkerigeenin, joka sallii solujen valikoinnin, jotka ovat ottaneet sisäänsä transformoivaa DNA:ta, koska vain . 98931 12 transformoidut solut kykenevät jäämään henkiin ja kasvamaan käytetyissä selektiivisissä kasvuolosuhteissa (selektiiviset kasvuolosuhteet ovat valikoitavissa olevan markkerigeenin tehtävä, jota geeniä käytetään osana transformoivaa DNA:ta).
Kun Pichia-kantoja, joissa primäärinen alkoholioksidaasigeeni (A0X1) saatettiin useaan osaan, käytettiin isäntinä heterolo-gisten geenien ilmentämiseksi, havaittiin yllättäen, että heterologisten geenituotteiden ilmenemistaso, joidenkin pro-moottoreiden säätelyn alaisina (esim. A0X1- tai DAS-promootto-rit), lisääntyi moninkertaiseksi verrattuna ilmenemistasoon, joka saavutettiin, kun käytettiin täysin alkoholioksidaasi-kompetenttia isäntää. Tämän havainnon ja tämän ilmiön lisätutkimuksen seurauksena, on tehty johtopäätös, että on olemassa yleinen menetelmä heterologisten geenien ilmenemis-tason lisäämiseksi isäntäorganismeissa, joka käsittää isäntä-kannan kasvattamisen ravinteellisesti rajoitetuissa olosuhteissa substraatilla, jota varten on olemassa voimakas substraattiin reagoiva promoottorialue, jossa heterologinen geeni on tämän voimakkaan, substraattiin reagoivan, promoottorin säätelevän ohjauksen alainen.
"Ravinteellisesti rajoittavat olosuhteet", joita tarvitaan tämän keksinnön mukaiseen geenin lisääntyneeseen ilmenemiseen, voidaan saada aikaan joko antamalla soluille rajoittavia määriä ravinnetta, tai käyttämällä mutantti-isäntää, joka mutaation seurauksena on ravitsemuksellisesti rajoitettu tietyissä kasvuolosuhteissa. Näin ollen, esimerkiksi, kun halutaan lisätä heterologisten geenien ilmenemistasoa, jotka geenit ovat olleet voimakkaiden alkoholioksidaasi- tai di-hydroksiasetonisyntetaasipromoottorien kontrollin alaisina, joista promoottoreista kumpikin reagoi metanolin läsnäoloon kasvualustassa, joko käyttämällä isäntää, joka on osittain vajaakykyinen käyttämään metanolia, tai käyttämällä metanoli-rajoitteisia kasvuolosuhteita täysin alkoholioksidaasikompe-tentin isännän kanssa, saadaan aikaan tarvittavat ravinteellisesti rajoittavat olosuhteet, niin että saavutetaan lisääntynyt geenin ilmeneminen.
98931 13
Uskotaan, että menetelmä heterologisten geenituotteiden ilmenemisen lisäämiseksi, jota tässä on kuvailtu, on yleinen menetelmä, joka on käyttökelpoinen kaikilla organismeilla, joita varten on olemassa promoottoreja, jotka reagoivat ravinteellisiin rajoituksiin. Näin ollen, saattamalla heterologinen geeni sellaisen promoottorialueen kontrollin alaiseksi, viljelemällä sitten isäntäorganismia ravinteelli-sesti rajoitetuissa olosuhteissa, sen ravinteen (niiden ravinteiden) suhteen, joka aiheuttaa promoottorin toiminnan käynnistymisen, geenin lisääntynyttä ilmenemistä tulisi esiintyä. Edullinen tapa tällä hetkellä tuottaa ravinteellisesti rajoitetut kasvuolosuhteet, on käyttää mutanttia isäntäorganismia, joka on osittain vajaakykyinen metaboloimaan ravinnetta (ravinteita) , mikä aiheuttaa joidenkin promoottorien ilmenemisen paljon suurempina tasoina kuin ei-mutantissa isännässä.
Pichiassa tämä on osoitettu, kuten kuvaillaan yksityiskohtaisemmin esimerkissä 5.
Kun Pichia pastoris-kantaa, jossa primäärinen alkoholioksi-daasigeeni saatettiin useaan osaan keksinnöllisellä menetelmällä genomin modifioimiseksi, viljeltiin metanoli hiilen-lähteenä, todettiin odottamatta, että sellaiset kannat, jotka olivat vajavaisia primäärisen alkoholioksidaasigeenin suhteen, olivat silti kykeneväisiä kasvamaan metanolilla, vaikkakin pienemmällä nopeudella verrattuna villityypin Pichian soluihin. Tämä havainto osoitti toisen alkoholioksidaasigeenin mahdollisen läsnäolon Pichian metanolia käyttävillä kannoilla.
Pichian kromosomaalisen DNA:n kokoelman seulonta on johtanut 3 kbp:n palasen eristämiseen, joka näyttää koodaavan toisen alkoholioksidaasigeenin (A0X2) yhtä osaa. Palanen ön sijoitettu inserttinä pBR322:een (ainutlaatuisessa BamHI-paikassa). Plasmidia nimitetään pPG3,0:ksi, ja sitä pitää sisällään E. coli-isäntä LE392. Tämä kanta on tallennettu talletus-laitokseen Northern Regional Research Center, the United 14 9893 1
States Department of Agriculture, Peoriassa, Illinoisissa, varmistamaan sen käytettävyys yleisölle tämän hakemuksen patentiksi julkaisemisen yhteydessä, ja sille on annettu talletusnumero NRRL B-18022.
pPG3,0:n restriktiokartta esitetään kuviossa 16b, jossa sitä verrataan primäärisen alkoholioksidaasigeenin, pPG4,0, genomi-palaseen. Viimeksi mainittu palanen on aikaisemmin kuvailtu. Kahden alkoholioksidaasigeenin vertaileminen (katso kuvio 16) selventää sen, että kaksi palasta eivät ole vain saman genomilokuksen toisiaan peittäviä osia. Kahden palasen välillä on selvästi jonkin verran homologiaa, ilmeten siten, että kahdella palasella on useita yhteisiä restriktiopaik-koja. Kahdelle geenille, A0X1 ja A0X2, yhteiset restriktio-paikat on ilmaistu kuviossa 16 tähdellä. Kuitenkin, se, että kummassakin palasessa on useita restriktiopaikkoja, joita ei ole läsnä toisessa, osoittaa, että palasissa on useita eroavaisuuksia nukleotiditasolla.
Keksintöä kuvaillaan nyt yksityiskohtaisemmin viittaamalla seuraaviin ei-rajoittaviin esimerkkeihin.
Seuraavissa esimerkeissä käytetyillä puskureilla ja liuoksilla on alla annetut koostumukset: 1M Tris-puskuri 121,1 g Tris-emästä 800 ml:ssa i^Oita; ~~ säädetään pH haluttuun arvoon lisäämällä konsentroitua HCl:n (35 %) vesiliuosta; annetaan liuoksen jäähtyä huoneenlämpö-tilaan ennen pH:n lopullista säätämistä; laimennetaan lopulliseen 1 L:n tilavuuteen .
TE-puskuri 1,0 mM EDTA
0,01 M (pH 7,4) Tris-puskurissa LB-(Luria-Bertani) 5 g Bacto-tryptonia alusta 5 g Bacto-hiivauutetta 2,5 g NaCl 1 l:ssa vettä, säädettynä pH-arvoon 7,5 NaoH:11a • 98931 15 2B-alusta 0,2 % NH^PO^ 1,2 % Na2HP04 0,013 % MgS04.7H20 0,074 % CaCl2.2H20 2 yug/mL biotiinia 1 ,ug/mL tiamiinia 100 /Ug/itiL tryptofaania 0,4 % dekstroosia 0,2 % kasaminohappoja YPD-alusta 1 % Bacto-hiivauutetta 2 % Bacto-peptonia 2 % dekstroosia SD-alusta 6,75 g hiivan typpipohja ilman amino happoja (DIFCO) 2 % dekstroosia 1 l:ssa vettä SED 1 M sorbitolia
25 mM EDTA 50 mM DTT
SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 1,47 g natriumsitraattia 0,168 g EDTA 50 mL H20 pH-arvoon 5,8 HCl:lla
CaS 1 M sorbitolia 10 mM CaCl2 steriloidaan suodattamalla PEG-liuos 20 % polyetyleeniglykolia 3350 1OmM CaCl2 1OmM Tris-HCl (pH 7,4) steriloidaan suodattamalla SOS 1 M sorbitolia 0,3x YPD alusta 10 mM CaCl2
Seuraavia lyhenteitä käytetään kaikissa esimerkeissä seuraavasti: EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo SDS natriumdodekyylisulfaatti DTT ditiotreitoli - 98931 16
Esimerkki 1
Pichia pastoriksen transformaatiomenetelmä A. Solukasvatus 1. Siirrostetaan Pichia pastoris GS115-pesäke (NRRL Y-15851) noin 10 mlraan YPD-alustaa ja ravistellaan viljelmää 30°C:ssa 12-20 tuntia.
2. Noin 12-20 tunnin kuluttua laimennetaan solut OD,
b U U
arvoon noin 0,01-0,1 ja pidetään soluja logaritmisessa kasvuvaiheessa YPD-alustassa 30°C:ssa noin 6-8 tuntia.
3. Noin 6-8 tunnin kuluttua siirrostetaan 100 ml:aan YPD-alustaa 0,5 ml ymppiviljelmää OD^QQ-arvossa noin 0,1 (tai ekvivalenttinen määrä). Ravistellaan 30°C:ssa noin 12-20 tuntia.
4. Kerätään viljelmä talteen, kun OD6QQ-arvo on noin 0,2-0,3 (suunnilleen 16-20 tunnin kuluttua), sentrifugoimalla 1500 g:ssa 5 minuutin ajan.
B. Sferoplastien valmistaminen 1. Pestään soluja kerran 10 ml:ssa steriiliä vettä. (Kaikki sentrifugoinnit vaiheissa 1-5 ovat 1500 g:ssa 5 minuutin ajan).
2. Pestään soluja kerran 10 ml:ssa juuri valmistettua SED:tä.
3. Pestään solut kahdesti 10 ml:ssa steriiliä 1 M sorbitolia.
4. Suspendoidaan solut uudelleen 10 ml:aan SCE-puskuria.
5. Lisätään 5-10 ^,ul 4 mg/ml Zymolyase 60000-entsyymiä (Miles Laboratories). Inkuboidaan soluja 30°C:ssa noin 30-60 minuutin ajan.
Koska sferoplastien valmistaminen on kriittinen vaihe trans-formaatiomenettelyssä, tulisi sferoplastien muodostumista .. 98931 17 seurata seuraavasti: lisätään 100 ^ul:n solulisäyksiä 900 ^ul:aan 5 % SDS:ää ja 900 ^ul:aan 1 M sorbitolia ennen ja juuri jälkeen zymolyaasilisäyksen ja eri ajankohtina inkubointijakson aikana. Lopetetaan inkubointi kohdassa, jossa solut lyseeraavat (hajoavat) SDS:ssä mutta eivät sorbitolissa (tavallisesti 30-60 inkubointiminuutin välillä).
6. Pestään sferoplasteja kahdesti 10 ml:ssa steriiliä 1 M sorbitolia sentrifugoiden 100 g:ssa 5-10 minuutin ajan. (Sentrifugoinnin aika ja nopeus voivat vaihdella; sentrifu-goidaan tarpeeksi sferoplastien pelletoimiseksi, mutta ei niin paljon, että ne repeävät voiman vaikutuksesta).
7. Pestään solut kerran 10 ml:ssa steriiliä CaS:a.
8. Suspendoidaan solut uudelleen kaikkiaan 0,6 ml:aan CaS:a.
C. Transformaatio 1. Lisätään DNA-näytteet (20 ^ul:n tilavuuteen asti) 12 x 75 mm steriileihin polypropyleeniputkiin. (DNA tulee olla vedessä tai TE-puskurissa; maksimaalisten transformaatiotrekvenssien saavuttamiseksi pienillä DNA-määrillä, on suositeltava lisätä noin 1 ^«ul 5 mg/ml sonikoitua E. colin DNA:ta kuhunkin näytteeseen) .
2. Lisätään 100 ^,ul sferoplasteja kuhunkin DNA-näytteeseen ja inkuboidaan huoneenlämpötilassa noin 20 minuutin ajan.
3. Lisätään 1 ml PEG-liuosta kuhunkin näytteeseen ja inkuboidaan huoneenlämpötilassa noin 15 minuutin ajan.
4. Sentrifugoidaan näytteitä 1000 g:ssa 5-10 minuuttia ja dekantoidaan PEG-liuos.
5. Suspendoidaan näytteet uudelleen 150 ^ul:aan SDS:ää ja inkuboidaan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa.
- 98931 18 6. Lisätään 850 yul steriiliä 1 M sorbitolia ja maljavil-jellään näytealikvootit kuten alla on kuvailtu.
D. Sferoplastien regenerointi 1. Regenerointiagaralustan resepti: a. Agar-KCl- 9 g Bacto-agar, 13,4 g KC1, 240 ml H20, autokla-voidaan.
b. 1Ox glukoosi- 20 g dekstroosi, 100 ml Η2<0, autoklavoidaan.
c. 10x SC- 6,75 g hiivan typpipohjaa ilman aminohappoja, 100 ml H20, autoklavoidaan. (Lisätään mitä tahansa aminohappoa tai nukleiinihappoa konsentraatioon 200^,ug/ml:aan asti ennen tai jälkeen autoklavoinnin).
d. Lisätään 30 ml 1Ox glukoosia ja 30 ml 1Ox SC:tä 240 ml:aan sulaa agar-KCl-liuosta. Lisätään 0,6 ml 0,2 mg/ml biotiinia ja mitä tahansa muuta haluttua aminohappoa tai nukleiinihappoa konsentraatioon 20 ^ug/ml. Pidetään sulatettua rege-nerointiagaria 55-60°C:ssa.
2. Transformaationäytteiden maljaus:
Valetaan 10 ml:n pöhja-agarkerros regenerointiagaria maljaa kohti vähintään 30 minuuttia ennenkuin transformaationäyt-teet ovat valmiit. Jaetaan 10 ml:n annokset regenerointiagaria koeputkiin 45-50°C:ssa hauteessa sen jakson aikana, kun transformaationäytteet ovat SDS:ssä. Lisätään yhtä suuret osat edellä kuvailtuja transformaationäytteitä koeputkiin, joissa on regenerointiagaria ja valetaan maljojen pohja-agar-kerroksien päälle.
3. Sferoplastien valmistuksen laadun määrittäminen:
Poistetaan 10 yul yhdestä näytteestä ja laimennetaan 100 kertaa lisäämällä 990 ^ul:aan 1 M sorbitolia. Poistetaan 10 ^ul 100-kertaisesta laimennuksesta ja laimennetaan lisää 100-kertaisesti lisäämällä toiseen 990 ^ul:n määrään 1 M sorbitolia. Levitetään 100 ^ul molempia laimennoksia agar-maljoille, jotka sisältävät YPD-alustaa, sferoplasteiksi . 98931 19 muodostumattomien kokosolujen konsentraation määrittämiseksi, jotka ovat jäljellä valmisteessa. Lisätään 100 ^ul kumpaakin laimennosta 10 ml:aan regenerointiagaria, johon on lisätty 40 ^ug/ml histidiiniä regeneroitavissa olevien sferoplastien kokonaismäärän määrittämiseksi. Hyviä arvoja 7 transformaatiokokeessa ovat 1-3 x 10 regeneroitavissa ole- 3 vien sferoplastien kokonaismäärä/ml ja noin 1x10 ehjiä soluja/ml.
4. Inkuboidaan maljoja 30°C:ssa 3-5 päivän ajan.
Esimerkki 2
Saccharomyces ARG4-geenin ja pBR322;n paikkaspesifinen liittäminen ja Pichian HIS4:n poistaminen GS190:ssä (NRRL Y-18014)
Kuvio 1 esittää plasmidia pYMI1 ja kuvio 2 esittää diagrammia tapahtumista, joista on seurauksena plasmidin paikkakohdis-tettu liittyminen P. pastoriksen genomiin. Vektori on suunniteltu liittämään Saccharomyces ARG4-geeni ja DNA-sekvenssejä pBR322ista Pichian HIS4-lokukseen, poistaen samanaikaisesti koko HIS4-geenilokus Pichian genomista. Muita sekvenssejä, sellaisia kuin ekspressiokasetit, voitaisiin helposti liittää pYMI1:een ja sitten samalla tavalla liittää P. pastoriksen genomiin.
Plasmidi pYMI1 koostuu EcoRI-BamHI-palasesta, joka sijaitsee, in situ, Pichian HIS4-geenin 5'-päässä, ja EcoRI-Clal-pala-sesta, joka sijaitsee Pichian HIS4-geenin 3'-päässä. Kumpaakin HIS4-geeniä reunustavaa palasta voidaan saada plasmidista pYJ8 (saatavissa E. coli-isännästä talletuslaitoksesta the Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, numerolla NRRL B-15889; katso kuvio 3), ja ne ovat noin 400 bp pitkiä ja yhdistyvät EcoRI-päistään pYMI1:ssä. Valikoitavissa olevana markkerina, pYMI1-vektori sisältää 2,6 kbp:n Hindlll-Sall-palasen pYM25:stä (saatavissa E. coli-isännästä koo- - 98931 20 dilla NRRL B-18015; katso kuvio 17), joka koodaa Saccharomycek-sen arginiinisukkinaattilyaasia (ARG4-geenituote). Katkaistaessa EcoRI:llä, pYMI1:stä tulee lineaarinen, HIS4-geeniä reunustavien palasten ollessa sen päissä.
Pichia pastoris arg4-kanta, GS190 (NRRL Y-18014), transformoitiin EcoRI-katkaistulla pYMI1:llä arginiiniprototrofi-seksi (Arg +). Regenerointiagaralustaan lisättiin 40 ^ug/ml histidiiniä selektiopaineen vaikutuksen välttämiseksi trans-formantteja vastaan, jotka tarvitsivat histidiiniä HIS4-geenin poistamisen seurauksena.
Arg+-transformantit valikoitiin niiden osalta, joista oli tullut His :ia HIS4-geenin poistamisen seurauksena. His -trans-formanttien seulomiseksi, siirrettiin regenerointiagaria, johon oli sekoitettu Arg+-pesäkkeitä, steriiliin 50 ml:n putkeen, joka sisälsi 25 ml steriiliä vettä. Agar jauhettiin sitten hienoksi sekoittamalla Brinkman Instruments'in Polytron-homogenisaattorilla asetusarvossa 5 noin 1 minuutin ajan. Hiivasolut erotettiin agarista suodattamalla kolmen steriilin harsoverkkokerroksen läpi. Osa hiivasoluista sonikoitiin sitten, laimennettiin ja levitettiin SD-agaralustamaljoille, joihin oli lisätty 40 ^.ug/ml histidiiniä.
Sonikointia varten, solunäytteitä laimennettiin A^QQ-arvoon 0,1 ja sonikoitiin 10 sekunnin ajan Sonifier Cell Disrupter 350-laitteessa (Branson Sonic Power Co.) tehon asetusarvossa 4, käsittely, joka riittää erottamaan solut toisistaan mutta ei riitä alentamaan solujen elinkykyä. 2-3 päivän kuluttua, pesäkkeitä, jotka kasvoivat SD plus histidiini-agarmaljoilla toistomaljattiin SD-maljaryhmiin, toinen ryhmä histidiinin kanssa ja toinen ilman.
Arg+ His -pesäkkeiden suhteellinen osuus oli keskimäärin 0,7 % Arg+-transformanttien kokonaismäärästä. Genomin DNA:ta kolmesta Arg+ His -kannasta tutkittiin Southern blot-hybridi-saatiolla. Koko HIS4-geeni puuttui kaikista kolmesta, ja - 98931 21 lineaarinen plasmidi liitettiin kuten on esitetty kuvion 2 alaosassa.
Sen tosiseikan lisäksi, että GS190-pYMI1-kanta tarvitsee histidiiniä eikä enää tarvitse arginiinia kasvuun, mitään muita muutoksia ravinteellisissa vaatimuksissa tai kasvunopeuksissa ei havaittu.
Esimerkki 3 HIS4-geenin poistaminen P. pastoris-kannasta NRRL Y-11430 Kuvio 4 esittää plasmidia pYMI3a, ja kuvio 5 tuo esille tapahtumat joista on seurauksena palasen lineaarinen liittäminen plasmidista P. pastoris-kannan NRRL γ-11430 HIS4-lokuk- £ seen. Vektori sisältää G418-resistenssigeenin (G418 ) pBPG1-1:stä (saatavissa talletuslaitoksesta the United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, E. coli-isännässä numerolla NRRL B-18020; katso kuvio 6) selektiivisenä markkerina. G418 -geeni siirrettiin plasmidista pBPG1-1 suunnilleen 2,2 kbp:n BamHI (pBR322-paikka)/Bglll(PARSI-paikka)-palasessa ja liitettiin pYJ8:n Bglll-paikkaan (NRRL B-15889; katso kuvio 3), syrjäyttämällä 2,7 kbp:n Bglll-palanen, joka sisältää Pichian HIS4-geenin.
Vektori pYMI3a liuotettiin EcoRI;llä 2,9 kbp:n palasen tuot-tamiseksi, joka sisälsi G418 -geenin, jota reunusti noin 450 ja 250 bP:n (emäsparin) DNA:t alueelta, joka sijaitsi HIS4-geenin päiden 5' ja 3' kohdalla täsmälleen, vastaavasti. EcoRI;llä katkaistu plasmidi siirrettiin P. pastoris-isäntään.
Transformantit seulottiin niiden kyvyn perusteella kasvaa antibiootin G418, 300 ^ug/ml, läsnäollessa. Seulontaa varten, modifioitiin regenerointiagaralustaa siitä, jota kuvailtiin esimerkissä I, osa D, seuraavasti: 22
9893 I
1. Regenerointiagaralustan resepti: a. Agar-sorbitoli- 9 g Bacto-agar, 54,6 g sorbitoli, 240 ml i^O, autoklavoidaan.
b. 10x glukoosi- 20 g dekstroosi, 100 ml H20, autoklavoidaan.
c. 10x YP- 10 g hiivauute, 20 g peptoni, 100 ml H20, autoklavoidaan.
d. Lisätään 30 ml 10x glukoosia ja 30 ml 10x YP:tä 240 ml: aan sulatettua agar-sorbitoliliuosta. Pidetään sulaa regeneroin-tiagaralustaa 55°C - 60°C:ssa.
2. Transformanttien maljaviljely. Näyte: Vähintään 30 minuuttia ennen kuin transformaationäytteet olivat valmiit, valettiin 10 ml/malja regenerointiagaralustaa pohja-agarkerrokseksi, johon oli lisätty 600 ^ug/ml antibioottia G418. Transformaatiojakson aikana näytteet olivat SDS:ssä, 10 ml:n regenerointiagaralustan alikvootit (ilman G418:ta) jaettiin putkiin 45-50°C:ssa hauteessa. Kun transformaationäytteet olivat valmiit, yhtä suuret määrät näytteitä lisättiin putkiin, joissa oli regenerointiagaria ja valettiin 10 ml pohja-agarkerroksen päälle, joka sisälsi antibioottia G418. Maljoja inkuboitiin 30°C:ssa 3-5 päivää.
Sen jälkeen kun pesäkkeitä oli muodostunut regenerointiagar-maljoilla, joissa oli G418 mukana, soluja seulottiin niiden kyvyn perusteella kasvaa ilman histidiiniä. Solut kerättiin regenerointiagarilta, sonikoitiin, ja levitettiin SD-agar-alustamaljoille, joihin oli lisätty 40 ^,ug/ml histidiiniä, kuten kuvailtiin esimerkissä 2. 2-3 päivän inkuboinnin kuluttua 30°C:ssa, pesäkkeet viljeltiin toistomaljäämällä SD-agaralustamaljoille histidiinin kanssa ja ilman sitä.
R —
Likimääräisesti 0,1 % G418 -pesäkkeistä oli His (2 suunnilleen 2000:sta seulotusta). Southern-blottauksen hybridisaa-tiokokeet osoittivat, että HIS4-geeni poistettiin molempien His -kantojen genomeista, ja että molemmat genomit sisälsivät p G418 -geenin, kuten on esitetty kuviossa 5. Toista näistä His -kannoista, jolle on annettu laboratoriotunnus KM31 (saa- - 98931 23 tavissa talletuslaitoksesta the United States Department of Agricultures, Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, numerolla NRRL Y-18018) on menestyksellä transformoitu useilla HIS4-sisältävillä Pichia-peräisillä plasmi-deilla, kuten esim. pSA0H5:lla (saatavissa E. coli-isännästä numerolla NRRL B-15862), mikä antaa lisänäyttöä sille, että KM31 on spesifisesti organismi, jolta on poistettu HIS4-geeni.
Tämä on ensimmäinen kerta, kun "villityypin" P. pastoris NRRL Y-11430 on transformoitu suoraan (so. ilman, että eristetään ja karakterisoidaan ensin auksotrofinen johdannainen). Näiden HIS4-mutanttikantojen mahdollinen etu on se, että koska ne konstruoitiin paikkaspesifisellä liittämis/poistamismene-telmällä, niissä ei esiinny sekundäärisiä mutaatioita, joita luultavasti esiintyy Pichian auksotrofisissä isännissä, joita tuotetaan esimerkiksi kemiallisen mutageneesin kautta, kuten esim. GS115 (NRRL Y-15851) ja GS190 (NRRL Y-18014).
On huomioitava, että Pichian HIS4-geenin poistaminen Pichian genomista liittämällä EcoRI-palanen pYMI3a:sta ei johtanut suurten pBR322-osien lisäykseen (kuten tapahtui, kun pYMI1 liitettiin; katso esimerkki 2). Koska useimmat autonomiset ARS-pohjäiset Pichian ekspressiovektorit, kuten esimerkiksi pSA0H5 (katso kuvio 9), koostuvat pääasiallisesti pBR322:n ja Pichian HIS4-geenin sekvensseistä, ovat nämä autonomiset vektorit hyvin vähän homologisia näiden Pichia HIS4-deleetio-isäntien genomin kanssa ja sen vuoksi niiden ei tulisi usein integroitua.
Esimerkki 4
Primäärisen alkoholioksidaasigeenin saattaminen useaan osaan Pichia-kannat, joilta puuttuvat alkoholioksidaasigeenit (primääristä alkoholioksidaasigeeniä merkitään tässä A0X1 ja sekundäärinen alkoholioksidaasigeeni on tässä merkittynä A0X2), ovat kiinnostuksen kohteina ainakin kahdesta syystä. Ensiksi, apukeinona tutkittaessa geenin ilmenemisen säätelyä 98931 24 metanolin avulla. Esimerkiksi mutanttikannan avulla, jolta puuttuvat A0X1- ja A0X2-geenit, kuten kuvaillaan yksityiskohtaisemmin esimerkissä 7, voidaan saada näyttöä siitä, onko metanoli vai jokin toinen metaboliitti (formaldehydi, formaatti, jne.) todellinen metanolilla säädettyjen geenien indusoiva molekyyli. Toinen kiinnostuksen kohde AOX-vajaassa Pichia-kannassa perustuu mahdollisuuteen, että sellainen kanta voisi ilmentää suurempia heterologisten geenituotteiden tasoja, kuten kuvaillaan yksityiskohtaisemmin esimerkeissä 5 ja 6.
AOX-geenin saattamiseksi useaan osaan, luotiin plasmidi pYMI7 (kuvio 7). Plasmidi konstruoitiin liittämällä 2,9 kbp BamHISalI-palanen plasmidista pYM25 (NRRL B-18015; katso kuvio 17), joka sisältää Saccharomyces ARG4-geenin, BamHI-katkaistuun pPG4,0:aan (NRRL B-15868; katso kuvio 16a:n restriktio-karttaa tämän plasmidin Pichia-osasta). Liittäminen johtaa noin 600 emäsparin poistamiseen AOXl-geenin 5'-osasta (noin yksi neljäsosa geenistä). Plasmidi pYMI7 linearisoitiin liuottamalla PvuII:11a ja EcoRI:llä ja transformoitiin PPFl:seen (arg4 his4, NRRL Y-18017) valikoimalla Arg+-prototrofeja.
Transformantit kerättiin regenerointiagarilta ja niitä soni-koitiin, kuten kuvailtiin esimerkissä 2 ja levitettiin SD-agaralustamaljoille, jotka sisälsivät 0,1 % glukoosia (2 % sijasta) ja 40 g/ml histidiiniä. Pesäkkeet, jotka kehittyivät, viljeltiin sitten toistomaljamenetelmällä SD-agaralustamalja-joukon pinnoille (sisältäen histidiiniä) seuraavien hiilen lähteiden kanssa: l) ei hiiltä; 2) 0,5 % metanolia; ja 3) 2 % glukoosia. Noin 81 % Arg+-pesäkkeistä ei voinut kasvaa normaalisti metanolilla. Genomin DNA:n Southern blot-analyysi kahdesta näistä metanolia käyttämättömistä kannoista, so. KM71 ja KM72, vahvisti sen, että AOXl-geeni oli näillä kannoilla saatettu useaan osaan, ja että vektori oli liitetty, kuten on esitetty kuvion 8 alaosassa.
PPFl-pYM17-alkoholioksidaasivajaat konstruktiot, joilla on genotyyppi: (his4 aoxl:: SARG4), ovat mahdollisesti hyvin ’ arvokkaita. Esimerkiksi koska kanta on his4, Pichia-vekto reita, jotka sisältävät HIS4-geenin valittavissa olevana 25 - 98961 markkerina, kuten esimerkiksi pSA0H5 (NRRL B-15862; katso kuvio 9), voidaan transformoida tähän isäntään, kuten kuvaillaan täydellisemmin esimerkissä 5, jäljempänä.
Esimerkki 5
IacZ-geenin metanolin säätelemä ilmeneminen Pichia pasto-riksen alkoholioksidaasivajaassa mutanttikannassa Tämä esimerkki kuvailee kokeita, jotka käsittelevät lacZ-geenin ilmenemistä Pichia-isännässä KM71 (PPF1-pYMI17-alko-holioksidaasivajaa konstruktio), jota valmistettiin kuten kuvailtiin esimerkissä 4.
Aox1 -isäntä näissä vertailevissa kokeissa oli KM71 (his4 aoxl;:SARG4) ja Aox1+-isäntä oli PPF1 (arg4 his4; NRRL Y-18017). A0X1-promoottori-lacZ-ekspressiokasetti, joka transformoitiin molempiin kantoihin, oli plasmidilla pSA0H5 (katso kuvio 9, NRRL B-15862). Molemmista kannoista eristettiin useita pysyviä His+-transformantteja. Niiden genomien DNA:itä tutkittiin Southern blot-analyysin avulla, jotta saataisiin yhteneväisten kantojen joukko, jokaisen sisältäessä pSA0H5-plasmidin integroituneena A0X1-promoottorilokuksessa. Samalla tavalla transformoitiin dihydroksiasetonisyntetaasin (DAS) promoottori-lacZ-geeniyhdistymä KM71:een ja PPF1:een plasmidilla pT76H3 (katso kuvio 18; NRRL B-18000) valikoimalla histidiinin prototrofian perusteella.
Kutakin neljää kantaa kasvatettiin alunperin SD-alustassa 2 % glyserolin ollessa poikkeuksellisesti hiilen ja energian lähteenä 2 % glukoosin sijasta. Kukin viljelmä siirrettiin sitten, so. kerättiin talteen sentrifugoimalla ja siirrettiin eri alustaan, so. SD-alusta, jossa oli 0,5 % metanoli ainoana hiilen lähteenä. Näiden viljelmien näytteistä määritettiin 8-galaktosidaasi, tulosten ollessa tiivistettynä taulukossa I.
98931 26
Taulukko I
A
β-galaktosidaasi yksikköä/,ug + —
Aika, tuntia Aoxl -isäntä Aox1 -isäntä
Pronoottori-> A0X1 DAS A0X1 DAS
0 0 0 0 0 2 3 2 5 4 4 11 8 7 7 10 18 9 12 11 16 17 - 26 20 21 12 38 18 25 - 16 - 24 30 18 - 43 27 32 22 37 42 14 - 72 50 22 48 54 14 - 48 β-galaktosidaasimääritys A. Tarvittavat liuokset: 1. Z-puskuri: Loppukonsentraatio
Na2HP04 · 7H20 16,1 g 0,06 M
NaH2P04 5,5 g 0,04 M
KC1 0,75 g 0,01 M
MgS04 . 7H20 0,246 g 0,001 M
2-merkaptoetanoli 2,7 ml 0,05 M
täytetään 1 l:ksi; pH:n tulisi olla 7 2 . O-nitrof enyyli^-D-galaktosidi (ONPG)
Liuotetaan 400 mg ONPG:tä (Sigma N-1127) 100 ml:aan tislattua vettä 4 mg/ml ONPG-liuoksen tekemiseksi.
B. Määritysmenettely; 1. Poistetaan määrätty osa viljelyalustasta (20-50=hiivaso-lujen OD600), sentrifugoidaan ja pestään solupelletti kylmällä steriilillä vedellä.
98931 27 2. Lisätään 1 ^ul 40 % Z-puskuria solupellettiin ja 0,2 !ug hapolla pestyjä 0,45-0,50 mm lasihelmiä. Pidetään kaikkia näytteitä jään päällä. Pyörresekoitetaan seosta suurimmalla asetusarvolla neljä (4) kertaa yhden minuutin ajan joka kerta. Näytteitä tulisi pitää jäissä vähintään yksi minuutti pyörresekoituskertojen välillä.
3. Siirretään lysaatit mikrosentrifugiputkiin ja sentri-fugoidaan mikrosentrifugilla 4°C:ssa 5 minuutin ajan. Siirretään supernatantit uusiin mikrosentrifugiputkiin, ja pidetään ekstrakteja jään päällä.
4. Kokonaisproteiinikonsentraatio ekstraktissa estimoitiin käyttämällä Bio-Rad Laboratories1 in (Bradford) proteiini-määritysmenetelmää. Tätä varten laimennettiin Bio-Radin väri-reagenssikonsentraattia neljällä tilavuudella deioni-soitua vettä ja suodatettiin Whatman 3MM-paperin läpi. Sitten valmistettiin standardikonsentraatiokäyrä lisäämällä 3, 10, 30 ja 100 yug naudan seerumin albumiinia (BSA) 100 ^ulissa Z-puskuria joukkoon 13 x 100 mm lasiputkia, joista kukin sisälsi 2,5 ml värireagenssia. Näytteitä sekoitettiin ja pidettiin huoneenlämpötilassa 5 minuuttia ja niiden optiset tiheydet 595 nm:ssa määritettiin. Ekstraktien 3, 10, ja 30 yul:n näytteet saatettiin 100 yul:ksi liuoksella, joka sisälsi Z-puskuria, ja proteiinimäärä määritettiin kuten edellä kuvailtiin. Proteiinikonsentraation arvo kullekin ekstraktille interpoloitiin sitten käyttämällä BSA-konsentraatiokäyrää.
5. β-galaktosidaasimäärityksiä varten, 10 ^ul ekstraktin 1Ox laimennosta lisättiin ml:aan Z-puskuria, ja seosta inku-boitiin 5 minuuttia 30°C:ssa.
6. Aloitetaan reaktio lisäämällä 0,2 ml ONPGitä (4 mg/ml), pyörresekoitetaan.
7. Pysäytetään reaktio lisäämällä 0,5 ml 1 M Na2C03-liuosta sopivina ajankohtina (tavallisesti 1 ja 30 minuutin välillä, ja kohdassa A^2q< 1)· 8. Luetaan supernatantin absorbanssi 420 nmrssa.
98931 28 C. β-galaktosidaasin aktiivisuusyksikköjen laskeminen; 1 U = 1 nmooli ortonitrofenolia (ONP) muodostuen minuuttia kohti 30°C:ssa ja pH:ssa 7.
1 nmoolilla ONP:tä on absorbanssi 420 nm:ssa (A42o^ 0*0045 yhden cm:n valotien pituudessa; näin ollen absorbanssin arvo 1 420 nm:ssa edustaa 22 nmoolia ONP/ml, tai 378 nmoolia/ 1.7 ml, koska analysoitavan supematantin kokonaistilavuus on 1.7 ml. Tästä johtuen taulukoissa ilmenevät yksiköt lasketaan : U = A420 X 378 t (min)
Missään neljästä viljelmästä ei esiintynyt juuri lainkaan ilmaistavaa β-galaktosidaasiaktiivisuutta glyseroli-kasvuvaiheen aikana. Noin 10-20 tunnin kuluttua siirtämisestä metanolialustaan, kahdessa viljelmässä, jotka sisälsivät AOX1 -IacZ-ja DAS-lacZ-ekspressiokasetteja Aox1+-isännässä, oli β-galaktosidaasin aktiivisuus asettumassa tasolle noin 20 yksikköä β-galaktosidaasiaktiivisuutta per ^ug proteiinia. Kuitenkin, AOX1-IacZ-kasetti Aox1 -taustassa, osoitti aktiivisuutta, joka kipusi 60 yksikön lähelle/^ug. DAS-lacZ-kasetti Aox1 -isännässä osoitti lisäystä β-galaktosidaasin aktiivi-suustasoissa samoin. Näin ollen, transformoitu Aoxl -isäntä, KM71, ilmensi β-galaktosidaasia 2-3-kertaisesti siihen tasoon nähden, minkä transformoitu isogeeninen-Aox1+-kanta ilmensi, PPF1 .
Esimerkki 6
Hepatitis B pinta-antigeenigeenin liittäminen ja AOX1-geenin poistaminen Tässä paikkakohdistettua liittämistä/poistamista käsittelevässä esimerkissä, AOX1-geenin koko koodaava sekvenssi poistettiin, ja Hepatitis B pinta-antigeeni (HBsAg)-geeni liitettiin AOX1-geenin promoottorin kontrollin alaisena, joka pysyy genomissa. Tätä P. pastoriksen isäntäkonstruktiota var- 9893'! 29 ten luotiin plasmidi pBSAGI5I (tallennettu E. coli-isäntään talletuslaitoksessa the Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture/ Peoria,
Illinois, ja on yleisön saatavissa rajoituksetta talletus-numerolla NRRL B-18021; kuvio 12). Plasmidi sisältää 1,0 kiloemäsparin palasen sekvensseistä, jotka ympäröivät AOX1-geenin 5’-päätä, jota seuraavat hepatitis B pinta-antigeenin (HBsAg) sekvenssi, ja 300 emäsparin AOX1-terminaattoripala-sen, kaikki asettuneina kuten on esitetty kuvioissa 9, 10 ja 11. Ekspressiokasettia seurasi 2,7 kbp palanen, joka koodaa Pichian HIS4-geeniä ja viimein, 1,5 kbp PvuII-palanen, joka sisältää sekvenssit 3' AOX1-geeniin. Kun pBSAGI5I liuotettiin BglII:lla, vapautui 7,2 kbp lineaarinen vektori, joka sisälsi 0,85 kbp 5'-AOX1-geenin sekvenssin toisessa päässä ja 1,1 kbp 3'-AOX1-sekvenssin toisessa päässä. Bglll-katkaistu pBSAGI5l transformoitiin kantaan GS115 seuloen his-tidiinin prototrofian perusteella, transformantit kerättiin regenerointiagarilta, ja niitä sonikoitiin kuten on kuvailtu esimerkissä II, ja levitettiin SD-agaralustamaljoille, joissa oli 0,1 % glukoosia (2,0 % asemesta). Syntyneet pesäkkeet toistomaljättiin sitten minimaaliagarmaljoille, joissa oli seuraavia hiilen lähteitä: 1) ei hiilen lähdettä, 2) 0,5 % metanoli, ja 3) 2 % glukoosi. Keskimäärin 32 % tutkituista pesäkkeistä ei kyennyt normaalisti kasvamaan metanolilla.
Kahden metanolia käyttämättömän kannan genomin DNA:n Southern blot-analyysi osoitti, että A0X1-geeni oli poistettu, ja että vektorisekvenssit oli liitetty kuten on esitetty kuviossa 13.
Kasvaessaan metanolissa, ilmensi GS115-pBSAGI5I-kanta (aox1:: HBsAg-HIS4) HBsAg:n suurempina tasoina kuin mitä ilmensivät täysin alkoholioksidaasikompetentit, samalla tavalla transformoidut solut.
30 96931
Esimerkki 7
Pichia pastoriksen toisen alkoholioksidaasigeenin identifioiminen paikkakohdistetun liittämistekniikan avulla Toisen alkoholioksidaasigeenin läsnäolo voidaan osoittaa seuraavista havainnoista: a) Southern bloteissa, joissa koettimet joko AOX-cDNA:sta tai genomin DNA:sta hybridisoi-tiin katkaistuihin Pichian DNA:hin, esiintyi aina vähintään kaksi juovaa; 2) kaksi Pichian genomin DNA-palasta eristettiin alunperin, jotka olivat samankaltaiset mutta eivät identtiset toisiinsa nähden (katso kuvio 16); ja 3) mutantit Pi^hia-kannat, kuten KM71 ja GS115-pBSAGI5I, joista primäärinen AOX-geeni (AOX1) oli poistettu tai saatettu useaan osaan, saattoi silti kasvaa metanolilla ja sisälsi alkoholi-oksidaasiaktiivisuutta. Kasvunopeus ja AOX-aktiivisuus näiden Aox' kantojen metanolissa kasvavalla soluilla oli paljon alhaisempi kuin isogeenisillä Aox+-kannoilla. Sen vuoksi näyttää siltä, että toinen AOX-geeni (AOX2) ilmenee alempitasoisena, tai että sen tuote on vähemmän aktiivinen metanolissa. Esimerkissä 4 osoitettiin, että Pichian DNA-palanen pPG4,0:ssa sisältää A0X1-geenin.
Vakuuttavin menetelmä sen osoittamiseksi, että genomin DNA-palanen pPG3,0:sta sisältää ainakin osan AOX2-geenistä, on konstruoida mutanttikanta, jossa tämä oletettu A0X2-geeni on jaettu useaan osaan tai poistettu. Tätä varten konstruoitiin paikkakohdistettu vektori pYMI12a (kuvio 14). Plasmidi käsittää pääasiallisesti pPG3,0:n (kuvio 16b), joka sisältää oletetun AOX2-geenin 3,0 kbp:n BamHI-palasessa. 2,7 kbp:n Bglll-palanen, joka sisältää Pichian HIS4-geenin, eristettiin pYJ8:sta (kuvio 3; NRRL B-15889) ja liitettiin sekvenssien paikalle, jotka sijaitsivat pPG3,0:n Bglll- ja vasem-manpuoleisimman Kpnl-paikkojen välissä (Kpnl-paikka muutettiin Bglll-paikaksi oligonukleotidiadaptorin avulla ennen liittämistä; ja HIS4-geenin BamHI-paikka tuhottiin "täyttämällä" ennen liittämistä pPG3,0:ssa.) AOX1 ja oletetun A0X2-geenin (kuvio 16) vertailu osoittaa, että tämän konstruoinnin tulisi johtaa noin 800 bp:n poistamiseen AOX2:n keskeltä. Liuottamalla pYMI12a BamHI:n avulla, vapautui 4,5 kbp:n 31 96931 lineaarinen vektori, joka sisälsi HIS4-geenin palasen, jota ympäröivät sekvenssit oletetun A0X2-lokuksen kohdista 1,1 ja 0,7 kbp, vastaavasti (katso kuvio 15).
Tämä lineaarinen vektori transformoitiin AoXl" -kantaan, KM71, (aoxl his4::SARG4), ja transformantit eristettiin valikoimalla histidiiniprototrofeja. Transformantit seulottiin sitten metanolin käyttämiskyvyn osalta toistomalja-menetelmällä agarmaljaryhmissä.
Transformoimaton AOX1" -kanta KM71 kasvoi niin hitaasti me-tanolimaljoilla, että jos metanolia sisällytettiin agariin, se haihtui ennenkuin merkittävää kasvua voitiin havaita.
Tämä ongelma ratkaistiin syöttämällä metanolia soluihin höyryfaasissa. Tätä tarkoitusta varten, noin 0,2 ml 100 % metanolia asetettiin maljan kannen alle, jossa ei ollut mitään hiilen lähdettä agaralustassa. Maljan annettiin olla huoneenlämpötilassa, ja kansi vahdettiin joka 2-4. päivä kanteen, joka sisälsi tuoretta metanolia. Noin 1-2 viikon kuluttua, olivat villityypin (Aoxl+ Aox2+), ja mutanttikan-tojen, (Aoxl* Aox2+) ja (Aoxl' Aox2') kasvuerot metanolissa selviä.
Seuraamalla höyry-faasisyötön menetelmää todettiin, että noin 0,1 % kannan Aoxl' His+-transformanteista ei kyennyt kasvamaan metanolilla. DNA:t kahdeksasta Aoxl' Aox2' His+ transformantista analysoitiin Southernin suodinhybridisaa-tiomenetelmällä. Kolme näistä DNA:sta sisälsi lineaarisen pYMI12a-vektorin liitettynä kuten on esitetty kuviossa 15. Analyysi yhdestä Aoxl" Aox2'-kaksoismutantista, KM7121 «( (NRRL Y-18019), osoitti, että kanta ei lainkaan kasva meta nolilla, ja ettei kannassa ole ilmaistavissa olevaa AOX-aktiivisuutta. Näistä tuloksista KM7121:llä käy selväksi, että Pichian palanen pPG3,0:ssa sisältää sekvenssejä toisesta AOX-geenistä, ja että, näiden kahden alkoholioksidaa-sin lisäksi, ei mitään metanolia hapettavia aktiivisuuksia ole P. pastoriksella.
Claims (14)
1. Menetelmä polypeptidien korkeatasoiseksi ilmentämiseksi hiivaisännässä, tunnettu siitä, että käytetään hiivaisäntänä korkeatasoiselle geeniekspressiolle Pichia-suvun hiivakantaa, transformoidaan mainittu hiivaisäntä jaksottaisesti järjestäytyneellä lineaarisella DNA-palasella, joka käsittää ensimmäisen liitettävän DNA-palasen, voimakkaan substraattivasteen omaavan säätelyalueen, heterologisen geenin, valikoitavan markkerigeenin, ja toisen liitettävän DNA-palasen; että mainitut ensimmäinen ja toinen liitettävissä oleva DNA-palanen ovat kumpikin vähintään noin 200 nukleotidia pituudeltaan ja niissä on nukleotidisekvenssejä, jotka ovat homologisia na-tiivin hiivaisännän genomin erillisten osien kanssa; että mainitut ensimmäinen ja toinen liitettävä DNA-palanen ovat toisiinsa nähden sijoittuneet mainitussa lineaarisessa DNA-palasessa siten kuin ne ovat sijoittuneet hiivaisännän geno-missa; että mainittu heterologinen geeni on säätelyalueen kontrollin alaisena; että säätelyalue/heterologinen geeni -rakenne, kuten myöskin mainittu valikoitava markkerigeeni, on sijoitettu ensimmäisen ja toisen liitettävän DNA-palasen väliin, ja viljellään näin transformoitua hiivaisäntää ravin-nollisesti rajoitetuissa olosuhteissa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ravinnollisesti rajoitetut olosuhteet saadaan aikaan syöttämällä soluille rajoitettu määrä substraattia ravinteena.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ravinnollisesti rajoitetut olosuhteet saadaan aikaan käyttämällä mutantti-isäntää, joka mutaation tuloksena on osittain kykenemätön metaboloimaan substraattia.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu substraatti on metanoli.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu Pichia-suvun isäntäkanta, joka transformoidaan mainitulla jaksottaisesti järjestäytyneellä 33 9 69 ό 1 lineaarisella DNA-palasella, omaa katkaistun primäärisen oksidaasigeenin (A0X1) ja ensimmäinen ja toinen liitettävä DNA-palanen valitaan palasista, joiden pituudet ovat alueella noin 200-500 emäsparia dihydroksiasetonisyntaasigeenistä, arginiinisukkinaattilyaasigeenistä, histidinolidehydrogenaa-sigeenistä ja alkoholioksidaasigeeneistä.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu Pichia-suvun isäntäkanta, joka transformoidaan mainitulla jaksottaisesti järjestetyllä lineaarisella DNA-palasella, omaa koskemattoman primäärisen oksidaasigeenin (AOX1), ja mainittu ensimmäinen ja toinen liitettävä DNA-fragmentti on valikoitu fragmenteista, joiden pituudet ovat alueella noin 200-5000 emäsparia primäärisestä oksidaasigeenistä (AOX1).
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen liitettävä DNA-palanen identifioidaan jonkin restriktiokartan avulla, joka on esitetty kuvioissa 1, 4, 7, 12 tai 14.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu Pichia-suvun isäntäkanta on lajin Pichia pastoris kanta.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu Pichia pastoris -suvun isäntä on Pichia pastoris (GS115 NRRL Y-15851), Pichia pastoris (GS190 NRRL Y-18014), Pichia pastoris (KM31 NRRL Y-18018), Pichia pastoris (KM71, joka voidaan saada transformoimalla kanta PPFl plasmidilla pYM17 (kuva 7)) tai Pichia pastoris (PPFl NRRL Y-18017).
10. Jaksottaisesti järjestäytyneen lineaarisen DNA-palasen käyttö patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä, tunnettu siitä, että se käsittää ensimmäisen liitettävän DNA-palasen, voimakkaan, substraattivasteen omaavan säätelyalueen, heterologisen geenin, valikoitavan markkerigeenin ja ; toisen liitettävän DNA-palasen; että mainitut ensimmäinen ja toinen liitettävissä oleva DNA-palanen ovat kumpikin vähin- 34 98931 tään noin 200 nukleotidia pituudeltaan, niissä on nukleoti-disekvenssejä, jotka ovat homologisia natiivin hiivaisännän genomin erillisten osien kanssa; että mainitut ensimmäinen ja toinen liitettävissä oleva DNA-palanen ovat toisiinsa nähden sijoittuneet mainitussa lineaarisessa DNA-palasessa siten, kuin ne ovat sijoittuneet hiivaisännän genomissa; että mainittu heterologinen geeni on säätelyalueen kontrollin alaisena; ja että säätelyalue/heterologinen geeni -rakenne, kuten myös valikoitava markkerigeeni, on sijoitettu ensimmäisen ja toisen liitettävän DNA-palasen väliin.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitut ensimmäinen ja toinen liitettävä DNA-palanen on valittu palasista, joiden pituudet ovat alueella noin 200-5000 emäsparia dihydroksiasetonisyntaasigeenistä, alkoholi-oksidaasigeenistä, arginiinisukkinaattilyaasigeenistä ja his-tidinolidehydrogenaasigeenistä.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen liitettävä DNA-palanen identifioidaan jollakin restriktiokartalla, joka on esitetty kuviossa 1, 4, 7, 12 ja 14.
13. Jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu lineaarinen DNA-palanen lisäksi käsittää bakteerista peräisin olevan plasmidi-DNA:n.
14. Suljetun rengasmaisen plasmidin käyttö, tunnettu siitä, että plasmidi käsittää jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukaisen lineaarisen DNA-palasen ja bakteerista peräisin olevan plasmidi-DNA:n. 35 93931
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US79101385 | 1985-10-25 | ||
| US06/791,013 US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1985-10-25 | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI864319A0 FI864319A0 (fi) | 1986-10-24 |
| FI864319A FI864319A (fi) | 1987-04-26 |
| FI98931B FI98931B (fi) | 1997-05-30 |
| FI98931C true FI98931C (fi) | 1997-09-10 |
Family
ID=25152397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI864319A FI98931C (fi) | 1985-10-25 | 1986-10-24 | Menetelmä polypeptidien korkeatasoiseksi ilmentämiseksi Pichia-suvun hiivassa |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4882279A (fi) |
| EP (2) | EP0560401B1 (fi) |
| JP (1) | JP2614215B2 (fi) |
| KR (1) | KR930002738B1 (fi) |
| CN (1) | CN86107108A (fi) |
| AT (2) | ATE98695T1 (fi) |
| AU (2) | AU581107B2 (fi) |
| CA (1) | CA1339209C (fi) |
| DD (1) | DD255544A5 (fi) |
| DE (2) | DE3689411T2 (fi) |
| DK (1) | DK510786A (fi) |
| EG (1) | EG17985A (fi) |
| ES (2) | ES2061433T3 (fi) |
| FI (1) | FI98931C (fi) |
| HU (1) | HU208552B (fi) |
| IE (1) | IE68454B1 (fi) |
| IL (1) | IL80286A (fi) |
| IN (1) | IN166443B (fi) |
| MX (1) | MX168390B (fi) |
| NO (1) | NO176923C (fi) |
| NZ (1) | NZ217809A (fi) |
| PH (1) | PH25990A (fi) |
| PL (1) | PL154843B1 (fi) |
| PT (1) | PT83618B (fi) |
| YU (1) | YU46758B (fi) |
| ZA (1) | ZA867650B (fi) |
Families Citing this family (162)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| IL89989A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts |
| IL89993A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts |
| IL90021A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Process for the production of interferon |
| IL89991A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of hepatitis b pres2 protein in methylotrophic yeasts |
| IL89992A0 (en) | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
| AT390267B (de) * | 1988-06-08 | 1990-04-10 | Vogelbusch Gmbh | Verfahren zum markieren und identifizieren von industriell eingesetzten mikroorganismen, vorzugsweise hefestaemmen |
| US5102789A (en) * | 1989-03-15 | 1992-04-07 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells |
| US5204252A (en) * | 1989-02-08 | 1993-04-20 | Henkel Research Corporation | Candida tropicalis transformation system |
| WO1990009434A1 (en) * | 1989-02-13 | 1990-08-23 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells |
| CA2017176A1 (en) * | 1989-05-22 | 1990-11-22 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. | Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin |
| JPH0669365B2 (ja) * | 1989-05-22 | 1994-09-07 | 株式会社ミドリ十字 | アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法 |
| US6440681B1 (en) | 1990-04-03 | 2002-08-27 | Merck & Co., Inc. | Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors |
| US5369028A (en) * | 1990-04-03 | 1994-11-29 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same |
| US5258302A (en) * | 1990-07-03 | 1993-11-02 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| WO1992004363A1 (en) * | 1990-09-04 | 1992-03-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
| JPH06506117A (ja) * | 1991-04-01 | 1994-07-14 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）蛋白質分解活性に影響する遺伝子およびその使用 |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
| US5665600A (en) * | 1991-09-18 | 1997-09-09 | Research Corporation Technologies, Inc. | Pichia pastoris linear plasmids and DNA fragments thereof |
| EP0690921B1 (en) * | 1993-03-03 | 1997-05-28 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Production of glycolate oxidase in methylotrophic yeast |
| ATE279516T1 (de) * | 1993-03-08 | 2004-10-15 | Merck & Co Inc | Menschliche neuronale nikotin-acetylcholin- rezeptor-verbindungen und methoden ihres einsatzes |
| JPH08509607A (ja) * | 1993-04-20 | 1996-10-15 | ザ ソールク インスチチュート バイオテクノロジー／インダストリアル アソシエイツ，インコーポレイテッド | ヒトｎ−メチル−ｄ−アスパラギン酸受容体サブユニット、これをコードする核酸およびその用途 |
| CN1124981A (zh) * | 1993-05-28 | 1996-06-19 | 纳幕尔杜邦公司 | 水合乙醛酸/氨甲基膦酸二烷基酯混合物的制备方法 |
| US5521297A (en) | 1993-06-04 | 1996-05-28 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates | Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors |
| US5912122A (en) * | 1993-06-04 | 1999-06-15 | Sibia Neurosciences, Inc. | Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6 |
| US6001581A (en) | 1993-06-04 | 1999-12-14 | Sibia Neurosciences, Inc. | Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors |
| US6638905B2 (en) | 1993-06-18 | 2003-10-28 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CFR receptor(s) |
| US6495343B1 (en) | 1993-06-18 | 2002-12-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CRF receptor(s) |
| WO1995013299A1 (en) * | 1993-11-08 | 1995-05-18 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same |
| ATE196311T1 (de) * | 1993-12-09 | 2000-09-15 | Univ Jefferson | Verbindungen und verfahren zur ortsspezifischen mutation in eukaryotischen zellen |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| DE69535317T2 (de) * | 1994-10-18 | 2007-06-21 | Dendreon Corp., Seattle | Aus nematoden extrahierte serinprotease-inhibitoren und die koagulation hemmende proteine |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| AU715423B2 (en) | 1995-03-17 | 2000-02-03 | Novozymes A/S | Novel endoglucanases |
| US6485967B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-11-26 | Merck & Co., Inc. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid |
| AU7719696A (en) * | 1995-10-18 | 1997-05-07 | New York Blood Center, Inc., The | Recombinant alpha-n-acetylgalactosaminidase enzyme |
| AU1158297A (en) * | 1995-11-09 | 1997-05-29 | Zymogenetics Inc. | Production of gad65 in methylotrophic yeast |
| US6001597A (en) * | 1995-11-09 | 1999-12-14 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
| ATE505485T1 (de) | 1996-03-01 | 2011-04-15 | Novo Nordisk As | Appetithemmendes peptid, zusammensetzung und verwendung |
| US5731181A (en) * | 1996-06-17 | 1998-03-24 | Thomas Jefferson University | Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides |
| CN1127568C (zh) | 1996-10-16 | 2003-11-12 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | 成纤维细胞生长因子同系物 |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| CN1344320A (zh) | 1998-09-23 | 2002-04-10 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | 细胞因子受体zalphall |
| EP1137773B1 (en) | 1998-12-07 | 2008-08-13 | ZymoGenetics, Inc. | Growth factor homolog zvegf3 |
| US6780615B1 (en) | 1998-12-31 | 2004-08-24 | Genway Biotech Inc. | Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system |
| US7833529B1 (en) | 1999-01-07 | 2010-11-16 | Zymogenetics, Inc. | Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor |
| EP1141274B2 (en) | 1999-01-07 | 2014-11-12 | ZymoGenetics, Inc. | Soluble receptor br43x2 and methods of using them for therapy |
| MXPA01009074A (es) | 1999-03-09 | 2002-03-27 | Zymogenetics Inc | Nuevo ligando zalfa11 de citocina. |
| US7504253B2 (en) * | 1999-06-11 | 2009-03-17 | The Burnham Institute For Medical Research | Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof |
| EP1860188B1 (en) | 1999-07-07 | 2011-05-04 | ZymoGenetics, Inc. | Human cytokine receptor |
| DE60043944D1 (de) | 1999-12-23 | 2010-04-15 | Zymogenetics Inc | Zytokin zcyt018 |
| ATE473280T1 (de) | 2000-05-11 | 2010-07-15 | Zymogenetics Inc | Zsig33-ähnliche peptide |
| EP2258725A3 (en) | 2000-06-26 | 2014-09-17 | ZymoGenetics, L.L.C. | Cytokine receptor zcytor17 |
| EP2322644A1 (en) * | 2000-06-28 | 2011-05-18 | GlycoFi, Inc. | Methods for producing modified glycoproteins |
| US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
| US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
| US7863020B2 (en) | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
| BR0112119A (pt) | 2000-06-30 | 2003-05-06 | Zymogenetics Inc | Polipeptìdeo isolado, molécula de ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira recombinante, método de produzir a proteìna zcyto21, anticorpo ou fragmento de anticorpo, método de detectar a presença da expressão do gene zcyto21 em uma amostra biológica |
| EP2028275A3 (en) | 2000-06-30 | 2009-05-06 | VIB vzw | Protein glycosylation modification in pichia pastoris |
| US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
| EP1736545A3 (en) | 2000-08-08 | 2007-03-28 | ZymoGenetics, Inc. | Soluble zcytor 11 cytokine receptors |
| EP2301971A1 (en) | 2001-02-20 | 2011-03-30 | ZymoGenetics, L.L.C. | Antibodies that bind both BCMA and TACI |
| CA2441580A1 (en) | 2001-03-22 | 2002-10-03 | Novo Nordisk Health Care Ag | Coagulation factor vii derivatives |
| EP1385866A4 (en) | 2001-04-05 | 2006-03-29 | Univ Nebraska | ALCOHOL OXIDASE-1 REGULATING NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR HETEROLOGIC GENE EXPRESSION IN YEAST |
| DK1436003T3 (da) | 2001-05-24 | 2010-03-15 | Zymogenetics Inc | TACI-immunoglobulin-fusionsproteiner |
| ATE444363T1 (de) | 2001-11-05 | 2009-10-15 | Zymogenetics Inc | Il-21-antagonisten |
| EP1463807A4 (en) * | 2001-12-19 | 2006-04-12 | Bristol Myers Squibb Co | FORMATHYDROGENASE FROM PICHIA PASTORIS AND USES THEREOF |
| SI1576112T1 (sl) | 2002-01-18 | 2012-10-30 | Zymogenetics Inc | Multimerni citokinski receptor zcitor17 |
| EP2230299B1 (en) | 2002-01-18 | 2011-12-07 | ZymoGenetics, Inc. | Novel cytokine ZCYTOR17 ligand |
| WO2003089589A2 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | Merck & Co., Inc. | Matrix analysis of gene expression in cells (magec) |
| EP2295455A1 (en) | 2002-04-19 | 2011-03-16 | ZymoGenetics, L.L.C. | Cytokine receptor |
| IL165717A0 (en) | 2002-06-26 | 2006-01-15 | Flanders Interuniversity Inst | A strain of methylotrophic yeast for producing proteins |
| ATE494367T1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-01-15 | Hoffmann La Roche | Rekombinante desoxyribonuclease i aus rinder- pankreas mit hoher spezifischer aktivität |
| DE60319333D1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-04-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Hitzelabile Desoxyribonuklease I-Varianten |
| US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
| EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
| JP4808157B2 (ja) | 2003-08-07 | 2011-11-02 | ザイモジェネティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー | Ｉｌ−２８およびｉｌ−２９の均一な調製物 |
| JP4824559B2 (ja) | 2003-09-09 | 2011-11-30 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 凝固因子ｖｉｉポリペプチド |
| JP4411192B2 (ja) * | 2003-12-05 | 2010-02-10 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 組換えで発現されるカルボキシペプチダーゼｂおよびその精製 |
| EP2325318A1 (en) | 2004-02-13 | 2011-05-25 | Novozymes A/S | Protease variants |
| EP1732946B1 (en) | 2004-03-08 | 2011-07-27 | ZymoGenetics, Inc. | Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them |
| AU2005266892B2 (en) | 2004-07-29 | 2011-03-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Use of IL-28 and IL-29 to treat cancer and autoimmune disorders |
| CN101001951B (zh) | 2004-08-02 | 2011-06-15 | 巴斯福植物科学有限公司 | 分离转录终止序列的方法 |
| CA2596390A1 (en) | 2005-02-08 | 2006-08-17 | Zymogenetics, Inc. | Anti-il-20, anti-il-22 and anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation |
| US8034326B2 (en) | 2005-04-18 | 2011-10-11 | Novo Nordisk A/S | IL-21 variants |
| ATE515512T1 (de) | 2005-05-12 | 2011-07-15 | Zymogenetics Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur modulierung von immunreaktionen |
| WO2006130657A2 (en) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Stereoselective reduction process for the preparation of pyrrolotriazine compounds |
| CA2618763A1 (en) | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Zymogenetics, Inc. | Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules |
| AR059945A1 (es) * | 2005-08-09 | 2008-05-14 | Zymogenetics Inc | Metodos para tratar afecciones malignas de celulas b que utilizan una molecula de fusion taci-ig |
| WO2007020256A1 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| PL1926749T3 (pl) * | 2005-09-14 | 2011-12-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Cięcie prekursorów insuliny przez wariant trypsyny |
| WO2007031559A2 (en) | 2005-09-14 | 2007-03-22 | Novo Nordisk Health Care Ag | Human coagulation factor vii polypeptides |
| US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
| EP1931697B1 (en) | 2005-09-28 | 2010-09-15 | ZymoGenetics, Inc. | Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same |
| NZ572373A (en) * | 2006-05-15 | 2012-02-24 | Ares Trading Sa | Methods for treating rheumatoid arthritis using a taci-ig fusion molecule |
| WO2008037735A1 (en) | 2006-09-27 | 2008-04-03 | Novo Nordisk A/S | Method for making maturated insulin polypeptides |
| EP2508614A3 (en) * | 2007-04-03 | 2012-11-28 | Oxyrane UK Limited | Glycosylation of molecules |
| WO2008157263A2 (en) | 2007-06-15 | 2008-12-24 | Arkansas State University | Methods of delivery of molecules to cells using a ricin subunit and compositions relating to same |
| KR101700711B1 (ko) | 2007-11-21 | 2017-01-31 | 로스킬드 유니베르시테트 | 얼음-결합 활성을 포함하는 폴리펩티드 |
| CN101952309A (zh) * | 2007-12-21 | 2011-01-19 | Ifxa有限公司 | 蛋白酶抑制剂 |
| WO2009092806A2 (en) * | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Aarhus Universitet | Selective exosite inhibition of papp-a activity against igfbp-4 |
| TWI449788B (zh) | 2008-03-03 | 2014-08-21 | Abbvie Inc | 轉型酵母菌之方法 |
| JP5425180B2 (ja) | 2008-03-27 | 2014-02-26 | ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド | ＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦ−Ａを阻害するための組成物および方法 |
| WO2009139349A1 (ja) * | 2008-05-14 | 2009-11-19 | Ｂｉｏ－ｅｎｅｒｇｙ株式会社 | 酵母細胞に遺伝子を導入する方法およびそのためのベクター |
| EP2623112B1 (en) | 2008-06-27 | 2015-03-04 | Zymogenetics, Inc. | Soluble hybrid Fc gamma receptors and related methods |
| ES2410579T5 (es) | 2008-12-16 | 2021-10-04 | Novartis Ag | Sistemas de despliegue de levaduras |
| WO2010091122A1 (en) | 2009-02-03 | 2010-08-12 | Amunix, Inc. | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
| WO2010103038A1 (en) | 2009-03-11 | 2010-09-16 | Novo Nordisk A/S | Interleukin-21 variants having antagonistic binding to the il-21 receptor |
| WO2011006982A2 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Rigshospitalet | Inhibitors of complement activation |
| US20120263701A1 (en) | 2009-08-24 | 2012-10-18 | Volker Schellenberger | Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same |
| KR102000383B1 (ko) | 2009-09-29 | 2019-07-15 | 유니버시테이트 젠트 | 만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 포스포-6-만노스로의 가수분해 |
| CA2781240A1 (en) | 2009-11-19 | 2011-05-26 | Oxyrane Uk Limited | Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans |
| CN102639559B (zh) | 2009-11-25 | 2015-04-29 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 用于制备多肽的方法 |
| JP5931738B2 (ja) | 2009-12-01 | 2016-06-08 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 新規のペプチジルアルファ−ヒドロキシグリシンアルファ−アミド化リアーゼ |
| EP2542569B1 (en) | 2010-03-05 | 2020-09-16 | Omeros Corporation | Chimeric inhibitor molecules of complement activation |
| CA2802017A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Zymogenetics, Inc. | Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods |
| JP6131190B2 (ja) | 2010-09-29 | 2017-05-17 | オキシレイン ユーケー リミテッド | リン酸化ｎ−グリカンの脱マンノシル化 |
| US9347050B2 (en) | 2010-09-29 | 2016-05-24 | Oxyrane Uk Limited | Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated N-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins |
| WO2013098651A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Oxyrane Uk Limited | Methods and materials for reducing degradation of recombinant proteins |
| SG10201606285YA (en) | 2012-02-01 | 2016-09-29 | Synthetic Genomics Inc | Materials and methods for the synthesis of error-minimized nucleic acid molecules |
| CA2861051C (en) | 2012-02-09 | 2021-06-22 | Var2 Pharmaceuticals Aps | Targeting of chondroitin sulfate glycans |
| EP2822577B1 (en) | 2012-02-15 | 2019-02-06 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor viii proteins |
| LT2814840T (lt) | 2012-02-15 | 2020-02-25 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Faktoriaus viii kompozicijos ir jų gavimo ir naudojimo būdai |
| CA2867237C (en) | 2012-03-15 | 2024-01-02 | Wouter Vervecken | Methods and materials for treatment of pompe's disease |
| KR101958234B1 (ko) * | 2012-05-09 | 2019-03-14 | 엘지이노텍 주식회사 | 보이스 코일 모터 |
| WO2014060401A1 (en) | 2012-10-15 | 2014-04-24 | Novo Nordisk Health Care Ag | Coagulation factor vii polypeptides |
| EP2964758B1 (en) | 2013-03-05 | 2020-05-27 | Oxyrane UK Limited | Production of catalytically active type i sulfatase |
| US10053501B2 (en) | 2013-03-21 | 2018-08-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Purification of triple helical proteins |
| EP3004156A1 (en) | 2013-06-07 | 2016-04-13 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| WO2014202089A2 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Roskilde Universitet | Variants of anti-freeze polypeptides |
| EP3033097B1 (en) | 2013-08-14 | 2021-03-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor viii-xten fusions and uses thereof |
| EP3044233A4 (en) | 2013-09-09 | 2017-07-19 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Modified bacterial collagen-like proteins |
| WO2016017693A1 (ja) * | 2014-07-30 | 2016-02-04 | 第一三共株式会社 | タンパク質の改良高分泌生産方法 |
| AU2016301303B2 (en) | 2015-08-03 | 2021-10-07 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX fusion proteins and methods of making and using same |
| WO2017044424A1 (en) | 2015-09-08 | 2017-03-16 | Theripion, Inc. | Apoa-1 fusion polypeptides and related compositions and methods |
| WO2018136163A2 (en) | 2016-12-09 | 2018-07-26 | Theripion, Inc. | Tandem apoa-1 fusion polypeptides |
| JP7012663B2 (ja) * | 2016-12-15 | 2022-02-14 | 株式会社カネカ | 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 |
| WO2019016402A1 (en) | 2017-07-20 | 2019-01-24 | Aptevo Research And Development Llc | BINDING PROTEINS BINDING AT 5T4 AND 4-1BB, COMPOSITIONS AND METHODS RELATED THERETO |
| BR112020012364A2 (pt) | 2017-12-20 | 2020-11-24 | Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd | anticorpos de ligação a ctla-4 e usos dos mesmos |
| US10150801B1 (en) | 2017-12-27 | 2018-12-11 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
| WO2019132765A1 (en) | 2017-12-27 | 2019-07-04 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
| WO2019173541A1 (en) * | 2018-03-06 | 2019-09-12 | Miraculex, Inc. | Recombinantly expressed taste modifying polypeptides and preparations and formulations comprising the same |
| AU2019270184A1 (en) | 2018-05-18 | 2020-11-26 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods of treating hemophilia A |
| US20210278406A1 (en) | 2018-07-13 | 2021-09-09 | Varct Diagnostic Aps | Isolation of circulating cells of fetal origin using recombinant malaria protein var2csa |
| CN111378585B (zh) * | 2018-12-28 | 2023-06-16 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株 |
| WO2021040610A1 (en) | 2019-08-26 | 2021-03-04 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
| US10675332B1 (en) | 2019-08-26 | 2020-06-09 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
| EP4168034A1 (en) | 2020-06-22 | 2023-04-26 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and combinations for use in the treatment of cancer |
| WO2022178090A2 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Theripion, Inc. | Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods |
| WO2024148328A2 (en) | 2023-01-06 | 2024-07-11 | Aptevo Research And Development Llc | Bispecific pd-l1 and cd40 binding molecules and uses thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| US4414329A (en) * | 1980-01-15 | 1983-11-08 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
| JPS57206699A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Plasmid patm 3 and its preparation |
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
-
1985
- 1985-10-25 US US06/791,013 patent/US4882279A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-29 CA CA000514838A patent/CA1339209C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-06 IE IE263786A patent/IE68454B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-06 NZ NZ217809A patent/NZ217809A/en unknown
- 1986-10-07 ZA ZA867650A patent/ZA867650B/xx unknown
- 1986-10-08 MX MX003971A patent/MX168390B/es unknown
- 1986-10-08 IN IN731/CAL/86A patent/IN166443B/en unknown
- 1986-10-09 PH PH34343A patent/PH25990A/en unknown
- 1986-10-10 IL IL80286A patent/IL80286A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 AU AU63882/86A patent/AU581107B2/en not_active Expired
- 1986-10-20 KR KR1019860008825A patent/KR930002738B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-10-20 JP JP61249403A patent/JP2614215B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-22 EG EG659/86A patent/EG17985A/xx active
- 1986-10-23 AT AT86114700T patent/ATE98695T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 EP EP93105818A patent/EP0560401B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 DE DE3689411T patent/DE3689411T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 YU YU180386A patent/YU46758B/sh unknown
- 1986-10-23 ES ES86114700T patent/ES2061433T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 AT AT93105818T patent/ATE197962T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 ES ES93105818T patent/ES2152233T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 DE DE3650749T patent/DE3650749T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 EP EP86114700A patent/EP0226752B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-24 DD DD29558586A patent/DD255544A5/de unknown
- 1986-10-24 PL PL1986262030A patent/PL154843B1/pl unknown
- 1986-10-24 PT PT83618A patent/PT83618B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 FI FI864319A patent/FI98931C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 NO NO864275A patent/NO176923C/no unknown
- 1986-10-24 HU HU864480A patent/HU208552B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 DK DK510786A patent/DK510786A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-10-24 CN CN198686107108A patent/CN86107108A/zh active Pending
-
1988
- 1988-04-15 AU AU14699/88A patent/AU593436B2/en not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI98931C (fi) | Menetelmä polypeptidien korkeatasoiseksi ilmentämiseksi Pichia-suvun hiivassa | |
| US5166329A (en) | DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia | |
| FI94426B (fi) | Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille | |
| US5330901A (en) | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris | |
| US4885242A (en) | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof | |
| FI94427B (fi) | Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa | |
| FI95929B (fi) | Hepatitis B pinta-antigeenin tuotanto hiivassa | |
| AU601768B2 (en) | Yeast production of human tumor necrosis factor | |
| DE68929115T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Serumalbumin in Hefe | |
| Sreekrishna et al. | Pichia pastoris | |
| US5135868A (en) | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification | |
| JP2614314B2 (ja) | メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびｐｒｅＳ▲下２▼タンパク質の発現 | |
| EP0399455B1 (en) | Stably transformed yeast host cells and their use for the production of albumin | |
| JPH0576375A (ja) | 改良された酵母ベクター | |
| EP0339568A1 (en) | Expression of Human Interleukin-2 in Methylotrophic Yeasts | |
| SK1662000A3 (en) | Expression vector for improved production of polypeptides in yeast | |
| GB2217332A (en) | Expression of salmon growth hormone in methylotrophic yeast of genus pichia | |
| IE83234B1 (en) | DNA fragment encoding an AOX | |
| Wolf et al. | Pichia pastoris | |
| JPH02303497A (ja) | サケ成長ホルモンのピキア属メチロトローフ酵母での発現 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC. |
|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC. |
|
| MA | Patent expired |