CN116057070A - 抗cd40结合分子和包括其的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了与CD40结合的抗体(例如，人源化抗体)和包括其的双特异性抗体，用于靶向CD40和第二个合适的抗原(例如肿瘤抗原或免疫检查点分子)。第二抗原的实例包括PD‑1、PD‑L1、HER2、B7H3、B7H4、坏死肿瘤细胞(TNT)或CEA。本文还提供了此类抗体的治疗用途。

Description

抗CD40结合分子和包括其的双特异性抗体
相关申请
本申请要求于2019年10月23日提交的国际申请号PCT/CN2009/112809，标题为“抗CD40结合分子和包括此类分子的双特异性抗体”的优先权和权益，其全部内容出于所有目的通过引用并入本文。
背景技术
分化簇40(CD40)是抗原呈递细胞(APC)激活所需的APC共刺激蛋白。CD40是肿瘤坏死因子(TNF)-受体超家族的成员，并且是各种免疫应答和炎症反应(包括T细胞依赖性免疫球蛋白类别转换、记忆B细胞发育和生发中心形成)所必需的。另外，CD40发现于肿瘤细胞(例如B淋巴瘤)的表面上并且占所有实体瘤的约70％。已经显示，其激活逆转对肿瘤特异性抗原的耐受性，从而导致抗原特异性抗肿瘤免疫。
涉及激活的免疫细胞的疗法是用于消除患病细胞(例如癌细胞)的有前景的方法。然而，这种治疗方法经常引起安全问题。例如，过度激活的免疫细胞将导致非期望的细胞毒性，从而造成组织损伤。因此，开发有效且安全的新免疫疗法具有重大意义。
发明内容
本公开至少部分基于人源化抗CD40抗体的开发，该人源化抗CD40抗体相对于鼠亲本具有相似CD40结合亲和力、CD40激动活性和显著抗肿瘤活性。本文还提供了包括该人源化抗CD40抗体和第二抗原结合部分的双特异性抗体(bsAb)，该第二抗原结合部分对肿瘤抗原或免疫检查点分子(例如，HER2、坏死肿瘤细胞(TNT)、癌胚抗原(CEA)、PD-1、PD-L1、B7H3或B7H4)具有特异性。与从中获得bsAb的亲本单克隆抗体相比，此类双特异性抗体显示出出乎意料的优异生物活性，例如，对CD40的激动活性、树突细胞(DC)激活和体内抗肿瘤活性。例如，PD-1/CD40 bsAb克隆Ly517和Ly518，以及PD-L1/CD40 bsAb克隆Ly338、Ly303、Ly340、Ly342和Ly343表现出优异的抗肿瘤活性，而没有明显的肝毒性。
因此，在一方面，本公开的特征在于一种特异于人CD40的人源化抗体，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，人源化抗CD40抗体包括VH链，该VH链包括IGHV3-73*01框架以及重链互补决定区(CDR)1、2和3。在一些实例中，重链CDR与亲本鼠抗体Lyv377的重链CDR相同。在其他实例中，相对于亲本鼠抗体Lyv377，重链CDR总共包含不超过5个氨基酸残基变异。
在一些实施方案中，人源化抗CD40抗体包括VH链，该VH链包括IGHV3-23*04框架以及重链CDR 1、2和3。在一些实例中，重链CDR与亲本鼠抗体Lyv378的重链CDR相同。在其他实例中，相对于亲本鼠抗体Lyv378，重链CDR总共包含不超过5个氨基酸残基变异。
可选地或另外地，本文公开的人源化抗CD40抗体的VL链可以包括IGKV1-39*01框架以及轻链CDR 1、2和3。在一些实例中，轻链CDR与亲本鼠抗体Lyv377的轻链CDR相同。可选地，相对于亲本鼠抗体Lyv377，轻链CDR具有不超过5个氨基酸残基变异。在一些实例中，轻链CDR与亲本鼠抗体Lyv378的轻链CDR相同。可选地，相对于亲本鼠抗体Lyv378，轻链CDR具有不超过5个氨基酸残基变异。
在一些实例中，本文公开的人源化抗CD40抗体可以包括(a)IGHV3-73*01重链框架和源自鼠亲本抗体Lyv377的重链CDR(例如，相同或总共包含不超过5个氨基酸变异)，和(b)IGKV1-39*01轻链框架和源自鼠亲本抗体Lyv377的轻链CDR(例如，相同或总共包含不超过5个氨基酸变异)。
在一些实例中，本文公开的人源化抗CD40抗体可以包括(a)IGHV3-23*04重链框架和源自鼠亲本抗体Lyv378的重链CDR(例如，相同或总共包含不超过5个氨基酸变异)，和(b)IGKV1-39*01轻链框架和源自鼠亲本抗体Lyv378的轻链CDR(例如，相同或总共包含不超过5个氨基酸变异)。
在具体实例中，本文公开的人源化抗CD40抗体可以包括VH链，该VH链包括：包括GFNFNDSFMN(SEQ ID NO:1)、GFNFQDSFMN(SEQ ID NO:2)、GFNFNDAFMN(SEQ ID NO:3)或GFNFNDYFMN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的重链CDR1，包括QIRNKNYNYATYYTESLEG(SEQ IDNO:5)的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包括YYYDGFADYFDY(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的重链CDR3。可选地或另外地，人源化抗CD40抗体可以包括VL链，该VL链包括：分别包括氨基酸序列KASQNIYIYLN(SEQ ID NO:7)、NTNNLQT(SEQ ID NO:8)和LQHSSRRT(SEQ ID NO:9)的轻链CDR1、轻链CDR2和/或轻链CDR。
在一些实施方案中，相对于野生型对应物，人源化抗CD抗体中的VH可以包括VH框架中的一个或多个突变。在一些实例中，VH框架中的突变是基于亲本鼠抗体中相应位置的氨基酸残基的回复突变。示例性回复突变包括E1Q、A24T、F70V和/或R100S。在一些具体实例中，人源化抗CD40抗体的VH可以包括SEQ ID NO:10-14的氨基酸序列。可选地或另外地，人源化抗CD40抗体的VL可以包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗CD40抗体中的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3可以分别包括GFTFTNYGLH(SEQ ID NO:16)、SISPSGGVTYYRDSVKG(SEQ ID NO:17)和PFLGWGGANWIAH(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列。可选地或另外地，人源化抗CD40抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3可以分别包括LASEDISNDLA(SEQ ID NO:19)、FVDRLLD(SEQ IDNO:20)和QQSYKYPPT(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列。在具体实例中，VH可以包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列和/或VL可以包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
本文公开的任何人源化抗CD40抗体可以是全长抗体。在一些实例中，全长抗体可以是IgG/κ分子。例如，全长抗体可以包括重链，该重链为IgG1、IgG2或IgG4链。在一些实例中，重链可以包括突变Fc区，与野生型对应物相比，该突变Fc区表现出对Fc受体具有改变的结合亲和力或选择性。
在具体实例中，人源化抗CD40抗体可以是TM550、TM553、LP3771、LP3772、LP3773、TM738、TM739、TM740和Ly181。可选地，人源化抗CD40抗体可以是TM559、LP3781、LP3782和LP3783。
在另一方面，本文提供了抗PD-L1抗体，其包括：(i)包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，该重链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv5574的重链CDR相同或相对于参考抗体Lyv5574包含不超过5个氨基酸残基变异；和(ii)包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，该轻链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv5574的轻链CDR相同或相对于参考抗体Lyv5574包含不超过5个氨基酸残基变异。在一些实例中，抗PD-L1抗体包括：包括与抗体Lyv5574的重链CDR相同的重链CDR的VH和包括与参考抗体Lyv5574的轻链CDR相同的轻链CDR的VL。
在一些实施方案中，本文公开的抗PD-L1抗体的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3可以分别包括GYTFTDFWMS(SEQ ID NO:24)、QIYPNTGTTHSNEKFKG(SEQ ID NO:25)和SYHISTTPNWFAY(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。可选地或另外地，抗PD-L1抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3可以分别包括KASQNVYKKLE(SEQ ID NO:27)、HTNILQT(SEQ ID NO:28)和YQWNSGPT(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列。
本文公开的任何抗PD-L1抗体可以是人抗体或人源化抗体。在一些实例中，人源化抗体的VH可以包括人IGHV1-46*01框架。可选地或另外地，人源化抗体的VL可以包括人IGKV1-27*01框架。在具体实例中，VH可以包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列，和/或VL包括SEQID NO:31的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与野生型对应物相比，本文公开的人源化抗PD-L1抗体的VH和/或VL可以包括人VH和/或VL框架中的一个或多个突变，例如，在VL链中的位置L42(例如，L42V)和/或F71(例如，F71V)。在一个实例中，人源化抗PD-L1抗体的VL可以包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
本文公开的任何抗PD-L1抗体可以是全长抗体，例如，IgG1/κ分子。在一些实例中，全长抗体可以包括重链，该重链包括突变Fc区，与其野生型对应物相比，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性。
在具体实例中，本文公开的抗PD-L1抗体是Ly074、Ly075或Ly076。
在又一方面，本公开提供一种分离的抗B7H3抗体，其包括：(i)包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，该重链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv383或Lyv387的重链CDR相同，或相对于参考抗体Lyv383或Lyv387包含不超过5个氨基酸残基变异；和(ii)包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，该轻链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv383或Lyv387的轻链CDR相同，或相对于参考抗体Lyv383或Lyv387包含不超过5个氨基酸残基变异。
在一些实例中，抗B7H3抗体可以包括：包括源自参考抗体Lyv383的重链CDR(例如，相同或包含不超过5个氨基酸变异)的VH和包括源自参考抗体Lyv383的轻链CDR(例如，相同或包含不超过5个氨基酸变异)的VL。例如，抗B7H3抗体可以包括：包括与参考抗体Lyv383相同的重链CDR的VH和包括与参考抗体Lyv383相同的轻链CDR的VL。
在一些实例中，抗B7H3抗体可以包括：包括源自参考抗体Lyv387的重链CDR(例如，相同或包含不超过5个氨基酸变异)的VH和包括源自参考抗体Lyv387的轻链CDR(例如，相同或包含不超过5个氨基酸变异)的VL。例如，抗B7H3抗体可以包括：包括与参考抗体Lyv387相同的重链CDR的VH和包括与参考抗体Lyv387相同的轻链CDR的VL。
在一些实施方案中，本文公开的抗B7H3抗体可以包括(a)重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3分别包括GYTFTSYVMH(SEQ ID NO:33)、INPYNDGTECTDKFKG(SEQ ID NO:34)和SIYYGYDGTYFGV(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列，或(b)重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3分别包括GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:36)、MIHPNSGGTNYNEKFKG(SEQ ID NO:37)和SQATWFAY(SEQ IDNO:38)的氨基酸序列。可选地或另外地，本文公开的抗B7H3抗体可以包括(a)轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3分别包括RASSSVSYMH(SEQ ID NO:39)、TSNLAS(SEQ ID NO:40)和QQWSSNTLT(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列；或(b)轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3分别包括RASSSVSSSYLH(SEQ ID NO:42)、STSNLAS(SEQ ID NO:43)和QHYSGYPLT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列。
在一些实例中，本文公开的抗B7H3抗体可以包括(a)分别包括GYTFTSYVMH(SEQ IDNO:33)、INPYNDGTECTDKFKG(SEQ ID NO:34)和SIYYGYDGTYFGV(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及(b)分别包括RASSSVSYMH(SEQ ID NO:39)、TSNLAS(SEQ ID NO:40)和QQWSSNTLT(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。在具体实例中，抗B7H3抗体中的VH可以包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和/或其中VL可以包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在其他实例中，本文公开的抗B7H3抗体可以包括(a)分别包括GYTFTSYWMH(SEQ IDNO:36)、MIHPNSGGTNYNEKFKG(SEQ ID NO:37)和SQATWFAY(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；以及(b)分别包括RASSSVSSSYLH(SEQ ID NO:42)、STSNLAS(SEQ ID NO:43)和QHYSGYPLT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。在具体实例中，抗B7H3抗体的VH可以包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和/或VL可以包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
本文公开的任何抗B7H3抗体可以是人抗体或人源化抗体。在一些实施例中，该抗体是全长抗体，例如IgG/κ分子。在一些实施方案中，全长抗体包括重链，该重链包括突变Fc区，相对于野生型对应物，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性。
此外，本公开的特征还在于一种分离的抗B7H4抗体，其包括：(i)包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，该重链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv361或Lyv366的重链CDR相同，或相对于参考抗体Lyv361或Lyv366包含不超过5个氨基酸残基变异；和(ii)包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VH)，该轻链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv361或Lyv366的轻链CDR相同，或相对于参考抗体Lyv361或Lyv366包含不超过5个氨基酸残基变异。
在一些实例中，抗B7H4抗体可以包括：包括源自参考抗体Lyv361的重链CDR(例如，相同或包含不超过5个氨基酸变异)的VH和包括源自参考抗体Lyv361的轻链CDR(例如，相同或包含不超过5个氨基酸变异)的VL。例如，抗B7H4抗体可以包括：包括与参考抗体Lyv361相同的重链CDR的VH和包括与参考抗体Lyv361相同的轻链CDR的VL。
在一些实例中，抗B7H4抗体可以包括：包括源自参考抗体Lyv366的重链CDR(例如，相同或包含不超过5个氨基酸变异)的VH和包括源自参考抗体Lyv366的轻链CDR(例如，相同或包含不超过5个氨基酸变异)的VL。例如，抗B7H3抗体可以包括：包括与参考抗体Lyv366相同的重链CDR的VH和包括与参考抗体Lyv366相同的轻链CDR的VL。
在一些实施方案中，本文公开的抗B7H4抗体可以包括：(a)分别包括GFTFSSYGMS(SEQ ID NO:49)、AISTGGSYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:50)和RGATGSWFAY(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，或(b)分别包括GFTFSDSGMH(SEQ ID NO:52)、YINSGSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:53)和GRGYAMDY(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。可选地或另外地，抗B7H4抗体可以包括：(a)分别包括HASQGINNNIG(SEQ ID NO:55)、GTNLED(SEQ ID NO:56)和VQYVQFPRT(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；或(b)分别包括SASSSISSDFLH(SEQ ID NO:58)、RISNLAS(SEQ ID NO:59)和QQGSNVPRT(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。
在一些实例中，本文公开的抗B7H4抗体可以包括(a)分别包括GFTFSSYGMS(SEQ IDNO:49)、AISTGGSYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:50)和RGATGSWFAY(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及(b)分别包括HASQGINNNIG(SEQ ID NO:55)、GTNLED(SEQ ID NO:56)和VQYVQFPRT(SEQ ID NO:57)的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。在具体实例中，本文公开的抗B7H4抗体可以包括SEQ ID NO:61的VH和/或SEQ ID NO:62的VL。
在其他实例中，本文公开的抗B7H4抗体可以包括：(a)分别包括GFTFSDSGMH(SEQID NO:52)、YINSGSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:53)和GRGYAMDY(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；以及(b)分别包括SASSSISSDFLH(SEQ ID NO:58)、RISNLAS(SEQ ID NO:59)和QQGSNVPRT(SEQ ID NO:60)的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。在具体实例中，抗B7H4抗体可以包括SEQ ID NO:63的VH，和/或其中SEQ ID NO:64的VL。
本文公开的任何抗B7H4抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。可选地或另外地，抗体可以是全长抗体，例如，IgG/κ分子。在一些实例中，全长抗体可以包括重链，该重链包括突变Fc区，与野生型对应物相比，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性。
在一些方面，本文提供了一种分离的抗PD-1抗体，其中该抗体包括：(i)包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，该重链CDR 1、2和3与参考抗体Ly516的重链CDR相同；和(ii)包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，该轻链CDR 1、2和3与参考抗体Ly516的轻链CDR相同。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以包括与抗体Ly516相同的VH和相同的VL。本文公开的任何抗PD-1抗体可以是全长抗体。在一些实例中，全长抗体是IgG/κ分子。在具体实例中，全长抗体包括重链，该重链包括突变Fc区，相对于其野生型对应物，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性。
此外，本文提供了一种双特异性抗体，其包括：(a)第一抗体部分，该第一抗体部分结合人CD40，和(b)第二抗体部分，该第二抗体部分结合选自由HER2、坏死肿瘤细胞(TNT)、癌胚抗原(CEA)、PD-1、PD-L1、B7H3和B7H4组成的组。在一些实施方案中，第一抗体部分或第二抗体部分为单链抗体(scFv)形式。scFv部分可以为VH至VL方向(从N-末端至C-末端)。在其他实例中，scFv部分可以为VL至VH方向(从N-末端至C-末端)。可选地或另外地，其他抗体部分为包括重链和轻链的全长抗体形式。
在一些实施方案中，结合人CD40的第一抗体部分是scFv和/或第二抗体部分包括包括抗体重链的第一多肽和包括抗体轻链的第二多肽。scFv可以与第一多肽或第二多肽融合。在一些实例中，抗CD40 scFv链与第一多肽融合，该第一多肽包括对第二抗原(例如本文公开的那些)具有特异性的抗体的重链。scFv可以与第一多肽的N-末端融合。可选地，scFv可以与第一多肽的C-末端融合。在其他实例中，抗CD40 scFv链与第二多肽融合，该第二多肽包括对第二抗原(例如本文公开的那些)具有特异性的抗体的轻链。scFv可以与第二多肽的N-末端融合。可选地，scFv可以与第二多肽的C-末端融合。
在一些实施方案中，结合人CD40的第一抗体部分是如本文公开的人源化抗CD40抗体，例如源自Lyv377或Lyv378的那些。在一些实例中，人源化抗CD40抗体(例如，scFv形式)可以包括：包括SEQ ID NOs:10-14的氨基酸序列的VH链和/或包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL链。在一些实例中，人源化抗CD40抗体(例如，scFv形式)可以包括：包括SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH链和/或包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL链。在其他实施方案中，结合人CD40的第一抗体部分可以具有与抗体Ly253相同的重链和轻链CDR。
在一些实施方案中，第二抗体部分结合PD-L1，例如，本文公开的任何抗PD-L1抗体。在一些实例中，抗PD-L1部分可以包括：包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH和/或包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL。在一些实例中，抗PD-L1部分可以包括：包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH和/或包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。抗CD40/抗PD-L1双特异性抗体的实例包括Ly301、Ly303、Ly338、Ly339、Ly340、Ly341、Ly342、Ly343、Ly344、Ly345、Ly349和Ly350。
在一些实施方案中，第二抗体部分结合B7H3，例如，本文公开的任何抗B7H3抗体。在一些实例中，抗B7H3部分可以包括：包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VH，和/或包括SEQID NO:46的氨基酸序列的VL。在一些实例中，抗B7H3部分可以包括：包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH，和/或包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VL。抗CD40/抗B7H3双特异性抗体的实例包括Ly610、Ly611、Ly612、Ly613、Ly614、Ly615、Ly616、Ly617、Ly801、Ly802、Ly803、Ly804、Ly805、Ly806、Ly807、Ly808、Ly809、Ly810、Ly811、Ly812、Ly813、Ly814、Ly815和Ly816。
在一些实施方案中，第二抗体部分结合B7H4，例如，本文公开的任何抗B7H4抗体。在一些实例中，抗B7H4部分可以包括：包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH，和/或包括SEQID NO:62的氨基酸序列的VL。在一些实例中，抗B7H4部分可以包括：包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VH，和/或包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL。抗CD40/抗B7H4双特异性抗体的实例包括Ly474、Ly475、Ly476、Ly477、Ly478、Ly479、Ly480、Ly481、Ly482、Ly483、Ly484、Ly485、Ly486、Ly487、Ly488、Ly489、Ly490、Ly491、Ly492、Ly493、Ly494、Ly495、Ly496和Ly497。
在一些实施方案中，第二抗体部分结合CEA。例如，第二抗体部分可以包括与参考抗体Ly311相同的重链CDR，和/或与参考抗体Ly311相同的轻链CDR。在一些实例中，第二抗体部分可以包括与参考抗体Ly311相同的VH和/或与参考抗体Ly311相同的VL。在一些实施方案中，第二抗体部分包括与参考抗体Ly312相同的重链CDR，和/或与参考抗体Ly312相同的轻链CDR。在一些实例中，第二抗体部分可以包括与参考抗体Ly312相同的VH(例如，重链)，和/或与参考抗体Ly312相同的VL(例如，相同的轻链)。实例包括Ly401、Ly402、Ly403、Ly404、Ly405、Ly406、Ly407、Ly408、Ly409、Ly410、Ly411、Ly412、Ly413、Ly414、Ly415、Ly416、Ly417、Ly418、Ly419、Ly420、Ly421、Ly422、Ly423和Ly424。
在一些实施方案中，第二抗体部分结合TNT(坏死肿瘤细胞)。在一些实例中，第二抗体部分包括与参考抗体Ly368相同的重链CDR；和/或与参考抗体Ly368相同的轻链CDR。在一些实例中，第二抗体部分包括与参考抗体Ly368相同的VH(例如，重链)；和/或与参考抗体Ly368相同的VL(例如，轻链)。实例包括Ly462、Ly463、Ly464、Ly465、Ly466、Ly467、Ly468、Ly469、Ly470、Ly471、Ly472和Ly473。
在一些实施方案中，第二抗体部分结合PD-1。例如，第二抗体部分包括与抗体Ly516相同的重链CDR；和/或与抗体Ly516相同的轻链CDR。在一些实例中，第二抗体部分包括与抗体Ly516相同的VH(例如，重链)；和/或其中第二抗体部分包含与抗体Ly516相同的VL(例如，轻链)。抗CD40/抗PD1双特异性抗体的实例包括Ly517、Ly518、Ly519、Ly520、Ly606、Ly607、Ly608、Ly609、Ly817、Ly818、Ly819和Ly820。
在一些实施方案中，第二抗体部分结合HER2。例如，第二抗体部分包括与参考抗体TM737相同的重链CDR和/或与参考抗体TM737相同的轻链CDR。在一些实例中，第二抗体部分包括与参考抗体TM737相同的VH(例如，重链)和/或与参考抗体TM737相同的VL(例如，轻链)。在其他实例中，第二抗体部分包括与参考抗体Ly591相同的重链CDR和/或与参考抗体Ly591相同的轻链CDR。在一些实例中，第二抗体部分包括与参考抗体Ly591相同的VH(例如，重链)和/或与参考抗体Ly591相同的VL(例如，轻链)。抗CD40/抗HER2双特异性抗体的实例包括Ly618、Ly619、Ly620、Ly621、Ly622、Ly623、Ly624、Ly625、Ly821、Ly822、Ly823、Ly824、Ly825、Ly826、Ly827、Ly828、Ly829、Ly830、Ly831、Ly832、Ly833、Ly834、Ly835和Ly836。
本文还提供了一种核酸或核酸集，其共同编码本文公开的任何抗体。在一些实例中，核酸或核酸集可以是表达载体或表达载体集。此外，本文提供了包括本文公开的任何核酸或核酸集的宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)。
此外，本公开的特征在于一种用于产生本文公开的任何抗体的方法，该方法包括：(i)在实现抗体表达的条件下培养本文公开的任何宿主细胞；和(ii)收获由此产生的抗体。
本公开的范围还包括一种用于调节免疫应答的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的任何抗体。在一些实例中，受试者是患有或疑似患有癌症的人患者。此外，本文提供了包括本文公开的任何抗体的药物组合物，用于治疗本文公开的目标疾病，或此类抗体用于生产用于预期医学用途的药物的用途，也如本文所公开。
在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的详细信息。本发明的其他特征或优点从以下附图和若干实施方案的详细描述以及也从所附权利要求中将变得显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本公开的某些方面，通过参考附图并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本公开的某些方面。
图1A-1F是显示所示抗CD40抗体与在CHO细胞上表达的人CD40的结合活性(如x轴所示)的图表。柱状图(“IgG对照”和“第二”)用作对照。这些抗CD40抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。1A：如所示不同浓度的克隆TM377、TM378、TM550和TM553。1B：如所示不同浓度的克隆TM559。1C：如所示不同浓度的克隆TM738、TM739、TM740和TM553。1D：如所示不同浓度的克隆Ly181和TM740。1E：如所示不同浓度的克隆LP3771、LP3772、LP3773、LP3781、LP3782和LP3783。1F：如所示不同浓度的克隆TM377、Ly253-G4和Ly253-G2。
图2A-2D是显示在报告基因测定中许多抗CD40抗体对人CD40激活的刺激(如IL8分泌所示)的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴表示CD40激活信号。2A：如所示不同浓度的克隆TM377、TM550、TM553、TM378、TM559和Ly253-G4。2B：如所示不同浓度的克隆TM553、LP3771、LP3772、LP3773、Ly253-G4、Ly253-G2、TM559、LP3781、LP3782和LP3783。2C：如所示不同浓度的克隆TM738、TM739、TM740、LP3773和Ly253-G2。2D：如所示不同浓度的克隆Ly181、TM740、LP3783和Ly253-G2。
图3是显示示例性人源化抗CD40抗体克隆TM740、LP3783和克隆Ly253的抗肿瘤活性的图表。
图4A和4B是显示如接种MC38肿瘤细胞的人CD40敲入小鼠同系模型中所示，人源化抗CD40抗体处理后血清丙氨酸转氨酶(ALT，肝损伤时释放到血清中的肝酶)水平的图表。
图5是显示所示抗PD-L1抗体与在CHO细胞上表达的人PD-L1的结合活性(如x轴所示)的图表。标记为“IgG对照”、“第二”和“空白”的柱状图用作对照。这些抗PD-L1抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。
图6是显示抗PD-L1抗体的阻断作用的图表。X轴表示抗体，并且y轴上的RLU信号反映了PD-1/PD-L1相互作用的阻断导致信号增加。
图7是显示在使用人PD-L1过表达MC38肿瘤细胞的人PD-L1敲入小鼠同系模型中抗PD-L1抗体的抗肿瘤活性的一组图。显示了平均和单个肿瘤体积。左上图：克隆Ly075和Ly076的抗肿瘤作用。右上图：对照。左下图：克隆Ly075的抗肿瘤作用。右下图：克隆Ly076的抗肿瘤作用。
图8A-8B是显示所示抗PD-L1/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人PD-L1的PD-L1结合活性(如x轴所示)的图表。标记为“IgG对照”的柱状图用作对照。这些抗PD-L1/CD40双特异性抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。8A：如所示不同浓度的克隆Ly301、Ly338、Ly339、Ly349、Ly303、Ly340和Ly076。8B：如所示不同浓度的克隆Ly341、Ly350、Ly342、Ly343、Ly344、Ly345和Ly076。
图9A-9B是显示所示抗PD-L1/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人CD40的CD40结合活性(如x轴所示)的图表。Ly076用作对照。这些抗PD-L1/CD40双特异性抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。9A：如所示不同浓度的克隆Ly301、Ly338、Ly339、Ly349、Ly303、Ly340、TM740、Ly253-G2和Ly076。9B：如所示不同浓度的克隆Ly341、Ly350、Ly342、Ly343、Ly344、Ly345、TM740、Ly253-G2和Ly076。
图10A-10L是显示示例性抗PD-L1/CD40抗体同时结合重组人PD-L1和CD40蛋白的图表。如所示不同浓度的克隆Ly339(10A)、Ly303(10B)、Ly349(10C)、Ly338(10D)、Ly342(10E)、Ly301(10F)、Ly343(10G)、Ly341(10H)、Ly340(10I)、Ly345(10J)、Ly350(10K)和Ly344(10L)。
图11A-11D是显示在报告基因测定中许多抗PD-L1/CD40抗体对人CD40激活的刺激(如IL8分泌所示)的图表。在溶液中或与PD-L1过表达CHO细胞共培养时评价这些双特异性抗体的激动活性。X轴表示各种抗体，并且y轴表示CD40激活信号。标记为“IgG对照”和“培养基”的柱状图用作对照。11A：克隆Ly301、Ly338、Ly339、Ly349、Ly303、Ly340、Ly341、Ly350、TM740、Ly253-G2和Ly076以如所示不同浓度存在于溶液中。11B：将克隆Ly301、Ly338、Ly339、Ly349、Ly303、Ly340、Ly341、Ly350、TM740、Ly253-G2和Ly076以所示不同浓度与PD-L1过表达CHO-K1细胞共培养。11C：克隆Ly342、Ly343、Ly344、Ly345、TM740、Ly253-G2和Ly076以所示不同浓度存在于溶液中。11D：克隆Ly342、Ly343、Ly344、Ly345、TM740、Ly253-G2和Ly076以所示不同浓度与PD-L1过表达CHO-K1细胞共培养。
图12A-12B是显示示例性抗PD-L1/抗CD40双特异性抗体对PD-1/PD-L1通路的阻断作用的图表。X轴表示抗体，并且y轴上的RLU信号反映了PD-1/PD-L1相互作用的阻断导致信号增加(例如，PD-1激活)。12A：示例性克隆Ly301、Ly338、Ly349、Ly340、Ly350、Ly341、Ly253-G2和Ly076的阻断作用。12B：示例性克隆Ly342、Ly344、Ly343、Ly345、Ly253-G2和Ly076的阻断作用。
图13A-13B是显示示例性抗PD-L1/CD40双特异性抗体对SEB激活的人PBMC的刺激活性的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴表示IL-2分泌对人PBMC细胞的刺激。13A：由克隆Ly301、Ly338、Ly349、Ly339、Ly303、Ly340、TM559、Ly253-G2、Ly076和Tecentriq激活的PBMC分泌IL-2。13B：由克隆Ly350、Ly341、Ly344、Ly343、Ly345、TM559、Ly253-G2和Ly076激活的PBMC产生的IL-2。使用亲本抗PD-L1或抗CD40抗体未观察到由某些双特异性抗体(例如，Ly301、Ly338、Ly349、Ly339、Ly303和Ly340)实现的激活作用。
图14A-14B是显示许多抗PD-L1/CD40双特异性抗体对来自两个健康供体的人B细胞增殖的活性的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴上的发光信号(RLU)表示人B细胞增殖。14A：供体1。14B：供体2。
图15A-15D包括一组柱状图，显示示例性抗PD-L1/CD40双特异性抗体在通过溶液中(图15A和15C)或表达人PD-L1的CHO细胞的共培养中(图15B和15D)的抗体激活来自两个健康供体的人树突细胞(DC)中的活性。DC激活由培养物上清液中的IL-8的柱状图信号指示。双特异性抗体的Dc激活活性远高于抗CD40 mAb。
图16A-16C包括显示小鼠中所示抗PD-L1/CD40双特异性抗体的药代动力学的一组图。16A：克隆Ly301(左上)、Ly338(右上)、Ly339(左下)和Ly349(右下)。16B：克隆Ly303(左上)、Ly340(右上)、Ly341(左下)和Ly350(右下)。16C：克隆Ly342(左上)、Ly343(右上)、Ly344(左下)和Ly345(右下)。
图17A-17C是显示在使用人PD-L1过表达MC38肿瘤细胞的人CD40敲入小鼠同系模型中抗PD-L1/CD40抗体的抗肿瘤活性的一组图。17A：克隆Ly301、Ly338、Ly349、Ly253-G2和Ly076的抗肿瘤作用。17B：克隆Ly303、Ly340、Ly341、Ly253-G2和Ly076的抗肿瘤作用。17C：克隆Ly342、Ly343、Ly253-G2和Ly076的抗肿瘤作用。
图18是显示如纯合子B-hCD40 C57BL6小鼠中所示，抗体处理后血清丙氨酸转氨酶(ALT，在肝损伤时释放到血清中的肝酶)水平的图表。
图19A-19D是显示所示抗B7H4/CD40抗体对在CHO细胞上表达的人B7H4的B7H4结合活性(如x轴所示)的图表。柱状图(“IgG对照”)用作对照。这些抗B7H4/CD40抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。19A：克隆Ly474-Ly479和Ly361。19B：克隆Ly480-Ly485和Ly361。19C：克隆Ly486-Ly491和Ly366。19D：克隆Ly492-497和Ly366。
图20A-20D是显示所示抗B7H4/CD40抗体对在CHO细胞上表达的人CD40的CD40结合活性(如x轴所示)的图表。Ly361和Ly366作为对照。这些抗B7H4/CD40抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。20A：克隆Ly474-479和TM740。20B：克隆Ly480-485和TM740。20C：克隆Ly486-Ly491和TM740。20D：克隆Ly492-Ly497和TM740。
图21A-21J是显示示例性抗B7H4/CD40抗体同时结合重组人B7H4和CD40蛋白的图表。如所示不同浓度的克隆Ly479(21A)、Ly478(21B)、Ly482(21C)、Ly490(21D)、Ly494(21E)、Ly483(21F)、Ly491(21G)、Ly495(21H)、Ly475(21I)和Ly487(21J)。
图22A-22L是显示在报告基因测定中许多抗B7H4/CD40抗体对人CD40激活的刺激(如IL8分泌所示)的图表。在溶液中或与B7H4过表达CHO细胞共培养时评价这些双特异性抗体的激动活性。X轴表示各种抗体，并且y轴表示CD40激活信号。22A：如所示不同浓度的克隆Ly474-Ly477、TM740和Ly361用于激活溶液中的CD40。22B：如所示不同浓度的克隆Ly474-Ly477、TM740和Ly361在与B7H4过表达CHO-K1细胞共培养时用于激活CD40。22C：如所示不同浓度的克隆Ly478-Ly481和Ly361用于激活溶液中的CD40。22D：如所示不同浓度的克隆Ly478-Ly481和Ly361在与B7H4过表达CHO-K1细胞共培养时用于激活CD40。22E：如所示不同浓度的克隆Ly482-Ly485、Ly253-G2和Ly361用于激活溶液中的CD40。22F：如所示不同浓度的Ly482-Ly485、Ly253-G2和Ly361在与B7H4过表达CHO-K1细胞共培养时用于激活CD40。22G：如所示不同浓度的克隆Ly486-Ly489、TM740和Ly474用于激活溶液中的CD40。22H：如所示不同浓度的克隆Ly486-Ly489、TM740和Ly474在与B7H4过表达CHO-K1细胞共培养时用于激活CD40。22I：如所示不同浓度的克隆Ly490-Ly493和Ly478用于激活溶液中的CD40。22J：如所示不同浓度的克隆Ly490-Ly493和Ly478在与B7H4过表达CHO-K1细胞共培养时用于激活CD40。22K：如所示不同浓度的克隆Ly494-Ly497、Ly253-G2和Ly366用于激活溶液中的CD40。22L：如所示不同浓度的克隆Ly494-Ly497、Ly253-G2和Ly366在与B7H4过表达CHO-K1细胞共培养时用于激活CD40。
图23A-23D是显示许多抗B7H4/CD40抗体对来自两个健康供体(供体1(图23A和23B)和供体2(图23A和23B))的人B细胞增殖的活性的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴上的发光信号(RLU)表示人B细胞增殖。
图24A-24H包括一组柱状图，显示示例性抗B7H4/CD40抗体在通过溶液中(图24A、24C、24E和24G)或表达人B7H4的CHO细胞的共培养中(图24B、24D、24F和24H)的抗体激活来自两个健康供体的人树突细胞(DC)中的活性。DC激活由培养物上清液中的IL-8的柱状图信号指示。
图25A-25I包括显示小鼠中所示抗B7H4/CD40双特异性抗体的药代动力学的一组图。克隆Ly479(25A)、Ly483(25B)、Ly482(25C)、Ly478(25D)、Ly491(25E)、Ly490(25F)、Ly495(25G)、Ly475(25H)和Ly494(25I)。
图26A-26E是显示所示抗CEA/CD40抗体对在CHO细胞上表达的人CEA的CEA结合活性(如x轴所示)的图表。柱状图(“IgG对照”)用作对照。这些抗CEA/CD40抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。26A：如所示不同浓度的克隆Ly401、Ly405、Ly410、Ly414、Ly417、Ly421、Ly311和Ly312。26B：不同浓度的克隆Ly401-Ly404、Ly409、Ly410和Ly311。26C：如所示不同浓度的克隆Ly411、Ly412、Ly417-Ly420和Ly311。26D：如所示不同浓度的克隆Ly405-Ly408、Ly413、Ly414和Ly311。26E：不同浓度的克隆Ly415、Ly416、Ly421-Ly424和Ly311。
图27A-27D是显示所示抗CEA/CD40抗体对在CHO细胞上表达的人CD40的CD40结合活性(如x轴所示)的图表。柱状图(“IgG对照”)用作对照。这些抗CEA/CD40抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。27A：如所示不同浓度的克隆Ly401-Ly404、Ly409、Ly410、LP3783和TM740。27B：如所示不同浓度的克隆Ly411、Ly412、Ly417-Ly420、TM740和LP3783。27C：如所示不同浓度的Ly405-Ly408、Ly413、Ly414、LP3783和TM740。27D：如所示不同浓度的Ly415、Ly416、Ly421-Ly424、TM740和LP3783。
图28A-28L是显示在报告基因测定中许多抗CEA/CD40抗体对人CD40激活的刺激(如IL8分泌所示)的图表。在溶液中或与CEA过表达CHO细胞共培养时评价这些双特异性抗体的激动活性。X轴表示各种抗体，并且y轴表示CD40激活信号。图28A、28C、28E、28G、28I和28K：由溶液中以如所示不同浓度的克隆激活CD40。图28B、28D、28F、28H、28J和28L：当与CEA过表达CHO细胞共培养时，所示不同浓度的所示克隆激活CD40。
图29A-29D是显示许多抗CEA/CD40抗体对来自两个健康供体(供体1(图29A和29B)和供体2(图29A和29B))的人B细胞增殖的活性的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴上的发光信号(RLU)表示人B细胞增殖。
图30A-30B是显示所示抗TNT/CD40抗体与坏死MC38细胞的结合活性(如x轴所示)的图表。柱状图(“IgG对照”)用作对照。这些抗TNT/CD40抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。30A：如所示不同浓度的克隆Ly462-Ly467、Ly368、TM740和LP3783。30B：如所示不同浓度的克隆Ly468-Ly473、Ly368、TM740和LP3783。
图31A-31B是显示所示抗TNT/CD40抗体对在CHO细胞上表达的人CD40的CD40结合活性(如x轴所示)的图表。柱状图(“IgG对照”)用作对照。这些抗TNT/CD40抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。31A：如所示不同浓度的克隆Ly462-Ly467、Ly368、TM740和LP3783。31B：如所示不同浓度的克隆Ly468-Ly473、Ly368、TM740和LP3783。
图32A-32B是显示许多抗TNT/CD40双特异性抗体对来自两个健康供体的人B细胞增殖的活性的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴上的发光信号(RLU)表示人B细胞增殖。32A：供体1。32B：供体2。
图33A-33C是显示所示抗B7H3/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人B7H3的B7H3结合活性(如x轴所示)的图表。标记为“IgG对照”的柱状图用作对照。这些抗B7H3/CD40双特异性抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。33A：如所示不同浓度的克隆Ly610、Ly611、Ly612、Ly613、Ly614、Ly615、Ly616、Ly617、Ly383、Ly076、TM740和Ly3783。33B：如所示不同浓度的克隆Ly801、Ly802、Ly803、Ly804、Ly809、Ly810、Ly811、Ly812、Ly383、Ly387、Ly181、Ly253-G2和TM559。33C：如所示不同浓度的克隆Ly805、Ly806、Ly807、Ly808、Ly813、Ly814、Ly815、Ly816、Ly383、Ly387、Ly181、Ly253-G2和TM559。
图34A-34C是显示所示抗B7H3/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人CD40的CD40结合活性(如x轴所示)的图表。Ly253-G2用作对照。这些抗B7H3/CD40双特异性抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。34A：如所示不同浓度的克隆Ly610、Ly611、Ly612、Ly613、Ly614、Ly615、Ly616、Ly617、TM740、Ly3783和Ly253-G2。34B：如所示不同浓度的克隆Ly805、Ly806、Ly807、Ly808、Ly813、Ly814、Ly815、Ly816、Ly181、TM383、TM559和Ly387。34C：如所示不同浓度的克隆Ly801、Ly802、Ly803、Ly804、Ly809、Ly810、Ly811、Ly812、Ly181、TM383、TM559和Ly383。
图35A-35H是显示示例性抗B7H3/CD40抗体同时结合重组人B7H3和CD40蛋白的图表。如所示不同浓度的克隆Ly610(35A)、Ly611(35B)、Ly612(35C)、Ly613(35D)、Ly614(35E)、Ly615(35F)、Ly616(35G)和Ly617(35H)。
图36包括显示在报告基因测定中许多抗B7H3/CD40抗体对人CD40激活的刺激(如IL8分泌所示)的图表。在溶液中或与B7H3过表达CHO细胞共培养时评价这些双特异性抗体的激动活性。X轴表示各种抗体，并且y轴表示CD40激活信号。标记为“IgG对照”和“培养基”的柱状图用作对照。小图A：克隆Ly612、Ly613、Ly616、Ly617、Ly253-G2和LP3783以所示不同浓度存在于溶液中。小图B：克隆Ly612、Ly613、Ly616、Ly617、Ly253-G2和LP3783以所示不同浓度与B7H3过表达CHO-K1细胞共培养。小图C：克隆Ly610、Ly611、Ly614、Ly615、TM740和Ly253-G2以所示不同浓度存在于溶液中。小图D：克隆Ly610、Ly611、Ly614、Ly615、TM740和Ly253-G2以所示不同浓度与B7H3过表达CHO-K1细胞共培养。小图E：克隆Ly614、Ly615、Ly616、Ly617。Ly805、Ly806、Ly807、Ly808、Ly813、Ly814、Ly815、Ly816、Ly181、Ly387、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度存在于溶液中。小图F：克隆Ly614、Ly615、Ly616、Ly617。Ly805、Ly806、Ly807、Ly808、Ly813、Ly814、Ly815、Ly816、Ly181、Ly387、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度与B7H3过表达CHO-K1细胞共培养。小图G：克隆Ly801、Ly802、Ly803、Ly804、Ly805、Ly806、Ly807、Ly808、Ly181、Ly387、Ly383、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度存在于溶液中。小图H：克隆Ly801、Ly802、Ly803、Ly804、Ly805、Ly806、Ly807、Ly808、Ly181、Ly387、Ly383、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度与B7H3过表达CHO-K1细胞共培养。小图I：克隆Ly809、Ly810、Ly811、Ly812、Ly813、Ly814、Ly815、Ly816、Ly181、Ly387、Ly383、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度存在于溶液中。小图J：克隆Ly809、Ly810、Ly811、Ly812、Ly813、Ly814、Ly815、Ly816、Ly181、Ly387、Ly383、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度与B7H3过表达CHO-K1细胞共培养。
图37A-37D是显示许多抗B7H3/CD40双特异性抗体对来自两个健康供体的人B细胞增殖的活性的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴上的发光信号(RLU)表示人B细胞增殖。37A：供体1。37B：供体2。37C：供体1。37D：供体2。
图38包括一组柱状图，显示示例性抗B7H3/CD40抗体在通过溶液中(小图A和小图C)或表达人B7H3的CHO细胞的共培养中(小图B和小图D)的抗体激活来自两个健康供体的人树突细胞(DC)中的活性。DC激活由培养物上清液中的IL-8的柱状图信号指示。
图39A-39H包括显示小鼠中所示抗B7H3/CD40双特异性抗体的药代动力学的一组图。示例性克隆包括克隆Ly617(39A)、Ly612(39B)、Ly613(39C)和Ly616(39D)、Ly614(39E)、Ly611(39F)、Ly610(39G)以及Ly615(39H)。
图40A-40B是显示所示抗PD-1/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人PD-1的PD-1结合活性(如x轴所示)的图表。标记为“IgG对照”的柱状图用作对照。这些抗PD-1/CD40双特异性抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。40A：如所示不同浓度的克隆Ly817、Ly818、Ly819、Ly820、PD-1mAb、Ly181、TM559和Ly253-G2。40B：如所示不同浓度的克隆Ly517、Ly518、Ly519、Ly520、Ly606、Ly607、Ly608、Ly609、PD-1mAb、TM559和Ly253-G2。
图41A-41B是显示所示抗PD-1/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人CD40的CD40结合活性(如x轴所示)的图表。Ly076用作对照。这些抗PD-1/CD40双特异性抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。41A：如所示不同浓度的克隆Ly517、Ly518、Ly519、Ly520、Ly606、Ly607、Ly608、Ly609、TM740、Ly3783和Ly253-G2。41B：如所示不同浓度的克隆Ly817、Ly818、Ly819、Ly820、Ly181、TM559和Ly253-G2。
图42A-42H是显示示例性抗PD-1/CD40抗体同时结合重组人PD-1和CD40蛋白的图表。克隆Ly606(42A)、Ly607(42B)、Ly518(42C)。所示不同浓度的Ly608(42D)、Ly609(42E)和Ly517(42F)、Ly519(42G)以及Ly520(42H)。
图43A-43D是显示在报告基因测定中许多抗PD-1/CD40抗体对人CD40激活的刺激(如IL8分泌所示)的图表。在溶液中或与PD-1过表达CHO细胞共培养时评价这些双特异性抗体的激动活性。X轴表示各种抗体，并且y轴表示CD40激活信号。标记为“IgG对照”和“培养基”的柱状图用作对照。43A：克隆Ly517、Ly518、Ly519、Ly520、Ly606、Ly607、Ly817、Ly818、Ly253-G2、Ly181、TM559和PD-1mAb所示不同浓度存在于溶液中。43B：克隆Ly517、Ly518、Ly519、Ly520、Ly606、Ly607、Ly817、Ly818、Ly253-G2、Ly181、TM559和PD-1mAb以所示不同浓度与PD-L1过表达CHO-K1细胞共培养。43C：克隆Ly608、Ly609、Ly819、Ly820、Ly253-G2、Ly181、TM559和PD-1mAb以所示不同浓度存在于溶液中。43D：克隆Ly608、Ly609、Ly819、Ly820、Ly253-G2、Ly181、TM559和PD-1mAb以所示不同浓度与PD-1过表达CHO-K1细胞共培养。
图44A-44B是显示抗PD-L1/CD40双特异性抗体对PD-1通路的阻断作用的图表。X轴表示抗体，并且y轴上的RLU信号反映了PD-1/PD-L1相互作用的阻断导致信号增加。44A：克隆Ly608、Ly609、Ly819、Ly820、Ly456、Ly458、PD-1mAb和Ly253-G2的阻断作用。44B：克隆Ly517、Ly518、Ly519、Ly520、Ly606、Ly607、Ly817、Ly818、PD-1mAb和Ly253-G2的阻断作用。
图45是显示许多抗PD-1/CD40双特异性抗体对来自一个健康供体的人B细胞增殖的活性的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴上的发光信号(RLU)表示人B细胞增殖。
图46A-46H包括显示小鼠中所示抗PD-1/CD40双特异性抗体的药代动力学的一组图。示例性克隆包括Ly607(46A)、Ly606(46B)、Ly609(46C)和Ly518(46D)。克隆Ly519(46E)、Ly520(46F)、Ly517(46G)和Ly608(46H)。
图47是显示抗PD-1/CD40抗体在人CD40和人PD-1双敲入小鼠同系B16-ova模型中的抗肿瘤活性的图表。克隆Ly517、Keytruda和参考CD40 mAb的抗肿瘤作用。
图48是显示如纯合子B-hCD40 C57BL6小鼠中所示，抗体处理后血清丙氨酸转氨酶(ALT，在肝损伤时释放到血清中的肝酶)水平的图表。
图49A-49C是显示所示抗HER2/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人HER2的HER2结合活性(如x轴所示)的图表。标记为“IgG对照”的柱状图用作对照。这些抗HER2/CD40双特异性抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。49A：如所示不同浓度的克隆Ly622、Ly623、Ly624、Ly625、Ly825、Ly826、Ly827、Ly828、Ly591、Ly181、Herceptin、TM559和Ly253-G2。49B：如所示不同浓度的克隆Ly618、Ly619、Ly620、Ly621、Ly821、Ly822、Ly823、Ly824、Ly591、Herceptin、Ly181、TM559和Ly253-G2。49C：如所示不同浓度的克隆Ly829、Ly830、Ly831、Ly832、Ly833、Ly834、Ly835、Ly836、Ly591、Herceptin、Ly181、TM559和Ly253-G2。
图50A-50C是显示所示抗HER2/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人CD40的CD40结合活性(如x轴所示)的图表。Ly076用作对照。这些抗HER2/CD40双特异性抗体的结合由y轴上的平均荧光强度(MFI)表示。50A：如所示不同浓度的克隆Ly622、Ly623、Ly624、Ly625、Ly825、Ly826、Ly827、Ly828、Ly591、Ly181、TM559和Ly253-G2。50B：如所示不同浓度的克隆Ly618、Ly619、Ly620、Ly621、Ly821、Ly822、Ly823、Ly824、Ly181、TM559、Ly591和Ly253-G2。50C：如所示不同浓度的克隆Ly829、Ly830、Ly831、Ly832、Ly833、Ly834、Ly835、Ly836、Ly591、Ly181、TM559和Ly253-G2。
图51包括显示在报告基因测定中许多抗HER2/CD40抗体对人CD40激活的刺激(如IL8分泌所示)的图表。在溶液中或与HER2过表达CHO细胞共培养时评价这些双特异性抗体的激动活性。X轴表示各种抗体，并且y轴表示CD40激活信号。标记为“IgG对照”和“培养基”的柱状图用作对照。小图A：克隆Ly618、Ly619、Ly620、Ly621、Ly821、Ly822、Ly823、Ly824、Ly181、TM559、Ly591和Ly253-G2以所示不同浓度存在于溶液中。小图B：克隆Ly618、Ly619、Ly620、Ly621、Ly821、Ly822、Ly823、Ly824、Ly181、TM559、Ly591和Ly253-G2以所示不同浓度与HER2过表达CHO-K1细胞共培养。小图C：克隆Ly622、Ly623、Ly624、Ly625、Ly825、Ly826、Ly827、Ly828、Ly591、Ly181、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度存在于溶液中。小图D：克隆Ly622、Ly623、Ly624、Ly625、Ly825、Ly826、Ly827、Ly828、Ly591、Ly181、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度与HER2过表达CHO-K1细胞共培养。小图E：克隆Ly829、Ly830、Ly831、Ly832、Ly833、Ly834、Ly835、Ly836、Ly591、Ly181、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度存在于溶液中。小图F：克隆Ly829、Ly830、Ly831、Ly832、Ly833、Ly834、Ly835、Ly836、Ly591、Ly181、TM559和Ly253-G2以所示不同浓度与HER2过表达CHO-K1细胞共培养。
图52A-52B是显示许多抗HER2/CD40双特异性抗体对来自两个健康供体的人B细胞增殖的活性的图表。X轴表示各种抗体，并且y轴上的发光信号(RLU)表示人B细胞增殖。
图53是显示在使用人HER2过表达MC38肿瘤细胞的人CD40敲入小鼠同系模型中抗HER2/CD40抗体的抗肿瘤活性的一组图。观察示例性克隆Ly619、Ly831和Ly833的抗肿瘤作用。
具体实施方式
本文提供了CD40特异性抗体(即，抗CD40抗体，例如人源化抗CD40抗体)、PD-L1特异性抗体(即，抗PD-L1抗体)、B7H3特异性抗体(即，抗B7H3抗体)或B7H4特异性抗体(即，抗B7H4抗体)。本文还提供了双特异性抗体，其包括对CD40特异的第一抗体部分和可以是肿瘤抗原的第二抗原。实例包括但不限于PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、癌胚抗原(CEA)、人表皮生长因子受体2(HER2)或坏死肿瘤细胞。此类抗体或双特异性抗体可用于各种治疗、诊断或研究目的。例如，该抗体可用于调节需要此类治疗的受试者的免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答。抗体还可用于癌症治疗或癌症诊断。
I.抗体分子
如本文所用，抗体(以复数形式可互换使用)是指能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点与靶标(例如，本文公开的任何靶抗原)特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，术语“抗体”不但涵盖完整(即，全长)多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、纳米抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型，该经修饰构型包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和经共价修饰抗体。抗体包括任何类的抗体，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定类。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同类。存在五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类中的若干类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
典型的抗体分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们通常参与抗原结合。VH和VL区可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，其散布有更保守的被称为“框架区”(“FR”)的区。每个VH和VL通常由按以下顺序从氨基末端至羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区和CDR的范围可以使用本领域已知的方法，例如，通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义来精确识别，所有这些定义均是本领域熟知的。参见，例如，Kabat,E.A.等人，(1991)免疫学关注的蛋白序列，第五版，美国卫生与公众服务部，NIH公开号91-3242(Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)，Chothia等人，(1989)自然342:877(Chothia et al.,(1989)Nature 342:877)；Chothia,C.等人(1987)分子生物学杂志196:901-917(Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)，Al-lazikani等人(1997)分子生物学杂志273:927-948(Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948)；和Almagro，分子识别杂志17:132-143(2004)(Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004))。另见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。
本文所述的抗体可以是鼠、大鼠、人或任何其他来源(包括嵌合抗体或人源化抗体)。此类抗体是非天然存在的，即在没有人行为(例如，用期望的抗原或其片段免疫此类动物或从抗体文库中分离)的情况下将不在动物中产生。
本文所述的任何抗体可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同源抗体群，并且“多克隆抗体”是指异源抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或其制备方式。
(i)抗CD40抗体
本公开的一方面提供了人源化抗CD40抗体。CD40是本领域熟知的蛋白。例如，NCBIGenBank登录号NP_001241.1和XP_005569275.1分别提供了人和食蟹猴CD40抗原的信息。
人源化抗体
在一些实施方案中，本文公开的抗CD40抗体是源自非人亲本抗体克隆的人源化抗体，例如与CD40结合的鼠抗体，例如人CD40。人源化抗体是指为特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的抗原结合片段的非人(例如，鼠)抗体的形式。通常，人源化抗体是来自接受者的CDR的残基被来自具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括既未在接受者抗体中发现也未在导入的CDR或框架序列中发现但被包含在内以进一步精化和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体将包括至少一个并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区或结构域的至少一部分。抗体可以具有如WO 99/58572中所描述的修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有关于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)。这也称为“源自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗体还可以涉及亲和力成熟。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见，例如，Queen等人，美国国家科学院院刊，86:10029-10033(1989)(Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989))。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的VH和VL可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来识别被预测对形成正确CDR结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中识别具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH链和人VL链。然后选择人VH受体基因和人VL受体基因。
可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代所选人受体基因内的CDR区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与CDR区相互作用时具有重要性的残基来取代人受体基因中的对应残基。
在一些实施方案中，本文公开的抗CD40抗体是源自鼠亲本克隆Lyv377的人源化抗体，其在以下实施例1中公开。此类人源化抗体可以包括IGHV3-73*01重链框架和/或IGKV1-39*01轻链框架。此外，此类人源化抗体可以包括与鼠亲本克隆相同的重链和/或轻链互补决定区(CDR)。具有相同VH和/或VL CDR的两种抗体意指当通过相同方法(例如，本领域已知的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义)确定时它们的CDR相同。可选地，相对于鼠亲本Lyv377的相应CDR区，可以包括IGHV3-73*01重链框架和/或IGKV1-39*01轻链框架的人源化抗CD40抗体在一个或多个CDR区中可以包括一个或多个氨基酸残基变异。例如，人源化抗体在三个重链CDR中可以总共包括至多5个(例如，至多4、3、2或1个)氨基酸残基。在其他实例中，人源化抗体在三个轻链CDR中可以总共包括至多5个(例如，至多4、3、2或1个)氨基酸残基。在另外的其他实例中，人源化抗体在三个重链CDR和三个轻链CDR中可以总共包括至多8个(例如，至多7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸残基。
在一些实施方案中，本文公开的抗CD40抗体是源自鼠亲本克隆Lyv378的人源化抗体，其在以下实施例1中公开。此类人源化抗体可以包括IGHV3-23*04重链框架和/或IGKV1-39*01轻链框架。此外，此类人源化抗体可以包括与鼠亲本克隆相同的重链和/或轻链互补决定区(CDR)。可选地，相对于鼠亲本Lyv378的相应CDR区，可以包括IGHV3-23*04重链框架和/或IGKV1-39*01轻链框架的人源化抗CD40抗体在一个或多个CDR区中可以包括一个或多个氨基酸残基变异。例如，人源化抗体在三个重链CDR中可以总共包括至多5个(例如，至多4、3、2或1个)氨基酸残基。在其他实例中，人源化抗体在三个轻链CDR中可以总共包括至多5个(例如，至多4、3、2或1个)氨基酸残基。在另外的其他实例中，人源化抗体在三个重链CDR和三个轻链CDR中可以总共包括至多8个(例如，至多7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸残基。
可选地或另外地，氨基酸残基变异可以是保守氨基酸残基取代。如本文所用，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白的相对电荷或大小特性的氨基酸取代。可以根据用于改变本领域的普通技术人员已知的多肽序列的方法来制备变体，例如见于编制此类方法的参考文献，例如分子克隆：实验室手册，J.Sambrook等人，编辑，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)，或现代分子生物学实验技术，F.M.Ausubel等人，编辑，约翰威利父子出版公司，纽约(Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。氨基酸的保守取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。
本文公开的人源化抗CD40抗体的示例性重链CDR和轻链CDR在下表1中提供(根据Kabat CDR定义确定)：
表1.示例性人源化抗CD40抗体的CDR区
在一些实施方案中，任何人源化抗CD40抗体可以包括与人受体种系VH和/或VL基因相同的框架。在其他实施方案中，人源化抗体的框架区可以包括相对于人受体种系VH和/或VL基因的一个或多个突变。例如，人源化抗体的VH和/或VL链的框架区中的一个或多个位置可以包含一个或多个回复突变，该回复突变是指将人受体种系基因中的残基改变回鼠亲本相应位置的残基。例如，源自鼠亲本克隆Lyv377的人源化抗体可以在位置E1(例如，E1Q)、A24(例如，A24T)、F70(例如，F70V)和R100(例如，R100S)中的一个或多个位置处包括突变(例如，回复突变)。
在一些实例中，本文公开的人源化抗CD40抗体可以包括本文公开的任何重链和轻链CDR(例如，上表1中提供的任何CDR组合)。此外，此类人源化抗CD40抗体可以包括与IGHV3-23*04的重链框架区或IGHV3-23*04具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％或更多)同一性的重链框架。可选地或另外地，人源化抗CD40抗体可以包括与IGKV1-39*01的轻链框架区具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％或更多)同一性的轻链框架。
使用如Karlin和Altschul美国国家科学院院刊90:5873-77,1993(Karlin andAltschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993)修改的Karlin和Altschul美国国家科学院院刊87:2264-68,1990(Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990)的算法确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”。此类算法并入Altschul等人，分子生物学杂志215:403-10,1990(Altschul,et al.J.Mol.Biol.215:403-10,1990)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序(分值＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白检索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以利用如Altschul等人，核酸研究25(17):3389-3402,1997(Altschul et al.,Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402,1997)中描述的带空位BLAST。当利用BLAST程序和带空位的BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
以下实施例1中提供了源自Lyv377或Lyv378的示例性人源化抗CD40抗体，其也在本公开的范围内。
在一些实施方案中，抗CD40抗体是以下实施例1中公开的Ly253或源自其的功能变体。Ly253可以包括分别融合至人重链恒定区和人轻链恒定区的VH链和VL链。人重链恒定区可以来自IgG分子和/或人轻链恒定区可以来自κ链。重链恒定结构域可以源自合适的Ig同种型，例如，人IgG1、IgG2或IgG4分子。在一些实施方案中，恒定结构域在Fc区中可以包括一个或多个突变以增强或降低对Fc受体的结合亲和力和/或结合特异性。实例在本文中提供或在WO/2018/183520和PCT/US2019/053505(于2019年9月27日提交)中公开，出于本文引用的目的和主题，其各自的相关公开内容通过引用并入。此类重组抗体可以进一步包括与人轻链恒定区(例如κ链恒定区)融合的Ly253相同的轻链可变区。源自Ly253的示例性抗CD40抗体在以下实施例1中提供，其也在本公开的范围内。
(ii)抗PD-L1抗体
本公开还提供了结合人PD-L1的抗体，其可以是任何来源，例如人和/或猴PD-L1。此类抗PD-L1抗体(即，结合PD-L1抗原的抗体)可以特异性结合特定物种的PD-L1(例如，人PD-L1)。可选地，本文所述的抗PD-L1抗体可以与不同物种的PD-L1抗原发生交叉反应(例如，与人和猴PD-L1结合)。在一些情况下，本文所述的抗PD-L1抗体可以结合细胞表面PD-L1，例如，在表面上天然表达PD-L1的细胞(例如，免疫细胞)上表达的PD-L1。本文所述的抗PD-L1抗体可以是激动性抗体，其在与PD-L1结合后引发由PD-L1介导的细胞信号传导。
PD-L1(程序性死亡配体1)，也称为CD274或B7同源物1(B7-H1)，是40kDa的跨膜蛋白，其在抑制适应性免疫系统臂中起重要作用。PD-L1是本领域熟知的蛋白。例如，人PD-L1的氨基酸序列信息可见于基因ID:29126。
在一些实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体与本文所述的参考抗体Lyv5574结合相同的PD-L1多肽表位(参见以下实施例3)或与参考抗体竞争结合PD-L1抗原。“表位”是指靶抗原上被抗体识别并结合的位点。位点可以完全由氨基酸组分构成、完全由蛋白的氨基酸的化学修饰(例如，糖基部分)构成或由其组合构成。重叠表位包括至少一个共同的氨基酸残基。表位可以是线性的，其长度通常为6-15个氨基酸。可选地，表位可以是构象的。可以通过常规技术，例如表位作图方法(参见，例如，以下描述)来确定抗体与其结合的表位。与本文所述的参考抗体相同的表位结合的抗体可以与参考抗体完全相同的表位或基本上重叠的表位(例如，包含少于3个非重叠氨基酸残基、少于2个非重叠氨基酸残基或仅1个非重叠氨基酸残基)结合。可以通过本领域熟知的竞争测定来确定两种抗体是否彼此竞争与同源抗原结合。
在一些实施方案中，如本文所述的抗PD-L1抗体包括重链可变区，该重链可变区包括通过重链框架区连接的重链CDR1区(HC CDR1)、重链CDR2区(HC CDR2)和重链CDR3区(HCCDR3)。可选地或另外地，抗PD-L1可以包括轻链可变区，该轻链可变区包括通过轻链框架区连接的轻链CDR1区(LC CDR1)、轻链CDR2区(LC CDR2)和轻链CDR3区(LC CDR3)。在一些实例中，本文公开的抗PD-L1抗体可以包括与参考抗体Lyv5574相同的重链CDR和/或相同的轻链CDR(详见以下实施例3)。
在具体实例中，抗PD-L1抗体的重链CDR 1、2和3可以分别包括GYTFTDFWMS(SEQ IDNO:24)、QIYPNTGTTHSNEKFKG(SEQ ID NO:25)和SYHISTTPNWFAY(SEQ ID NO:26)的序列。抗PD-L1抗体的轻链CDR 1、2和3可以分别包括KASQNVYKKLE(SEQ ID NO:27)、HTNILQT(SEQ IDNO:28)和YQWNSGPT(SEQ ID NO:29)的序列。
参考抗体Lyv5574的功能变体也在本公开的范围内。此类功能变体在结构和功能上均与参考抗体基本上类似。功能变体包括与参考抗体基本上相同的VH和VL CDR。例如，它可以在参考抗体的总重链CDR区中仅包括至多5个(例如，4、3、2或1个)氨基酸残基变异和/或在参考抗体的总轻链CDR区中仅包括至多5个(例如，4、3、2或1个)氨基酸残基变异。在一些实例中，相对于参考抗体的那些，功能性变体可以在总重链和轻链CDR中包括至多8个(例如，7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸残基变异。此类功能变体可以以基本上类似的亲和力(例如，具有相同数量级的KD值)结合PD-L1的相同表位。可选地或另外地，氨基酸残基变异是如本文公开的保守氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体可以包括与本文所述的Lyv5574的VH CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可选地或另外地，抗PD-L1抗体可以包括与如Lyv5574的VL CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
在一些实例中，本文公开的抗PD-L1抗体可以是源自参考抗体Lyv5574的人源化抗体。此类人源化抗体可以包括来自种系基因IGHV1-46*01的重链框架区和/或来自种系基因IGKV1-27*01的轻链框架区。在一些情况下，人源化抗体可以具有与Lyv5574相同的重链和/或轻链CDR。可选地，它可以包括与Lyv5574基本上类似的重链和/或轻链CDR，例如，相对于Lyv5574，在重链和/或轻链CDR中包括不超过5个氨基酸残基变异(例如，不超过4、3、2或1个)。可选地或另外地，与人受体重链和/或轻链框架区相比，人源化抗体可以在重链和/或轻链框架区中包含一个或多个突变(例如，一个或多个回复突变)。在具体实例中，人源化抗体可以在VL框架中位置L42(例如，L42V)、F71(例如，F71Y)或两者处包括一个或多个回复突变。可选地或另外地，人源化抗体可以包括与IGHV1-46*01的框架区具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％或更多)同一性的重链框架区，和/或包括与IGKV1-27*01的框架区具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％或更多)同一性的轻链框架区。IGHV1-46*01和IGKV1-27*01的结构信息在以下实施例3中提供。
以下实施例3中提供了示例性抗PD-L1抗体及其人源化形式，它们也在本公开的范围内。
(ii)抗B7H3抗体
本公开还提供了结合人B7H3的抗体，其可以是任何来源，例如人和/或猴B7H3。此类抗B7H3抗体(即，结合B7H3抗原的抗体)可以特异性结合特定物种的B7H3(例如，人B7H3)。可选地，本文所述的抗B7H3抗体可以与不同物种的B7H3抗原交叉反应(例如，与人和猴B7H3结合)。在一些情况下，本文所述的抗B7H3抗体可以结合细胞表面B7H3，例如，在表面上天然表达B7H3的细胞(例如，免疫细胞)上表达的B7H3。
B7H3，也称为CD276，是B7和CD28家族的免疫检查点分子。据报道，B7H3在许多类型的癌症中异常过度表达，并且其上调通常指示临床预后不良。B7H3是本领域熟知的蛋白。例如，人B7H3的结构信息可见于基因ID:80381。
在一些实施方案中，本文所述的抗B7H3抗体与参考抗体Lyv383或参考抗体Lyv387结合相同的B7H3多肽表位，两者均在以下实施例7中公开，或与参考抗体竞争结合B7H3抗原。
在一些实施方案中，如本文所述的抗B7H3抗体包括重链可变区，该重链可变区包括通过重链框架区连接的重链CDR1区(HC CDR1)、重链CDR2区(HC CDR2)和重链CDR3区(HCCDR3)。可选地或另外地，抗B7H3可以包括轻链可变区，该轻链可变区包括通过轻链框架区连接的轻链CDR1区(LC CDR1)、轻链CDR2区(LC CDR2)和轻链CDR3区(LC CDR3)。在一些实施例中，本文公开的抗B7H3抗体可以包括与参考抗体Lyv383相同的重链CDR和/或相同的轻链CDR3(详见以下实施例3)。在其他实施例中，本文公开的抗B7H3抗体可以包括与参考抗体Lyv387相同的重链CDR和/或相同的轻链CDR3(详见以下实施例7)。
在具体实例中，抗B7H3抗体的重链CDR 1、2和3可以分别包括GYTFTSYVMH(SEQ IDNO:33)、INPYNDGTECTDKFKG(SEQ ID NO:34)和IYYGYDGTYFGV(SEQ ID NO:35)的序列。抗PD-L1抗体的轻链CDR 1、2和3可以分别包括RASSSVSYMH(SEQ ID NO:39)、TSNLAS(SEQ ID NO:40)和QQWSSNTLT(SEQ ID NO:41)的序列。
在其他具体实例中，抗B7H3抗体的重链CDR 1、2和3可以分别包括GYTFTSYWMH(SEQID NO:36)、MIHPNSGGTNYNEKFKG(SEQ ID NO:37)和SQATWFAY(SEQ ID NO:38)的序列。抗PD-L1抗体的轻链CDR 1、2和3可以分别包括RASSSVSSSYLH(SEQ ID NO:42)、STSNLAS(SEQ IDNO:43)和QHYSGYPLT(SEQ ID NO:44)的序列。
参考抗体Lyv383或Lyv387的功能变体也在本公开的范围内。此类功能变体在结构和功能上均与参考抗体基本上类似。功能变体包括与参考抗体基本上相同的VH和VL CDR。例如，它可以在参考抗体的总重链CDR区中仅包括至多5个(例如，4、3、2或1个)氨基酸残基变异和/或在参考抗体的总轻链CDR区中仅包括至多5个(例如，4、3、2或1个)氨基酸残基变异。在一些实例中，相对于参考抗体的那些，功能性变体可以在总重链和轻链CDR中包括至多8个(例如，7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸残基变异。此类功能变体可以以基本上类似的亲和力(例如，具有相同数量级的KD值)结合B7H3的相同表位。可选地或另外地，氨基酸残基变异是如本文公开的保守氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，抗B7H3抗体可以包括与本文所述的Lyv383的VH CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可选地或另外地，抗B7H3抗体可以包括与如Lyv383的VL CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
在其他实施方案中，抗B7H3抗体可以包括与本文所述的Lyv387的VH CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可选地或另外地，抗B7H3抗体可以包括与如Lyv387的VL CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
示例性抗B7H3抗体在以下实施例7中提供，其也在本公开的范围内。
(iii)抗B7H4抗体
本公开还提供了结合人B7H4的抗体，其可以是任何来源，例如人和/或猴B7H4。此类抗B7H4抗体(即，结合B7H4抗原的抗体)可以特异性结合特定物种的B7H4(例如，人B7H4)。可选地，本文所述的抗B7H4抗体可以与不同物种的B7H4抗原交叉反应(例如，与人和猴B7H4结合)。在一些情况下，本文所述的抗B7H4抗体可以结合细胞表面B7H4，例如，在表面上天然表达B7H4的细胞(例如，免疫细胞)上表达的B7H4。B7H4，也称为VCTN1(包含T细胞激活抑制剂1的V-set结构域)，是负调节T细胞免疫的B7家族成员。已发现B7H4过表达与肿瘤进展相关。B7H4是本领域熟知的蛋白。例如，人B7H4的结构信息可见于基因ID:79679。
在一些实施方案中，本文所述的抗B7H4抗体与参考抗体Lyv361或参考抗体Lyv366结合相同的B7H4多肽表位，两者均在以下实施例4中公开，或与参考抗体竞争结合B7H4抗原。
在一些实施方案中，如本文所述的抗B7H4抗体包括重链可变区，该重链可变区包括通过重链框架区连接的重链CDR1区(HC CDR1)、重链CDR2区(HC CDR2)和重链CDR3区(HCCDR3)。可选地或另外地，抗B7H4可以包括轻链可变区，该轻链可变区包括通过轻链框架区连接的轻链CDR1区(LC CDR1)、轻链CDR2区(LC CDR2)和轻链CDR3区(LC CDR3)。在一些实施例中，本文公开的抗B7H4抗体可以包括与参考抗体Lyv361相同的重链CDR和/或相同的轻链CDR3(详见以下实施例4)。在其他实施例中，本文公开的抗B7H4抗体可以包括与参考抗体Lyv366相同的重链CDR和/或相同的轻链CDR3(详见以下实施例4)。
在具体实例中，抗B7H3抗体的重链CDR 1、2和3可以分别包括GFTFSSYGMS(SEQ IDNO:49)、AISTGGSYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:50)和RGATGSWFAY(SEQ ID NO:51)的序列。抗PD-L1抗体的轻链CDR 1、2和3可以分别包括HASQGINNNIG(SEQ ID NO:55)、GTNLED(SEQ ID NO:56)和VQYVQFPRT(SEQ ID NO:57)的序列。
在其他具体实例中，抗B7H3抗体的重链CDR 1、2和3可以分别包括GFTFSDSGMH(SEQID NO:52)、YINSGSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:53)和GRGYAMDY(SEQ ID NO:54)的序列。抗PD-L1抗体的轻链CDR 1、2和3可以分别包括SASSSISSDFLH(SEQ ID NO:58)、RISNLAS(SEQ IDNO:59)和QQGSNVPRT(SEQ ID NO:60)的序列。
参考抗体Lyv361或Lyv366的功能变体也在本公开的范围内。此类功能变体在结构和功能上均与参考抗体基本上类似。功能变体包括与参考抗体基本上相同的VH和VL CDR。例如，它可以在参考抗体的总重链CDR区中仅包括至多5个(例如，4、3、2或1个)氨基酸残基变异和/或在参考抗体的总轻链CDR区中仅包括至多5个(例如，4、3、2或1个)氨基酸残基变异。在一些实例中，相对于参考抗体的那些，功能性变体可以在总重链和轻链CDR中包括至多8个(例如，7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸残基变异。此类功能变体可以以基本上类似的亲和力(例如，具有相同数量级的KD值)结合B7H4的相同表位。可选地或另外地，氨基酸残基变异是如本文公开的保守氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，抗B7H4抗体可以包括与本文所述的Lyv361的VH CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可选地或另外地，抗B7H4抗体可以包括与如Lyv361的VL CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
在其他实施方案中，抗B7H4抗体可以包括与本文所述的Lyv366的VH CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可选地或另外地，抗B7H4抗体可以包括与如Lyv366的VL CDR相比，单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
在一些具体实施例中，本文公开的抗B7H4抗体是嵌合抗体，例如，源自以下实施例4中公开的鼠亲本克隆Lyv361或鼠亲本克隆Lyv366的嵌合抗体。本文公开的嵌合抗体可以包括与Lyv361或Lyv366相同的重链可变结构域，其可以与来自人免疫球蛋白分子(例如IgG分子，包括任何合适的本文公开的异构体)的恒定结构域或其片段融合。在一些实施方案中，恒定结构域在Fc区中可以包括一个或多个突变以增强或降低对Fc受体的结合亲和力和/或结合特异性。本文其他地方提供了详细信息。此类嵌合抗体可以进一步包括与人轻链恒定区(例如κ链恒定区)融合的Lyv361或Lyv366相同的轻链可变区。
示例性抗B7H4抗体(包括其嵌合形式)在以下实施例4中提供，其也在本公开的范围内。
(iv)抗PD-1抗体
在一些方面，本公开还提供了PD-1多肽(例如人PD-1)特异性抗体。此类抗PD-1抗体可以具有与参考抗体Ly516相同的包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其氨基酸序列在下文提供。可选地或另外地，抗PD-1抗体可以具有与抗体Ly516相同的包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)。在一些实例中，本文公开的抗PD-1抗体可以包括与抗体Ly516相同的VH和/或相同的VL。
任何抗PD-1抗体可以是任何形式，例如本文公开的那些形式。在一些实施方案中，抗体是全长抗体，例如IgG分子。在一些情况下，全长抗体包括重链，该重链包括突变Fc区，相对于其野生型对应物，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性。
(v)CD40和另一种抗原特异的双特异性抗体
在一些方面，本公开还提供了双特异性抗体，其各自包括至少两个抗体部分，一个对CD40具有特异性，并且另一个对另一种目标抗原(例如肿瘤抗原和/或免疫检查点分子)具有特异性。对本文公开的双特异性抗体具有特异性的其他抗原的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、CEA、HER2、B7H3或B7H4。
如本文所述的双特异性抗体中的每个抗体部分可以是任何形式的抗体，包括但不限于完整(即全长)抗体、其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab').sub.2、Fv)、单链抗体(scFv抗体)和四价抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是四价的，其包括CD40的两个结合位点和其他抗原(例如PD-1、PD-L1、CEA、HER2、B7H3、TNT或B7H4)的两个结合位点。
本文公开的任何双特异性抗体可以是本领域已知的任何双特异性抗体形式，例如BsIgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白或BsAb缀合物。参见，例如，分子免疫学67(2):95-106(2015)(Mol.Immunol.67(2):95-106(2015))。
在一些实施方案中，与双特异性抗体中的第一抗原结合的第一抗体部分，例如结合CD40的抗体部分，可以是单链片段(scFv)形式，并且第二抗体部分与第二抗原是多链抗体形式，其包括包括VH和重链恒定区或其部分的重链，以及包括VL和轻链恒定区(例如，κ链)的轻链。可选地，结合CD40的抗体部分可以是本文公开的多链抗体形式，而结合其他抗原的抗体部分可以是scFv形式。双特异性抗体中的任何scFv片段均可以以VH→VL方向。可选地，它可以以VL→VH方向。
在一些实例中，双特异性抗体可以包括两条链：第一链是一个抗体部分的scFv片段与另一个抗体部分的重链或轻链的融合蛋白，并且第二链是另一个抗体部分的另一链。例如，双特异性抗体可以包括第一链，该第一链是与第一抗原(例如CD40)结合的第一抗体部分的scFv片段融合至与第二抗原(例如PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、CEA或HER2)结合的第二抗体部分的重链的融合蛋白，以及第二链，该第二链是第二抗体部分的轻链。在其他实例中，双特异性抗体可以包括第一链，该第一链是与第一抗原(例如CD40)结合的第一抗体部分的scFv片段融合至与第二抗原(例如PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、CEA或HER2)结合的第二抗体部分的轻链的融合蛋白，以及第二链，该第二链是第二抗体部分的重链。在任何融合链中，scFv片段和重链或轻链可以是任何顺序。在一些情况下，scFv可以位于N-末端。在其他情况下，重链或轻链可以位于N-末端。
肽接头可以位于本文公开的双特异性抗体中的两个片段之间，例如，在scFv片段中的VH和VL部分之间，或在scFv片段和融合链中的重链或轻链之间。示例性肽接头包括(GGGGS)n(SEQ ID NOs:65-70)的接头，其中n可以是1-6之间的整数，例如1、2、3、4、5或6。本文所述的任何肽接头，例如，SGGGS(SEQ ID NO:65)接头或(GGGGS)4(SEQ ID NO:68)接头，可以包括天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His))、异亮氨酸(He)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然存在的氨基酸可以包括受保护的氨基酸，例如用基团(例如乙酰基、甲酰基、甲苯磺酰基、硝基等)保护的天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸的非限制性实例包括叠氮高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对溴苯丙氨酸、对碘苯丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸，包含内部烯烃的氨基酸，例如反式巴豆烯、丝氨酸烯丙基醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、乙烯基甘氨酸、吡咯赖氨酸、N-σ-o-叠氮苄氧基羰基-L-赖氨酸(AzZLys)、N-σ-炔丙基氧羰基-L-赖氨酸，N-σ-2-叠氮基乙氧羰基-L-赖氨酸、N-σ-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(BocLys),N-σ-烯丙氧羰基-L-赖氨酸(AlocLys)、N-σ-乙酰基-L-赖氨酸(AcLys)、N-σ-苄氧基羰基-L-赖氨酸(ZLys)、N-σ-环戊氧基羰基-L-赖氨酸(CycLys)、N-σ-D-脯氨酰-L-赖氨酸、N-σ-烟酰-L-赖氨酸(NicLys)、N-σ-N-Me-蒽酰-L-赖氨酸(NmaLys)、N-σ-生物素-L-赖氨酸、N-σ-9-芴基甲氧羰基-L-赖氨酸、N-σ-甲基-L-赖氨酸、N-σ-二甲基-L-赖氨酸、N-σ-三甲基-L-赖氨酸、N-σ-异丙基-L-赖氨酸、N-σ-丹磺酰基-L-赖氨酸、N-σ-邻,对二硝基苯基-L-赖氨酸、N-σ-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2羧乙基-L-赖氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-赖氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-赖氨酸、叠氮高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对溴苯丙氨酸、对碘苯丙氨酸、叠氮苯丙氨酸、乙酰苯丙氨酸或乙炔苯丙氨酸，以及包含内部烯烃的氨基酸，例如反式巴豆烯、丝氨酸烯丙基醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸和乙烯基甘氨酸。
(a)抗CD40部分
任何能够与CD40结合的抗体均可以用于构建本文公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所述的双特异性抗体的抗CD40部分可以源自本文提供的任何人源化抗CD40抗体(例如，源自本文公开的Lyv377或Lyv378的那些抗体)。在其他实例中，双特异性抗体的抗CD40部分可以源自本文公开的任何抗CD40抗体(例如本文公开的Ly253或其衍生物)。
如本文所用，“源自”亲本抗体的双特异性抗体中的抗体部分意指亲本抗体用作制备本领域已知的双特异性抗体的起始材料。抗体部分可以包括与亲本抗体相同的重链和/或轻链CDR。可选地，抗体部分可以包括与亲本抗体的重链和/或轻链CDR基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在具体实例中，Lyv377或源自其的人源化抗体(例如，TM550、TM553、LP3771、LP3772、LP3773、TM738、TM739、TM740或Ly181)可用作制备本文公开的任何双特异性抗体的起始材料。在其他实例中，Lyv378或源自其的人源化抗体(例如，TM559、LP3781、LP3782或LP3783)可用作制备本文公开的任何双特异性抗体的起始材料。在另外的其他实例中，本文公开的Ly253抗体可用作制备本文公开的任何双特异性抗体的起始材料。
(b)双特异性抗体中的第二抗体部分
除了与CD40结合的第一抗体部分之外，本文公开的双特异性抗体还包括能够与合适的抗原结合的第二抗体部分，例如肿瘤抗原或免疫检查点分子(例如，负调节免疫应答的那些)。实例包括B7H3、B7H4、CEA、HER2、PD-1、TNT或PD-L1。
抗CD40/B7H3双特异性抗体
在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体中的第二抗体部分结合B7H3，例如人B7H3。任何能够与B7H3结合的抗体均可以用于构建本文公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所述的双特异性抗体的抗B7H3部分可以源自本文提供的任何抗B7H3抗体(例如，Ly383或Ly387)。抗B7H3抗体部分可以包括与亲本抗体(例如，Ly383或Ly387)相同的重链和/或轻链CDR。可选地，抗体部分可以包括与亲本抗体的重链和/或轻链CDR基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗B7H3抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗CD40/B7H3双特异性抗体可以包括scFv形式的抗CD40部分和多链形式的抗B7H3部分。抗CD40 scFv片段可以来源于本文公开的任何抗CD40抗体，例如，Lyv377、Lyv378或Ly253。例如，双特异性抗体可以包括：包括与抗B7H3抗体的重链(例如Ly383或Ly387的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗B7H3抗体的轻链的第二链。可选地，双特异性抗体可以包括：包括可以与抗B7H3抗体的重链(例如Ly383或Ly387的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗B7H3抗体的重链的第二链。在一些情况下，抗B7H3抗体的重链可以包括突变Fc区，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力和/或结合特异性，例如本文所述的那些。
示例性抗CD40/B7H3双特异性抗体在实施例7中提供，其在本公开的范围内。
抗CD40/B7H4双特异性抗体
在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体中的第二抗体部分结合B7H4，例如人B7H4。任何能够与B7H4结合的抗体均可以用于构建本文公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所述的双特异性抗体的抗B7H4部分可以源自本文提供的任何抗B7H4抗体(例如，Ly361或Ly366)。抗B7H3抗体部分可以包括与亲本抗体(例如，Ly361或Ly366)相同的重链和/或轻链CDR。可选地，抗体部分可以包括与亲本抗体的重链和/或轻链CDR基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗B7H4抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗CD40/B7H4双特异性抗体可以包括scFv形式的抗CD40部分和多链形式的抗B7H3部分。抗CD40 scFv片段可以来源于本文公开的任何抗CD40抗体，例如，Lyv377、Lyv378或Ly253。例如，双特异性抗体可以包括：包括与抗B7H4抗体的重链(例如Ly361或Ly366的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗B7H4抗体的轻链的第二链。可选地，双特异性抗体可以包括：包括可以与抗B7H4抗体的重链(例如Ly361或Ly366的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗B7H4抗体的重链的第二链。在一些情况下，抗B7H4抗体的重链可以包括突变Fc区，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力和/或结合特异性，例如本文所述的那些。
示例性抗CD40/B7H4双特异性抗体在实施例4中提供，其在本公开的范围内。
抗CD40/CEA双特异性抗体
在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体中的第二抗体部分结合CEA，该CEA是与癌症发展相关的抗原。任何能够与CEA结合的抗体均可以用于构建本文公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所述的双特异性抗体的抗CEA部分可以源自本文提供的任何抗CEA抗体(例如，Ly311或Ly312)。抗CEA抗体部分可以包括与亲本抗体(例如，Ly311或Ly312)相同的重链和/或轻链CDR。可选地，抗体部分可以包括与亲本抗体的重链和/或轻链CDR基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗CEA抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗CD40/CEA双特异性抗体可以包括scFv形式的抗CD40部分和多链形式的抗CEA部分。抗CD40 scFv片段可以来源于本文公开的任何抗CD40抗体，例如，Lyv377、Lyv378或Ly253。例如，双特异性抗体可以包括：包括与抗CEA抗体的重链(例如Ly311或Ly312的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗CEA抗体的轻链的第二链。可选地，双特异性抗体可以包括：包括可以与抗CEA抗体的重链(例如Ly311或Ly312的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗CEA抗体的重链的第二链。在一些情况下，抗CEA抗体的重链可以包括突变Fc区，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力和/或结合特异性，例如本文所述的那些。
示例性抗CD40/CEA双特异性抗体在实施例5中提供，其在本公开的范围内。
抗CD40/HER2双特异性抗体
在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体中的第二抗体部分结合HER2，该HER2是乳腺癌的重要生物标志物和治疗靶标。任何能够与HER2结合的抗体均可以用于构建本文公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所述的双特异性抗体的抗HER2部分可以源自本文提供的任何抗HER2抗体(例如，TM737或Ly591)。抗HER2抗体部分可以包括与亲本抗体(例如，TM737或Ly591)相同的重链和/或轻链CDR。可选地，抗体部分可以包括与亲本抗体的重链和/或轻链CDR基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗HER2抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗CD40/HER2双特异性抗体可以包括scFv形式的抗CD40部分和多链形式的抗HER2部分。抗CD40 scFv片段可以来源于本文公开的任何抗CD40抗体，例如，Lyv377、Lyv378或Ly253。例如，双特异性抗体可以包括：包括与抗HER2抗体的重链(例如TM737或Ly591的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗HER2抗体的轻链的第二链。可选地，双特异性抗体可以包括：包括可以与抗HER2抗体的重链(例如TM737或Ly591的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗HER2抗体的重链的第二链。在一些情况下，抗HER2抗体的重链可以包括突变Fc区，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力和/或结合特异性，例如本文所述的那些。
示例性抗CD40/HER2双特异性抗体在实施例9中提供，其在本公开的范围内。
抗CD40/PD-1双特异性抗体
在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体中的第二抗体部分结合PD-1(程序性细胞死亡蛋白1或CD279)，该PD-1是在许多免疫细胞表面上表达的免疫检查点分子，其下调免疫应答。任何能够与PD-1结合的抗体均可以用于构建本文公开的双特异性抗体。实例包括西米普利单抗、纳武利尤单抗和帕博利珠单抗。WO 2017/087599中公开的抗PD-1抗体也在本公开内容的范围内，并且出于本文引用的目的和主题通过引用并入。在一些实例中，本文所述的双特异性抗体的抗PD-1部分可以源自本文提供的任何抗PD-1抗体(例如，Ly516)。抗PD-1抗体部分可以包括与亲本抗体(例如，Ly516)相同的重链和/或轻链CDR。可选地，抗体部分可以包括与亲本抗体的重链和/或轻链CDR基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗PD-1抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗CD40/PD-1双特异性抗体可以包括scFv形式的抗CD40部分和多链形式的抗PD-1部分。抗CD40 scFv片段可以来源于本文公开的任何抗CD40抗体，例如，Lyv377、Lyv378或Ly253。例如，双特异性抗体可以包括：包括与抗PD-1抗体的重链(例如Ly516的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗PD-1抗体的轻链的第二链。可选地，双特异性抗体可以包括：包括可以与抗PD-1抗体的重链(例如Ly516的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗PD-1抗体的重链的第二链。在一些情况下，抗PD-1抗体的重链可以包括突变Fc区，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力和/或结合特异性，例如本文所述的那些。
示例性抗CD40/PD-1双特异性抗体在实施例8中提供，其在本公开的范围内。
抗CD40/TNT双特异性抗体
在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体中的第二抗体部分结合坏死肿瘤细胞(TNT)。任何能够与坏死肿瘤细胞结合的抗体均可以用于构建本文公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所述的双特异性抗体的抗TNT部分可以源自本文提供的任何抗TNT抗体(例如，Ly368)。抗TNT抗体部分可以包括与亲本抗体(例如，Ly368)相同的重链和/或轻链CDR。可选地，抗体部分可以包括与亲本抗体的重链和/或轻链CDR基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗HER2抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗CD40/TNT双特异性抗体可以包括scFv形式的抗CD40部分和多链形式的抗TNT部分。抗CD40 scFv片段可以来源于本文公开的任何抗CD40抗体，例如，Lyv377、Lyv378或Ly253。例如，双特异性抗体可以包括：包括与抗TNT抗体的重链(例如Ly368的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗TNT抗体的轻链的第二链。可选地，双特异性抗体可以包括：包括可以与抗TNT抗体的重链(例如Ly368的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗TNT抗体的重链的第二链。在一些情况下，抗TNT抗体的重链可以包括突变Fc区，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力和/或结合特异性，例如本文所述的那些。
示例性抗CD40/TNT双特异性抗体在实施例6中提供，其在本公开的范围内。
抗CD40/PD-L1双特异性抗体
在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体中的第二抗体部分结合PD-L1(见以上讨论)。任何能够与PD-L1结合的抗体均可以用于构建本文公开的双特异性抗体。实例包括阿维单抗、度伐利尤单抗和阿替利珠单抗。在一些实例中，本文所述的双特异性抗体的抗PD-L1部分可以源自本文提供的任何抗PD-1抗体(例如，Ly074、Ly075或Ly076)。抗PD-1抗体部分可以包括与亲本抗体(例如，Ly074、Ly075或Ly076)相同的重链和/或轻链CDR。可选地，抗体部分可以包括与亲本抗体的重链和/或轻链CDR基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗PD-L1抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗体部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗CD40/PD-L1双特异性抗体可以包括scFv形式的抗CD40部分和多链形式的抗PD-L1部分。抗CD40 scFv片段可以来源于本文公开的任何抗CD40抗体，例如，Lyv377、Lyv378或Ly253。例如，双特异性抗体可以包括：包括与抗PD-L1抗体的重链(例如Ly074、Ly075或Ly076的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗PD-L1抗体的轻链的第二链。可选地，双特异性抗体可以包括：包括可以与抗PD-L1抗体的重链(例如Ly074、Ly075或Ly076的重链)融合的scFv片段的第一链和作为抗PD-L1抗体的重链的第二链。在一些情况下，抗PD-L1抗体的重链可以包括突变Fc区，该突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力和/或结合特异性，例如本文所述的那些。
示例性抗CD40/PD-L1双特异性抗体在实施例3中提供，其在本公开的范围内。
本文所述的CD40、PD-L1、B7H3或B7H4特异性抗体中的任一种可以是全长抗体，其包含两条重链和两条轻链，其各自包括可变结构域和恒定结构域。可选地，本文所述的抗体的重链恒定区可以包括单个结构域(例如，CH1、CH2或CH3)或任何单个结构域的组合。抗体重链和轻链恒定区是本领域熟知的，例如，在IMGT数据库(www.imgt.org)中或在www.vbase2.org/vbstat.php.提供的那些，两者均通过引用并入本文。
可选地，本文公开的抗体可以是全长抗体的抗原结合片段。全长抗体的术语“抗原结合片段”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，二价片段，包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)自然341:544-546(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546))，其由VH结构域组成；和(vi)保留功能的分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接起来，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子，称为单链Fv(scFv)。参见，例如，Bird等人(1988)科学242:423-426(Bird et al.(1988)Science 242:423-426)；和Huston等人(1988)美国科学院院刊85:5879-5883(Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。
在一些实施方案中，本文所述的抗体与相应的靶抗原(例如，CD40、PD-L1、PD-1、CEA、B7H3、B7H4、TNT或HER2)或其表位特异性结合。与抗原或表位“特异性结合”的抗体是本领域充分理解的术语。如果分子与特定靶抗原比其与可选的靶标更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应，则所述分子被称为表现出“特异性结合”。如果抗体比其与其他物质亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述抗体与靶抗原或表位“特异性结合”。例如，与抗原(例如，如上所述的那些抗原)或其中的抗原表位特异性(或优先地)结合的抗体是与这种靶抗原比其与其他抗原或同一抗原中的其他表位亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合的抗体。利用这个定义还应理解，例如，与第一靶抗原特异性结合的抗体可以或可以不与第二靶抗原特异性结合或优先地结合。如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包括)排他结合。在一些实例中，与靶抗原或其表位“特异性结合”的抗体可以不与其他抗原或同一抗原中的其他表位结合(即，在常规方法中仅可以检测基线结合活性)。可选地或另外地，相对于猴对应物，本文所述的抗体与人抗原或其片段特异性结合，或反之亦然(例如，如在相同的测定条件下的相同测定中确定的，对一种抗原的结合亲和力比对另一种抗原的结合亲和力高至少10倍)。在其他情况下，本文所述的抗体可以与人抗原和非人抗原(例如，猴)交叉反应，例如，对人抗原和非人抗原的结合亲和力差异小于5倍，例如小于2倍，或基本上类似。
在一些实施方案中，本文所述的抗体对靶抗原(例如，CD40、PD-L1、PD-1、CEA、B7H3、B7H4、TNT或HER2)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所述的抗体对于靶抗原或抗原表位的结合亲和力(KD)可以为至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低。结合亲和力升高对应于KD降低。抗体相对于第二抗原对第一抗原的更高亲和力结合可以通过比用于结合第二抗原的KA(或数值KD)更高的用于结合第一抗原的KA(或更小的数值KD)来指示。在这种情况下，该抗体相对于第二抗原(例如，第二构象或其模拟物中的相同的第一蛋白；或第二蛋白)对第一抗原(例如，第一构象或其模拟物中的第一蛋白)具有特异性。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其他比较)可以为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、37.5倍、50倍、70倍、80倍、91倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或105倍。在一些实施方案中，任何抗体可以进一步亲和力成熟以增加抗体对靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
可以通过各种方法来确定结合亲和力(或结合特异性)，包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子共振或光谱学(例如，使用荧光测定)。用于评价结合亲和力的示例性条件为在HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可以用于根据靶蛋白浓度测量结合的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白的浓度([结合(Bound)])通常通过以下等式与游离靶蛋白([游离(Free)])的浓度相关：
[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])
然而，并不总是需要对KA进行精确测定，因为有时例如通过功能性测定，例如体外或体内测定中的活性足以获得对亲和力的定量测量、获得对亲和力的定性测量或者获得对亲和力的推断，该亲和力例如是使用如ELISA或FACS分析等方法确定的、与KA成正比并且因此可以用于比较，如确定更高的亲和力是否例如高2倍。
在一些实施方案中，能够与CD40、PD-1、PD-L1、B7H3、B7H4、CEA、TNT和/或HER2结合的任何抗体(包括双特异性抗体)可以包含与野生型对应物相比的突变Fc区，使得该抗体对Fc受体具有改变的结合亲和力和/或结合特异性。在一些实例中，抗体可以包括对FcγRIIB(CD32B)具有提高的结合亲和力的修饰的Fc区，其可以有效地接合表达FcγRIIB的细胞，或与所有Fcγ受体具有低结合或不结合的修饰的Fc区，从而增强治疗效果。突变Fc区的实例在本文中提供或在WO/2018/183520和PCT/US2019/053505(于2019年9月27日提交)中公开，出于本文引用的目的和主题，其各自的相关公开内容通过引用并入。
可选地，本文所述的抗体可以包括修饰的恒定区。例如，它可以包括免疫学惰性的修饰的恒定区，例如，不触发补体介导的裂解，或不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC活性可以使用美国专利号5,500,362中公开的方法进行评估。在其他实施方案中，如在欧洲免疫学杂志(1999)29:2613-2624(Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624)；PCT申请号PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请号9809951.8中所述修饰恒定区。
II.抗体制备方法
如本文所述的任何抗体(包括双特异性抗体)可以通过本领域已知的任何方法进行制备。参见，例如，Harlow和Lane，(1998)抗体：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(Harlowand Lane,(1998)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可以通过常规方法制备。例如，F(ab')2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，并且Fab片段可以通过还原F(ab')2片段的二硫键产生。
基因工程抗体(例如人源化抗体)、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体，可以通过例如常规重组技术产生。在一个实例中，编码对靶抗原特异的单克隆抗体的DNA可以使用常规程序容易地分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，DNA可被置于一种或多种表达载体中，然后转染到宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白蛋白的骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。参见，例如，PCT公开号WO 87/04462。然后可以修饰DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列，Morrison等人，(1984)美国国家科学院院刊81:6851(Morrison et al.,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851)，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。以这种方式，可以制备具有靶抗原结合特异性的基因工程抗体，例如“嵌合”或“杂合”抗体。
用于产生“嵌合抗体”而开发的技术是本领域熟知的。参见，例如，Morrison等人(1984)美国国家科学院院刊81,6851(Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,6851)；Neuberger等人(1984)自然312,604(Neuberger et al.(1984)Nature 312,604)；和Takeda等人(1984)自然314:452(Takeda et al.(1984)Nature 314:452)。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见，例如，Queen等人，美国国家科学院院刊，86:10029-10033(1989)(Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989))。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的VH和VL可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来识别被预测对形成正确CDR结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中识别具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH链和人VL链。然后选择人VH受体基因和人VL受体基因。
可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代所选人受体基因内的CDR区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与CDR区相互作用时具有重要性的残基(参见以上描述)来取代人受体基因中的对应残基。
单链抗体可以经由重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列进行制备。优选地，在两个可变区之间掺入柔性接头。可选地，用于产生单链抗体的描述的技术(美国专利号4,946,778和4,704,692)可适用于产生噬菌体或酵母scFv文库，并且可以按照常规程序从文库中识别对本文公开的靶抗原特异的scFv克隆。
在一些实例中，如本文公开的任何抗体(包括双特异性抗体)可以通过如下示例的重组技术进行制备。
可以将对本文所述的抗体的重链和轻链进行编码的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与合适的启动子可操作地连接。在一个实例中，对重链和轻链进行编码的核苷酸序列中的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。可选地，对重链和轻链进行编码的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链两者均从同一启动子表达。在必要时，可以在对重链和轻链进行编码的序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实例中，将对抗体的两条链进行编码的核苷酸序列克隆到两个载体中，该载体可以被引入到相同或不同的细胞中。当在不同的细胞中表达这两条链时，其中的每条链均可以从表达这种链的宿主细胞中分离，并且分离的重链和轻链可以混合并在实现形成抗体的合适条件下温育。
通常，可以使用本领域已知的方法将编码抗体的一条链或所有链的核酸序列克隆到合适的表达载体中，与合适的启动子可操作地连接。例如，可以在合适条件下使核苷酸序列和载体与限制酶相接触，以在每个分子上产生可以彼此配对并且用连接酶连接在一起的互补端。可选地，可以将合成的核酸接头与基因的末端连接。这些合成的接头包含对应于载体中的特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
可以使用各种启动子来表达本文所述的抗体，这些启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒LTR(例如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌(E.coli)lac UV5启动子和单纯性疱疹tk病毒启动子。
还可以使用可调节的启动子。这些可调节的启动子包括使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节剂对携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调节的那些启动子(Brown,M.等人，细胞，49:603-612(1987)(Brown,M.et al.,Cell,49:603-612(1987)))、使用四环素阻遏物(tetR)的那些启动子(Gossen,M.和Bujard,H.，美国国家科学院院刊89:5547-5551(1992)(Gossen,M.,and Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992))；Yao,F.等人，人类基因疗法，9:1939-1950(1998)(Yao,F.et al.,HumanGene Therapy,9:1939-1950(1998))；Shockelt,P.,等人，美国国家科学院院刊，92:6522-6526(1995)(Shockelt,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995)))。其他系统包括FK506二聚体、使用雌二醇(astradiol)的VP16或p65、RU486、二元酚米乐甾酮(diphenol murislerone)或雷帕霉素(rapamycin)。诱导型系统可获自Invitrogen、Clontech和Ariad。
可以使用包括具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以作为转录调节剂来调节携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录(M.Brown等人，细胞，49:603-612(1987)(M.Brown et al.,Cell,49:603-612(1987))；Gossen和Bujard(1992)(Gossen and Bujard(1992))；M.Gossen等人，美国国家科学院院刊，89:5547-5551(1992)(M.Gossen et al.,Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)))，该携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子将四环素阻遏物(tetR)与转录激活子(VP 16)组合，以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，携带有tetO的哺乳动物启动子源自人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期启动子以用于产生tetR-tet操纵基因系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素诱导型开关。当四环素操纵基因适当地定位在CMVIE启动子的TATA元件下游时，四环素阻遏物(tetR)而非tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物可以单独用作强效反式调节剂来调节哺乳动物细胞中的基因表达(Yao等人，人类基因疗法，10(16):1392-1399(2003)(Yao etal.,Human Gene Therapy,10(16):1392-1399(2003)))。这个四环素诱导型开关的一个特别的优点是其不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白来实现其可调节作用，在一些情况下，该四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白可能对细胞有毒(Gossen等人，美国国家科学院院刊，89:5547-5551(1992)(Gossen etal.,Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))；Shockett等人，美国国家科学院院刊，92:6522-6526(1995)(Shockett et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995)))。
另外，载体可以包含例如以下中的一些或全部：可选标志基因，例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的游离型复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)、通用多克隆位点；以及用于正义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。用于产生包含转基因的载体的合适的载体和方法是本领域熟知并且可获得的。
可用于实践本文所述的方法的聚腺苷酸化信号的实例包含但不限于人胶原I聚腺苷酸化信号、人胶原II聚腺苷酸化信号和SV40聚腺苷酸化信号。
可以将包括对抗体中的任何抗体进行编码的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)引入到合适的宿主细胞中以用于产生抗体。可以在合适的条件下培养宿主细胞以用于表达抗体或其任何多肽链。可以通过常规方法(例如亲和力纯化)通过培养的细胞(例如，来自细胞或培养上清液)来回收这种抗体或其多肽链。如有必要，可以在合适的条件下在实现产生抗体的合适时间段内温育抗体的多肽链。
在一些实施方案中，用于制备本文所述的抗体的方法涉及对也如本文所述的抗体(包括双特异性抗体)的重链和轻链进行编码的重组表达载体。可以通过常规方法(例如磷酸钙介导的转染)将重组表达载体引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可以选择并在实现表达形成抗体的这两条多肽链的合适条件下培养阳性转化体宿主细胞，这两条多肽链可以从细胞或从培养基中回收。在必要时，可以在实现形成抗体的合适条件下温育从宿主细胞中回收的这两条链。
在一个实例中，提供了两种重组表达载体，一种编码抗体的第一链(例如，重链)，并且另一种编码抗体的第二链(例如，轻链)。可以通过常规方法(例如磷酸钙介导的转染)将这两种重组表达载体都引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可选地，可以将表达载体中的每种表达载体均引入到合适的宿主细胞中。可以选择并在实现表达抗体的多肽链的合适条件下培养阳性转化体。在将这两种表达载体引入到相同的宿主细胞中时，可以从宿主细胞或从培养基中回收其中产生的抗体。如有必要，可以从宿主细胞或从培养基中回收多肽链，并且然后在实现形成抗体的合适条件下温育多肽链。当将这两种表达载体引入到不同的宿主细胞中时，这两种表达载体中的每种表达载体可以从对应的宿主细胞或从对应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下温育这两条多肽链以用于形成抗体。
使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。例如，可以用蛋白A或蛋白G偶联基质通过亲和色谱法来分离一些抗体。
编码如本文所述的抗体的第一链(例如，重链)、第二链(例如，轻链)或两者的任何核酸，包含其的载体(例如，表达载体)；和包括载体的宿主细胞在本公开的范围内。
III.药物组合物
可以将本文所述的任何抗体(包括双特异性抗体)以及编码核酸或核酸集、包括其的载体或包括载体的宿主细胞与药学上可接受的运载体(carrier)(辅料)混合以形成用于治疗目标疾病的药物组合物。“可接受的”意指运载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的辅料(运载体)包括缓冲液，该缓冲液是本领域熟知的。参见，例如，雷明顿：药学的科学与实践第20版(2000)Lippincott Williams和Wilkins，K.E.Hoover编辑(Remington:The Science andPractice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。
用于本发明方法的药物组合物可以包括冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的运载体、辅料或稳定剂。(雷明顿：药学的科学与实践第20版(2000)Lippincott Williams和Wilkins，K.E.Hoover编辑(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20thEd.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover))。可接受的运载体、辅料或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实例中，本文所述的药物组合物包括包含抗体(或编码核酸)的脂质体，该脂质体可以通过本领域已知的方法制备，例如Epstein等人，美国国家科学院院刊82:3688(1985)(Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985))；Hwang等人，美国国家科学院院刊77:4030(1980)(Hwang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980))；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。美国专利号5,013,556中公开了具有增强循环时间的脂质体。可以用脂质组合物(包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE))来通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。通过具有限定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有期望直径的脂质体。
还可以将抗体或一种或多种编码核酸包埋在例如通过凝聚法技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中。这些技术均是本领域已知的，参见，例如，雷明顿：药学的科学与实践第20版Mack出版社(2000)(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.MackPublishing(2000))。
在其他实例中，本文所述的药物组合物可以以缓释型形式配制。缓释型制剂的合适的实例包含含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品，例如薄膜或微胶囊的形式。缓释型基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-7-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体))、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常将治疗性抗体组合物置于具有无菌进口端的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。
本文所述的药物组合物可以以单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂或者栓剂，以用于口服、肠胃外或直肠施用或者通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物(例如片剂)，可以将主要活性成分与药物运载体例如常规压片成分(例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其他药物稀释剂(例如水)混合，以形成包含本发明的化合物的均相混合物固体预制剂组合物或无毒的其药学上可接受的盐。在称这些预制剂组合物为均相时，这意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂组合物细分成上述类型的单位剂型，该单位剂型包含0.1至约500mg本发明的活性成分。可以包衣或以其他方式配混新组合物的片剂或丸剂以提供给出延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量组分和外剂量组分，后者在前者之上采用包封的形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗胃中的崩解并且使得内组分完整地传递进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可以用于这种肠溶层或包衣，这种材料包括多种聚合酸以及聚合酸与如虫胶、十六醇和乙酸纤维素等此类材料的混合物。
合适的表面活性剂具体地包括非离子剂，例如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，TweenTM20、40、60、80或85)和其他山梨聚糖(例如，SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括0.05至5％的表面活性剂，并且可以为0.1至2.5％。应当理解，如有必要，可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的媒剂。
可以使用可商购获得的脂肪乳剂(例如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM)来制备合适的乳剂。活性成分可以溶解于预混合的乳剂组合物中，或可选地，活性成分可以溶解于油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成的乳剂中。应当理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常将包含至多20％的油，例如，5至20％。脂肪乳剂可以包括0.1至1.0μm、具体地0.1至0.5μm的脂肪滴，并且pH范围为5.5至8.0。
乳剂组合物可以是通过将抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些乳剂组合物。
用于吸入或吹入的药物组合物包括药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和混悬剂以及粉末。液体或固体组合物可以包含如上文所列出的合适的药学上可接受的辅料。在一些实施方式中，通过口服或鼻腔呼吸途径施用组合物以产生局部或全身作用。
可以通过使用气体来雾化优选地无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置中呼吸雾化溶液，或者雾化装置可以附接至面罩、帐幕或间歇正压呼吸机。可以从以适当方式递送制剂的装置优选地通过口服或鼻腔施用溶液、混悬剂或粉末组合物。
IV.治疗应用
任何抗CD40抗体、抗PD-L1抗体、抗B7H3抗体和抗B7H4抗体，以及抗CD40/PD-1双特异性抗体、抗CD40/PD-L1双特异性抗体、抗CD40/B7H3双特异性抗体、抗CD40/B7H4双特异性抗体、抗CD40/CEA双特异性抗体、抗CD40/TNT双特异性抗体和抗CD40/HER2双特异性抗体可用于临床环境(例如，治疗或诊断)或非临床环境(例如，用于研究目的)。
在一些方面，本文提供了使用本文公开的任何抗体用于调节需要治疗的受试者的免疫应答或用于治疗需要治疗的受试者的靶向疾病的方法。为了实践本文所公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者(例如，人)施用有效量的本文所述的药物组合物，该合适的途径例如静脉内施用(例如，如推注或通过一段时间内的连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或外用途径。用于液体制剂的可商购获得的雾化器(包括喷射雾化器和超声雾化器)可用于施用。液体制剂可以直接雾化并且冻干粉可以在复溶之后雾化。可选地，本文所述的抗体可以使用碳氟化合物制剂和计量吸入器来雾化或者作为冻干粉和研磨粉吸入。
待通过本文所述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包括但不限于家畜、运动动物、宠物、灵长类动物、马、犬、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人受试者可以是患有、有风险或疑似患有目标疾病/病症(例如癌症)或免疫病症(例如自身免疫疾病)的人患者。
癌症的实例包括但不限于乳腺癌；胆管癌；膀胱癌；脑癌，包含成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌(gastric cancer)；血液肿瘤，包括急性淋巴细胞白血病和骨髓性白血病，例如B细胞CLL；T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤；毛细胞白血病；慢性骨髓性白血病，多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内肿瘤，包括博文氏病(Bowen's disease)和佩吉特氏病(Paget'sdisease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏病(Hodgkin's disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；成神经细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括由以下引起的那些：上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑色素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括胚组织瘤，如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；以及肾癌，包括腺癌和威尔姆氏肿瘤(Wilmstumor)。
患有目标癌症的受试者可以通过常规医学检查(例如实验室检测、器官功能检测、CT扫描、超声或基因检测)来识别。在一些实施方案中，通过本文所述的方法待治疗的受试者可以是已经经历或正经受抗癌疗法(例如，化学疗法、放射疗法、免疫疗法或外科手术)的人癌症患者。
免疫病症是指免疫系统功能障碍。实例包括自身免疫性疾病、免疫缺陷或过敏。在一些实施方案中，治疗的目标疾病是自身免疫性疾病。实例包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力(MG)、格雷夫氏病(Graves'Disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、自身免疫性心肌炎、膜性肾小球肾炎、高IgM综合征、糖尿病、I型或II型糖尿病、多发性硬化症、雷诺氏综合征(Reynaud'ssyndrome)、自身免疫性甲状腺炎、胃炎、乳糜泻、白癜风、肝炎、原发性胆汁性肝硬化、炎症性肠病、脊椎关节病变、实验性自身免疫性脑脊髓炎、免疫性中性粒细胞减少症、青少年型糖尿病、和与常见于结核病、结节病和多肌炎中的由细胞因子、T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应相关的免疫应答、多动脉炎、皮肤血管炎、天疱疮、类天疱疮(pemphigold)、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、川崎氏病(Kawasaki's disease)、系统性硬化症、抗磷脂综合征、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、移植物抗宿主(GVH)疾病和免疫性血小板减少症。
可以通过常规医学检查，例如，存在抗核抗体、抗线粒体自身抗体、抗中性粒细胞胞质抗体、抗磷脂抗体、抗瓜氨酸肽(抗CCP)、抗类风湿因子、免疫球蛋白A、C反应蛋白检测、补体检测、红细胞沉降率(ESR)检测、凝血特征和蛋白电泳/免疫固定电泳和/或基因检测，识别患有目标自身免疫病的受试者。在一些实施方案中，通过本文所述的方法待治疗的受试者可以是患有自身免疫性疾病的人受试者，该人受试者已经经历或正经受自身免疫性疾病治疗，例如免疫抑制介导、激素替代疗法、输血、抗炎药物和/或疼痛药物。
疑似患有任何此类目标疾病/病症的受试者可能示出该疾病/病症的一种或多种症状。具有疾病/病症风险的受试者可以是具有该疾病/病症的一种或多种风险因素的受试者。
如本文所用，“有效量”是指单独地或与一种或多种其他活性剂组合地赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。确定抗体的量是否达到治疗效果对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。如本领域的技术人员所认识到的，有效量有所不同，这取决于正在治疗的特定病状、病状的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重)、治疗持续时间、同时疗法的性质(若有)、具体施用途径和在健康从业者的知识和专业技能内的相似因素。这些因素是本领域的普通技术人员所熟知的并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用单独组分或其组合的最大剂量，即，根据合理的医学判断的最高安全剂量。
经验性考虑(例如半衰期)通常将有助于确定剂量。例如，可以使用与人免疫系统相容的抗体(例如抗体或完全人抗体)来延长抗体的半衰期并且防止抗体受到宿主的免疫系统的攻击。施用频率可以在治疗过程中确定并进行调整，并且通常但不一定是基于目标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可选地，抗体的持续缓释制剂可以是适当的。用于实现缓释的各种制剂和装置是本领域已知的。
在一个实例中，本文所述的抗体的剂量可以在给予一次或多次抗体施用的个体中凭经验确定。给予个体递增剂量的激动剂。为了评估激动剂的疗效，可以遵循疾病/病症的指标。
通常，对于施用本文所述的任何抗体，初始候选剂量可以为约2mg/kg。出于本公开的目的，典型的日剂量的范围根据上述因素可以为约0.1μg/kg至3μg/kg、至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多中的任何剂量。对于在若干天或更长时间内的重复施用，根据病状持续治疗，直至出现期望的症状抑制或直至达到足以减轻目标疾病或病症或其症状的治疗水平。示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，随后施用约1mg/kg抗体的每周维持剂量或者随后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰变模式，其他剂量方案可能是有用的。例如，设想每周给药一至四次。在一些实施方案中，可以使用的剂量范围为约3μg/mg至约2mg/kg(例如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)。在一些实施例中，给药频率为每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更久一次。通过常规技术和测定，容易地监测该疗法的进展。给药方案(包括使用的抗体)可以随时间而变化。
在一些实施方案中，对于正常体重的成年患者，可以施用的剂量范围为约0.3至5.00mg/kg。在一些实例中，如本文所述的抗体的剂量可以为10mg/kg。特定的给药方案，即剂量、时间计划和重复，将取决于特定个体和该个体的病史以及单独药剂的性质(例如药剂的半衰期和本领域所熟知的其他考虑)。
出于本公开的目的，本文所述的抗体的适当剂量将取决于所采用的特异性抗体、抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/病症的类型和严重程度、抗体是否出于预防或治疗目的而施用、既往疗法、患者的临床病史和对激动剂的应答以及主治医生的判定。通常，临床医生将施用抗体，直至达到实现期望的结果的剂量。在一些实施方案中，期望的结果是肿瘤微环境中抗肿瘤免疫应答增加。确定剂量是否产生期望结果的方法对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。一种或多种抗体的施用可以是连续或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性的还是预防性的以及熟练从业者已知的其他因素。抗体的施用可以在预选时间段内基本上是连续的，或者可以例如在发展目标疾病或病症之前、期间或之后采用一系列间隔剂量。
如本文所使用的，术语“治疗”是指向受试者施加或施用包括一种或多种活性剂的组合物，该受试者患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状或对疾病/症状有易感性，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。
减轻目标疾病/病症包括延迟疾病的发展或进展或者降低疾病严重程度或延长生存时间。减轻疾病或延长生存时间不一定需要治愈结果。如本文所用，“延迟”目标疾病或病症的发展意指推迟、阻碍、减缓、放缓、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或正在治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是降低在给定时间范围内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或与不使用该方法相比在给定时间范围内降低症状的程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的许多受试者。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或后续进展。疾病的发展可以是可检测到的并且可以使用如本领域熟知的标准临床技术进行评估。然而，发展还指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
根据待治疗的疾病的类型或疾病的部位，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法来向受试者施用药物组合物。这种组合物还可以通过其他常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、外用、直肠、鼻腔、颊、阴道或通过植入式储药器施用。如本文所使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射的贮库施用途径向受试者施用组合物，例如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解材料和方法。在一些实例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。
可注射组合物可以包含各种运载体，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性抗体，由此输注包含抗体和生理学上可接受的辅料的药物制剂。生理学上可接受的辅料可以包括，例如，5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或其他合适的辅料。肌肉内制剂(例如，抗体的合适的可溶性盐形式的无菌制剂)可以在药物辅料(例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液)溶解和施用。
在一个实施方案中，通过部位特异性或靶向局部递送技术施用抗体。定位或靶向局部递送技术的实例包括抗体的各种可植入的长效来源或局部递送导管，例如输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹、分流器和支架或其他可植入装置、定位的运载体、直接注射或直接施加。参见，例如，PCT公开号WO 00/53211和美国专利号5,981,568。
也可以使用包含反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术例如描述于Findeis等人，生物技术趋势(1993)11:202(Findeis et al.,Trends Biotechnol.(1993)11:202)；Chiou等人，基因治疗：直接基因转移的方法和应用(J.A.Wolff，编辑)(1994)(Chiou et al.,Gene Therapeutics:Methodsand Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff,ed.)(1994))；Wu等人，生物化学杂志(1988)263:621(Wu et al.,J.Biol.Chem.(1988)263:621)；Wu等人，生物化学杂志(1994)269:542(Wu et al.,J.Biol.Chem.(1994)269:542)；Zenke等人，美国国家科学院院刊(1990)87:3655(Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655)；Wu等人，生物化学杂志(1991)266:338(Wu et al.,J.Biol.Chem.(1991)266:338)。
包含多核苷酸(例如，编码本文所述抗体的那些)的治疗组合物以约100g至约200gDNA的范围施用，用于基因治疗方案中的局部施用。在一些实施方案中，在基因治疗方案期间还可以使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg、和约20μg至约100μg或更多的浓度范围。
本文所述的治疗性多核苷酸和多肽可以使用基因递送溶媒递送。基因递送溶媒可以是病毒或非病毒来源的(通常参见，Jolly,癌症基因治疗(1994)1:51(Jolly,CancerGene Therapy(1994)1:51)；Kimura,人基因治疗(1994)5:845(Kimura,Human GeneTherapy(1994)5:845)；Connelly,人基因治疗(1995)1:185(Connelly,Human GeneTherapy(1995)1:185)；和Kaplitt,自然遗传学(1994)6:148(Kaplitt,Nature Genetics(1994)6:148))。可以使用内源哺乳动物或异源启动子和/或增强子诱导此类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型的或受调控的。
用于递送期望的多核苷酸并在期望细胞中表达的基于病毒的载体是本领域熟知的。示例性的基于病毒的溶媒包括但不限于重组逆转录病毒(参见，例如，PCT公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利号5,219,740和4,777,127；英国专利号2,200,651；和欧洲专利号0 345242)，基于甲病毒的载体(例如，Sindbis病毒载体、Semliki森林病毒)(ATCC VR-67；ATCCVR-1247)，罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如，PCT公开号WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。还可以采用如Curiel,人基因治疗(1992)3:147(Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147)中所述的施用与被杀死的腺病毒相关的DNA。
还可以使用非病毒递送溶媒和方法，包括但不限于，单独与杀死的腺病毒连接或不连接的聚阳离子缩合DNA(参见，例如，Curiel,人基因治疗(1992)3:147(Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147))；配体连接的DNA(参见，例如，Wu,生物化学杂志(1989)264:16985(Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985))；真核细胞递送溶媒细胞(参见，例如，美国专利号5,814,482；PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；和WO 97/42338)和核酸电荷中和或与细胞膜融合。还可以使用裸DNA。示例性的裸DNA引入方法描述于PCT公开号WO 90/11092和美国专利第5,580,859号。可以充当基因递送载体的脂质体描述于美国专利5,422,120；PCT公开号WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；和欧洲专利0524968。其他方法描述于Philip,分子细胞生物学(1994)14:2411(Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411)和Woffendin,美国国家科学院院刊(1994)91:1581(Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581)。
本文所述的方法中使用的特定给药方案，即剂量、时间计划和重复，将取决于特定受试者和所述受试者的病史。
在一些实施方案中，可以向需要治疗的受试者施用多于一种抗体或抗体与另一种合适的治疗剂的组合。抗体还可以与用于增强和/或补充药剂有效性的其他药剂结合使用。可以通过本领域熟知的方法对目标疾病/病症的治疗疗效进行评估。
当本文所述的任何抗体用于治疗癌症时，它可以与例如本领域已知的那些抗癌疗法联合使用。另外的抗癌疗法包括化学疗法、外科手术、辐射、免疫疗法、基因疗法等。
可选地，本公开的治疗可以与以下组合：化学治疗剂，例如，嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)和阿糖胞苷)、嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物例如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管破坏剂例如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛(docetaxel))、长春新碱、长春碱、诺考达唑(nocodazole)、埃博霉素(epothilone)和诺维本(navelbine)、表鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶(amsacrine)、蒽环霉素(anthracycline)、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、卡铂、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、六轻甲基蜜胺(hexamethyhnelamine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、二氯甲基二乙胺(merchlorehtamine)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亚硝基脲、普卡霉素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉酚(taxol)、泰索帝(taxotere)、替尼泊苷、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和依托泊苷(VP16))；抗生素，例如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、伊达比星(idarubicin)、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素；酶(系统地代谢L-天冬酰胺并且剥夺不具有合成其自身的天冬酰胺的能力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，例如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和类似物、链脲霉素(streptozocin))、三氮烯-达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦(mitotane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素、激素类似物(雌激素、三苯氧胺(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide))和芳香酶抑制剂(来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林(aspirin)、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(贝莱维定(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如，TNP-470、染料木黄酮、贝伐单抗(bevacizumab))和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab))；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸(tretinoin))；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、京尼平苷(eniposide)、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))、皮质类固醇(可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基强的松龙(methylpednisolone)、强的松(prednisone)和泼尼松龙(prednisolone))；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶激活剂；以及染色质破坏剂。
当本文所述的任何抗体用于治疗免疫病症时，它可以与其他免疫调节治疗(例如治疗性疫苗(包括但不限于GVAX、基于DC的疫苗等)，或检查点抑制剂(包括但不限于阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的药剂))共同使用。在一些情况下，抗体可以与另一种自身免疫性疾病疗法联合使用。实例包括但不限于，静脉Ig治疗；非甾体抗炎药(NSAID)；皮质类固醇；环孢菌素、雷帕霉素、子囊霉素；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；布喹那(brequinar)；FTY720；来氟米特；咪唑立滨；霉酚酸；吗替麦考酚酯；15-脱氧精胍；免疫抑制剂或粘附分子抑制剂。
关于另外的有用药剂的实例，另见内科医生案头参考，补充第59版，(2005),Thomson PD R,Montvale N.J.(Physician's Desk Reference,59.sup.th edition,(2005),Thomson P D R,Montvale N.J.)；Gennaro等人编辑，雷明顿药学的科学与实践补充第20版，(2000),Lippincott Williams和Wilkins,Baltimore Md.(Gennaro et al.,Eds.Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition,(2000),Lippincott Williams and Wilkins,Baltimore Md.)；Braunwald等人编辑，Harrison的内科学原理，补充第15版,(2001),McGraw Hill,NY(Braunwald et al.,Eds.Harrison's Principles of Internal Medicine,15.sup.th edition,(2001),McGraw Hill,NY)；Berkow等人编辑，默克诊疗手册，(1992),默克研究实验室,Rahway N.J(Berkow et al.,Eds.The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,(1992),MerckResearch Laboratories,Rahway N.J)。
当使用第二治疗剂时，这种药剂可以与本文所述的治疗剂同时或序贯(以任何顺序)施用。当与另外的治疗剂共同施用时，可以根据相加作用或协同效应降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。
V.包括本文公开的抗体的试剂盒
本公开还提供了用于治疗或减轻如本文所述的目标疾病(例如癌症或免疫病症)的试剂盒。此类试剂盒可以包括一个或多个容器，该容器包括抗CD40抗体、抗PD-L1抗体、抗B7H3抗体和抗B7H4抗体、抗CD40/PD-1双特异性抗体、抗CD40/PD-L1双特异性抗体、抗CD40/B7H3双特异性抗体、抗CD40/B7H4双特异性抗体、抗CD40/CEA双特异性抗体、抗CD40/TNT双特异性抗体和/或抗CD40/HER2双特异性抗体，例如本文所述的任何抗体，以及任选地与该抗体共同使用的第二治疗剂，其也在本文中描述。
在一些实施方式中，试剂盒可以包括用于根据本文所述的任何方法使用的说明书。包括的说明书可以包括对施用用于治疗、延迟发作或减轻目标疾病(如本文所述的那些目标疾病)的抗体和任选的第二治疗剂的描述。试剂盒可以进一步包括对基于例如采用本文所述的诊断方法识别个体是否患有目标疾病来选择适于治疗的所述个体的描述。在还其他实施方案中，说明书包括对向具有目标疾病风险的个体施用抗体的描述。
与抗体的使用有关的说明书通常包括关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面说明书，但是机器可读的用法说明(例如，载于磁盘或光存储磁盘上的说明书)也是可接受的。
标签或包装插页指示组合物用于治疗、延迟发作和/或减轻疾病，例如癌症、免疫病症(例如自身免疫性疾病)。可以提供说明书以用于实践本文所述的任何方法。
本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。还设想了与具体装置(例如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(例如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的那些抗体。
试剂盒可以任选地提供另外的组分(例如缓冲液)以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施方式中，本发明提供了包括上文所述的试剂盒的内容物的制品。
通用技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在如以下文献中进行充分解释：例如分子克隆：实验室手册，第二版(Sambrook等人，1989)冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,et al.,1989)Cold Spring Harbor Press)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编辑，1984)(；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.1984))；分子生物学方法,胡马纳出版社(Methods in Molecular Biology,Humana Press)；细胞生物学：实验室记录(J.E.Cellis编辑，1989)学术出版社(Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1989)Academic Press)；动物细胞培养(R.I.Freshney编辑，1987)(Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.1987))；细胞和组织培养简介(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum出版社(Introuction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather andP.E.Roberts,1998)Plenum Press)；细胞和组织培养：实验室程序(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley和Sons(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.1993-8)J.Wileyand Sons)；酶学方法(学术出版社公司)(Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.))；实验免疫学手册(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：哺乳动物细胞的基因转移载体(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)(Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.):Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987))；当代分子生物学实验技术(F.M.Ausubel等人编辑，1987)(Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,etal.eds.1987))；PCR：聚合酶链反应,(Mullis等人编辑，1994)(PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis,et al.,eds.1994))；当代免疫学实验技术(J.E.Coligan等人编辑，1991)(Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991))；精编分子生物学实验技术(Wiley和Sons,1999)(Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons,1999))；免疫生物学(C.A.Janeway和P.Travers,1997)(Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997))；抗体(P.Finch,1997)(Antibodies(P.Finch,1997))；抗体：实用方法(D.Catty.编辑，IRL出版社,1988-1989)(Antibodies:a practiceapproach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989))；单克隆抗体：实用的方法(P.Shepherd和C.Dean编辑，牛津大学出版社，2000)(Monoclonal antibodies:apractical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000))；使用抗体：实验室手册(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999)(Using antibodies:a laboratorymanual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999))；抗体(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，Harwood学术出版社,1995)(The Antibodies(M.Zanettiand J.D.Capra,eds.Harwood Academic Publishers,1995))；DNA克隆：实用方法，第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)(DNA Cloning:A practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985))；核酸杂交(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985))(Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)))；转录和翻译(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，(1984))(Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984)))；动物细胞培养(R.I.Freshney编辑，(1986))(Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1986)))；固定细胞和酶(lRL出版社,(1986))(Immobilized Cellsand Enzymes(lRL Press,(1986)))；和B.Perbal,分子克隆实用指南(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)(B.Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubelet al.(eds.))。
无需进一步详细阐述，相信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。
实施例1：CD40特异性人源化抗体的构建
本实施例提供了源自两种鼠亲本抗CD40抗体LYV377和LYV378的示例性人源化抗CD40抗体。
(i)源自LYV377的人源化抗CD40抗体
以下提供了鼠LYV377的VH和VL序列(使用Kabat CDR定义识别的CDR区(以粗体显示))：
>LYV377_VH(SEQ ID NO:71)
>LYV377_VL(SEQ ID NO:72)
按照本领域已知的方法，进行序列比对以分别将LYV377 VH和VL与人种系VH和VL序列进行比较。参见，例如，Glanville J.等人PNAS 2009；106(48)20216–21(GlanvilleJ.et al.PNAS 2009；106(48)20216–21)。基于整体序列同一性、匹配的界面位置和类似分类的CDR规范位置，每个轻链和重链的种系家族作为期望的受体框架，即对于轻链，IGKV1-39*01，以及对于重链，IGHV3-73*01。人受体被识别为ACJ71716.1免疫球蛋白κ轻链和CAF28444.1免疫球蛋白重链可变区，其氨基酸序列如下所示：
>CAF28444.1人VH受体序列(SEQ ID NO:73)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANSYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRLVADGGWYGMDVWGQGTTVTVSS
>ACJ71716.1人VL受体序列(SEQ ID NO:74)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
将亲本LYV377抗体的CDR移植到上述人VH和VL受体序列的相应CDR区，生成人源化LYV377_VH-1和LYV377_VL-1链(移植人源化抗体)，其各自的氨基酸序列如下所示(CDR以粗体显示)：
>LYV377_VH-1(移植的LYV377_VH；SEQ ID NO:10)
>LYV377_VL-1(移植的LYV377_VL；SEQ ID NO:15)
LYV377抗体Fv片段的同源性建模如下进行。简言之，针对PDB抗体数据库对LYV377VH和VL序列进行BLAST搜索，以识别Fv片段的合适模板，特别是用于构建结构域界面。选择结构模板2UZI(CRYSTAL STRUCTURE OF HRAS(G12V)-ANTI-RAS FV COMPLEX)，同一性＝65％。LYV377抗体和2UZI模板之间的氨基酸序列比对如下所示，其中│是重链/轻链断裂和*表示两个序列中相同的氨基酸残基。
2UZI
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTFSMNWVRQAPGKGLEWVSYISRTS--KTI
LYV377
EVQILETGGGLVKPGGSLRLSCATSGFNFNDSFMNWVRQAPGKGLEWVAQIRNKNYNYAT
2UZI
YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR------GRFFDYWGQGTLVT
LYV377
YYTESLEGRVTISRDDSKSRVYLQVSSLRAEDSAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGVMVT
2UZI
VS-│-IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGEAPKLLIYSASVLQSG
LYV377
VSS│DIKMTQSPSFLSASVGDSVTFTCKASQNIYIYLNWYQQKFGEAPKLLIYNTNNLQTG
2UZI VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVMIPMTFGQGTKVE---(SEQ ID NO:75)
LYV377
IPSRFSGSESGTVFTLTISSLQPEDVATYFCLQHSS-RRTFGGGTKLELKR(SEQ ID NO:71)
同源模型使用定制的构建同源模型方案构建。二硫键被指定和连接。使用DOPE方法优化循环。基于2UZI同源模型，分析LYV377抗体的VH和VL序列。识别预期对于结合活性重要的框架区(FR)残基，包括规范FR残基，以及抗体的VH-VL界面残基。进一步分析内核中的框架残基，识别LYV377_VH-1(移植的LYV377_VH)的四个残基进行回复突变，包括E1(易形成焦谷氨酸的表面暴露残基)、A24(具有侧链极性的掩蔽残基)、F70(掩蔽规范残基)和R100(具有侧链电荷的掩蔽残基)。
人源化变体LYV377_VH-2(序列如下所示)被设计为包括这些回复突变(E1Q、A24T、F70V和R100S，以粗体显示)，并检查其生物活性以识别有助于保持最佳活性(例如，抗原结合活性、CD40激动活性和/或抗肿瘤活性)的回复突变。此外，HCDR1内潜在的N-糖基化位点在LYV377_VH-2Q、LYV377_VH-2A和LYV377_VH-2Y中发生突变(序列也如下所示；进一步的突变以粗体和下划线显示)。
>LYV377_VH-2(SEQ ID NO:11)
>LYV377_VH-2Q(SEQ ID NO:12)
>LYV377_VH-2A(SEQ ID NO:13)
>LYV377_VH-2Y(SEQ ID NO:14)
构建人源化LYV377抗体的重组全长人IgG/κ。人源化LYV377抗体包括：
-TM550(来自LYV377的CDR移植人源化抗体)
-TM553(包括VH-2/IgG2的重链和一条VL-1/κ的轻链)，
-LP3771(包括VH-2/IgG1的重链和VL-1/κ的轻链)，
-LP3772(包括VH-2/IgG4的重链和VL-1/κ的轻链)，
-LP3773(包括VH-2/IgG1mut的重链和VL-1/κ的轻链)，
-TM738(包括VH-2Q/IgG1mut的重链和VL-1/κ的轻链)，
-TM739(包括VH-2A/IgG1mut的重链和VL-1/κ的轻链)，
-TM740(包括VH-2Y/IgG1mut的重链和VL-1/κ的轻链)，和
-Ly181(包括VH-2Y/IgG2的重链和VL-1/κ的轻链)。
上文所列的嵌合抗体TM377和源自LYV377的人源化抗CD40抗体的重链和轻链的氨基酸序列提供如下：
·TM377
重链(SEQ ID NO:76):
EVQILETGGGLVKPGGSLRLSCATSGFNFNDSFMNWVRQAPGKGLEWVAQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKSRVYLQVSSLRAEDSAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
轻链(SEQ ID NO:77):
DIKMTQSPSFLSASVGDSVTFTCKASQNIYIYLNWYQQKFGEAPKLLIYNTNNLQTGIPSRFSGSESGTVFTLTISSLQPEDVATYFCLQHSSRRTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·TM550重链(SEQ ID NO:78):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFNFNDSFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·TM553重链(SEQ ID NO:79):
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDSFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·LP3771重链(SEQ ID NO:80):
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDSFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·LP3772重链(SEQ ID NO:81):
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDSFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
·LP3773重链(SEQ ID NO:82):
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDSFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·TM738重链(SEQ ID NO:83):
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFQDSFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·TM739重链(SEQ ID NO:84):
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDAFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·TM740重链(SEQ ID NO:85):
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·Ly181重链(SEQ ID NO:86):
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
所有上述抗CD40人源化抗体共享以下共同轻链(人κ链)：
·共同轻链(SEQ ID NO:87):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
这些人源化抗体与嵌合抗体TM377(包括LYV377 VH/人IgG4的重链和LYV377 VL/κ的轻链)一起在HEK293细胞或CHO细胞中表达，然后按照常规方法从细胞培养物中纯化抗体。检查纯化抗体的内毒素(<5EU/mg)和单体化(>95％)。
(ii)源自LYV378的人源化抗CD40抗体
以下提供了鼠LYV378的VH和VL序列(使用Kabat CDR定义识别的CDR区(以粗体显示))：
>LYV378_VH(SEQ ID NO:88)
>LYV378_VL(SEQ ID NO:89)
按照本领域已知的方法，进行序列比对以分别将LYV378 VH和VL与人种系VH和VL序列进行比较。参见，例如，Glanville J.等人PNAS 2009；106(48)20216–21(GlanvilleJ.et al.PNAS 2009；106(48)20216–21)。基于整体序列同一性、匹配的界面位置和类似分类的CDR规范位置，每个轻链和重链的种系家族作为期望的受体框架，即对于轻链，IGKV1-39*01，以及对于重链，IGHV3-23*04。人受体被识别为CAG17622.1免疫球蛋白κ轻链和AAF75634.1免疫球蛋白重链可变区，其氨基酸序列如下所示：
>AAF75634.1人VH受体(SEQ ID NO:90)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRPTLGATGYWGQGTLVTVSS
>CAG17622.1人VL受体(SEQ ID NO:91)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPRTFGQGTKLEIKRT
将亲本LYV378抗体的CDR移植到上述人VH和VL受体序列的相应CDR区，生成人源化LYV378_VH-1和LYV378_VL-1链(移植人源化抗体)，其各自的氨基酸序列如下所示(CDR以粗体显示)：
>LYV378_VH-1(移植的LYV378_VH,SEQ ID NO:22)
>LYV378_VL-1(移植的LYV378_VL；SEQ ID NO:23)
构建人源化LYV378抗体的重组完全人IgG/κ。人源化LYV378抗体包括：
-TM559(包括LYV378_VH-1/IgG2的重链和LYV378_VL-1/κ的轻链)，
-LP3781(包括LYV378_VH-1/IgG1的重链和LYV378_VL-1/κ的轻链)，
-LP3782(包括LYV378_VH-1/IgG4的重链和LYV378_VL-1/κ的轻链)，和
-LP3783(包括LYV378_VH-1/IgG1mut的重链和LYV378_VL-1/κ的轻链)。
上述嵌合抗体TM378(IgG4)和源自LYV378的抗CD40人源化抗体的重链和轻链的氨基酸序列提供如下：
·TM378
重链(SEQ ID NO:92):
EVHLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFTNYGLHWIRQAPTKGLEWVASISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNGKTTLHLQMDSLRSEDTATYYCALPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
轻链(SEQ ID NO:93):
DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEDISNDLAWYQQKSGKSPQLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTRHSLKISGMQPEDEADYFCQQSYKYPPTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·TM559重链((SEQ ID NO:94):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·LP3781重链(SEQ ID NO:95):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
·LP3782重链(SEQ ID NO:96):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
·LP3783重链(SEQ ID NO:97):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
人源化抗CD40抗体TM559、LP3781、LP3782和LP3783共享以下共同轻链：
共同轻链(SEQ ID NO:98):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
以下提供了抗CD40 Ly253抗体的重链和轻链的氨基酸序列(CDR以粗体显示)：
·Ly253-G4重链(SEQ ID NO:99):
·Ly253-G2重链(SEQ ID NO:100):
Ly253-G4和Ly253-G2共享以下共同轻链(SEQ ID NO:101)：
这些人源化抗体与嵌合抗体TM378(人IgG4)一起在HEK293细胞或CHO细胞中表达，并通过蛋白A亲和层析从细胞培养物中纯化用于进一步分析。检查纯化抗体的内毒素(<5EU/mg)和单体化(>95％)。
实施例2：抗CD40抗体的评价
CD40结合FACS
进行FACS分析以评价示例性抗CD40抗体的结合特性。简言之，使用胰蛋白酶-EDTA部分消化，随后在1000g下离心3分钟，收获过表达人CD40的CHO细胞。将细胞以2x106/mL重悬于冷PBS-BSA(2％)中并且等分为100μL/管。将抗CD40抗体在PBS-BSA中稀释(最终浓度为0.01、0.1、1和10μg/mL)，并将各50μL添加到CHO-CD40细胞中。将细胞溶液混合并且在4℃下在黑暗中温育2小时。然后将细胞用PBS-BSA洗涤两次。以1/500稀释度和100μL/孔添加二抗缀合物(山羊F(ab')2抗人IgG-Fc(PE)，预吸附型(Abcam#ab98596)并且将细胞混合并在4℃下在黑暗中温育1小时。然后将细胞用PBS-BSA洗涤两次，随后在2％PFA/PBS中固定，并且然后进行FACS分析。
如图1A所示，与嵌合亲本TM377相比，CDR移植的377人源化抗体TM550显示出降低的结合活性，并且具有回复突变的人源化抗体(具有VH-2链的TM553)显示出于TM377亲本相当的细胞CD40结合。具有去除潜在N-糖基化位点的突变的人源化抗体TM738、TM739、TM740和Ly181显示出与TM553相当的CD40结合活性(图1C和图1D)。人源化IgG抗体LP3771(人IgG1)、LP3772(人IgG4)和LP3773(人IgG1突变体)显示出与TM553(人IgG2)相似的CD40结合活性(图1E和图1F)。
源自LYV378的TM559人源化抗体表现出与其嵌合对应物TM378相似的细胞CD40结合活性(图1A和图1B)。此外，源自LYV378的人源化IgG抗体，包括LP3781(人IgG1)、LP3782(人IgG4)和LP3783(人IgG1突变体)，显示出与TM559(人IgG2)相似的CD40结合活性(图1B和图1E)。
另外的CD40抗体Ly253-G4、Ly253-G2显示出与TM377相似的CD40结合活性(图1F)。
CD40报告基因测定
为了确定这些抗CD40抗体的激动剂活性，开发了CD40报告基因测定，其涉及过表达人CD40的报告细胞。用测定缓冲液(含1％FBS的MEM)将该GS-H2-huCD40报告细胞重悬并稀释至1x 104个细胞/mL。以100μL/孔添加细胞，使得在测定板(Nunc，货号167425)中最终细胞数量为1000个细胞/孔。以100uL/孔检测样品以2x最终浓度向测定板添加样品。将测定板在37℃、5％CO2温育箱中温育18-20小时。温育18-20小时之后，从测定板的每个孔中收集8μl上清液并且将其添加到HTRF检测测定板(Nunc)中。使用人IL-8测定试剂盒(Cisbio，货号62IL8PEB)进行人白介素8(CD40激活的报告基因)检测测定。具体地，使用16μL的测定体积。使用Tecan F200pro的时间分辨荧光读取结果，并且记录相对光单位数据。
如图2A-2D所示，抗CD40抗体以不同程度刺激人CD40激活，如报告基因测定中IL-8的分泌水平所证明。嵌合TM377和源自LYV377的人源化抗体，包括TM550、TM553、TM738、TM739、TM740、Ly181、LP3771、LP3772和LP3773，无论这些人源化抗体中使用的IgG同种型如何，均显示出刺激CD40报告基因的弱活性。源自LYV378的人源化抗体TM559(IgG2)表现出高CD40激动剂活性。源自LYV378的嵌合TM378和人源化抗体，包括TM3781和TM3783(均为IgG1)和TM3782(IgG4)显示低CD40激动剂活性。抗体Ly253-G2和Ly253-G4显示出CD40激动剂活性。
这三个系列的抗CD40抗体显示出不同水平的CD40激动剂活性，尽管它们显示出与CD40相似的结合活性。可能由于每种抗体同种型结构的铰链柔性，CD40激活的量级进一步受其中所含有的Fc变体的影响。
抗肿瘤活性
在体内小鼠同系肿瘤模型中检测示例性抗CD40抗体以确定这些抗体的抗肿瘤疗效和毒性。将鼠结肠癌MC38肿瘤细胞皮下植入到纯合子人CD40敲入C57BL6小鼠中。当肿瘤大小为约150±50mm3(n＝6)时，将小鼠分组。通过腹腔注射施用抗CD40抗体，并且在4-6周的抗体处理期间测量肿瘤大小。使用0.5×长×宽2的公式将肿瘤大小计算为肿瘤体积。
在对照组和抗体处理组的肿瘤大小之间评价抗肿瘤疗效，如图3所示。示例性克隆TM740和LP3783显示出相对于Ly253-G2具有较低疗效，但与阴性对照相比仍然具有显著的抗肿瘤活性。此外，与Ly253-G2相比，LP3773、TM739、TM740和LP3783未引起血清ALT的明显升高(图4A和4B)。
实施例3：CD40和PD-L1双特异性抗体
抗PD-L1抗体的构建
使用标准鼠杂交瘤技术产生抗人PD-L1抗体。开发示例性抗PD-L1抗体LYV5574(杂交瘤30H8)。分析抗体LYV5574的氨基酸序列，并按照Kabat CDR定义识别CDR。以下提供了LYV5574的VH和VL序列，其中CDR区以粗体标识：
>LYV5574_VH((SEQ ID NO:102)
>LYV5574_VL(SEQ ID NO:103)
LYV5574按照上述实施例1中的描述进行人源化。种系IGKV1-27*01基因和IGHV1-46*01基因分别被识别为重链和轻链受体框架。然后人受体被识别为>AAB48616.1 Igκ链V区和AAC18181.1免疫球蛋白重链可变区。
将亲本LYV5574抗体的CDR移植到上述人VH和VL受体序列的相应CDR区，生成人源化LYV5574_VH-1和LYV5574_VL-1链(移植的人源化抗体)，其各自的氨基酸序列提供如下(CDR以粗体显示)：
>LYV5574_VL-1(移植的LYV5574_VL；SEQ ID NO:31)
>LYV5574_VH-1(移植的LYV5574_VH；SEQ ID NO:30)
进行LYV5574 Fv片段的同源性建模。针对PDB抗体数据库对LYV5574的VH和VL序列进行BLAST搜索，以识别Fv片段的最佳模板，特别是用于构建结构域界面。选择结构模板1JV5(抗血型A Fv)，同一性＝59％。LYV5574抗体与1JV5模板之间的氨基酸序列比对如下所示，其中│是链断裂且*表示两个序列中相同的氨基酸残基。
LYV5574
DIQMTQAPSLLSASVGDRVTLNCKASQNVYKKLEWYQQKHGEAPKVVIHHTNILQTGISS
1JV5
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSRLHSGVPS
LYV5574
RFSGSGSGTDYTLTISSLQSEDVATYYCYQWNSGP-TFGAGTKLELKR│QVKLLQSGAALV
1JV5
RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK-│QVQLQQPGAELV
LYV5574
KPGASVKMSCKTSGYTFTDFWMSWVKQSHGKSLEWVGQIYPNTGTTHSNEKFKGKATLTV
1JV5
KPGTSVKLSCKASGYNFTSYWINWVKLRPGQGLEWIGDIYPGSGITNYNEKFKSKATLTV
LYV5574
DKSTSTAYLELSRLTSEDSAIYYCSRSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:102)
1JV5 DTSSSTAYMQLSSLASEDSALYYCAGQYG----NLWFAYWGQGTLVTVS-(SEQID NO:104)
同源模型使用定制的构建同源模型方案构建。二硫键被指定和连接。使用DOPE方法优化循环。基于1JV5的同源模型，分析LYV5574的序列抗体。识别被认为对于结合活性重要的框架区(FR)残基，即规范FR残基，以及抗体的VH-VL界面残基。我们进一步分析了内核中的框架残基，并识别了LYV5574_VL-1(移植的LYV5574_VL)的四个残基用于回复突变，其中包括L42(具有侧链大小的掩蔽残基)和F71(掩蔽规范残基)。人源化变体LYV371_VL-2(序列如下所示)被设计为将这些残基改变回LYV5574抗体对应物(L42V和F71Y；下划线和粗体显示)，以测试这些残基是否需要保持最佳活性。
>LYV5574_VL-2(SEQ ID NO:32)
使用人IgG1和人κ轻链恒定区构建人源化LYV5574抗体的重组完整人IgG1/κ。人源化抗体Ly075包含CDR移植的VH-1和VL-1链，没有回复突变，并且抗体Ly076包括VH-1和VL-2，其中包含两个回复突变L42V和F71Y。抗体Ly075和Ly076以及嵌合对应物Ly074构建为人IgG1/κ(序列如下所示)分子，在HEK293细胞或CHO细胞中表达和纯化。抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。检查纯化抗体的内毒素(<5EU/mg)和单体化(>95％)。
·Ly074
重链(SEQ ID NO:105):
QVKLLQSGAALVKPGASVKMSCKTSGYTFTDFWMSWVKQSHGKSLEWVGQIYPNTGTTHSNEKFKGKATLTVDKSTSTAYLELSRLTSEDSAIYYCSRSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链(SEQ ID NO:106):
DIQMTQAPSLLSASVGDRVTLNCKASQNVYKKLEWYQQKHGEAPKVVIHHTNILQTGISSRFSGSGSGTDYTLTISSLQSEDVATYYCYQWNSGPTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·Ly075轻链(SEQ ID NO:107):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYKKLEWYQQKPGKVPKLLIYHTNILQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCYQWNSGPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·Ly076轻链(SEQ ID NO:108):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYKKLEWYQQKPGKVPKVLIYHTNILQTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQWNSGPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ly075和Ly076共享以下共同IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:109)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFWMSWVRQAPGQGLEWMGQIYPNTGTTHSNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗PD-L1抗体的表征
(i)与细胞表面PD-L1的结合活性
通过FACS分析本文公开的抗PD-L1抗体与在CHO细胞上表达的人PD-L1的结合特性。简言之，收获、计数培养的细胞并使用台盼蓝拒染法评价细胞活力。然后在含2％BSA的PBS中将活细胞调整为每mL 2x 106个细胞。每孔将100μL这种细胞悬液进一步等分到V型底96孔板中。将50μL抗体或IgG对照添加到含有细胞的孔中，以获得0.1μg/mL至10μg/mL的最终浓度。在4℃下温育2小时后，将细胞离心(3分钟，1000x g)，用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤，重悬并在4℃下用100μL/孔再温育1小时荧光染料缀合的抗IgG抗体用于检测抗体。然后用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤细胞，重悬于100μL/孔FACS染色缓冲液中，使用FACS机器采集和分析。
评价抗体与表达人PD-L1的CHO细胞的结合，并将平均荧光强度绘制在直方图或点图中，如图5所示。两种人源化形式的抗PD-L1抗体均显示出与细胞表面PD-L1相似的结合活性。
(ii)PD-1/PD-L1相互作用阻断
为了确定抗体阻断PD-L1/PD-1细胞功能的能力，使用报告基因测定系统。该测定由两种基因工程细胞系组成：Raji-PD-L1细胞是表达人PD-L1的Raji细胞。Jurkat/NFκB-Luci/PD-1细胞是表达人PD-1和由NFkB反应元件驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞。简言之，收获Raji-PD-L1细胞并调整至2x 10^6个细胞/mL，进一步以25μL/孔等分到96孔板中。然后将4μg/mL的25μL/孔抗CD3抗体添加到96孔板中，以25μL/孔加入4X终浓度的检测抗体。将板在37℃下温育20min。收获过表达Jurkat/NFκB-Luci的人PD-1并调整至1.5x 106个细胞/mL，将25μL Jurkat细胞悬液分配到含有Raji细胞、抗CD3抗体和检测抗体的孔中。将板在37℃下再温育6小时，然后使用来自Promega#E2620的试剂盒进行Bright-GloTM荧光素酶测定。添加阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗PD-1或抗PD-L1抗体释放抑制信号并导致NFκB介导的发光。
如图6所示，抗PD-L1抗体的两种人源化形式显示出有效且相似的阻断活性。
(iii)抗肿瘤活性
在体内小鼠同系肿瘤模型中进一步检查两种人源化抗PD-L1抗体，以确定它们的抗肿瘤疗效。在第0天将过表达人PD-L1的鼠结肠癌MC38细胞皮下植入到纯合子人PD-L1敲入C57BL/6小鼠中。当肿瘤大小为约150±50mm3(n＝6)时，将小鼠分组。通过腹腔注射施用抗PD-L1抗体，并且在4-6周的抗体处理期间测量肿瘤大小。使用0.5×长×宽2的公式将肿瘤大小计算为肿瘤体积。在对照组和抗体处理组的肿瘤大小之间评价抗肿瘤疗效。
如图7所示，与溶媒对照相比，两种抗PD-L1抗体Ly075和Ly076均显示出强抗肿瘤活性，然而，Ly076在6只小鼠中的3只中诱导肿瘤完全消退。
抗PD-L1/CD40双特异性抗体的制备
使用本文公开的示例性人或人源化抗CD40和抗PD-L1抗体设计抗PD-L1/CD40双特异性抗体。编码抗PD-L1抗体Ly076的VH和VL链以及抗CD40抗体TM740、TM559和Ly253的VH和VL链的cDNA用作起始材料。用编码对应的重链序列和轻链序列的质粒进行CHO瞬时表达。这些抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。以下提供了双特异性抗体的重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列：
·Ly301:
第一多肽(从N→C末端，Ly076的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:110):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFWMSWVRQAPGQGLEWMGQIYPNTGTTHSNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
第二多肽：Ly076的轻链(SEQ ID NO:108)。
·Ly338
第一多肽(从N→C末端，Ly076的重链，具有IgG1突变的Fc区Fc结构域和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:111):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFWMSWVRQAPGQGLEWMGQIYPNTGTTHSNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly076轻链(SEQ ID NO:108)
·Ly349
第一多肽：具有IgG1突变Fc的Ly076重链(SEQ ID NO:112)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFWMSWVRQAPGQGLEWMGQIYPNTGTTHSNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
第二多肽(从N→C末端，Ly076的轻链和TM740的scFv，以VL→VH方向，SEQ ID NO:113):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYKKLEWYQQKPGKVPKVLIYHTNILQTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQWNSGPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
·Ly339
第一多肽：Ly349的重链(SEQ ID NO:112)
第二多肽(从N→C末端，Ly076的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向，SEQ ID NO:114)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYKKLEWYQQKPGKVPKVLIYHTNILQTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQWNSGPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
·Ly303
第一多肽(从N→C末端，Ly076的重链，具有IgG1突变的Fc结构域和TM559的scFv，以VL→VH方向，SEQ ID NO:115)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFWMSWVRQAPGQGLEWMGQIYPNTGTTHSNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSS
第二多肽：Ly076的轻链(SEQ ID NO:108)
·Ly340
第一多肽(从N→C末端，Ly076的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VH→VL方向，SEQ ID NO:116)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFWMSWVRQAPGQGLEWMGQIYPNTGTTHSNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
第二多肽：Ly076轻链(SEQ ID NO:108)
·Ly341
第一多肽：Ly349的重链(SEQ ID NO:112)
第二多肽(从N→C末端，Ly075的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向，SEQ ID NO:118)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYKKLEWYQQKPGKVPKVLIYHTNILQTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQWNSGPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
·Ly350
第一多肽：Ly349的重链(SEQ ID NO:112)
第二多肽(从N→C末端，Ly076的轻链和TM559的scFv，以VL→VH的方向，SEQ IDNO:117)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYKKLEWYQQKPGKVPKVLIYHTNILQTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQWNSGPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSS
·Ly342
第一多肽(从N→C末端，Ly076的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向，SEQ ID NO:119)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFWMSWVRQAPGQGLEWMGQIYPNTGTTHSNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
第二多肽：Ly076的轻链(SEQ ID NO:108)
·Ly343
第一多肽：Ly349的重链(SEQ ID NO:112)
第二多肽(从N→C末端，Ly076的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH的方向，(SEQ IDNO:121)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYKKLEWYQQKPGKVPKVLIYHTNILQTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQWNSGPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
·Ly344
第一多肽(从N→C末端，Ly076的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VH→VL方向，SEQ ID NO:120)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFWMSWVRQAPGQGLEWMGQIYPNTGTTHSNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYHISTTPNWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly076的轻链(SEQ ID NO:108)
·Ly345
第一多肽：Ly349的重链(SEQ ID NO:112)
第二多肽(从N→C末端，Ly076的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:122)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYKKLEWYQQKPGKVPKVLIYHTNILQTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQWNSGPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
在一些实施方案中，本文公开的抗PD-L1/抗CD40双特异性抗体包括第一多肽，其是包括scFv形式的抗CD40部分和抗PD-L1部分的重链的融合多肽。在一些实例中，抗CD40scFv可以以VH→VL方向。可选地，抗CD40 scFv可以以VL→VH方向。在一些实例中，抗PD-L1部分的重链可以位于第一多肽的N-末端。在其他情况下，抗CD40 scFv部分可以位于第一多肽的N-末端。发现这种形式的抗PD-L1/抗CD40双特异性抗体(例如，Ly338、Ly303、Ly340和Ly342)表现出出乎意料的优越特征，例如，如本文所示，无明显肝毒性的优异抗肿瘤活性，例如，以下提供的数据。
抗PD-L1/CD40双特异性抗体的表征
(i)结合活性
通过FACS分析抗PD-L1/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人PD-L1和/或人CD40的结合特性。简言之，收获、计数培养的细胞并使用台盼蓝拒染法评价细胞活力。然后在含2％BSA的PBS中将活细胞调整为每mL 2x 106个细胞。每孔将100μL这种细胞悬液进一步等分到V型底96孔板中。将50μL双特异性抗体或相应的IgG对照添加到含有细胞的孔中，以获得0.1μg/mL至10μg/mL的最终浓度。在4℃下温育2小时后，将细胞离心(3分钟，1000xg)，用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤，重悬并在4℃下用100μL/孔再温育1小时荧光染料缀合的抗IgG抗体用于检测双特异性抗体。然后用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤细胞，重悬于100μL/孔FACS染色缓冲液中，使用FACS机器采集和分析。评价双特异性抗体与表达人PD-L1或人CD40的CHO细胞的结合，并将平均荧光强度绘制在直方图或点图中。
如图8A和8B中所示，示例性抗PD-L1/CD40双特异性抗体表现出与在过表达例如Ly076的CHO细胞上表达的人PD-L1相似的结合亲和力。如图9A和9B所示，双特异性抗体表现出对在CHO细胞上表达的人CD40的结合亲和力。与相应的亲本抗体相比，包括CD40抗体的scFv形式的双特异性抗体的结合活性保持最小的变化。
通过ELISA分析示例性抗PD-L1/CD40双特异性抗体与重组人PD-L1和人CD40的同时结合。简言之，将Ly090(带有His标签的人CD40 ECD蛋白)稀释，并通过在4℃下温育过夜将其以100μL/孔的体积包被在ELISA板上。第二天，用PBST-BSA缓冲液封闭板，然后将连续稀释的抗PD-L1/CD40双特异性抗体样品以50μL/孔移液到适当的孔中，然后将板温育1h，随后洗涤。将人PD-L1 ECD蛋白(小鼠IgG2a Fc标签)以50μL/孔添加到板中。在室温下温育1小时后，将HRP缀合的抗小鼠IgG，Fc G2a抗体以100μL/孔加入板中。将板在室温下温育1小时，然后洗涤。以100μL/孔添加TMB底物溶液，并通过添加100uL/孔终止溶液(2N H2SO4)来终止显色。通过Tecan F200 Pro读板器读取450nm和620nm处的吸光度。使用Graphpad 7.0，“[激动剂]vs.响应-可变斜率(四个参数)”绘制结合数据并计算结合EC50值。
如图10A-10L所示，示例性抗PD-L1/CD40双特异性抗体同时结合重组人CD40和人PD-L1。
(ii)CD40的激动活性
按照上述实施例2中公开的相同程序，本文公开的CD40报告基因测定用于确定双特异性抗体的激动剂活性。在与表达PD-L1的CHO细胞共培养中还进行CD40报告基因测定。
如图11A-11D所示，溶液中的双特异性抗体显示出不同程度的CD40激动剂活性。在共培养测定中，激动剂活性大大增强，如剂量效应饱和所示，其中0.01μg/mL双特异性抗体的最低浓度表现出最大活性。在微环境中检测的双特异性抗体分子与CD40和PD-L1同时结合将由于亲合力效应而影响个体结合，该亲合力效应是指个体非共价结合相互作用的多个亲和力的累积强度。当与表达PD-L1的CHO细胞共培养时，双特异性抗体显示出增加的活性。因此，与人PD-L1和CD40的结合特征将影响这些双特异性抗体的激动剂活性。
(iii)PD-1/PD-L1相互作用阻断
本文公开的PD-1报告基因测定用于确定双特异性抗体阻断PD-L1/PD-1细胞功能的能力，按照上述“抗PD-L1抗体表征”部分中公开的相同程序“。抗PD-L1抗体Ly076用作参考。
如图12A和12B所示，示例性双特异性抗体显示出有效且相似的阻断活性。
(iv)免疫细胞激活
进行免疫细胞测定以显示双特异性抗体的功能。简言之，用SEB激活正常健康人PBMC(来自两个供体1和2)并在6孔板中检测抗体持续5天。
为了评价CD40激动剂活性和由此导致的IL-2产生，将100μL培养基中的2x105PBMC添加SEB(最终浓度为0.01μg/mL)和在100μL培养基中连续稀释的抗体样品添加到板中并在37℃，含5％CO2下温育持续5天。按照说明手册，使用人IL-2检测试剂盒(Cisbio，货号62HIL02PEH)刺激5天后收集细胞培养上清液用于细胞因子检测。图13A和13B显示与抗PD-L1(Ly076)或抗CD40(Ly181、Ly253-G2)mAb克隆相比，示例性双特异性抗体诱导人PBMC产生更强的IL-2。因此，与它们的亲本mAb相比，如本文所例示的双特异性抗体在微环境中同时结合CD40和PD-L1将增强PBMC刺激活性。
(v)B细胞增殖
评价抗PD-L1/CD40双特异性抗体刺激人B细胞增殖的活性。简言之，使用来自Stemcell的B细胞富集试剂盒从人PBMC中分离人B细胞，然后重悬于RPMI1640/10％FBS培养基中，并进一步将每孔100μL等分到96孔细胞培养板中。将100μL双特异性抗体或相应的IgG对照添加到含有细胞的孔中，以获得0.1μg/mL至10μg/mL的最终浓度。在37℃ 5％CO2培养箱中培养3天后，通过来自Promega的CellTiter-Glo试剂盒，#G7582测定B细胞增殖。
如图14A-14B所示，这些示例性双特异性抗体在B细胞增殖方面表现出不同的特征。值得注意的是，双特异性抗体Ly303、Ly340、Ly341和Ly350对B细胞增殖没有刺激作用。
(vi)树突细胞激活
如上文所述，在体外检测抗PD-L1/CD40抗体的CD40结合活性和激动活性。其在激活人树突细胞中的活性如下进行。
将来自健康供体的冷冻人PBMC(Allcells，货号PB005F)解冻并用于单核细胞分离(EasySepTM人CD14阳性选择试剂盒II Stemcell，货号：17858)GM-CSF和IL-4按照标准过程诱导CD14+单核细胞分化成树突细胞。
为了进行DC激活测定，将细胞密度调整为1x 106/mL。将0.05mL细胞悬液加入96孔板中，5x 104个细胞/孔。将系列稀释的抗体样品添加到板中，并在37℃和5％CO2下温育24小时。24小时后，收集细胞培养上清液用于细胞培养上清液中的huIL-8检测试剂盒(Cisbio，货号62HIL08PEH)进行细胞因子检测。还在与表达PD-L1的CHO细胞共培养的情况下进行DC激活测定。
如图15A-15D所示，检测的抗PD-L1/CD40抗体在不同程度上刺激DC激活，如抗体温育后从DC培养物分泌IL8所证明。与溶液中抗体的测定(图15A和15C)相比，在与两个供体的共培养测定(图15B和15D)中DC激活的量级增加。在微环境中抗体分子与CD40和PD-L1同时结合将影响个体结合，这是由于亲合力效应导致抗体的CD40激动作用的改变。结果表明，与抗CD40 mAb相比，双特异性抗体显示出高得多的DC激活活性。
(vii)抗PD-L1/CD40双特异性抗体的药代动力学研究
将C57BL/6小鼠(6-7周龄，19-20g，雄性，购自SLAC Laboratory Animal Co.LTD)用于研究。在PBS中配制抗体，并以4只小鼠为一组中通过尾静脉注射以3mg/kg施用。
通过连续取血在给药前、1d、4d、7d、10d、14d、17d和21d进行血液取样。每个时间点将10μL血液添加到40uL的PBS-BSA溶液中。然后将样品充分混合并在4℃下以2000g离心5分钟。收集后立即将上清液置于干冰上，并在约-70℃下储存直至分析。通过ELISA测定血液抗体浓度。图16A-16C显示了单次静脉内注射3mg/kg后双特异性抗体的血液浓度。这些双特异性抗体显示出高且持久的循环浓度。
(viii)抗肿瘤活性
在体内小鼠同系肿瘤模型中检测示例性抗PD-L1/CD40抗体以确定这些抗体的抗肿瘤疗效和毒性。将过表达人PD-L1的鼠结肠癌MC38肿瘤细胞皮下植入到纯合子人CD40敲入C57BL6小鼠中。当肿瘤大小为约150±50mm3(n＝6)时，将小鼠分组。通过腹腔注射施用抗PD-L1/CD40抗体，并且在4-6周的抗体处理期间测量肿瘤大小。使用0.5×长×宽2的公式将肿瘤大小计算为肿瘤体积。
在对照组和抗体处理组的肿瘤大小之间评价抗肿瘤疗效，如17A-17C所示。抗体Ly253-G2在诱导血清ALT升高的同时显示出抗肿瘤疗效。几种双特异性抗体(包括Ly338、Ly303、Ly340、Ly341、Ly342和Ly343)显示出与Ly253-G2相当或更强的疗效。此外，Ly338、Ly303、Ly340和Ly342未引起血清ALT的明显升高(图18)。
实施例4：抗B7H4/CD40双特异性抗体
制备抗B7H4抗体
使用标准鼠杂交瘤技术产生抗人B7H4抗体。分析示例性抗B7H4抗体Ly361(杂交瘤14D3)和Ly366(杂交瘤25F3)的氨基酸序列，并按照Kabat CDR定义识别它们的CDR。以下提供了Ly361和Ly366的VH和VL序列，其中CDR区以粗体突出显示。制备包括人IgG1恒定区的嵌合抗体，并证实其显示出与B7H4的高亲和力结合。
>Ly361_VH(SEQ ID NO:45)
>Ly361_VL(SEQ ID NO:46)
>Ly366_VH(SEQ ID NO:47)
>Ly366_VL(SEQ ID NO:48)
·Ly361(嵌合体)
重链(SEQ ID NO:123):
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVAAISTGGSYTYYPDSVKGRFTISRDTATNTLYLQMSTLKSEDTAMYYCTRRGATGSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链(SEQ ID NO:124):
DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQGINNNIGWLQRKPGKSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYVQFPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·Ly366(嵌合体)
重链(SEQ ID NO:125):
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDSGMHWVRQAPEKGLEWITYINSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGRGYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链(SEQ ID NO:126)
EIVLTQSPTTMAASPGEKITIFCSASSSISSDFLHWYQQKPGFSPKLLIYRISNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSNVPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
制备抗B7H4/CD40双特异性抗体
抗B7H4/CD40双特异性抗体是针对以上举例说明的人或人源化抗CD40抗体产生的。编码抗B7H4抗体的VH和VL链以及抗CD40抗体的VH和VL链的cDNA用作起始材料。使用配置用于表达相应重链和轻链序列的质粒进行CHO瞬时表达。这些抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。以下提供了双特异性抗体多肽的氨基酸序列：
·Ly474
第一多肽(从N→C末端，Ly361的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:127)
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVAAISTGGSYTYYPDSVKGRFTISRDTATNTLYLQMSTLKSEDTAMYYCTRRGATGSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
第二多肽：Ly361的轻链(SEQ ID NO:124)
·Ly475
第一多肽(从N→C末端，Ly361的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:128)
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVAAISTGGSYTYYPDSVKGRFTISRDTATNTLYLQMSTLKSEDTAMYYCTRRGATGSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly361的轻链(SEQ ID NO:124)
·Ly476
第一多肽：Ly361的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:129)：
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVAAISTGGSYTYYPDSVKGRFTISRDTATNTLYLQMSTLKSEDTAMYYCTRRGATGSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
第二多肽(从N→C末端，Ly361的轻链和TM740的scFv，以VL-VH方向；SEQ ID NO:130)
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·Ly477
第一多肽：Ly476的重链(SEQ ID NO:129)
第二多肽(从N→C末端，Ly361的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:131)
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·Ly478
第一多肽((从N→C末端，Ly361的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM599的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:132)
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第二多肽：Ly361的轻链(SEQ ID NO:124)
·Ly479
第一多肽((从N→C末端、Ly361的重链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:133)
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第二多肽：Ly361的轻链(SEQ ID NO:124)
·Ly480
第一多肽：Ly476的重链(SEQ ID NO:129)
第二多肽((从N→C末端、Ly361的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:134)
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·Ly481
第一多肽：Ly476的重链(SEQ ID NO:129)
第二多肽((从N→C末端、Ly361的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:135)
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·Ly482
第一多肽(从N→C末端，Ly361的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:136)
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第二多肽：Ly361的轻链(SEQ ID NO:124)
·Ly483
第一多肽(从N→C末端，Ly361的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:137)
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第二多肽：Ly361的轻链(SEQ ID NO:124)
·Ly484
第一多肽：Ly476的重链(SEQ ID NO:129)
第二多肽(从N→C末端，Ly361的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:138)
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·Ly485
第一多肽：Ly476的重链(SEQ ID NO:129)
第二多肽(从N→C末端，Ly361的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:139)
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·Ly486
第一多肽(从N→C末端，Ly366的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:140)
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第二多肽：Ly366的轻链(SEQ ID NO:126)
·Ly487
第一多肽(从N→C末端，Ly366的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:141)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDSGMHWVRQAPEKGLEWITYINSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGRGYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly366的轻链(SEQ ID NO:126)
·Ly488
第一多肽：Ly366的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:142)：
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第二多肽(从N→C末端，Ly366的轻链和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:143)
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·Ly489
第一多肽：Ly488的重链(SEQ ID NO:142)
第二多肽(从N→C末端，Ly366的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:144)
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·Ly490
第一多肽(从N→C末端，Ly366的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:145)
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第二多肽：Ly366的轻链(SEQ ID NO:126)
·Ly491
第一多肽(从N→C末端，Ly366的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:146)
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第二多肽：Ly366的轻链(SEQ ID NO:126)
·Ly492
第一多肽：Ly488的重链(SEQ ID NO:142)
第二多肽(从N→C末端，Ly366的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:147)
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·Ly493
第一多肽：Ly488的重链(SEQ ID NO:142)
第二多肽(从N→C末端，Ly366的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:148)
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·Ly494
第一多肽(从N→C末端，Ly366的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:149)
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第二多肽：Ly366的轻链(SEQ ID NO:126)
·Ly495
第一多肽(从N→C末端，Ly366的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:150)
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第二多肽：Ly366的轻链(SEQ ID NO:126)
·Ly496
第一多肽：Ly488的重链(SEQ ID NO:142)
第二多肽(从N→C末端，Ly366的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:151)
EIVLTQSPTTMAASPGEKITIFCSASSSISSDFLHWYQQKPGFSPKLLIYRISNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSNVPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
·Ly497
第一多肽：Ly488的重链(SEQ ID NO:142)
第二多肽(从N→C末端，Ly366的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:152)
EIVLTQSPTTMAASPGEKITIFCSASSSISSDFLHWYQQKPGFSPKLLIYRISNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSNVPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
抗B7H4/CD40双特异性抗体的表征
(i)结合活性
通过FACS分析抗B7H4/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人B7H4或人CD40的结合特性。简言之，收获、计数培养的细胞并使用台盼蓝拒染法评价细胞活力。然后在含2％BSA的PBS中将活细胞调整为每mL 2x 106个细胞。每孔将100μL这种细胞悬液进一步等分到V型底96孔板中。将50μL双特异性抗体或相应的IgG对照添加到含有细胞的孔中，以获得0.1μg/mL至10μg/mL的最终浓度。在4℃下温育2小时后，将细胞离心(3分钟，1000x g)，用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤，重悬并在4℃下用100μL/孔再温育1小时荧光染料缀合的抗IgG抗体用于检测双特异性抗体。然后用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤细胞，重悬于100μL/孔FACS染色缓冲液中，使用FACS机器采集和分析。评价双特异性抗体与表达人B7H4或人CD40的CHO细胞的结合，并将平均荧光强度绘制在直方图或点图中。
如图19A-19D所示，示例性抗B7H4/CD40双特异性抗体与亲本抗体Ly361和Ly366表现出与在CHO细胞上表达的人B7H4相似的结合亲和力。如图20A-20D所示，这些抗体也表现出对在CHO细胞上表达的人CD40的结合亲和力。与相应的亲本抗体相比，包括CD40抗体的scFv形式的双特异性抗体的结合活性保持最小的变化。
通过ELISA分析抗B7H4/CD40双特异性抗体与重组人B7H4和人CD40的同时结合。简言之，将人B7H4蛋白稀释，并通过在4℃下温育过夜将其以100/孔的体积包被ELISA板上。第二天，用PBST-BSA缓冲液封闭板，然后将连续稀释的抗B7H4/CD40双特异性抗体样品以50μL/孔移液到适当的孔中，然后将板温育1h，随后洗涤。将人CD40 ECD蛋白(小鼠IgG2a Fc标签)以50μL/孔添加到板中。在室温下温育1小时后，将HRP缀合的抗小鼠IgG(H+L)抗体以100μL/孔加入板中。将板在室温下温育1小时，然后洗涤。以100μL/孔添加TMB底物溶液，并通过添加100uL/孔终止溶液(2N H2SO4)来终止显色。通过Tecan F200 Pro读板器读取450nm和620nm处的吸光度。使用Graphpad 7.0，“[激动剂]vs.响应-可变斜率(四个参数)”绘制结合数据并计算结合EC50值。
如图21A-21I所示，示例性抗B7H4/CD40双特异性抗体同时结合重组人B7H4和人重组CD40。
(ii)CD40的激动活性
按照上述实施例2中公开的相同程序，本文公开的CD40报告基因测定用于确定双特异性抗体的激动剂活性。在与表达B7H4的CHO细胞共培养中还进行CD40报告基因测定。
如图22A-22L所示，当在溶液中检测时，双特异性抗体显示出一系列激动剂活性。与表达B7H4的细胞共培养增强大多数双特异性抗体中的CD40激动剂活性。在微环境中所测试的抗体分子与CD40和B7H4同时结合将由于亲合力效应而影响个体结合，所述亲合力效应是指个体非共价结合相互作用的多个亲和力的累积强度。当与表达B7-H4的CHO细胞共培养时，抗体显示出增加的活性。因此，与人B7H4和CD40的结合特征将影响这些双特异性抗体的激动剂活性。
(iii)B细胞增殖
按照以上实施例3中公开的程序，评价抗B7H4/CD40双特异性抗体刺激人B细胞增殖的活性。如图23A-23D所示，这些双特异性抗体对B细胞增殖表现出明显的作用，其中大多数在刺激B细胞增殖方面表现出最小活性。
(iv)树突细胞激活
如上文实施例中所述，在体外检测抗B7H4/CD40抗体的CD40结合活性和激动活性。其在激活人树突细胞中的活性如以上实施例3所述进行。还在与表达B7H4的CHO细胞共培养的情况下进行DC激活测定。
如图24A-24H所示，检测的示例性抗B7H4/CD40抗体在不同程度上刺激DC激活，如抗体温育后从DC培养物中分泌IL8所证明。DC激活的幅度增加，可能是由于双特异性抗体分子在微环境中同时结合CD40和B7H4，这将影响个体结合，因为亲和力效应导致抗体的CD40激动作用改变。
(v)抗B7H4/CD40双特异性抗体的药代动力学研究
将C57BL/6小鼠(6-7周龄，19-20g，雌性，购自SLAC Laboratory Animal Co.LTD)用于研究。在PBS中配制抗体，并以4只小鼠为一组中通过尾静脉注射以5mg/kg施用。
通过连续取血在给药前、1d、4d、7d、10d、14d、17d和21d进行血液取样。每个时间点将10μL血液添加到40uL的PBS-BSA溶液中。然后将样品充分混合并在4℃下以2000g离心5分钟。收集后立即将上清液置于干冰上，并在约-70℃下储存直至分析。通过ELISA测定血液抗体浓度。图25A-25I显示了单次静脉内注射3mg/kg后双特异性抗体的血液浓度。这些双特异性抗体显示出高且持久的循环浓度。
实施例5：抗CEA/CD40双特异性抗体
抗CEA/CD40双特异性抗体是针对以上举例说明的人或人源化抗CD40抗体产生的。编码抗CEA抗体的VH和VL链以及抗CD40抗体的VH和VL链的cDNA用作起始材料。CHO细胞瞬时表达使用被配置用于表达双特异性抗体链的质粒进行。这些抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。
以下提供了抗CEA抗体(Ly311和Ly312)的重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列以及双特异性抗体的多肽组分的氨基酸序列：
·Ly311
重链(SEQ ID NO:153):
轻链(SEQ ID NO:154)
·Ly312
重链(SEQ ID NO:155):
轻链(SEQ ID NO:156):
·Ly401
第一多肽(从N→C末端，Ly311的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:157)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
第二多肽：Ly311的轻链(SEQ ID NO:154)
·Ly402
第一多肽(从N→C末端，Ly311的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:158)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly311的轻链(SEQ ID NO:154)
·Ly403
第一多肽：Ly311的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:159)：
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
第二多肽(从N→C末端，Ly311的轻链和TM740的scFv，以VL→VH方向；(SEQ ID NO:160)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
·Ly404
第一多肽：Ly403的重链(SEQ ID NO:159)
第二多肽(从N→C末端，Ly311的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:161)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
·Ly405
第一多肽(从N→C末端，Ly312的重链，具有IgG1变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:162)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
第二多肽：Ly312的轻链(SEQ ID NO:156)
·Ly406
第一多肽(从N→C末端，Ly312的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:163):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly312的轻链(SEQ ID NO:156)
·Ly407
第一多肽：Ly312的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:164)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
第二多肽(从N→C末端，Ly312的轻链和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:165):
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·Ly408
第一多肽：Ly407的重链(SEQ ID NO:164)
第二多肽(从N→C末端，Ly312的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:166):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
·Ly409
第一多肽(以N→C末端，Ly311的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:167):
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第二多肽：Ly311的轻链(SEQ ID NO:154)
·Ly410
第一多肽(从N→C末端，Ly311的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:168):
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第二多肽：Ly311的轻链(SEQ ID NO:154)
·Ly411
第一多肽：Ly403的重链(SEQ ID NO:159)
第二多肽(从N→C末端，Ly311的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:169):
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·Ly412
第一多肽：Ly403的重链(SEQ ID NO:159)
第二多肽(N→C末端，Ly311的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:170):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
·Ly413
第一多肽(从N→C末端，Ly312的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:171):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSS
第二多肽：Ly312的轻链(SEQ ID NO:156)
·Ly414
第一多肽(从N→C末端，Ly312的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:172):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
第二多肽：Ly312的轻链(SEQ ID NO:156)
·Ly415
第一多肽：Ly407的重链(SEQ ID NO:164)
第二多肽(从N→C末端，Ly312的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:173):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSS
·Ly416
第一多肽：Ly407的重链(SEQ ID NO:164)
第二多肽(从N→C末端，Ly312的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:174):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
·Ly417
第一多肽(从N→C末端，Ly311的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:175):
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第二多肽：Ly311的轻链(SEQ ID NO:154)
·Ly418
第一多肽(从N→C末端，Ly311的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:176):
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly311的轻链(SEQ ID NO:154)
·Ly419
第一多肽：Ly403的重链(SEQ ID NO:159)
第二多肽(从N→C末端，Ly311的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:177):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
·Ly420
第一多肽：Ly403的重链(SEQ ID NO:159)
第二多肽(从N→C末端，Ly311的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:178):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
·Ly421
第一多肽(从N→C末端，Ly312的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:179):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
第二多肽：Ly312的轻链(SEQ ID NO:156)
·Ly422
第一多肽(从N→C末端，Ly312的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:180):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly312的轻链(SEQ ID NO:156)
·Ly423
第一多肽：Ly407的重链(SEQ ID NO:164)
第二多肽(从N→C末端，Ly312的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:181):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
·Ly424
第一多肽：Ly407的重链(SEQ ID NO:164)
第二多肽(从N→C末端，Ly312的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:182):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
抗CEA/CD40双特异性抗体的表征
(i)结合活性
按照以上实施例1-3中公开的程序，通过FACS分析抗CEA/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人CEA或人CD40的结合特性。
如图26A-26E所示，本实施例中的示例性抗CEA/CD40双特异性抗体研究显示出与相对于Ly311和Ly312相似的在CHO细胞上表达的人CEA的结合亲和力。如图27A-27D所示，这些抗体表现出对在CHO细胞上表达的人CD40的结合亲和力。与相应的亲本抗体相比，包含CD40抗体的scFv形式的双特异性抗体的结合活性保持最小的变化。
(ii)CD40的激动活性
按照上述实施例2中公开的相同程序，本文公开的CD40报告基因测定用于确定双特异性抗体的激动剂活性。在与表达CEA的CHO细胞共培养中还进行CD40报告基因测定。
如图28A-28L所示，溶液中的双特异性抗体显示出不同程度的CD40激动剂活性。在共培养测定中，激动剂活性大大增强。在微环境中所测试的抗体分子与CD40和CEA同时结合将由于亲合力效应而影响个体结合，所述亲合力效应是指个体非共价结合相互作用的多个亲和力的累积强度。当与表达CEA的CHO细胞共培养时，抗体显示出增加的活性。因此，与人CEA和CD40的结合特征将影响这些双特异性抗体的激动剂活性。
(iii)B细胞增殖
按照上文实施例3中公开的程序，评价抗CEA/CD40双特异性抗体刺激人B细胞增殖的活性。如图29A-29D所示，这些双特异性抗体表现出对B细胞增殖的明显影响，其中许多对B细胞增殖没有表现出影响，表明这些双特异性蛋白的不可预测性。
实施例6：抗TNT/CD40双特异性抗体
肿瘤坏死治疗(TNT)可以通过利用识别坏死细胞特异性暴露的抗原的单克隆抗体来实现。使用上述示例的人或人源化抗CD40抗体产生抗TNT/CD40双特异性抗体。编码示例性抗TNT抗体(Ly368)的VH和VL链以及本文公开的抗CD40抗体的VH和VL链的cDNA用作起始材料。CHO瞬时表达使用包含对应的重链序列和轻链序列的质粒进行。这些抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。
下文提供了抗TNT抗体(Ly368)和示例性抗TNT/CD40双特异性抗体的重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列：
·Ly368
重链(具有IIgG1突变的Fc区；SEQ ID NO:183)：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVRWIRQPPGKGLEWLGVIWGGGSTYYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAKEKRRGYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
轻链(SEQ ID NO:184)：
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·Ly462
第一多肽(从N→C末端，Ly368的重链和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:185):
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVRWIRQPPGKGLEWLGVIWGGGSTYYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAKEKRRGYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
第二多肽：Ly368的轻链(SEQ ID NO:184)
·Ly463
第一多肽(从N→C末端，Ly368的重链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:186):
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVRWIRQPPGKGLEWLGVIWGGGSTYYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAKEKRRGYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly368的轻链(SEQ ID NO:184)
·Ly464
第一多肽：Ly368的重链(SEQ ID NO:183)
第二多肽(从N→C末端，Ly368的轻链和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:187):
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
·Ly465
第一多肽：Ly368的重链(SEQ ID NO:183)
第二多肽(从N→C末端，Ly368的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:188):
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
·Ly466
第一多肽(来自N→C末端，Ly368的重链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ IDNO:189):
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVRWIRQPPGKGLEWLGVIWGGGSTYYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAKEKRRGYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSS
第二多肽：Ly368的轻链(SEQ ID NO:184)
·Ly467
第一多肽(从N→C末端，Ly368的重链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:190):
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVRWIRQPPGKGLEWLGVIWGGGSTYYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAKEKRRGYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
第二多肽：Ly368的轻链(SEQ ID NO:184)
·Ly468
第一多肽：Ly368的重链(SEQ ID NO:183)
第二多肽(从N→C末端，Ly368的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:191):
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSS
·Ly469
第一多肽：Ly368的重链(SEQ ID NO:183)
第二多肽(从N→C末端，Ly368的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:192):
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
·LY470
第一多肽(从N→C末端，Ly368的重链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:193):
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVRWIRQPPGKGLEWLGVIWGGGSTYYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAKEKRRGYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
第二多肽：Ly368的轻链(SEQ ID NO:184)
·Ly471
第一多肽(从N→C末端，Ly368的重链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:194):
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVRWIRQPPGKGLEWLGVIWGGGSTYYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAKEKRRGYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly368的轻链(SEQ ID NO:184)
·Ly472
第一多肽：Ly368的重链(SEQ ID NO:183)
第二多肽(从N→C末端，Ly368的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:195):
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
·Ly473
第一多肽：Ly368的重链(SEQ ID NO:183)
第二多肽(从N→C末端，Ly368的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:196):
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
抗TNT/CD40双特异性抗体的表征
(i)结合活性
通过FACS分析抗TNT/CD40双特异性抗体与作为靶标(TNT)的CHO细胞或坏死细胞上表达的人CD40的结合特性。简言之，通过在室温下用2％PFA处理10min和在-20℃下用丙酮处理3min来制备坏死细胞。然后将收获的表达CD40的CHO细胞或坏死细胞，例如MC38，重悬于含BSA的FACS染色缓冲液中，并进一步将每孔100μL等分到V形底96孔板中。将50μL双特异性抗体或相应的IgG对照添加到含有细胞的孔中，以获得0.1μg/mL至10μg/mL的最终浓度。在4℃下温育2小时后，将细胞离心(3分钟，1000x g)，用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤，重悬并在4℃下用100μL/孔再温育1小时荧光染料缀合的抗IgG抗体用于检测双特异性抗体。然后用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤细胞，重悬于100μL/孔FACS染色缓冲液中，使用FACS机器采集和分析。评价双特异性抗体与在CHO细胞上表达的TNT或人CD40的结合，并将平均荧光强度绘制在直方图或点图中。
如图3A-30B所示，这些抗体相对于Ly368表现出与坏死MC38细胞相似的结合亲和力。如图31A-31B所示，这些抗体表现出对在CHO细胞上表达的人CD40的结合亲和力。与相应的亲本抗体相比，具有CD40抗体的scFv形式的双特异性抗体的结合活性保持最小的变化。
(ii)B细胞增殖
按照以上实施例3中公开的程序，评价示例性抗TNT/抗CD40双特异性抗体刺激人B细胞增殖的活性。如图32A和32B所示，这些双特异性抗体表现出对B细胞增殖的显著影响。值得注意的是，与当前申请中引用的所有其他bsAb靶标组合相比，TNT和CD40的组合导致双特异性抗体在刺激B细胞增殖方面表现出更大的活性。
实施例7：抗B7H3-CD40双特异性抗体
抗B7H3抗体的制备
使用标准鼠杂交瘤技术产生抗人B7H3抗体。分析了示例性抗体Ly383(杂交瘤18B11)和Ly387(杂交瘤55E4)的氨基酸序列，并按照Kabat CDR定义识别它们的CDR区。示例性抗B7H3抗体的VH和VL链如下所示，其中CDR区以粗体标识。制备包括示例性抗体的VH/VL和人IgG1和κ链的嵌合抗体，并证实其显示与B7H3的高亲和力结合。
>Ly383_VH(SEQ ID NO:45)
>Ly383_VL(SEQ ID NO:46)
>Ly387_VH(SEQ ID NO:47)
>Ly387_VL(SEQ ID NO:48)
抗B7H3/CD40双特异性抗体的制备
使用以上示例的人或人源化抗CD40抗体和抗B7H3抗体产生抗B7H3/CD40双特异性抗体。将编码抗B7H3抗体的VH和VL链以及抗CD40抗体的VH和VL链的cDNA用作起始材料。CHO细胞瞬时表达使用被配置用于表达双特异性抗体多肽的质粒进行。这些抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。
以下提供了抗B7H3嵌合抗体的重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列以及双特异性抗体的多肽的氨基酸序列：
·Ly383
重链(SEQ ID NO:197)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTECTDKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCASIYYGYDGTYFGVWGAGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链(SEQ ID NO:198)：
QIVLSQSPAILSTSPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSRSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNTLTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·Ly387
重链(SEQ ID NO:199)：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGGTNYNEKFKGKGTLTVDKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCVTSQATWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链(SEQ ID NO:200)：
ENVLTQSPAIMSVSPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKFWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQHYSGYPLTFGAGTKLELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·LY610
第一多肽(从N→C末端，Ly383的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:201):
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第二多肽：Ly383的轻链(SEQ ID NO:198)
·Ly611
第一多肽(从N→C末端，Ly383的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:202):
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第二多肽：Ly383的轻链(SEQ ID NO:198)
·Ly612
第一多肽(从N→C末端，Ly383的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:203):
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第二多肽：Ly383的轻链(SEQ ID NO:198)
·Ly613
第一多肽(从N→C末端，Ly383的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:204):
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTECTDKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCASIYYGYDGTYFGVWGAGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
第二多肽：Ly383的轻链(SEQ ID NO:198)
·Ly614
第一多肽(从N→C末端，Ly387的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:205):
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGGTNYNEKFKGKGTLTVDKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCVTSQATWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
第二多肽：Ly387的轻链(SEQ ID NO:200)
·LY615
第一多肽(从N→C末端，Ly387的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:206):
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第二多肽：Ly387的轻链(SEQ ID NO:200)
·LY616
第一多肽(从N→C末端，Ly387的重链，带有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:207):
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第二多肽：Ly387的轻链(SEQ ID NO:200)
·Ly617
第一多肽(从N→C末端，Ly387的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:208):
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第二多肽：Ly387的轻链(SEQ ID NO:200)
·LY801
第一多肽：Ly383的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:209)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTECTDKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCASIYYGYDGTYFGVWGAGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
第二多肽(从N→C末端，Ly383的轻链和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:210):
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·LY802
第一多肽：Ly801的重链(SEQ ID NO:209)
第二多肽(从N→C末端，Ly383的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:211):
QIVLSQSPAILSTSPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSRSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNTLTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
·LY803
第一多肽：Ly801的重链(SEQ ID NO:209)
第二多肽(从N→C末端，Ly383的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:212):
QIVLSQSPAILSTSPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSRSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNTLTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSS
·LY804
第一多肽：Ly801的重链(SEQ ID NO:209)
第二多肽(从N→C末端，Ly383的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:213):
QIVLSQSPAILSTSPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSRSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNTLTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
·LY805
第一多肽：Ly387的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:214)：
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第二多肽(从N→C末端，Ly387的轻链和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:215):
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·LY806
第一多肽：Ly805的重链(SEQ ID NO:214)
第二多肽(从N→C末端，Ly387的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:216):
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·LY807
第一多肽：Ly805的重链(SEQ ID NO:214)
第二多肽(从N→C末端，Ly387的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:217):
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·LY808
第一多肽：Ly805的重链(SEQ ID NO:214)
第二多肽(从N→C末端，Ly387的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:218):
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·LY809
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第二多肽：Ly383的轻链(SEQ ID NO:198)
·LY810
第一多肽(从N→C末端，Ly383的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:220):
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第二多肽：Ly383的轻链(SEQ ID NO:198)
·LY811
第一多肽：Ly801的重链(SEQ ID NO:214)
第二多肽(从N→C末端，Ly383的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:221):
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·LY812
第一多肽：Ly801的重链(SEQ ID NO:214)
第二多肽(从N→C末端，Ly383的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:222):
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·LY813
第一多肽(从N→C末端，Ly387的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:223):
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第二多肽：Ly387的轻链(SEQ ID NO:200)
·LY814
第一多肽(从N→C末端，Ly387的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:224):
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第二多肽：Ly387的轻链(SEQ ID NO:200)
·LY815
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第二多肽(从N→C末端，Ly387的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:225):
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·LY816
第一多肽：Ly805的重链(SEQ ID NO:214)
第二多肽(从N→C末端，Ly387的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:226)
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将在小鼠模型中评价这些双特异性抗体的体外和体内活性，包括与靶抗原(B7H3和CD40)的结合、CD40报告基因检测系统中的激动活性、B细胞和DC细胞的激活、抗肿瘤活性。抗B7H3/CD40双特异性抗体的表征
(i)结合活性
通过FACS分析示例性抗B7H3/抗CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人B7H3和/或人CD40的结合特性。简言之，收获、计数培养的细胞并使用台盼蓝拒染法评价细胞活力。然后在含2％BSA的PBS中将活细胞调整为每mL 2x 106个细胞。每孔将100μL这种细胞悬液进一步等分到V型底96孔板中。将50μL双特异性抗体或相应的IgG对照添加到含有细胞的孔中，以获得0.1μg/mL至10μg/mL的最终浓度。在4℃下温育2小时后，将细胞离心(3分钟，1000x g)，用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤，重悬并在4℃下用100μL/孔再温育1小时荧光染料缀合的抗IgG抗体用于检测双特异性抗体。然后用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤细胞，重悬于100μL/孔FACS染色缓冲液中，使用FACS机器采集和分析。评价双特异性抗体与表达人B7H3或人CD40的CHO细胞的结合，并将平均荧光强度绘制在直方图或点图中。
如图33A-33C所示，示例性抗B7H3/CD40双特异性抗体表现出与在过表达例如Ly383和Ly387的CHO细胞上表达的人B7H3相似的结合亲和力。如图34A-34C所示，双特异性抗体表现出对在CHO细胞上表达的人CD40的结合亲和力。与相应的亲本抗体相比，包括CD40抗体的scFv形式的双特异性抗体的结合活性保持最小的变化。
通过ELISA分析抗B7H3/CD40双特异性抗体与重组人B7H3和人CD40的同时结合。简言之，将人B7H3 CD蛋白(His标签)稀释，并通过在4℃下温育过夜将其以100/孔的体积包被ELISA板上。第二天，用PBST-BSA缓冲液封闭板，然后将连续稀释的抗B7H3/CD40双特异性抗体样品以50μL/孔移液到适当的孔中，并将板温育1h，随后洗涤。将人CD40-msFc抗体以50μL/孔添加到板中。在室温下温育1小时后，将ECD蛋白(小鼠IgG2a Fc标签)抗小鼠IgG(H+L)抗体以100μL/孔加入板中。将板在室温下温育1小时，然后洗涤。以100μL/孔添加TMB底物溶液，并通过添加100uL/孔终止溶液(2N H2SO4)来终止显色。通过Tecan F200Pro读板器读取450nm和620nm处的吸光度。使用Graphpad 7.0，“[激动剂]vs.响应-可变斜率(四个参数)”绘制结合数据并计算结合EC50值。
如图35A-35B所示，示例性抗B7H3/CD40双特异性抗体同时结合重组人B7H3和人CD40。
(ii)CD40的激动活性
按照上述实施例2中公开的相同程序，本文公开的CD40报告基因测定用于确定双特异性抗体的激动剂活性。在与表达B7H3的CHO细胞共培养中还进行CD40报告基因测定。
如图36，小图A-M所示，溶液中的双特异性抗体显示出不同程度的CD40激动剂活性。在共培养测定中，激动剂活性大大增强，如剂量效应饱和所示，其中0.01μg/mL双特异性抗体的最低浓度表现出最大活性。在微环境中检测的双特异性抗体分子与CD40和B7H3同时结合将由于亲合力效应而影响个体结合，该亲合力效应是指个体非共价结合相互作用的多个亲和力的累积强度。当与表达B7H3的CHO细胞共培养时，双特异性抗体显示出增加的活性。因此，与人B7H3和CD40的结合特征将影响这些双特异性抗体的激动剂活性。
(iii)B细胞增殖
按照以上实施例3中公开的程序，评价抗B7H3/CD40双特异性抗体刺激人B细胞增殖的活性。如图37A-37D所示，这些双特异性抗体在B细胞增殖方面表现出不同的特征。值得注意的是，双特异性抗体Ly612、Ly613、Ly801、Ly802、Ly803、Ly804、Ly809、Ly811、Ly812、Ly615、Ly616、Ly617、Ly807和Ly815对B细胞增殖没有刺激作用。
(iv)树突细胞激活
如上文实施例中所述，在体外检测抗B7H3/CD40抗体的CD40结合活性和激动活性。其在激活人树突细胞中的活性如以上实施例3所述进行。还在与表达B7H3的CHO细胞共培养的情况下进行DC激活测定。
如图38A-38D所示，检测的示例性抗B7H3/CD40抗体在不同程度上刺激DC激活，如抗体温育后从DC培养物中分泌IL8所证明。DC激活的幅度增加，可能是由于双特异性抗体分子在微环境中同时结合CD40和B7H4，这将影响个体结合，因为亲和力效应导致抗体的CD40激动作用改变。
(v)抗B7H3/抗CD40双特异性抗体的药代动力学研究
将C57BL/6小鼠(6-7周龄，19-20g，雄性，购自SLAC Laboratory Animal Co.LTD)用于研究。在PBS中配制抗体，并以4只小鼠为一组中通过尾静脉注射以3mg/kg施用。
通过连续取血在给药前、1d、4d、7d、10d、14d、17d和21d进行血液取样。每个时间点将10μL血液添加到40uL的PBS-BSA溶液中。然后将样品充分混合并在4℃下以2000g离心5分钟。收集后立即将上清液置于干冰上，并在约-70℃下储存直至分析。通过ELISA测定血液抗体浓度。图39A-39H显示了单次静脉注射3mg/kg后双特异性抗体的血液浓度。这些双特异性抗体显示出高且持久的循环浓度。
实施例8：抗PD-1/CD40双特异性抗体
使用上述示例的人或人源化抗CD40抗体产生抗PD-1/CD40双特异性抗体。编码抗PD-1抗体和抗CD40的VH和VL链的cDNA用作起始材料。CHO细胞瞬时表达使用被配置用于表达双特异性抗体多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。
以下提供了抗PD-1抗体(Ly516)和双特异性抗体多肽的重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列：
·Ly516
重链(SEQ ID NO:227)：
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
轻链(SEQ ID NO:228)：
NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·Ly517
第一多肽(从N→C末端，Ly516的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:229):
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
第二多肽：Ly516的轻链(SEQ ID NO:228)
·Ly518
第一多肽(从N→C末端，Ly516的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:230):
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第二多肽：Ly516的轻链(SEQ ID NO:228)
·Ly519
第一多肽：Ly516的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:231)：
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·Ly520
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·Ly606
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第二多肽：Ly516的轻链(SEQ ID NO:228)
·Ly607
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第二多肽：Ly516的轻链(SEQ ID NO:228)
·Ly817
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·Ly818
第一多肽：Ly519的重链(SEQ ID NO:231)
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·Ly608
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第二多肽：Ly516的轻链(SEQ ID NO:228)
·Ly609
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第二多肽：Ly516的轻链(SEQ ID NO:228)
·Ly819
第一多肽：Ly519的重链(SEQ ID NO:231)
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·Ly820
第一多肽：Ly519的重链(SEQ ID NO:231)
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在一些实施方案中，本文公开的抗PD-1/抗CD40双特异性抗体包括第一多肽，其是包括scFv形式的抗CD40部分和抗PD-1部分的重链的融合多肽。在一些实例中，抗CD40 scFv可以以VH→VL方向。可选地，抗CD40 scFv可以以VL→VH方向。在一些实例中，抗PD-1部分的重链可以位于第一多肽的N-末端。在其他情况下，抗CD40 scFv部分可以位于第一多肽的N-末端。发现这种形式的抗PD-1/抗CD40双特异性抗体(例如，Ly517和Ly518)表现出出乎意料的优越特征，例如，如本文所示，无明显肝毒性的优异抗肿瘤活性，例如，以下提供的数据。
抗PD-1/CD40双特异性抗体的表征
(i)结合活性
通过FACS分析抗PD-1/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人PD-1和/或人CD40的结合特性。简言之，收获、计数培养的细胞并使用台盼蓝拒染法评价细胞活力。然后在含2％BSA的PBS中将活细胞调整为每mL 2x 106个细胞。每孔将100μL这种细胞悬液进一步等分到V型底96孔板中。将50μL双特异性抗体或相应的IgG对照添加到含有细胞的孔中，以获得0.1μg/mL至10μg/mL的最终浓度。在4℃下温育2小时后，将细胞离心(3分钟，1000xg)，用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤，重悬并在4℃下用100μL/孔再温育1小时荧光染料缀合的抗IgG抗体用于检测双特异性抗体。然后用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤细胞，重悬于100μL/孔FACS染色缓冲液中，使用FACS机器采集和分析。评价双特异性抗体与表达人PD-1或人CD40的CHO细胞的结合，并将平均荧光强度绘制在直方图或点图中。
如图40A和40B中所示，示例性抗PD-1/CD40双特异性抗体表现出与在过表达例如SSI361的CHO细胞上表达的人PD-1相似的结合亲和力。如图41A和41B所示，双特异性抗体表现出对CHO细胞上表达的人CD40的结合亲和力。与相应的亲本抗体相比，包括CD40抗体的scFv形式的双特异性抗体的结合活性保持最小的变化。
通过ELISA分析抗PD-1/CD40双特异性抗体与重组人PD-1和人CD40的同时结合。简言之，将人CD40 ECD蛋白(His标签)稀释，并通过在4℃下温育过夜将其以100μl/孔的体积包被在的ELISA板上。第二天，用PBST-BSA缓冲液封闭板，然后将连续稀释的抗PD-1/CD40双特异性抗体样品以50μL/孔移液到适当的孔中，并将板温育1h，随后洗涤。将人PD-1-ECD蛋白(小鼠IgG2a Fc标签)以50μL/孔添加到板中。在室温下温育1小时后，将HRP缀合的抗小鼠IgG(H+L)抗体以100μL/孔加入板中。将板在室温下温育1小时，然后洗涤。以100μL/孔添加TMB底物溶液，并通过添加100uL/孔终止溶液(2N H2SO4)来终止显色。通过Tecan F200Pro读板器读取450nm和620nm处的吸光度。使用Graphpad 7.0，“[激动剂]vs.响应-可变斜率(四个参数)”绘制结合数据并计算结合EC50值。
如图42A-42H所示，示例性抗PD-1/CD40双特异性抗体同时结合包被的重组人CD40和可溶性人重组PD-1。
(ii)CD40的激动活性
按照上述实施例2中公开的相同程序，本文公开的CD40报告基因测定用于确定双特异性抗体的激动剂活性。在与表达PD-1的CHO细胞共培养中还进行CD40报告基因测定。
如图43A-43D所示，溶液中的双特异性抗体显示出不同程度的CD40激动剂活性。在共培养测定中，激动剂活性大大增强，如剂量效应饱和所示，其中0.01μg/mL双特异性抗体的最低浓度表现出最大活性。在微环境中检测的双特异性抗体分子与CD40和PD-1同时结合将由于亲合力效应而影响个体结合，该亲合力效应是指个体非共价结合相互作用的多个亲和力的累积强度。当与表达PD-1的CHO细胞共培养时，双特异性抗体显示出增加的活性。因此，与人PD-1和CD40的结合特征将影响这些双特异性抗体的激动剂活性。
(iii)PD-1/PD-L1相互作用阻断
按照上文实施例3中公开的相同程序，本文公开的PD-1报告基因测定用于确定双特异性抗体阻断PD-L1/PD-1细胞功能的能力。抗PD-1和CD40抗体用作参考。
如图44A-44B所示，双特异性抗体显示出比PD-1或CD40抗体更强的阻断活性。
(iv)B细胞增殖
按照以上实施例3中公开的程序，评价示例性抗PD-1/抗CD40双特异性抗体刺激人B细胞增殖的活性。如图44A-44B所示，这些双特异性抗体在B细胞增殖方面表现出不同的特征。
(v)示例性抗PD-1/抗CD40双特异性抗体的药代动力学研究
将C57BL/6小鼠(6-7周龄，19-20g，雄性，购自SLAC Laboratory Animal Co.LTD)用于研究。在PBS中配制抗体，并以4只小鼠为一组中通过尾静脉注射以3mg/kg施用。
通过连续取血在给药前、1d、4d、7d、10d、14d、17d和21d进行血液取样。每个时间点将10μL血液添加到40uL的PBS-BSA溶液中。然后将样品充分混合并在4℃下以2000g离心5分钟。收集后立即将上清液置于干冰上，并在约-70℃下储存直至分析。通过ELISA测定血液抗体浓度。图46A-46H显示了单次静脉注射5mg/kg后双特异性抗体的血液浓度。这些双特异性抗体显示出高且持久的循环浓度。
(vi)抗肿瘤活性
在体内小鼠同系肿瘤模型中检测示例性抗PD-1/CD40抗体以确定这些抗体的抗肿瘤疗效和毒性。将过表达卵清蛋白的鼠黑色素瘤B16F10肿瘤细胞皮下植入纯合人CD40敲入C57BL6小鼠中。当肿瘤大小为约150±50mm3(n＝6)时，将小鼠分组。通过腹腔注射施用抗PD-L1/CD40抗体，并且在4-6周的抗体处理期间测量肿瘤大小。使用0.5×长×宽2的公式将肿瘤大小计算为肿瘤体积。
在对照组和抗体处理组的肿瘤大小之间评价抗肿瘤疗效，如图47所示。抗体Keytruda和CD40 ref mAb用作参考。值得注意的是，即使Keytruda在图47所示的实验中没有显示出抗肿瘤活性，但克隆Ly517仍然显示出与Ly253-G2相当的疗效。此外，Ly517和Ly607未引起血清ALT的明显升高(图48)。
实施例9：抗HER2/CD40双特异性抗体
HER2代表典型的致癌生长受体，其在肿瘤中高表达。靶向HER2的单克隆抗体已上市用于癌症治疗。使用上述示例的人或人源化抗CD40抗体产生抗HER2/CD40双特异性抗体。编码抗HER2抗体和抗CD40的VH和VL链的cDNA用作起始材料。CHO细胞瞬时表达使用被配置用于表达双特异性抗体多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。
以下提供了抗HER2抗体(TM737和Ly591)和双特异性抗体多肽的重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列：
·TM737
重链(SEQ ID NO:242)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链(SEQ ID NO:243)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·Ly591
重链(SEQ ID NO:244)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链(SEQ ID NO:245)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·Ly618
第一多肽(从N→C末端，TM737的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:246):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSS
第二多肽：TM737的轻链(SEQ ID NO:243)
·Ly619
第一多肽(从N→C末端，TM737的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:247):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
第二多肽：TM737的轻链(SEQ ID NO:243)
·Ly821
第一多肽：TM737的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:248)：
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第二多肽(从N→C末端，TM737的轻链和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:249):
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·Ly822
第一多肽：Ly821的重链(SEQ ID NO:248)
第二多肽(从N→C末端，TM737的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:250):
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·Ly620
第一多肽(从N→C末端，TM737的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM599的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:251):
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第二多肽：TM737的轻链(SEQ ID NO:243)
·Ly621
第一多肽(从N→C末端，TM737的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:252):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGVTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFLGWGGANWIAHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYFVDRLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKYPPTFGQGTKLEIK
第二多肽：TM737的轻链(SEQ ID NO:243)
·Ly823
第一多肽：Ly821的重链(SEQ ID NO:248)
第二多肽(从N→C末端，TM737的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:253):
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·Ly824
第一多肽：Ly821的重链(SEQ ID NO:248)
第二多肽(从N→C末端，TM737的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:254):
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·Ly622
第一多肽(从N→C末端，Ly591的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:255):
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第二多肽：Ly591的轻链(SEQ ID NO:245)
·Ly623
第一多肽(从N→C末端，Ly591的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:256):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFNFNDYFMNWVRQASGKGLEWVGQIRNKNYNYATYYTESLEGRVTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYYYDGFADYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSSRRTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly591的轻链(SEQ ID NO:245)
·Ly825
第一多肽：Ly591的重链，具有IgG1突变的Fc(SEQ ID NO:257)：
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·Ly826
第一多肽：Ly825的重链(SEQ ID NO:257)
第二多肽(从N→C末端，Ly591的轻链和TM740的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:259):
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·Ly624
第一多肽(从N→C末端，Ly591的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM599的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:260):
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第二多肽：Ly591的轻链(SEQ ID NO:245)
·Ly625
第一多肽(从N→C末端，Ly591的重链，具有IgG1突变的Fc区和TM599的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:261):
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第二多肽：Ly591的轻链(SEQ ID NO:245)
·Ly827
第一多肽：Ly825的重链(SEQ ID NO:257)
第二多肽(从N→C末端，Ly591的轻链和TM559的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:262):
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·Ly828
第一多肽：Ly825的重链(SEQ ID NO:257)
第二多肽(从N→C末端，Ly591的轻链和TM559的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:263):
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·Ly829
第一多肽(从N→C末端，TM737的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:264):
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·Ly830
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第二多肽：TM737的轻链(SEQ ID NO:243)
·Ly831
第一多肽：Ly821的重链(SEQ ID NO:248)
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·Ly832
第一多肽：Ly821的重链(SEQ ID NO:248)
第二多肽(从N→C末端，TM737的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:267):
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·Ly833
第一多肽(从N→C末端，Ly591的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:268):
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第二多肽：Ly591的轻链(SEQ ID NO:245)
·Ly834
第一多肽(从N→C末端，Ly591的重链，具有IgG1突变的Fc区和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:269):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
第二多肽：Ly591的轻链(SEQ ID NO:245)
·Ly835
第一多肽：Ly825的重链(SEQ ID NO:257)
第二多肽(从N→C末端，Ly591的轻链和Ly253的scFv，以VL→VH方向；SEQ ID NO:270):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
·Ly836
第一多肽：Ly825的重链(SEQ ID NO:257)
第二多肽(从N→C末端，Ly591的轻链和Ly253的scFv，以VH→VL方向；SEQ ID NO:271):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
将在小鼠模型中评价这些双特异性抗体的体外和体内活性，包括与靶抗原(HER2和CD40)的结合、CD40报告基因检测系统中的激动活性、B细胞和DC细胞的激活、抗肿瘤活性。抗HER2/CD40双特异性抗体的表征
(i)结合活性
通过FACS分析抗HER2/CD40双特异性抗体与在CHO细胞上表达的人HER2和/或人CD40的结合特性。简言之，收获、计数培养的细胞并使用台盼蓝拒染法评价细胞活力。然后在含2％BSA的PBS中将活细胞调整为每mL 2x 106个细胞。每孔将100μL这种细胞悬液进一步等分到V型底96孔板中。将50μL双特异性抗体或相应的IgG对照添加到含有细胞的孔中，以获得0.1μg/mL至10μg/mL的最终浓度。在4℃下温育2小时后，将细胞离心(3分钟，1000xg)，用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤，重悬并在4℃下用100μL/孔再温育1小时荧光染料缀合的抗IgG抗体用于检测双特异性抗体。然后用250μL/孔含BSA的FACS染色缓冲液洗涤细胞，重悬于100μL/孔FACS染色缓冲液中，使用FACS机器采集和分析。评价双特异性抗体与表达人HER2或人CD40的CHO细胞的结合，并将平均荧光强度绘制在直方图或点图中。
如图49A-49C所示，示例性抗HER2/CD40双特异性抗体对在过表达HER2的CHO细胞上表达的人HER2表现出相似的结合亲和力。如图50A-50C所示，双特异性抗体表现出对在CHO细胞上表达的人CD40的结合亲和力。与相应的亲本抗体相比，包括CD40抗体的scFv形式的双特异性抗体的结合活性保持最小的变化。
(ii)CD40的激动活性
按照上述实施例2中公开的相同程序，本文公开的CD40报告基因测定用于确定双特异性抗体的激动剂活性。在与表达HER2的CHO细胞共培养中还进行CD40报告基因测定。
如图51，小图A-F所示，溶液中的双特异性抗体显示出不同程度的CD40激动剂活性。在微环境中检测的双特异性抗体分子与CD40和HER2同时结合将由于亲合力效应而影响个体结合，该亲合力效应是指个体非共价结合相互作用的多个亲和力的累积强度。当与表达HER2的CHO细胞共培养时，双特异性抗体显示出增强的活性。因此，与人HER2和CD40的结合特征将影响这些双特异性抗体的激动剂活性。
(iii)B细胞增殖
按照上文实施例3中公开的程序，评价抗HER2/CD40双特异性抗体刺激人B细胞增殖的活性。如图52A和52B所示，这些双特异性抗体表现出不同的B细胞增殖效应曲线。
(iv)抗肿瘤活性
在体内小鼠同系肿瘤模型中检测示例性抗HER2/CD40抗体以确定这些抗体的抗肿瘤疗效和毒性。将过表达人HER2的鼠结肠癌MC38肿瘤细胞皮下植入到纯合子人CD40敲入C57BL/6小鼠中。当肿瘤大小为大约150±50mm3(n＝6)时，将小鼠分组。通过腹腔注射施用抗HER2/CD40抗体，并且在4-6周的抗体处理期间测量肿瘤大小。使用0.5×长×宽2的公式将肿瘤大小计算为肿瘤体积。在对照组和抗体处理组的肿瘤大小之间评价抗肿瘤疗效，如图53所示。抗体Ly253-G2用作参考，在诱导血清ALT升高的同时显示出抗肿瘤疗效。几种双特异性抗体(例如Ly619、Ly831和Ly833)显示出与Ly253-G2相当或更强的疗效，而未导致血清ALT升高。
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等同或类似目的的可选特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等同或类似特征的通用系列的实例。
通过以上描述，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特性，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求范围内。
等同方案
尽管本文已经描述和展示了若干个本发明实施方案，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的优点中的一个或多个优点的各种其他方式和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一个均被视为在本文所述的本发明实施方案的范围内。更通常地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置表示示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体本发明实施方案的许多等同方案。因此，应理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同方案的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施方案。本公开的本发明实施方案涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合被包括在本公开的发明范围内。
本文中定义和使用的所有定义均应当理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文件中的定义和/或定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而并入本文，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。
除非清楚地相反地指出，否则如本文中在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应理解为意指“至少一个”。
如本文中在说明书和权利要求中所使用的，短语“和/或”应当理解为意指如此联合的要素中的“任一个或两个”，即要素在一些情况下结合地存在而在其他情况下分开存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式理解，即如此联合的要素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其他要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实施例，当与开放式语言，例如“包括”结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中可以仅指代A(任选地包括除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指代B(任选地包括除了A之外的要素)；在又另一个实施方案中，指代A和B两者(任选地包括其他要素)等。
如本文中在说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含多个要素或要素列表中的至少一个要素、但是还包含多于一个要素，以及任选地另外未列出的项。只有明确地指示相反的术语，如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或者在权利要求中使用时“由……组成”将指代包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，当之前有排他性术语，如“任一个”、“……中的一个”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”时，如本文中所使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代方案(即“一个或另一个而非两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
如本文中在说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不必要包括要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个并且不排除要素列表中的要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个”所指代的要素列表内具体标识的要素之外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实施例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指代至少一个，任选地包含多于一个A，而不存在B(并且任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施方案中指代至少一个、任选地包含多于一个B，而不存在A(并且任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施方案中指代至少一个、任选地包含多于一个A，以及至少一个、任选地包含多于一个B(并且任选地包含其他要素)等。
还应该理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述方法的步骤或动作的顺序。

Claims (98)

1.一种特异于人CD40的人源化抗体，其中所述人源化抗体包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
(i)所述VH包括IGHV3-73*01框架以及重链互补决定区(CDR)1、2和3，所述重链CDR 1、2和3与亲本鼠抗体Lyv377的重链CDR相同，或相对于所述亲本鼠抗体Lyv377，所述重链CDR1、2和3总共包含不超过5个氨基酸残基变异；或
(ii)所述VH包括IGHV3-23*04框架以及重链CDR 1、2和3，所述CDR 1、2和3与亲本鼠抗体Lyv378的重链CDR相同，或相对于所述亲本鼠抗体Lyv378，所述重链CDR 1、2和3总共包含不超过5个氨基酸残基变异。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体，其中所述VL包括IGKV1-39*01框架以及轻链CDR1、2和3，所述轻链CDR 1、2和3与所述亲本鼠抗体Lyv377或Lyv378的轻链CDR相同，或相对于所述亲本鼠抗体Lyv377或Lyv378，所述轻链CDR 1、2和3总共包含不超过5个氨基酸残基变异。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的人源化抗体，其中所述抗体包括(i)的VH并且其中所述重链CDR1包括GFNFNDSFMN(SEQ ID NO:1)、GFNFQDSFMN(SEQ ID NO:2)、GFNFNDAFMN(SEQ ID NO:3)或GFNFNDYFMN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中所述重链CDR2包括QIRNKNYNYATYYTESLEG(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，以及其中所述重链CDR3包括YYYDGFADYFDY(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的人源化抗体，其中所述轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDRs分别包括KASQNIYIYLN(SEQ ID NO:7)、NTNNLQT(SEQ ID NO:8)和LQHSSRRT(SEQID NO:9)的氨基酸序列。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的人源化抗体，其中所述VH包括VH框架中的一个或多个突变。
6.根据权利要求5所述的人源化抗体，其中所述VH框架中的突变是基于所述亲本鼠抗体中相应位置的氨基酸残基的回复突变。
7.根据权利要求6所述的人源化抗体，其中所述回复突变包括E1Q、A24T、F70V、R100S或其组合。
8.根据权利要求3所述的人源化抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:10-14的氨基酸序列。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的人源化抗体，其中所述VL包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的人源化抗体，其中所述抗体包括(ii)的VH并且其中所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GFTFTNYGLH(SEQ IDNO:16)、SISPSGGVTYYRDSVKG(SEQ ID NO:17)和PFLGWGGANWIAH(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的人源化抗体，其中所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括LASEDISNDLA(SEQ ID NO:19)、FVDRLLD(SEQ ID NO:20)和QQSYKYPPT(SEQ IDNO:21)的氨基酸序列。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的人源化抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的人源化抗体，其中所述VL包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体是全长抗体。
15.根据权利要求14所述的人源化抗体，其中所述全长抗体是IgG/κ分子。
16.根据权利要求15所述的人源化抗体，其中所述全长抗体包括重链，所述重链为IgG1、IgG2或IgG4链。
17.根据权利要求16所述的人源化抗体，其中所述重链包括突变Fc区，相对于野生型对应物，所述突变Fc区表现出对Fc受体的改变的结合亲和力或选择性。
18.根据权利要求15所述的人源化抗体，其中所述抗体选自由TM550、TM553、LP3771、LP3772、LP3773、TM738、TM739、TM740和Ly181组成的组。
19.根据权利要求15所述的人源化抗体，其中所述抗体选自由TM559、LP3781、LP3782和LP3783组成的组。
20.一种分离的抗PD-L1抗体，其中所述抗体包括：
(i)包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，所述重链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv5574的重链CDR相同，或相对于所述参考抗体Lyv5574，所述重链CDR1、2和3包含不超过5个氨基酸残基变异；和
(ii)包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VH)，所述轻链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv5574的轻链CDR相同，或相对于所述参考抗体Lyv5574，所述轻链CDR 1、2和3包含不超过5个氨基酸残基变异。
21.根据权利要求20所述的抗PD-L1抗体，其中所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GYTFTDFWMS(SEQ ID NO:24)、QIYPNTGTTHSNEKFKG(SEQ ID NO:25)和SYHISTTPNWFAY(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的抗PD-L1抗体，其中所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括KASQNVYKKLE(SEQ ID NO:27)、HTNILQT(SEQ ID NO:28)和YQWNSGPT(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的抗PD-L1抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
24.根据权利要求23所述的抗PD-L1抗体，其中所述抗体的VH包括人IGHV1-46*01框架，和/或其中所述抗体的VL包括人IGKV1-27*01框架。
25.根据权利要求24所述的抗PD-L1抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列，和/或其中所述VL包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
26.根据权利要求24所述的抗PD-L1抗体，其中所述VH和/或所述VL包括人VH和/或VL框架中的一个或多个突变。
27.根据权利要求26所述的抗PD-L1抗体，其中所述抗体的VL包括位置L42和/或位置F71的突变。
28.根据权利要求27所述的抗PD-L1抗体，其中所述突变是L42V和/或F71Y的回复突变。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的抗PD-L1抗体，其中所述VL包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
30.根据权利要求20-29中任一项所述的抗PD-L1抗体，其中所述抗体是全长抗体。
31.根据权利要求30所述的抗PD-L1抗体，其中所述全长抗体是IgG1/κ分子。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的抗PD-L1抗体，其中所述全长抗体包括重链，所述重链包括突变Fc区，相对于其野生型对应物，所述突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性。
33.根据32所述的抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体选自由Ly074、Ly075和Ly076组成的组。
34.一种分离的抗B7H3抗体，其中所述抗体包括：
(i)包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，所述重链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv383或Lyv387的重链CDR相同，或相对于所述参考抗体Lyv383或Lyv387，所述重链CDR 1、2和3包含不超过5个氨基酸残基变异；和
(ii)包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VH)，所述轻链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv383或Lyv387的轻链CDR相同，或相对于所述参考抗体Lyv383或LYV387，所述轻链CDR 1、2和3包含不超过5个氨基酸残基变异。
35.根据权利要求34所述的抗B7H3抗体，其中：
(a)所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GYTFTSYVMH(SEQ ID NO:33)、INPYNDGTECTDKFKG(SEQ ID NO:34)和SIYYGYDGTYFGV(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列，或
(b)所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:36)、MIHPNSGGTNYNEKFKG(SEQ ID NO:37)和SQATWFAY(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的抗B7H3抗体，其中：
(a)所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括RASSSVSYMH(SEQ ID NO:39)、TSNLAS(SEQ ID NO:40)和QQWSSNTLT(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列；或
(b)所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括RASSSVSSSYLH(SEQ ID NO:42)、STSNLAS(SEQ ID NO:43)和QHYSGYPLT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列。
37.根据权利要求34所述的抗B7H3抗体，其中(a)所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GYTFTSYVMH(SEQ ID NO:33)、INPYNDGTECTDKFKG(SEQ ID NO:34)和SIYYGYDGTYFGV(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列，并且其中(b)所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括RASSSVSYMH(SEQ ID NO:39)、TSNLAS(SEQ ID NO:40)和QQWSSNTLT(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列。
38.根据权利要求37所述的抗B7H3抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和/或其中所述VL包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
39.根据权利要求34所述的抗B7H3抗体，其中(a)所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:39)、MIHPNSGGTNYNEKFKG(SEQ ID NO:40)和SQATWFAY(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列；并且其中(b)所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括RASSSVSSSYLH(SEQ ID NO:42)、STSNLAS(SEQ ID NO:43)和QHYSGYPLT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列。
40.根据权利要求39所述的抗B7H3抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和/或其中所述VL包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的抗B7H3抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
42.根据权利要求34-41中任一项所述的抗B7H3抗体，其中所述抗体是全长抗体。
43.根据权利要求42所述的抗B7H3抗体，其中所述全长抗体是IgG/κ分子。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的抗B7H3抗体，其中所述全长抗体包括重链，所述重链包括突变Fc区，相对于其野生型对应物，所述突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性。
45.一种分离的抗B7H4抗体，其中所述抗体包括：
(i)包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，所述重链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv361或Lyv366的重链CDR相同，或相对于所述参考抗体Lyv361或Lyv366，所述重链CDR 1、2和3包含不超过5个氨基酸残基变异；和
(ii)包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VH)，所述轻链CDR 1、2和3与参考抗体Lyv361或Lyv366的轻链CDR相同，或相对于所述参考抗体Lyv361或Lyv366，所述轻链CDR 1、2和3包含不超过5个氨基酸残基变异。
46.根据权利要求45所述的抗B7H4抗体，其中：
(a)所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GFTFSSYGMS(SEQ ID NO:49)、AISTGGSYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:50)和RGATGSWFAY(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列，或
(b)所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GFTFSDSGMH(SEQ ID NO:52)、YINSGSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:53)和GRGYAMDY(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的抗B7H4抗体，其中：
(a)所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括HASQGINNNIG(SEQ ID NO:55)、GTNLED(SEQ ID NO:56)和VQYVQFPRT(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列；或
(b)所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括SASSSISSDFLH(SEQ ID NO:58)、RISNLAS(SEQ ID NO:59)和QQGSNVPRT(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
48.根据权利要求45所述的抗B7H4抗体，其中(a)所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GFTFSSYGMS(SEQ ID NO:49)、AISTGGSYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:50)和RGATGSWFAY(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列，并且其中(b)所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括HASQGINNNIG(SEQ ID NO:55)、GTNLED(SEQ ID NO:56)和VQYVQFPRT(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列。
49.根据权利要求48所述的抗B7H4抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列，和/或其中所述VL包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
50.根据权利要求45所述的抗B7H4抗体，其中(a)所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3分别包括GFTFSDSGMH(SEQ ID NO:52)、YINSGSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:53)和GRGYAMDY(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列；并且其中(b)所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3分别包括SASSSISSDFLH(SEQ ID NO:58)、RISNLAS(SEQ ID NO:59)和QQGSNVPRT(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
51.根据权利要求50所述的抗B7H4抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列，和/或其中所述VL包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
52.根据权利要求45-51中任一项所述的抗B7H4抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
53.根据权利要求45-52中任一项所述的抗B7H4抗体，其中所述抗体是全长抗体。
54.根据权利要求53所述的抗B7H4抗体，其中所述全长抗体是IgG/κ分子。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的抗B7H4抗体，其中所述全长抗体包括重链，所述重链包括对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性的突变Fc区。
56.一种双特异性抗体，包括：
(a)第一抗体部分，所述第一抗体部分结合人CD40，和
(b)第二抗体部分，所述第二抗体部分结合选自由HER2、坏死肿瘤细胞(TNT)、癌胚抗原(CEA)、PD-1、PD-L1、B7H3和B7H4组成的组的抗原。
57.根据权利要求56所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体部分或所述第二抗体部分为单链抗体(scFv)形式。
58.根据权利要求57所述的双特异性抗体，其中其他抗体部分为包括重链和轻链的全长抗体形式。
59.根据权利要求57或权利要求58所述的双特异性抗体，其中结合人CD40的所述第一抗体部分是scFv；其中所述第二抗体部分包括：包括抗体重链的第一多肽和包括抗体轻链的第二多肽，并且其中所述scFv与所述第一多肽或所述第二多肽融合。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的双特异性抗体，其中结合人CD40的所述第一抗体部分是权利要求1-13中任一项所述的人源化抗CD40抗体，或具有与抗体Ly253相同的重链和轻链CDR的抗CD40抗体。
61.根据权利要求56-60中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分结合PD-L1。
62.根据权利要求61所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分是权利要求20-33中任一项所述的抗PD-L1抗体。
63.根据权利要求62所述的双特异性抗体，其选自由Ly301、Ly303、Ly338、Ly339、Ly340、Ly341、Ly342、Ly343、Ly344、Ly345、Ly349和Ly350组成的组。
64.根据权利要求56-60中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分结合B7H3。
65.根据权利要求64所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体是权利要求34-44中任一项所述的抗B7H3抗体。
66.根据权利要求65所述的双特异性抗体，其选自由Ly610、Ly611、Ly612、Ly613、Ly614、Ly615、Ly616、Ly617、Ly801、Ly802、Ly803、Ly804、Ly805、Ly806、Ly807、Ly808、Ly809、Ly810、Ly811、Ly812、Ly813、Ly814、Ly815和Ly816组成的组。
67.根据权利要求56-60中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分结合B7H4。
68.根据权利要求67所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分是权利要求45-55中任一项所述的抗B7H4抗体。
69.根据权利要求68所述的双特异性抗体，其选自由Ly474、Ly475、Ly476、Ly477、Ly478、Ly479、Ly480、Ly481、Ly482、Ly483、Ly484、Ly485、Ly486、Ly487、Ly488、Ly489、Ly490、Ly491、Ly492、Ly493、Ly494、Ly495、Ly496和Ly497组成的组。
70.根据权利要求56-60中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分结合CEA。
71.根据权利要求70所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分包括与参考抗体Ly311或Ly312相同的重链CDR，和/或其中所述第二抗体部分包括与参考抗体Ly311或Ly312相同的轻链CDR。
72.根据权利要求71所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分包括与参考抗体Ly311或Ly312相同的重链，和/或其中所述第二抗体部分包括与参考抗体Ly311或Ly312相同的轻链。
73.根据权利要求72所述的双特异性抗体，其选自由Ly401、Ly402、Ly403、Ly404、Ly405、Ly406、Ly407、Ly408、Ly409、Ly410、Ly411、Ly412、Ly413、Ly414、Ly415、Ly416、Ly417、Ly418、Ly419、Ly420、Ly421、Ly422、Ly423和Ly424组成的组。
74.根据权利要求56-60中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分结合坏死肿瘤细胞(TNT)。
75.根据权利要求74所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分包括与参考抗体Ly368相同的重链CDR；和/或其中所述第二抗体部分包括与所述参考抗体Ly368相同的轻链CDR。
76.根据权利要求75所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分包括与所述参考抗体Ly368相同的重链；和/或其中所述第二抗体部分包括与所述参考抗体Ly368相同的轻链。
77.根据权利要求76所述的双特异性抗体，其选自由Ly462、Ly463、Ly464、Ly465、Ly466、Ly467、Ly468、Ly469、Ly470、Ly471、Ly472和Ly473组成的组。
78.根据权利要求56-60中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分结合PD-1。
79.根据权利要求78所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分包括与参考抗体Ly516相同的重链CDR；和/或其中所述第二抗体部分包括与所述参考抗体Ly516相同的轻链CDR。
80.根据权利要求79所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分包括与所述参考抗体Ly516相同的重链；和/或其中所述第二抗体部分包括与所述参考抗体Ly516相同的轻链。
81.根据权利要求80所述的双特异性抗体，其选自由Ly517、Ly518、Ly519、Ly520、Ly606、Ly607、Ly608、Ly609、Ly817、Ly818、Ly819和Ly820组成的组。
82.根据权利要求56-60中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分结合HER2。
83.根据权利要求82所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分包括与参考抗体TM737或Ly591相同的重链CDR；和/或其中所述第二抗体部分包括与所述参考抗体TM737或Ly591相同的轻链CDR。
84.根据权利要求83所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分包括与所述参考抗体TM737或Ly591相同的重链；和/或其中第二抗体部分包括与所述参考抗体TM737或Ly591相同的轻链。
85.根据权利要求84所述的双特异性抗体，其选自由Ly618、Ly619、Ly620、Ly621、Ly622、Ly623、Ly624、Ly625、Ly821、Ly822、Ly823、Ly824、Ly825、Ly826、Ly827、Ly828、Ly829、Ly830、Ly831、Ly832、Ly833、Ly834、Ly835和Ly836组成的组。
86.一种分离的抗PD-1抗体，其中所述抗体包括：
(i)包括重链互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，所述重链CDR 1、2和3与参考抗体Ly516的重链CDR相同；和
(ii)包括轻链CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，所述轻链CDR 1、2和3与参考抗体Ly516的轻链CDR相同。
87.根据权利要求86所述的抗PD-1抗体，其包括与抗体Ly516相同的VH和相同的VL。
88.根据权利要求86或权利要求87所述的抗PD-1抗体，其中所述抗体是全长抗体。
89.根据权利要求88所述的抗PD-1抗体，其中所述全长抗体是IgG/κ分子。
90.根据权利要求88或权利要求89所述的抗PD-1抗体，其中所述全长抗体包括重链，所述重链包括突变Fc区，相对于其野生型对应物，所述突变Fc区对Fc受体具有改变的结合亲和力或特异性。
91.一种核酸或核酸集，所述核酸或核酸集共同编码前述权利要求中任一项的抗体。
92.根据权利要求91所述的核酸或核酸集，其为表达载体或表达载体集。
93.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求91或权利要求92所述的核酸或核酸集。
94.根据权利要求93所述的宿主细胞，其是哺乳动物宿主细胞。
95.一种用于产生权利要求1-90中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括：
(i)在实现抗体表达的条件下培养权利要求88或权利要求89的宿主细胞；和
(ii)收获由此产生的所述抗体。
96.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1-90中任一项的抗体和药学上可接受的运载体。
97.一种用于调节免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-90中任一项所述的抗体或其药物组合物。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有癌症的人患者。
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