FI94426B - Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille - Google Patents
Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille Download PDFInfo
- Publication number
- FI94426B FI94426B FI854143A FI854143A FI94426B FI 94426 B FI94426 B FI 94426B FI 854143 A FI854143 A FI 854143A FI 854143 A FI854143 A FI 854143A FI 94426 B FI94426 B FI 94426B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- yeast
- pichia
- pichia pastoris
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/938—Pichia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
! . 94426
Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DHft-tekniikan alaan. Tämän keksinnön eräs piirre kohdistuu DNA-kappaleisiin, jotka säilyvät kromosomien ulkopuolisina elementteinä Pichia-sukuisessa isännässä· Tämän keksinnön eräs toinen piirre kohdistuu ilmentäviin vek-toreihin, jotka sisältävät edellä kuvattuja DNA-kappaleita.
Tämän keksinnön eräs muu piirre kohdistuu uusiin mikro-organis-meihin, jotka on muunnettu edellä kuvatuilla ilmentävillä vektoreilla. Edelleen, tämän keksinnön eräs muu piirre kohdistuu menetelmään tämän keksinnön mukaisten uusien DNA-kappaleiden eristämiseksi.
Yhdistelmä-DNA-tekniikan alalla käytettävät perusmenetelmät ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Jotta jokin isäntänä toimiva mikro-organismi voisi olla käyttökelpoinen yhdistelmä-DNA-tekniikassa, niin käytettävissä ovat tällöin toivottavasti seuraavat elementit: (1) geeni, joka koodaa yhtä tai useampaa toivottua polypepti-diä, ja jossa on isäntänä toimivassa mikro-organismissa tapahtuvan ilmentymisen edellyttämät, riittävät säätelyketjut; (2) vektori, tavallisesti plasmidi, johon tämä geeni säätelyket-juineen voidaan istuttaa. Tämän vektorin avulla voidaan taata geenin siirtyminen solun sisään sekä DNA-ketjujen pysyminen tässä solussa. Mikäli tämä vektori sisältää autonomisia repli-kaatioketjuja, niin tällöin solua kohden vektorista voidaan saada useita kopioita, ja solussa voidaan päästä edellä mainitun geenin hyvään ilmentymiseen; ja . (3) sopiva isäntänä toimiva mikro-organismi, johon tämän toivo tun geenin sisältämä vektori voidaan siirtää, ja jolla isäntänä toimivalla mikro-organismilla on myöskin isäntään istutetun geenin koodaaman informaation ilmentymisen mahdollistavat solu-toiminnot ; jotka elementit eivät kuitenkaan rajoitu näihin lueteltuihin ehtoihin.
2 . 94426
Yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytetty peruselementti on plasmidi, joka on joissakin mikro-organismeissa esiintyvä, kromosomien ulkopuolinen, kaksoisjuosteinen DNA-ketju. Mikäli plasmideja esiintyy luonnostaan mikro-organismeissa, niin tällöin niitä esiintyy solussa useina kopioina. Luonnossa esiintyvien plasmi-dien lisäksi myös lukuisia keinotekoisia plasmideja, eli hybridi-vektoreita, on valmistettu. Plasmidi-DNA:hän koodattu informaatio sisältää ne tiedot, joita tarvitaan tämän plasmidin lisääntymiseen tytärsoluissa, eli tämä plasmidi-DNA sisältää autonomisen replikaatioketjun. Tähän plasmidi-DNA:han koodatun informaation tulee myös sisältää fenotyypin valikoinnin mahdollistavia ominaisuuksia. Näiden fenotyypin valikoinnin mahdollistavien ominaisuuksien avulla voidaan tunnistaa ja valikoida mielenkiinnon kohteena olevan plasmidin sisältävän isäntäsolun klooneja siten, että soluja kasvatetaan toivotunlaisella selektiivisellä alustalla.
Plasmidien hyödyllisyys perustuu siihen tosiseikkaan, että niitä voidaan pilkkoa spesifisesti yhdellä tai useammalla restriktio-endonukleaasilla tai restriktioentsyymillä, joista kukin tunnistaa yhden ainoan, spesifisen, plasmidi-DNA:ssa olevan kohdan.
Tämän jälkeen tähän plasmidiin voidaan istuttaa homologisia geenejä, heterologisia geenejä, eli isäntäorganismista poikkeavasta organismista peräisin olevia geenejä, tai geenikappaleita siten, että tämä pilkottu plasmidi ja toivottu geneettinen materiaali liitetään päistään yhteen pilkkomiskohdistaan tai pilkkomiskohdan viereen muodostetuista päistään. Tuloksena olevaa yhdistettyä DNA-materiaalia voidaan kutsua hybridivektoriksi.
DNA:n yhdistäminen toteutetaan isäntänä toimivan mikro-organismin ulkopuolella. Tuloksena oleva hybridivektori voidaan viedä isäntänä toimivan mikro-organismin sisään menetelmällä, joka tunnetaan käsitteellä muuntaminen (transformaatio). Hybridivekto-reita voidaan saada suuria määriä kasvattamalla tätä muunnettua mikro-organismia. Mikäli tämä geeni on istutettu asianmukaisesti '> plasmidissa sijaitsevien, DNA:hän koodautuneen viestin kopiointia 3 . 94426 ja luentaa (transkriptio ja translaatio) säätävien osien suhteen, niin tällöin tätä tuloksena olevaa hybridivektoria voidaan käyttää tämän istutetun geenin koodaaman polypeptidiketjun tuotannon ohjaamiseen. Täten tapahtuvaa polypeptidin tuotantoa kutsutaan geenin ilmentymiseksi (ekspressio).
Toistaiseksi, erilaisten polypeptidien tuotantoon tähtäävässä, yhdistelmä-DNA-tekniikkaa soveltavassa kaupallisessa toiminnassa ollaan keskitytty isäntäorganismin suhteen Escherichia coli-bakteeriin. Kuitenkin joissakin tilanteissa E. coli saattaa osoittautua sopimattomaksi isännäksi. E. coli sisältää esimerkiksi monia toksisia, pyrogeenisiä tekijöitä, jotka on poistettava kaikista sellaisista polypeptideistä, joita voidaan käyttää farmaseuttisina tuotteina. Se tehokkuus, joka tässä puhdistamisessa saavutetaan, riippuu luonnollisestikin kyseisestä poly-peptidistä. Lisäksi E. coli-bakteerissa esiintyvät proteolyytti-set aktiivisuudet saattavat rajoittaa huomattavasti joidenkin käyttökelpoisten tuotteiden saantoja. Nämä ja myöskin muut seikat ·. ovat lisänneet vaihtoehtoisiin isäntiin kohdistuvaa mielenkiintoa, erityisesti tavoitteena on eukarioottisten organismien käyttö polypeptidituotteiden tuottamiseen.
Mikäli käytettävissä olisi keinoja polypeptidituotteiden tuottamiseksi eukarioottisissa järjestelmissä, esimerkiksi hiivoissa, ’ niin tällöin voitaisiin saavuttaa merkittäviä etuja yhdistelmä- DNA:n koodaamien polypeptidien tuotannossa prokarioottisten järjestelmien, kuten E. coli-bakteerin, käyttöön verrattuna. Hiivoja on käytetty vuosisatojen ajan teollisissa käymisprosesseissa, kun taas E.coli-bakteerin käyttö teollisissa käymisprosesseissa on suhteellisen uutta. Hiivoja voidaan kasvattaa tavallisesti * suurempiin solutiheyksiin bakteereihin verrattuna, ja ne voidaan sopeuttaa helposti jatkuviin käymistapahtumiin. Itse asiassa, hiivan, esimerkiksi Pichia pastoris-hiivan kasvattaminen erittäin korkeisiin solutiheyksiin, eli yli 100 g/1 oleviin solutiheyksiin, on julkaistu US-patenttijulkaisussa 4 414 329. Hiiva-isäntien muista eduista mainittakoon se seikka,että tämän 4 . 94426 organismin monet kriittiset toiminnot, esimerkiksi hapettava fosforylaatio, tapahtuvat solussa organellien sisällä, joten ne eivät ole alttiina organismissa tapahtuvan, isäntäsolun villityypille vieraiden polypeptidien tuotannon aiheuttamille, mahdollisille haitallisille vaikutuksille. Eukarioottisena organismina hiiva saattaa kyetä glykosyloimaan ilmentyneet poly-peptidituotteet, mikäli tällainen glykosylointi on tärkeätä tämän polypeptidituotteen bioaktiivisuudelle. Samoin on mahdollista, että eukarioottisena organismina hiivassa esiintyvä kodonien suosituimmuusjärjestys on sama kuin korkeammissakin organismeissa, mikä täten näkyy suuntauksena nisäkkäiden geeneistä tai esimerkiksi nisäkkään mRNA:sta käänteisellä kopioinnilla saadusta täydentävästä DNA:sta (c-DNA) peräisin olevien, ilmentyvien tuotteiden tehokkaampaan tuotantoon.
Huonosti tunnetuista hiivalajeista muodostuvien isäntä/vektori-järjestelmien kehittämistä hidastaa huomattavasti se, ettei käytettävissä ole tietoa muuntamisen olosuhteista eikä sopivista vektoreista. Lisäksi käytettävissä ei ole auksotroofisia mutaatioita, joten muunnettujen organismien auksotroofisen täydentämisen avulla tapahtuva suora valinta on mahdotonta. Jotta yhdistelmä-DNA-tekniikan odotukset saataisiin täytetyiksi, niin uusia isäntä/vektori-järjestelmiä on saatava aikaan, jotka järjestelmät helpottavat DNA:n manipulointia ja joissa järjestelmissä istutettujen DNA-ketjujen ilmentyminen voidaan optimoida siten, että toivottuja polypeptidituotteita on mahdollista tuottaa hallituissa olosuhteissa, saannon ollessa korkea.
Täten tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusia autonomisia replikaatioketjuja (ARS), jotka säilyttävät plasmidit kro-: mosomien ulkopuolisina elementteinä solua kohden saaduissa lukuisissa kopioissa, Pichia-sukuisissa isännissä.
Tämän keksinnön toisena tavoitteena on saada aikaan uusia vektoreita, jotka saadaan säilymään kromosomien ulkopuolisina elementteinä Pichia-sukuisissa isännissä.
ia m i imi i I I e» ; 5 . 94426
Edelleen tämä keksintö kohdistuu uusiin Pichia-suvun hiivakan-toihin.
Tämän keksinnön edellä mainitut ja muut tavoitteet ovat ilmeisiä oheisen kuvauksen ja oheisten patenttivaatimusten perusteella.
Tämän keksinnön mukaisesti sellaisten autonomisten replikaatio-ketjujen, joiden avulla yhdistelmä-DNA-materiaali saadaan säilymään kromosomien ulkopuolisena elementtinä solua kohden saaduissa lukuisissa kopioissa, Pichia-sukuisissa isäntäsoluissa, olemassaolo on todettu, nämä ketjut on eristetty ja niiden tunnusomaiset piirteet selvitetty. Lisäksi keksinnössä saadaan aikaan menetelmä sellaisten DNA-ketjujen, joilla on autonomista repli-koitumisaktiivisuutta Pichia-suvun hiivoissa, eristämiseksi mistä tahansa DNA-lähteestä.
Piirustuksissa kuva 1 on tämän keksinnön mukaisen, autonomisesti replikoituvan ketjun (PARSI) restriktiokartta.
Kuva 2 on tämän keksinnön mukaisen, autonomisesti replikoituvan ketjun (PARS2) restriktiokartta.
Kuva 3 on plasmidin YEpl3 restriktiokartta.
Kuva 4 on plasmidin pYJ8 restriktiokartta.
Kuva 5 on plasmidin pYJ8ACla restriktiokartta.
Kuva 6 on plasmidin pYM4 restriktiokartta.
Kuva 7 on plasmidin pYJ30 restriktiokartta.
Kuva 8 on plasmidin pYJ32 restriktiokartta.
Kuva 9 on plasmidin pYA2 restriktiokartta.
Käytetyistä restriktioentsyymeistä käytetään tässä hakemuksessa seuraavia lyhenteitä: 6 94426
Lyhenne Restriktioentsyymi
A AluI
Ah Ahalll
Av Aval
B BamHI
B2 Bglll C Clal H2 Hindll H3 Hindlll
Mb MboII
Nr NruI
Ps PstI
Pv2 PvuII
Rs RsaI
R^ EcoRI
S Sali
Sm Smal
Sp Sphl
S3 Sau3AI
T Taql
Xh XhoI
Liitteenä olevissa kuvissa DNA:n manipuloimiseen käytetyt restriktiokohdat, jotka tuhoutuvat ligaatiossa, on merkitty : siten, että tuhoutuneen kohdan lyhenne on kirjoitettu sulkui hin. Nukleiinihappojen järjestyksen perusteella oletetut restriktiokohdat, joita ei kuitenkaan ole varmistettu todellisella, restriktioentsyymillä suoritetulla käsittelyllä, on esitetty liittämällä tähän oletettuun restriktiokohtaan tähti.
Tämän keksinnön mukaisesti, siinä saadaan aikaan uusia DNA-kappaleita, jotka sisältävät autonomisia replikaatioketjuja, jotka säilyttävät plasmidit kromosomien ulkopuolisina elementteinä Pichia-sukuisissa isännissä.
Edelleen tämän keksinnön mukaisesti, siinä saadaan aikaan menetelmä DNA-ketjujen, joilla on autonomisen replikoitumisen 94426 7 ominaisuuksia Pichia-sukuisessa isännässä, eristämiseksi mistä tahansa lähteestä.
Isäntäorganismit
Isäntäorganismejä, joiden ajatellaan olevan käyttökelpoisia tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa, ovat mm. Pichia-suvun eri lajit. Käyttökelpoisten isäntien erään luokan muodostavat auksotroofiset mutantit, eli sellaiset mutanttikannat, jotka kasvaakseen edellyttävät sitä, että niiden kasvatusalustaa täydennetään yhdellä tai useammalla aminohapolla, vitamiinilla tai muulla ravintoaineella. Tällaisen mutantin transformantte-ja (muunnoksia) voidaan valita helposti siten, että isäntänä toimivan mutantin muuntamiseen käytetyn yhdistelmä-DNA-materiaa-lin osana käytetään DNA-ketjuja, jotka koodaavat puuttuvan geeni-tuotteen tuotantoa.
Erityisen edullinen, isäntänä toimiva hiivakanta on mutantti Pichia pastoris GS115, jolta mutantilta puuttuu kyky tuottaa histidiiniä, ja jonka mutantin genotyypiksi on tunnistettu his4. GS115 saatiin aikaan geneettisellä mutaatiolla Pichia pastoris-kannasta NRRL Y-11430, ja se on tallennettu kanta-kokoelmaan Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, joten tämä isäntä on yleisön vapaasti käytettävissä, kun tälle hakemukselle myönnetään patenttioikeudet. Pichia pastoris-kannan GS155 tunnusnumerona tässä kantakokoelmassa on NRRL Y-15851, ja tallentaminen tapahtui elokuun 31. päivänä 1984. Tämä erityinen isäntä on käyttökelpoinen, koska se on auksotroofinen mutantti, jossa histidiinireitti on puutteellinen. Alan asiantuntijalle on luonnollisestikin selvää, että myöskin muita mutantteja, jotka ovat muuttuneet monien muiden, Pichia-hiivan aineenvaihdunnalle tärkeiden geenien suhteen, on olemassa tai voidaan eristää. Täten Pichia-hiivan muuntamisessa voidaan myös käyttää monia muitakin isäntiä, mitä rajoittaa ainoastaan sellaisten geenien saatavuus tai kyky eristää sellaisia geenejä, jotka geenit koodaavat sen geenituotteen tuotantoa, joka on puutteellinen isäntänä toimivassa mutantissa.
3 . 94426
Pichia pastoris NRRL Y-15851 on tunnistettu mutantiksi, jossa histidinoli-dehydrogenaasin tuotanto on puutteellista. Tämä tunnistaminen tapahtui mittaamalla nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidin (NAD) pelkistyminen NRRL Y-15851-soluista saadulla proteiiniuutteella histidinoli-dehydrogenaasin substraatin, histidi-nolin läsnäollessa. S. cerevisiae-hiivan yhteydessä käytetyn nimeämisjärjestelmän mukaisesti tätä puutteellista NRRL Y-15851-kantaa kutsutaan his4C-mutantiksi.
Pichia pastoris-hiivan HIS4-geenin eristäminen ja tunnusomaisten piirteiden selvittäminen_ HIS4-geeni eristettiin P.pastoris-kannasta NRRL Y-11430 siten, että koko kromosomaalinen DNA-materiaali pilkottiin osittain entsyymillä Sau3A, jota seurasi sentrifugointi sakkaroosigradient-tien läpi. 5-20 kiloemäsparin kappaleet kloonattiin BamHI-pilk-koutumiskohtaan S. cerevisiae - E. coli-sukkulavektorissa YEp 13 (ATCC 37115; kuva 3), ja siirrettiin E. coli-bakteeriin. Noin 50 000 pesäkettä valittiin ja yhdistettiin, jonka jälkeen koko plasmidi-DNA uutettiin. S. cerevisiae-kannan 5799-4D (NRRL Y-15859), joka on his4ABC-mutantti, sferoplasteja sekoitettiin noin 1 mikrogrammaan YEpl3-Pichia'n DNA-kirjastoon Hinnen'in et ai. (1978) menetelmällä, ja annettiin regeneroitua alustassa, josta 3 puuttui histidiini. Transformaatio johti noin 1 x 10 proto-troofiseen hiivapesäkkeeseen, kun lähdettiin regeneroituvien • 7 • sferoplastien yhteensä 5 x 10 suuruisesta populaatiosta. Ilman DNA:ta inkuboidulla, samanaikaisella vertailunäytteellä ei saatu pesäkkeitä. Hiivan koko DNA uutettiin 20 His+ -pesäkkeestä, ja siirrettiin takaisin E. coli-bakteeriin. 17 hiiva-DNA:n valmistetta tuotti ampisilliinille vastustuskykyisiä pesäkkeitä. Näiden kloonattujen kappaleiden tunnusomaiset piirteet selvitettiin lisäksi entsymaattisella mitoituksella ja kartoituksella, sekä myöskin sillä perusteella, miten ne kykenivät ristikkäishybri-disoitumaan merkityn S. cerevisiae-hiivan HIS4-fragmentin kanssa, lujuuden ollessa alhainen (huuhtelu hybridisaation jälkeen 2 x SSC 55°C:n lämpötilassa). Kukin HIS4:n sisältävä kappale sisälsi yhden tai useamman sellaisen fragmentin, jotka hybridisoi-tuivat S. cerevisiae-hiivan HIS4-geeniin. Eräs tällainen HIS4:n 9 . 94426 sisältävä plasmidi kloonattiin uudestaan, jolloin saatiin HIS4:n sisältämä plasmidi pYJ8, joka on esitetty kuvassa 4. Plasmidi pYJ8 sisältää pBR325-ketjut, kloramfenikolin ja ampi-silliinin vastustuskyvyn toimivat geenit sekä Pichia-hiivan HIS4-geeni mukaan lukien.
Alikloonaamalla 6,0 kiloemäsparin suuruinen, pYJ8-plasmidista saatu Pichia-hiivan DNA-kappale voitiin todeta, että tämän DNA:n 2,7 kiloemäsparin suuruinen kappale säilytti kykynsä transformoida joko sellaisia Pichia- tai Saccharomyces-kantoja, joissa HIS4A-, HIS4B- tai HIS4C-geenin koodaamat aktiivisuudet olivat puutteelliset. Täten, esimerkiksi Pichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115), joka on his-4-mutantti, kykenee kasvamaan sellaisella alustalla, johon ei ole lisätty histidiiniä, mikäli tämä mutantti on transformoitu plasmideilla pYJ30 ja pYJ32 (katso kuvat 7 ja 8, vastaavasti). Nämä kaksi plasmidia, joista kumpikin sisältää 2,7 kiloemäsparin suuruisen, Pichia-hiivan kromosomaalisen DNA:n Bglll-kappaleen, koodaavat kumpikin HIS4-geenin toiminnon.
Toimenpiteet Pichia pastoris-hiivan transformoimiseksi Kokeelliset toimenpiteet Pichia pastoris-hiivan transformoimiseksi esitetään yksityiskohtaisemmin jäljempänä (esimerkki 1).
P. pastoris-hiivan transformoimiseksi soveltuvan järjestelmän • kehittämiseksi auksotroofinen mutantti GS115 (NRRL Y-15851) eristettiin ja sen histidiinireitti todettiin puutteelliseksi siinä suhteessa, ettei kannasta voitu todeta minkäänlaista histidinoli-dehydrogenaasin aktiivisuutta.
Kanta GS115 (NRRL Y-15851) voidaan transformoida soluseinämien .* entsymaattista hajottamista käyttäen, jolloin saadaan sferoplas- teja; tämän jälkeen nämä sferoplastit sekoitetaan transformoivaan yhdistelmä-DNA-materiaaliin ja tätä seosta inkuboidaan kalsiumionien ja polyetyleeniglykolin läsnäollessa, ja annetaan regeneroitua selektiivisellä kasvatusalustalla, josta puuttuu histidiini. Transformoiva DNA-materiaali sisältää HIS4-geenin, . 94426 10 joka puuttuu isäntäkannalta, joten ainoastaan transformoidut solut pysyvät elossa tällä käytetyllä selektiivisellä kasvatus-alustalla .
Pichia pastoris-hiivan autonomisten replikaatioketjujen eristä-minen Tämän keksinnön mukaiset vektorit sisältävät Pichia-hiivasta peräisin olevia autonomisia replikaatioketjuja (PARS), jotka parantavat sekä GS115-kannan (NRRL Y-15851) transformaation esiintymistiheyttä että vektoreiden säilymistä stabiileina, kromosomien ulkopuolisina elementteinä Pichia-suvun hiivoissa.
Nämä autonomiset replikaatioketjut ovat käyttökelpoisia siitä syystä, että S. cerevisiae-hiivasta eristetyt, tunnetut hiivan ARS-elementit eivät toimi Pichia-sukuisissa isännissä. Täten, jotta voitaisiin kehittää sellainen ilmentymisjärjestelmänä toimiva Pichia-hiiva, jota voidaan käyttää polypeptidituottei-den tuottamiseen hiivassa, niin sellaisten DNA-ketjujen eristäminen oli välttämätöntä, joilla DNA-ketjuilla on ARS-aktiivisuutta Pichia-hiivassa.
Pichia-hiivan ARS-ketjujen eristämiseksi Pichia pastoris-hiivan kannasta NRRL Y-15851 peräisin oleva DNA pilkottiin osittain entsyymillä Taql ja 5-10 kiloemäsparin suuruiset kappaleet eristettiin ja kloonattiin plasmidin pYJ8ACla (katso kuva 5) ainoaan Clal-kohtaan. Plasmidi-DNA:n annettiin lisääntyä E. coli-bakteerissa, se otettiin talteen ja sitä käytettiin Pichia pastoris-hiivan NRRL Y-15851-kannan transformoimiseen. Tämän jälkeen plasmidi-DNA otettiin talteen noin 10 000 His+ -Pichia-pesäk-keestä ja sitä käytettiin jälleen E. coli-bakteerin transformoin-tiin. Noin 10 000 ampisilliinille resistentistä (vastustus- kykyisestä) E. coli-bakteerin pesäkkeestä saadut plasmidit eristettiin, jonka jälkeen ne siirrettiin takaisin P. pastoris-hiivan kantaan NRRL Y-15851 (GS115; his4). Tämän His+-hiivan 40 pesäkettä, jotka olivat peräisin tästä alikirjaston muodostavasta transformaatiosta, vedettiin toisistaan erillään selektiiviselle alustalle ja kasvatettiin erillisinä tällä selektiivisellä alustalla. Kustakin näistä 40 viljelmästä uutettiin hiivan 11 . 94426 koko DNA-materiaali, ja se siirrettiin E. coli-bakteeriin. Lisäanalysointia varten valittiin kaksi plasmidia, pYA63, joka sisälsi ketjun PARSI, sekä pYA90, joka sisälsi ketjun PARS2.
Nämä molemmat plasmidit transformoivat Pichia pastoris-hiivaa NRRL Y-15851 (GS115) erittäin suurella esiintymistiheydellä, ne säilyivät autonomisina elementteinä ja kumpikin sisälsi P. pastoris-hiivan uuden DNA-fragmentin.
Nämä uudet, plasmideista pYA63 ja pYA90 saadut autonomiset replikaatioketjut alikloonattiin plasmidin pYM4 (katso kuva 6) ainoaan Clal-kohtaan, jolloin saatiin plasmidit pYJ30 ja pYJ32, vastaavasti. Plasmidi pYJ30 on esitetty yksityiskohtaisesti kuvassa 7, kun taas plasmidi pYJ32 on esitetty samalla tavalla kuvassa 8. Nämä plasmidit, siirrettyinä E. coli-isäntään, on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center of the U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, joten ne ovat vapaasti yleisön käytettävissä, kun tälle hakemukselle myönnetään patenttioikeudet. Tallennetuilla kannoilla on seuraavat tunnusnumerot:
Plasmidi Isäntäkanta NRRL-tunnusnumero pYJ30 LE392 NRRL B-15890 pYJ32 LE392 NRRL B-15891
Pichia pastoris-hiivan autonomisten replikaatioketjujen tunnusomaisten piirteiden selvittäminen_ Tämän keksinnön mukaiset autonomiset replikaatioketjut PARSI ja PARS2 saadaan vaivattomasti talteen plasmideista pYJ30 ja pYJ32, vastaavasti, käsittelemällä plasmideja restriktioentsyymeillä EcoRI ja Hindlll. Toivottu ARS-elementti saadaan tällöin siten, 1·· että sen 5'-päähän (R^-kohdan viereen) on liittynyt noin 23 ylimääräistä emäsparia ja sen 3'-päähän (H^-kohdan viereen) on liittynyt noin 5 ylimääräistä emäsparia. Istutetut PARSI- ja PARS2-kappaleet voidaan luonnollisestikin saada talteen plasmideista pYJ30 ja pYJ32 käsittelemällä näitä plasmideja lukuisilla muilla restriktioentsyymeillä, mikä on ilmeistä alan asiantuntijalle kuvissa 7 ja 8 esitettyjen restriktiokarttojen tarkastelun 12 . 94426 perusteella. Näiden istutettujen PARSI- ja PARS2-kappaleiden tunnusomaiset piirteet on selvitetty restriktioentyymeillä kartoittamalla. Nämä kaksi DNA-kappaletta esitetään kuvissa 1 ja 2, vastaavasti.
Näiden DNA-kappaleiden suhteellisen pienestä koosta johtuen niiden ketjut on saatu täydellisesti selvitetyiksi. Nukleotidien järjestys PARSl-kappaleessa on todettu seuraavaksi:
51-TCGAGATAAG CTGGGGGAAC ATTCGCGAAA ATGAAACAAG
TCGGCTGTTA TAGTATATTT ATTATAATAT TGAAAGATCT
CAAAAGACTA CTTATTTTTG AATGAACCAA GTATGAAATC
AACCTATTTG GGGTTGACCA AAATAAGTAA ATATTAATTG
TCGA-3'
Nukleotidien järjestys PARS2-kappaleessa on todettu seuraavaksi:
5'-TCGAACATAG TCCGTCCCCG GGGGAAGATT TATTGTCTCA
AAAGGTCAAT TTCATATTTT ATATGCATTC AATACTTATT
TATTATTAAT TTAGCTTGAC TACGATGCAT ATAATTTTAA
TTTTATTTTA AATTATATAT GAGGTAAGAG TATAACTCTA
AACCTAATAA ATATATAATT AATTATACGC AATAGTTAAA
. CCATAGATTA ATTACAACTA ATCCTTTCGT ACTAAGTTGT
AATCCTTTAT TGACATTTCC CTAAAGCAGA TAGAAACCAT
: ACTGTCTCAC GACTATTAAA CCCAACTCAC GTAACCTTTT
AATTGACGAA CAGTCAAACC CTTATCAGCG TGTGCTACCA
ATAGGATAGG TTGAGTCGAC ATCGA-3'
Jotta saataisiin määritetyksi se, miten PARS-ketjut kykenevät säilyttämään plasmidit autonomisina elementteinä Pichia-hiivassa, I plasmideilla pYJ30 ja pYJ32 transformoitujen hiivasolujen vil jelmiä kasvatettiin selektiivisellä alustalla ja niistä otettiin näytteitä tietyin väliajoin. Näiden plasmidiketjujen tilat soluissa määritettiin hybridisoimalla hiivan pilkkomattomia DNA-ketjuja Southern'in menetelmällä radioaktiivisesti merkit-tyyn plasmidiin pBR322. Plasmidit pYJ30 ja pYJ32 säilyivät 13 94426 autonomisina elementteinä Pichia-hiivassa vähintään 50 sukupolven ajan selektiivisellä alustalla.
Plasmidin keskimääräinen kopioluku Pichia pastoris-hiivan solua kohden saatiin Pichia-hiivan HIS4-geenin genomikopioiden määrän ja plasmidista peräisin olevan HIS4-geenin genomikopioiden määrän välisestä suhteesta. Plasmideilla pYA63 ja pYJ30 (jotka molemmat sisältävät PARSl-ketjun) sekä plasmideilla pYA90 ja pYJ32 (jotka molemmat sisältävät PARS2-ketjun) transformoitujen Pichia pastoris-hiivan solujen tapauksessa Pichia-hiivan HIS4-geenin sisältävän plasmidi-DNA:n kopioiden keskimääräinen lukumäärä suhteessa Pichia-hiivan kromosomaalisen HIS4-geenin kopioiden lukumäärään oli noin 10-15. Alan asiantuntijalle on selvää, että edellä esitetyllä tavalla saadut kopiolukujen arvot ovat mahdollisimman pieniä arvioita plasmidikopioiden lukumäärästä solua kohden.
Yleisesti ottaen, sellaiset DNA-ketjut, joilla on autonomisen replikaation aktiivisuutta Pichia-sukuisessa isännässä, voidaan eristää transformoimalla Pichia-isäntä vektoriksi muodostetulla, DNA-fragmenttien kirjastolla, joka vektori sisältää muiden DNA-ketjujen ohella merkitsingeenin, mutta joka ei sisällä sellaisia DNA-ketjuja, joilla on ARS-aktiivisuutta Pichia-hiivassa. Tämä käytetty merkitsingeeni saa aikaan valikoitavissa olevan fenotyy-: pin isäntänä käytettyyn hiivakantaan. Se esiintymistiheys, jolla tämä vektori transformoi isäntäkannan, suurenee yhdellä tai useammalla kertaluokalla, kun tässä vektorissa on läsnä sellaisia DNA-ketjuja, joilla on ARS-aktiivisuutta, verrattuna muuntamattomalla vektorilla suoritetun transformoinnin esiintymistiheyteen. Näin ollen transformoidun isännän valikoinnilla ja ·* eristämisellä saadaan aikaan organismeja, jotka sisältävät istutettuja DNA-ketjuja kantavia plasmideja, joilla istutetuilla DNA-ketjuilla on ARS-aktiivisuutta. Tällä tavalla voidaan mistä tahansa lähteestä eristää helposti DNA-ketjuja, joilla on ARS-aktiivisuutta Pichia-hiivassa.
• · 94426 14
Esimerkit
Seuraavissa esimerkeissä käytettyjen puskureiden ja liuosten koostumus on seuraava: 1 M Tris-puskuri 121,1 g Tris-emästä 800 millilitrassa vettä; pH asetetaan toivottuun arvoon lisäämällä tähän seokseen väkevää (35 %) HCl:n vesiliuosta; liuoksen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan ennen pH-arvon lopullista säätämistä; liuos laimennetaan lopulliseen tilavuuteensa, yhdeksi litraksi.
TE-puskuri 1,0 mM EDTA 0,01 M (pH 7,4) Tris-puskurissa.
SSC 0,15 M NaCl, 15 mM natriumsitraatti, pH asete taan arvoon 7,0 NaOH:lla.
Denhardt'in liuos 5 g Ficoll'ia (50 x) 5 g polyvinyylipyrrolidonia 5 g naudan seerumin albumiinia (BSA; Pentax-fraktio V), saatetaan lopulliseen, yhden litran tilavuuteen vedellä.
LB (Luria-Bertani)- alusta 5 g Bacto-tryptonia ; 5 g Bacto-hiivauutetta 2,5 g NaClria 1 litrassa vettä, pH asetettu arvoon 7,5 NaOH:11a YPD-alusta 1 % Bacto-hiivauutetta 2 % Bacto-peptonia 2 % dekstroosia SD-alusta 6,75 g hiivan typpialustaa, joka ei sisällä aminohappoja (DIFCO; Yeast nitrogen base) 2 % dekstroosia yhdessä litrassa vettä 15 . 94426 SED 1 M sorbitoli
25 mM EDTA 50 mM DTT
SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 1,47 g natriumsitraattia 0,168 g EDTA 50 ml H20 pH asetetaan arvoon 5,8 HCl:lla
CaS 1 M sorbitolia 10 mM CaCl2:ia steriloidaan suodattamalla PEG-liuos 20 % polyetyleeniglykolia-3350 10 mM CaCl2 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) steriloidaan suodattamalla SOS 1 M sorbitolia 0,3 x YPD-alustaa 10 mM CaCl2
Kaikissa esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä, joilla on seuraava merkitys: EDTA etyleenidiamiini-tetraetikkahappo SDS natriumdodekyylisulfaatti DTT ditiotreitoli.
Useita koejärjestelyjä toteutettiin rutiininomaisesti tavan-: . omaisilla menetelmillä, jotka esitetään ohessa yksityiskohtai sesti.
Sentrifugoinnit toteutetaan sellaisella pyörimisnopeudella, ja niiden kestäessä sellaisen ajan, että tuloksena saatava supernatantti on kirkasta. Yleisesti ottaen, hiivasolujen sentrifugointi toteutetaan vähintään nopeudella 1500 g, ja se kestää vähintään 5 minuuttia.
94426 16
Nukleiinihappojen uuttamiset fenoli/kloroformi/isoamyylialkoho-liseoksella toteutetaan siten, että nukleiinihappoja sisältävä liuos saatetaan kosketuksiin yhtä suuren tilavuuden kanssa seosta, jossa fenolin, kloroformin ja isoamyylialkoholin tilavuussuhteet ovat 50:48:2, vastaavasti. Kloroformin ja isoamyylialkoholin seoksella toteutettavissa uuttamisissa käsiteltävä liuos saatetaan kosketuksiin yhtä suuren tilavuuden kanssa seosta, jossa kloroformin ja isoamyylialkoholin välinen tilavuussuhde on 48:2.
Kun geelien, suodattimien ja muiden vastaavien kohdalla esitetään, että ne pestään tai upotetaan tiettyyn liuokseen, niin tällöin koko geeli, suodatin tai muu vastaava upotettiin asianmukaiseen astiaan (kulho, malja, ampulli, jne.), jotta geelin, suodattimen tai muun vastaavan koko pinta saatiin kosketuksiin kyseisen liuoksen kanssa.
Nukleiinihappojen etanolisaostukset suoritetaan siten, että ensin, mikäli välttämätöntä, nukleiinihappoja sisältävän liuoksen suolapitoisuus sovitetaan oikeaksi, jonka jälkeen tämä liuos saatetaan kosketuksiin kylmän etanolin kaksi kertaa suuremman tilavuuden kanssa, ja sitten saostuma otetaan talteen sentrifugoimalla.
Esimerkki 1
Pichia pastoris-hiivan transformoimisessa käytetyt toimenpiteet A. Solujen kasvatus 1. Pichia pastoris-hiivan GS115 (NRRL Y-15851) pesäke siirros-tettiin noin 10 millilitraan YPD-alustaa, ja tätä viljelmää . ravisteltiin 30°C:n lämpötilassa 12-20 tunnin ajan.
2. Noin 12-20 tunnin kuluttua, soluliuos laimennettiin siten, että sen optinen tiheys 0DgQ0 oli noin 0,01-0,1, ja soluja pidettiin logaritmisen kasvun vaiheessa YPD-alustassa 30°C:n lämpötilassa noin 6-8 tunnin ajan.
17 94426 3. Noin 6-8 tunnin kuluttua 100 millilitraan YPD-alustaa siir-rostettiin 0,5 ml siemenviljelmää, jonka ODg^Q-arvo oli noin 0. 1.(tai vastaava määrä). Tätä viljelmää ravistettiin 30°C:n lämpötilassa noin 12-20 tunnin ajan.
4. Solut otetaan talteen, kun 0Dg0Q-arvo on noin 0,2-0,3 (eli noin 16-20 tunnin kuluttua) sentrifugoimalla liuosta nopeudella 1500 g 5 minuutin ajan.
B. Sferoplastien valmistus 1. Solut pestään ensin kertaalleen 10 millilitralla steriiliä vettä. (Vaiheissa 1-5 käytetyt sentrifugoinnit suoritetaan nopeudella 1500 g 5 minuutin ajan.) 2. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla juuri valmistettua SED:tä.
3. Solut pestään kahdesti 10 millilitralla steriiliä 1 M sorbitolia.
4. Solut suspendoidaan uudestaan 10 milllilitraan SCE-puskuria.
5. Tähän lisätään 5-10 yul entsyymin Zymolyase 60 000 (Miles Laboratories) liuosta, pitoisuus 4 mg/ml. Soluja inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa noin 30-60 minuutin ajan.
Koska sferoplastien valmistaminen on kriittinen vaihe transfor-' mointimenetelmässä, niin sferoplastien muodostumista tulisi seurata seuraavasti: 100 ^ul solususpensiota lisätään 900 mikro-litraan 5 % SDS:iä ja 900 mikrolitraan 1 M sorbitolia juuri ennen zymolyaasin lisäämistä tai juuri zymolyaasin lisäämisen jälkeen, sekä eri hetkillä inkubointijakson aikana. Inkubointi . pysäytetään sillä hetkellä, jolloin solut hajoavat SDS:ssä, mutta eivät sorbitolissa (tavallisesti 30-60 minuutin pituisen inkuboinnin jälkeen).
6. Sferoplastit pestään kahdesti 10 millilitralla steriiliä 1 M sorbitolia sentrifugoimalla niitä 1000 g:n nopeudella 5-10 minuutin ajan. (Sentrifugoinnin pituus ja nopeus voivat vaihdella; sentrifugointi on riittävää sferoplastien kasauttamiseksi, ιβ 54426 mutta se ei saa olla niin voimakasta, että sferoplastit hajoavat voiman vaikutuksesta.) 7. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla steriiliä CaS-liuosta.
8. Solut suspendoidaan uudestaan yhteensä 0,6 millilitraan CaS-liuosta.
C. Transformointi 1. DNA-näytteet (tilavuudeltaan jopa 20 yUl) lisätään 12 x 75 millimetrin steriileihin, polypropyleenista valmistettuihin putkiin. (DNA:n tulisi olla vedessä tai TE-puskurissa; transformaation mahdollisimman suurien esiintymistiheyksien saavuttamiseksi kuhunkin näytteeseen on suositeltavaa lisätä noin 1 yul sonikoidun E. coli-bakteerin DNA:ta liuoksena, jonka pitoisuus on 5 mg/ml.) 2. Kuhunkin DNA-näytteeseen lisätään 100 ^ul sferoplasteja, ja näytteitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa noin 20 minuuttia.
3. Kuhunkin näytteeseen lisätään 1 ml PEG-liuosta, ja näytteitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan.
4. Näytteitä sentrifugoidaan nopeudella 1000 g 5-10 minuuttia, ja PEG-liuos dekantoidaan.
5. Näytteet suspendoidaan uudestaan 150 mikrolitraan SOS-liuos- * ta, ja niitä inkuboidaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa.
6. Niihin lisätään 850 ^ul steriiliä 1 M sorbitolia, ja pieni määrä näytettä maljataan jäljempänä esitetyllä tavalla.
D. Sferoplastien regenerointi 1. Regenerointiin käytetyn agaralustan valmistusohje: a. Agar-sorbitoli- 9 g Bacto-agaria, 54,6 g sorbitolia, 240 ml vettä, autoklavointi.
b. lOx glukoosi- 20 g dekstroosia, 100 ml vettä, autoklavointi.
c. lOx SC- 6,75 g hiivan typpialustaa (Yeast Nitrogen Base), joka ei sisällä aminohappoja, 100 ml vettä, autoklavointi.
(Tähän lisätään mitä tahansa toivottua aminohappoa tai nukleiini- 19 94426 happoa aina 200 yUl/ml pitoisuuteen saakka, joko ennen autokla-vointia tai sen jälkeen.) d. 30 ml lOx glukoosia ja 30 ml lOx SC:tä lisätään 300 milli-litraan sulaa agar-sorbitoli-liuosta. Tähän lisätään 0,6 ml biotiinia liuoksena, jonka pitoisuus on 0,2 mg/ml sekä mitä tahansa muuta toivottua aminohappoa tai nukleiinihappoa pitoisuudeksi 20 yug/ml. Sulaa regenerointiin soveltuvaa agaria pidetään 55-60°C:n lämpötilassa.
2. Transformointiin käytettyjen näytteiden maljaaminen Kuhunkin maljaan kaadetaan 10 ml regenerointiagaria vähintään 30 minuuttia ennen transformointiin käytettävien näytteiden valmistumista, maljan pohjalle saadaan tällöin agarkerros. Regenerointiagaria lisätään 10 ml putkiin, jotka ovat 45-50°C:n lämpöisessä hauteessa, siinä vaiheessa, jolloin transformointiin käytettävät näytteet ovat SOS-liuoksessa. Edellä kuvatuista, transformointiin käytettävistä näytteistä lisätään pieniä määriä regenerointiagaria sisältäviin putkiin, ja putkien sisältö kaadetaan maljojen pohjalla olevien agarkerrosten päälle. Kustakin näytteestä lisätään tietty määrä 10 millilit-raan sulaa regenerointiagaria, jota pidetään 45-50°C:n lämpötilassa, ja kukin näistä kaadetaan maljaan, jonka pohjalla on 10 ml kiinteätä, kerroksen muodostavaa regeneraatioagaria.
: 3. Sferoplastivalmisteen laadun määrittäminen
Yhdestä näytteestä otetaan 10 ^ul, ja se laimennetaan 100-kertaisesti lisäämällä se 990 mikrolitraan 1 M sorbitolia. Tästä 100-kertaisesta laimennoksesta otetaan 10 ^ul, ja se laimennetaan edelleen 100-kertaisesti lisäämällä se toiseen 990 mikro-litran suuruiseen annokseen 1 M sorbitolia. Molempia laimen- *; noksia otetaan 100 yUl, ja ne maljattiin maljahajotuksena YPD-agarin muodostamalle alustalle, jotta saataisiin selville valmisteeseen jääneiden kokonaisten, sferoplastiksi muuttumatta jääneiden solujen pitoisuus. Kustakin laimennoksesta lisätään 100 ^ul 10 millilitraan regenerointiagaria, johon oli lisätty 40 yug/ml histidiiniä, jolloin regeneroituvien sferoplastien 94426 20 kokonaismäärä saadaan määritetyksi. Tässä transformointiko- 7 keessa hyviksi arvoiksi katsotaan yhteensä 1-3 x 10 regeneroituvaa sferoplastia/ml ja noin 1 x 10"* kokonaista solua/ml.
4. Maljoja inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa 3-5 vuorokautta. Esimerkki II
Pichia pastoris-hiivan autonomisten replikaatioketjujen eristä-minen ja tunnusomaisten piirteiden selvittäminen_ A. Kannat Käytetyt kannat olivat: (a) Pichia pastoris-kanta NRRL Y-11430; (b) Pichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115-his4); sekä (c) E. coli-kanta 848 (F met thi gal T^R ¢80^ hsdR hsdM+).
B. Plasmidit 5. cerevisiae-hiivan HIS4-geenin kappaleiden lähteenä käytettiin plasmidia pYA2 (kuva 9), joka käsittää S. cerevisiae-hiivan HIS4-geenin siinä 9,3 kiloemäksen suuruisessa Pstl-kappaleessa, joka on istutettu plasmidin pBR325 Pstl-kohtaan, ja tämä plasmidi on tallennettu E.coli-isäntään ja se on yleisön saatavana tunnusnumeron NRRL B-15874 perusteella.
Plasmidi pYJACla (kuva 5), joka on plasmidin pYJ8 (kuva 4) johdannainen, saatiin aikaan pilkkomalla pYJ8 entsyymillä Clal, ja ligaatiolla.
C. Alustat
Pichia pastoris-hiivaa kasvatettiin joko YPD-alustalla (rikas alusta) tai IMG-alustalla (vähimmäisvaatimukset täyttävä alusta) . IMG, vähimmäisalusta, muodostuu seuraavista: 1. IM^ suoloista, joiden lopullisena pitoisuutena oli 36,7 mM KH2P04, 22,7 mM (NH4)2S04, 2,0 mM MgS04*7H20, 6,7 mM KC1, 0,7 mM CaCl2-2H20, joista valmistettiin lOx varastoliuos, joka autoklavoitiin; t 21 94426 2. Hivensuoloista, joiden lopullisena pitoisuutena oli 0,2 ^uM CuS04-5H20, 1,25 /UM KI, 4,5 ^uM MnS04*H20, 2,0 yUM NaMo04*2H20, 0. 75 ^uM H3B03, 17,5 ^uM ZnS04*7H20, 44,5 ^uM FeCl3*6H20, ja joista valmistettiin 400x varastoliuos, joka steriloitiin suodattamalla; 3. 0,4 ^ug/ml biotiinia; ja 4. 2 % dekstroosia.
E.coli-bakteeria viljeltiin joko LB-alustalla tai 2B-alustalla (0,2 % NH4P04, 1,2 % Na2HP04, 0,013 % MgS04-7H20, 0,074 % CaCl2*2H20, 1 yug/ml tiamiinia ja 0,4 % dekstroosia), joihin oli lisätty 100 ^ug/ml tryptofaania ja 0,2 % kasaminohappoja.
D. DNA:n eristämiset 1. Hiivan DNA:n valmistaminen suuressa mittakaavassa DNA:n eristäminen sekä Pichia pastoris- että S. cerevisiae-hiivasta toteutettiin siten, että soluja kasvatettiin 100 milli-litrassa minimialustaa, kunnes Ag0Q on 1-2, jonka jälkeen solut otetaan talteen sentrifugoimalla niitä nopeudella 2000 g 5 minuutin ajan. Solut pestiin kertaalleen vedellä, kertaalleen SED-liuoksessa, kertaalleen 1 M sorbitolissa, jonka jälkeen ne suspendoitiin 5 millilitraan 0,1 M Tris-HCl-seosta (pH 7,0), joka on 1 M sorbitolin suhteen. Solut sekoitettiin 50-100 mikro-litraan entsyymin Zymolyase 60 000 (Miles Laboratories) liuosta, : jossa entsyymin pitoisuus oli 4 mg/ml, ja tätä seosta inkuboi- tiin 30°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan soluseinämien hajoittami-seksi. Sitten tätä sferoplastipreparaattia sentrifugoitiin nopeudella 1000 g 5-10 minuutin ajan ja se suspendoitiin lysoin-tipuskuriin (0,1 % SDS, 10 mM Tris-HCl, (pH 7,4), 5 mM EDTA ja 50 mM NaCl). Sekä entsyymiä Proteinase K (Boehringer Mannheim) • että entsyymiä RNase A (Sigma) lisättiin 100 ^ug/ml, ja näitä seoksia inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Proteiinit poistettiin DNAssta sekoittamalla tätä preparaattia varovaisesti yhtä suureen tilavuuteen kloroformia, joka sisälsi iso-amyylialkoholia, ja faasit erotettiin sentrifugoimalla seosta nopeudella 12 000 g 20 minuutin ajan. Ylempi (vesi-)faasi imettiin uuteen putkeen, ja se uutettiin yhtä suurella tilavuudella 94426 22 seosta, joka käsitti fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia. Faasit erotettiin edellä kuvatulla tavalla, ja ylempi faasi laitettiin putkeen, joka sisälsi 2-3 tilavuutta kylmää 100 % etanolia. Näytettä sekoitettiin varovasti, ja DNA otettiin talteen kiertämällä sitä muovisauvan päälle. DNA liuotettiin välittömästi 1 millilitraan TE-puskuria, ja sitä dialysoitiin yön yli 4°C:n lämpötilassa TE-puskurin 100 tilavuutta vastaan.
2. Hiivan DNA:n valmistaminen pienessä mittakaavassa Viiden millilitran suuruisia hiivaviljelmiä kasvatettiin vähim-mäisalustassa niin kauan, kunnes A^qq oli 1-5, ja solut otettiin talteen sentrifugoimalla viljelmiä nopeudella 2000 g 5 minuutin ajan. Solut suspendoitiin 1 millilitraan SED-liuosta, ja ne siirrettiin 1,5 millilitran mikrofuugiputkeen, pestiin kertaalleen 1 M sorbitolilla ja suspendoitiin uudestaan 0,5 millilitraan 0,1 M Tris-HCl-liuosta (pH 7,4), joka on 1 M sorbitolin suhteen. Kuhunkin näytteeseen lisättiin entsyymiä Zymolyase 60 000 (Miles Laboratories; 10 yul liuosta, jonka pitoisuus oli 4 mg/ml), ja soluja inkuboitiin 30-60 minuuttia 30°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen soluja sentrifugoitiin 1 minuutin ajan, suspendoitiin lysointipuskuriin ja inkuboitiin 65-70°C:n lämpötilassa. 15 minuutin kuluttua näytteet sekoitettiin 100 mikrolitraan 5 M kaliumasetaattia, pidettiin jäähau-teessa 15 minuutin ajan, ja niitä sentrifugoitiin 5 minuuttia.
:* Supernatantit dekantoitiin puhtaaseen mikrofuugiputkeen, joka sisälsi 1 ml 100 % etanolia, sekoitettiin ja sentrifugoitiin välittömästi 10 sekuntia. Lopuksi DNA-kasaumia kuivattiin ilmassa 10-15 minuutin ajan ja ne liuotettiin 50 mikrolitraan TE-puskuria .
; 3. E. coli-bakteerin DNA:n eristäminen suuressa mittakaavassa
Suuren mittakaavan (0,5-1 1) plasmidipreparaatteja varten tarkoitettuja E. coli-viljelmiä kasvatettiin 37°C:n lämpötilassa ravistaen niitä 2B-alustassa, jota oli täydennetty edellä kuvatusta, ja käyttäen asianmukaista antibioottia. Plasmidista pBR322 saatuja plasmideja sisältävien solujen tapauksessa vil- * 23 . 94426 jelmiä kasvatettiin niin kauan, että ^550 n°i-n 0,7, jonka ajan kuluttua viljelmiin lisättiin niin paljon kloramfenikolia, että sen pitoisuudeksi saatiin 100 yug/ml, ja solut otettiin talteen 15 tuntia myöhemmin. Kannat, jotka sisälsivät plasmidis-ta pBR325 peräisin olevia plasmideja, siirrostettiin täydennettyyn 2B-alustaan siten, että A^0 oli alussa noin 0,01-0,05, ja niitä inkuboitiin ravistellen 37°C:n lämpötilassa 20-24 tuntia ennen solujen ottamista talteen. Plasmidit eristettiin alka-lisella hajoitusmenetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Birnboim ja Doly (1979).
4. E. coli-bakteerin DNA:n valmistaminen pienessä mittakaavassa Plasmidien eristämiseksi nopeasti ja pienessä mitassa, 2 ml täydennetyssä 2B-alustassa, joka sisälsi antibioottia, olevia viljelmiä kasvatettiin yön yli 37°C:n lämpötilassa ravistaen, ja solut otettiin talteen sentrifugoimalla 1,5 millilitran mikrofuugiputkissa. Plasmidit eristettiin alkalisella hajo-tusmenetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Birnboim ja Doly : (1979) .
E. DNA;n pilkkominen (restriktio) ja kappaleiden eristäminen Restriktioentyymejä saatiin yhtiöistä New England Biolabs ja Bethesda Research Laboratories, ja pilkkomiset toteutettiin tavanomaisilla menetelmillä. Restriktiokartoittaminen toteutettiin vertaamalla toisiinsa sellaisten plasmidien samanaikaisia hajoamisia, joihin plasmideihin oli joko istutettu DNA:ta tai joista tällainen DNA puuttuu. Restriktiokappaleet puhdistettiin eluoimalla ne sähköisesti agaroosigeeleiltä Whatman 3 MM suodatinpaperiliuskoille, joita tuettiin dialyysiputkilla. Kappaleet otettiin talteen näistä papereista ja putkista pesemällä niitä 3-4 kertaa 0,1-0,2 millilitran suuruisilla tilavuuksilla liuosta, joka sisälsi 0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Lopuksi kappaleet uutettiin seoksella, joka käsitti fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia, saostettiin etanolilla ja liuotettiin uudestaan pieneen tilavuuteen TE-puskuria.
94426 24 F. P. pastoris-hiivan autonomisten replikaatioketjujen kirjas- ton muodostaminen E. coli-bakteeriin_
Pichia pastoris-hiivan DNA-pYJ8ZCla-kirjaston muodostamiseksi 50 yug plasmidia pYJ8ACla pilkottiin täydellisesti entsyymillä Clal, ja käsiteltiin vasikan suolistosta peräisin olevalla alka-lisella fosfataasilla DNA-ketjun 5'-päässä olevan fosfaatin poistamiseksi. 100 ^ug Pichia pastoris-hiivan NRRL Y-15851 DNA:ta pilkottiin osittain 20 yksiköllä entsyymiä Taql inkuboi-malla DNA:ta 5 minuuttia 65°C:n lämpötilassa yhteensä 1 milli-litran tilavuudessa. 5-10 kiloemäsparin suuruiset kappaleet valikoitiin kokonsa perusteella eluoimalla ne sähköisesti 0,5 % agaroosigeeliltä (katso esimerkki II, kappale E) . Yksi ^,ug vektoria ja 2 ^ug Pichia-hiivan TaqI-kappaleita sekoitettiin 20 yksikköön T4 DNA-ligaasia (Bethesda Research Laboratories), 200 mikrolitran kokonaistilavuudeksi, ja tätä seosta inkuboi-tiin yön yli 4°C:n lämpötilassa. Ligatoidut DNA-ketjut siirrettiin (transformoitiin) E. coli-bakteeriin lisäämällä koko ligaatioreaktion seos 2 millilitraan asianmukaisia E. coli-bakteerin 848 soluja, ja tätä seosta inkuboitiin 15 minuuttia 0°C:n lämpötilassa. Seosta lämmitettiin 37°C:ssa 5 minuutin ajan, jonka ajan kuluttua siihen lisättiin 40 ml LB-alustaa, ja 37°C:n lämpötilassa tapahtuvaa inkubointia jatkettiin edelleen tunnin ajan. Tämän jälkeen seokseen lisättiin ampisillii-nia kokonaispitoisuudeksi 100 ^ug/ml, ja inkubointia jatkettiin toisen tunnin ajan. Lopuksi soluja sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 3000 g, ne suspendoitiin uudestaan 1 milli-litraan juuri valmistettua LB-alustaa, ja levitettiin samansuuruisina määrinä 10 ml LB-agaria sisältäville maljoille, jossa agar sisälsi 100 ^ug/ml ampisilliinia. Tuloksena olevat, noin 10 000 pesäkettä kaavittiin maljoilta, ja osa soluista t i siirrostettiin 500 millilitraan täydennettyä 2B-alustaa siten, että oli aluksi noin 0,1. Tätä viljelmää kasvatettiin ja plasmidit uutettiin edellä esitetysti.
G. Southern'in hybridisaatiot
Hybridisoinnit toteutettiin Southern'in (1975) kuvaamalla menetelmällä. Suurten tai erittäin kietoutuneiden DNA-molekyylien 94426 25 siirtämiseksi nitroselluloosalle DNA hydrolysoitiin ensin osittain upottamalla agaroosigeelit 10 minuutiksi 0,25 M HClriin ennen alkalilla toteutettavaa denaturointia. S. cerevisiae-hiivan HIS4-geenistä peräisin olevien merkittyjen kappaleiden hybridisoiminen Pichia pastoris-hiivan DNA:hän toteutettiin 42°C:n lämpötilassa käyttäen 50 % formamidia, 6x SSC, 5x Denhardt'in liuosta, 0,1 % SDS-liuosta, 1 mM EDTA, sekä 100 yug/ml denaturoitua sillin sperman DNA:ta. Hybridisoin-nin jälkeiset pesut toteutettiin liuoksilla 2x SSC, 1 mM EDTA, 0. 1 % SDS ja 1,0 % natriumpyrofosfaattia, 55°C:n lämpötilassa.
32 H. P-merkitseminen
Avoimen fosfodiesterisillan luenta ("nick translation") toteutettiin Rigby'n et ai. kuvaamalla menetelmällä (1977).
1. DNA-ketjun järjestyksen selvittäminen DNA-ketjun järjestys selvitettiin Sanger’in et ai. kuvaamalla (1980) dideoksinukleotidiketjun päätemenetelmällä. 1
Pichia-hiivan autonomisten replikaatioketjujen eristäminen Edellä osassa F kuvatulla tavalla muodostettua Pichia-kirjastoa käytettiin Pichia pastoris-hiivan NRRL Y-15851 transformointiin. Plasmidi-DNA:n annettiin lisääntyä E. coli-bakteerissa, otettiin talteen, ja sitä käytettiin Pichia pastoris-hiivan NRRL Y-15851 transformointiin. Tämän jälkeen plasmidi-DNA otettiin talteen noin 10 000 Pichia'n his+ -pesäkkeestä, ja sitä käytettiin E. coli-bakteerin transformoimiseksi uudestaan. Plasmidit noin 10 000 ampisilliinille vastustuskykyisestä E.coli-pesäkkees-tä eristettiin ja ne siirrettiin sitten takaisin P. pastoris-hiivaan NRRL Y-15851 (GS115; his4). Hiivan 40 His+-pesäkettä tästä alikirjaston muodostavasta transformaatiosta levitettiin toisistaan erillään selektiiviselle alustalle ja niitä kasvatettiin toisistaan riippumatta tällä selektiivisellä alustalla. Hiivan koko DNA uutettiin kustakin näistä 40 viljelmästä ja niillä transformoitiin E. coli-bakteereja. Lisäanalysointia varten valittiin kaksi plasmidia, plasmidi pYA63, joka sisältää ketjun PARSI, sekä plasmidi pYA90, joka sisältää ketjun PARS2.
26 54426 Näillä molemmilla plasmideilla toteutetuissa Pichia pastoris-hiivan NRRL Y-15851 (GS115) transformaatioissa transformaation esiintymistiheys oli erittäin korkea, ne molemmat säilyivät autonomisena elementtinä ja kumpikin niistä sisälsi P. pastoris-hiivan uuden DNA-kappaleen.
K. Autonomisten replikaatioketjujen analysointi Pichia pastoris- transformanteista_
Pichia-hiivan ARS-ketjun sisältävien plasmidien kyky säilyä autonomisina elementteinä Pichia pastoris-hiivan soluissa määritettiin seuraavasti: transformantin pesäke otettiin regenerointi-agaria sisältävästä maljasta ja vedettiin SD-alustaa sisältävälle agarmaljalle sekä siirrostettiin nestemäiseen IMG-alus-taan. SD-maljaa inkuboitiin 3 vuorokautta 30°C:n lämpötilassa, jonka ajan kuluttua tältä maljalta otettiin yksi pesäke, se vedettiin toiselle SD-maljalle sekä sitä siirrostettiin toiseen, IMG-alustaa sisältävään pulloon. Tämä toistettiin kolmannen kerran. 3 IMG-viljelmää kasvatettiin 30°C:n lämpötilassa ravis-·' telien, kunnes A^qq oli noin 1-2, jonka jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimalla. DNA uutettiin näistä hiivaviljelmis-tä edellä kuvatusti, erotettiin elektroforeettisesti 0,8 % agaroosigeeleihin 10-15 tunnin ajan käyttäen 30 volttia ja 30 milliampeeria, siirrettiin nitroselluloosalle ja hybridisoi- 32 tiin edellä kuvatusti P-merkittyyn plasmidiin pBR322 tai pBR325. Näyte, joka sisälsi 10 ng E. coli-bakteerista eristettyä plasmidia ja näyte, joka sisälsi 1-2 pg Pichia pastoris-hiivan NRRL Y-15851 (GS115) transformoimatonta DNA:ta, käsiteltiin vertailun vuoksi myöskin elektroforeettisesti koenäyttei-den tavoin.
Kussakin tutkitussa Pichia-hiivan PARS-ketjun sisältävässä plas-midimuunnoksessa merkitty koetin hybridisoitui samalla tavalla kuin E. coli-bakteerista eristetty plasmidi-DNA. Vertailuna, merkityn koettimen todettiin hybridisoituvan Pichia pastoris-hiivasta NRRL Y-15851 (GS115) peräisin olevaan,molekyylipainol-taan suurempaan kromosomaaliseen DNA:hän, kun se oli transformoitu 94426 27 plasmidilla pYJ8ACla (integroitumiseen johtava, transformoiva vektori, jolla ei ole ARS-aktiivisuutta Pichia-hiivassa).
Koetin ei hybridisoitunut DNA:han, joka oli peräisin transfor-moimattomasta hiivasta NRRL Y-15851.
Jotta saataisiin kvantitatiivisempi mitta PARS-ketjujen kyvystä säilyttää plasmidit autonomisina elementteinä Pichia-hiivassa, plasmideilla pYJ30 ja pYJ32 transformoituja hiivasolujen viljelmiä kasvatettiin selektiivisellä alustalla, ja niistä otettiin näytteitä tietyin väliajoin. Plasmidiketjujen tila soluissa määritettiin hybridisoimalla pilkkomaton hiivan DNA Southern'in menetelmällä radioaktiivisesti merkittyyn plasmi-diin pBR322. Plasmidit pYJ30 ja pYJ32 säilyivät Pichia-hiivassa autonomisina elementteinä vähintään 50 sukupolven ajan selektiivisessä alustassa.
L. Plasmidin kopioluvun määrittäminen
Plasmidin keskimääräinen kopioluku P. pastoris-hiivan solua ·' kohden saatiin P. pastoris-hiivan HIS4-geenin genomikopioiden määrän ja plasmidista peräisin olevan HIS4-geenin genomikopioiden määrän välisestä suhteesta. Koska tutkitut kannat sisälsivät Pichia-hiivan HIS4-geeniä kantavia plasmideja, niin DNA:t uutettiin, pilkottiin restriktioendonukleaaseilla, käsiteltiin elektroforeettisesti agaroosigeeliin, siirrettiin nitroselluloo- • 32 sasuodattimelle ja hybridisoitiin P-merkityn, 2,7 kiloemäs- parin suuruisen Bglll-kappaleen kanssa, joka kappale sisälsi Pichia-hiivan HIS4-geenin. Hybridisoinnin jälkeen suoritettujen huuhtelujen jälkeen tällä suodattimena valotettiin rönt-gensädefilmien sarjaa tietyn pituisten ajanjaksojen ajan, ja nämä filmit analysoitiin Beckman DU-8B-spektrofotometrillä, joka oli ohjelmoitu Compuset-moduulilla geeliliuskoja varten. Tulokset on lueteltu seuraavassa taulukossa.
. 94426 28
Taulukko PARS-ketjuja sisältävien Pichia pastoris-hiivojen transformant- tien tunnusomaiset piirteet_
Plasmidi Autonominen Kuva- Sukupolvet Kopio- replikaatio- viite autonomisena luku _ ketju_ _ elementtinä _ pYM4 — 6 pYJ30 PARSI 7 50 13 pYJ32 PARS2 8 50 13
Kirjallisuutta
Birnboim ja Doly (1979) Nucl. Acids Res. Ί_, 1513-1523.
Hinnen et ai. (1978) Proc. Nat. Acad. Sei., USA 75^ 1929-1933. Rigby et ai. (1977) J. Mol. Biol. 113, 237.
Southern (1975) J. Mol. Biol. 9_8, 503-517.
Sanger et ai. (1980) J. Mol. Biol. 143, 161-178.
Claims (9)
1. Pichia pastoriksesta johdettu rekombinantti-DNA-fragmentti, joka käsittää autonomisen replikaatioketjun (PARSI tai PARS2), tunnettu siitä, että mainittu DNA-fragmentti kykenee säilyttämään plasmidin kromosomien ulkopuolisena elementtinä lukuisina kopioina solua kohden Pichia pastorik-sessa, ja siitä, että mainittu DNA-fragmentti parantaa transformoitumisen esiintymistiheyttä, kun Pichia pastoris transformoidaan mainitun DNA-fragmentin sisältävällä vektorilla, verrattuna transformoitumisen siihen esiintymistiheyteen, johon päästään transformoitaessa Pichia pastoris sellaisella vektorilla, joka ei sisällä mainittua DNA-fragmenttia, ja että PARSI:llä ja PARS2:lla on seuraavat DNA-sekvenssit: PARSI 5'-TCGAGATAAG CTGGGGGAAC ATTCGCGAAA ATGAAACAAG TCGGCTGTTA TAGTATATTT ATTATAATAT TGAAAGATCT CAAAAGACTA CTTATTTTTG AATGAACCAA GTATGAAATC AACCTATTTG GGGTTGACCA AAATAAGTAA ATATTAATTG TCGA-3' PARS 2 5'-TCGAACATAG TCCGTCCCCG GGGGAAGATT TATTGTCTCA AAAGGTCAAT TTCATATTTT ATATGCATTC AATACTTATT •·\ TATTATTAAT TTAGCTTGAC TACGATGCAT ATAATTTTAA TTTTATTTTA AATTATATAT GAGGTAAGAG TATAACTCTA AACCTAATAA ATATATAATT AATTATACGC AATAGTTAAA CCATAGATTA ATTACAACTA ATCCTTTCGT ACTAAGTTGT AATCCTTTAT TGACATTTCC CTAAAGCAGA TAGAAACCAT ACTGTCTCAC GACTATTAAA CCCAACTCAC GTAACCTTTT : AATTGACGAA CAGTCAAACC CTTATCAGCG TGTGCTACCA ATAGGATAGG TTGAGTCGAC ATCGA-3'
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että mainittu autonominen replikaatioketju on peräisin hiivasta Pichia pastoris NRRL Y-11430. CM?* 30 ·' '
3. Hybridiplasmidi, joka kykenee transformoimaan Pichia pastoriksen, tunnettu siitä, että mainittu plasmidi käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen autonomisen replikaatioketjun sekä siitä, että mainittu plasmidi säilyy kromosomien ulkopuolisena elementtinä Pichia pastoriksessa.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hybridiplasmidi, tunnettu siitä, että mainitun plasmidin tunnusomaiset piirteet ovat piirustuksissa esitetyn kuvan 7 restriktiokartan mukaiset (pYJ30).
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hybridiplasmidi, tunnet-tu siitä, että mainitun plasmidin tunnusomaiset piirteet ovat piirustuksissa esitetyn kuvan 8 restriktiokartan mukaiset (pYJ32).
6. Pichia pastoriksesta johdettu transformoitu hiivakanta, tunnettu siitä, että se on saatu transformoimalla Pichia pastoris jonkin patenttivaatimuksen 3-5 mukaisella hybridi-plasmidilla.
7. Escherichia coli -bakteeri NRRL B-15890 (LE392-pYJ30).
8. Escherichia coli -bakteeri NRRL B-15891 (LE392-pYJ32).
·· 9. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-fragmentin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: a) Escherichia coli -bakteeria NRRL B-15890 (LE392-pYJ30) viljellään ravintoalustalla; b) viljelmästä saadut solut hajotetaan; ja c) plasmidi, joka on piirustuksissa esitetyn kuvan 7 restriktiokartan mukainen ja jonka koko on 7,1 kbp, (pYJ30) otetaan talteen näistä hajotetuista soluista, tai a) Escherichia coli -bakteeria NRRL B-15891 (LE392-pYJ32) viljellään ravintoalustalla; b) viljelmästä saadut solut hajotetaan; ja ai 94426 c) plasmidi, joka on piirustuksissa esitetyn kuvan 8 re-striktiokartan mukainen ja jonka koko on 7,3 kbp, (pYJ32) otetaan talteen näistä hajotetuista soluista, ja valinnaisesti se käsittää lisäksi seuraavat vaiheet, joissa: d) mainittu plasmidi, joka on piirustuksissa esitetyn kuvan 7 restriktiokartan mukainen ja jonka koko on 7,1 kbp, (pYJ30) pilkotaan jollakin restriktioentsyymien yhdistelmällä, jotka valitaan entsyymeistä EcoRI-Hindlll ja Taql; e) se DNA-fragmentti otetaan talteen, jonka fragmentin tunnusomaiset piirteet ovat piirustuksissa esitetyn kuvan 1 restriktiokartan mukaiset (PARSI), tai d) mainittu plasmidi, joka on piirustuksissa esitetyn kuvan 8 restriktiokartan mukainen ja jonka koko on 7,3 kbp, (pYJ32) pilkotaan jollakin restriktioentsyymien yhdistelmällä, jotka valitaan entsyymeistä EcoRI-Hindlll; Clal-Hindlll ja Taql; e) se DNA-fragmentti otetaan talteen, jonka fragmentin tunnusomaiset piirteet ovat piirustuksissa esitetyn kuvan 2 restriktiokartan mukaiset (PARS2).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/666,577 US4837148A (en) | 1984-10-30 | 1984-10-30 | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
| US66657784 | 1984-10-30 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI854143A0 FI854143A0 (fi) | 1985-10-23 |
| FI854143L FI854143L (fi) | 1986-05-01 |
| FI94426B true FI94426B (fi) | 1995-05-31 |
| FI94426C FI94426C (fi) | 1995-09-11 |
Family
ID=24674597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI854143A FI94426C (fi) | 1984-10-30 | 1985-10-23 | Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4837148A (fi) |
| EP (1) | EP0180899B1 (fi) |
| JP (2) | JPH0795955B2 (fi) |
| AT (1) | ATE71660T1 (fi) |
| AU (1) | AU563860B2 (fi) |
| CA (1) | CA1273882C (fi) |
| DE (1) | DE3585206D1 (fi) |
| DK (1) | DK496185A (fi) |
| ES (1) | ES8609463A1 (fi) |
| FI (1) | FI94426C (fi) |
| GR (1) | GR852607B (fi) |
| IE (1) | IE58216B1 (fi) |
| IL (1) | IL76762A (fi) |
| MX (1) | MX429A (fi) |
| NO (1) | NO177269C (fi) |
| PT (1) | PT81400B (fi) |
| SG (1) | SG43192G (fi) |
| ZA (1) | ZA858183B (fi) |
Families Citing this family (168)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| US4885242A (en) * | 1984-10-30 | 1989-12-05 | Phillips Petroleum Company | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof |
| US4996144A (en) * | 1985-01-25 | 1991-02-26 | Calgene, Inc. | Microassay for detection of DNA and RNA |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| US4818700A (en) * | 1985-10-25 | 1989-04-04 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| IL81817A0 (en) * | 1986-03-14 | 1987-10-20 | Phillips Petroleum Co | Methanol and glucose responsive yeast regulatory regions |
| FR2626584B1 (fr) * | 1988-01-28 | 1990-07-13 | Agronomique Inst Nat Rech | Sequence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procede pour sa preparation |
| IL89992A0 (en) | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
| JP2596466B2 (ja) * | 1990-03-03 | 1997-04-02 | アサヒビール株式会社 | ダニの主要アレルゲンの還伝情報を有するｄｎａおよび該アレルゲンの製造方法 |
| US6197548B1 (en) | 1990-04-02 | 2001-03-06 | Medeva Pharma Limited | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen |
| US5369028A (en) * | 1990-04-03 | 1994-11-29 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same |
| US6440681B1 (en) | 1990-04-03 | 2002-08-27 | Merck & Co., Inc. | Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors |
| US5258302A (en) * | 1990-07-03 | 1993-11-02 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells |
| JPH06500470A (ja) * | 1990-09-04 | 1994-01-20 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生 |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| DK0574402T3 (da) | 1990-11-26 | 1998-05-18 | Chiron Corp | Ekspression af PACE i værtsceller og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| ES2177528T3 (es) * | 1991-04-01 | 2002-12-16 | Merck & Co Inc | Genes que influyen en la actividad proteolitica de pichia y usoso de los mismos. |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
| US5665600A (en) * | 1991-09-18 | 1997-09-09 | Research Corporation Technologies, Inc. | Pichia pastoris linear plasmids and DNA fragments thereof |
| ES2229216T3 (es) * | 1993-03-08 | 2005-04-16 | MERCK & CO., INC. | Composiciones de receptores nicotinicos neurales humanos de acetilcolina y procedimientos que emplean las mismas. |
| AU696922B2 (en) | 1993-04-20 | 1998-09-24 | Merck & Co., Inc. | Human N-methyl-D-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor |
| US5912122A (en) | 1993-06-04 | 1999-06-15 | Sibia Neurosciences, Inc. | Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6 |
| US6001581A (en) | 1993-06-04 | 1999-12-14 | Sibia Neurosciences, Inc. | Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors |
| US5521297A (en) | 1993-06-04 | 1996-05-28 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates | Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors |
| US6638905B2 (en) * | 1993-06-18 | 2003-10-28 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CFR receptor(s) |
| US6495343B1 (en) | 1993-06-18 | 2002-12-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CRF receptor(s) |
| WO1995013299A1 (en) * | 1993-11-08 | 1995-05-18 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same |
| US5629167A (en) | 1994-04-19 | 1997-05-13 | Biocine S.P.A. | Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay |
| US5712249A (en) * | 1994-09-08 | 1998-01-27 | Ciba-Geigy Corporation | Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response |
| US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| NZ296648A (en) * | 1994-10-18 | 2001-05-25 | Corvas Int Inc | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US6485967B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-11-26 | Merck & Co., Inc. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
| AU9120898A (en) | 1997-08-27 | 1999-03-16 | Chiron Corporation | Molecular mimetics of meningococcal b epitopes |
| BR9813930A (pt) | 1997-11-06 | 2006-12-19 | Chiron Spa | antìgeno neisserial |
| WO1999036544A2 (en) | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
| GB9808932D0 (en) | 1998-04-27 | 1998-06-24 | Chiron Spa | Polyepitope carrier protein |
| WO2001031019A2 (en) | 1999-10-29 | 2001-05-03 | Chiron Spa | Neisserial antigenic peptides |
| JP5102414B2 (ja) | 1998-05-01 | 2012-12-19 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 髄膜炎菌抗原および組成物 |
| EP1121437B1 (en) | 1998-10-15 | 2008-02-20 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Metastatic breast and colon cancer regulated genes |
| EP1141331B1 (en) | 1998-12-16 | 2008-09-17 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | HUMAN CYCLIN-DEPENDENT KINASE (hPNQALRE) |
| US6780615B1 (en) | 1998-12-31 | 2004-08-24 | Genway Biotech Inc. | Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system |
| CN100392082C (zh) | 1999-04-30 | 2008-06-04 | 启龙股份公司 | 保守的奈瑟球菌抗原 |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| US7504253B2 (en) * | 1999-06-11 | 2009-03-17 | The Burnham Institute For Medical Research | Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| US6440414B1 (en) * | 1999-10-01 | 2002-08-27 | Amgen Inc. | Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent |
| US6261820B1 (en) * | 1999-10-01 | 2001-07-17 | Amgen Inc. | Fibronolytically active polypeptide |
| AU783767B2 (en) | 1999-10-14 | 2005-12-01 | Takara Bio Usa, Inc. | Anthozoa derived chromophores/fluorophores and methods for using the same |
| US7033776B2 (en) * | 1999-12-17 | 2006-04-25 | Amgen Inc. | Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases |
| DE60134956D1 (de) | 2000-01-10 | 2008-09-04 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Gene differentiell experimiert in brudtkrebs |
| CN1416352B (zh) | 2000-01-17 | 2011-05-25 | 启龙股份公司 | 含有脑膜炎奈瑟球菌b血清群外膜蛋白质的外膜囊(omv)疫苗 |
| US7863020B2 (en) * | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
| US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
| US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| WO2002000879A2 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Glycofi, Inc. | Methods for producing modified glycoproteins |
| US7449308B2 (en) * | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
| WO2002000856A2 (en) | 2000-06-30 | 2002-01-03 | Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology (Vib) | Protein glycosylation modification in pichia pastoris |
| DE60136379D1 (de) * | 2000-07-14 | 2008-12-11 | Archer Daniels Midland Co | Transformationssysteme für flavinogene hefen |
| US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
| EP1328543B1 (en) | 2000-10-27 | 2009-08-12 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b |
| WO2002059337A1 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Georgetown University School Of Medicine | Anti-apoptopic gene scc-s2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| AU2002303262A1 (en) * | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene shinc-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| AU2002303261A1 (en) * | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| WO2002081642A2 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-17 | Georgetown University | Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| AU2002305151A1 (en) * | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| ES2386386T3 (es) | 2001-12-12 | 2012-08-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Inmunización contra Chlamydia trachomatis |
| RU2330067C2 (ru) * | 2001-12-19 | 2008-07-27 | Дзе Юниверсити Оф Чикаго | Полинуклеотид, кодирующий хромо- или флуоресцирующий мутантный полипептид, вектор экспрессии, клетка, способ получения хромо- или флуоресцирующего полипептида, набор для получения хромо- или флуоресцирующего полипептида, применение полипептида и применение полинуклеотида |
| US7244565B2 (en) * | 2002-04-10 | 2007-07-17 | Georgetown University | Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US7138512B2 (en) * | 2002-04-10 | 2006-11-21 | Georgetown University | Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US20060088834A1 (en) * | 2002-04-15 | 2006-04-27 | Gretchen Bain | Matrix analysis of gene expression in cells (magec) |
| US20030228317A1 (en) * | 2002-05-22 | 2003-12-11 | Prafulla Gokhale | Gene BRCC-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| EP1513945A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Restoragen Inc | PROCESS FOR UNIVERSAL ENZYMATIC PRODUCTION OF BIOACTIVE PEPTIDES |
| EP1554302A4 (en) * | 2002-05-24 | 2006-05-03 | Restoragen Inc | DNA RECOMBINATION METHODS AND PRODUCTS FOR HIGH-YIELD PRODUCTION OF POLYPEPTIDES |
| WO2003099854A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
| ATE452137T1 (de) | 2002-05-24 | 2010-01-15 | Restoragen Inc | Verfahren und konstrukte zur expression von clostripain mit hoher ausbeute |
| WO2003099847A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Restoragen, Inc. | Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides |
| IL165717A0 (en) | 2002-06-26 | 2006-01-15 | Flanders Interuniversity Inst | A strain of methylotrophic yeast for producing proteins |
| ATE466875T1 (de) | 2002-11-15 | 2010-05-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Unerwartete oberflächenproteine in neisseria meningitidis |
| US7118901B2 (en) * | 2002-12-18 | 2006-10-10 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Recombinant bovine pancreatic desoxyribonuclease I with high specific activity |
| DE60319333D1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-04-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Hitzelabile Desoxyribonuklease I-Varianten |
| US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
| EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| AU2004263900A1 (en) * | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Methods of protein production in yeast |
| WO2005035569A2 (en) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Kiaa0779, splice variants thereof, and methods of their use |
| DK1684719T3 (da) * | 2003-11-14 | 2012-01-30 | Baxter Int | Alfa-1-antitrypsin-sammensætninger og behandlingsfremgangsmåder, der anvender sådanne sammensætninger |
| SI1704234T1 (sl) * | 2003-11-21 | 2012-08-31 | Nps Pharma Inc | Proizvodnja glukagonu podobnih peptidov 2 in analogov |
| DE602004025192D1 (de) * | 2003-12-05 | 2010-03-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung |
| US8906676B2 (en) | 2004-02-02 | 2014-12-09 | Ambrx, Inc. | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
| EP1737499A4 (en) * | 2004-03-09 | 2009-07-22 | Arriva Pharmaceuticals Inc | TREATMENT OF CHRONIC OBSTRUCTIVE LUNG DISEASE BY INHALATION OF LOW DOSES OF A PROTEASE HEMMER |
| JP4792390B2 (ja) | 2004-03-29 | 2011-10-12 | 株式会社ガルファーマ | 新規ガレクチン９改変体タンパク質及びその用途 |
| JP4755174B2 (ja) | 2004-04-07 | 2011-08-24 | ザ ユニヴァーシティー オヴ シカゴ | 単量体赤色蛍光タンパク質 |
| KR101699142B1 (ko) * | 2004-06-18 | 2017-01-23 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| JP2008507280A (ja) * | 2004-07-21 | 2008-03-13 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 非天然コードアミノ酸を用いた生合成ポリペプチド |
| US20070105768A1 (en) * | 2004-11-10 | 2007-05-10 | Rajiv Nayar | Dry recombinant human alpha 1-antitrypsin formulation |
| SG158148A1 (en) | 2004-12-22 | 2010-01-29 | Ambrx Inc | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| MX2007007591A (es) | 2004-12-22 | 2007-07-25 | Ambrx Inc | Metodos para expresion y purificacion de hormona de crecimiento humano recombinante. |
| CN103520735B (zh) | 2004-12-22 | 2015-11-25 | Ambrx公司 | 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方 |
| CA2590429C (en) * | 2004-12-22 | 2014-10-07 | Ambrx, Inc. | Compositions of aminoacyl-trna synthetase and uses thereof |
| JP2008525473A (ja) | 2004-12-22 | 2008-07-17 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒト成長ホルモン |
| BRPI0609695A2 (pt) | 2005-03-21 | 2011-10-18 | Applera Corp | composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição farmacêutica, e, método para tratar uma doença e uma paciente sofrendo uma terapia |
| EP3683230A1 (en) | 2005-05-12 | 2020-07-22 | ZymoGenetics, Inc. | Compositions and methods for modulating immune responses |
| JP2008541769A (ja) * | 2005-06-03 | 2008-11-27 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 改善されたヒトインターフェロン分子及びそれらの使用 |
| CN102703446B (zh) * | 2005-08-18 | 2014-05-28 | Ambrx公司 | tRNA组合物和其用途 |
| CA2621344C (en) * | 2005-09-14 | 2014-12-16 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin |
| WO2007053732A2 (en) | 2005-11-01 | 2007-05-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Promoter polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods |
| PL1954710T3 (pl) * | 2005-11-08 | 2011-09-30 | Ambrx Inc | Przyspieszacze do modyfikacji aminokwasów niewystępujących w przyrodzie i polipeptydów zbudowanych z aminokwasów nie występujących w przyrodzie |
| PT2339014E (pt) * | 2005-11-16 | 2015-10-13 | Ambrx Inc | Métodos e composições compreendendo aminoácidos não-naturais |
| CA2882445A1 (en) * | 2005-12-14 | 2007-06-21 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| US20110206692A1 (en) | 2006-06-09 | 2011-08-25 | Novartis Ag | Conformers of bacterial adhesins |
| ES2465473T3 (es) * | 2006-09-08 | 2014-06-05 | Ambrx, Inc. | Transcripción de arnt supresor en células de vertebrado |
| KR20090060294A (ko) * | 2006-09-08 | 2009-06-11 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 인간 혈장 폴리펩티드 또는 Ｆｃ 스캐폴드 및 그의 용도 |
| WO2008030613A2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Ambrx, Inc. | Hybrid suppressor trna for vertebrate cells |
| US7985783B2 (en) | 2006-09-21 | 2011-07-26 | The Regents Of The University Of California | Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification |
| CN104163864B (zh) | 2007-03-30 | 2017-08-01 | Ambrx公司 | 经修饰fgf‑21多肽和其用途 |
| US8026083B2 (en) | 2007-04-03 | 2011-09-27 | Oxyrane Uk Limited | Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris HAC1 nucleic acids |
| AU2008247815B2 (en) * | 2007-05-02 | 2012-09-06 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| EP3241846B1 (en) | 2007-10-04 | 2022-02-23 | ZymoGenetics, Inc. | B7 family member zb7h6 and related compositions and methods |
| US8679749B2 (en) * | 2007-11-01 | 2014-03-25 | The University Of Chicago | Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation |
| JP5547083B2 (ja) * | 2007-11-20 | 2014-07-09 | アンブルックス，インコーポレイテッド | 修飾されたインスリンポリペプチドおよびそれらの使用 |
| WO2009073511A2 (en) * | 2007-11-30 | 2009-06-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods |
| CN103694337B (zh) | 2008-02-08 | 2016-03-02 | Ambrx公司 | 经修饰瘦素多肽和其用途 |
| JP5647009B2 (ja) | 2008-03-03 | 2014-12-24 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 酵母を形質転換するための方法 |
| UA118536C2 (uk) * | 2008-07-23 | 2019-02-11 | Амбркс, Інк. | Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування |
| KR101647164B1 (ko) | 2008-09-26 | 2016-08-09 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| NZ607477A (en) | 2008-09-26 | 2014-09-26 | Ambrx Inc | Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines |
| ITMI20090946A1 (it) | 2009-05-28 | 2010-11-29 | Novartis Ag | Espressione di proteine ricombinanti |
| CA2775938C (en) | 2009-09-29 | 2021-08-10 | Oxyrane Uk Limited | Hydrolysis of mannose-1-phospho-6-mannose linkage to phospho-6-mannose |
| JP2013511272A (ja) | 2009-11-19 | 2013-04-04 | オキシレイン ユーケー リミテッド | 哺乳類様複合ｎ−グリカンを生成する酵母株 |
| CN107056929A (zh) | 2009-12-21 | 2017-08-18 | Ambrx 公司 | 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途 |
| CN107674121A (zh) | 2009-12-21 | 2018-02-09 | Ambrx 公司 | 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途 |
| FR2954349A1 (fr) | 2009-12-22 | 2011-06-24 | Agronomique Inst Nat Rech | Sulfatase modifiant selectivement les glycosaminoglycanes |
| US8617856B2 (en) * | 2010-01-07 | 2013-12-31 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Fatty acid-producing hosts |
| US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
| MX346786B (es) | 2010-08-17 | 2017-03-31 | Ambrx Inc | Polipeptidos de relaxina modificados y sus usos. |
| AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
| EP2622088A2 (en) | 2010-09-29 | 2013-08-07 | Oxyrane UK Limited | Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins |
| CN103261432A (zh) | 2010-09-29 | 2013-08-21 | 奥克西雷恩英国有限公司 | 磷酸化的n-聚糖的脱甘露糖基化 |
| KR20190114003A (ko) | 2012-03-15 | 2019-10-08 | 옥시레인 유케이 리미티드 | 폼페병의 치료를 위한 방법 및 물질 |
| US20140073022A1 (en) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Production of polyhydroxyalkanoates with a defined composition from an unrelated carbon source |
| WO2014131056A1 (en) | 2013-02-25 | 2014-08-28 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Pan-yeast autonomously replicating sequence |
| WO2014136065A2 (en) | 2013-03-05 | 2014-09-12 | Oxyrane Uk Limited | Production of catalytically active type i sulfatase |
| CN105143243B (zh) | 2013-03-21 | 2020-03-13 | 国家科学和工业研究组织 | 三螺旋蛋白的纯化 |
| KR102384622B1 (ko) | 2013-09-09 | 2022-04-11 | 에보닉 오퍼레이션스 게엠베하 | 변형된 세균 콜라겐-유사 단백질 |
| US9708630B1 (en) | 2013-10-08 | 2017-07-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Cells and methods for producing fatty alcohols |
| PL3412302T3 (pl) | 2014-10-24 | 2021-11-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Zmodyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowania |
| US9920102B2 (en) | 2015-05-15 | 2018-03-20 | Albert Einstein College Of Medicine, Inc. | Fusion tags for protein expression |
| US10301653B2 (en) | 2015-07-06 | 2019-05-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microorganisms that co-consume glucose with non-glucose carbohydrates and methods of use |
| US10421951B2 (en) | 2016-06-22 | 2019-09-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Gene construct encoding mutant thioesterase, mutant thioesterase encoded thereby, transformed host cell containing the gene construct, and method of using them to produce medium-chain fatty acids |
| CN110637027B (zh) | 2017-02-08 | 2024-08-30 | 百时美施贵宝公司 | 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途 |
| WO2019084319A1 (en) | 2017-10-25 | 2019-05-02 | The Regents Of The University Of California | ANTIBODIES AGAINST CDCP1 FOR THE TREATMENT AND DETECTION OF CANCER |
| CN111378585B (zh) * | 2018-12-28 | 2023-06-16 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株 |
| EP4153765A1 (en) | 2020-05-20 | 2023-03-29 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Cells and methods for producing methyl ketones |
| US20240218383A1 (en) | 2021-05-12 | 2024-07-04 | Circular Industries Holding Pte Ltd. | Recombinant yeasts for producing acetone and/or isopropanol from fatty acid feedstocks |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2441659A1 (fr) * | 1978-11-14 | 1980-06-13 | Anvar | Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant |
| US4354535A (en) * | 1980-04-21 | 1982-10-19 | Powell Robert Y | Hand-held automatic wire binding tool |
| US4617274A (en) * | 1981-10-29 | 1986-10-14 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
| JP2608540B2 (ja) * | 1982-05-19 | 1997-05-07 | ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ | クルイベロミセス種のためのクローニング系 |
| US4628033A (en) * | 1983-10-06 | 1986-12-09 | Pfizer Inc. | Novel host strain for transformation of Yarrowia lipolytica |
-
1984
- 1984-10-30 US US06/666,577 patent/US4837148A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-08-06 CA CA488180A patent/CA1273882C/en not_active Expired
- 1985-10-08 IE IE247285A patent/IE58216B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-16 AU AU48757/85A patent/AU563860B2/en not_active Expired
- 1985-10-20 IL IL76762A patent/IL76762A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-10-23 FI FI854143A patent/FI94426C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-10-24 ZA ZA858183A patent/ZA858183B/xx unknown
- 1985-10-29 DE DE8585113735T patent/DE3585206D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-29 DK DK496185A patent/DK496185A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-10-29 MX MX42985A patent/MX429A/es unknown
- 1985-10-29 AT AT85113735T patent/ATE71660T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-10-29 ES ES548304A patent/ES8609463A1/es not_active Expired
- 1985-10-29 EP EP85113735A patent/EP0180899B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-29 GR GR852607A patent/GR852607B/el unknown
- 1985-10-30 NO NO854332A patent/NO177269C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-10-30 JP JP60243781A patent/JPH0795955B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-30 PT PT81400A patent/PT81400B/pt not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-04-21 SG SG43192A patent/SG43192G/en unknown
-
1993
- 1993-06-30 JP JP5162611A patent/JP2552809B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE58216B1 (en) | 1993-08-11 |
| JPH0686680A (ja) | 1994-03-29 |
| DE3585206D1 (de) | 1992-02-27 |
| NO177269C (no) | 1995-08-16 |
| IL76762A0 (en) | 1986-02-28 |
| JPS61108390A (ja) | 1986-05-27 |
| PT81400A (en) | 1985-11-01 |
| FI854143L (fi) | 1986-05-01 |
| ATE71660T1 (de) | 1992-02-15 |
| EP0180899A2 (en) | 1986-05-14 |
| DK496185A (da) | 1986-05-01 |
| EP0180899B1 (en) | 1992-01-15 |
| IE852472L (en) | 1986-04-30 |
| FI854143A0 (fi) | 1985-10-23 |
| PT81400B (pt) | 1987-11-11 |
| NO177269B (no) | 1995-05-08 |
| US4837148A (en) | 1989-06-06 |
| MX429A (es) | 1993-11-01 |
| IL76762A (en) | 1991-08-16 |
| AU4875785A (en) | 1986-06-12 |
| CA1273882A (en) | 1990-09-11 |
| FI94426C (fi) | 1995-09-11 |
| EP0180899A3 (en) | 1987-09-23 |
| GR852607B (fi) | 1986-03-04 |
| AU563860B2 (en) | 1987-07-23 |
| DK496185D0 (da) | 1985-10-29 |
| ZA858183B (en) | 1987-03-25 |
| SG43192G (en) | 1992-06-12 |
| NO854332L (no) | 1986-05-02 |
| ES8609463A1 (es) | 1986-07-16 |
| CA1273882C (en) | 1990-09-11 |
| JP2552809B2 (ja) | 1996-11-13 |
| ES548304A0 (es) | 1986-07-16 |
| JPH0795955B2 (ja) | 1995-10-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI94426B (fi) | Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille | |
| CA1340733C (en) | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast | |
| FI98931C (fi) | Menetelmä polypeptidien korkeatasoiseksi ilmentämiseksi Pichia-suvun hiivassa | |
| US4885242A (en) | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof | |
| US4808537A (en) | Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use | |
| FI104497B (fi) | DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta | |
| EP0495208B1 (en) | Pichia pastoris acid phosphatase gene | |
| GB2100737A (en) | A process for the production of a polypeptide | |
| JP2614314B2 (ja) | メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびｐｒｅＳ▲下２▼タンパク質の発現 | |
| KR20010023688A (ko) | 효모에서 폴리펩티드를 생산하는 발현 벡터 | |
| JP2003509024A (ja) | ピチア・メタノリカグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２プロモーター及びターミネーター | |
| JPH02303497A (ja) | サケ成長ホルモンのピキア属メチロトローフ酵母での発現 | |
| IE940005L (en) | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region | |
| JPH066060B2 (ja) | 新規なプロモ−タ− |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC. |
|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC. |
|
| MA | Patent expired |