BR112020012364A2

BR112020012364A2 - anticorpos de ligação a ctla-4 e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112020012364A2
Application number: BR112020012364-1A
Authority: BR
Inventors: Xin GAN; Yun He; Yuqiang SHEN; Jiuqiao Zhao; Yiping Rong; Frank Grosveld; Dubravka Drabek; Marinus (Rien) Van Haperen; Rick Janssens
Original assignee: Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-11-24
Also published as: EP4295915A3; ES2965187T3; JP2022120064A; JP7087107B2; EP3710484B1; DK3710484T3; CN111655728A9; CA3085861C; US12240905B2; CN111655728B; JP2021508255A; CA3085861A1; IL275391B1; PL3710484T3; PH12020550933A1; DK3710484T5; KR20200101422A; NZ765588A; FI3710484T3; CN111655728A

Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isolados, compreendendo um domínio de ligação a cd152, em que os anticorpos se ligam especificamente ao cd152 humano. também são fornecidos métodos de produção e uso dos anticorpos para tratar doenças, incluindo cânceres e doenças autoimunes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS DE LIGAÇÃO A CTLA-4 E USOS DOS MESMOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção refere-se a anticorpos monoclonais anti-CTLA-4, ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, vetores de expressão e células recombinantes contendo os ácidos nucleicos e composições far- macêuticas compreendendo os anticorpos. São também fornecidos mé- todos de produção dos anticorpos, e métodos de uso dos anticorpos para tratar doenças, incluindo cânceres e doenças autoimunes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A imunoterapia contra o câncer, um avanço recente no trata- mento do câncer, emprega o próprio sistema imunológico do paciente para atacar as células tumorais. A promoção de uma resposta citotóxica robusta dependente de células T CD8 no microambiente do tumor é im- portante para a geração de uma resposta imune antitumoral eficaz. No entanto, o tumor tende a fugir da vigilância imunológica, aproveitando o mecanismo de supressão de células T. A exaustão dos linfócitos infil- trantes de tumores (TIL) resulta na anergia das células T citotóxicas e no escape das células tumorais (Wherry e Kurachi, 2015, Nat Rev Immunol., 2015, 15: 486 a 499; Dyck e Mills, 2017, Eur J. Immunol., 47 (5): 765 a 779).

[0003] Os inibidores das proteínas da via de sinalização imune têm o potencial de tratar uma variedade de tumores, tal como melanoma metastático, câncer de pulmão, câncer de mama e carcinoma de células renais. O CTLA-4 (CD152) é uma molécula de via de sinalização inibi- tória na superfície das células T. Ela foi originalmente identificada por triagem diferencial de uma biblioteca de cDNA de células T citolíticas de murino (Brunet e outros, 1987, Nature, 328: 267 a 270). É sugerido que o CTLA-4 possa funcionar como um regulador negativo da ativação das células T (Walunas e outros, 1994, Immunity, 1: 405 a 413). O CTLA-4 é expresso constitutivamente nas superfícies das células T reguladoras, mas a quantidade é relativamente baixa. Ele é induzido após a ativação das células T. Após a ativação, o CTLA-4 interage com CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2), que também são os ligandos para CD28, com uma afini- dade de ligação muito maior que o CD28 (van der Merwe e outros, 1997, J Exp Med 185: 393 a 403; Alegre e outros, 2001, Nat Rev Immunol, 1: 220 a 228). A sinalização de CD28 promove a ativação das células T, enquanto a interação de CTLA-4 com seus ligandos B7.1 e B7.2 impede a ativação adicional das células T.

[0004] Os antagonistas de CTLA-4 são atraentes, uma vez que o bloqueio de CTLA-4 com os antagonistas foi mostrado como uma tera- pia eficiente contra tumores (Patente US No. 6.984.720). A inibição desse receptor de superfície usando um antagonista, tal como um mAb anti CTLA-4, aumentou as respostas das células T CD4 e CD8 efetoras e reduziu a função supressora das células Treg. Os tratamentos basea- dos em antagonistas de CTLA-4 progrediram rapidamente nos últimos anos. O ipilimumab (VERYORO) é um anticorpo humanizado e bloqueia os efeitos de CTLA-4, que aumenta as respostas das células T às célu- las tumorais. O ipilimumab foi o primeiro medicamento a mostrar uma melhora na sobrevida geral de pacientes com melanoma metastático em um estudo randomizado e controlado de fase 3. Ele tem um perfil de segurança administrável em uma dose de 3 mg / kg como uma monote- rapia em pacientes previamente tratados com outras terapias e em uma dose de 10 mg / kg em combinação com dacarbazina em pacientes que não receberam tratamento. Além do melanoma maligno, o Ipilimumab também está em desenvolvimento para o tratamento de câncer de prós- tata e câncer de pulmão de células não pequenas.

[0005] No entanto, apesar dos progressos mencionados acima, são desejados antagonistas de CTLA-4 com afinidade, especificidade e ca- pacidade de desenvolvimento melhoradas. Além disso, são necessários terapêuticos mais eficazes envolvendo anticorpos anti-CTLA-4 que ini- bam efetivamente a atividade de sinalização de CTLA-4 e causem efei- tos colaterais adversos mínimos em seres humanos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] É descrito um anticorpo monocional isolado, compreendendo um domínio de ligação a CD152, em que o domínio de ligação a CD152 compreende uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3, em que CDR1, CDR2 e CDR3 compreendem sequências de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com (1) SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente; (2) SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respectivamente; (3) SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectiva- mente; (4) SEQ ID NOs: 22, 23 e 24, respectivamente; (5) SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; (6) SEQ ID NOs: 34, 35 e 36, respectiva- mente; (7) SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, respectivamente; (8) SEQ ID NOs: 46, 47 e 48, respectivamente; (9) SEQ ID NOs: 52, 53 e 54, respectiva- mente; (10) SEQ ID NOs: 58, 59 e 60, respectivamente; (11) SEQ ID NOs: 64, 65 e 66, respectivamente; (12) SEQ ID NOs: 70, 71 e 72, res- pectivamente; (13) SEQ ID NOs: 76, 77 e 78, respectivamente; (14) SEQ ID NOs: 82, 83 e 84, respectivamente; (15) SEQ ID NOs: 88, 89 e 90, respectivamente; (16) SEQ ID NOs: 94, 95 e 96, respectivamente; (17) SEQ ID NOs: 100, 101 e 102, respectivamente; (18) SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, respectivamente; (19) SEQ ID NOs: 112, 113 e 114, respectivamente; (20) SEQ ID NOs: 118, 119 e 120, respectivamente; (21) SEQ ID NOs: 124, 125 e 126, respectivamente; (22) SEQ ID NOs: 130, 131 e 132, respectivamente; (23) SEQ ID NOs: 136, 137 e 138, respectivamente; (24) SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respectivamente; (25) SEQ ID NOs: 148, 149 e 150, respectivamente; (26) SEQ ID NOs: 154, 155 e 156, respectivamente; (27) SEQ ID NOs: 160, 161 e 162, respectivamente; (28) SEQ ID NOs: 166, 167 e 168, respectivamente;

(29) SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente; (30) SEQ ID NOs: 178, 179 e 180, respectivamente; (31) SEQ ID NOs: 184, 185 e 186, respectivamente; ou (32) SEQ ID NOs: 190, 191 e 192, respectiva- mente.

[0007] Em alguns casos, o anticorpo é um anticorpo somente de cadeia pesada. Em alguns casos, o anticorpo não compreende uma ca- deia leve de imunoglobulina. Em alguns casos, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em alguns casos, o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de imunoglobulina. Em alguns ca- Sos, o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas de imunoglobulina. Em alguns casos, pelo menos uma das duas cadeias pesadas de imu- noglobulina compreende uma sequência de aminoácidos com pelo me- nos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 97%, 98%, 99% ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182 ou 188.

[0008] Em alguns casos, a região variável de cadeia pesada de imu- noglobulina compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 171, 177, 183 ou 189.

[0009] Em alguns casos, o anticorpo se liga especificamente a CD152 humano. Em alguns casos, o anticorpo se liga a CD152 humano com alta afinidade. Em alguns casos, o anticorpo se liga a CD152 hu- mano com uma afinidade maior do que um análogo de ipilimumab. Em alguns casos, o anticorpo se liga a CD152 humano com a afinidade que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes mais alta do que a um análogo de ipilimumapb.

[0010] Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Ka de 1,0 * 107 M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Ka de 1,0 * 108 M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Kia de 1,0 * 10º M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Ka de 1,0 * 10º M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Ka de 1,0 * 10º M ou menos. Em alguns casos, o Ka é de 6,0 * 10º M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com o Ka me- nor do que de um análogo de ipilimumab. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com o Ka que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo me- nos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes menor do que de um análogo de ipilimumab. Em alguns casos, o Ka é determi- nado por ressonância plasmônica de superfície.

[0011] Em alguns casos, o anticorpo se liga especificamente ao CD152 de macaco. Em alguns casos, o anticorpo não se liga especifi- camente ao CD152 de macaco. Em alguns casos, o anticorpo bloqueia a ligação a CD152 a CD80, CD86 ou ambos. Em alguns casos, o anti- corpo promove a secreção de IL-2 por células imunes. Em alguns casos, o anticorpo induz a ativação de células T. Em alguns casos, o anticorpo estimula uma resposta imune antitumoral pelas células imunes. Em al- guns casos, o anticorpo é um anticorpo humano, humanizado ou quimé- rico.

[0012] Em outro aspecto, é aqui descrito um anticorpo monoclonal isolado apenas de cadeia pesada, compreendendo um domínio de liga- ção a CD152, em que o anticorpo se liga especificamente a CD152 hu- mano. Em alguns casos, o anticorpo não compreende uma cadeia leve de imunoglobulina. Em alguns casos, o anticorpo compreende uma ca-

deia pesada de imunoglobulina. Em alguns casos, o anticorpo compre- ende duas cadeias pesadas de imunoglobulina. Em alguns casos, o an- ticorpo consiste em duas cadeias pesadas de imunoglobulina.

[0013] Em alguns casos, o anticorpo se liga a CD152 humano com alta afinidade. Em alguns casos, o anticorpo se liga a CD152 humano com uma afinidade maior do que o análogo de ipilimumab. Em alguns casos, o anticorpo se liga a CD152 humano com a afinidade que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes maior do que de um análogo de ipilimumab.

[0014] Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Ka de 1,0 * 107 M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Ka de 1,0 * 108 M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Kia de 1,0 * 10º M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Ka de 1,0 * 10º M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Kia de 1,0 * 10º M ou menos. Em alguns casos, o Ka é de 6,0 * 10º M ou menos. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com o Ka me- nor do que de um análogo de ipilimumab. Em alguns casos, o anticorpo se dissocia de CD152 humano com o Ka que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo me- nos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes menor do que de um análogo de ipilimumab. Em alguns casos, o Ka é determi- nado por ressonância plasmônica de superfície.

[0015] Em alguns casos, o anticorpo se liga especificamente ao CD152 de macaco. Em alguns casos, o anticorpo não se liga especifi- camente ao CD152 de macaco. Em alguns casos, o domínio de ligação a CD152 compreende uma região variável de cadeia pesada de imuno- globulina compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3, em que CDR1, CDR2 e CDR3 compreendem sequências de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identi- dade com (1) SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente; (2) SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respectivamente; (3) SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectiva- mente; (4) SEQ ID NOs: 22, 23 e 24, respectivamente; (5) SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; (6) SEQ ID NOs: 34, 35 e 36, respectiva- mente; (7) SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, respectivamente; (8) SEQ ID NOs: 46, 47 e 48, respectivamente; (9) SEQ ID NOs: 52, 53 e 54, respectiva- mente; (10) SEQ ID NOs: 58, 59 e 60, respectivamente; (11) SEQ ID NOs: 64, 65 e 66, respectivamente; (12) SEQ ID NOs: 70, 71 e 72, res- pectivamente; (13) SEQ ID NOs: 76, 77 e 78, respectivamente; (14) SEQ ID NOs: 82, 83 e 84, respectivamente; (15) SEQ ID NOs: 88, 89 e 90, respectivamente; (16) SEQ ID NOs: 94, 95 e 96, respectivamente; (17) SEQ ID NOs: 100, 101 e 102, respectivamente; (18) SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, respectivamente; (19) SEQ ID NOs: 112, 113 e 114, respectivamente; (20) SEQ ID NOs: 118, 119 e 120, respectivamente; (21) SEQ ID NOs: 124, 125 e 126, respectivamente; (22) SEQ ID NOs: 130, 131 e 132, respectivamente; (23) SEQ ID NOs: 136, 137 e 138, respectivamente; (24) SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respectivamente; (25) SEQ ID NOs: 148, 149 e 150, respectivamente; (26) SEQ ID NOs: 154, 155 e 156, respectivamente; (27) SEQ ID NOs: 160, 161 e 162, respectivamente; (28) SEQ ID NOs: 166, 167 e 168, respectivamente; (29) SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente; (30) SEQ ID NOs: 178, 179 e 180, respectivamente; (31) SEQ ID NOs: 184, 185 e 186, respectivamente; ou (32) SEQ ID NOs: 190, 191 e 192, respectiva- mente.

[0016] Em alguns casos, o domínio de ligação a CD152 compre- ende pelo menos uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que a ca- deia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de amino- ácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%,

99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182 ou 188. Em alguns casos, a re- gião variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 153, 159, 165, 171, 177, 183, ou 189.

[0017] Em alguns casos, o anticorpo bloqueia a ligação de CD152 a CD80, CD86 ou ambos. Em alguns casos, o anticorpo promove a se- creção de IL-2 por células imunes. Em alguns casos, o anticorpo induz a ativação de células T. Em alguns casos, o anticorpo estimula uma resposta imune antitumoral por células imunes. Em alguns casos, o an- ticorpo é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.

[0018] Em outro aspecto, é aqui descrita uma composição farma- cêutica compreendendo qualquer anticorpo aqui descrito, e um excipi- ente farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em alguns casos, o exci- piente farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo que consiste em carreadores, agentes de superfície ativa, agentes espes- santes ou emulsificantes, ligantes sólidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, solubilizadores, corantes, agentes flavorizantes, revesti- mentos, agentes desintegrantes, lubrificantes, adoçantes, conservan- tes, agentes isotônicos, e combinações dos mesmos. Em alguns casos, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo anticorpo, em que o segundo anticorpo é um anticorpo imunoestimulatório ou an- ticorpo coestimulatório. Em alguns casos, o anticorpo imunoestimulató- rio é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti- PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-STAT3 e um anticorpo anti-ROR1. Em al- guns casos, o anticorpo coestimulatório é um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-GITR.

[0019] Em outro aspecto, é aqui descrita uma molécula de ácido nu- cleico isolada que codifica qualquer anticorpo aqui descrito. Em alguns casos, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nu- cleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1,7, 13, 19,25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 ou 187. Em alguns casos, a mo- lécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos apre- sentada na SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67,73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 ou 187.

[0020] Em outro aspecto, é aqui descrito um vetor de expressão compreendendo um segmento de ácido nucleico que codifica qualquer anticorpo aqui descrito, em que o segmento de ácido nucleico está ope- racionalmente ligado a sequências reguladoras adequadas para expres- são do segmento de ácido nucleico em uma célula hospedeira. Em al- guns casos, o segmento de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1,7,13,19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 ou 187. Em alguns casos, o segmento de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1,7, 13,19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 ou 187.

[0021] Em outro aspecto, é aqui descrita uma célula hospedeira compreendendo qualquer vetor de expressão aqui descrito.

[0022] Em outro aspecto, é aqui descrito um método para a produ- ção de um anticorpo monoclonal que se liga a CD152, o método com- preendendo: cultivar uma célula hospedeira compreendendo qualquer vetor de expressão sob condições em que o segmento de ácido nucleico é expresso, produzindo desse modo o anticorpo monoclonal que se liga a CD152. Em alguns casos, a célula hospedeira é uma linhagem de cé- lulas hospedeiras CHO, HEK293 ou COS. Em alguns casos, a linhagem de células hospedeiras CHO é a linhagem de células CHO-K1. Em al- guns casos, o método compreende ainda recuperar o anticorpo mono- clonal que se liga a CD152.

[0023] Em outro aspecto, é descrito neste documento um método para induzir uma citotoxicidade mediada por células dependente de an- ticorpo (ADCC) contra uma célula que expressa um antígeno associado a um tumor, o método compreendendo: colocar em contato uma célula T com qualquer anticorpo aqui descrito, em que o dito contato está sob condições em que a ADCC contra a célula que expressa o antígeno associado ao tumor é induzida.

[0024] Em outro aspecto, é aqui descrito um método para o trata- mento de um distúrbio em um sujeito, o método compreendendo admi- nistrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer anticorpo aqui descrito ou qualquer composição farmacêutica aqui des- crita. Em alguns casos, o distúrbio é um câncer. Em alguns casos, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, lin- foma, LLC, pequeno linfoma linfocítico, linfoma de célula B de zona mar- ginal, linfoma de Burkett, carcinoma de células renais, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de células epiteliais escamo- sas, melanoma, mieloma, câncer de estômago, câncer cerebral, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer cervical, câncer de ovário, cân- cer de fígado, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de testículo, câncer de tireoide, e câncer de cabeça e pescoço. Em alguns casos, o método compreende ainda um agente terapêutico. Em alguns casos, o agente terapêutico é um fármaco anticâncer. Em alguns casos, o agente terapêutico é o ipilimumab, ou um produto biossimilar do mesmo. Em alguns casos, o distúrbio é uma doença autoimune.

[0025] Em outro aspecto, é aqui descrito o uso de qualquer compo- sição farmacêutica aqui descrita na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio. Em alguns casos, o distúrbio é um câncer. Em alguns casos, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, linfoma, LLC, pequeno linfoma linfocítico, linfoma de célula B de zona marginal, linfoma de Burkett, carcinoma de células renais, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de células epiteliais escamosas, melanoma, mieloma, câncer de estômago, câncer cerebral, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de prós- tata, câncer de testículo, câncer de tireoide, e câncer de cabeça e pes- coço. Em alguns casos, o distúrbio é uma doença autoimune.

[0026] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo mo- noclonal isolado, ou a uma sua porção de ligação ao antígeno, tendo uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região CDR1, uma região CDR2 e uma região CDR3, em que a região CDR1, a região CDR2 e a região CDR3 compreendem sequências de aminoá- cidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com (1) SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente; (2) SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respectivamente; (3) SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, res- pectivamente; (4) SEQ ID NOs: 22, 23 e 24, respectivamente; (5) SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; (6) SEQ ID NOs: 34, 35 e 36, respectivamente; (7) SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, respectivamente; (8) SEQ ID NOs: 46, 47 e 48, respectivamente; (9) SEQ ID NOs: 52, 53 e 54, respectivamente; (10) SEQ ID NOs: 58, 59 e 60, respectivamente; (11) SEQ ID NOs: 64, 65 e 66, respectivamente; (12) SEQ ID NOs: 70,

71 e 72, respectivamente; (13) SEQ ID NOs: 76, 77 e 78, respectiva- mente; (14) SEQ ID NOs: 82, 83 e 84, respectivamente; (15) SEQ ID NOs: 88, 89 e 90, respectivamente; (16) SEQ ID NOs: 94, 95 e 96, res- pectivamente; (17) SEQ ID NOs: 100, 101 e 102, respectivamente; (18) SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, respectivamente; (19) SEQ ID NOs: 112, 113 e 114, respectivamente; (20) SEQ ID NOs: 118, 119 e 120, respec- tivamente; (21) SEQ ID NOs: 124, 125 e 126, respectivamente; (22) SEQ ID NOs: 130, 131 e 132, respectivamente; (23) SEQ ID NOs: 136, 137 e 138, respectivamente; (24) SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respec- tivamente; (25) SEQ ID NOs: 148, 149 e 150, respectivamente; (26) SEQ ID NOs: 154, 155 e 156, respectivamente; (27) SEQ ID NOs: 160, 161 e 162, respectivamente; (28) SEQ ID NOs: 166, 167 e 168, respec- tivamente; (29) SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente; (30) SEQ ID NOs: 178, 179 e 180, respectivamente; (31) SEQ ID NOs: 184, 185 e 186, respectivamente; ou (32) SEQ ID NOs: 190, 191 e 192, res- pectivamente; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antí- geno se liga a CTLA-4.

[0027] Em outro aspecto, um anticorpo monoclonal isolado, ou uma sua porção de ligação ao antígeno, da presente invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, Identidade de 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 171, 177, 183 ou 189.

[0028] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção com- preende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146 152, 158, 164, 170, 176, 182 ou 188, que podem ser codificados pela sequência de ácidos nucleicos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID No: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 139, 145, 151, 157, 163, 169, 175, 181 ou 187.

[0029] Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção consiste substancialmente de ou consiste em duas cadeias pesadas descritas acima.

[0030] Em outro aspecto da invenção, o anticorpo ou uma sua por- ção de ligação ao antígeno é parte de um imunoconjugado que compre- ende um agente terapêutico, por exemplo, uma citotoxina ou um isótopo radioativo, ligado ao anticorpo. Em outro aspecto, o anticorpo é parte de uma molécula biespecífica que compreende uma segunda porção fun- cional (por exemplo, um segundo anticorpo) tendo uma especificidade de ligação diferente do dito anticorpo, ou sua porção de ligação ao antí- geno. Em outro aspecto, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antí- geno da presente invenção pode ser transformado em parte de um re- ceptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T mani- pulado. O anticorpo ou suas porções de ligação ao antígeno da presente invenção também pode ser codificado ou utilizado em conjunto com um vírus oncolítico.

[0031] Uma composição farmacêutica compreendendo um anti- corpo, ou sua porção de ligação a antígeno, um imunoconjugado, uma molécula biespecífica, um receptor de antígeno quimérico, um receptor de célula T manipulado, ou um vírus oncolítico da invenção, opcional- mente formulada em um carreador farmaceuticamente aceitável, tam- bém é fornecida.

[0032] A composição farmacêutica pode ainda compreender outros agentes anticâncer. A composição farmacêutica pode ainda compreen- der pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-TIM3, um anti - STAT3, e um anticorpo anti-ROR1 e / ou um anticorpo coestimulatório que pode ser um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-GITR.

[0033] Também é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno (por exemplo, regiões variáveis e / ou CDRs) da invenção, bem como um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico e uma célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão. Também é fornecido um método para preparar um anticorpo anti-CTLA-4 usando a célula hospedeira que compreende o vetor de expressão e compreende as etapas de (i) ex- pressar o anticorpo na célula hospedeira e (ii) isolar o anticorpo a partir da célula hospedeira.

[0034] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método para inibir o crescimento de células tumorais em um sujeito, compreen- dendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, da invenção. O tumor pode ser um tumor sólido ou não sólido, selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, linfoma, LLC, pequeno linfoma linfocí- tico, linfoma de célula B de zona marginal, linfoma de Burkett, carcinoma de células renais, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de células epiteliais escamosas, melanoma, mieloma, câncer de estômago, câncer cerebral, câncer de pulmão, câncer pancreático, cân- cer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, cân- cer de próstata, câncer de testículo, câncer de tireoide, e câncer de ca- beça e pescoço. De preferência, o tumor é melanoma, câncer de prós- tata ou câncer de pulmão de células não pequenas. Em ainda outra mo- dalidade, a invenção fornece um método para o tratamento de doenças autoimunes em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, da invenção. Ainda em outra modalidade, a inven- ção fornece um método para o tratamento de infecção viral em um su- jeito, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, da invenção. Em outra modalidade, o método compreende administrar uma composição farmacêutica, um biespecífico ou um imunoconjugado da invenção.

[0035] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- CTLA-4 e uma composição da invenção para uso nos métodos anterio- res, ou para a fabricação de um medicamento para uso nos métodos anteriores (por exemplo, para tratamento).

[0036] Outras características e vantagens da presente descrição serão evidentes a partir da descrição e exemplos detalhados a seguir, que não devem ser interpretados como limitantes. O conteúdo de todas as referências, entradas do Genbank, patentes e pedidos de patentes publicados citados ao longo deste pedido é aqui expressamente incor- porado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0037] O sumário anterior, bem como a seguinte descrição deta- lhada da invenção, será compreendido melhor quando interpretado em conjunto com os desenhos. Dever-se-ia entender que a invenção não está limitada às modalidades, como mostrado nos desenhos.

[0038] Nos desenhos:

[0039] A Figura 1 mostra a atividade de ligação dos anticorpos anti- CTLA-4 da presente invenção a CTLA-4 humano expresso em células

293.

[0040] A Figura 2 mostra a atividade de ligação dos anticorpos anti- CTLA-4 da presente invenção a CTLA-4 de macaco expresso em célu- las 293.

[0041] A Figura 3 mostra a capacidade dos anticorpos anti-CTLA-4 da presente invenção de bloquear a interação entre CTLA-4 e B7.1.

[0042] As Figuras 4A e 4B mostram o efeito do anticorpo anti-CTLA- 4 CL3, CL5, CL11 e CL22 (A) e CL24, CL25 e CL30 (B) na secreção de IL-2 em um ensaio de estimulação de linfócitos T dependente de SEB usando PBMC do doador 1.

[0043] As Figuras 5A e 5B mostram a capacidade de ligação do an- ticorpo anti-CTLA-4 CL5, CL11, CL22, CL24 e CL25 (A) e CL5 (B) ao CTLA-4 humano ou CTLA-4 de camundongo.

[0044] As Figuras 6A e 6B mostram o efeito do anticorpo anti-CTLA- 4 CL5, CL11 e seus mutantes (A) e CL22, CL25 e seus mutantes (B) na secreção de |L-2 em um ensaio de estimulação de linfócitos T depen- dente de SEB utilizando PBMC do doador 2.

[0045] As Figuras 7A e 7B mostram a atividade de ligação de mu- tantes de anticorpos anti-CTLA-4 ao CTLA-4 humano.

[0046] As Figuras 8A, 8B e 8C mostram a atividade de mutantes de anticorpos anti-CTLA-4 na interação de bloqueio entre CTAL-4 e B7.1 marcado com biotina (A e B) e B7.2(C).

[0047] A Figura 9 mostra o efeito de mutantes de anticorpo anti- CTLA-4 na secreção de |L-2 em um ensaio de estimulação de linfócitos T dependente de SEB usando PBMC do doador 3.

[0048] A Figura 10 mostra a atividade de ligação do anticorpo anti- CTLA-4 CL5 e seus mutantes ao CTLA-4 humano ou de macaco, con- forme medido por BiaCore.

[0049] As Figuras 11A e 11B mostram a atividade ADCC in vitro do anticorpo anti-CTLA-4 CL5 e seu mutante em células CHO K1I-CTLA-A4.

[0050] A Figura 12 mostra o perfil de tempo - concentração sérica do anticorpo anti-CTLA-4 CL5 em camundongos machos C57BL/6.

[0051] A Figura 13 mostra a relação tumor / soro da concentração de anti-CTLA4 HCAb.

[0052] As Figuras 14A, 14B e 14C mostram a atividade antitumoral de anticorpos anti-CTLA-4 em camundongos portadores de tumor MC38. (A) Curvas de crescimento de tumor em diferentes grupos. (B) Curva de sobrevida de Kaplan — Meier de tempo até o desfecho. (C) Os pesos corporais dos camundongos mantiveram-se relativamente cons- tantes juntamente com o tratamento com anticorpo anti-CTLA-4 hu- mano. Os dados foram expressos como Média + SEM, N=9.

[0053] As Figura 15A e 15B mostram a inibição do crescimento do tumor por anticorpos anti-CTLA-4 humanos em camundongos portado- res de MC38. (A) Curva de crescimento do tumor. (B) Os pesos corpo- rais dos camundongos mantiveram-se relativamente constantes junta- mente com o tratamento com anticorpo anti-CTLA-4 humano. Os dados foram expressos como Média + SEM, N=6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Visão Geral

[0054] A descrição fornece anticorpos que se ligam especificamente a CD152. Essas moléculas de ligação podem se ligar especificamente a CD152 e a outro alvo. A administração de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um anticorpo de ligação a CD152 a um paciente em necessidade de tratamento é útil para o tratamento de certos distúrbios, incluindo certos cânceres. A ligação do anticorpo a uma célula T que expressa CD152 induz uma citotoxicidade mediada por célula depen- dente de anticorpo contra uma célula que expressa um antígeno asso- ciado a um tumor. O terapêutico de ligação a CD152 da descrição ofe- rece várias vantagens no tratamento de pacientes, por exemplo, ligação eficaz a CD152, indução eficiente da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo e / ou menor risco de eventos adversos (por exemplo, toxicidade). Em certos aspectos, os anticorpos de ligação a CD152 se ligam a CD152 de maneira mais eficaz em certos formatos (por exemplo, anticorpo apenas de cadeia pesada em comparação com anticorpo de comprimento total típico), levando a uma potência mais alta e a uma utilidade melhorada no tratamento de distúrbios associados a CD152. Definições

[0055] Os títulos das seções aqui utilizados são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o as- sunto descrito. Todos os documentos ou partes de documentos aqui ci- tados, incluindo, entre outros, patentes, pedidos de patentes, artigos, livros e tratados, são expressamente incorporados por referência na ín- tegra para qualquer finalidade. Caso um ou mais documentos incorpo- rados ou partes de documentos definam um termo que contradiga a de- finição desse termo no pedido, a definição que aparece neste pedido controla. No entanto, a menção de qualquer referência, artigo, publica- ção, patente, publicação de patente e pedido de patente aqui citada não é e não deve ser tomada como um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que eles constituam arte prévia válida ou façam parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo.

[0056] Na presente descrição, qualquer faixa de concentração, faixa percentual, faixa de relação ou faixa inteira deve ser entendida como incluindo o valor de qualquer inteiro dentro da faixa citada e, quando apropriado, frações do mesmo (tal como um décimo e um centésimo de um inteiro), a menos que indicado ao contrário. Dever-se-ia entender que os termos "um" e "uma", conforme aqui utilizados, se referem a "um ou mais" dos componentes enumerados, a menos que indicado de outra forma. O uso da alternativa (por exemplo, "ou") deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternati- vas. Como usado aqui, os termos "incluir" e "compreender" são usados como sinônimos. Além disso, dever-se-ia entender que os polipeptídeos compreendendo as várias combinações dos componentes (por exem- plo, domínios ou regiões) e substituintes aqui descritos, são descritos pelo presente pedido na mesma extensão como se cada polipeptídeo fosse apresentado individualmente. Assim, a seleção de componentes particulares de polipeptídeos individuais está dentro do escopo da pre- sente descrição.

[0057] O termo "cerca de" e seus equivalentes gramaticais em rela- ção a um valor numérico de referência e seus equivalentes gramaticais, conforme usado aqui, podem incluir uma faixa de valores mais ou me- nos 10% desse valor, tal como uma faixa de valores mais ou menos 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% desse valor. Por exem- plo, a quantia "cerca de 10" inclui quantias de 9 a 11.

[0058] Como aqui utilizado, um "polipeptídeo" ou "cadeia polipeptí- dica" é um arranjo único, linear e contíguo de aminoácidos ligados co- valentemente. Ele não inclui duas cadeias polipeptídicas que se ligam de maneira não linear, tal como por meio de uma ligação dissulfeto inter- cadeia (por exemplo, uma meia molécula de imunoglobulina na qual uma cadeia leve se liga a uma cadeia pesada por meio de uma ligação dissulfeto). Os polipeptídeos podem ter ou formar uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia. No que diz respeito aos polipeptídeos, como aqui descrito, a referência a resíduos de aminoácidos correspondentes aos especificados pela SEQ ID NO inclui modificações pós-traducionais desses resíduos.

[0059] Uma "proteína" é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias polipeptídicas. Uma proteína também pode compreen- der componentes não peptídicos, tal como grupos de carboidratos. Car- boidratos e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula na qual a proteína é produzida e variará com o tipo de célula. As proteínas são aqui definidas em termos da sua es- trutura principal de aminoácidos; substituintes tais como grupos carboi- dratos geralmente não são especificados, mas podem estar presentes no entanto.

[0060] O termo "anticorpo", "imunoglobulina" ou "lg" pode ser usado de forma intercambiável aqui e significa uma molécula de imunoglobu- lina que reconhece e se liga especificamente a um alvo, tal como uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, ou combinações dos anteriores através de pelo menos um sítio de reco- nhecimento de antígeno dentro da região variável da molécula de imu- noglobulina. Como usado aqui, o termo "anticorpo" abrange anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, fragmentos de an- ticorpos (tal como fragmentos Fab, Fab', F(ab')> e Fu), mutantes de ca- deia única Fu (scFv), anticorpos multiespecíficos tal como anticorpos biespecíficos (incluindo anticorpos de ligação dupla), anticorpos quimé- ricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de determinação de antígeno de um anti- corpo, e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno, desde que os an- ticorpos exibam a atividade biológica desejada. O termo "anticorpo" tam- bém pode se referir a uma glicoproteína em forma de Y com um peso molecular de aproximadamente 150 kDa, composta por quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias leves (L) e duas cadeias pesadas (H). Exis- tem cinco tipos de isotipos de cadeia pesada de lg de mamíferos, deno- tados pelas letras gregas alfa (a), delta (5), epsilon (e), gama (y) e mu (u). O tipo de cadeia pesada define a classe de anticorpo, isto é, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. As classes y e a são ainda dividi- das em subclasses com base nas diferenças na sequência de domínio constante e na função, por exemplo, IgG1, IgG2A, IgG2B, 1gG3, 1gG4, IgA1 e IgA2. Nos mamíferos, existem dois tipos de cadeias leves de imunoglobulina, A e «.

[0061] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, re- fere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente e / ou modificações pós-tradução (por exem- plo, isomerizações, amidações) que podem estar presentes em quanti- dades menores.

Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico.

Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem dife- rentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epíto- pos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único deter- minante no antígeno.

Além de sua especificidade, os anticorpos mono- clonais são vantajosos por serem sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminados por outras imunoglobulinas.

O modificador "monoclo- nal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer mé- todo específico.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utili- zados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibri- doma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo e outros, Hybridoma, 14 (3): 253 a 260 (1995), Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2º ed. 1988); Hammerling e outros, em: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas 563 a 681 (Elsevier, NY, 1981)), métodos de DNA re- combinante (ver, por exemplo, Patente US No. 4.816.567), tecnologias de exibição de fagos (ver, por exemplo, Clackson e outros, Nature, 352: 624 a 628 (1991); Marks e outros, J.

Mol.

Biol. 222: 581 a 597 (1992); Sidhu e outros, J.

Mol.

Biol. 338 (2): 299 a 310 (2004); Lee e outros, J.

Mol.

Biol. 340 (5): 1073 a 1093 (2004); Fellouse, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 101 (34): 12467 a 12472 (2004); e Lee e outros, J.

Immunol.

Me- thods 284 (1-2): 119 a 132 (2004), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou semelhantes a humanos em animais que têm partes ou todos os loci de imunoglobulina humana ou genes codificando sequências de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, WO 1998/24893, WO 1996/34096, WO 1996/33735, WO 1991/10741, Jako- bovits e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits e outros Nature 362: 255 a 258 (1993); Bruggemann e outros, Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes US. Nos. 5.545.807, 5.545.806,

5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, e 5.661.016; Marks e outros, Bio / Technology 10: 779 a 783 (1992); Lonberg e outros, Nature 368: 856 a 859 (1994); Morrison, Nature 368: 812 a 813 (1994); Fishwild e outros, Nature Biotechnol. 14: 845 a 851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65 a 93 (1995).

[0062] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo apenas de cadeia pesada" (HCAb) refere-se a um anticorpo que consiste em apenas duas cadeias pesadas e não tem as duas cadeias leves normalmente encon- tradas em anticorpos de comprimento total.

[0063] O termo "anticorpo isolado", quando usado para descrever os vários anticorpos aqui descritos, significa um anticorpo que foi iden- tificado e separado e / ou recuperado a partir de uma célula ou cultura de células a partir da qual foi expresso. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que normalmente interferem nos usos diagnósticos ou terapêuticos do polipeptídeo, e podem incluir en- zimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algu- mas modalidades, um anticorpo é purificado com pureza superior a 95% ou 99%, conforme determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, foco isoelétrico (IEF), eletroforese capilar) ou cro- matográfica (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para uma revisão dos métodos para avaliação da pureza do anticorpo, ver, por exemplo, Flatman e outros, J. Chromatogr. B 848: 79 a 87 (2007). Em modalidades preferenciais, o anticorpo será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de ami- noácidos interna ou N-terminal através do uso de um sequenciador de tubo de centrifugação ou (2) até homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras usando corante azul de Coomas- sie ou, preferencialmente, prata. O anticorpo isolado inclui anticorpos in situ dentro de células recombinantes, porque pelo menos um compo- nente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. Normal- mente, no entanto, o polipeptídeo isolado será preparado por pelo me- nos uma etapa de purificação.

[0064] O termo um ácido nucleico "isolado" refere-se a uma molé- cula de ácido nucleico que foi separada de um componente do seu am- biente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossômica ou em uma localização cromossômica dife- rente da sua localização cromossômica natural.

[0065] Os termos "região variável de cadeia leve" (também conhe- cida como "domínio variável de cadeia leve" ou "VL" ou V.) e "região variável de cadeia pesada" (também conhecida como "domínio variável de cadeia pesada" ou "VH" ou Vn) referem-se à região de ligação variá- vel a partir de uma cadeia leve e cadeia pesada do anticorpo, respecti- vamente. As regiões de ligação variável são compostas por sub-regiões discretas e bem definidas, conhecidas como "regiões determinantes de complementaridade" (CDRs) e "regiões estruturais" (FRs), geralmente compreendendo na ordem FR1I-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 do amino terminal ao carboxil terminal. Em uma modalidade, as FRs são humanizadas. O termo "CL" refere-se a uma "região constante de ca- deia leve de imunoglobulina" ou uma "região constante de cadeia leve", isto é, uma região constante de uma cadeia leve de anticorpo. O termo

"CH" refere-se a uma "região constante de cadeia pesada de imunoglo- bulina" ou "região constante de cadeia pesada", que é ainda mais divi- sível, dependendo do isotipo do anticorpo em domínios CH1, CH2 e CH3 (IgA, 1gD, IgG) ou domínios CH1, CH2, CH3 e CH4 (IgE, IgM). Um "Fab" (fragmento de ligação ao antígeno) é a parte de um anticorpo que se liga a antígenos e inclui a região variável e o domínio CH1 da cadeia pesada ligado à cadeia leve por meio de uma ligação dissulfeto entre cadeias.

[0066] Como usado aqui, o termo "domínio de ligação" ou "região de ligação" refere-se ao domínio, região, porção ou sítio de uma prote- ína, polipeptídeo, oligopeptídeos, ou peptídeo, ou anticorpo, ou domínio de ligação derivado de um anticorpo que tem a capacidade de reconhe- cer e se ligar especificamente a uma molécula alvo, tal como um antí- geno, ligando, receptor, substrato, ou inibidor (por exemplo, CD152). Os domínios de ligação exemplificativos incluem regiões variáveis de anti- corpo de cadeia única (por exemplo, anticorpos de domínio, sFv, scFv, scFab), ectodomínios receptores, e ligandos (por exemplo, citocinas, quimiocinas). Em certas modalidades, o domínio de ligação compre- ende ou consiste em um sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, com- preendendo uma sequência variável de cadeia pesada e uma sequência variável de cadeia leve ou três regiões determinantes de complementa- ridade (CDRs) de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada de um anticorpo localizado em regiões estruturais (FRs) alternativas (por exemplo, FRs humanas opcionalmente compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos). Uma variedade de ensaios é conhecida para identificar domínios de ligação da presente descrição que se ligam especificamente a um alvo particular, incluindo Western blot, ELISA, tri- agem de biblioteca de exibição de fagos, e análise de interação BIA- COREQG. Como usado aqui, um "domínio de ligação a CD152" pode ter uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreen- dendo três CDRs de cadeia pesada: CDR1, CDR2 e CDR3.

[0067] Um anticorpo ou domínio de ligação "liga-se especifica- mente" a um alvo se ele liga-se ao alvo com uma afinidade ou Ka (isto é, uma constante de associação de equilíbrio de uma interação de liga- ção específica com unidades de 1 / M) igual ou superior a 10º M, em- bora não se ligue significativamente a outros componentes presentes em uma amostra de teste. Os anticorpos ou domínios de ligação podem ser classificados como anticorpos ou domínios de ligação de "alta afini- dade" e anticorpos ou domínios de ligação de "baixa afinidade". Anticor- pos ou domínios de ligação de "alta afinidade" referem-se a esses anti- corpos ou domínios de ligação com uma Ka de pelo menos 107 M, pelo menos 108 M, pelo menos 10º M!, pelo menos 10ºº M!, pelo menos 10º? M, pelo menos 10"? M ou pelo menos 10º? M. Anticorpos ou domínios de ligação de "baixa afinidade" referem-se a esses anticorpos ou domínios de ligação com uma Ka de até 107 M, até 106º M”, até 10º M. Alternativamente, a afinidade pode ser definida como uma cons- tante de dissociação de equilíbrio (Ka) de uma interação de ligação par- ticular com unidades de M (por exemplo, 10º M a 103 M). No caso de um anticorpo se ligar a um antígeno, Ka = 1 / Ka. As afinidades de anti- corpos ou domínios de ligação de acordo com a presente descrição po- dem ser prontamente determinadas usando técnicas convencionais, tal como ressonância plasmônica de superfície (ver, por exemplo, Scatchard e outros (1949) Ann. NY Acad. Sci. 51: 660; e Patentes US. Nos. 5.283.173, 5.468.614 ou equivalente).

[0068] Como usado aqui, "CD152" refere-se ao agrupamento de di- ferenciação 152, que também é conhecido como proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4). Os termos "CD152", "CTLA-4" e "CTLA4" são usados aqui de forma intercambiável. Da mesma forma, "anti-CD152", "anti-CTLA-4", "anti-cCTLA4" também são usados de forma intercambiável neste documento.

[0069] Como usado aqui, "CD80" refere-se ao agrupamento de di- ferenciação 80, que é uma proteína encontrada em células dendríticas, células B ativadas e monócitos que fornece um sinal coestimulatório ne- cessário para a ativação e sobrevida de células T. Os termos "CD80", "B7-1" e "B7.1" são usados aqui de forma intercambiável.

[0070] Como usado aqui, "CD86" refere-se ao agrupamento de di- ferenciação 86, que é uma proteína expressa em células apresentado- ras de antígeno que fornece sinais coestimulatórios necessários para a ativação e sobrevida de células T. Os termos "CD86", "B7-2" e "B7.2" são usados aqui de forma intercambiável.

[0071] Como aqui utilizado, uma "substituição conservativa" é reco- nhecida na técnica como uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades similares. Substituições conservati- vas exemplificativas são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, WO 97/09433, página 10, publicada em 13 de março de 1997; Lehnin- ger, Biochemistry, Segunda Edição; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), pág. 71 a 77; Lewin, Genes |V, Oxford University Press, NY e Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8). Em certas modalidades, uma substituição conservativa inclui uma substituição de leucina por serina.

[0072] Como aqui utilizado, "análogo de ipilimumab" refere-se a um anticorpo monoclonal, que se liga especificamente a CTLA-4, compre- endendo uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 200.

[0073] Como usado aqui, a menos que indicado de outra forma, qualquer nome não proprietário ou genérico de um produto biológico inclui o produto biológico e qualquer produto biossimilar do mesmo. Por exemplo, o nome não proprietário, ipilimumab, refere-se ao produto bi-

ológico vendido sob o nome comercial YERVOY,; ele inclui também qual- quer produto biossimilar do produto biológico.

[0074] Como usado aqui, a menos que indicado de outra forma, o termo "produto biossimilar" refere-se a 1) um produto biológico tendo uma sequência de aminoácidos que é idêntica a um produto de referên- cia; 2) um produto biológico tendo uma sequência de aminoácidos dife- rente (por exemplo, truncamentos no N-terminal ou C-terminal) de um produto de referência; ou 3) um produto biológico tendo uma modifica- ção pós-tradução diferente (por exemplo, glicosilação ou fosforilação) de um produto de referência, em que o produto biossimilar e o produto de referência utilizam o mesmo mecanismo ou mecanismos de ação para a prevenção, tratamento ou cura de uma doença ou condição.

[0075] Como aqui utilizado, o termo "derivado" refere-se a uma mo- dificação de um ou mais resíduos de aminoácidos de um peptídeo por meios químicos ou biológicos, com ou sem uma enzima, por exemplo, por glicosilação, alquilação, acilação, formação de éster, ou formação de amida.

[0076] Como aqui utilizado, uma sequência de polipeptídeo ou ami- noácido "derivada de" um polipeptídeo ou proteína designada refere-se à origem do polipeptídeo. Em certas modalidades, a sequência de poli- peptídeo ou aminoácido que é derivada de uma sequência particular (às vezes chamada de sequência "de partida" ou "mãe" ou "parental") tem uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica à se- quência de partida ou uma porção da mesma, em que a porção consiste em pelo menos 10 a 20 aminoácidos, pelo menos 20 a 30 aminoácidos ou pelo menos 30 a 50 aminoácidos, ou pelo menos 50 a 150 aminoá- cidos, ou que é de outra forma identificável para um versado na técnica como tendo sua origem na sequência de partida. Por exemplo, um do- mínio de ligação pode ser derivado de um anticorpo, por exemplo, um Fab, F(ab')2, Fab', scFv, anticorpo de domínio único (sdAb), etc.

[0077] Os polipeptídeos derivados de outro polipeptídeo podem ter uma ou mais mutações em relação ao polipeptídeo inicial, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos que foram substituídos por outro resíduo de aminoácido ou que têm uma ou mais inserções ou deleções de resíduos de aminoácidos. O polipeptídeo pode compreender uma se- quência de aminoácidos que não ocorre naturalmente. Tais variações têm necessariamente menos de 100% de identidade de sequência ou similaridade com o polipeptídeo inicial. Em uma modalidade, a variante terá uma sequência de aminoácidos de cerca de 60% a menos de 100% de identidade ou similaridade com a sequência de aminoácidos do poli- peptídeo de partida. Em outra modalidade, a variante terá uma sequên- cia de aminoácidos de cerca de 75% a menos de 100%, de cerca de 80% a menos de 100%, de cerca de 85% a menos de 100%, de cerca de 90% a menos de 100%, de cerca de 95% a menos de 100% de iden- tidade ou similaridade com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo inicial.

[0078] Como usado aqui, a menos que seja estabelecido de outra forma, uma posição de um resíduo de aminoácido em uma região vari- ável de uma molécula de imunoglobulina é numerada de acordo com a convenção de numeração IMGT (Brochet, X, e outros, Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508) e a posição de um resíduo de aminoácido em uma região constante de uma molécula de imunoglobulina é numerada de acordo com a nomenclatura EU (Ward e outros, 1995 Therap. Immu- nol. 2: 77 a 94). Outras convenções de numeração são conhecidas na técnica (por exemplo, a convenção de numeração de Kabat (Kabat, Se- quences of Proteins of Immunological Interest, 5º ed. Bethesda, MD: Pu- blic Health Service, National Institutes of Health (1991)).

[0079] Como usado aqui, o termo anticorpo "humano" refere-se a um anticorpo de origem humana ou um anticorpo humanizado.

[0080] Como usado aqui, o termo "humanizado" refere-se a um pro- cesso de produção de um anticorpo ou proteínas e polipeptídeos de li- gação à imunoglobulina derivados de uma espécie não humana (por exemplo, camundongo ou rato) menos imunogênica para seres huma- nos, enquanto ainda retém propriedades de ligação ao antígeno do an- ticorpo original, usando técnicas de engenharia genética. Em algumas modalidades, o(s) domínio(s) de ligação de um anticorpo ou proteínas e polipeptídeos de ligação à imunoglobulina (por exemplo, regiões variá- veis de cadeia leve e pesada, Fab, scFv) é humanizado. Os domínios de ligação não humanos podem ser humanizados usando técnicas co- nhecidas como enxerto de CDR (Jones e outros, Nature 321: 522 (1986)) e variantes das mesmas, incluindo "remodelagem" (Verhoeyen e outros, 1988 Science 239: 1534 a 1536; Riechmann, e outros, 1988 Nature 332: 323 a 337; Tempest, e outros, Bio / Technol 1991 9: 266 a 271), "hiperquimerização" (Queen, e outros, 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: 10029 a 10033; Co, e outros, 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88: 2869 a 2873; Co, e outros, 1992 J Immunol 148: 1149 a 1154) e "folhe- ado" (Mark, e outros, " Derivation of therapeutically active humanized and vennered anti-CD18 antibodies". em: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therpeutical potential. New York: Plenum Press, 1994: 291 a 312). Se derivado de uma fonte não humana, outras regiões do anticorpo ou proteínas e polipeptídeos de ligação à imunoglobulina, tal como a região de dobradiça e os domínios da região constante, também podem ser humanizadas.

[0081] Conforme usado neste documento, o termo "paciente em ne- cessidade de tratamento" ou "sujeito em necessidade de tratamento" refere-se a um paciente ou um sujeito em risco, ou que sofre de uma doença, distúrbio ou condição passível de tratamento ou melhora com um anticorpo de ligação a CD152 ou uma composição do mesmo aqui fornecida.

[0082] Como usado aqui, o termo "farmaceuticamente aceitável" re- fere-se a entidades e composições moleculares que geralmente não produzem reações alérgicas ou outras reações adversas graves quando administradas usando vias bem conhecidas na técnica. Entidades mo- leculares e composições aprovadas por uma agência reguladora do go- verno federal ou estadual ou listadas na Farmacopeia US. ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais par- ticularmente, em seres humanos são consideradas "farmaceuticamente aceitáveis".

[0083] Como usado aqui, o termo "tratamento", "tratando" ou "me- lhorando" refere-se a um tratamento terapêutico ou tratamento profilá- tico / preventivo. Um tratamento é terapêutico se pelo menos um sin- toma da doença em um indivíduo que recebe tratamento melhorar ou um tratamento pode atrasar o agravamento de uma doença progressiva em um indivíduo, ou impedir o aparecimento de outras doenças associ- adas adicionais.

[0084] Como aqui utilizado, o termo "quantidade (ou dose) terapeu- ticamente eficaz" ou "quantidade (ou dose) eficaz" de uma molécula de ligação específica ou composto refere-se a essa quantidade do com- posto suficiente para resultar na melhora de um ou mais sintomas da doença tratados de maneira estatisticamente significativa ou uma me- lhora estatisticamente significativa na função do órgão. Quando se re- fere a um ingrediente ativo individual, administrado isoladamente, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se a esse ingrediente isolada- mente. Quando se refere a uma combinação, uma dose terapeutica- mente eficaz se refere a quantidades combinadas dos ingredientes ati- vos que resultam no efeito terapêutico, administrados em série ou si- multaneamente (na mesma formulação ou simultaneamente em formu- lações separadas).

[0085] Conforme usado neste documento, os termos "citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" e "ADCC" se referem a um processo mediado por células no qual células citotóxicas não espe- cíficas que expressam FceyRs (por exemplo, células monociíticas tal como células exterminadoras naturais (NK) e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado (ou outra proteína capaz de se ligar a FoyRs) em uma célula alvo e subsequentemente causam lise da célula alvo. Em princí- pio, qualquer célula efetora com um FcyR de ativação pode ser ativada para mediar a ADCC. As células primárias para mediar a ADCC são células NK, que expressam apenas FcyRill, enquanto monócitos, de- pendendo do estado de ativação, localização ou diferenciação, podem expressar FcyRI, FeyRIIl e FeyRiIll. Para uma revisão da expressão de FcyR em células hematopoiéticas, ver, por exemplo, Ravetch e outros, 1991, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92.

[0086] Como aqui utilizado, o termo "promotor" refere-se a uma re- gião de DNA envolvida na ligação da RNA polimerase para iniciar a transcrição.

[0087] Como usado aqui, os termos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" referem-se a desoxirribonucleotí- deos ou ribonucleotídeos e seus polímeros, na forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitados, os termos abrangem áci- dos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos naturais que têm pro- priedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácido nucleico específica também abrange implicitamente variantes modifica- das conservativamente (por exemplo, substituições de códons degene- radas) e sequências complementares, bem como a sequência explicita- mente indicada. Especificamente, substituições de códons degeneradas podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resí- duos de base mista e / ou desoxinosina (Batzer e outros (1991) Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka e outros (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605 a 2608; Cassol e outros (1992); Rossolini e outros (1994) Mol. Cell. Pro- bes 8: 91 a 98). O termo ácido nucleico é usado de forma intercambiável com o gene, cDNA e mRNA codificado por um gene. Como usado aqui, os termos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico" ou "polinucle- otídeo" devem incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (por exemplo, mMRNA), análogos do DNA ou RNA gerado usando análogos de nucleotídeos, e seus derivados, fragmentos e homólogos.

[0088] O termo "expressão" refere-se à biossíntese de um produto codificado por um ácido nucleico. Por exemplo, no caso do segmento de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse, a expres- são envolve a transcrição do segmento de ácido nucleico no mRNA e a tradução do MRNA em um ou mais polipeptídeos.

[0089] Os termos "unidade de expressão" e "cassete de expressão" são usados aqui de forma intercambiável e denotam um segmento de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse e capaz de for- necer expressão do segmento de ácido nucleico em uma célula hospe- deira. Uma unidade de expressão compreende tipicamente um promo- tor de transcrição, um quadro de leitura aberto codificando o polipeptí- deo de interesse, e um terminador de transcrição, todos em configura- ção operável. Além de um promotor e terminador de transcrição, uma unidade de expressão pode incluir ainda outros segmentos de ácido nu- cleico, tais como, por exemplo, um intensificador ou um sinal de polia- denilação.

[0090] O termo "vetor de expressão", como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico, linear ou circular, compreendendo uma ou mais unidades de expressão. Além de uma ou mais unidades de expressão, um vetor de expressão também pode incluir segmentos adicionais de ácido nucleico, tal como, por exemplo, uma ou mais ori- gens de replicação ou um ou mais marcadores selecionáveis. Os veto- res de expressão são geralmente derivados de plasmídeo ou DNA viral, ou podem conter elementos de ambos.

[0091] Como aqui utilizado, o termo "identidade de sequência" re- fere-se a uma relação entre duas ou mais sequências de polinucleotí- deos ou entre duas ou mais sequências de polipeptídeos. Quando uma posição em uma sequência é ocupada pela mesma base de ácido nu- cleico ou resíduo de aminoácido na posição correspondente da sequên- cia comparadora, diz-se que as sequências são "idênticas" nessa posi- ção. A porcentagem de "identidade de sequência" é calculada determi- nando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucleico ou o resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições "idênticas". O número de posições "idên- ticas" é então dividido pelo número total de posições na janela de com- paração e multiplicado por 100 para gerar a porcentagem de "identidade de sequência". A porcentagem de "identidade de sequência" é determi- nada comparando-se duas sequências alinhadas de maneira ideal em uma janela de comparação. A janela de comparação para sequências de ácidos nucleicos pode ter, por exemplo, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 ou mais ácidos nucleicos de comprimento. A janela de comparação para sequências de polipeptí- deos pode ter, por exemplo, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 ou mais aminoácidos de comprimento. A fim de alinhar otimamente sequências para comparação, a porção de uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções denominadas espaços, enquanto a sequência de referência é mantida constante. Um alinhamento ideal é o alinhamento que, mesmo com espaços, produz o maior número possível de posições "idênticas" entre a sequência de referência e sequências comparadoras. A "identi- dade de sequência" percentual entre duas sequências pode ser deter- minada usando a versão do programa "BLAST 2 Sequences", disponí- vel no National Center for Biotechnology Information em 1 de setembro de 2004, cujo programa incorpora os programas BLASTN (para compa- ração de sequências de nucleotídeos) e BLASTP (para comparação de sequência de polipeptídeos), programas que são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (12): 5873 a 5877, 1993). Ao utilizar "BLAST 2 Sequences", os parâmetros que eram parâ- metros padrão a partir de 1 de setembro de 2004, podem ser usados para tamanho de palavra (3), penalidade de abertura de espaço (11), penalidade sobre expansão de espaço (1), terminação de espaços "dro- pofíf" (50), valor esperado (10) e qualquer outro parâmetro necessário, incluindo mas não limitado à opção de matriz. Considera-se que duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos têm "identidade de se- quência substancialmente semelhante" ou "identidade de sequência substancial" se as duas sequências tiverem pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência uma em relação à outra. Anticorpos

[0092] São aqui descritos anticorpos monoclonais humanos com- preendendo um domínio de ligação a CD152. Os anticorpos podem ser anticorpos apenas de cadeia pesada. Os anticorpos podem consistir de apenas duas cadeias pesadas. Os anticorpos podem não compreender cadeias leves. Os anticorpos podem se ligar especificamente a CD152. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais isolados que se ligam especificamente a CD152 com alta afinidade.

[0093] Os anticorpos anti-CD152 aqui descritos podem se ligar es- pecificamente a CD152 humano. Em alguns casos, os anticorpos anti- CD152 podem se ligar ao CD152 humano com alta afinidade (por exem- plo, Ka < 6,0 * 10º M). Os anticorpos anti-CD152 podem ter uma afini- dade comparável ou superior ao CTLA-4 quando comparados a um aná- logo de ipilimumab. Os anticorpos anti-CD152 também podem bloquear a ligação de CD152 aos seus ligandos B7.1. Os anticorpos anti-CD152 podem ter uma relação tumor / soro periférico melhor do que o análogo de ipilimumab. Os anticorpos anti-CD152 podem induzir uma ADCC mais alta, por exemplo, os anticorpos podem induzir um aumento de pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes ou pelo menos cerca de 20 vezes da atividade de lise por células NK.

[0094] Os anticorpos anti-CD152 podem compreender um domínio de ligação a CD152, que compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3. Os anticorpos anti-CD152 também podem compreender CDR1, CDR2 e CDR3 que diferem daquelas dos anticorpos anti-CD152 aqui descritos por uma ou mais modificações conservativas. Entende-se na técnica que certas modificações conservativas de sequência podem ser feitas e que não removem a ligação ao antígeno. Ver, por exemplo, Brummell e outros, 1993, Biochem 32: 1180-8; de Wildt e outros, 1997, Prot. Eng. 10: 835-41; Komissarov e outros, 1997, J. Biol. Chem. 272: 26864 a 26870; Hall e outros, 1992, J. Immunol. 149: 1605-12; Kelley e O'Con- nell, 1993, Biochem.32: 6862-35; Adib-Conquy e outros, 1998, Int. Immunol.10: 341-6; e Beers e outros, 2000, Clin. Pode. Res. 6: 2835-

43.

Composições Farmacêuticas e Formulações

[0095] Uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais anticorpos anti-CD152 aqui descritos, formulados em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Um excipiente é con- siderado um "excipiente farmaceuticamente aceitável" se sua adminis- tração puder ser tolerada por um paciente receptor. Excipientes que po- dem ser utilizados incluem carreadores, agentes de superfície ativa, agentes espessantes ou emulsificantes, ligantes sólidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, solubilizadores, corantes, agentes flavorizan- tes, revestimentos, agentes desintegrantes, lubrificantes, adoçantes, conservantes, agentes isotônicos, e combinações dos mesmos. A sele- ção e o uso de excipientes adequados são descritos por Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20º ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003), e por Gennaro, ed., Remington's Pharmaceu- tical Sciences (Mack Publishing Company, 19º ed. 1995). A solução sa- lina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de um excipiente far- maceuticamente aceitável. As formulações podem incluir ainda um ou mais carreadores, diluentes, conservantes, solubilizadores, agentes tamponantes, albumina para impedir a perda de proteínas nas superfí- cies dos frascos, etc.

[0096] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única pode variar dependendo do sujeito a ser tratado e do modo particular de administração e pode geralmente ser a quantidade da composição far- macêutica que produz um efeito terapêutico. Geralmente, a quantidade de ingrediente ativo pode variar de cerca de 0,01% a cerca de 99% (em peso) da composição, por exemplo, pode ser de cerca de 0,1% a 1%, cerca de 0,1% a 5%, cerca de 0,1 a 10%, cerca de 0,1% a 20%, cerca de 0,5% a 1%, cerca de 0,5% a 5%, cerca de 0,5% a 10%, cerca de 0,5% a 20%, cerca de 1% a 5%, cerca de 1% a 10%, cerca de 1% a

20%, cerca de 5% a 10%, cerca de 5% a 20%, cerca de 10% a 20%, cerca de 10% a 30%, cerca de 20% a 30%, cerca de 20% a 40%, cerca de 30% a 40%, cerca de 30% a 50%, cerca de 40% a 50%, cerca de 40% a 60%, cerca de 50% a 60%, cerca de 50% a 70%, cerca de 60% a 70%, cerca de 60% a 80%, cerca de 70% a 80%, cerca de 70% a 90%, cerca de 80% a 90%, cerca de 80% a 95% ou 95% a 99% da composi- ção farmacêutica. Preferencialmente, a quantidade de ingrediente ativo pode ser de cerca de 0,1% a cerca de 70%, e mais preferencialmente de cerca de 1% a cerca de 30% da composição farmacêutica.

[0097] A composição farmacêutica pode ser adequada para admi- nistração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o ingrediente ativo pode ser revestido em um ma- terial para protegê-lo da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativá-lo. A frase "administração parentérica", conforme aqui uti- lizada, significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracap- sular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtra- queal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subarac- noidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Alternativamente, um anti- corpo da invenção pode ser administrado por uma via não parentérica, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica. A compo- sição farmacêutica pode estar na forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis. A composição farmacêutica também pode ser formu- lada em uma microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco.

[0098] A composição farmacêutica pode ser formulada em uma forma de dosagem selecionada a partir do grupo que consiste em: uma forma de dosagem unitária oral, uma forma de dosagem unitária intra- venosa, uma forma de dosagem unitária intranasal, uma forma de do- sagem unitária de supositório, uma forma de dosagem unitária intradér- mica, uma forma de dosagem unitária intramuscular, uma forma de do- sagem unitária intraperitoneal, uma forma de dosagem unitária subcu- tânea, uma forma de dosagem unitária epidural, uma forma de dosagem unitária sublingual e uma forma de dosagem unitária intracerebral. A forma de dosagem unitária oral pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em: comprimidos, pílulas, peletes, cápsulas, pós, pasti- lhas, grânulos, soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires, for- mulações de liberação sustentada, aerossóis, e aspersões.

[0099] A composição farmacêutica pode ser uma formulação de |i- beração controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de entrega microencapsulados. Podem ser utilizados políme- ros biodegradáveis e biocompatíveis, tal como etileno vinil acetato, po- lianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilá- tico. Ver, por exemplo, Suspended and Controlled Release Drug Deli- very Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova lorque,

1978.

[0100] Os anticorpos monoclonais aqui descritos podem ser formu- lados para garantir a distribuição adequada in vivo. Por exemplo, para garantir que o anticorpo terapêutico da invenção atravesse a barreira hematoencetfálica, eles podem ser formulados em lipossomos, que po- dem adicionalmente compreender porções de direcionamento para me- lhorar o transporte seletivo para células ou órgãos específicos. Ver, por exemplo, Patentes US. Nos. 4.522.811, 5.374.548, 5.416.016, e

5.399.331; V. V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol.29: 685; Umezawa e outros, 1988, Biochem. Biophys. Res. Comum. 153: 1038; Bloeman e outros, 1995, FEBS Lett.357: 140; M. Owais e outros, 1995, Antimicrob. Agentes Chemother. 39: 180; Briscoe e outros, 1995, Am. J. Physiol.

1233: 134; Schreier e outros, 1994, J. Biol. Chem. 269: 9090; Keinanen e LaukKkanen, 1994, FEBS Lett. 346: 123; e Killion e Fidler, 1994, Im- munomethods 4: 273.

[0101] A composição farmacêutica pode opcionalmente conter um ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos adicionais, como outro anticorpo ou um fármaco. As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em uma terapia combinada com, por exemplo, outro agente anticâncer, outro agente anti-inflamatório, ou uma vacina.

[0102] As composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um Kkit compreendendo um recipiente que compreende a composição farmacêutica como aqui descrita. Uma composição farmacêutica pode ser fornecida, por exemplo, na forma de uma solução injetável para do- ses únicas ou múltiplas, ou como um pó estéril que será reconstituído antes da injeção. Alternativamente, esse kit pode incluir um dispensador de pó seco, gerador de aerossol líquido, ou nebulizador para adminis- tração de uma composição farmacêutica. Esse kit pode ainda compre- ender informações escritas sobre indicações e uso da composição far- macêutica. Métodos de Tratamento

[0103] É ainda descrito neste documento um método de tratamento de um distúrbio através de administrar a um sujeito uma quantidade te- rapeuticamente eficaz do anticorpo ou da composição farmacêutica aqui descrita. Os anticorpos anti-CD152 aqui descritos podem ser utilizados em um método para o tratamento de um sujeito (por exemplo, um ser humano ou primata não humano) ou para a fabricação de um medica- mento para o tratamento de um sujeito. Geralmente, esses métodos in- cluem administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento an- ticorpos anti-CD152, como aqui descrito.

[0104] Os anticorpos anti-CD152 aqui descritos podem ser utiliza- dos em um método para o tratamento de um sujeito (por exemplo, um ser humano ou primata não humano) ou para a fabricação de um medi- camento para o tratamento de um sujeito. Geralmente, esses métodos incluem administrar a um sujeito em necessidade de tal tratamento um anticorpo anti-CD152 como aqui descrito. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD152 compreende pelo menos uma função efetora se- lecionada a partir de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) e / ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), de modo que o anticorpo anti-CD152 induza ADCC e / ou CDC contra células que expressam CD152 no sujeito.

[0105] Também é aqui descrito um método para o tratamento de um distúrbio caracterizado pela superexpressão de um antígeno tumoral, tal como câncer. Exemplos de antígenos tumorais que podem ser reconhe- cidos por um anticorpo biespecífico anti-CD152 podem incluir PSMA, CD19, CD20, CD37, CD38, CD123, Her2, ROR1, RON, antígeno da gli- coproteína A33 (gpA33) e CEA. Geralmente, esses métodos incluem administrar a um sujeito em necessidade de tal tratamento uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD152 compreen- dendo um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumo- ral, como aqui descrito. O anticorpo anti-CD152 pode induzir citotoxici- dade de célula T redirecionada (RTCC) contra células que expressam o antígeno tumoral no sujeito.

[0106] O método pode ser usado para tratar cânceres tal como cân- cer de próstata, câncer colorretal, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer de glândula salivar, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de pulmão de células não pequenas, melanoma, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo), câncer adre- nal, linfoma de células do manto, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, linfoma não-Hodgkin, leucemia mieloide aguda (LMA),

leucemia linfoide B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmoci- toides (BPDCN), e leucemia células pilosas.

[0107] Também é aqui descrito um método para tratar um distúrbio autoimune compreendendo administrar uma quantidade terapeutica- mente eficaz das composições farmacêuticas ou anticorpo anti-CD152 aqui descrito a um paciente em necessidade de tratamento.

[0108] Os sujeitos para administração dos anticorpos anti-CD152, conforme descritos neste documento, incluem pacientes com alto risco de desenvolver um distúrbio específico, bem como pacientes que apre- sentam um distúrbio existente. Tipicamente, o sujeito foi diagnosticado como tendo o distúrbio para o qual o tratamento é procurado. Além disso, os indivíduos podem ser monitorados durante o curso do trata- mento para qualquer alteração no distúrbio (por exemplo, para um au- mento ou diminuição dos sintomas clínicos do distúrbio). Além disso, em algumas variações, o sujeito não sofre de outro distúrbio que exige tra- tamento que envolva o direcionamento de células que expressam CD152.

[0109] Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas podem ser administradas a um paciente susceptível a, ou de outra forma em risco de, um distúrbio específico em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco ou atrasar o aparecimento do distúrbio. Em aplicações terapêuticas, as composições podem ser administradas a um paciente suspeito ou que já sofra desse distúrbio em uma quanti- dade suficiente para curar, ou pelo menos interromper parcialmente os sintomas do distúrbio e suas complicações. Uma quantidade adequada para conseguir isso é chamada de dose ou quantidade terapeutica- mente eficaz. Nos regimes profilático e terapêutico, os agentes podem ser administrados em várias dosagens até que uma resposta suficiente seja alcançada. Tipicamente, a resposta é monitorada e dosagens re- petidas são dadas se a resposta desejada começar a desaparecer.

[0110] Para identificar pacientes em questão para tratamento de acordo com os métodos da descrição, métodos de triagem aceitos po- dem ser empregados para determinar fatores de risco associados a dis- túrbios específicos ou para determinar o estado de um distúrbio exis- tente identificado em um sujeito.

Tais métodos podem incluir, por exem- plo, determinar se um indivíduo tem parentes que foram diagnosticados com um distúrbio específico.

Os métodos de triagem também podem incluir, por exemplo, exames convencionais para determinar o estado familiar para um distúrbio particular conhecido por ter um componente hereditário.

Por exemplo, vários cânceres também são conhecidos por terem certos componentes hereditários.

Os componentes hereditários dos cânceres incluem, por exemplo, mutações em múltiplos genes que estão se transformando (por exemplo, Ras, Raf, EGFR, cMet e outros), a presença ou ausência de certas moléculas de HLA e moléculas de receptor inibidor de células exterminadoras (KIR), ou mecanismos pelos quais as células cancerosas são capazes de modular a supressão imune de células tal como células NK e células T, direta ou indireta- mente (ver, por exemplo, Ljunggren e Malmberg, Nature Rev.

Immunol. 7: 329 a 339, 2007; Boyton e Altmann, Clin Exp.

Immunol. 149: 1 a 8, 2007). Para esse fim, sondas de nucleotídeos podem ser rotineiramente empregadas para identificar indivíduos portadores de marcadores ge- néticos associados a um distúrbio de interesse particular.

Além disso, uma ampla variedade de métodos imunológicos é conhecida na técnica que são úteis para identificar marcadores para distúrbios específicos.

Por exemplo, vários métodos de imunoensaio ELISA que estão dispo- níveis e são bem conhecidos na técnica empregam sondas de anticor- pos monoclonais para detectar antígenos associados a tumores espe- cíficos.

A triagem pode ser implementada conforme indicado pela sinto- matologia conhecida do paciente, fatores de idade, fatores de risco re-

lacionados, etc. Esses métodos permitem que o médico selecione roti- neiramente pacientes que precisam dos métodos aqui descritos para tratamento. De acordo com esses métodos, o direcionamento de células patológicas que expressam antígenos tumorais pode ser implementado como um programa de tratamento independente ou como um acompa- nhamento, complemento ou regime de tratamento coordenado com ou- tros tratamentos.

[0111] A determinação de dosagens eficazes neste contexto é tipi- camente baseada em estudos com modelos animais seguidos por en- saios clínicos em humanos e é guiada pela determinação de dosagens eficazes e protocolos de administração que reduzem significativamente a ocorrência ou gravidade do distúrbio em questão nos sujeitos modelo. As doses eficazes das composições da presente descrição variam de- pendendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administra- ção, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados, se o tratamento é pro- filático ou terapêutico, bem como a atividade específica da própria com- posição e sua capacidade de obter a resposta desejada no indivíduo. Geralmente, o paciente é humano, mas em algumas doenças, pode ser um mamífero não humano. Tipicamente, os regimes de dosagem são ajustados para fornecer uma resposta terapêutica ideal, isto é, para oti- mizar a segurança e a eficácia. Consequentemente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos co- laterais indesejados são superados pelos efeitos benéficos da adminis- tração de um anticorpo anti-CD152, como aqui descrito. Para adminis- tração de um anticorpo anti-CD152, uma dosagem pode variar de cerca de 0,1 ug a 100 mg / kg ou 1 ug / kg a cerca de 50 mg / kg e, geralmente, ug a 5 mg / kg do peso corporal do sujeito. Em modalidades mais específicas, uma quantidade eficaz do agente está entre cerca de 1 ug / kg e cerca de 20 mg / kg, entre cerca de 10 ug / kg e cerca de 10 mg /

kg, ou entre cerca de 0,1 mg / kg e cerca de 5 mg / kg. As dosagens dentro dessa faixa podem ser alcançadas por administrações únicas ou múltiplas, incluindo, por exemplo, múltiplas administrações por dia ou diariamente, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente. Por exemplo, em certas variações, um regime consiste em uma administra- ção inicial seguida por múltiplas administrações subsequentes em inter- valos semanais ou quinzenais. Outro regime consiste em uma adminis- tração inicial seguida por múltiplas administrações subsequentes em in- tervalos mensais ou bimensais. Alternativamente, as administrações po- dem ser irregulares, conforme indicado pelo monitoramento dos sinto- mas clínicos do distúrbio.

[0112] A dosagem da composição farmacêutica pode ser variada pelo médico para manter uma concentração desejada no sítio alvo. Por exemplo, se um modo de administração intravenosa for selecionado, a concentração local do agente na corrente sanguínea no tecido alvo pode estar entre cerca de 0,01 e 50 nanomoles da composição por litro, às vezes entre 1,0 nanomoles por litro e 10, 15, ou 25 nanomoles por litro, dependendo do estado do sujeito e da resposta medida projetada. Con- centrações maiores ou menores podem ser selecionadas com base no modo de entrega, por exemplo, entrega transepidérmica versus entrega a uma superfície da mucosa. A dosagem também deve ser ajustada com base na taxa de liberação da formulação administrada, por exem- plo, aspersão nasal versus pó, partículas orais ou injetadas de liberação sustentada, formulações transdérmicas, etc. Para atingir o mesmo nível de concentração sérica, por exemplo, partículas de liberação lenta com uma taxa de liberação de 5 nanomoles (sob condições padrão) seria administrada com cerca do dobro da dosagem de partículas com uma taxa de liberação de 10 nanomoles.

[0113] O terapêutico anti-CD152 (por exemplo, anticorpo anti-CD152) também pode ser administrado em uma dosagem diária de cerca de 0,001 a cerca de 10 miligramas (mg) por quilograma (mpk) de peso corporal, de preferência dada como uma dose diária única ou em doses divididas cerca de duas a seis vezes por dia. Para administração a um paciente adulto humano, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser admi- nistrada em doses na faixa de 0,2 mg a 800 mg por dose, incluindo, sem limitação, 0,2 mg por dose, 0,5 mg por dose, 1 mg por dose, 5 mg por dose, 10 mg por dose, 25 mg por dose, 100 mg por dose, 200 mg por dose e 400 mg por dose, e múltiplas doses diárias geralmente consecu- tivas podem ser administradas durante um tratamento. O terapêutico anti-CD152 pode ser administrado em diferentes momentos do dia. Em uma modalidade, a dose terapêutica ideal pode ser administrada à noite. Em outra modalidade, a dose ideal do terapêutico pode ser administrada pela manhã. A dosagem diária total do terapêutico anti-CD152 pode, portanto, em uma modalidade, variar de cerca de 1 mg a cerca de 29, e geralmente varia de cerca de 100 mg a cerca de 1,5 g, e na maioria das vezes varia de cerca de 200 mg a cerca de 1200 mg. No caso de um humano adulto típico de 70 Kg, a dose diária total de terapêutico anti- CD152 pode variar de cerca de 2 mg a cerca de 1200 mg e, muitas vezes, como observado acima, varia de cerca de 0,2 mg a cerca de 800 mg.

[0114] Os regimes de dosagem também podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêu- tica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facili- tar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associa- ção com o carreador farmacêutico necessário. Alternativamente, o anti- corpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sus- tentada, caso em que é necessária uma administração menos fre- quente.

[0115] Para administração do anticorpo, a dosagem pode variar de cerca de 0,0001 a 100 mg / kg, e mais geralmente 0,01 a 5 mg / kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg / kg de peso corporal, 1 mg / kg de peso corporal, 3 mg / kg de peso corporal, 5 mg / kg de peso corporal ou 10 mg / kg de peso corporal ou na faixa de 1 a 10 mg / kg. Um regime de tratamento exemplificativo envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro sema- nas, uma vez por mês, uma vez a cada três meses, ou uma vez a cada três a 6 meses. Os regimes de dosagem preferenciais para um anticorpo anti-CD152 da invenção incluem 1 mg / kg de peso corporal ou 3 mg / kg de peso corporal por administração intravenosa, com o anticorpo sendo administrado usando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, depois a cada três me- ses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg / kg de peso corporal, uma vez seguido de 1 mg / kg de peso corporal a cada três semanas. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anti- corpo no plasma de cerca de 1 a 1000 ug / ml e em alguns métodos cerca de 25 a 300 ug / ml.

[0116] Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-CD152 da invenção resulta preferencialmente em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, em um aumento na frequência e na duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou na prevenção de comprometimento ou incapacidade devido a à aflição da doença. Por exemplo, para o tratamento de indivíduos portadores de tumor, uma "do- sagem terapeuticamente eficaz" inibe preferencialmente o crescimento do tumor em pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente em pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 60% e ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 80% em relação aos indivíduos não tratados. Uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um anticorpo terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou, de outro modo, melhorar os sintomas em um indivíduo, que é tipicamente humano ou pode ser outro mamífero.

[0117] No que diz respeito particularmente ao tratamento de tumo- res sólidos, os protocolos para avaliar os desfechos e a atividade anti- tumoral são bem conhecidos na técnica. Embora cada protocolo possa definir avaliações de resposta tumoral de maneira diferente, atualmente os critérios RECIST (Critérios de avaliação de resposta em tumores só- lidos) são considerados as diretrizes recomendadas para avaliação da resposta tumoral pelo Instituto Nacional do Câncer (ver Therasse e ou- tros, J. Natl. Cancer Inst. 92: 205 a 216, 2000). De acordo com os crité- rios RECIST, a resposta tumoral significa uma redução ou eliminação de todas as lesões ou metástases mensuráveis. Geralmente, a doença é considerada mensurável se compreender lesões que podem ser me- didas com precisão em pelo menos uma dimensão tal como > 20 mm com técnicas convencionais ou > 10 mm TC espiral com margens cla- ramente definidas por fotografia médica ou raios-X, tomografia axial computadorizada (TC) , ressonância magnética (RM) ou exame clínico (se as lesões forem superficiais). A doença não mensurável significa que a doença compreende lesões < 20 mm com técnicas convencionais ou < 10 mm com TC espiral, e lesões verdadeiramente não mensuráveis (pequenas demais para serem medidas com precisão). A doença não mensurável inclui efusões pleurais, ascites e doenças documentadas por evidências indiretas.

[0118] Os critérios para o estado objetivo são necessários para pro- tocolos para avaliar a resposta do tumor sólido. Os critérios representa- tivos incluem o seguinte: (1) Resposta Completa (RC), definida como desaparecimento completo de toda a doença mensurável; sem novas lesões; sem sintomas relacionados à doença; nenhuma evidência de doença não mensurável; (2) Resposta Parcial (RP) definida como redu- ção de 30% na soma do maior diâmetro das lesões alvo (3) Doença Progressiva (DP), definida como aumento de 20% na soma do maior diâmetro das lesões alvo ou aparecimento de qualquer nova lesão; (4) Resposta estável ou sem resposta, definida como não qualificada para RC, RP ou doença progressiva (ver Therasse e outros, acima).

[0119] Desfechos adicionais aceitos na técnica oncológica incluem sobrevida geral (OS), sobrevida livre de doença (DFS), taxa de resposta objetiva (ORR), tempo para progressão (TTP), e sobrevida livre de pro- gressão (PFS) (ver Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics, abril de 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD).

[0120] Os anticorpos anti-CD152 podem ser usados para suprimir as vias de sinalização mediadas por CTLA-4 que regulam negativa- mente as respostas imunes e, portanto, melhoram as respostas imunes tumor-específicas, ou como monoterapia ou em combinação com anti- corpos monoclonais anti-PD-L1 ou outros fármacos anticâncer. Métodos de Preparação de Anticorpos

[0121] Os anticorpos aqui descritos podem ser um anticorpo apenas de cadeia pesada humano (HCAb) gerado a partir de camundongos hu- manizados Harbor (Patentes US. Nos. 9.353.179, 9.346.877 e 8.921.522 e Patentes Europeias 1776383 e 1864998). As moléculas produzidas pe- los camundongos HCAb podem ser solúveis e podem ter afinidades, diversidade e / ou propriedades físico-químicas comparáveis aos anti- corpos IgG humanos tradicionais.

[0122] A preparação de HCAbs a partir de camundongos HCAb pode facilitar a geração de domínios VH humanos solúveis, a unidade mínima de reconhecimento de imunoglobulina e, portanto, a construção de novas moléculas multifuncionais compreendendo vários domínios VH ou domínios VH acoplados a outras moléculas, tal como biespeciífi- cas, conjugados anticorpo — fármaco ou moléculas terapêuticas ou de diagnóstico derivadas de domínio VH.

[0123] Os anticorpos anti-CD152 também podem ser preparados usando um anticorpo com uma ou mais das sequências V, do anticorpo anti-CD152 aqui descritas como material de partida para manipular um anticorpo modificado. Um anticorpo pode ser manipulado modificando- se um ou mais resíduos dentro das regiões variáveis (isto é, Vx e / ou V.), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e / ou dentro de uma ou mais regiões estruturais. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser manipulado modificando-se os resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.

[0124] Moléculas de polinucleotídeos compreendendo uma sequên- cia de polinucleotídeos desejada podem ser propagadas colocando-se a molécula em um vetor. Podem ser utilizados vetores virais e não virais, incluindo plasmídeos. A escolha do plasmídeo dependerá do tipo de cé- lula em que a propagação é desejada e do objetivo da propagação. Cer- tos vetores são úteis para amplificar e produzir grandes quantidades da sequência de DNA desejada. Outros vetores são adequados para ex- pressão em células em cultura. Ainda outros vetores são adequados para transferência e expressão em células de um animal ou pessoa in- teira. A escolha do vetor apropriado está dentro da habilidade da téc- nica. Muitos desses vetores estão disponíveis comercialmente. O poli- nucleotídeo de comprimento parcial ou total é inserido em um vetor tipi- camente por meio da ligação de DNA ligase a um sítio da enzima de restrição clivado no vetor. Alternativamente, a sequência de nucleotí- deos desejada pode ser inserida por recombinação homóloga in vivo. Tipicamente, isto é conseguido ligando-se as regiões de homologia ao vetor nos flancos da sequência de nucleotídeos desejada. As regiões de homologia são adicionadas por ligação de oligonucleotídeos, ou por reação em cadeia da polimerase usando iniciadores compreendendo tanto a região de homologia quanto uma porção da sequência de nucle- otídeos desejada, por exemplo.

[0125] Para expressão, um cassete ou sistema de expressão pode ser empregado. Para expressar um ácido nucleico codificando um poli- peptídeo descrito neste documento, uma molécula de ácido nucleico co- dificando o polipeptídeo, operacionalmente ligada a sequências regula- doras que controlam a expressão transcricional em um vetor de expres- são, é introduzida em uma célula hospedeira. Além das sequências re- guladoras de transcrição, tal como promotores e intensificadores, os ve- tores de expressão podem incluir sequências reguladoras da tradução e um gene marcador que é adequado para a seleção de células que carregam o vetor de expressão. O produto gênico codificado por um po- linucleotídeo da descrição é expresso em qualquer sistema de expres- são conveniente, incluindo, por exemplo, sistemas bacterianos, levedu- ras, insetos, anfíbios e mamíferos. No vetor de expressão, o polinucle- otídeo codificando o polipeptídeo é ligado a uma sequência reguladora conforme apropriado para obter as propriedades de expressão deseja- das. Isso pode incluir promotores, intensificadores, terminadores, ope- radores, repressores e indutores. Os promotores podem ser regulados (por exemplo, o promotor do vetor plIND induzível a esteroides (Invitro- gen)) ou constitutivos (por exemplo, promotores das sequências CMV, SVA40, Fator de Alongamento ou LTR). Estes estão ligados à sequência de nucleotídeos desejada utilizando as técnicas descritas acima para ligação a vetores. Quaisquer técnicas conhecidas podem ser usadas.

Consequentemente, o vetor de expressão geralmente fornecerá uma região de iniciação de transcrição e tradução, que pode ser induzível ou constitutiva, em que a região codificante está operacionalmente ligada sob o controle transcricional da região de iniciação de transcrição e uma região de terminação de transcrição e tradução.

[0126] Um cassete de expressão pode ser introduzido em uma va- riedade de vetores, por exemplo, plasmídeo, BAC, YAC, bacteriófago, tal como lambda, P1, M13, etc., vetores virais de plantas ou animais (por exemplo, vetores baseados em retrovírus, vetores adenovirais) e simi- lares, onde os vetores são normalmente caracterizados pela capaci- dade de fornecer seleção de células compreendendo os vetores de ex- pressão. Os vetores podem fornecer manutenção extracromossômica, particularmente como plasmídeos ou vírus, ou para integração no cro- mossomo hospedeiro. Quando a manutenção extracromossômica é de- sejada, é fornecida uma sequência de origem para a replicação do plas- mídeo, que pode ser um baixo ou alto número de cópias. Uma grande variedade de marcadores está disponível para seleção, particularmente aqueles que protegem contra toxinas, mais particularmente contra anti- bióticos. O marcador específico escolhido é selecionado de acordo com a natureza do hospedeiro, onde, em alguns casos, a complementação pode ser empregada com hospedeiros auxotróficos. A introdução do construto de DNA pode usar qualquer método conveniente, incluindo, por exemplo, conjugação, transformação bacteriana, DNA precipitado com cálcio, eletroporação, fusão, transfecção, infecção com vetores vi- rais, biolística e similares. A descrição se refere a um vetor de expressão compreendendo um segmento de ácido nucleico, em que o dito seg- mento de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleo- tídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 ou 187.

[0127] Consequentemente, as proteínas para uso dentro da pre- sente descrição podem ser produzidas em células hospedeiras geneti- camente modificadas de acordo com técnicas convencionais. As células hospedeiras adequadas são aqueles tipos de células que podem ser transformados ou transfectados com DNA exógeno e cultivados em cul- tura, e incluem bactérias, células fúngicas e células eucarióticas superi- ores cultivadas (incluindo células cultivadas de organismos multicelula- res), particularmente células de mamíferos cultivadas. Técnicas para manipular moléculas de DNA clonadas e introduzir DNA exógeno em uma variedade de células hospedeiras são descritas por Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001) e Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology (4º ed., John Wiley & Sons, 1999).

[0128] Para direcionar uma proteína recombinante para a via secre- tora de uma célula hospedeira, uma sequência de sinal secretora (tam- bém conhecida como sequência líder) é fornecida no vetor de expres- são. A sequência de sinal secretora pode ser a da forma nativa da pro- teína recombinante, ou pode ser derivada de outra proteína secretada ou sintetizada de novo. A sequência de sinal secretora está operacio- nalmente ligada à sequência de DNA que codifica o polipeptídeo, isto é, as duas sequências são unidas no quadro de leitura correto e posicio- nadas para direcionar o polipeptídeo recém-sintetizado para a via se- cretora da célula hospedeira. As sequências de sinal secretoras são co- mumente posicionadas 5' à sequência de DNA que codifica o polipeptí- deo de interesse, embora certas sequências de sinal possam ser posi- cionadas em outro lugar na sequência de DNA de interesse (ver, por exemplo, Welch e outros, Patente US No. 5.037.743; Holland e outros, Patente US No. 5.143.830).

[0129] As células de mamíferos cultivadas são hospedeiros ade- quados para a produção de proteínas recombinantes para uso dentro da presente descrição. Os métodos para introduzir DNA exógeno nas células hospedeiras de mamíferos incluem transfecção mediada por fosfato de cálcio (Wigler e outros, Cell 14: 725, 1978; Corsaro e Pear- son, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham e Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), eletroporação (Neumann e outros, EMBO J. 1: 841 a 845, 1982), transfecção mediada por DEAE-dextrano (Ausubel e outros, acima) e transfecção mediada por lipossomas (Hawley-Nelson e outros, Foco 15:73, 1993; Ciccarone e outros, Foco 15:80, 1993). A produção de polipeptídeos recombinantes em células de mamíferos cultivadas é descrita por, por exemplo, Levinson e outros, Patente US. No.

4.713.339; Hagen e outros, Patente US. No. 4.784.950; Palmiter e ou- tros, Patente US. No. 4.579.821; e Ringold, Patente US. No. 4.656.134. Exemplos de células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem cé- lulas renais de macaco verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células renais embrionárias humanas (293-HEK; ATCC CRL 1573), células re- nais de hamster bebê (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células renais caninas (MDCK; ATCC CCL 34), células de ová- rio de hamster chinês (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44; CHO DXB11 (Hyclone, Logan, UT); ver também, por exemplo, Chasin e ou- tros, Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555, 1986)), células da glândula pitui- tária de rato (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rato (H-4-1|-E; ATCC CRL 1548), células renais de macaco transformadas com SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) e célu- las embrionárias de murino (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). As linhagens de células adequadas adicionais são conhecidas na técnica e estão dis- poníveis em depósitos públicos, tal como a American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Podem ser utilizados fortes promotores de transcrição, tal como promotores de SV-40 ou citomegalovírus. Ver,

por exemplo, Patente U.S. No. 4.956.288. Outros promotores adequa- dos incluem os dos genes de metalotioneína (Patentes US. Nos.

4.579.821 e 4.601.978) e o promotor tardio principal de adenovírus.

[0130] A seleção de fármacos é geralmente usada para selecionar células de mamíferos cultivadas nas quais DNA estranho foi inserido. Essas células são comumente chamadas de "transfectantes". As célu- las que foram cultivadas na presença do agente seletivo e são capazes de transmitir o gene de interesse para sua progênie são chamadas de "transfectantes estáveis". Marcadores selecionáveis exemplificativos in- cluem um gene que codifica resistência ao antibiótico neomicina, o que permite que a seleção seja realizada na presença de um fármaco do tipo neomicina, tal como G-418 ou similar; o gene gpt da xantina-gua- nina fosforibosil transferase, que permite o crescimento de células hos- pedeiras na presença de ácido micofenólico / xantina; e marcadores que fornecem resistência à zeocina, bleomicina, blastocidina e higromicina (ver, por exemplo, Gatignol e outros, Mol. Gen. Genet. 207: 342, 1987; Drocourt e outros, Nucl. Acids Res. 18: 4009, 1990). Os sistemas de seleção também podem ser usados para aumentar o nível de expressão do gene de interesse, um processo conhecido como "amplificação". À amplificação é realizada cultivando-se transfectantes na presença de um baixo nível do agente seletivo e aumentando-se então a quantidade de agente seletivo a ser selecionado para células que produzem altos níveis dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador selecionável amplificável exemplificativo é a di-hidrofolato redutase, que confere re- sistência ao metotrexato. Outros genes de resistência a fármacos (por exemplo, resistência à higromicina, resistência a múltiplos fármacos, pu- romicina acetiltransferase) também podem ser utilizados.

[0131] Outras células eucarióticas superiores também podem ser usadas como hospedeiros, incluindo células de insetos, células de plantas e células de aves. A utilização de Agrobacterium rhizogenes como um ve- tor para expressar genes em células de plantas foi revisado por Sinkar e outros, J. Biosci. (Bangalore) 11: 47 a 58, 1987. A transformação de célu- las de insetos e a produção de polipeptídeos estranhos nas mesmas são descritas por Guarino e outros, US. 5.162.222 e WO 94/06463.

[0132] As células de insetos podem ser infectadas com baculovírus recombinante, comumente derivado do vírus da poliedrose nuclear Au- tographa californica (ACNPV). Ver King e Possee, The Baculovirus Ex- pression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, Londres); O'Reilly e outros, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., Nova lorque 1994); e Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995). O baculovírus recombinante também pode ser produzido através do uso de um sistema baseado em transposons descrito por Luckow e outros (J. Virol. 67: 4566 a 4579, 1993). Este sis- tema, que utiliza vetores de transferência, está disponível comercial- mente em forma de kit (kit BAC-TO-BAC; Life Technologies, Gaithers- burg, MD). O vetor de transferência (por exemplo, PEASTBAC1; Life Technologies) contém um transposon Tn7 para mover o DNA codifi- cando a proteína de interesse para um genoma de baculovírus mantido em E. coli como um grande plasmídeo chamado "bacmídeo". Ver Hill- Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 a 976, 1990; Bonning e outros, J. Gen. Virol. 75: 1551 a 1556, 1994; e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 a 1549, 1995. Além disso, os vetores de transferência podem incluir uma fusão em quadro com DNA codificando uma exten- são de polipeptídeo ou uma etiqueta de afinidade, como descrito acima. Utilizando técnicas conhecidas, um vetor de transferência contendo uma sequência de DNA codificando a proteína é transformado em célu- las hospedeiras de E. coli, e as células são triadas quanto a bacmídeos que contêm um gene lacZ interrompido indicativo de baculovírus recom- binante. O DNA do bacmídeo contendo o genoma do baculovírus re- combinante é isolado, usando técnicas comuns, e usado para transfec- tar células de Spodoptera frugiperda, tal como as células Sf9. O vírus recombinante que expressa a proteína ou o interesse é subsequente- mente produzido. Os estoques de vírus recombinantes são feitos por métodos comumente usados na técnica.

[0133] Para a produção de proteínas, o vírus recombinante é usado para infectar células hospedeiras, tipicamente uma linhagem celular de- rivada de lagarta militar, Spodoptera frugiperda (por exemplo, células Sf9 ou Sf21) ou Trichoplusia ni (por exemplo, células HIGH FIVE; Invitrogen, Carilsbad, CA). Ver geralmente Glick e Pasternak, Molecular Biotechnol- ogy, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Wash- ington, D.C., 1994). Ver também Patente US. No. 5.300.435. Meios sem soro são usados para cultivar e manter as células. Formulações de meios adequados são conhecidas na técnica e podem ser obtidas a partir de for- necedores comerciais. As células são cultivadas a partir de uma densidade de inoculação de aproximadamente 2 a 5 x 10º células para uma densi- dade de 1 a 2x 10º células, momento em que um estoque de vírus recom- binante é adicionado a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 a 10, mais tipicamente próxima de 3. Os procedimentos utilizados são geral- mente descritos nos manuais de laboratório disponíveis (ver, por exemplo, King e Possee, acima; O'Reilly e outros, acima; Richardson, acima).

[0134] Células fúngicas, incluindo células de levedura, também po- dem ser usadas dentro da presente descrição. As espécies de leveduras nesse aspecto incluem, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Os métodos para transformar células de S. cerevisiae com DNA exógeno e produzir polipeptídeos recombinan- tes a partir dele são descritos, por exemplo, por Kawasaki, Patente US. No. 4.599.311; Kawasaki e outros, Patente US. No. 4.931.373; Brake,

Patente US. No. 4.870.008; Welch e outros, Patente US. No. 5.037.743; e Murray e outros, Patente US. No. 4.845.075. As células transformadas são selecionadas por fenótipo determinado pelo marcador selecionável, geralmente resistência a fármacos ou a capacidade de crescer na au- sência de um nutriente específico (por exemplo, leucina). Um sistema vetorial exemplificativo para uso em Saccharomyces cerevisiae é o sis- tema vetorial POT1 descrito por Kawasaki e outros (Patente US. No.

4.931.373), que permite que as células transformadas sejam seleciona- das por crescimento em meio contendo glicose. Promotores e termina- dores adequados para uso em leveduras incluem aqueles a partir de genes de enzimas glicolíticas (ver, por exemplo, Kawasaki, Patente US. No. 4.599.311; Kingsman e outros, Patente US. No. 4.615.974; e Bitter, Patente US. No. 4.977.092) e genes de álcool desidrogenase. Ver tam- bém as Patentes US. Nos. 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936, e

4.661.454. Sistemas de transformação para outras leveduras, incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gleeson e outros, J. Gen. Microbiol. 132: 3459 a 3465, 1986; Cregg, Patente US. No. 4.882.279; e Raymond e outros, Yeast 14: 11 a 23, 1998. As células de Aspergillus podem ser utilizadas de acordo com os métodos de McKnight e outros, Patente US. No. 4.935.349. Os métodos para transformar Acremonium chrysogenum são descritos por Sumino e outros, Patente US. No. 5.162.228. Os mé- todos para transformar Neurospora são descritos por Lambowitz, Pa- tente US. No. 4.486.533. A produção de proteínas recombinantes em Pichia methanolica é descrita nas Patentes US. Nos. 5.716.808,

5.736.383, 5.854.039, e 5.888.768.

[0135] Células hospedeiras procarióticas, incluindo cepas das bac- térias Escherichia coli, Bacillus e outros gêneros, também são células hospedeiras úteis dentro da presente descrição. As técnicas para trans- formar estes hospedeiros e expressar sequências de DNA estranhas nele clonadas são bem conhecidas (ver, por exemplo, Sambrook e Rus- sell, acima). Ao expressar uma proteína recombinante em bactérias tal como E. coli, a proteína pode ser retida no citoplasma, tipicamente como grânulos insolúveis, ou pode ser direcionada para o espaço periplás- mico por uma sequência de secreção bacteriana. No primeiro caso, as células são lisadas, e os grânulos são recuperados e desnaturados usando, por exemplo, isotiocianato de guanidina ou ureia. A proteína desnaturada pode então ser redobrada e dimerizada diluindo o desna- turante, tal como por diálise contra uma solução de ureia e uma combi- nação de glutationa reduzida e oxidada, seguida por diálise contra uma solução salina tamponada. Alternativamente, a proteína pode ser recu- perada a partir do citoplasma na forma solúvel e isolada sem o uso de desnaturantes. A proteína é recuperada a partir da célula como um ex- trato aquoso, por exemplo, em solução salina tamponada com fosfato. Para capturar a proteína de interesse, o extrato é aplicado diretamente a um meio cromatográfico, tal como um anticorpo imobilizado ou uma coluna de heparina-Sefarose. As proteínas secretadas podem ser recu- peradas a partir do espaço periplásmico em uma forma solúvel e funci- onal, rompendo as células (por exemplo, sonicação ou choque osmó- tico) para liberar o conteúdo do espaço periplásmico e recuperar a pro- teína, evitando assim a necessidade de desnaturação e redobragem. Os anticorpos, incluindo anticorpos de cadeia única, podem ser produ- zidos em células hospedeiras bacterianas de acordo com métodos co- nhecidos. Ver, por exemplo, Bird e outros, Science 242: 423 a 426, 1988; Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 a 5883, 1988; e Pantoliano e outros, Biochem. 30: 10117 a 10125, 1991.

[0136] As células hospedeiras transformadas ou transfectadas são cultivadas de acordo com procedimentos convencionais em um meio de cultura contendo nutrientes e outros componentes necessários para o crescimento das células hospedeiras escolhidas. Uma variedade de meios adequados, incluindo meios definidos e meios complexos, é co- nhecida na técnica e geralmente inclui uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais. O meio também pode conter componentes tal como fatores de crescimento ou soro, conforme necessário. O meio de crescimento geralmente seleci- ona células contendo o DNA adicionado exogenamente, por exemplo, por seleção ou deficiência de fármaco em um nutriente essencial que é complementado pelo marcador selecionável transportado no vetor de expressão ou cotransfectado na célula hospedeira.

[0137] Os anticorpos anti-CD152 podem ser purificados por méto- dos convencionais de purificação de proteínas, tipicamente por uma combinação de técnicas cromatográficas. Ver geralmente Affinity Chro- matography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Upp- sala, Suécia, 1988); Escopes, Protein Purification: Principles and Prac- tice (Springer-Verlag, Nova lorque 1994). As proteínas que compreen- dem uma região Fc de imunoglobulina podem ser purificadas por cro- matografia de afinidade em proteína A ou proteína G imobilizada. Eta- pas adicionais de purificação, tal como filtração em gel, podem ser usa- das para obter o nível de pureza desejado ou para dessalinização, troca de tampão, e similares.

[0138] Os seguintes exemplos da invenção são para ilustrar ainda mais a natureza da invenção. Dever-se-ia entender que os exemplos a seguir não limitam a invenção e que o escopo da invenção deve ser determinado pelas reivindicações em anexo. Exemplos Exemplo 1 - Geração de anticorpos anti-CTLA-4

[0139] A proteína CTLA-4-ECD humana (Acro Bio) foi usada como um imunogene para gerar anticorpos anti-CTLA-4. Os usos da tecnolo- gia de camundongos transgênicos de imunoglobulina humana para o desenvolvimento e a preparação de anticorpos humanos foram descri- tos pela primeira vez por Abgenix (xeno mouse e Medarex (HuMab "mouse"); Lonberg e outros, 1994, Nature, 368: 856 a 859; Lonberg e Huszar, 1995, Internal Rev. Immunol., 13: 65 a 93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. NY Acad. Sei., 764: 536 a 546).

[0140] Os camundongos HCAb foram imunizados com a proteína CTLA-4-ECD humana a 20 mg / por camundongo a cada duas semanas por três vezes, e seis deles foram imunizados por mais cinco vezes a 44 mg / por camundongo. Exceto pela primeira injeção, em que Stimune (Prionics) foi usado como adjuvante, todos os reforços foram feitos com o adjuvante Ribi (sistema adjuvante Sigma S6322-1VL). Após a imuni- zação, suspensões de células únicas foram isoladas a partir da medula óssea de camundongo, baço e linfonodos. Em seguida, as células plas- máticas de camundongo foram isoladas usando o kit de isolamento de células plasmáticas (Miltenyi, Cat.No.130-092-530). Resumidamente, os RNAs totais das células plasmáticas do camundongo foram prepara- dos e transcritas reversamente para cCDNAs em um grande grupo. As regiões VH humanas foram amplificadas a partir dos cDNAs utilizando iniciadores como segue.

[0141] Iniciador Direto: lib-3-23 / 53-S8: -GTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTG (SEQ ID NO: 193) e lib-3-11-S: -GTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG (SEQ ID NO: 194)

[0142] Iniciador Reverso: mMG1hrv: -GGCTTACAACCACAATCCCTGGGC (SEQ ID NO: 195).

[0143] Todos os fragmentos de PCR contendo domínio VH amplifi- cados foram clonados em um vetor de expressão de mamífero pTT5. Os plasmídeos obtidos foram transformados em bactérias (DH5a) por eletroporação. Os plasmídeos foram duplicados e purificados, e depois transfectados para células HEK 293 para produção de anticorpos.

[0144] As células 293 foram incubadas em meio 293 FreeStyle (12338018, Thermo) por 10 dias, e os sobrenadantes foram triados com um ensaio ELISA. As proteínas CTLA4-his humanas recombinantes (Acro Bio) foram diluídas em PBS com uma concentração de 2 ug / mL, e 100 uL das proteínas CTLA-4-his diluídas foram adicionados por poço às microplacas ELISA, que foram incubadas durante a noite a 4º C para revestir as placas com as proteínas recombinantes. As placas foram en- tão bloqueadas com solução de bloqueio ELISA (contendo BSA a 2%, de Tween-20 a 0,05% (em volume), tampão PBS pH 7,4, peso / volume) a 37º C por duas horas e depois incubadas com sobrenadantes por 1 hora a 37º C. As placas foram lavadas e incubadas com anticorpo IgG anti-humano (H + L) de cabra conjugado com peroxidase de rábano sil- vestre (HRP) (A18805, Life Technologies) a 37º C por uma hora. Foram adicionados 100 uL de tetrametilbenzidina (TMB), e as placas foram in- cubadas em temperatura ambiente por 15 minutos. 50 ul de HCl a 1N foram adicionados para finalizar a reação. Trinta e cinco clones positivos mostrando coloração significativa foram selecionados para testes adici- onais.

[0145] Os 35 clones foram sequenciados, e 9 dos 35 foram escolhi- dos com sequências CDR3 únicas. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos desses 9 anticorpos anti-CTLA-4 foram resumidas na Ta- bela 1. Os anticorpos HCAb continham apenas duas cadeias pesadas.

Tabela 1. Sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de anticorpos anti-CTLA-4 humanos Cadeia pesada | Cadeia Região variável de / CDR1 de ca-/CDR2 de ca- /CDR3 de ca- e a E IR E E Rg ; na: ácido nucleico; aa: aminoácido

Exemplo 2 — Preparação e purificação de anticorpos anti-CTLA-4 Etapa 1. Preparação de células HEK 293F que superexpressam hCTLA-4

[0146] A sequência de nucleotídeos codificando CTLA-4 humano (SEQ ID NO: 196, codificando uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197) foi subclonada em um vetor pcDNA3.1 (Clontech) para ob- ter um plasmídeo. As células HEK293 e CHO-K1 (Invitrogen) foram transfectadas transientemente com os plasmídeos usando PEI, e os transformantes foram cultivados em meio de cultura DMEM contendo 0,59 / mL de penicilina / estreptomicina e soro fetal bovino (FBS) a 10% (em peso) por 2 semanas. Foi realizada uma diluição limitada em uma placa de cultura de 96 poços, e a placa foi incubada a 37º C com CO> a 5% (em volume) por aproximadamente 2 semanas. Os monociones fo- ram expandidos em placas de 6 poços, e os clones expandidos foram triados por citometria de fluxo usando anticorpos anti-hCTLA-4 disponí- veis comercialmente (R&D Systems). Os clones exibindo taxas de cres- cimento mais altas e intensidade de fluorescência mais alta, conforme medido por FACS, foram ainda mais expandidos e crioconservados em nitrogênio líquido. Etapa 2. Determinação da atividade de ligação de anticorpos anti- CTLA-4 no meio de células HEK 293F por ELISA e ensaio de ligação FACS baseado em células

[0147] Proteínas CTLA4-his humanas recombinantes (Acro Bio) fo- ram diluídas em PBS com uma concentração de 2 ug / mL, e 100 ul das proteínas CTLA-4-his diluídas foram adicionados por poço às mi- croplacas ELISA, que foram incubadas durante a noite a 4º C para re- vestir as placas com as proteínas recombinantes. As placas foram então bloqueadas com solução de bloqueio ELISA (contendo BSA a 2%, Tween-20 a 0,05% (em volume), tampão PBS pH 7,4, peso / volume) a 37º C por duas horas e depois incubadas com meio de células 293F contendo anticorpos anti-CTLA-4 (ver o Exemplo 1) por 1 hora a 37º C. As placas foram lavadas e incubadas com anticorpo IgG humano (H + L) de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (A18805, Life Technologies) a 37º C por uma hora. Foram adicionados 100 uL de tetrametilbenzidina (TMB), e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos. 50 uL de HCI a 1N foram adicio- nados para terminar a reação, e o OD450nm foi determinado por um leitor de placas ELISA.

[0148] Enquanto isso, as células 293-hCTLA-4 preparadas na etapa 1 foram cultivadas e usadas para medir a atividade de ligação ao anti- corpo. As células foram tratadas com solução de dissociação celular li- vre de enzimas (solução Versene, Invitrogen) e depois coletadas. BSA foi adicionado à suspensão de células até uma concentração final de 1%, e as células foram bloqueadas por 30 minutos em gelo e depois lavadas duas vezes com HBSS. As células foram coletadas após cen- trifugação e ressuspensas em tampão FACS (HBSS + BSA a 1%, em volume) a 2 x 106 células / mL. 100 ul da suspensão de células foram então adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços. 100 uL de meio de célula 293F contendo anticorpos anti-CTLA-4 (ver Exemplo 1) foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços e incubados por 1 hora em gelo. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS, e 100 uL de anticorpo anti-humano (H + L) marcado com Alexa 488 (In- vitrogen) foram adicionados à placa de 96 poços e incubados por 1 hora em gelo. As amostras foram lavadas três vezes com tampão FACS, e 100 uL de tampão de fixação (paraformaldeído a 4% em volume) foram adicionados a cada poço e incubados por 10 minutos. As células foram então lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 100 uL de tampão FACS. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi de- terminada usando FACS Calibur (BD).

Etapa 3. Produção e purificação dos principais anticorpos candi- datos

[0149] A concentração de anticorpos a partir das células HEK293 foi de cerca de 1 a 10 ug / mL e variou amplamente. Além disso, o FBS e os componentes do meio de cultura poderiam interferir na análise. Portanto, era necessário realizar produção e purificação de anticorpos em pequena escala (1 a 5 mg).

[0150] Os construtos contendo sequências de nucleotídeos codifi- cando os anticorpos anti-CTLA-4 (conforme listado na Tabela 1) foram introduzidos nas células 293. O sobrenadante contendo os anticorpos alvo foi colhido 6 a 7 dias após a transfecção por centrifugação e filtra- ção. Os anticorpos monoclonais foram purificados passando-os através de colunas de 2 mL de proteína G (GE Healthcare). As colunas de pro- teína G foram primeiro equilibradas com tampão PBS (pH 7,2), e os so- brenadantes da cultura de hibridoma foram então aplicados às colunas de proteína G equilibradas com uma taxa de fluxo constante de 3 mL / minuto. As colunas foram então lavadas com tampão PBS tendo um volume 3 vezes maior que o da coluna. Os anticorpos anti-CTLA-4 foram então eluídos com tampão de eluição (tampão acetato a 0,1 M, pH 2,5), e a absorbância de UV dos eluatos foi monitorada usando um detector de UV (pico de absorção de UV A280). 10% de tampão Tris-HCL a 1,0 M foram adicionados aos eluatos para neutralizar o pH, e as amostras foram filtradas estéril passando-as através de filtros de 0,22 mícron. Fo- ram obtidos anticorpos anti-CTLA-4 purificados por filtração estéril.

[0151] As concentrações de anticorpos anti-CTLA-4 purificados foram determinadas por absorbância de UV (A280 / 1,4), e a pureza e o nível de endotoxina (kit Lonza) foram medidos. Os anticorpos anti-CTLA-4 purifi- cados tinham concentrações de endotoxina inferiores a 1,0 EU / mg. Exemplo 3 — Caracterização dos principais anticorpos candidatos

[0152] As células 293 foram transfectadas de maneira estável com plasmídeos pTT5 contendo a sequência de ácido nucleico codificando CTLA-4 humano (SEQ ID NO: 196) para gerar células 293F que expres- sam estavelmente CTLA-4 humano (aqui chamadas de células 293- hCTLA-4). As células 293 adicionais foram transfectadas de maneira estável com plasmídeos plRES contendo a sequência de ácido nucleico codificando CTNO-4 de comprimento total (SEQ ID NO: 198) para gerar células 293 expressando estavelmente CTNO-4 de cyno (aqui chama- das de células 293-cynoCTLA-4). As células 293-hCTLA-4 e 293- cynoCTLA-4 foram cultivadas e expandidas em frascos de cultura T-75 até 90% de confluência.

O meio de cultura foi aspirado, e as células foram lavadas duas vezes com HBSS (Solução Salina Balanceada de Hank, Invitrogen). As células foram tratadas com solução de dissocia- ção celular livre de enzimas (solução Versene, Invitrogen) e coletadas.

As células foram então lavadas duas vezes com HBSS, as contagens de células foram determinadas, e as células foram ressuspensas com HBSS a 2 x 10º células / mL.

BSA foi adicionado à suspensão de células até uma concentração final de 1%, e as células foram bloqueadas por minutos em gelo e depois lavadas duas vezes com HBSS.

As células foram coletadas após centrifugação e ressuspensas em tampão FACS (HBSS + BSA a 1%, em volume) a 2 x 106 células / mL. 100 uL da sus- pensão de células foram então adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços. 100 uL de anticorpos anti-CTLA-4 purificados do Exemplo 2 ou anticorpos de controle foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços e incubados por 1 hora em gelo, onde a cadeia pesada e a cadeia leve do análogo de Ipilimumab tinham sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 199 e SEQ ID NO: 200, respectivamente.

As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e 100 uL de anticorpo anti-humano (H + L) marcado com Alexa 488 (Invitrogen) foram adicio- nados à placa de 96 poços e incubados por 1 hora em gelo.

As amostras foram lavadas três vezes com tampão FACS, e 100 uL de tampão de fixação (contendo paraformaldeído a 4%, em volume) foram adiciona- dos a cada poço e incubados por 10 minutos. As células foram então lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 100 ul de tampão FACS.

[0153] A intensidade média de fluorescência (MFI) foi determinada usando FACS Calibur (BD), e os resultados foram mostrados nas Figura 1 e Figura 2. Os anticorpos do Exemplo 2 tinham atividade de ligação ao CTLA humano ou cyno em células 293F comparáveis ao análogo de Ipilimumab. Exemplo 4 — Determinação da capacidade dos anticorpos anti- CTLA-4 de bloquear a ligação de CTLA-4 a B7.1

[0154] O ensaio de ligação ao receptor — ligando baseado em célu- las foi realizado para determinar a capacidade dos anticorpos anti- CTLA-4 de bloquear a ligação de CTLA-4 aos seus ligandos B7.1. À proteína B7.15ºP-Fc recombinante (B71-H5259, Acro Bio) foi biotinilada usando EZ-LINK NHS-PEG12-Biotina (Thermo Scientific %& 21312) de acordo com as instruções do fabricante. A proteína B7.12ºP-Fc biotini- lada foi concentrada e a etiqueta livre foi removida usando o filtro cen- trífugo Amicon (corte de 10kDa). O domínio extracelular de B7.1 corres- pondia aos aminoácidos Val35-Asn242 da proteína de banco de dados Uniprot P33681.

[0155] As células 293-hCTLA-4 preparadas no Exemplo 3 foram cultivadas e expandidas em frascos de cultura T-75 até 60 a 80% de confluência. O meio de cultura foi aspirado, e as células foram lavadas duas vezes com PBS. As células foram tratadas com solução de disso- ciação celular livre de enzimas (solução Versene, Invitrogen) e coleta- das. A solução de dissociação foi neutralizada pela adição de 8 mL de meio de cultura, e as contagens de células foram determinadas. As cé- lulas foram centrifugadas a 300 g por 5 minutos e ressuspensas em tampão de bloqueio (contendo BSA a 2%, pH 7,4 de tampão PBS, peso

/ volume) a 1 x 106 células / mL. As células foram bloqueadas por 15 minutos a 37º C. Enquanto isso, os poços das placas de fundo redondo de 96 poços foram bloqueados com 200 uL de tampão de bloqueio por 1 hora a 37º C. O tampão de bloqueio foi descartado, e 200 uL de célu- las foram dispensados para cada poço das placas de 96 poços (2 x 10º células / poço). As placas foram centrifugadas a 500 g por 5 minutos, e os sobrenadantes foram descartados. As células foram ressuspensas em 100 uL de anticorpos anti-CTLA-4 preparados em tampão de blo- queio com concentrações variadas. Foram adicionados 100 ul de B7.1FºP-Fc biotinilado (60 ug / mL em tampão de bloqueio) a cada poço da placa de 96 poços e misturados agitando-se suavemente. As placas foram incubadas a 4º C por 90 minutos e lavadas duas vezes com 200 uL de tampão de bloqueio. O tampão de bloqueio foi descartado, e as células foram ressuspensas em 100 uL de solução de estreptavidina- Alexa 488 (Invitrogen, 1:500 em tampão de bloqueio) e incubadas a 4º C por 1 hora. As placas foram lavadas três vezes com tampão de blo- queio e adicionadas com 200 uL de tampão de bloqueio.

[0156] A intensidade média de fluorescência (MFI) foi determinada usando FACS Calibur (BD). Os resultados, como mostrado na Figura 3, demonstraram que os anticorpos anti-CTLA-4 podem bloquear a ligação de CTLA-4 expresso em células ao seu ligando B7.1 a um nível compa- rável ao análogo de I|pilimumab. Exemplo 5 — Anticorpos anti-CLTA-4 HCAb promoveram a libera- ção de IL-20 Etapa 1. teste de estimulação de PBMC

[0157] 100 ul de PBMC (contendo 1 x 10º células) foram adiciona- dos aos poços de uma placa de 96 poços, e 50 uL de cada anticorpo de teste com várias concentrações foram então adicionados à placa de 96 poços e incubados por 15 minutos em temperatura ambiente. 50 uL de SEB a 100 ng / mL foram adicionados a cada poço e cultivados a 37º C,

CO» a 5% por 72 horas. Os sobrenadantes foram coletados e armaze- nados a -20º C até a análise. Etapa 2. Detecção de secreção de interleucina IL-2 por ELISA

[0158] A quantificação dos níveis de IL-2 no sobrenadante de cul- tura foi realizada usando o kit humano IL-2 Quantikine ELISA (DY202, R&D Systems) seguindo as instruções de operação fornecidas pelo fa- bricante. Resumidamente, os anticorpos policlonais anti-IL-2 foram re- vestidos nas microplacas ELISA, e 100 uL do sobrenadante de cultura, bem como o padrão, foram adicionados a cada poço e incubados em temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram lavadas 4 vezes com tampão de lavagem, seguido pela adição de anticorpos anti-IL-2 humanos conjugados com HRP e incubadas em temperatura ambiente durante 2 horas. Após as lavagens, um substrato cromogênico (5120- 0077, SeraCare) foi adicionado e incubado no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos, e a reação foi terminada pela adição de uma solução de paragem (E661006-0200, BBI Life sciences).

[0159] A absorbância a 450 nm foi determinada usando um leitor de placas ELISA, e os resultados, como mostrado nas Figura 4A e 4B, de- monstraram que alguns dos anticorpos anti-CTLA-4 podem aumentar a secreção de IL-2 em baixas concentrações em comparação com IgG humana (AB170090, Crown Bio) ou com o análogo de Ipilimumab. Exemplo 6 — Anticorpos anti-CTLA-4 HCAb ligados ao CTLA-4 hu- mano, mas não ao CTLA-4 murino no ensaio ELISA

[0160] A proteína CTLA4-his humana ou de camundongo recombi- nante (CT4-H5229 para proteína humana, CT4-M52H5 para proteína de camundongo, Acro Bio) foi diluída em PBS até uma concentração de 2 ug / mL, e 100 uL de proteína CTLA-4-his diluída foram adicionados por poço às microplacas ELISA, que foram incubadas durante a noite a 4º C para revestir as placas com as proteínas recombinantes. As placas foram então bloqueadas com solução de bloqueio ELISA (contendo BSA a 2%, Tween-20 a 0,05% (em volume), tampão PBS pH7,4, peso / vo- lume) a 37º C por duas horas e depois incubadas com anticorpos anti- CTLA-4 com várias concentrações por 1 hora a 37º C. As placas foram lavadas e incubadas com anticorpo IgG humano (H + L) de cabra con- jugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (A18805, Life Technologies) a 37º C por uma hora. Foram adicionados 100 yuL de te- trametilbenzidina (TMB), e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos. 50 ul de HCI a 1N foram adicionados para terminar a reação, e o OD450nm foi determinado por um leitor de placas ELISA.

[0161] Os dados foram mostrados nas Figura 5A e Figura 5B, suge- rindo todos os clones se ligaram ao CTLA-4 humano, mas quase não se ligaram ao CTLA-4 murino. Exemplo 7 — Mutantes de anticorpos anti-CTLA-4 promoveram a li- beração de IL-20

[0162] Foi realizado um ensaio de estimulação de células T em al- guns anticorpos mencionados acima e seus mutantes para examinar o efeito desses anticorpos na estimulação de células T bloqueando a liga- ção do CTLA-4 aos seus ligandos B7.1 e B7.2.

[0163] Os mutantes de anticorpos foram preparados aplicando mu- tações S239D e 1332E no domínio constante Fc do clone 5, clone 11, clone 22, clone 25 e clone 30 de HCAb, por PCR. Os anticorpos muta- dos foram expressos em células HEK293 e purificados como descrito no Exemplo 2. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos dos mutantes de anticorpos foram determinadas usando métodos padrão de biologia molecular e estão resumidas na Tabela 2.

Tabela 2. Sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de mutantes de anticorpos anti-CTLA-4 Cadeia Cadeia pe- | Região variável de | CDR1 de cadeia | CDR2 de cadeia | CDR3 de cadeia na: ácido nucleico; aa: aminoácido º

[0164] O teste de estimulação de PBMC e a detecção da secreção de interleucina IL-2 por ELISA foram realizados como no Exemplo 5.

[0165] Os resultados nas Figuras 6A e 6B demonstraram que os mutantes de anticorpos anti-CTLA-4 promoveram mais secreção de |L- 2 quando comparados ao controle de isotipo I9G1 humano e seus clo- nes parentais. Exemplo 8 — Variantes de anticorpo anti-CTLA-4 com PTM removido

[0166] As sequências de aminoácidos de 7 clones de HCAb (CL22, CL25, CL5, CL3, CL11, CL30, CL24) foram alinhadas ao gene IGHV3- 53*01 e exibidas na Tabela 3. As diferenças no gene da linhagem ger- minativa e sítios PTM foram destacadas. As sequências foram numera- das no esquema de numeração de Chothia.

[0167] O gene de linhagem germinativa IGHV3-53 não tem um mo- tivo de N-glicosilação nativamente, e os motivos de N-glicosilação car- regados nos 7 clones de HCAb foram formados por mutações somáti- cas. Portanto, uma abordagem para remover esse motivo foi substituí- lo pelos resíduos de contraparte correspondentes na linhagem germina- tiva, por exemplo, substituir o motivo NVS em CDR1 de CL11 por TVS da linhagem germinativa. A abordagem alternativa também foi explo- rada combinando a remoção de PTM com a "linhagem germinativa", com base no conceito de enxerto de CDR usado para humanização. Na segunda abordagem, as CDRs de cada HCAb foram enxertadas nas estruturas da linhagem germinativa IGHV3-53 e os principais resíduos da estrutura de HCAb parental também foram mantidos. Para alguns anticorpos, as mutações de aminoácidos localizadas em resíduos espe- ciais, que podem afetar a atividade de ligação entre CTLA-4 e anticor- pos, foram restauradas. As sequências de ácidos nucleicos e aminoáci- dos das variantes de anticorpos anti-CTLA-4 HCAb humano com remo- ção de PTM foram listadas na Tabela 4.

Tabela 3. Diferenças da sequência de aminoácidos de HCAb em comparação com a sequência da linhagem ger- minativa Linhagem germinativa PTM crítico Cloneitt IGHV Ident% FR1 CDRI1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 CcL22 IGHV3-53*02 89,7% NxS/T CcL25 IGHV3-53*02 96,9% NxS/T CL5 IGHV3-53*02 86,6% NxS/T CcL3 IGHV3-53*02 88,7% NxS/T NxS/T CL1I1 IGHV3-53*02 86,6% NxS/T CL30 IGHV3-53*02 87,6% NxS/T CL24 IGHV3-53*02 84,5% NxS/T NxS/T a CL20 IGHV3-74*03 98,0% NxS/T,NS,DG 8 CL34 IGHV3-74*03 88,8% NxS/T,NS,DG DG Tabela 4. Sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de variantes de anticorpos anti-CTLA-4 com remoção de

Cadeia Região variável /CDR1I de ca- | CDR2 de ca- /CDR3 de ca- Cadeia pesada aa | de cadeia pesada | deia — pesada |deia pesada |deia pesada ame 2 PA E ss pras eres [ermraPTm 55 ss Ag Ag [emraenr foro fe e a ss e s ê ' [cade for fa a mm e [csdemm ro fe TR BR [crasderv fas Ts A e=ig [esoderm for fe Ta a as as [crsoderir foras Rr e na: ácido nucleico; aa: aminoácido

Exemplo 9 - Atividade de ligação baseada em células de variantes de anticorpo anti-CTLA-4 com remoção de PTM

[0168] O ensaio de ligação baseado em células foi realizado para determinar a capacidade de ligação das variantes de anticorpo anti- CTLA-4 com remoção de PTM ao CTLA-4 humano. O procedimento de ensaio foi semelhante ao descrito no Exemplo 3. Em resumo, as células 293F-hCTLA-4 foram colhidas usando solução de dissociação de célu- las livre de enzima (solução Versene, Invitrogen) e depois neutralizadas por meio de cultura, e as contagens de células foram determinadas. As células foram centrifugadas e bloqueadas em tampão de bloqueio (con- tendo BSA a 2%, tampão PBS a pH 7,4, peso / volume) a 1 x 106 células / mL por 15 minutos a 37º C. Foram dispensados 200 uL de células a cada poço das placas de 96 poços (2 x 105º células / poço). As placas foram centrifugadas e os sobrenadantes foram descartados. As células foram ressuspensas em 100 uL de anticorpos anti-CTLA-4 preparados em tampão de bloqueio. As placas foram incubadas a 4º C por 90 minu- tos e lavadas duas vezes. Após o descarte do tampão de bloqueio, as células foram ressuspensas em 100 uL de anticorpo anti-humano (H + L) marcado com Alexa 488 (1: 500, Invitrogen) e incubadas a 4º C por 1 hora. As células foram lavadas e ressuspensas em 200 uL de tampão de bloqueio. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi determinada usando FACS Calibur (BD).

[0169] Os resultados, como mostrado nas Figuras 7A e 7B, de- monstraram que as variantes de anticorpo anti-CTLA-4 com a remoção de PTM se ligaram a CTLA-4 humano expresso em células. Exemplo 10 — Atividade de bloqueio de variantes de anticorpo anti- CTLA-4 com remoção de PTM na interação CTLA-4 - B7.1 e B7.2

[0170] O ensaio de ligação receptor — ligando baseado em células foi realizado como descrito no Exemplo 4 para determinar a capacidade das variantes de anticorpo anti-CTLA-4 com remoção de PTM de blo- quear a ligação de CTLA-4 aos seus ligandos B7.1.

[0171] Os resultados, como mostrado nas Figuras 8A, 8B e 8C, de- monstraram que as variantes de anticorpo anti-CTLA-4 com remoção de PTM bloquearam a ligação de CTLA-4 expresso em células aos seus ligandos B7.1 e B7.2 (dados não mostrados) a um nível comparável com o análogo de ipilimumab. Exemplo 11 — Variantes de anticorpo anti-CTLA-4 com remoção de PTM promoveram liberação de IL-20

[0172] A estimulação de PBMC e a quantificação do nível de IL-20 foram realizadas como descrito no Exemplo 5.

[0173] Os resultados, como mostrado na Figura 9, demonstraram que as variantes de anticorpo anti-CTLA-4 com remoção de PTM ainda podem promover a secreção de IL-2. Os anticorpos anti-CTLA-4 com mutações S239D e |332E e remoção de PTM induziram mais aumento da secreção de IL-2 do que aqueles com mutações S239D e |1332E, mas nenhuma remoção de PTM. Exemplo 12 — Afinidade de ligação e constante de dissociação de variantes de anticorpo anti-CTLA-4 com remoção de PTM

[0174] As constantes de dissociação foram determinadas por Bia- core T200 (GE Healthcare), seguindo as especificações do instrumento fornecido pelo fabricante. Resumidamente, 1 ug / mL de anticorpos anti- CTLA-A4 diluídos em NaOAc a 10 mM (pH 5,0, sigma) foram imobilizados na célula de fluxo de um chip sensor Série S CM5. Os grupos ésteres ativos restantes foram bloqueados com etanolamina a 1 M (pH 8,5). Com o HBS-EP+ como tampão de corrida, as proteínas recombinantes CTLA-4-his (CT4-H5229, AcroBio) e cynoCTLA-4-his (CT4-C5227, AcroBio) recombinantes com cinco concentrações diluídas em série fo- ram injetadas nas células de fluxo a 30 uL / min com o tempo de asso- ciação de 180 s. O fluxo de tampão foi mantido para dissociação por

600 s. O valor de KD para cada interação entre anticorpo e antígeno foi avaliado usando o software de avaliação Biacore T200 1.0 e o modelo de ajuste de ligação 1:1.

[0175] Os resultados foram mostrados na Figura 10 e Tabela 5. À afinidade de ligação de dois clones foi similar à do análogo de Ipilimu- mab. Tabela 5. Cinética de ligação e afinidades de Abs anti-CTLA-4 humano à proteína CTLA-4ECD-his humana e à proteína cynoCTLA-4"EºP-his conforme determinado por Biacore T200 Exemplo 13 — Análise de Função ADCC In vitro

[0176] Para confirmar a atividade citotóxica dependente de NK pre- sumida dos anticorpos anti-CTLA-4humanos, foi realizado o ensaio de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) tanto em células CHO-K1 expressando CTLA-4 quanto em células Treg estimuladas in vitro expressando CTLA-4.

[0177] As células CHO-K1 expressando CTLA-4, como descrito no Exemplo 2, etapa 1, foram ajustadas para uma concentração de 2 x 105 células / mL com meio ADCC (contendo RPMI 1640 sem vermelho de fenol, FBS a 10% e penicilina / estreptomicina a 1%). Foram adicionados 50 uL de suspensões celulares (1 x 10º células viáveis) a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em V. Os anticorpos de teste foram diluídos em série em meio ADCC (sem vermelho de fenol) e 50 ul de cada solução resultante foram adicionados aos poços em triplicado. As concentrações finais de anticorpos foram: 0,087 pM, 0,44 pM, 2,2 pM, 10,9 pM, 54 pM, 272 pM, 1,36 nM e 6,8 nM. A placa foi incubada a 37º C por 30 minutos. As células NK92 transfectadas de forma estável com FeyRI11158V foram ajustadas com meio ADCC (sem vermelho de fenol) de modo que, adicionando-se 100 uL de células NK92 transfectadas de maneira estável com FcyRlI11158V às células alvo, a relação de células efetoras para células alvo foi de 5:1. A placa foi então incubada a 37º C por 6 horas. Após 6 horas de incubação, a placa foi centrifugada e 50 uL de cada sobrenadante foram transferidos para uma nova placa. O sobrenadante foi incubado com 50 uL de tampão de detecção de LDH em temperatura ambiente por 30 min e medido quanto à absorbância a 490 nm. Para o controle da lise celular máxima, foram adicionados 50 uL de células CHO-K1 expressando CTLA-4, 50 ul de meio ADCC e 100 uL de tampão triton-X100 a 1% para detecção de LDH. Para o con- trole da lise celular mínima, foram adicionados 50 uL de células CHO- K1 expressando CTLA-4 e 150 ul de meio ADCC para detecção de LDH. A absorbância a 492/650 nm foi medida. A percentagem de lise celular foi calculada como 100 * (absorbância das amostras - absorbân- cia de fundo) / (absorbância da liberação máxima - absorbância da libe- ração mínima). Toda a porcentagem de valores de lise celular foi calcu- lada usando GraphPad Prism 5.0.

[0178] Os resultados, como mostrado na Figura 11, mostraram que o anticorpo de clone CL5-dPTM' induziu o efeito ADCC nas células CHO-K1 expressando CTLA-A, e o clone CL5-eA-dTPM' com mutação adicional S239D e 1332E mostrou uma atividade ADCC mais alta do que o análogo de l|pilimumab.

[0179] As células Treg estimuladas in vitro expressando CTLA-A4 fo- ram derivadas de células T CD4+ virgens isoladas in vitro. Primeiro, as células T CD4+ virgens foram isoladas a partir de PBMC primário de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi, 130-094-131). Em se- guida, as células T CD4+ virgens foram ativadas por incubação com o ativador T humano Dynabeads CD3 / CD28 (1:1) (Thermo, 11131D), 10 ng / mL de IL-2 (PeproTech, 200-02-B) e 20 ng / mL de TGF- B1 (Pepro- Tech, 100-21) por três dias.

No dia do experimento de morte em ADCC, as células Treg estimuladas foram ajustadas para uma concentração de 1 x 108 células / mL com meio ADCC (contendo RPM! 1640 sem verme- lho de fenol, FBS a 10% e penicilina / estreptomicina a 1%). 1 x 1086 células foram coradas com 5 ul de calceína AM (Therom, C34851, es- toque preparado como 50 ug por 50 ul de DMSO) por 1 ha 37º C.

As células Treg foram lavadas três vezes com meio ADCC. 50 uL de sus- pensões de células Treg (5 x 10º células viáveis) foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em V.

Os anticorpos de teste foram diluídos em série em meio ADCC (sem vermelho de fenol) e 50 uL de cada solução resultante foram adicionados aos poços em triplicado.

As concentrações finais de anticorpos foram: 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM e 100 nM.

A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos.

PBMC frescos (Miaotong) foram ajusta- dos 5 x 108 células / mL com meio ADCC (sem vermelho de fenol). Ao adicionar 50 ul de PBMC fresco às células Treg coradas, a relação de células efetoras para células alvo foi de 50:1. A placa foi então incubada a 37º C por 2 horas.

Após 2 horas de incubação, a placa foi centrifugada e 100 uL de cada sobrenadante foram transferidos para uma nova placa.

O sobrenadante foi medido pelo instrumento Enspire.

Para o controle da lise celular máxima, foram adicionados 50 uL de células Treg cora- das com calceína AM, 50 ul de meio ADCC e 100 uL de tampão triton- X100 a 1% para detecção de calceína AM liberada.

Para o controle da lise celular mínima, foram adicionados 50 ul de células coradas com calceína AM e 150 ul de meio ADCC para detecção de calceína AM liberada.

A absorbância a 520 / 650nm foi medida.

A porcentagem de morte específica é calculada como 100 * (absorbância das amostras - absorbância de fundo) / (absorbância da liberação máxima - absorbân- cia da liberação mínima). Toda a porcentagem de valores de morte es- pecífica foi calculada usando GraphPad Prism 5.0.

[0180] Os resultados, como mostrados na Figura 11B, mostraram que os anticorpos anti-CTLA-4 humanos induziram o efeito ADCC nas células Treg expressando CTLA-A, e o anticorpo com a mutação S239D e 1332E mostrou uma atividade ADCC mais alta do que o não mutado. Exemplo 14 — Estudo farmacocinético de anticorpos anti-CTLA-4 Etapa 1. Tratamento de dose única de anticorpo anti-CTLA-4 em camundongos

[0181] Camundongos machos C57BL/6 foram injetados com 3 mg / kg de anticorpos anti-CTLA-4 via veia da cauda para medir a concentra- ção sérica de anticorpos anti-CTLA-4. Os animais foram contidos ma- nualmente e aproximadamente 100 uL de sangue / ponto no tempo fo- ram coletados por punção retro-orbital, sendo o tempo pré-dose, 0,166, 1,4, 8, 24 horas, 2, 4, 7, 14 dias após a injeção de anticorpo. A coleta terminal foi realizada por punção cardíaca. As amostras de sangue fo- ram mantidas em temperatura ambiente e centrifugadas a 2.000Xg por min a 4º C para obter amostras de soro. Etapa 2. Concentração sérica de anticorpos anti-CTLA-4, conforme medido por ELISA

[0182] Todas as amostras de soro foram diluídas 20 vezes no Dilu- ente de Ensaio primeiro. Diluição adicional foi feita em soro de camun- dongo a 5% (PBS, em volume). A proteína CTLA4-his humana recom- binante (Acro Bio) foi diluída em PBS até uma concentração de 0,5 ug / mL, e 50 uL da amostra de proteína CTLA-4-his diluída foram adiciona- dos por poço às microplacas ELISA, que foram incubadas durante a noite a 4º C para revestir as placas com as proteínas recombinantes. As placas foram então bloqueadas com solução de bloqueio ELISA (con- tendo BSA a 2%, Tween-20 a 0,05% (em volume), tampão PBS pH 7,4, peso / volume) a 37º C por duas horas. O tampão de bloqueio foi aspi- rado e as placas foram incubadas com amostras de soro diluídas por 1 hora a 37º C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lava- gem (PBS + Tween 20 a 0,01% (em volume)) e incubadas com anticorpo IgG(Fc) anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano sil- vestre (HRP) (A0170, Sigma) a 37º C para uma hora. Foram adiciona- dos 100 uL de tetrametilbenzidina (TMB), e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos. Foram adicionados 100 ul de HCl a 0,1 N a cada poço para parar a reação. A absorbância a 450 nm foi medida com um leitor de placas ELISA (SpectraMax M2).

[0183] A concentração sérica correspondente de anticorpos anti- CTLA-A4 foi mostrada na Figura 12, com dados detalhados listados na Tabela 6.

Tabela 6. Concentração sérica média de anticorpos após uma dose IV de 3 mg / kg em camundongos

Dados de concentração sérica média e individual — tempo de análogo de Ipilimumab após uma dose IV de 3 mg / kg em camundongos

C57BL/6 machos

Dose (mg / kg) Viade Dosagem Tempo de amostragem (Dia) Concentração (vg/mL) Média(vgml) SD CV (%)

Individual (41 — 412)

3 IV o BQL BQL BOL BQL NA NA 0,00694 67,3 69,8 60,2 65,8 4,99 7,59 0,0417 52,8 58,4 54,0 55,1 2,92 5,29 0,167 42,1 55,6 52,7 50,2 7,09 14,14 0,333 37,3 42,0 38,1 39,2 2,54 6,50 1 21,7 26,0 24,0 23,9 2,163 9,04 2 19,8 22,8 17,6 201 2,59 12,9 S 4 17,7 17,5 17,0 17,4 0,389 2,24 S 7 18,3 13,3 134 15,03 2,829 18,83 14 10,8 9,8 10,3 10,30 0,531 5,15

Parâmetros PK Unidade Valor Estimado

CL mL / dia / kg 7,12

Vss mL / kg 127 vi mL / kg 47,2

Alfa tio Dia 0,271

Beta tio Dia 12,8

AUC Dia * vg / mL 421

MRT Dia 17,8

Dados de concentração sérica média e individual — tempo de CL5 após uma dose IV de 3 mg / kg em camundongos C57BL/6 machos

Dose Via de Dosagem Tempo de amostragem (Dia) Concentração (pg / mL) Média SD CV (%) (mg / kg) Individual (ug / mL) 3 IV o BQL BQL BQL BQL NA NA 0,00694 44,3 49,7 50,9 48,3 3,54 7,33 0,0417 37,5 39,6 33,4 36,8 3,20 867 0,167 26,0 26,0 22,5 24,8 200 807 0,333 22,1 18,7 21,0 20,6 1,70 827 1 12,8 14,1 14,0 13,6 0,697 5,12 2 12,7 13,6 11,0 124 1,32 10,6 4 11,0 10,5 9,62 10,4 0,690 6,66 7 9,94 9,09 10,2 9,75 0,594 6,09 14 4,99 5,42 5,89 5,43 0,449 8,26 & Parâmetros PK Unidade Valor Estimado fo) CL mL / dia / kg 13,9 eo Vss mL / kg 194 vi mL / kg 64,0 Alfa tio Dia 0,113 Beta tio Dia 9,92 AUC Dia * vg / mL 216 MRT Dia 14,0

[0184] Além disso, a relação da concentração tumoral / sérica de anti-CTLA4 HCAb foi medida em camundongos C57BL/6 portadores de tumores MC38. Os camundongos foram injetados com 3 mg / kg de an- ticorpos anti-CTLA-4 através da veia da cauda para medir a concentra- ção de soro e tumor residente de anticorpos anti-CTLA-4. Os animais foram contidos manualmente e aproximadamente 100 uL de sangue / ponto no tempo foram coletados por punção retro-orbital, sendo o ponto no tempo 8 e 24 horas após a injeção. A coleta terminal foi realizada por punção cardíaca. As amostras de sangue foram mantidas em tempera- tura ambiente e centrifugadas a 2.000Xg por 5 min a 4º C para obter amostras de soro. As concentrações séricas e tumorais de anticorpos anti-CTLA-4 também foram testadas por ELISA, como na etapa 2.

[0185] A relação sérica da concentração tumoral / de anti-CTLA4 HCAb no grupo CL5-eA-dPTM' foi cerca de uma vez maior do que a do grupo análogo Ipi, como mostrado na Figura 13, o que pode ser devido ao único característica de anticorpos HCAb apenas de cadeia pesada. Uma maior distribuição tumor / soro pode levar a uma maior penetração no tecido tumoral dos anticorpos HCAb. Exemplo 15 - Camundongos portadores de tumor MC38 sobrevive- ram melhor com anticorpos anti-CTLA-4 humanos

[0186] A linhagem de células MC-38 de carcinoma de cólon murino criopreservada foi recuperada e cultivada em meio DMEM contendo soro fetal bovino (FBS) a 10% e penicilina estreptomicina a 1% a 37º C para obter células suficientes para a implantação do tumor. As células MC-38 cultivadas foram colhidas, ressuspensas em PBS a uma densi- dade de 1x107 células / mL com viabilidade > 90% e implantadas sub- cutaneamente no flanco direito de 120 hOTLA-4 em camundongos (GempharmaTech). Cinco dias após a inoculação do tumor, 81 camun- dongos com tamanho de tumor variando de 26 a 64 mm? (tamanho mé- dio do tumor foi de 40 mm?) foram selecionados e divididos em 9 grupos usando a randomização estratificada com 9 camundongos por grupo com base em seus volumes de tumor. Os tratamentos foram iniciados a partir do dia da randomização (definido como DO). O grupo 1 foi tratado com hlgG1 i.p. a 10mpk em DO, D3, D6, D10, D13, D16; o grupo 2 foi tratado com CL20'-eA (sequências na Tabela 7) i.p. a 5,4 mpk em DO, D3, D6, D10, D13, D16; o grupo 3 foi tratado com análogo de Ipilimumab i.p. a 10 mpk em DO, D3, D6, D10, D13, D16; o grupo 4 foi tratado com análogo de lpilimumab i.p. a 1 mpk em DO, D3, D6, D10, D13, DI6; o grupo 5 foi tratado com CL5'-dPTM' i.p. a 5,4 mpk em DO, D3, D6, D10, D13, D16; o grupo 6 foi tratado com CL5'-dPTM' i.p. a 0,54 mpk em DO, D3, D6, D10, D13, D16; o grupo 7 foi tratado com CL5'-eA-dPTM' i.p. a 5,4 mpk em DO, D3, D6, D10, D13, D16; o grupo 8 foi tratado com CL5'- eA-dPTM' i.p. a 1,5 mpk em DO, D3, D6, D10, D13, D16; e o grupo 9 foi tratado com CL5'-eA-dPTM' i.p. a 0,54 mpk em DO, D3, D6, D10, D13, D16. Tabela 7. Sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos do clone CL20'-eA una 2º Dos zoo pesada | velde cadeia | cadeia de ca-jde ca Cadeia pesada | aa pesada aa pesada deia pe- | deia pe- Clone ID | na aa sada aa | sada aa na: ácido nucleico; aa: aminoácido

[0187] Os tamanhos do tumor foram medidos três vezes por se- mana durante o tratamento. Quando um animal individual chegava ao desfecho de terminação (TV > 2000 mm?), ele era sacrificado. O tempo desde o início do tratamento até o término foi considerado como o tempo de sobrevida. A curva de sobrevida foi plotada pelo método de Kaplan- Meier. O tempo médio de sobrevida (MST) foi calculado para cada grupo. O aumento da expectativa de vida (ILS) foi calculado de acordo com a seguinte fórmula:

[0188] ILS (%) = (MST rratamento - MST veículo) / MST veículo X 100%).

[0189] ILS (%) > 25% será considerado como benefício de sobre- vida biologicamente significativo, de acordo com os Critérios do National Cancer Institute.

[0190] A alteração relativa do peso corporal (RCBW) de cada ca- mundongo foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: RCBW (%) = (BW; - BWo) / BWo x 100%, em que BW; se refere ao peso corporal médio no Dia i, e BWo se refere ao peso corporal médio no Dia 0.

[0191] Os volumes de tumor (TV) foram calculados com base na seguinte fórmula: volume de tumor = (comprimento * largura?) / 2.

[0192] A taxa de inibição do crescimento de tumor (TGI%) de cada grupo de dosagem foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: TGI% = [1-TV; / TVw] * 100%, em que TV; se refere ao volume médio de tumor de um grupo de dosagem no Dia i, e TVv se refere ao volume médio de tumor do grupo de veículo no Dia i.

[0193] O erro médio e padrão da média (SEM) do peso corporal de camundongos, RCBW e volume de tumor de cada grupo foram calcula- dos usando o Microsoft Excel 2007. Figuras de peso corporal, alteração relativa do peso corporal, curva de crescimento de tumor, e inibição de crescimento de tumor foram plotadas usando o GraphPad Prism 5. O crescimento do tumor entre diferentes grupos foi analisado usando RM ANOVA de duas vias. As curvas de sobrevida de Kaplan — Meier foram analisadas pelo teste de Log-Rank. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

[0194] O estudo completo foi finalizado em D65. As curvas de cres- cimento de tumor individuais de cada grupo foram mostradas na Figura 14A. As curvas de sobrevida de Kaplan — Meier no tempo até o desfecho do animal foram mostradas na Figura 14B. Todos os tratamentos foram tolerados sem nenhum efeito adverso, como observado na Figura 14C.

Na maioria desses grupos, todos os camundongos foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu 2000 mm?. No Grupo 7, 3 de 9 ca- mundongos tratados com CL5'-eA-dPTM' a 5,4 mpk sobreviveram sem tumor no D65. No Grupo 9, 2 de 9 camundongos administrados com CL5'-eA-dPTM' a 0,54 mpk sobreviveram sem tumor no D65.

[0195] O MST foi calculado para cada grupo e mostrado na Tabela

8. O MST do grupo de veículo hligG1 a 5,4 mpk e CL20'-eA a 5,4 mpk foram ambos 14 dias. Os MSTs dos grupos de tratamento com o aná- logo de ipilimumab em 10 mpk e 1 mpk, CL5'-dPTM' em 5,4 mpk e 0,54 mpk, CL5"-eA-dPTM' em 5,4 mpk, 1,5 mpk e 0,54 mpk foram 14, 23, 19, 21, 14, 40, 21 e 28 dias, respectivamente. Também pode ser visto na Tabela 8, que o ILS nos grupos de tratamento foi de 64,3%, 35,7%, 50%, 0%, 185,7%, 50% e 100% em comparação com o grupo de tratamento com veículo hlgG1. O análogo de ipilimumab em 10mpk, CL5-dPTM' em 5,4 mpk, CL5'-eA-dPTM' em 5,4 mpk, 1,5 mpk e 0,54 mpk aumentou significativamente o tempo médio de sobrevida. Os camundongos trata- dos com CL5'-eA-dPTM' a 5,4 mpk pareciam ter um ILS melhor do que aqueles com o análogo de Ipilimumab a 10 mpk. Tabela 8. Análise de Sobrevida Grupo MST ILS (%) Valor p G1 hlgG1, 10 mpk 14 - - G2 CL20'-eA, 5,4 mpk 14 0,0 ns G3 Análogo de Ipilimumab, 10 mpk 23 64,3 <0,01 G4 Análogo de Ipilimumab, 1 mpk 19 35,7 ns G5 CL5'-dPTM', 5,4 mpk 21 50,0 <0,05 G6 CL5'-dPTM', 0,54 mpk 14 0,0 ns G7 CL5'-eA-dPTM', 5,4 mpk 40 185,7 <0,05 G8 CL5'-eA-dPTM', 1,5 mpk 21 50,0 <0,05 G9 CL5'-eA-dPTM', 0,54 mpk 28 100,0 <0,05 Nota: ILS = (MSTen — MSTG1) / MST: * 100%; Valor p é de todos os grupos em comparação com o grupo G1

Exemplo 16 — Inibição do crescimento do tumor MC38 em hCTLA- 4 em camundongos por anti-CTLA-4 HCAb

[0196] A linhagem de células de carcinoma do cólon murino MC-38 criopreservada foi recuperada e cultivada em meio DMEM contendo soro fetal bovino (FBS) a 10% e penicilina estreptomicina a 1% a 37º C para obter células suficientes para a implantação do tumor. As células MC-38 cultivadas foram colhidas, ressuspensas em PBS a uma densi- dade de 5x10º células / mL com viabilidade > 90% e implantadas sub- cutaneamente no flanco direito de 60 hOTLA-4 knock em camundongos. Sete dias após a inoculação do tumor, 30 camundongos portadores de tumor com tamanho médio de 102 mm? foram selecionados e randomi- zados em 5 grupos (n = 6) com base em seus tamanhos de tumor. Os tratamentos foram iniciados no dia da randomização (definido como DO). Os camundongos arrolados foram tratados com hlgG1 (0,5 mpk), o aná- logo de Ipilimumab (0,5 e 0,2 mpk) e CL5-eA-dPTM' (0,27 e 0,1 mpk), respectivamente, por via intraperitoneal (i.p) em DO, D6, D9, D13, D1I6 e D19. Os camundongos foram monitorados diariamente e os pesos corporais foram registrados nos dias úteis. Os tamanhos do tumor foram medidos duas vezes por semana durante o tratamento.

[0197] A alteração relativa do peso corporal (RCBW), volumes de tumor (TV) e taxa de inibição do crescimento de tumor (TGI%) foram calculados como no Exemplo 16. Média, erro padrão da média (SEM) do peso corporal de camundongos, RCBW e o volume de tumor de cada grupo foram calculados usando o Microsoft Excel 2007. Os valores de peso corporal, alteração relativa do peso corporal, curva de crescimento de tumor e inibição do crescimento de tumor foram plotados usando GraphPad Prism 5. O crescimento de tumor entre diferentes grupos foi analisado usando o método RM ANOVA de duas vias. As curvas de so- brevida de Kaplan — Meier foram analisadas pelo teste de Log-Rank. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

[0198] As curvas de crescimento de tumor foram mostradas na Fi- gura 15A. Todos os tratamentos foram tolerados sem nenhum efeito ad- verso, como observado na Figura 15B. Os camundongos em grupos de CL5'-eA-dPTM' a 0,1 mpk e 0,27 mpk, análogo de ipilimumab a 0,5 mpk mostraram inibição significativa do crescimento do tumor de D20 a D30 em comparação com camundongos no grupo de hlgG1 a 0,2 mpk. En- quanto, o tratamento com análogo ao ipilimumab a 0,2 mg / kg não mos- trou inibição significativa do crescimento do tumor em comparação com o hlgG1 a 0,2 mpk. CL5'-eA-dPTM' promoveu uma melhor inibição do crescimento de tumor do que o análogo de Ipilimumab na mesma dose.

[0199] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes e com referência a modalidades específicas da mesma, será evidente para um versado na técnica que várias alterações e modificações podem ser fei- tas sem abandonar o espírito e o escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação a CD152, em que o domínio de ligação a CD152 compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3, em que CDR1, CDR2 e CDR3 compreendem sequências de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com (1) SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente; (2) SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respectivamente; (3) SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente; (4) SEQ ID NOs: 22, 23 e 24, respectivamente; (5) SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; (6) SEQ ID NOs: 34, 35 e 36, respectivamente; (7) SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, respectivamente; (8) SEQ ID NOs: 46, 47 e 48, respectivamente; (9) SEQ ID NOs: 52, 53 e 54, respectivamente; (10) SEQ ID NOs: 58, 59 e 60, respectivamente; (11) SEQ ID NOs: 64, 65 e 66, respectivamente; (12) SEQ ID NOs: 70, 71 e 72, respectivamente; (13) SEQ ID NOs: 76, 77 e 78, respectivamente; (14) SEQ ID NOs: 82, 83 e 84, respectivamente; (15) SEQ ID NOs: 88, 89 e 90, respectivamente; (16) SEQ ID NOs: 94, 95 e 96, respectivamente; (17) SEQ ID NOs: 100, 101 e 102, respectivamente; (18) SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, respectivamente; (19) SEQ ID NOs: 112, 113 e 114, respectivamente; (20) SEQ ID NOs: 118, 119 e 120, respectivamente; (21) SEQ ID NOs: 124, 125 e 126, respectivamente; (22) SEQ ID NOs: 130, 131 e 132, respectivamente;

(23) SEQ ID NOs: 136, 137 e 138, respectivamente; (24) SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respectivamente; (25) SEQ ID NOs: 148, 149 e 150, respectivamente; (26) SEQ ID NOs: 154, 155 e 156, respectivamente; (27) SEQ ID NOs: 160, 161 e 162, respectivamente; (28) SEQ ID NOs: 166, 167 e 168, respectivamente; (29) SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente; (30) SEQ ID NOs: 178, 179 e 180, respectivamente; (31) SEQ ID NOs: 184, 185 e 186, respectivamente; ou (32) SEQ ID NOs: 190, 191 e 192, respectivamente.

2. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo apenas de cadeia pesada.

3. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindica- ção 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de imunoglobulina.

4. Anticorpo monoclional isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo consiste em duas cadeias pesadas de imunoglobulina.

5. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequên- cia de aminoácidos possuindo pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97% , 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 171, 177, 183 ou 189.

6. Anticorpo monoclional isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo me- nos uma das duas cadeias pesadas de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 88%,

90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182 ou

188.

7. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que exibe uma ou uma combinação das seguintes propriedades: (a) liga-se ao CD152 humano; (b) liga-se especificamente ao CD152 de macaco; (c) não se liga ao CD152 de camundongo; (d) bloqueia a ligação de CD152 a CD80, CD86 ou ambos; (e) promove a secreção de IL-2 por células imu- nes; (f) induz a ativação de células T; (g) estimula uma resposta imune antitumoral pelas células imunes.

8. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que exibe uma ou uma combinação das seguintes propriedades: (a) liga-se ao CD152 humano com uma afinidade maior que a de um análogo de ipilimumab; (b) liga-se ao CD152 humano com a afinidade que é pelo menos 2 ve- zes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos pelo menos 100 vezes maior do que de um análogo de ipilimumab; (c) dissocia-se de CD152 humano com um Ka de 1,0 * 10º M ou menos; (d) dissocia- se de CD152 humano com um Ka que é menor do que de um análogo de ipilimumab; (e) dissocia-se de CD152 humano com um Ka que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes menor do que o de um análogo de ipilimumab.

9. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se dissocia de CD152 humano com um Ka de 6,0 * 10? M ou menos.

10. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um excipiente farmaceutica- mente aceitável.

12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 11, caracterizada pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo que consiste em carreadores, agentes de superfície ativa, agentes espessantes ou emulsificantes, li- gantes sólidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, solubilizadores, corantes, agentes flavorizantes, revestimentos, agentes desintegrantes, lubrificantes, adoçantes, conservantes, agentes isotônicos, e uma com- binação dos mesmos.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que compreende adicional- mente um segundo anticorpo, em que o segundo anticorpo é um anti- corpo imunoestimulatório ou anticorpo coestimulatório.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 13, caracterizada pelo fato de que o anticorpo imunoestimulatório é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti- TIM 3, um anticorpo anti-STAT3, e um anticorpo anti-ROR1.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que o anticorpo coestimulatório é um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-GITR.

16. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

17. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica- ção 16, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1,7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 ou 187.

18. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que com- preende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 16 ou 17, em que a molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a sequências reguladoras adequadas para a expressão do seg- mento de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

19. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor de expressão, como definido na reivindicação 18.

20. Método para induzir uma citotoxicidade mediada por cé- lulas dependente de anticorpo (ADCC) contra uma célula expressando um antígeno associado a um tumor, caracterizado pelo fato de que com- preende colocar em contato uma célula T com o anticorpo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o dito con- tato é feito sob condições em que a ADCC contra a célula expressando o antígeno associado ao tumor é induzida.

21. Uso do anticorpo monoclonal isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou da composição farmacêu- tica, como definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, carac- terizado pelo fato de que é na preparação de uma composição ou me- dicamento para tratamento de um distúrbio, em que o distúrbio é um câncer ou uma doença autoimune.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, linfoma, LLC, pequeno linfoma linfocítico, linfoma de cé- lula B de zona marginal, linfoma de Burkett, carcinoma de células renais, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de células epiteliais escamosas, melanoma, mieloma, câncer de estômago, câncer cerebral, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de próstata, cân- cer de testículo, câncer de tireoide, e câncer de cabeça e pescoço.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o medicamento contém adicional- mente um agente terapêutico adicional.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um agente anticâncer.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é Ipilimumab e um pro- duto biossimilar do mesmo.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é uma doença autoimune.

28. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende pelo me- nos um recipiente que compreende a composição farmacêutica como definida na reivindicação 11.

29. Invenção, caracterizada em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.