ES2965187T3

ES2965187T3 - Anticuerpos que unen CTLA-4 y sus usos

Info

Publication number: ES2965187T3
Application number: ES18892518T
Authority: ES
Inventors: Xin Gan; Yun He; Yuqiang Shen; Jiuqiao Zhao; Yiping Rong; Frank Grosveld; Dubravka Drabek; Haperen Marinus Van (Rien); Rick Janssens
Original assignee: Harbour Biomed Shanghai Co Ltd
Current assignee: Harbour Biomed Shanghai Co Ltd
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2024-04-11
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: MX2020006585A; WO2019120232A8; CA3085861A1; PH12020550933A1; SG11202005692WA; PL3710484T3; EP3710484B1; RU2756100C1; EP3710484A4; CN111655728A9; AU2018391831A1; JP7087107B2; WO2019120232A1; ZA202003641B; US20190202914A1; EP4295915A3; JP2022120064A; KR20200101422A; AU2018391831B2; US20220002414A1

Abstract

Se describen anticuerpos monoclonales aislados, que comprenden un dominio de unión a CD152, en donde los anticuerpos se unen específicamente a CD152 humano. También se proporcionan métodos para producir y usar los anticuerpos para tratar enfermedades que incluyen cánceres y enfermedades autoinmunitarias. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que unen CTLA-4 y sus usos

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4, ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos, vectores de expresión y células recombinantes que contienen los ácidos nucleicos, y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos. También se proporcionan métodos para producir anticuerpos y su uso para tratar enfermedades que incluyen cánceres y enfermedades autoinmunitarias. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia contra el cáncer, un avance reciente en el tratamiento del cáncer, emplea el propio sistema inmunológico del paciente para atacar las células tumorales. Promover una sólida respuesta citotóxica dependiente de células T CD8 en el microambiente tumoral es importante para la generación de una respuesta inmune antitumoral eficaz. Sin embargo, el tumor tiende a evadir la vigilancia inmune aprovechando la maquinaria de supresión de las células T. El agotamiento de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) provoca la anergia de las células T citotóxicas y el escape de las células tumorales (Wherry y Kurachi, 2015, Nat Rev Immunol., 2015, 15: 486-499; Dyck y Mills, 2017, Eur. J. Immunol., 47(5): 765-779).

Los inhibidores de las proteínas de los puntos de control inmunológico tienen el potencial de tratar una variedad de tumores, como el melanoma metastásico, el cáncer de pulmón, el cáncer de mama y el carcinoma de células renales. CTLA-4 (CD152) es una molécula de punto de control inhibidora en la superficie de las células T. Originalmente se identificó mediante cribado diferencial de una biblioteca de ADNc de células T citolíticas murinas (Brunet et al., 1987, Nature, 328:267-270). Se sugiere que CTLA-4 puede funcionar como un regulador negativo de la activación de las células T (Walunas et al., 1994, Immunity, 1:405-413). CTLA-4 se expresa constitutivamente en las superficies de las células T reguladoras, pero la cantidad es relativamente baja. Está sobrerregulado tras la activación de las células T. Tras la activación, CTLA-4 interactúa con CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2), que también son los ligandos para CD28, con una afinidad de unión mucho mayor que CD28 (van der Merwe et al., 1997, J Exp Med. 185:393-403; Alegre et al., 2001, Nat Rev Immunol, 1: 220-228). La señalización de CD28 promueve la activación de las células T, mientras que la interacción de CTLA-4 con sus ligandos B7.1 y B7.2 previene una mayor activación de las células T.

Los antagonistas de CTLA-4 son atractivos ya que se demostró que el bloqueo de CTLA-4 con los antagonistas es una terapia eficaz contra los tumores (patentes de EE.UU. n° 6.984.720). La inhibición de este receptor de superficie usando un antagonista como un mAb anti CTLA-4 aumentó las respuestas de las células T CD4 y CD8 efectoras y redujo la función supresora de las células Treg. Los tratamientos basados en antagonistas de CTLA-4 progresaron rápidamente en los últimos años. Ipilimumab (YERVOY®), es un anticuerpo humanizado y bloquea los efectos de CTLA-4, que aumenta las respuestas de las células T a las células tumorales. Ipilimumab fue el primer medicamento que mostró una mejora en la supervivencia general de pacientes con melanoma metastásico en un ensayo de fase 3 controlado y aleatorizado. Tiene un perfil de seguridad manejable a una dosis de 3 mg/kg como monoterapia en pacientes previamente tratados con otras terapias y a una dosis de 10 mg/kg en combinación con dacarbazina en pacientes sin tratamiento previo. Además del melanoma maligno, también se está desarrollando ipilimumab para el tratamiento del cáncer de próstata y del cáncer de pulmón de células no pequeñas.

La patente internacional WO 2017/198212 A1 describe una proteína de unión a CTLA-4. El documento CN 106 220 732 A describe un nanocuerpo que se une a CTLA-4.

Sin embargo, a pesar de los avances mencionados anteriormente, se desean antagonistas de CTLA-4 con afinidad, especificidad y capacidad de desarrollo mejoradas. Además, también se necesitan terapias más eficaces que impliquen anticuerpos anti-CTLA-4 que inhiban eficazmente la actividad de señalización de CTLA-4 y al mismo tiempo causen efectos secundarios adversos mínimos en los seres humanos.

Compendio de la invención

Se describe un anticuerpo monoclonal aislado, que comprende un dominio de unión a CD152, en donde el dominio de unión a CD152 comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena pesada únicamente, en donde el anticuerpo comprende la función efectora de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). En algunos casos, el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. En algunos casos, el anticuerpo consiste en dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. En algunos casos, al menos una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182.

En algunos casos, el anticuerpo se une específicamente al CD152 humano. En algunos casos, el anticuerpo se une al CD152 humano con alta afinidad. En algunos casos, el anticuerpo se une al CD152 humano con una afinidad mayor que la de un análogo de ipilimumab. En algunos casos, el anticuerpo se une al CD152 humano con una afinidad que es al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces mayor que un análogo de ipilimumab.

En algunos casos, el anticuerpo se disocia del CD152 humano con una Kd de 1,0*10-7 M o menos. En algunos casos, el anticuerpo se disocia del CD152 humano con una Kd de 1,0*10-8 M o menos. En algunos casos, el anticuerpo se disocia del CD152 humano con una Kd de 1,0*10-9 M o menos. En algunos casos, el anticuerpo se disocia del CD152 humano con una Kd de 1,0* 10-10 M o menos. En algunos casos, el anticuerpo se disocia del CD152 humano con una Kd de 1,0*10-11 M o menos. En algunos casos, la Kd es 6,0*10-11 M o menos. En algunos casos, el anticuerpo se disocia del CD152 humano con la Kd que es menor que un análogo de ipilimumab. En algunos casos, el anticuerpo se disocia del CD152 humano con la Kd que es al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces menor que un análogo de ipilimumab. En algunos casos, la Kd se determina por resonancia de plasmón superficial.

En algunos casos, el anticuerpo se une específicamente al CD152 de mono. En algunos casos, el anticuerpo no se une específicamente al CD152 de mono. En algunos casos, el anticuerpo bloquea la unión de CD152 a CD80, CD86 o ambos. En algunos casos, el anticuerpo promueve la secreción de IL-2 por parte de las células inmunitarias. En algunos casos, el anticuerpo induce la activación de las células T. En algunos casos, el anticuerpo estimula una respuesta inmunitaria antitumoral por parte de las células inmunitarias. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria una composición farmacéutica, que comprende cualquier anticuerpo descrito en la presente memoria y un excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, el excipiente farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en vehículos, agentes tensioactivos, agentes espesantes o emulsionantes, aglutinantes sólidos, auxiliares de dispersión o suspensión, solubilizantes, colorantes, agentes saborizantes, recubrimientos, agentes desintegrantes, lubricantes, edulcorantes, conservantes, agentes isotónicos y combinaciones de los mismos. En algunos casos, la composición farmacéutica comprende además un segundo anticuerpo, en donde el segundo anticuerpo es un anticuerpo inmunoestimulador o un anticuerpo coestimulador. En algunos casos, el anticuerpo inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-LAG-3, un anticuerpo anti-TIM3, un anticuerpo anti-STAT3 y un anticuerpo anti-ROR1. En algunos casos, el anticuerpo coestimulador es un anticuerpo anti-CD137 o un anticuerpo anti-GITR.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo descrito en la presente memoria, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 181. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 181.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria un vector de expresión que comprende un segmento de ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo descrito en la presente memoria, en donde el segmento de ácido nucleico está unido operativamente a secuencias reguladoras adecuadas para la expresión del segmento de ácido nucleico en una célula huésped. En algunos casos, el segmento de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 181. En algunos casos, el segmento de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 181.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria una célula huésped que comprende cualquier vector de expresión descrito en la presente memoria.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria un método para tratar un trastorno en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier anticuerpo descrito en la presente memoria o cualquier composición farmacéutica descrita en la presente memoria. En algunos casos, el trastorno es un cáncer. En algunos casos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, linfoma, CLL, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células B de células marginales, linfoma de Burkett, carcinoma de células renales, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de células escamosas epiteliales, melanoma, mieloma, cáncer de estómago, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de tiroides y cáncer de cabeza y cuello. En algunos casos, el método comprende además un agente terapéutico. En algunos casos, el agente terapéutico es un fármaco anticancerígeno. En algunos casos, el agente terapéutico es ipilimumab o un producto biosimilar del mismo. En algunos casos, el trastorno es una enfermedad autoinmune.

Breve descripción de los dibujos

El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de la invención, se entenderán mejor cuando se interpreten en conjunto con los dibujos. Debe entenderse que la invención no se limita a las realizaciones que se muestran en los dibujos.

En los dibujos:

La Fig. 1 muestra la actividad de unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente descripción a CTLA-4 humano expresado en células 293.

La Fig. 2 muestra la actividad de unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente descripción a CTLA-4 de cynomolgus expresado en células 293.

La Fig. 3 muestra la capacidad de los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente descripción para bloquear la interacción entre CTLA-4 y B7.1.

Las Fig. 4A y 4B muestran el efecto del anticuerpo anti-CTLA-4 CL3, CL5, CL11 y CL22 (A), y CL24, CL25 y CL30 (B) sobre la secreción de IL-2 en un ensayo de estimulación de linfocitos T dependiente de SEB usando PBMC del donante 1.

Las Fig. 5A y 5B muestran la capacidad de unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 CL5, CL11, CL22, CL24 y CL25 (A) y CL5 (B) a CTLA-4 humano o CTLA-4 de ratón.

Las Fig. 6A y 6B muestran el efecto del anticuerpo anti-CTLA-4 CL5, CL11 y sus mutantes (A), y CL22, CL25 y sus mutantes (B) sobre la secreción de IL-2 en un ensayo de estimulación de linfocitos T dependiente de SEB usando PBMC del donante 2.

La Fig. 7 muestra la actividad de unión de mutantes de anticuerpo anti-CTLA-4 a CTLA-4 humano.

La Fig. 8 muestra la actividad de los mutantes del anticuerpo anti-CTLA-4 al bloquear la interacción entre CTAL-4 y B7.1 marcado con biotina.

La Fig. 9 muestra el efecto de los mutantes del anticuerpo anti-CTLA-4 sobre la secreción de IL-2 en un ensayo de estimulación de linfocitos T dependiente de SEB usando PBMC del donante 3.

La Fig. 10 muestra la actividad de unión del anticuerpo anti-CTLA-4 CL5 y sus mutantes al CTLA-4 humano o de cynomolgus como se mide por BiaCore.

La Fig. 11 muestra la actividad ADCCin vitrodel anticuerpo anti-CTLA-4 CL5 y su mutante en células CHO K1 -CTLA-4.

La Fig. 12 muestra el perfil de concentración sérica-tiempo del anticuerpo anti-CTLA-4 CL5 en ratones macho C57BL/6.

La Fig. 13 muestra la relación de tumor a suero de la concentración de HCAb anti-CTLA4.

Las Fig. 14A, 14B y 14C muestran la actividad antitumoral de los anticuerpos anti-CTLA-4 en ratones portadores de tumores MC38. (A) Curvas de crecimiento tumoral en diferentes grupos. (B) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de tiempo hasta el punto final. (C) Los pesos corporales de los ratones se mantuvieron relativamente constantes junto con el tratamiento con anticuerpos anti-CTLA-4 humanos. Los datos se expresaron como media EEM, N = 9. Las Fig. 15A y 15B muestran la inhibición del crecimiento tumoral mediante anticuerpos anti-CTLA-4 humanos en ratones portadores de MC38. (A) Curva de crecimiento tumoral. (B) Los pesos corporales de los ratones se mantuvieron relativamente constantes junto con el tratamiento con anticuerpos anti-CTLA-4 humanos. Los datos se expresaron como media EEM, N = 6.

Descripción detallada de la invención

Visión general

La descripción proporciona anticuerpos que se unen específicamente a CD152. Estas moléculas de unión pueden unirse específicamente a CD152 y a otra diana. La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de unión a CD152 a un paciente que lo necesita es útil para el tratamiento de ciertos trastornos, incluidos ciertos cánceres. La unión del anticuerpo a una célula T que expresa CD152 induce una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos contra una célula que expresa un antígeno asociado a un tumor. Las terapias de unión a CD152 de la descripción ofrecen diversas ventajas en el tratamiento de pacientes, por ejemplo, unión eficaz a CD152, inducción eficiente de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y/o un menor riesgo de eventos adversos (p. ej., toxicidad). En ciertos aspectos, los anticuerpos de unión a CD152 se unen a CD152 de manera más eficaz en ciertos formatos (p. ej., anticuerpo de cadena pesada solamente en comparación con un anticuerpo de longitud completa típico), lo que conduce a una mayor potencia y una utilidad mejorada en el tratamiento de trastornos asociados con CD152.

Definiciones

Los títulos de las secciones usados en la presente memoria tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito. En el caso de que uno o más de los documentos citados o partes de documentos definan un término que contradiga la definición de ese término en la solicitud, prevalecerá la definición que aparece en esta solicitud. Sin embargo, la mención de cualquier referencia, artículo, publicación, patente, publicación de patente y solicitud de patente citadas en este documento no debe considerarse, un reconocimiento ni ninguna forma de sugerencia de que constituyen un estado de la técnica anterior válido o forman parte del conocimiento general común en cualquier país del mundo.

En la presente descripción, se debe entender que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tales como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que los términos "un" y "una" tal como se usan en la presente memoria se refieren a "uno o más" de los componentes enumerados a menos que se indique lo contrario. El uso de la alternativa (p. ej., "o") debe entenderse como una, ambas o cualquier combinación de las alternativas. Tal como se usan en la presente memoria, los términos "incluir" y "comprender" se utilizan como sinónimos. Además, debe entenderse que los polipéptidos que comprenden las diversas combinaciones de los componentes (p. ej., dominios o regiones) y sustituyentes descritos en la presente memoria, se describen en la presente solicitud en la misma medida que si cada polipéptido se describiera individualmente. Por tanto, la selección de componentes particulares de polipéptidos individuales está dentro del alcance de la presente descripción.

El término "aproximadamente" y sus equivalentes gramaticales en relación con un valor numérico de referencia y sus equivalentes gramaticales como se usan en la presente memoria pueden incluir un intervalo de valores más o menos el 10 % de ese valor, tal como un intervalo de valores más o menos el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de ese valor. Por ejemplo, la cantidad "aproximadamente 10" incluye cantidades de 9 a 11.

Como se usa en la presente memoria, un "polipéptido" o "cadena polipeptídica" es una disposición única, lineal y contigua de aminoácidos unidos covalentemente. No incluye dos cadenas polipeptídicas que se unen de forma no lineal, como a través de un enlace disulfuro intracadenas (p. ej., una media molécula de inmunoglobulina en la que una cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro). Los polipéptidos pueden tener o formar uno o más enlaces disulfuro intracadena. Con respecto a los polipéptidos como se describen en la presente memoria, la referencia a residuos de aminoácidos correspondientes a los especificados por SEQ ID NO incluye modificaciones postraduccionales de dichos residuos.

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos de carbohidratos. La célula en la que se produce la proteína puede añadir carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos a una proteína, y variarán según el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente memoria en términos de sus estructuras principales de aminoácidos; los sustituyentes tales como grupos de carbohidratos generalmente no se especifican, pero no obstante pueden estar presentes.

El término "anticuerpo", "inmunoglobulina" o "Ig" se puede usar indistintamente en la presente memoria y significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fp), mutantes Fp (scFv) de cadena sencilla, anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos (incluidos anticuerpos de doble unión), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo" también puede referirse a una glicoproteína en forma de Y con un peso molecular de aproximadamente 150 kDa que está formada por cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas ligeras (L) y dos cadenas pesadas (H). Hay cinco tipos de isotipos de cadena pesada de Ig de mamíferos indicados por las letras griegas alfa (a), delta (5), épsilon (s), gamma (y) y mu (p). El tipo de cadena pesada define la clase de anticuerpo, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Las clases<y>y a se dividen a su vez en subclases según las diferencias en la secuencia y función del dominio constante. p. ej., IgG 1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. En los mamíferos existen dos tipos de cadenas ligeras de inmunoglobulinas, A y k.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que existen de forma natural y/o modificaciones posteriores a la traducción (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que se sintetizan mediante cultivo de hibridoma, sin estar contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (p. ej., Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (ver, p. ej., Patente de EE.UU n°. 4.816.567), tecnologías de visualización de fagos (ver, p. ej., Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a humanos en animales que tienen partes o todos los loci de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (ver, p. ej., las patentes internacionales WO 1998/24893;<w>O 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes de EE.UU. n2.5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Tal como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo de cadena pesada únicamente" (HCAb) se refiere a un anticuerpo que consiste únicamente en dos cadenas pesadas y carece de las dos cadenas ligeras que normalmente se encuentran en los anticuerpos de longitud completa.

El término "anticuerpo aislado", cuando se usa para describir los diversos anticuerpos descritos en la presente memoria, significa un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular a partir del cual se expresó. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que normalmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza superior al 95 % o 99 % según se determina, por ejemplo, mediante electroforética (p. ej., SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatográfica (p. ej., HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los métodos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, ver, p. ej., Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007). En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye anticuerpos in situ dentro de células recombinantes, porque al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Sin embargo, normalmente el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

El término ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una situación cromosómica que es diferente de su situación cromosómica natural.

Los términos "región variable de cadena ligera" (también denominada "dominio variable de cadena ligera" o "VL" o V<l>) y "región variable de cadena pesada" (también denominada como "dominio variable de cadena pesada" o "VH" o V<h>) se refieren a la región de unión variable de una cadena ligera y pesada de un anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión variables están formadas por subregiones discretas y bien definidas conocidas como "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) y "regiones marco" (FR), que generalmente comprenden en orden FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 del extremo amino al extremo carboxilo. En una realización, las FR están humanizadas. El término "CL" se refiere a una "región constante de cadena ligera de inmunoglobulina" o una "región constante de cadena ligera", es decir, una región constante de una cadena ligera de anticuerpo. El término "CH" se refiere a una "región constante de cadena pesada de inmunoglobulina" o una "región constante de cadena pesada", que es además divisible, dependiendo del isotipo del anticuerpo, en CH1, CH2 y CH3 (IgA, IgD, IgG), o Dominios CH1, CH2, CH3 y CH4 (IgE, IgM). Un "Fab" (fragmento de unión a antígeno) es la parte de un anticuerpo que se une a antígenos e incluye la región variable y el dominio CH1 de la cadena pesada unida a la cadena ligera mediante un enlace disulfuro entre cadenas.

Como se usa en la presente memoria, el término "dominio de unión" o "región de unión" se refiere al dominio, región, porción o sitio de una proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido o anticuerpo o dominio de unión derivado de un anticuerpo que posee la capacidad de reconocer y unirse específicamente a una molécula diana, como un antígeno, ligando, receptor, sustrato o inhibidor (p. ej., CD152). Los dominios de unión ejemplares incluyen regiones variables de anticuerpos monocatenarios (p. ej., anticuerpos de dominio, sFv, scFv, scFab), ectodominios del receptor y ligandos (p. ej., citocinas, quimiocinas). En determinadas realizaciones, el dominio de unión comprende o consiste en un sitio de unión a antígeno (p. ej., que comprende una secuencia de cadena pesada variable y una secuencia de cadena ligera variable o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera y tres CDR de cadena pesada de un anticuerpo situado en regiones marco alternativas (FR) (p. ej., FR humanas que comprenden opcionalmente una o más sustituciones de aminoácidos). Se conocen diversos ensayos para identificar dominios de unión de la presente descripción que se unen específicamente a una diana particular, incluidos Western blot, ELISA, detección de bibliotecas de presentación en fagos y análisis de interacción BIACORE®. Como se usa en la presente memoria, un "dominio de unión a CD152" puede tener regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina que comprenden tres CDR de cadena pesada: CDR1, CDR2 y CDR3.

Un anticuerpo o dominio de unión "se une específicamente" a una diana si se une a la diana con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación de equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) igual o mayor que 105 M-1, aunque no se une significativamente a otros componentes presentes en una muestra de prueba. Los anticuerpos o dominios de unión se pueden clasificar como anticuerpos o dominios de unión de "alta afinidad" y anticuerpos o dominios de unión de "baja afinidad". Los anticuerpos o dominios de unión de "alta afinidad" se refieren a aquellos anticuerpos o dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, o al menos 1013 M-1. Los anticuerpos o dominios de unión de "baja afinidad" se refieren a aquellos anticuerpos o dominios de unión con una Ka de hasta 107 M-1, hasta 106 M-1, hasta 105 M-1. Alternativamente, la afinidad se puede definir como una constante de disociación de equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (p. ej., 10-5 M a 10-13 M). En el caso de que un anticuerpo se una a un antígeno, Ka = 1/Kd. Las afinidades de anticuerpos o dominios de unión según la presente descripción se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales, tales como resonancia de plasmones superficiales (ver, p. ej., Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; y Patentes de EE.UU. n°. 5.283.173, 5.468.614, o su equivalente).

Como se usa en la presente memoria, "CD152" se refiere al grupo de diferenciación 152, que también se conoce como proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). Los términos "CD152", "CTLA-4" y "CTLA4" se usan indistintamente en el presente documento. De manera similar, "anti-CD152", "anti-CTLA-4", "anti-CTLA4" también se usan indistintamente en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "CD80" se refiere al grupo de diferenciación 80, que es una proteína que se encuentra en células dendríticas, células B activadas y monocitos que proporciona una señal coestimuladora necesaria para la activación y supervivencia de las células T. Los términos "CD80", "B7-1" y "B7.1" se utilizan indistintamente en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, "CD86" se refiere al grupo de diferenciación 86, que es una proteína expresada en células presentadoras de antígenos que proporciona señales coestimuladoras necesarias para la activación y supervivencia de las células T. Los términos "CD86", "B7-2" y "B7.2" se usan indistintamente en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, una "sustitución conservadora" se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Son bien conocidas en la técnica sustituciones conservadoras ejemplares(ver, p.ej,patente internacional WO 97/09433, página 10, publicado el 13 de marzo de 1997; Lehninger, Biochemistry, segunda edición; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), págs. 71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, Nueva York y Cell Press, Cambridge, MA (1990), pág. 8). En determinadas realizaciones, una sustitución conservadora incluye una sustitución de leucina por serina.

Como se usa en la presente memoria, "análogo de ipilimumab" se refiere a un anticuerpo monoclonal, que se une específicamente a CTLA-4, que comprende una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO.: 199 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 200.

Tal como se usa en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario, cualquier nombre no patentado o genérico de un producto biológico incluye el producto biológico y cualquier producto biosimilar del mismo. Por ejemplo, la denominación no patentada, ipilimumab, se refiere al producto biológico vendido bajo el nombre comercial YERVOY; también incluye cualquier producto biosimilar del producto biológico.

Como se usa en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario, el término "producto biosimilar" se refiere a 1) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un producto de referencia; 2) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos diferente (p. ej., truncamientos N o C terminales) de un producto de referencia; o 3) un producto biológico que tiene una modificación postraduccional diferente (p. ej., glicosilación o fosforilación) de un producto de referencia, en donde el producto biosimilar y el producto de referencia utilizan el mismo mecanismo o mecanismos de acción para la prevención, tratamiento o cura de una enfermedad o condición.

Como se usa en la presente memoria, el término "derivado" se refiere a una modificación de uno o más residuos de aminoácidos de un péptido por medios químicos o biológicos, ya sea con o sin una enzima. p. ej., por glicosilación, alquilación, acilación, formación de éster o formación de amida.

Como se usa en la presente memoria, un polipéptido o secuencia de aminoácidos "derivada de" un polipéptido o proteína designado se refiere al origen del polipéptido. En ciertas realizaciones, el polipéptido o secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia particular (a veces denominada secuencia "de partida" o "madre" o "parental") tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de partida o una porción de la misma, en donde la porción consiste en al menos 10-20 aminoácidos, al menos 20-30 aminoácidos, o al menos 30-50 aminoácidos, o al menos 50-150 aminoácidos, o que de otro modo es identificable para un experto en la técnica por tener su origen en la secuencia de partida. Por ejemplo, un dominio de unión puede derivarse de un anticuerpo, p. ej., un Fab, F(ab')2, Fab', scFv, anticuerpo de dominio único (sdAb), etc.

Los polipéptidos derivados de otro polipéptido pueden tener una o más mutaciones con respecto al polipéptido de partida, p. ej., uno o más residuos de aminoácidos que han sido sustituidos con otro residuo de aminoácido o que tiene una o más inserciones o eliminaciones de residuos de aminoácidos. El polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que no existe de forma natural. Dichas variaciones tienen necesariamente menos del 100 % de identidad o similitud de secuencia con el polipéptido de partida. En una realización, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 60 % a menos de 100 % de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de partida. En otra realización, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 75 % a menos del 100 %, de aproximadamente el 80 % a menos del 100 %, de aproximadamente el 85 % a menos del 100 %, de aproximadamente el 90 % a menos del 100 %, de aproximadamente el 95 % a menos del 100 % de identidad o similitud de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de partida.

Como se usa en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario, una posición de un residuo de aminoácido en una región variable de una molécula de inmunoglobulina se numera según la convención de numeración IMGT (Brochet, X et al., Nucl. Acid Res. (2008) 36, W503-508) y la posición de un residuo de aminoácido en una región constante de una molécula de inmunoglobulina está numerada según la nomenclatura de la UE (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94). Se conocen en la técnica otras convenciones de numeración (p. ej., la convención de numeración de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Bethesda, MD: Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud (1991)).

Como se usa en la presente memoria, el término anticuerpo "humano" se refiere a un anticuerpo de origen humano o un anticuerpo humanizado.

Como se usa en la presente memoria, el término "humanizado" se refiere a un proceso de elaboración de proteínas y polipéptidos que se unen a un anticuerpo o inmunoglobulina derivados de una especie no humana (p. ej., ratón o rata) menos inmunogénico para los humanos, aunque conserva las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo original, utilizando técnicas de ingeniería genética. En algunas realizaciones, el (los) dominio(s) de unión de un anticuerpo o proteínas y polipéptidos de unión a inmunoglobulina (p. ej., regiones variables de cadena ligera y pesada, Fab, scFv) están humanizadas. Los dominios de unión no humanos se pueden humanizar usando técnicas conocidas como injerto de CDR (Jones et al., Nature 321:522 (1986)) y sus variantes, incluida la "remodelación" (Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), "hiperquimerización" (Queen et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154), y "recubrimiento" (Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies". En: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potencial. Nueva York: Plenum Press, 1994: 291-312). Si se derivan de una fuente no humana, también se pueden humanizar otras regiones del anticuerpo o proteínas y polipéptidos de unión a inmunoglobulina, tales como la región bisagra y los dominios de la región constante.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "paciente que necesita" o "sujeto que necesita" se refiere a un paciente o un sujeto en riesgo de, o que padece, una enfermedad, trastorno o condición que es susceptible de tratamiento o mejora con un anticuerpo de unión a CD152 o una composición del mismo proporcionada en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que generalmente no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas graves cuando se administran usando rutas bien conocidas en la técnica. Las entidades moleculares y composiciones aprobadas por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumeradas en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos, se consideran "farmacéuticamente aceptables".

Tal como se usa en la presente memoria, el término "tratamiento", "tratar" o "mejorar" se refiere a un tratamiento terapéutico o a un tratamiento profiláctico/preventivo. Un tratamiento es terapéutico si al menos un síntoma de una enfermedad en un individuo que recibe tratamiento mejora o un tratamiento puede retrasar el empeoramiento de una enfermedad progresiva en un individuo, o prevenir la aparición de enfermedades asociadas adicionales.

Como se usa en la presente memoria, el término "cantidad (o dosis) terapéuticamente eficaz" o "cantidad (o dosis) eficaz" de una molécula o compuesto de unión específica se refiere a esa cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado la mejora de uno o más síntomas de la enfermedad a tratar de manera estadísticamente significativa o una mejora estadísticamente significativa en la función del órgano. Cuando se hace referencia a un ingrediente activo individual, administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se hace referencia a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea administrado en serie o simultáneamente (en la misma formulación o simultáneamente en formulaciones separadas).

Como se usan en la presente memoria, los términos "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a un proceso mediado por células en el que células citotóxicas no específicas que expresan FcyR (p. ej., células monocíticas tales como células asesinas naturales (NK) y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido (u otra proteína capaz de unirse a los FcyR) en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. En principio, cualquier célula efectora con un FcyR activador puede activarse para mediar en ADCC. Las células primarias para mediar en ADCC son las células NK, que expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos, dependiendo de su estado de activación, localización o diferenciación, pueden expresar FcyRI, FcyRII y FcyRIII. Para una revisión de la expresión de FcyR en células hematopoyéticas, ver, p. ej., Ravetch y col., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "promotor" se refiere a una región del ADN implicada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

Como se usan en la presente memoria, los términos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico" o "polinucleótido" se refieren a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limiten específicamente, los términos abarcan ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos que existen de forma natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc y ARNm codificados por un gen. Tal como se usan en la presente memoria, los términos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico" o "polinucleótido" pretenden incluir moléculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (p. ej., ARNm), análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos, y derivados, fragmentos y homólogos de los mismos.

El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto codificado por un ácido nucleico. Por ejemplo, en el caso de un segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés, la expresión implica la transcripción del segmento de ácido nucleico en ARNm y la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos.

Los términos "unidad de expresión" y "casete de expresión" se usan indistintamente en la presente memoria y denotan un segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés y capaz de proporcionar la expresión del segmento de ácido nucleico en una célula huésped. Una unidad de expresión normalmente comprende un promotor de la transcripción, un marco de lectura abierto que codifica el polipéptido de interés y un terminador de la transcripción, todos en una configuración operativa. Además de un promotor y terminador transcripcional, una unidad de expresión puede incluir además otros segmentos de ácido nucleico tales como, p. ej., un potenciador o una señal de poliadenilación.

El término "vector de expresión", como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico, lineal o circular, que comprende una o más unidades de expresión. Además de una o más unidades de expresión, un vector de expresión también puede incluir segmentos de ácido nucleico adicionales tales como, por ejemplo, uno o más orígenes de replicación o uno o más marcadores seleccionables. Los vectores de expresión generalmente se derivan de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos.

Como se usa en la presente memoria, el término "identidad de secuencia" se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polinucleótidos o entre dos o más secuencias de polipéptidos. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por la misma base de ácido nucleico o residuo de aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia comparadora, se dice que las secuencias son "idénticas" en esa posición. El porcentaje de "identidad de secuencia" se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones "idénticas". Luego, el número de posiciones "idénticas" se divide por el número total de posiciones en la ventana de comparación y se multiplica por 100 para proporcionar el porcentaje de "identidad de secuencia". El porcentaje de "identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación. La ventana de comparación para secuencias de ácidos nucleicos puede ser, por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 o más ácidos nucleicos de longitud. La ventana de comparación para secuencias polipeptídicas puede ser, por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 o más aminoácidos de longitud. Para alinear de manera óptima las secuencias para comparación, la porción de una secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones denominadas espacios mientras la secuencia de referencia se mantiene constante. Un alineamiento óptimo es aquel alineamiento que, incluso con espacios, produce el mayor número posible de posiciones "idénticas" entre las secuencias de referencia y de comparación. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se puede determinar usando la versión del programa "BLAST 2 Sequences" que estaba disponible en el Centro Nacional de Información Biotecnológica a partir del 1 de septiembre de 2004, programa que incorpora los programas BLASTN (para comparación de secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para comparación de secuencias de polipéptidos), cuyos programas se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Cuando se utiliza "BLAST 2 Sequences", los parámetros que eran parámetros predeterminados a partir del 1 de septiembre de 2004 se pueden usar para tamaño de palabra (3), penalización por espacio abierto (11), penalización por extensión del espacio (1), eliminación de espacio (50), valor esperado (10) y cualquier otro parámetro requerido, que incluye, pero no se limita a, la opción de matriz. Se considera que dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos tienen una "identidad de secuencia sustancialmente similar" o una "identidad de secuencia sustancial" si las dos secuencias tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia entre sí.

Anticuerpos

En la presente memoria se describen anticuerpos monoclonales humanos que comprenden un dominio de unión a CD152. Los anticuerpos son anticuerpos de cadena pesada únicamente. Los anticuerpos consisten en sólo dos cadenas pesadas. Los anticuerpos no contienen cadenas ligeras. Los anticuerpos pueden unirse específicamente a CD152. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales aislados que se unen específicamente a CD152 con alta afinidad.

Los anticuerpos anti-CD152 descritos en la presente memoria pueden unirse específicamente al CD152 humano. En algunos casos, los anticuerpos anti-CD152 pueden unirse al CD152 humano con alta afinidad (p. ej., K<d><6,0*10-11 M). Los anticuerpos anti-CD152 pueden tener una afinidad comparable o mayor por CTLA-4 en comparación con un análogo de ipilimumab. Los anticuerpos anti-CD152 también pueden bloquear la unión de CD152 a sus ligandos B7.1. Los anticuerpos anti-CD152 pueden tener una relación tumor/suero periférico mejorada que el análogo de ipilimumab. Los anticuerpos anti-CD152 pueden inducir una ADCC superior, por ejemplo, los anticuerpos pueden inducir al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, o al menos aproximadamente 20 veces el aumento de la actividad de lisis por células NK.

Los anticuerpos anti-CD152 pueden comprender un dominio de unión a CD152, que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Los anticuerpos anti-CD152 también pueden comprender CDR1, CDR2 y CDR3 que difieren de aquellos de los anticuerpos anti-CD152 descritos en la presente memoria por una o más modificaciones conservadoras. Se entiende en la técnica que se pueden realizar ciertas modificaciones de secuencia conservadoras que no eliminan la unión al antígeno. Ver, p. ej., Brummell et al., 1993, Biochem 32:1180-8; de Wildt et al., 1997, Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al., 1997, J. Biol. Chem.

272:26864-26870; Hall et al., 1992, J. Immunol. 149:1605-12; Kelley y O'Connell, 1993, Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al., 1998, Int. Immunol. 10:341 -6 y Beers et al., 2000, Clin. Can. Res. 6:2835-43.

Composiciones y formulaciones farmacéuticas

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más anticuerpos anti-CD152 descritos en la presente memoria formulados junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Se dice que un excipiente es un "excipiente farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por el paciente receptor. Los excipientes que se pueden usar incluyen vehículos, agentes tensioactivos, agentes espesantes o emulsionantes, aglutinantes sólidos, auxiliares de dispersión o suspensión, solubilizantes, colorantes, agentes aromatizantes, recubrimientos, agentes desintegrantes, lubricantes, edulcorantes, conservantes, agentes isotónicos y combinaciones de los mismos. La selección y uso de excipientes adecuados se enseña en Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed. (Lippincott Williams y Wilkins 2003), y en Gennaro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19a ed. 1995). La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de excipiente farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones pueden incluir además uno o más vehículos, diluyentes, conservantes, solubilizantes, agentes tampón, albúmina para evitar la pérdida de proteínas en las superficies de los viales, etc.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material de transporte para producir una forma de dosificación única puede variar dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración y generalmente puede ser esa cantidad de composición farmacéutica que produce un efecto terapéutico. Generalmente, la cantidad de ingrediente activo puede oscilar de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 99 % (p/p) de la composición, por ejemplo, puede ser aproximadamente 0,1 %-1 %, aproximadamente 0,1 %-5 %, aproximadamente 0,1-10 %, aproximadamente 0,1 %-20 %, aproximadamente 0,5 %-1 %, aproximadamente 0,5 %-5 %, aproximadamente 0,5 %-10 %, aproximadamente 0,5 %-20 %, aproximadamente 1 %-5 %, aproximadamente 1 %-10 %, aproximadamente 1 %-20 %, aproximadamente 5 %-10 %, aproximadamente 5 %-20 %, aproximadamente 10 %-20 %, aproximadamente 10 %-30 %, aproximadamente 20 %-30 %, aproximadamente 20 %-40 %, aproximadamente 30 %-40 %, aproximadamente 30 %-50 %, aproximadamente 40 %-50 %, aproximadamente 40 %-60 %, aproximadamente 50 %-60 %, aproximadamente 50 %-70 %, aproximadamente 60 %-70 %, aproximadamente 60 %-80 %, aproximadamente 70 %-80 %, aproximadamente 70 %-90 %, aproximadamente 80 %-90 %, aproximadamente 80 %-95 %, o 95 %-99 % de la composición farmacéutica. Preferiblemente, la cantidad de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 70 %, y lo más preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 30 % de la composición farmacéutica.

La composición farmacéutica puede ser adecuada para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el ingrediente activo puede estar recubierto de un material para protegerlo de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivarlo. La frase "administración parenteral" como se usa en la presente memoria significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Alternativamente, un anticuerpo de la invención se puede administrar mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. p. ej., por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La composición farmacéutica puede estar en forma de disoluciones o dispersiones acuosas estériles. La composición farmacéutica también se puede formular en una microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco.

La composición farmacéutica se puede formular en una forma de dosificación seleccionada del grupo que consiste en: una forma de dosificación unitaria oral, una forma de dosificación unitaria intravenosa, una forma de dosificación unitaria intranasal, una forma de dosificación unitaria de supositorio, una forma de dosificación unitaria intradérmica, una forma de dosificación unitaria intramuscular, una forma de dosificación unitaria intraperitoneal, una forma de dosificación unitaria subcutánea, una forma de dosificación unitaria epidural, una forma de dosificación unitaria sublingual y una forma de dosificación unitaria intracerebral. La forma de dosificación unitaria oral se puede seleccionar del grupo que consiste en: comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, polvos, pastillas para chupar, gránulos, disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires, formulaciones de liberación sostenida, aerosoles y atomizadores.

La composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Ver, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria se pueden formular para garantizar una distribución adecuadain vivo.Por ejemplo, para garantizar que el anticuerpo terapéutico de la invención cruce la barrera hematoencefálica, se pueden formular en liposomas, que pueden comprender adicionalmente restos de direccionamiento para mejorar el transporte selectivo a células u órganos específicos. Ver, p. ej. las patentes de EE.UU. n2.4.522.811; 5.374.548; 5.416.016; y 5.399.331; V. V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., 1995, FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al., 1995, Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen y Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346:123; y Killion y Fidler, 1994, Inmunomethods 4:273.

La composición farmacéutica puede contener opcionalmente uno o más ingredientes farmacéuticamente activos adicionales, tales como otro anticuerpo o un fármaco. Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en una terapia de combinación con, por ejemplo, otro agente anticancerígeno, otro agente antiinflamatorio o una vacuna.

Las composiciones farmacéuticas se pueden suministrar como un kit que comprende un recipiente que comprende la composición farmacéutica como se describe en la presente memoria. Una composición farmacéutica se puede proporcionar, por ejemplo, en forma de una disolución inyectable para dosis únicas o múltiples, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Alternativamente, dicho kit puede incluir un dispersor de polvo seco, un generador de aerosol líquido o un nebulizador para la administración de una composición farmacéutica. Un kit de este tipo puede comprender además información escrita sobre las indicaciones y el uso de la composición farmacéutica.

Métodos de tratamiento

Además se describe en la presente memoria un método para tratar un trastorno mediante la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o la composición farmacéutica descrita en la presente memoria. Los anticuerpos anti-CD152 descritos en la presente memoria se pueden usar en un método para tratar a un sujeto (por ejemplo, un ser humano o un primate no humano) o para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto. Generalmente, dichos métodos incluyen la administración a un sujeto que necesita dicho tratamiento unos anticuerpos anti-CD152 como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos anti-CD152 descritos en la presente memoria se pueden usar en un método para tratar a un sujeto (por ejemplo, un ser humano o un primate no humano) o para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto. Generalmente, dichos métodos incluyen administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento un anticuerpo anti-CD152 como se describe en la presente memoria. El anticuerpo anti-CD152 comprende la función efectora de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y opcionalmente citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), de manera que el anticuerpo anti-CD152 induce la ADCC y opcionalmente la CDC contra células que expresan CD152 en el sujeto.

También se describe en la presente memoria un método para tratar un trastorno caracterizado por la sobreexpresión de un antígeno tumoral, tal como el cáncer. Ejemplos de antígenos tumorales que pueden ser reconocidos por un anticuerpo anti-CD152 biespecífico pueden incluir PSMA, CD19, CD20, CD37, Cd 38, CD123, Her2, ROR1, RON, antígeno de glicoproteína A33 (gpA33) y CEA. Generalmente, dichos métodos incluyen administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD152 que comprende un segundo dominio de unión que se une a un antígeno tumoral como se describe en la presente memoria. El anticuerpo anti-CD152 puede inducir citotoxicidad de células T redirigidas (RTCC) contra células que expresan antígenos tumorales en el sujeto.

El método se puede usar para tratar cánceres tales como cáncer de próstata, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de glándulas salivales, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de células no pequeñas, melanoma, cáncer de mama (p. ej., cáncer de mama triple negativo), cáncer suprarrenal, linfoma de células del manto, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfoma no de Hodgkin, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide B, neoplasia dendrítica plasmocitoide blástica (BPDCN) y leucemia de células pilosas.

Los sujetos para la administración de los anticuerpos anti-CD152 como se describe en la presente memoria incluyen pacientes con alto riesgo de desarrollar un trastorno particular, así como pacientes que presentan dicho trastorno existente. Normalmente, al sujeto se le ha diagnosticado el trastorno para el que se busca tratamiento. Además, se puede monitorizar a los sujetos durante el curso del tratamiento para detectar cualquier cambio en el trastorno (p. ej., por un aumento o disminución de los síntomas clínicos del trastorno). Además, en algunas variaciones, el sujeto no padece otro trastorno que requiera tratamiento que implique dirigirse a células que expresan CD152.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un paciente susceptible a, o en riesgo de sufrir, un trastorno particular en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo o retrasar la aparición del trastorno. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se pueden administrar a un paciente que se sospecha que padece dicho trastorno o que ya lo padece en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas del trastorno y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se denomina dosis o cantidad terapéuticamente eficaz. Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, los agentes se pueden administrar en varias dosis hasta que se logre una respuesta suficiente. Por lo general, se monitoriza la respuesta y se administran dosis repetidas si la respuesta deseada comienza a desvanecerse.

Para identificar pacientes sujetos para el tratamiento según los métodos de la descripción, se pueden emplear métodos de cribado aceptados para determinar factores de riesgo asociados con trastornos específicos o para determinar el estado de un trastorno existente identificado en un sujeto. Dichos métodos pueden incluir, por ejemplo, determinar si un individuo tiene familiares a quienes se les ha diagnosticado un trastorno en particular. Los métodos de cribado también pueden incluir, por ejemplo, exámenes convencionales para determinar el estado familiar de un trastorno particular que se sabe que tiene un componente hereditario. Por ejemplo, también se sabe que varios cánceres tienen ciertos componentes hereditarios. Los componentes hereditarios de los cánceres incluyen, por ejemplo, mutaciones en múltiples genes que se transforman (p. ej., Ras, Raf, EGFR, cMet y otros), la presencia o ausencia de ciertas moléculas HLA y del receptor inhibidor asesino (KIR), o mecanismos mediante los cuales las células cancerígenas pueden modular la supresión inmune de células como las células NK y células T, ya sea directa o indirectamente (ver, p. ej., Ljunggren y Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton y Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007). Con este fin, se pueden emplear de forma rutinaria sondas de nucleótidos para identificar individuos que portan marcadores genéticos asociados con un trastorno de interés particular. Además, en la técnica se conoce una amplia variedad de métodos inmunológicos que son útiles para identificar marcadores de un trastorno específico. Por ejemplo, se encuentran disponibles y son bien conocidos en la técnica diversos métodos de inmunoensayo ELISA que emplean sondas de anticuerpos monoclonales para detectar antígenos asociados con tumores específicos. El cribado se puede implementar según lo indicado por la sintomatología conocida del paciente, factores de edad, factores de riesgo relacionados, etc. Estos métodos permiten al médico seleccionar de forma rutinaria a los pacientes que necesitan los métodos descritos en la presente memoria para el tratamiento. De acuerdo con estos métodos, el direccionamiento a células patológicas que expresan antígenos tumorales se puede implementar como un programa de tratamiento independiente o como un régimen de tratamiento de seguimiento, complementario o coordinado de otros tratamientos.

La determinación de dosis eficaces en este contexto generalmente se basa en estudios de modelos animales seguidos de ensayos clínicos en humanos y se guía mediante la determinación de dosis eficaces y protocolos de administración que reducen significativamente la aparición o gravedad del trastorno en cuestión en sujetos modelo. Las dosis eficaces de las composiciones de la presente descripción varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluidos los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados, si el tratamiento es profiláctico o terapéutico, así como la actividad específica de la propia composición y su capacidad para provocar la respuesta deseada en el individuo. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero en algunas enfermedades, el paciente puede ser un mamífero no humano. Normalmente, los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar una respuesta terapéutica óptima, es decir, para optimizar la seguridad y eficacia. Por consiguiente, una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto colateral no deseado es compensado por los efectos beneficiosos de la administración de un anticuerpo anti-CD152 como se describe en la presente memoria. Para la administración de un anticuerpo anti-CD152, una dosis puede variar de aproximadamente 0,1 pg a 100 mg/kg o de 1 pg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, y más habitualmente de 10 pg a 5 mg/kg del peso corporal del sujeto. En realizaciones más específicas, una cantidad eficaz del agente está entre aproximadamente 1 pg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, entre aproximadamente 10 pg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, o entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg. Las dosis dentro de este intervalo se pueden lograr mediante administraciones únicas o múltiples, incluidas, p. ej., administraciones múltiples por día o administraciones diarias, semanales, quincenales o mensuales. Por ejemplo, en ciertas variaciones, un régimen consiste en una administración inicial seguida de múltiples administraciones posteriores a intervalos semanales o quincenales. Otro régimen consiste en una administración inicial seguida de múltiples administraciones posteriores a intervalos mensuales o bimensuales. Alternativamente, las administraciones pueden realizarse de forma irregular, según lo indique el seguimiento de los síntomas clínicos del trastorno.

El médico tratante puede variar la dosis de la composición farmacéutica para mantener una concentración deseada en un sitio diana. Por ejemplo, si se selecciona un modo de administración intravenoso, la concentración local del agente en el torrente sanguíneo en el tejido diana puede estar entre aproximadamente 0,01 - 50 nanomoles de la composición por litro, a veces entre aproximadamente 1,0 nanomol por litro y 10, 15 o 25 nanomoles por litro dependiendo del estado del sujeto y la respuesta medida proyectada. Se pueden seleccionar concentraciones más altas o más bajas en base al modo de administración, p. ej., administración transepidérmica frente a administración a una superficie mucosa. La dosis también debe ajustarse en base a la velocidad de liberación de la formulación administrada, p. ej., aerosol nasal frente a polvo, partículas orales o inyectadas de liberación sostenida, formulaciones transdérmicas, etc. Para lograr el mismo nivel de concentración sérica, por ejemplo, se administrarían partículas de liberación lenta con una velocidad de liberación de 5 nanomolar (en condiciones estándar) en aproximadamente el doble de la dosis de partículas con una velocidad de liberación de 10 nanomolar.

El agente terapéutico anti-CD152 (p. ej., anticuerpo anti-CD152) también se puede administrar en una dosis diaria de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 miligramos (mg) por kilogramo (mpk) de peso corporal, preferiblemente administrado como una dosis diaria única o en dosis divididas de aproximadamente dos a seis veces al día. Para la administración a un paciente humano adulto, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede administrar en dosis en el intervalo de 0,2 mg a 800 mg por dosis, que incluyen, pero no se limitan a, 0,2 mg por dosis, 0,5 mg por dosis, 1 mg por dosis, 5 mg por dosis, 10 mg por dosis, 25 mg por dosis, 100 mg por dosis, 200 mg por dosis y 400 mg por dosis, y se pueden administrar múltiples dosis diarias, generalmente consecutivas, en un curso de tratamiento. El agente terapéutico anti-CD 152 se puede administrar en diferentes momentos del día. En una realización, la dosis terapéutica óptima se puede administrar por la noche. En otra realización, la dosis terapéutica óptima se puede administrar por la mañana. La dosis diaria total del agente terapéutico anti-CD152 puede, por lo tanto, en una realización, oscilar de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2 g, y a menudo oscila de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1,5 g y con la mayor frecuencia oscila de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 1200 mg. En el caso de un ser humano adulto típico de 70 kg, la dosis diaria total del agente terapéutico anti-CD152 puede oscilar de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 1200 mg y a menudo oscilará, como se indicó anteriormente, de aproximadamente 0,2 mg a aproximadamente 800 mg.

Los regímenes de dosificación también se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Alternativamente, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente.

Para la administración del anticuerpo, la dosis puede oscilar de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-CD152 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, administrándose el anticuerpo usando uno de los siguientes programas de dosificación: (i) cada cuatro semanas durante seis dosis, luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 pg/ml y en algunos métodos de aproximadamente 25-300 pg/ml.

Una "dosis terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-CD152 de la invención preferiblemente da como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido al sufrimiento por la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de sujetos portadores de tumores, una "dosis terapéuticamente eficaz" inhibe preferiblemente el crecimiento del tumor en al menos aproximadamente un 20 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 40 %, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente un 60 %, y todavía más preferiblemente en al menos aproximadamente un 80 % con respecto a los sujetos no tratados. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o mejorar de otro modo los síntomas en un sujeto, que normalmente es un ser humano o puede ser otro mamífero.

En particular con respecto al tratamiento de tumores sólidos, los protocolos para evaluar los criterios de valoración y la actividad antitumoral son bien conocidos en la técnica. Si bien cada protocolo puede definir las evaluaciones de la respuesta tumoral de manera diferente, los criterios RECIST (Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos) se consideran actualmente las pautas recomendadas para la evaluación de la respuesta tumoral por el Instituto Nacional del Cáncer (ver Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000). Según los criterios RECIST, la respuesta tumoral significa una reducción o eliminación de todas las lesiones o metástasis medibles. La enfermedad generalmente se considera medible si comprende lesiones que pueden medirse con precisión en al menos una dimensión como > 20 mm con técnicas convencionales o > 10 mm con tomografía computarizada en espiral con márgenes claramente definidos mediante fotografía médica o rayos X, tomografía axial computarizada (TC), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) o examen clínico (si las lesiones son superficiales). Enfermedad no medible significa que la enfermedad se compone de lesiones < 20 mm con técnicas convencionales o < 10 mm con tomografía computarizada en espiral, y lesiones verdaderamente no medibles (demasiado pequeñas para medir con precisión). La enfermedad no medible incluye derrames pleurales, ascitis y enfermedades documentadas mediante evidencia indirecta.

Los criterios de estado objetivo son necesarios para que los protocolos evalúen la respuesta del tumor sólido. Los criterios representativos incluyen los siguientes: (1) respuesta completa (CR), definida como la desaparición completa de toda enfermedad medible; sin nuevas lesiones; sin síntomas relacionados con la enfermedad; no hay evidencia de enfermedad no medible; (2) respuesta parcial (PR) definida como una disminución del 30 % en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana (3) enfermedad progresiva (PD), definida como un aumento del 20 % en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana o la aparición de cualquier lesión nueva; (4) estable o sin respuesta, definido como no cualificado para CR, PR o enfermedad progresiva. (Ver Therasse et al.,supra.)

Los criterios de valoración adicionales que se aceptan dentro de la técnica de la oncología incluyen la supervivencia general (OS), la supervivencia libre de enfermedad (DFS), la tasa de respuesta objetiva (ORR), el tiempo hasta la progresión (TTP) y la supervivencia libre de progresión (PFS) (ver Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics, Abril de 2005, Centro para la Evaluación e Investigación de Medicamentos, FDA, Rockville, MD.)

Los anticuerpos anti-CD152 se pueden usar para suprimir las vías de señalización mediadas por CTLA-4 que regulan negativamente las respuestas inmunes y, por lo tanto, mejorar las respuestas inmunes específicas del tumor, ya sea como monoterapia o en combinación con anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 u otros medicamentos contra el cáncer.

Métodos de preparación de anticuerpos

Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser un anticuerpo humano de cadena pesada únicamente (HCAb) generado a partir de ratones humanizados Harbour (patentes de EE.UU. n°s. 9.353.179, 9.346.877 y 8.921.522, y las patentes europeas n°s. 1776383 y 1864998). Las moléculas producidas por los ratones HCAb pueden ser solubles y pueden tener afinidades, diversidad y/o propiedades fisicoquímicas comparables a los anticuerpos IgG humanos tradicionales.

La preparación de HCAb a partir de ratones HCAb puede facilitar la generación de dominios VH humanos solubles, la unidad mínima de reconocimiento de inmunoglobulinas y, por tanto, la construcción de nuevas moléculas multifuncionales que comprenden múltiples dominios VH o dominio(s) VH acoplado(s) a otras moléculas, tales como como biespecíficos, conjugados de fármaco-anticuerpo o moléculas diagnósticas o terapéuticas derivadas del dominio VH.

Los anticuerpos anti-CD152 también se pueden preparar usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias V<h>del anticuerpo anti-CD152 descrito en la presente memoria como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado. Un anticuerpo se puede diseñar modificando uno o más residuos dentro de las regiones variables (es decir, V<h>y/o V<l>), por ejemplo dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. Adicional o alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo modificando residuos dentro de la(s) región(ones) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) función(ones) efectora(s) del anticuerpo.

Las moléculas de polinucleótidos que comprenden una secuencia de polinucleótidos deseada se pueden propagar colocando la molécula en un vector. Se pueden utilizar vectores virales y no virales, incluidos plásmidos. La elección del plásmido dependerá del tipo de célula en la que se desea la propagación y del propósito de la propagación. Ciertos vectores son útiles para amplificar y producir grandes cantidades de la secuencia de ADN deseada. Otros vectores son adecuados para la expresión en células en cultivo. Otros vectores más son adecuados para la transferencia y expresión en células de un animal o de una persona entera. La elección del vector apropiado está dentro de los conocimientos de la técnica. Muchos de estos vectores están disponibles comercialmente. El polinucleótido de longitud parcial o completa se inserta en un vector típicamente mediante unión de ADN ligasa a un sitio de enzima de restricción escindido en el vector. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos deseada se puede insertar mediante recombinación homólogain vivo.Normalmente, esto se logra uniendo regiones de homología al vector en los flancos de la secuencia de nucleótidos deseada. Las regiones de homología se añaden mediante ligado de oligonucleótidos o mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores que comprenden tanto la región de homología como una porción de la secuencia de nucleótidos deseada, por ejemplo.

Para la expresión, se puede emplear un casete o sistema de expresión. Para expresar un ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria, se introduce en una célula huésped una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, operativamente unida a secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión. Además de las secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras de la traducción y un gen marcador que sea adecuado para la selección de células que portan el vector de expresión. El producto génico codificado por un polinucleótido de la descripción se expresa en cualquier sistema de expresión conveniente, incluidos, por ejemplo, sistemas bacterianos, de levaduras, insectos, anfibios y mamíferos. En el vector de expresión, el polinucleótido que codifica el polipéptido está unido a una secuencia reguladora según sea apropiado para obtener las propiedades de expresión deseadas. Estos pueden incluir promotores, potenciadores, terminadores, operadores, represores e inductores. Los promotores pueden ser regulados (p. ej., el promotor del vector pIND inducible por esteroides (Invitrogen)) o constitutivo (p. ej., promotores de secuencias CMV, SV40, factor de alargamiento o LTR). Estos se unen a la secuencia de nucleótidos deseada usando las técnicas descritas anteriormente para el enlace a vectores. Se puede usar cualquier técnica conocida en la técnica. Por consiguiente, el vector de expresión generalmente proporcionará una región de iniciación transcripcional y traduccional, que puede ser inducible o constitutiva, donde la región codificante está operativamente unida bajo el control transcripcional de la región de iniciación transcripcional, y una región de terminación transcripcional y traduccional.

Se puede introducir un casete de expresión en una variedad de vectores, p. ej., plásmido, BAC, YAC, bacteriófago como lambda, P1, M13, etc., vectores virales vegetales o animales (p. ej., vectores basados en retrovirales, vectores de adenovirus) y similares, donde los vectores normalmente se caracterizan por la capacidad de proporcionar la selección de células que comprenden los vectores de expresión. Los vectores pueden proporcionar mantenimiento extracromosómico, particularmente como plásmidos o virus, o para la integración en el cromosoma huésped. Cuando se desea el mantenimiento extracromosómico, se proporciona una secuencia de origen para la replicación del plásmido, que puede tener un número de copias alto o bajo. Se pueden seleccionar una amplia variedad de marcadores, en particular aquellos que protegen contra toxinas, en particular contra antibióticos. El marcador particular que se elige se selecciona de acuerdo con la naturaleza del huésped, donde, en algunos casos, se puede emplear la complementación con huéspedes auxotróficos. La introducción del constructo de ADN puede usar cualquier método conveniente, incluido, p. ej., conjugación, transformación bacteriana, ADN precipitado con calcio, electroporación, fusión, transfección, infección con vectores virales, biolística y similares. La descripción se refiere a un vector de expresión que comprende un segmento de ácido nucleico, en donde dicho segmento de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 181.

Por consiguiente, las proteínas para el uso en la presente descripción se pueden producir en células huésped diseñadas genéticamente según técnicas convencionales. Las células huésped adecuadas son aquellos tipos de células que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y crecer en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucariotas superiores cultivadas (incluyendo células cultivadas de organismos multicelulares), particularmente células de mamíferos cultivadas. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en una variedad de células huésped se describen en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4a ed., John Wiley & Sons, 1999).

Para dirigir una proteína recombinante hacia la vía secretora de una célula huésped, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder) en el vector de expresión. La secuencia señal secretora puede ser la de la forma nativa de la proteína recombinante, o puede derivarse de otra proteína secretada o sintetizadade novo.La secuencia señal secretora está unida operativamente a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se posicionan para dirigir el polipéptido recién sintetizado hacia la vía secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras comúnmente están situadas en 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal pueden están situadas en otra parte de la secuencia de ADN de interés (ver, p. ej., Welch et al., Patente de EE.UU. n°. 5.037.743; Holland et al., Patente de EE.UU. n°. 5.143.830).

Las células de mamífero cultivadas son huéspedes adecuados para la producción de proteínas recombinantes para su uso en la presente descripción. Los métodos para introducir ADN exógeno en células huésped de mamíferos incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporación (et al., E<m>BO J. 1:841-845, 1982), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al.,supra),y transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamíferos cultivadas se describe, por ejemplo, por Levinson et al., Patente de EE.UU. n°. 4.713.339; Hagen et al., Patente de EE.UU. n°. 4.784.950; Palmiter et al., Patente de EE.Uu . n°. 4.579.821; y Ringold, Patente de EE.UU. n°. 4.656.134. Ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen células de riñón de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de riñón de embrión humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de cría de hámster (BHK-21,<b>H<k>-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44; CHO DXB11 (Hyclone, Logan, UT); ver también, p. ej., Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células de pituitaria de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Se conocen en la técnica líneas celulares adecuadas adicionales y están disponibles en depósitos públicos tales como la Colección de cultivo tipo americano, Manassas, Virginia. Se pueden utilizar promotores de transcripción fuertes, tales como promotores de SV-40 o citomegalovirus. Ver, p. ej., Patente de EE.UU. n°. 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen los de genes de metalotioneína (Patentes de EE.UU. n°s.

4.579.821 y 4.601.978) y el promotor tardío principal del adenovirus.

La selección de fármacos se utiliza generalmente para seleccionar células de mamíferos cultivadas en las que se ha insertado ADN extraño. Estas células se denominan comúnmente como "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie se denominan "transfectantes estables". Los marcadores seleccionables ejemplares incluyen un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina, que permite que la selección se lleve a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similar; el gen gpt para la xantina-guanina fosforribosil transferasa, que permite el crecimiento de la célula huésped en presencia de ácido micofenólico/xantina; y marcadores que proporcionan resistencia a la zeocina, bleomicina, blastocidina e higromicina (ver, p. ej., Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990). También se pueden utilizar sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado como "amplificación". La amplificación se lleva a cabo cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y luego aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que produzcan niveles altos de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable ejemplar es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. También pueden usarse otros genes de resistencia a los medicamentos (p. ej., resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa).

También se pueden usar como huéspedes otras células eucariotas superiores, incluidas células de insectos, células vegetales y células de aves. El usode Agrobacterium rhizogenescomo vector para expresar genes en células vegetales ha sido revisado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. La transformación de células de insectos y la producción de polipéptidos extraños en las mismas se describe por Guarino et al., documento US 5.162.222 y patente internacional WO 94/06463.

Las células de insectos pueden infectarse con baculovirus recombinantes, comúnmente derivados deAutographa califórnica,el virus de la poliedrosis nuclear (AcNPV). Ver King y Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman y Hall, Londres); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., Nueva York 1994); y Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995). El baculovirus recombinante también se puede producir mediante el uso de un sistema basado en transposones descrito por Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, está disponible comercialmente en forma de kit (kit BAC-TO-BAC; Life Technologies, Gaithersburg, MD). El vector de transferencia (p. ej., PFASTBAC1; Life Technologies) contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica la proteína de interés a un genoma de baculovirus mantenido enE. colicomo un plásmido grande llamado "bácmido". Ver Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en marco con ADN que codifica una extensión polipeptídica o una etiqueta de afinidad como se describe anteriormente. Usando técnicas conocidas en la técnica, un vector de transferencia que contiene una secuencia de ADN que codifica una proteína se transforma en células huésped deE. coli,y las células se analizan en busca de bácmidos que contengan un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aísla mediante técnicas habituales y se utiliza para transfectar células deSpodoptera frugiperda,como las células Sf9. Posteriormente se produce un virus recombinante que expresa la proteína o el interés. Las reservas virales recombinantes se preparan mediante métodos comúnmente utilizados en la técnica.

Para la producción de proteínas, el virus recombinante se usa para infectar células huésped, normalmente una línea celular derivada del gusano cogollero,Spodoptera frugiperda(p. ej., células Sf9 o Sf21) oTrichoplusia ni(p. ej., células HIGH FIVE; Invitrogen, Carlsbad, CA). Ver en general Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant Dn A (a Sm Press, Washington, D.C., 1994). Ver también la patente de EE.UU. n°.

5.300.435. Se usan medios sin suero para hacer crecer y mantener las células. Las formulaciones de medios adecuadas son conocidas en la técnica y pueden obtenerse de proveedores comerciales. Las células crecen a partir de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células a una densidad de 1-2 x 106 células, momento en el cual se añade una reserva viral recombinante con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, más típicamente cerca de 3. Los procedimientos usos generalmente se describen en los manuales de laboratorio disponibles (ver, p. ej., King y Possee,supra;O'Reillyet al., supra;Richardson,supra).

En la presente descripción también se pueden usar células fúngicas, incluidas células de levadura. Las especies de levadura a este respecto incluyen, p. ej.,Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris,yPichia methanolica.Métodos para transformar las células de S.cerevisiaecon ADN exógeno y que producen polipéptidos recombinantes a partir de las mismas se describen, por ejemplo, en Kawasaki, patente de E<e>.UU. n°. 4.599.311; Kawasaki et al., patente de EE.UU. n°.4.931.373; Brake, patente de E<e>.UU. n°.4.870.008; Welch et al., patente de EE.UU. n°.5.037.743; y Murray et al., patente de EE.UU. n°. 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente la resistencia a los medicamentos o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente particular (p. ej., leucina). Un sistema vectorial ejemplar para su uso enSaccharomyces cerevisiaees el sistema vectorial POT1 descrito por Kawasaki et al. (Patente de EE.UU n°. 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas mediante crecimiento en medios que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para su uso en levadura incluyen los de genes de enzimas glicolíticas (ver, p. ej., Kawasaki, Patente de EE.UU. n°. 4.599.311; Kingsman et al., patente de EE.UU. n°. 4.615.974; y Bitter, patente de EE.UU. n°. 4.977.092) y genes de alcohol deshidrogenasa. Ver también las patentes de EE.UU. n°s. 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936; y 4.661.454. Sistemas de transformación para otras levaduras, que incluyenHansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii,yCandida maltosason conocidos en la técnica. Ver, p. ej., Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, patente de EE.UU. n°. 4.882.279; y Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998. Las células deAspergillusse pueden utilizar según los métodos de McKnight et al., patente de EE.UU. n°. 4.935.349. Métodos para transformarAcremonium chrysogenumse describen por Sumino et al., patente de EE.UU. n°. 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora se describen por Lambowitz, patente de EE.UU. n°. 4.486.533. Producción de proteínas recombinantes enPichia methanolicase describe en las patentes de EE.UU. n°s. 5.716.808; 5.736.383; 5.854.039; y 5.888.768.

Las células huésped procarióticas, incluidas cepas de las bacteriasEscherichia coli, Bacillus,y otros géneros también son células huésped útiles dentro de la presente descripción. Las técnicas para transformar estos huéspedes y expresar secuencias de ADN extrañas clonadas en ellos son bien conocidas en la técnica (ver, p. ej., Sambrook y Russell,supra).Cuando se expresa una proteína recombinante en bacterias comoE. coli,la proteína puede retenerse en el citoplasma, típicamente como gránulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan y los gránulos se recuperan y desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. La proteína desnaturalizada puede luego replegarse y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis frente a una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido de diálisis frente a una solución salina tamponada. Como alternativa, la proteína puede recuperarse del citoplasma en forma soluble y aislarse sin el uso de desnaturalizantes. La proteína se recupera de la célula como un extracto acuoso en, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato. Para capturar la proteína de interés, el extracto se aplica directamente a un medio cromatográfico, como un anticuerpo inmovilizado o una columna de heparina-Sefarosa. Las proteínas secretadas se pueden recuperar del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional alterando las células (mediante, por ejemplo, sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando así la necesidad de desnaturalización y repliegue. Los anticuerpos, incluidos los anticuerpos monocatenarios, pueden producirse en células huésped bacterianas según métodos conocidos. Ver, p. ej., Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Houston et al., Proc. Natl. Acad. USA 85:5879-5883, 1988; y Pantoliano et al., Biochem. 30:10117-10125, 1991.

Las células huésped transformadas o transfectadas se cultivan según procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes necesarios para el crecimiento de las células huésped elegidas. En la técnica se conocen una variedad de medios adecuados, incluidos medios definidos y medios complejos, y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, según sea necesario. El medio de crecimiento generalmente seleccionará células que contienen el ADN añadido exógenamente mediante, por ejemplo, selección de fármaco o deficiencia en un nutriente esencial que se complementa con el marcador de selección transportado en el vector de expresión o cotransfectado en la célula huésped.

Los anticuerpos anti-CD152 pueden purificarse mediante métodos de purificación de proteínas convencionales, normalmente mediante una combinación de técnicas cromatográficas. Ver en general Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988); Scopes, Protein purification: Principles and Practice(Springer-Verlag, Nueva York 1994). Las proteínas que comprenden una región Fc de inmunoglobulina se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad en proteína A o proteína G inmovilizada. Se pueden usar etapas de purificación adicionales, tales como filtración en gel, para obtener el nivel deseado de pureza o para proporcionar desalación, intercambio de tampón y similares.

Los siguientes ejemplos de la invención sirven para ilustrar mejor la naturaleza de la invención. Debe entenderse que los siguientes ejemplos no limitan la invención y que el alcance de la invención debe determinarse mediante las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Generación de anticuerpos anti-CTLA-4

Se usó proteína CTLA-4-ECD humana (Acro Bio) como inmunógeno para generar anticuerpos anti-CTLA-4. Los usos de la tecnología de ratón transgénico de inmunoglobulina humana para el desarrollo y preparación de anticuerpos humanos fueron descritos por primera vez por Abgenix (ratón xeno y Medarex ("ratón" HuMab); Lonberg et al., 1994, Nature, 368: 856-859; Lonberg y Huszar, 1995, Internal Rev. Immunol., 13:65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Acad. Sci., 764:536-546).

Se inmunizaron ratones HCAb con la proteína CTLA-4-ECD humana a 20 mg/por ratón cada dos semanas durante tres veces, y seis de ellos se inmunizaron cinco veces más a 44 mg/por ratón. Excepto en la primera inyección, en la que se utilizó Stimune (Prionics) como adyuvante, todos los refuerzos se realizaron con el adyuvante Ribi (sistema de adyuvante Sigma S6322-1VL). Después de la inmunización, se aislaron suspensiones de células individuales de la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos del ratón. Luego se aislaron células plasmáticas de ratón usando un kit de aislamiento de células plasmáticas (Miltenyi, n° de catálogo 130-092-530). Brevemente, se prepararon ARN totales de células plasmáticas de ratón y se transcribieron de forma inversa a ADNc en un conjunto grande. Las regiones VH humanas se amplificaron a partir de los ADNc utilizando cebadores como sigue.

Cebador directo:

lib-3-23/53-S: 5'-GTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTG (SEQ ID NO: 193) y

lib-3-11 -S: 5'-GTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG (SEQ ID NO: 194)

Cebador inverso:

mG1 hrv: 5'-GGCTTACAACCACAATCCCTGGGC (SEQ ID NO: 195)

Todos los fragmentos de PCR que contienen el dominio VH amplificado se clonaron en un vector de expresión de mamífero pTT5. Los plásmidos obtenidos se transformaron en bacterias (DH5a) mediante electroporación. Los plásmidos se duplicaron y purificaron y luego se transfectaron en células HEK 293 para la producción de anticuerpos.

Las células 293 se incubaron en medio 293 FreeStyle (12338018, Thermo) durante 10 días y los sobrenadantes se examinaron con un ensayo ELISA. Se diluyeron proteínas CTLA4-his humanas recombinantes (Acro Bio) en PBS con una concentración de 2 gg/ml y se añadieron 100 gl de las proteínas CTLA-4-his diluidas por pocillo a microplacas ELISA, que se incubaron durante la noche a 4 °C para recubrir las placas con las proteínas recombinantes. Luego, las placas se bloquearon con disolución de bloqueo de ELISA (que contenía BSA al 2 %, Tween-20 al 0,05 % (v/v), pH 7,4, tampón PBS, p/v) a 37 °C durante dos horas y luego se incubaron con los sobrenadantes durante 1 hora a 37 °C. Las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpo IgG anti-humano de cabra (H+L) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (A18805, Life technologies) a 37 °C durante una hora. Se añadieron 100 gl de tetrametilbencidina (TMB) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 50 gl de HCl 1 N para terminar la reacción. Se seleccionaron treinta y cinco clones positivos que mostraban una tinción significativa para realizar pruebas adicionales.

Se secuenciaron los 35 clones y se eligieron 9 clones de los 35 con secuencias CDR3 únicas. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de estos 9 anticuerpos anti-CTLA-4 se resumieron en la Tabla 1. Los anticuerpos HCAb contenían sólo dos cadenas pesadas.

Tabla 1. Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de anticuerpos anti-CTLA-4 humanos

na: ácido nucleico; aa: aminoácido

Ejemplo 2 - Preparación y purificación de anticuerpos anti-CTLA-4.

Etapa 1. Preparación de células HEK 293F que sobreexpresan hCTLA-4

La secuencia de nucleótidos que codifica CTLA-4 humano (SEQ ID NO: 196, que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197) se subclonó en un vector pcDNA3.1 (Clontech) para obtener un plásmido. Se transfectaron transitoriamente células HEK293 y CHO-K1 (Invitrogen) con los plásmidos usando PEI, y los transformantes se cultivaron en medios de cultivo DMEM que contenían 0,5 g/ml de penicilina/estreptomicina y 10 % (p/p) de suero bovino fetal (FBS) durante 2 semanas. Se llevó a cabo una dilución limitada en una placa de cultivo de 96 pocillos y la placa se incubó a 37 °C con 5 % (v/v) de CO2 durante aproximadamente 2 semanas. Los monoclones se expandieron en placas de 6 pocillos y los clones expandidos se examinaron mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-hCTLA-4 disponibles comercialmente (R&D Systems). Los clones que exhibieron tasas de crecimiento más altas y una mayor intensidad de fluorescencia medida por FACS se expandieron aún más y se crioconservaron en nitrógeno líquido.

Etapa 2. Determinación de la actividad de unión de anticuerpos anti-CTLA-4 en medio celular HEK 293F mediante ELISA y ensayo de unión FACS basado en células

Se diluyeron proteínas CTLA4-his humanas recombinantes (Acro Bio) en PBS con una concentración de 2 gg/ml y se añadieron 100 gl de las proteínas CTLA-4-his diluidas por pocillo a microplacas ELISA, que se incubaron durante la noche a 4 °C para recubrir las placas con las proteínas recombinantes. Luego, las placas se bloquearon con disolución de bloqueo ELISA (que contenía BSA al 2 %, Tween-20 al 0,05 % (v/v), tampón PBS de pH 7,4, p/v) a 37 °C durante dos horas y luego se incubaron con medio celular 293F que contenía anticuerpos anti-CTLA-4 (ver Ejemplo 1) durante 1 hora a 37 °C. Las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpo IgG anti-humano de cabra (H+L) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (A18805, Life technologies) a 37 °C durante una hora. Se añadieron 100 gl de tetrametilbencidina (TMB) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 50 pl de HCl 1 N para terminar la reacción y se determinó la DO450 nm mediante un lector de placas ELISA.

Mientras tanto, se cultivaron células 293-hCTLA-4 preparadas en la etapa 1 y se usaron para medir la actividad de unión del anticuerpo. Las células se trataron con una solución de disociación celular libre de enzimas (disolución Versene, Invitrogen) y luego se recogieron. Se añadió BSA a la suspensión celular hasta una concentración final del 1 %, y las células se bloquearon durante 30 minutos en hielo y luego se lavaron dos veces con HBSS. Las células se recogieron después de la centrifugación y se resuspendieron en tampón FACS (HBSS BSA al 1%, v/v) a 2 x 106 células/mL. Luego se añadieron 100 pl de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 100 pl de medio celular 293F que contenía anticuerpos anti-CTLA-4 (ver Ejemplo 1) a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se añadieron 100 pl de anticuerpo antihumano (H+L) marcado con Alexa 488 (Invitrogen) a la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 1 hora en hielo. Las muestras se lavaron tres veces con tampón FACS y se añadieron 100 pl de tampón de fijación (4 % de paraformaldehído en v/v) a cada pocillo y se incubaron durante 10 minutos. Luego, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se resuspendieron en 100 pl de tampón FACS. La intensidad de fluorescencia media (MFI) se determinó utilizando FACS Calibur (BD).

Etapa 3 Producción y purificación de anticuerpos candidatos líderes.

La concentración de anticuerpos de las células HEK293 fue de aproximadamente 1-10 pg/ml y varió ampliamente. Además, el FBS y los componentes del medio de cultivo podrían interferir con el análisis. Por lo tanto, era necesario realizar una producción y purificación de anticuerpos a pequeña escala (1-5 mg).

Los constructos que contenían secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos anti-CTLA-4 (como se enumeran en la Tabla 1) se introdujeron en 293 células. El sobrenadante que contenía anticuerpos diana se recogió 6-7 días después de la transfección mediante centrifugación y filtración. Los anticuerpos monoclonales se purificaron pasándolos a través de columnas de proteína G de 2 ml (GE Healthcare). Las columnas de proteína G se equilibraron primero con tampón PBS (pH 7,2) y luego los sobrenadantes del cultivo de hibridoma se aplicaron a las columnas de proteína G equilibradas con un caudal constante de 3 ml/minuto. Luego se lavó cada una de las columnas con tampón PBS que tenía un volumen 3 veces mayor que el de la columna. A continuación, los anticuerpos anti-CTLA-4 se eluyeron con tampón de elución (tampón acetato 0,1 M, pH 2,5) y se controló la absorbancia UV de los eluatos usando un detector UV (pico de absorción UV A280). Se añadió un 10 % de tampón Tris-HCL 1,0 M a los eluatos para neutralizar el pH y las muestras se filtraron de forma estéril pasándolas a través de filtros de 0,22 micrómetros. Se obtuvieron anticuerpos anti-CTLA-4 purificados y filtrados de forma estéril.

Las concentraciones de anticuerpos anti-CTLA-4 purificados se determinaron mediante absorbancia UV (A280/1.4) y se midieron la pureza y el nivel de endotoxinas (kit Lonza). Los anticuerpos anti-CTLA-4 purificados tenían concentraciones de endotoxina inferiores a 1,0 EU/mg.

Ejemplo 3 - Caracterización de los principales anticuerpos candidatos

Las células 293 se transfectaron de manera estable con plásmidos pTT5 que contenían la secuencia de ácido nucleico que codifica CTLA-4 humano (SEQ ID NO: 196) para generar células 293<f>que expresan de manera estable CTLA-4 humano (en la presente memoria denominadas como células 293-hCTLA-4). Se transfectaron de forma estable células 293 adicionales con plásmidos pIRES que contenían la secuencia de ácido nucleico que codifica el cyno CTLA-4 de longitud completa (SEQ ID NO: 198) para generar células 293 que expresan de forma estable el cyno CTLA-4 (en la presente memoria denominadas células 293-cynoCTLA-4). Se cultivaron células 293-hCTLA-4 y 293-cynoCTLA-4 y se expandieron en matraces de cultivo T-75 hasta una confluencia del 90 %. Se aspiró el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con HBSS (solución salina equilibrada de Hanks, Invitrogen). Las células se trataron con una disolución de disociación celular libre de enzimas (disolución Versene, Invitrogen) y se recogieron. Luego, las células se lavaron dos veces con HBSS, se determinaron los recuentos celulares y las células se resuspendieron con HBSS a 2 x 106 células/mL. Se añadió BSA a la suspensión celular hasta una concentración final del 1 %, y las células se bloquearon durante 30 minutos en hielo y luego se lavaron dos veces con HBSS. Las células se recogieron después de la centrifugación y se resuspendieron en tampón FACS (HBSS BSA al 1 %, v/v) a 2 x 106 células/mL. Luego se añadieron 100 pl de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 100 pl de anticuerpos anti-CTLA-4 purificados del Ejemplo 2 o anticuerpos de control a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 1 hora en hielo, en donde la cadena pesada y la cadena ligera del análogo de Ipilimumab tenían secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO.: 199 y SEQ ID NO.: 200, respectivamente. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se añadieron 100 pl de anticuerpo antihumano (H+L) marcado con Alexa 488 (Invitrogen) a la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 1 hora en hielo. Las muestras se lavaron tres veces con tampón FACS y se añadieron a cada pocillo 100 pl de tampón de fijación (que contenía paraformaldehído al 4 %, v/v) y se incubaron durante 10 minutos. Luego, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se resuspendieron en 100 pl de tampón FACS.

La intensidad de fluorescencia media (MFI) se determinó usando FACS Calibur (BD), y los resultados se mostraron en las Fig. 1 y 2. Los anticuerpos del Ejemplo 2 tuvieron actividad de unión a CTLA humana o de cyno en células 293F comparable a la del análogo de Ipilimumab.

Ejemplo 4 - Determinación de la capacidad de los anticuerpos anti-CTLA-4 para bloquear la unión de CTLA-4 a B7.1

Se realizó un ensayo de unión de ligando-receptor basado en células para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-CTLA-4 para bloquear la unión de CTLA-4 a sus ligandos B7.1. La proteína recombinante B7.1ECD-Fc (B71-H5259, Acro Bio) se biotiniló usando EZ-LINK NHS-PEG12-Biotina (Thermo Scientific n°. 21312) según las instrucciones del fabricante. La proteína B7.1ECD-Fc biotinilada se concentró y la etiqueta libre se eliminó usando un filtro centrífugo Amicon (corte de 10 kDa). El dominio extracelular de B7.1 correspondió a los aminoácidos Val35-Asn242 de la proteína P33681 de la base de datos de Uniprot.

Se cultivaron células 293-hCTLA-4 preparadas en el Ejemplo 3 y se expandieron en matraces de cultivo T-75 hasta una confluencia del 60-80 %. Se aspiró el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS. Las células se trataron con una disolución de disociación celular libre de enzimas (disolución Versene, Invitrogen) y se recogieron. La disolución de disociación se neutralizó mediante la adición de 8 ml de medio de cultivo y se determinaron los recuentos celulares. Las células se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos y se resuspendieron en tampón de bloqueo (que contenía BSA al 2 %, tampón PBS a pH 7,4, p/v) a 1 x 106 células/mL. Las células se bloquearon durante 15 minutos a 37 °C. Mientras tanto, los pocillos de placas de fondo redondo de 96 pocillos se bloquearon con 200 |ul de tampón de bloqueo durante 1 hora a 37 °C. Se descartó el tampón de bloqueo y se dispensaron 200 |ul de células en cada pocillo de las placas de 96 pocillos (2 x 105 células/pocillo). Las placas se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos y se desecharon los sobrenadantes. Las células se resuspendieron en 100 |ul de anticuerpos anti-CTLA-4 preparados en tampón de bloqueo con concentraciones variables. Se añadieron 100 |uL de B7.1ECD-Fc biotinilada (60 |ug/ml en tampón de bloqueo) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se mezcló agitando suavemente. Las placas se incubaron a 4 °C durante 90 minutos y se lavaron dos veces con 200 |ul de tampón de bloqueo. Se descartó el tampón de bloqueo y las células se resuspendieron en 100 |ul de disolución de estreptavidina-Alexa 488 (Invitrogen, 1:500 en tampón de bloqueo) y se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y se añadieron 200 |ul de tampón de bloqueo. La intensidad de fluorescencia media (MFI) se determinó usando FACS Calibur (BD). Los resultados, como se muestra en la Fig. 3, demostraron que los anticuerpos anti-CTLA-4 pueden bloquear la unión de CTLA-4 expresado en células a su ligando B7.1 a un nivel comparable al análogo de ipilimumab.

Ejemplo 5 - Los anticuerpos anti-CLTA-4 HCAb promovieron la liberación de IL-20

Etapa 1 Prueba de estimulación de PBMC

Se añadieron 100 |uL de PBMC (que contiene 1 x 105 células) a los pocillos de una placa de 96 pocillos, y luego se añadieron 50 |ul de cada anticuerpo de prueba que tenía diversas concentraciones a la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 50 |ul de 100 ng/ml de SEB a cada pocillo y se cultivaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante 72 horas. Los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -20°C hasta su análisis.

Etapa 2 Detección de la secreción de interleucina IL-2 mediante ELISA

La cuantificación de los niveles de IL-2 en el sobrenadante del cultivo se llevó a cabo usando el kit ELISA de IL-2 Humano Quantikine (DY202, R&D Systems) siguiendo las instrucciones de funcionamiento proporcionadas por el fabricante. Brevemente, se recubrieron las microplacas de ELISA con anticuerpos policlonales anti-IL-2 y se añadieron a cada pocillo 100 |ul del sobrenadante del cultivo, así como el patrón, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron 4 veces con tampón de lavado, seguido de la adición de anticuerpos anti-IL-2 humana conjugados con HRP y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de los lavados, se añadió un sustrato cromogénico (5120-0077, SeraCare) y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos, y la reacción se terminó mediante la adición de una disolución de parada (E661006-0200, BBI Life Sciences).

La absorbancia a 450 nm se determinó utilizando un lector de placas ELISA y los resultados, como se muestran en las figuras 4A y 4B, demostraron que algunos de los anticuerpos anti-CTLA-4 pueden aumentar la secreción de IL-2 en concentraciones bajas en comparación con la IgG humana (AB 170090, Crown Bio) o el análogo de Ipilimumab.

Ejemplo 6 - Anticuerpos anti-CTLA-4 HCAb unidos a CTLA-4 humano pero no a CTLA-4 murino en ensayo ELISA

Se diluyó proteína CTLA4-his humana o de ratón recombinante (CT4-H5229 para proteína humana, CT4-M52H5 para proteína de ratón, Acro Bio) en PBS a una concentración de 2 |ug/ml, y se añadieron 100 |ul de proteína CTLA-4-his diluida por pocillo a microplacas de ELISA, que se incubaron durante la noche a 4 °C para recubrir las placas con las proteínas recombinantes. Luego, las placas se bloquearon con disolución de bloqueo ELISA (que contenía BSA al 2 %, Tween-20 al 0,05 % (v/v), tampón PBS a pH 7,4, p/v) a 37 °C durante dos horas y luego se incubaron con anti-CTLA-4 anticuerpos con diversas concentraciones durante 1 hora a 37 °C. Las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpo IgG anti-humana (H+L) de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (A18805, Life technologies) a 37 °C durante una hora. Se añadieron 100 |ul de tetrametilbencidina (TMB) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 50 pl de HCl 1 N para terminar la reacción y se determinó la OD450 nm mediante un lector de placas ELISA.

Los datos se mostraron en las Fig. 5A y 5B, lo que sugiere que todos los clones se unieron a CTLA-4 humano pero casi no se unieron a CTLA-4 murino.

Ejemplo 7 - Los mutantes del anticuerpo anti-CTLA-4 promovieron la liberación de IL-20

Se realizó un ensayo de estimulación de células T en algunos anticuerpos mencionados anteriormente y sus mutantes para examinar el efecto de estos anticuerpos en la estimulación de células T bloqueando la unión de CTLA-4 a sus ligandos B7.1 y B7.2.

Los mutantes de anticuerpos se prepararon aplicando mutaciones S239D e I332E en el dominio constante Fc del clon 5, clon 11, clon 22, clon 25 y clon 30 de HCAb mediante PCR. Los anticuerpos mutados se expresaron en células HEK293 y se purificaron como se describe en el Ejemplo 2. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de los anticuerpos mutantes se determinaron usando métodos estándar de biología molecular y se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2. Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de mutantes de anticuerpos anti-CTLA-4

na: ácido nucleico; aa: aminoácido

La prueba de estimulación de PBMC y la detección de la secreción de interleucina IL-2 mediante ELISA se realizaron como en el Ejemplo 5.

Los resultados en las Fig. 6A y 6B demostraron que los mutantes del anticuerpo anti-CTLA-4 promovieron una mayor secreción de IL-2 en comparación con el control del isotipo IgG1 humano y sus clones parentales.

Ejemplo 8 - Variantes de anticuerpos anti-CTLA-4 sin PTM

Las secuencias de aminoácidos de 7 clones de HCAb (CL22, CL25, CL5, CL3, CL11, CL30, CL24) se alinearon con el gen IGHV3-53*01 y se muestran en la Tabla 3. Se resaltaron las diferencias con el gen de la línea germinal y los sitios PTM. Las secuencias se numeraron según el esquema de numeración de Chothia.

El gen de la línea germinal IGHV3-53 no tiene un motivo de N-glicosilación de forma nativa, y esos motivos de N-glicosilación transportados en los 7 clones de HCAb se formaron mediante mutaciones somáticas. Por lo tanto, un enfoque para eliminar este motivo fue sustituirlo por los residuos homólogos correspondientes en la línea germinal, por ejemplo, reemplazar el motivo NVS en CDR1 de CL11 por TVS de la línea germinal. También se exploró un enfoque alternativo combinando la eliminación de PTM con la "generación de líneas germinales" basada en el concepto de injerto de CDR usado para la humanización. En el segundo enfoque, las CDR de cada HCAb se injertaron en estructuras de IGHV3-53 de la línea germinal y también se conservaron residuos clave de la estructura de HCAb parental. Para algunos anticuerpos, se restauraron las mutaciones de aminoácidos situadas en residuos especiales, que pueden afectar la actividad de unión entre CTLA-4 y los anticuerpos. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las variantes del anticuerpo HCAb anti-CTLA-4 humano con eliminación de PTM se enumeran en la Tabla 4.

Tabla 3. Diferencias de la secuencia de aminoácidos de HCAb en comparación con la secuencia de la línea germinal

Tabla 4. Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de variantes de anticuerpos anti-CTLA-4 con eliminación de

PTM

na: ácido nucleico; aa: aminoácido

Ejemplo 9 - Actividad de unión celular de variantes del anticuerpo anti-CTLA-4 con eliminación de PTM

Se realizó un ensayo de unión basado en células para determinar la capacidad de unión de las variantes del anticuerpo anti-CTLA-4 con eliminación de PTM a CTLA-4 humano. El procedimiento de ensayo fue similar al descrito en el Ejemplo 3. En resumen, se recolectaron células 293F-hCTLA-4 usando una disolución de disociación celular libre de enzimas (disolución de Versene, Invitrogen) y luego se neutralizaron con medio de cultivo y se determinaron los recuentos de células. Las células se centrifugaron y se bloquearon en tampón de bloqueo (que contenía BSA al 2%, tampón PBS a pH 7,4, p/v) a 1 x 106 células/mL durante 15 minutos a 37 °C. Se dispensaron 200 pl de células en cada pocillo de las placas de 96 pocillos (2 x 105 células/pocillo). Las placas se centrifugaron y se desecharon los sobrenadantes. Las células se resuspendieron en 100 pl de anticuerpos anti-CTLA-4 preparados en tampón de bloqueo. Las placas se incubaron a 4 °C durante 90 minutos y se lavaron dos veces. Después de desechar el tampón de bloqueo, las células se resuspendieron en 100 pl de anticuerpo antihumano (H+L) etiquetado con Alexa 488 (1:500, Invitrogen) y se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron y se resuspendieron en 200 pl de tampón de bloqueo. La intensidad de fluorescencia media (MFI) se determinó usando FACS Calibur (BD).

Los resultados, como se muestra en la Fig. 7, demostraron que las variantes del anticuerpo anti-CTLA-4 con la eliminación de PTM se unían al CTLA-4 humano expresado en células.

Ejemplo 10 - Actividad de bloqueo de variantes de anticuerpos anti-CTLA-4 con eliminación de PTM en la interacción de CTLA-4 - B7.1 y B7.2

El ensayo de unión del ligando del receptor basado en células se realizó como se describe en el Ejemplo 4 para determinar la capacidad de las variantes del anticuerpo anti-CTLA-4 con eliminación de PTM para bloquear la unión de CTLA-4 a sus ligandos B7.1.

Los resultados, como se muestra en la Fig. 8, demostraron que las variantes del anticuerpo anti-CTLA-4 con eliminación de PTM bloquearon la unión de CTLA-4 expresado en células a su ligando B7.1 y B7.2 (datos no mostrados) a un nivel comparable al del análogo de ipilimumab.

Ejemplo 11 - Las variantes del anticuerpo anti-CTLA-4 con eliminación de PTM promovieron la liberación de IL-20

La estimulación de PBMC y la cuantificación del nivel de IL-20 se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 5.

Los resultados, como se muestra en la Fig. 9, demostraron que las variantes del anticuerpo anti-CTLA-4 con eliminación de PTM aún pueden promover la secreción de IL-2. Los anticuerpos anti-CTLA-4 con mutaciones S239D e I332E y eliminación de PTM indujeron una mayor secreción de IL-2 que aquellos con mutaciones S239D e I332E pero sin eliminación de PTM.

Ejemplo 12 - Afinidad de unión y constante de disociación de las variantes del anticuerpo anti-CTLA-4 con eliminación de PTM

Las constantes de disociación se determinaron con Biacore T200 (GE Healthcare), siguiendo las especificaciones del instrumento proporcionadas por el fabricante. Brevemente, se inmovilizaron anticuerpos anti-CTLA-4 diluidos a 1 pg/ml en NaOAc 10 mM (pH 5,0, sigma) en una celda de flujo de un chip sensor CM5 Serie S. Los grupos éster activos restantes se bloquearon con etanolamina 1 M (pH 8,5). Con HBS-EP+ como tampón de ejecución, se inyectaron proteínas CTLA-4-his humanas recombinantes (CT4-H5229, AcroBio) y cynoCTLA-4-his (CT4-C5227, AcroBio) con cinco concentraciones diluidas en serie sobre células de flujo a 30 pL/min con un tiempo de asociación de 180 s. El flujo del tampón se mantuvo para la disociación durante 600 s. El valor de KD para cada interacción entre anticuerpo y antígeno se evaluó utilizando el software de evaluación Biacore T200 1.0 y el modelo de ajuste de unión 1:1.

Los resultados se mostraron en la Fig. 10 y la Tabla 5. La afinidad de unión de dos clones fue similar a la del análogo de Ipilimumab.

Tabla 5. Cinética de unión y afinidades de Abs anti-CTLA-4 humanos con proteína CTLA-4ECD-his humana y proteína cynoCTLA-4ECD-his como se determinó por Biacore T200

Ejemplo 13 - Análisis de la función ADCC in vitro

Para confirmar la supuesta actividad citotóxica dependiente de NK de los anticuerpos anti-CTLA-4 humanos, se realizó un ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) tanto en células CHO-K1 que expresan CTLA-4 como en células Treg estimuladas in vitro que expresan CTLA-4.

Las células CHO-K1 que expresan CTLA-4 como se describe en el Ejemplo 2, etapa 1, se ajustaron a una concentración de 2 x 105 células/mL con medio ADCC (que contiene RPMI 1640 sin rojo fenol, 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina). Se añadieron 50 pL de suspensiones celulares (1 x 104 células viables) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en serie en medio ADCC (sin rojo fenol) y se añadieron 50 pl de cada disolución resultante a los pocillos por triplicado. Las concentraciones finales de anticuerpos fueron: 0,087 pM, 0,44 pM, 2,2 pM, 10,9 pM, 54 pM, 272 pM, 1,36 nM y 6,8 nM. La placa se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Las células NK92 transfectadas de manera estable con FcyRi II158V se ajustaron con medio ADCC (sin rojo fenol) de modo que al añadir 100 pl de células NK92 transfectadas de manera estable con FcyRIII158V a las células diana, la relación entre células efectoras y diana fue de 5:1. Luego la placa se incubó a 37 °C durante 6 horas. Después de 6 horas de incubación, la placa se centrifugó y se transfirieron 50 pl de cada sobrenadante a una placa nueva. El sobrenadante se incubó con 50 pl de tampón de detección de LDH a temperatura ambiente durante 30 minutos y se midió la absorbancia a 490 nm. Para un control máximo de la lisis celular, se añadieron 50 pl de células CHO-K1 que expresan CTLA-4, 50 pl de medio ADCC y 100 pl de tampón T riton-X100 al 1 % para la detección de LDH. Para un control mínimo de la lisis celular, se añadieron 50 pl de células CHO-K1 que expresan CTLA-4 y 150 pl de medio ADCC para la detección de LDH. Se midió la absorbancia a 492/650 nm. El porcentaje de lisis celular se calculó como 100*(absorbancia de muestras - absorbancia del fondo)/(absorbancia de liberación máxima -absorbancia de liberación mínima). Todos los porcentajes de valores de lisis celular se calcularon usando GraphPad Prism 5.0.

Los resultados, como se muestra en la Fig. 11, mostraron que el anticuerpo clon CL5-dPTM' indujo un efecto ADCC en células CHO-K1 que expresan CTLA-4, y el clon CL5-eA-dTPM' con mutación S239D e I332E adicional mostró una mayor actividad ADCC que el análogo de ipilimumab.

Las células Treg estimuladas in vitro que expresan CTLA-4 se derivaron de células T CD4+ vírgenes aisladas in vitro. En primer lugar, se aislaron células T CD4+ vírgenes de PBMC primarias según las instrucciones del fabricante (Miltenyi, 130-094-131). Luego, las células T CD4+ vírgenes se activaron incubando con activador T humano Dynabeads CD3/CD28 (1:1) (Thermo, 11131D), 10 ng/ml de IL-2 (PeproTech, 200-02-B) y 20 ng/ml de TGF-p1 (PeproTech, 100-21) durante tres días. El día del experimento de destrucción de ADCC, las células Treg estimuladas se ajustaron a una concentración de 1 x 106 células/mL con medio ADCC (que contiene RPMI 1640 sin rojo fenol, 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina). 1x106 células se tiñeron con 5 ul de calceína AM (Therom, C34851, stock preparado como 50 ug por 50 ul de DMSO) durante 1 h a 37 °C. Las células Treg se lavaron tres veces con medio ADCC. Se añadieron 50 pL de suspensiones de células Treg (5 x 103 células viables) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en serie en medio ADCC (sin rojo fenol) y se añadieron 50 pl de cada disolución resultante a los pocillos por triplicado. Las concentraciones finales de anticuerpos fueron: 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM y 100 nM. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se ajustaron 5 x 106 células/mL de PBMC frescas (Miaotong) con medio ADCC (sin rojo fenol). Al añadir 50 pl de PBMC frescas a las células Treg teñidas, la relación entre células efectoras a diana fue de 50:1. Luego, la placa se incubó a 37 °C durante 2 horas. Después de 2 horas de incubación, la placa se centrifugó y se transfirieron 100 pl de cada sobrenadante a una placa nueva. El sobrenadante se midió con el instrumento Enspire. Para un control máximo de la lisis celular, se añadieron 50 pl de células Treg teñidas con calceína AM, 50 pl de medio ADCC y 100 pl de tampón T riton-X100 al 1 % para la detección de calceína AM liberada. Para un control mínimo de la lisis celular, se añadieron 50 pl de células teñidas con calceína AM y 150 pl de medio ADCC para la detección de calceína AM liberada. Se midió la absorbancia a 520/650 nm. El porcentaje de destrucción específica se calcula como 100*(absorbancia de muestras - absorbancia del fondo) / (absorbancia de liberación máxima - absorbancia de liberación mínima). Todos los porcentajes de valores de destrucción específicos se calcularon usando GraphPad Prism 5.0.

Los resultados mostraron que los anticuerpos anti-CTLA-4 humanos indujeron un efecto ADCC en las células Treg que expresan CTLA-4, y el anticuerpo con las mutaciones S239D e I332E mostró una mayor actividad ADCC que el no mutado.

Ejemplo 14 - Estudio farmacocinético de anticuerpos anti-CTLA-4

Etapa 1 Tratamiento con anticuerpos anti-CTLA-4 en dosis única en ratones

A ratones macho C57BL/6 se les inyectaron 3 mg/kg de anticuerpos anti-CTLA-4 a través de la vena de la cola para medir la concentración sérica de anticuerpos anti-CTLA-4. Los animales se sujetaron manualmente y se recogieron aproximadamente 100 pl de sangre/punto temporal mediante punción retroorbital, siendo el punto temporal Predosis, 0,167, 1, 4, 8, 24 horas, 2, 4, 7, 14 días después de la inyección de anticuerpos. La recogida terminal se realizó mediante punción cardíaca. Las muestras de sangre se mantuvieron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 2.000 Xg durante 5 minutos a 4 °C para obtener muestras de suero.

Etapa 2 Concentración sérica de anticuerpos anti-CTLA-4 medida por ELISA

Todas las muestras de suero se diluyeron primero 20 veces en diluyente de ensayo. Se realizó una dilución adicional en suero de ratón al 5 % (PBS, v/v). Se diluyó proteína CTLA4-his humana recombinante (Acro Bio) en PBS hasta una concentración de 0,5 pg/ml, y se añadieron 50 pl de la muestra de proteína CTLA-4-his diluida por pocillo a microplacas ELISA, que se incubaron durante la noche a 4 °C para recubrir las placas con las proteínas recombinantes. Luego, las placas se bloquearon con disolución de bloqueo ELISA (que contenía BSA al 2 %, Tween-20 al 0,05 % (v/v), tampón PBS a pH 7,4, p/v) a 37 °C durante dos horas. Se aspiró el tampón de bloqueo y las placas se incubaron con muestras de suero diluidas durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS Tween 20 al 0,01 % (v/v)) y se incubaron con anticuerpo IgG(Fc) antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (A0170, Sigma) a 37 °C durante una hora. Se añadieron 100 pl de tetrametilbencidina (TMB) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 100 pl de HCl 0,1 N a cada pocillo para detener la reacción. La absorbancia a 450 nm se midió con un lector de placas ELISA (SpectraMax M2).

La concentración sérica correspondiente de anticuerpos anti-CTLA-4 se muestra en la Fig. 12, con datos detallados enumerados en la Tabla 6.

Tabla 6. Concentración sérica media de anticuerpos después de una dosis IV de 3 mg/kg en ratones

Datos individuales y medios de concentración sérica-tiempo del análogo de ipilimumab después de una dosis IV de 3 mg/kg en ratones C57BL/6 macho

(

Datos individuales y medios de concentración sérica-tiempo de CL5 después de una dosis IV a 3 mg/kg en

)

(

Además, se midió la relación tumor-suero de la concentración de HCAb anti-CTLA4 en ratones C57BL/6 portadores de tumores MC38. A los ratones se les inyectaron 3 mg/kg de anticuerpos anti-CTLA-4 a través de la vena de la cola para medir la concentración de anticuerpos anti-CTLA-4 en suero y residente en el tumor. Los animales se sujetaron manualmente y se recogieron aproximadamente 100 gl de sangre/punto temporal mediante punción retroorbital, siendo el punto temporal 8 y 24 horas después de la inyección. La recogida terminal se realizó mediante punción cardíaca. Las muestras de sangre se mantuvieron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 2.000 Xg durante 5 min a 4 °C para obtener muestras de suero. Las concentraciones séricas y tumorales de anticuerpos anti-CTLA-4 también se analizaron mediante ELISA como en el etapa 2.

La relación de tumor a suero de la concentración de HCAb anti-CTLA4 en el grupo CL5-eA-dPTM' fue aproximadamente una vez mayor que en el grupo del análogo de Ipi, como se muestra en la Fig. 13, lo que puede deberse a la característica única de -los anticuerpos HCAb de sólo cadena pesada. La mayor distribución de tumor a suero puede conducir a una mayor penetración de los anticuerpos HCAb en el tejido tumoral.

Ejemplo 15 - Los ratones portadores de tumor MC38 sobrevivieron mejor con anticuerpos anti-CTLA-4 humanos

La línea celular MC-38 de carcinoma de colon murino criopreservado se recuperó y se cultivó en medio DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 % y penicilina estreptomicina al 1 % a 37 °C para obtener suficientes células para la implantación del tumor. Las células MC-38 cultivadas se recogieron y se resuspendieron en PBS a una densidad de 1 x 107 células/ml con viabilidad >90 % y se implantaron por vía subcutánea en el flanco derecho de 120 ratones knock in hCTLA-4 (GempharmaTech). Cinco días después de la inoculación del tumor, 81 ratones con un tamaño de tumor que oscilaba entre 26 y 64 mm3 (el tamaño promedio del tumor fue de 40 mm3) fueron seleccionados y asignados a 9 grupos mediante aleatorización estratificada con 9 ratones por grupo según el volumen de sus tumores. Los tratamientos se iniciaron desde el día de la aleatorización (definido como D0). El grupo 1 se trató con hlgG1 i.p. a 10 mpk en D0, D3, D6, D10, D13, D16; el grupo 2 se trató con CL20'-eA (secuencias en la Tabla 7) i.p. a 5,4 mpk en D0, D3, D6, D10, D13, D16; el grupo 3 se trató con un análogo de ipilimumab i.p. a 10 mpk en D0, D3, D6, D10, D l3, D16; el grupo 4 se trató con un análogo de ipilimumab i.p. a 1 mpk en D0, D3, D6, D10, D13, D16; el grupo 5 se trató con CL5'-dPTM' i.p. a 5,4 mpk en D0, D3, D6, D10, D13, D16; el grupo 6 se trató con CL5'-dPTM' i.p. a 0,54 mpk en D0, D3, D6, D10, D13, D16; el grupo 7 se trató con CL5'-eA-dPTM' i.p. a 5,4 mpk en D0, D3, D6, D10, D13, D16; el grupo 8 se trató con CL5'-eA-dPTM' i.p. a 1,5 mpk en D0, D3, D6, D10, D13, d 16; y el grupo 9 se trató con CL5'-eA-dPTM' i.p. a 0,54 mpk en D0, D3, D6, D10, D13, D16.

Tabla 7. Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos del clon CL20'-eA

na: ácido nucleico; aa: aminoácido

Los tamaños de los tumores se midieron tres veces por semana durante el tratamiento. Cuando un animal individual alcanzó el punto final de terminación (TV>2000 mm3), fue sacrificado. Se consideró como tiempo de supervivencia el tiempo transcurrido desde el inicio del tratamiento hasta su finalización. La curva de supervivencia se trazó mediante el método de Kaplan-Meier. Se calculó el tiempo medio de supervivencia (MST) para cada grupo. El aumento de la esperanza de vida (ILS) se calculó según la siguiente fórmula: ILS (%) = (MSTTratamiento- MSTVehículo)/ MSTVehículo x 100 %).

ILS (%) > 25 % se considerará un beneficio de supervivencia biológicamente significativo según los criterios del Instituto Nacional del Cáncer.

El cambio relativo del peso corporal (RCBW) de cada ratón se calculó según la siguiente fórmula: RCBW (%) = (BWi - BW0)/BWü x 100 %, en donde BWi se refiere al peso corporal promedio en el día i, y BW0 referido al peso corporal promedio el día 0.

Los volúmenes tumorales (TV) se calcularon en base a la siguiente fórmula: volumen tumoral = (longitud x anchura2)/2

La tasa de inhibición del crecimiento tumoral (% de TGI) de cada grupo de dosificación se calculó según la siguiente fórmula: % de TGI = [1-TVi/TVvi]*100 %, en donde TVi se refiere al volumen tumoral promedio de un grupo de dosificación el día i, y TVvi se refirió al volumen tumoral promedio del grupo del vehículo el Día i.

La media y el error estándar de la media (EEM) del peso corporal de los ratones, el RCBW y el volumen del tumor de cada grupo se calcularon utilizando Microsoft Excel 2007. Se representaron gráficamente las cifras del peso corporal, el cambio relativo del peso corporal, la curva de crecimiento del tumor y la inhibición del crecimiento del tumor usando GraphPad Prism 5. El crecimiento tumoral entre diferentes grupos se analizó usando RM ANOVA de dos vías. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se analizaron usando la prueba Log-Rank. Un valor de P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Todo el estudio finalizó en el D65. Las curvas de crecimiento tumoral individuales de cada grupo se mostraron en la Fig. 14A. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de tiempo hasta el punto final de los animales se mostraron en la Fig. 14B. Todos los tratamientos fueron tolerados sin ningún efecto adverso, como se observa en la Fig. 14C. En la mayoría de estos grupos, todos los ratones fueron sacrificados cuando el volumen del tumor alcanzó los 2000 mm3. En el Grupo 7, 3 de 9 ratones tratados con CL5'-eA-dPTM' a 5,4 mpk sobrevivieron libres de tumores en D65. En el Grupo 9, 2 de 9 ratones a los que se les administró CL5'-eA-dPTM' a 0,54 mpk sobrevivieron libres de tumores en D65.

El MST se calculó para cada grupo y se mostró en la Tabla 8. El MST del grupo de vehículo hIgG1 a 5,4 mpk y CL20'-eA a 5,4 mpk fueron ambos de 14 días. Los MST de los grupos de tratamiento con análogo de ipilimumab a 10 mpk y 1 mpk, CL5'-dPTM' a 5,4 mpk y 0,54 mpk, CL5'-eA-dPTM' a 5,4 mpk, 1,5 mpk y 0,54 mpk fueron 14, 23, 19, 21, 14, 40, 21 y 28 días, respectivamente. También se puede observar en la Tabla 8 que las ILS en los grupos de tratamiento fueron 64,3 %, 35,7 %, 50 %, 0 %, 185,7 %, 50 % y 100 % en comparación con el grupo de tratamiento con vehículo hIgG1. El análogo de ipilimumab a 10 mpk, CL5'-dPTM' a 5,4 mpk, CL5'-eA-dPTM' a 5,4 mpk, 1,5 mpk y 0,54 mpk aumentaron significativamente el tiempo medio de supervivencia. Los ratones tratados con CL5'-eA-dPTM' a 5,4 mpk tuvieron una mejor ILS que aquellos con el análogo de ipilimumab a 10 mpk.

Tabla 8. Análisis de supervivencia

Nota: ILS:(MST<go>-MST<gi>)/MST<gi>*100 %; El valor de p son todos los grupos en comparación con el grupo G1.

Ejemplo 16 - Inhibición del crecimiento del tumor MC38 en ratones knock in hCTLA-4 mediante HCAb anti-CTLA-4

La línea celular MC-38 de carcinoma de colon murino criopreservado se recuperó y se cultivó en medio DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 % y penicilina estreptomicina al 1 % a 37 °C para obtener suficientes células para la implantación del tumor. Las células MC-38 cultivadas se recogieron y se resuspendieron en PBS a una densidad de 5 x 106 células/ml con viabilidad >90 % y se implantaron por vía subcutánea en el flanco derecho de 60 ratones knock in hCTLA-4. Siete días después de la inoculación del tumor, 30 ratones portadores de tumores con un tamaño medio de tumor de 102 mm3 fueron seleccionados y aleatorizados en 5 grupos (n = 6) según el tamaño de sus tumores. Los tratamientos se iniciaron el día de la aleatorización (definido como DO). Los ratones inscritos fueron tratados con hlgGI (0,5 mpk), el análogo de Ipilimumab (0,5 y O,2 mpk) y CL5'-eA-dPTM' (O,27 y 0,1 mpk) respectivamente, por vía intraperitoneal (i.p.) en DO, D6, D9, D l3, D16 y D l9. Los ratones fueron monitorizados diariamente y se registraron los pesos corporales en los días laborales. Los tamaños de los tumores se midieron dos veces por semana durante el tratamiento.

El cambio relativo del peso corporal (RCBW), los volúmenes tumorales (TV) y la tasa de inhibición del crecimiento tumoral (% de TGl) se calcularon como en el Ejemplo 16. Se calculó la media, error estándar de la media (EEM) del peso corporal de los ratones, RCBW y volumen del tumor de cada grupo usando Microsoft Excel 2OO7. Las cifras de peso corporal, cambio relativo del peso corporal, curva de crecimiento tumoral e inhibición del crecimiento tumoral se representaron usando GraphPad Prism 5. El crecimiento tumoral entre diferentes grupos se analizó usando RM ANOVA de dos vías. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se analizaron mediante la prueba Log-Rank. Un valor de P <O,O5 se consideró estadísticamente significativo.

Las curvas de crecimiento tumoral se muestran en la Fig. 15A. Todos los tratamientos fueron tolerados sin ningún efecto adverso, como se observa en la Fig. 15B. Los ratones en grupos de CL5'-eA-dPTM' a 0,1 mpk y O,27 mpk, análogo de ipilimumab a 0,5 mpk mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral de D20 a D30 en comparación con los ratones en el grupo de hlgGI a O,2 mpk. Mientras, el tratamiento con análogos de ipilimumab a O,2 mg/kg no mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con hlgG 1 a O,2 mpk. CL5'-eA-dPTM' promovió una mejor inhibición del crecimiento tumoral que el análogo de ipilimumab a la misma dosis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, que comprende un dominio de unión a CD152, en donde el dominio de unión a CD152 comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena pesada únicamente, en donde el anticuerpo comprende la función efectora de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).

2. El anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina o consiste en dos cadenas pesadas de inmunoglobulina.

3. El anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 1 o 2, en donde la cadena pesada de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182.

4. El anticuerpo monoclonal aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

5. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo monoclonal aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en donde el excipiente farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en vehículos, agentes tensioactivos, agentes espesantes o emulsionantes, aglutinantes sólidos, auxiliares de dispersión o suspensión, solubilizantes, colorantes, agentes saborizantes, recubrimientos, agentes desintegrantes, lubricantes, edulcorantes, conservantes, agentes isotónicos y una combinación de los mismos.

6. La composición farmacéutica según la reivindicación 5, que comprende además un segundo anticuerpo, en donde el segundo anticuerpo es un anticuerpo inmunoestimulador o anticuerpo coestimulador, preferiblemente en donde el anticuerpo inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-LAG-3, un anticuerpo anti-TIM 3, un anticuerpo anti-STAT3 y un anticuerpo anti-ROR1; y preferiblemente en donde el anticuerpo coestimulador es un anticuerpo anti-CD137 o un anticuerpo anti-GITR.

7. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, preferiblemente en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 181.

8. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, en donde la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a secuencias reguladoras adecuadas para la expresión del segmento de ácido nucleico en una célula huésped.

9. Una célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 8.

10. El anticuerpo monoclonal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición farmacéutica según la reivindicación 5 o 6, para el uso en el tratamiento de un trastorno, en donde el trastorno es un cáncer o una enfermedad autoinmune, preferiblemente en donde el trastorno es un cáncer, preferiblemente en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, linfoma, CLL, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células B de células marginales, linfoma de Burkett, carcinoma de células renales, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de células escamosas epiteliales, melanoma, mieloma, cáncer de estómago, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de tiroides y cáncer de cabeza y cuello.

11. El anticuerpo monoclonal aislado o la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 10, en donde el anticuerpo monoclonal aislado o la composición farmacéutica se combina con un agente terapéutico adicional, preferiblemente en donde el agente terapéutico adicional es un agente anticancerígeno, preferiblemente en donde el agente terapéutico adicional es Ipilimumab o un producto biosimilar del mismo, en donde el producto biosimilar es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CTLA-4 y comprende una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 199 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 200.