JPH0686680A - 自律複製配列を有するｄｎａ断片、同断片を含有するハイブリッドプラスミド、同ハイブリッドプラスミドにより形質転換した大腸菌及び当該ｄｎａ断片の製造方法 - Google Patents

自律複製配列を有するｄｎａ断片、同断片を含有するハイブリッドプラスミド、同ハイブリッドプラスミドにより形質転換した大腸菌及び当該ｄｎａ断片の製造方法

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JPH0686680A
JPH0686680A JP5162611A JP16261193A JPH0686680A JP H0686680 A JPH0686680 A JP H0686680A JP 5162611 A JP5162611 A JP 5162611A JP 16261193 A JP16261193 A JP 16261193A JP H0686680 A JPH0686680 A JP H0686680A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ピキア属に属する宿主酵母で自律複製配列活
性を有するＤＮＡ断片、同ＤＮＡ断片を含有するハイブ
リッドプラスミド及び同プラスミドで形質転換された宿
主の提供 【構成】 下記選択図に示す制限酵素地図を有すること
を特徴とするＤＮＡ断片を分離し、これをプラスミドの
ＤＮＡ中に挿入し、得られたハイブリッドプラスミドを
用いてピキア属に属する酵母菌株を形質転換する。 【効果】 形質転換菌株中でのコピー数の多いプラスミ
ドが得られる。かくして所望のポリペプチドが発現され
ることとなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は組換ＤＮＡについての
技術分野に関する。この発明の一つの側面は、ピキア
（Ｐｉｃｈｉａ）属の宿主において染色体外要素として
保持されるＤＮＡ断片に関する。この発明の他の側面
は、上述のＤＮＡ断片を組み込んだベクターの発現に関
する。更にもう一つのこの発明の側面は、上述の発現ベ
クターで形質転換した新規な微生物に関するものであ
る。
【０００２】
【関連技術】組換ＤＮＡ技術において使用される基本的
な技術は当業者には既知のことである。組換ＤＮＡ技術
の実施に必要な宿主微生物に望まれる要素としては次の
ものがあるが、これのみに限定されるわけではない。 （１）ひとつ以上の所望のポリペプチドの遺伝情報を暗
号化して居り、かつ宿主微生物中で発現するに必要とさ
れる適切な調節配列を有していること。 （２）ベクター、通常はプラスミドであるが、その中に
調節配列を挿入できること。このベクターは細胞中への
遺伝子の導入を可能にし、細胞中でＤＮＡ配列を保持す
るのに役立つ。そのベクター中に自律複製配列が含まれ
ている場合は、細胞あたり当該ベクターの多数のコピー
が得られ、上述の遺伝子の発現も高水準となる。 （３）適切なる宿主微生物で、かつこの宿主は所望の遺
伝子を有するベクターで形質転換することができ、また
その宿主微生物は挿入された遺伝子により暗号化されて
いる情報の発現を許す細胞質の器具を有していること。
【０００３】組換ＤＮＡ技術に使用される基本的要素は
プラスミドであり、染色体外で、二重鎖のＤＮＡで、あ
る種の微生物内で見出されたものである。天然に微生物
中に存在するとして見出されたプラスミドの場合、細胞
１個あたり多数のコピーがしばしば存在することが見出
されている。天然に存在するプラスミドに加えて、種々
の人工プラスミドやハイブリッドベクターも作成されて
いる。プラスミドＤＮＡ中に暗号化されている情報中に
含まれているもので、娘細胞中でプラスミドを再生する
ときに必要とされるもの、それは自律複製配列である。
一つ又はそれ以上の遺伝子表現型の選抜特性が、プラス
ミドＤＮＡ中に暗号化されている情報中に含まれていな
ければならない。この遺伝子表現型の選抜特性は、選抜
培地中で細胞の優先的成育により区別され、選抜されう
る利益を有する当該プラスミドを含有する宿主細胞のク
ローン化を可能とする。
【０００４】プラスミドの利用性は、一種又は他の種類
の制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素、いずれも当該
プラスミド上に定まった特異的切断部位を認識するので
あるが、その酵素により特定の個所で切断されるという
事実に存する。切断した後、同属、又は宿主以外の微生
物由来の外来性の、遺伝子、あるいは遺伝子断片を、切
断部位又は切断部位に隣接し再構築された部位で、切断
されたプラスミドと所望の遺伝子材料との末端を結合さ
せることにより挿入する。生成した組換ＤＮＡはハイブ
リッドベクターと称することもできる。ＤＮＡ組換は宿
主微生物の菌体外で行なわれる。生成したハイブリッド
ベクターは形質転換として知られている過程により宿主
微生物へと導入される。形質転換された微生物を成育さ
せることにより大量のハイブリッドベクターを得ること
ができる。遺伝子がそのＤＮＡ中に暗号化されている情
報の転写及び翻訳をつかさどるプラスミド中の場所に関
して正しく挿入された場合は、生成したハイブリッドベ
クターは挿入遺伝子をコード化したポリペプタイド配列
の生産を指示するために使用することができる。ポリペ
プチドのこの方法による生産を遺伝子発現という。
【０００５】現在まで、種々のポリペプチドを生産する
ために組換ＤＮＡ技術を商業的に使用しようとする試み
は宿主生物として大腸菌を用いるものに集中している。
しかし、ある場合には大腸菌は宿主として適切でないと
いうことが判明している。例えば、大腸菌は医薬品とし
て有用なポリペプチドから除外しなければならない有害
な発熱因子を多数含有している。この精製が良好に実施
されるための効率は、勿論、特定のポリペプチドにより
異なる。更に、大腸菌の蛋白分解能がある種の有用な製
品の収率を著しく制限する。これら及びその他の点を配
慮し、代替宿主、特にポリペプチドの生産のために真核
生物を使用することに興味の対象が移りつつある。
【０００６】真核系すなわち酵母におけるポリペプチド
製品の生産の手段が存在することは、組換ＤＮＡにより
暗号化されたポリペプチドの生産に大腸菌などの原核系
を使用することと比較して、顕著な利点を提供できるこ
ととなった。酵母は、大腸菌の大規模醗酵が比較的最近
になり到来したのに比し、数世紀にもわたり大規模醗酵
に使用されてきている。酵母は、細菌に比較して一般的
に高い菌体濃度でも成長でき、連続醗酵工程にも応用さ
れている。事実、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母は、極めて高い細胞濃
度、すなわち１００ｇ／ｌを越える細胞濃度でも成育で
きることが米国特許第４，４１４，３２９号（フィリッ
プス石油（株）所有）にウェグナーにより開示されてい
る。酵母宿主の別の利点の中には、生物の多くの臨界的
機能、例えば酸化的リン酸化反応が細胞機関の中に存在
するので、そのため野性型の宿主細胞にとっては異物で
あるポリペプチドの当該生物による生産により、場合に
よっては起りうる恐ろしい作用にさらされることがない
という事実も含んでいる。真核生物として、酵母は発現
されたポリペプチド生産物をグルコース附加ができ、そ
のグルコース附加はポリペプチド生産物の生物活性にと
っては重要である。真核生物として酵母は高等生物と同
様のコードン優位性を示し、哺乳動物の遺伝子又は例え
ば哺乳動物のｍＲＮＡからの逆転写により得られた相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）由来の発現製品の効率的生産へと
向うこともまた可能である。
【０００７】充分に特性が明らかにはされていない酵母
類の宿主／ベクター系としての開発は形質転換条件につ
いての知識の欠如と適用なベクターが存在していないこ
とによりずいぶんと妨害された。更に、栄養要求突然変
異株はしばしば入手出来なく、このため栄養要求的補体
により形質転換体を直接選抜することを不可能としてい
る。もしも、組換ＤＮＡ技術が充分にその約束をはたせ
たら、ＤＮＡの操作を可能とし挿入したＤＮＡ配列の発
現を適正化し、その結果、所望のポリペプチド製品が制
御された条件下で、かつ、高収率で調製出来ることとな
る新しい宿主／ベクター系が発明されるにちがいない。
【０００８】
【発明の開示】この発明により、本発明者は、染色体外
要素として組換ＤＮＡ材料を１細胞あたり多数コピー保
持することを助ける自律複製配列の発見、分離及び特性
を明らかにした。その給源を問わずピキア属の酵母中で
自律複製する能力を有するＤＮＡ配列を提供するもので
ある。この明細書中では次の略号で使用した制限酵素を
表わした。
【０００９】
【表１】省略記号 制限酵素 Ａ ＡｌｕＩ Ａｈ ＡｈａＩＩＩ Ａｖ ＡｖａＩ Ｂ ＢａｍＨＩ Ｂ2 ＢｇｌＩＩ Ｃ ＣｌａＩ Ｈ2 ＨｉｎｄＩＩ Ｈ3 ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍｂ ＭｂｏＩＩ Ｎｒ ＮｒｕＩ Ｐｓ ＰｓｔＩ Ｐｖ2 ＰｖｕＩＩ Ｒｓ ＲｓａＩ Ｒ1 ＥｃｏＲＩ Ｓ ＳａｌＩ Ｓｍ ＳｍａＩ Ｓｐ ＳｐｈＩ Ｓ3 Ｓａｕ３ＡＩ Ｔ ＴａｑＩ Ｘｈ ＸｈｏＩ
【００１０】添付した図面の中で、ＤＮＡの操作に使用
した制限部位でリゲーションの際破壊したところは、破
壊部位に対応する省略記号をカッコで囲んで表示した。
核酸配列により予測しうる制限部位ではあるが、実際の
制限酵素処理により立証されていない個所は、星印を当
該制限部位につけて表示した。
【００１１】この発明は、ピキア属の宿主中で染色体外
要素としてプラスミドを保持する、自律複製配列を含む
新規なＤＮＡ断片を提供するものである。更にこの発明
は、ピキア属の宿主中で自律複製力を有するＤＮＡの配
列を、給源のいかんをとわず、分離する方法を提供する
ものである。この発明の実施に使用することのできる宿
主生物はピキア属に属する様々な種を含む。有用な宿主
のグループとしては栄養要求性の突然変異株である。す
なわち、成長のために一つ以上のアミノ酸、ビタミン又
は他の栄養素を補充する必要のある変異株である。この
ような変異株の形質転換体は、変異株宿主の形質転換に
使用する組換ＤＮＡ材料の一部として、失われた遺伝子
製品の生産を暗号化しているＤＮＡ配列を使用すること
により選抜できる。
【００１２】最も好ましい宿主酵母は変異株ピキア パ
ストリスＧＳ−１１５株であり、これはヒスチジンを生
産する能力を欠く変異株で、変異株遺伝子型ｈｉｓ４を
有していると同定されている。ＧＳ−１１５株はピキア
パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０より誘導化され
たもので、この発明が特許されたとき公衆が自由に入手
出来ることを確実とするため米国イリノイ州ペオリア市
にある米国農務省の北方地区研究センター（Ｎｏｔｈｅ
ｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅ
ｒ）に寄託している。ピキア パストリスＧＳ−１１５
株には１９８４年８月３１日現在、ＮＲＲＬ Ｙ１５８
５１の寄託番号が付されている。この特異な宿主は、ヒ
スチジン代謝経路における欠陥を有する栄養要求性変異
株であるので、有用である。勿論、当業者にとってはピ
キアの代謝経路において重要な他の多くの遺伝子に関し
ての変異株が存在し、また分離することができることは
容易に認めうるところである。それ故、他の多くの宿主
がピキア属の形質転換体として（使用）可能であり、変
異株宿主が欠損している遺伝子製品の生産を暗号化して
いる遺伝子が入手可能であるか、その遺伝子を分離する
能力を有しているかにより制限されるにすぎない。
【００１３】ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８
５１はヒスチジノール脱水素酵素の生産能を欠く変異株
であると同定されている。この同定は、ヒスチジノール
脱水素酵素の基質、ヒスチジノールの存在下でＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１の細胞からの蛋白抽出物でニコチン酸
アミド アデニン ジヌクレオチド（ＮＡＤ）の還元を
測定することにより達成された。エス・セレビシエ
（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に使用されている命名
法にちなんで、ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１における欠損
をｈｉｓ４Ｃ変異と称する。
【００１４】ピ・パストリスＮＲＲＬ Ｙ １１３４０
株から全染色体ＤＮＡのＳａｕ３Ａによる一部消化及び
引き続いての蔗糖濃度勾配遠心法によるＨＩＳ４遺伝子
の分離を行なった。エス・セレビシエ−大腸菌シャトル
ベクターＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５；図２参照）
のＢａｍＨＩ切断部位に、５ないし２０Ｋｂｐの断片を
クローン化し、大腸菌を形質転換した。約５３のコロニ
ーを選抜、一緒にし、全プラスミドＤＮＡを抽出した。
エス・セレビシエ ５７９９−４Ｄ株（ＮＲＲＬ Ｙ−
１５８５９）、ｈｉｓ４ＡＢＣ変異株のスフェロプラス
トを約１μｇのヒンネン等の方法によるＹＥｐ１３ピキ
アＤＮＡライブラリーと混合し、ヒスチジン欠損培地で
再生させた。全再生スフェロプラスト ５×１０7 個か
ら、形質転換体としては、約１×１０3 コロニーの原栄
養性酵母が得られた。ＤＮＡなしで培養した比較対照サ
ンプルではコロニーの発生はなかった。２０のＨｉｓ+
コロニーから全酵母ＤＮＡを抽出し、大腸菌を逆形質転
換させた。１７の酵母ＤＮＡ調製物がアンピシリン抵抗
性コロニーを形成した。これらのクローン化された断片
は制限酵素（切断物の）大きさ及び地図化並びに比較的
厳格でない条件下で標識されたエス・セレビシエＨＩＳ
４断片とクロスハイブリダイゼーション（ポストハイブ
リダイゼーション洗浄は５５℃でＳＳＣで２回実施）能
により更に特性が明らかとされた。このＨＩＳ４含有断
片はそれぞれが１つ以上のエス・セレビシエＨＩＳ４遺
伝子とハイブリッド化した断片を含有していた。そのう
ちの１つのＨＩＳ４含有プラスミドを再びクローン化し
て、ｐＹＪ８と命名したＨＩＳ４含有プラスミドがえら
れたが、それは図４に示している。プラスミドｐＹＪ８
はｐＢＲ３２５配列を含有し、この配列はクロラムフェ
ニコール及びアンピシリン抵抗性遺伝子と更にピキアＨ
ＩＳ４遺伝子を含んでいる。
【００１５】ｐＹＪ８からの６．０ＫｂｐピキアＤＮＡ
断片をサブクローン化することにより、この２．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片はピキア又はサッカロミセスをＨＩＳ４
Ａ、ＨＩＳ４Ｂ又はＨＩＳ４Ｃ遺伝子を暗号化させた活
性に欠損を持つ菌株に形質転換する能力を保有している
ことが判明した。それ故、例えばｈｉｓ４変異株である
ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ−
１１５）株は、プラスミドｐＹＪ３０及びｐＹＪ３２で
形質転換するとヒスチジンの添加されていない培地中で
も成育できる。（図６及び図７参照）。これらの二つの
プラスミドは、ピキア染色体ＤＮＡの２．７Ｋｂｐ Ｂ
ｇｌＩＩ断片をそれぞれ含有し、ともにＨＩＳ４遺伝子
機能を暗号化して保有している。
【００１６】ピキア パストリアの形質転換操作の実験
的操作は詳細に以下に述べる（実施例Ｉ）。ピー・パス
トリアの形質転換系の開発のために、栄養要求性変異株
ＧＳ−１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）を分離し、
当該菌株が検出しうるヒスチジオール脱水素酸素活性を
有していないことからヒスチジン代謝系において欠点を
有していることが判明した。ＧＳ−１１５（ＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１）はスフェロプラストを生成する細胞壁
の酵素分解により形質転換することが出来る。そのスフ
ェロプラストは形質転換組換ＤＮＡ材料と混合し、カル
シュウムイオンとポリエチレングリコールの存在下でイ
ンキュベートし、ヒスチジンを欠く淘汰用培地で再生さ
せる。形質転換ＤＮＡはＨＩＳ４遺伝子を含有し、宿主
株は当該遺伝子を欠くため、使用した淘汰用培地上では
形質転換された細胞のみが生存する。
【００１７】この発明のベクターはピキア由来の栄養要
求性の複数の自律複製配列（ＰＡＲＳｓ）を含有し、Ｇ
Ｓ−１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）の形質転換頻
度と共にピキア属の酵母中で安定な染色体外要素として
のベクターの保持力を高める。これらの自律複製配列
は、エス・セレビシエから分離した公知の自律複製配列
（ＡＲＳ）はピキア属の宿主では機能しないために、有
用である。それ故、酵母中でのポリペプチド製品の生産
に使用可能な発現系としてピキアを開発するためには、
ピキア中でＡＲＳ能を有するＤＮＡ配列を分離すること
が必要となった。
【００１８】ピキア用ＡＲＳを探し出すため、ＴａｑＩ
でピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１由来の
ＤＮＡを一部消化し、５ないし１０Ｋｂｐの断片を分離
し、ｐＹＪ８ΔＣｌａの特異的ＣｌａＩ部位へとクロー
ン化した（図４参照）。プラスミドＤＮＡを大腸菌内で
増幅し、回収し、ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１
５８５１の形質転換に使用した。プラスミドＤＮＡを約
１０，０００のＨｉｓ + コロニーから回収し、大腸菌を
再形質転換するのに使用した。約１０，０００のアンピ
シリン抵抗性大腸菌コロニーからプラスミドを分離し、
ピー・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ−１
１５、ｈｉｓ４）を逆形質転換した。このサブライブラ
リー形質転換体からの４０のＨｉｓ+ 酵母コロニーを選
抜用培地上に塗布し、それぞれ独立に淘汰培地上で成育
させた。これらの４０の培養物から全酵母ＤＮＡを抽出
し、大腸菌を形質転換した。二つのプラスミド、ＰＡＲ
Ｓ１を含有するｐＹＡ６３及びＰＡＲＳ２を含有するｐ
ＹＡ９０を更に解析するために選抜した。これらのプラ
スミドは両者ともピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１
５８５１（ＧＳ−１１５）を非常に高い頻度で形質転換
し、自律要素として保持され、それぞれピー・パストリ
スＤＮＡの新規断片を含有していた。
【００１９】ｐＹＡ６３及びｐＹＡ９０からの新規な自
律複製配列をプラスミドｐＹＭ４の特異的ＣｌａＩ部位
（図５参照）へとサブクローン化したところプラスミド
ｐＹＪ３０及びｐＹＪ３２がそれぞれ得られた。プラス
ミドｐＹ３０は図６に詳細に示し、プラスミドｐＹＪ３
２は図７において同様に示してある。この両プラスミド
で大腸菌宿主を形質転換し、この出願が特許されたとき
大衆が自由に入手出来るようにするためにイリノイ州ペ
オリア市米国農務省北方地区研究センターに寄託してあ
る。寄託した菌株は次の寄託番号が付与されている。
【００２０】
【表２】 プラスミド 宿主菌株 ＮＲＲＬ寄託番号 ｐＹＪ３２ ＬＥ３９２ ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９１ この発明の自律複製配列、ＰＡＲＳ２はｐＹＪ３２プラ
スミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理
することにより簡単に回収可能である。所望のＡＲＳ要
素は５′末端（Ｒ1 部位の隣り）での約２３個の余分の
塩基対と、３′末端での（Ｈ3 部位の隣り）で約５個の
余分の塩基対と共に得られる。ＰＡＲＳ２は、当業者な
らば図７に示した制限地図を検査することにより容易に
認識できるようにｐＹＪ３２を他の制限酵素を種々組合
せて、当該プラスミドを処理することによっても得るこ
とができる。ＰＡＲＳ２挿入は制限酵素の地図化により
特性が明らかとされている。このＤＮＡ断片は図１に示
してある。これらのＤＮＡ断片は比較的小さいため、完
全な配列が明らかになっている。ＰＡＲＳ２の核酸配列
は次の通りであると決定されている。
【００２１】
【化２】
【００２２】当該ＰＡＲＳがピキア中の自律要素として
プラスミドを保持する能力を測定するために、プラスミ
ドｐＹＪ３２での形質転換した酵母細胞の培養物を選抜
用培地中で成育させ、定期的にサンプルを採った。細胞
中でのプラスミド配列の状態は放射能で標識したｐＢＲ
３２２と制限酵素を作用させてない酵母のＤＮＡとサザ
ンハイブリダイゼーションにより決定した。プラスミド
ｐＹＪ３２は、選抜用培地中で少くとも５０世代ピキア
中での自律要素として保持されていた。ピキア パスト
リスの細胞あたりの平均プラスミドコピー数は、ピキア
ＨＩＳ４遺伝子のゲノムコピー数とプラスミド由来のＨ
ＩＳ４遺伝子のそれとの比から導びき出された。ｐＹＡ
９０及びｐＹＪ３２（それぞれＰＡＲＳ２を含有）で形
質転換したピキア パストリス細胞の場合では、ピキア
の染色体ＨＩＳ４遺伝子のコピーに対するピキアＨＩＳ
４遺伝子を含むプラスミドの平均コピー数の比は約１０
〜１５であった。ここに記載した如く、誘導されたコピ
ー数は、細胞あたりのプラスミドコピー数に対する最小
推定値を示すものであることは、当業者には認識されて
いる。
【００２３】一般に、ピキア属の宿主中で自律複製能力
を有するＤＮＡ配列は、マーカー遺伝子を他のＤＮＡ配
列の間に含有しているが、ピキア内でＡＲＳ能を有する
ＤＮＡ配列を含まないベクター内に構築されたＤＮＡ断
片のライブラリーで、ピキア宿主を形質転換することに
より分離できる。使用したマーカー遺伝子は、宿主の酵
母に選抜しうる遺伝表現型を与える。当該ベクターでの
宿主菌株の形質転換の発生頻度は、ＡＲＳ能を有するＤ
ＮＡ配列がベクター中に存在するときに、修飾していな
いベクターでの形質転換の発生頻度と比較して、１ない
しそれ以上のオーダーで増加する。それ故、形質転換さ
れた宿主の選抜及び分離は、ＡＲＳ能を有する挿入ＤＮ
Ａ配列をもつプラスミドを保有する生物を提供する。こ
の方法で、ＡＲＳ能をピキア内で有するＤＮＡはいかな
る給源からのものでも容易に分離することができる。
【００２４】実施例 以下の実施例で使用する緩衝液及び溶液は次の組成を有
する。 １モルトリス緩衝液：８００ｍｌの水に１２１．１ｇの
トリス塩基、ｐＨを所望の値に濃塩酸（３５％）を加え
て調整。最終ｐＨ調整前に溶液を室温まで冷却し、最終
液量を１リットルとする。 ＴＥ緩衝液：１．０ミリモルＥＤＴＡを０．０１モルの
トリス緩衝液（ｐＨ＝７．０）に添加 ＳＳＣ： ０．１５モルのＮａＣｌ １５ミリモルのクエン酸ソーダ ｐＨをＮａＯＨで７．０に調整 デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）氏溶液： ５ｇのファイコール（Ｆｉｃｏｌｌ） ５ｇのポリビニルピロリドン ５ｇの牛の血精アルブミン（ＢＳＡ；ペンタックス フ
ラクションＶ） 水で全量を５００ｍｌとする。
【００２５】ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培
地： ５ｇのバクト−トリプトン ５ｇのバクト−イースト抽出物 ２．５ｇのＮａＣｌ を１リットルの水に含み、ｐＨは７．５にＮａＯＨで調
整 ＹＰＤ培地： １％のバクト−イースト抽出物 ２％のバクト−ペプトン ２％のデキストローズ ＳＤ培地： ６．７５ｇのアミノ酸を含まない酵母用窒素源（ＤＩＦ
ＣＯ製） ２％のデキストローズ を１リットルの水に含む ＳＥＤ： １モルのソルビトール ２５ミリモルのＥＤＴＡ ５０ミリモルのＤＴＴ ＳＣＥ緩衝液： ９．１ｇのソルビトール １．４７ｇのクエン酸ソーダ ０．１６８ｇのＥＤＴＡ ５０ｍｌのＨ2 Ｏ ｐＨをＨＣｌで５．８とする。
【００２６】ＣａＳ： １モルのソルビトール １ミリモルのＣａＣｌ2 濾過後、滅菌 ＰＥＧ溶液： ２０％のポリエチレングリコール−３３５０ １０ミリモルのＣａＣｌ2 １０ミリモルのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４） 濾過後、滅菌 ＳＯＳ： １モルのソルビトール ０．３倍のＹＰＤ培地 １０ミリモルのＣａＣｌ2
【００２７】次の略号を実施例で使用しているが、以下
の意味を有するものである。 ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン テトラ酢酸 ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ソーダ ＤＴＴ＝ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉ
ｔｏｌ） 数種類の操作手順をルーチン的に以下に詳細にのべる標
準手順にもとづき用いた。遠心分離は澄明な上澄液が得
られるに充分な回転速度で、充分な時間をかけて行なっ
た。一般には、酵母細胞の遠心分離は少なくとも１，５
００Ｇで少なくとも５分間行なった。核酸のフェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコールでの抽出は、フ
ェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの、
容量比で５８：４８：２の混合液を核酸を含む溶液と等
量接触させることを含む。クロロホルム／イソアミルア
ルコールでの抽出は、クロロホルムとイソアミルアルコ
ールの容量比で４８：２の混液を処理すべき液と等量接
触させることを含む。
【００２８】ゲル、フィルターなどを特定の溶液で洗浄
又は浸漬したと記述している場合は、ゲル、フィルター
などの全体を、当該ゲル、フィルター等の全表面を当該
溶液に接触させるために適当な容器（パン、皿、バイア
ルなど）のなかにひたした。エタノールによる核酸の沈
澱はまず核酸を含む溶液の塩類濃度を調整し、必要に応
じ、二倍量の冷エタノールで溶液を接触させ、次いで遠
心分離により沈澱物を回収することを含む。
【００２９】実施例Ｉ ピキア パストリスの形質転換手順 Ａ．細胞の成育 １．ＹＰＤ培地約１０ｍｌ中へピキア パストリスＧＳ
−１１５（ＮＲＲＬＹ−１５８５１）のコロニーを植え
つけ、３０℃で１２−２０時間振とう培養する。 ２．約１２−２０時間後、ＯＤ600 で約０．０１から
０．１となるように細胞を希釈し、ＹＰＤ培地中で３０
℃で約６〜８時間細胞を対数増殖期に保持する。 ３．約６−８時間後、ＯＤ600 で約０．１（又はその相
当量）の種培養０．５ｍｌを、ＹＰＤ培地１００ｍｌに
植付ける。３０℃で約１２−２０時間振とう培養する。 ４．ＯＤ600 が約０．２−０．３となったとき（約１６
−２０時間後）培養物を１５００Ｇで５分間遠心分離
し、回収する。
【００３０】Ｂ．スフェロプラストの調製 １．細胞を１度１０ｍｌの滅菌水中で洗う（ステップ１
ないし５の遠心分離は、すべて１５００Ｇ、５分間であ
る）。 ２．新たに調製したＳＥＤ１０ｍｌ中で細胞を洗う。 ３．滅菌１モルソルビトール溶液１０ｍｌ中で細胞を２
度洗う。 ４．１０ｍｌのＳＣＥ緩衝液に細胞を再分散する。 ５．チモリアーゼ６０，０００（マイルズ ラボラトリ
ーズ社製）ｍｌ当り４ｍｇ含む溶液を５−１０μｌ加え
る。約３０−６０分、３０℃で細胞をインキュベートす
る。スフェロプラストの調製は形質転換手順において
は、危険をはらんだ工程であるため、スフェロプラスト
の形成を次の如くモニターする必要がある。細胞（を含
む液）１００μｌを９００μｌの５％ＳＤＳ及び９００
μｌの１モルのソルビトールに、チモリアーゼの添加前
又は添加直後及びインキュベート期間中種々な間隔で加
える。ＳＤＳ中では細胞が溶解するが、ソルビトール中
では溶解しない点（通常３０から６０分のインキュベー
ション）でインキュベーションを停める。 ６．スフェロプラストを滅菌した１モルのソルビトール
１０ｍｌ中で、１，０００Ｇで５−１０分遠心分離しな
がら二度洗浄する（遠心分離のための時間及び速度は変
動する。スフェロプラストがペレット化するに充分なだ
け遠心分離する、しかし、その力で破壊されるほどであ
ってはならない）。 ７．滅菌したＣｓＳ １０ｍｌ中で１度洗う。 ８．全量で０．６ｍｌのＣａＳに細胞を再分散させる。
【００３１】Ｃ．形質転換 １．ＤＮＡのサンプル（２０μｌの容量まで）を１２×
７５ｍｍの滅菌したポリプロピレン管に加える（ＤＮＡ
は水又はＴＥ緩衝液中に分散されていること；少量のＤ
ＮＡで最大限の形質転換頻度を上げるためには各サンプ
ルに、超音波処理した大腸菌ＤＮＡを５ｍｇ／ｍｌ含む
溶液１μｌを加えるのが好ましい）。 ２．１００μｌのスフェロプラストを各ＤＮＡサンプル
に加えて、室温で約２０分間インキュベートする。 ３．１ｍｌのＰＥＧ溶液を各サンプルに１ｍｌ加え、室
温で約２０分間インキュベートする。 ４．サンプルを１５００Ｇで５〜１０分間遠心分離し、
ＰＥＧ溶液をデカンテーションにより除く。 ５．サンプルを、ＳＯＳ１５０μｌ中に再分散し、室温
で３０分間インキュベートする。 ６．滅菌した１モルのソルビトール溶液８５０μｌを加
え、以下に記載した様に少量のサンプルをとり平板培養
する。
【００３２】Ｄ．スフェロプラストの再生 １．再生用寒天培地の組成 ａ．寒天−ソルビトール培地；９ｇのバクト寒天、５
４．６ｇのソルビトール、２４０ｍｌの水、高温滅菌す
る。 ｂ．グルコース１０倍培地；２０ｇのデキストローズ、
１００ｍｌの水、高温滅菌する。 ｃ．ＳＣ１０倍培地；６．７５ｇのアミノ酸を含まない
酵母窒素源、１００ｍｌの水、高温滅菌する（所望のア
ミノ酸又は核酸を２００μｇ／ｍｌの濃度まで高温滅菌
前又はその後に加える） ｄ．３０ｍｌのグルコース１０倍培地及び３０ｍｌのＳ
Ｃ１０倍培地を溶解した寒天−ソルビトール溶液に加え
３００ｍｌとする。０．２ｍｇ／ｍｌのビオチン液０．
２ｍｌ、及び所望のアミノ酸又は核酸を２０μｇ／ｍｌ
の濃度まで加える。溶解した再生用寒天培地を５５−６
０℃に保つ。
【００３３】２．形質転換したサンプルの平板培養 形質転換サンプルが用意できる少なくとも３０分前に、
プレートあたり１０ｍｌの再生用寒天培地よりなる基底
部寒天層を注ぐ。試験管に再生用寒天培地１０ｍｌを、
形質転換サンプルがＳＯＳ中に入れてある間に、４５−
５０℃のバス上で、分散させる。再生用寒天培地の入っ
た試験管に適当量の形質転換サンプルを加え、プレート
内の基底部寒天層上に注ぐ。４５−５０℃に保った溶融
状態の再生用寒天培地１０ｍｌにそれぞれのサンプルを
適当量加え、再生用寒天培地よりなる固まった１０ｍｌ
の基底部寒天層上にそれぞれ注ぐ。 ３．スフェロプラスト調製品の品質の決定 １サンプル当り１０μｌをとり、１Ｍのソルビトール９
９０μｌを加えて１００倍に希釈する。１００倍希釈液
を１０μｌとり、９９０μｌ量の１Ｍのソルビトールを
再び加えて更に１００倍希釈する。調製品中にスフェロ
プラスト化されずに残存している完全細胞の濃度を測定
するために、ＹＰＤ寒天培地上に上記二つの希釈液１０
０μｌを塗布する。４０μｇ／ｍｌヒスチジンを加えた
再生寒天１０ｍｌに、全再生可能なスフェロプラストを
測定するため核希釈液を１００μｌ加える。形質転換実
験のための良好な値としては、ｍｌ当り１−３×１０7
の全再生可能なスフェロプラストとｍｌ当り約１×１０
3 の完全細胞である。
【００３４】４．平板培地を３０℃で３−５日間培養す
る。
【００３５】実施例ＩＩ ピキア パストリス自律複製配列の分離及び特性決定 Ａ．菌株 使用した菌株は次の通りである。 （ａ）ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０
株 （ｂ）ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１
（ＧＳ−１１５−ｈｉｓ４）、及び （ｃ）大腸菌８４８株（Ｆ- ｍｅｔ ｔｈｉ ｇａｌ
Ｔ1 R φ８０s ｈｓｄＲ- ｈｓｄＭ+ ） Ｂ．プラスミド ｐＹＡ２（図８参照）は、ｐＢＲ３２５のＰｓｔＩ部位
に挿入された９．３Ｋｂ ＰｓｔＩ断片上のエス・セレ
ビシエのＨＩＳ４遺伝子より構成されて居り、それはエ
ス・セレビシエＨＩＳ４遺伝子断片の給源であり、大腸
菌宿主に移入してあり、ＮＲＲＬ Ｂ−１５８７４とし
て公衆が入手可能である。ｐＹＪ８ΔＣｌａ（図４参
照）はｐＹＪ８の誘導体であり、ｐＹＪ８のＣｌａＩ消
化及びリゲーションにより作り出されたものである。
【００３６】Ｃ．培地 ピキア パストリスはＹＰＤ（富裕）培地又はＩＭＧ
（最少）培地で成育させた。ＩＭＧ最少培地は次のもの
より構成されている。 １．ＩＭ1 塩類、最終濃度で３６．７ミリモルのＫＨ2
ＰＯ4 、２２．７ミリモルの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２．
０ミリモルのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、６．７ミリモルの
ＫＣｌ、０．７ミリモルのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ；１０
倍の貯蔵液として調製し、高温滅菌したもの ２．微量塩類、最終濃度で０．２マイクロモルのＣｕＳ
Ｏ4 ・５Ｈ2 Ｏ、１．２５マイクロモルのＫＩ、４．５
マイクロモルのＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、２．０マイクロモ
ルのＮａＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．７５マイクロモルの
Ｈ3 ＢＯ3 、１７．５マイクロモルのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ、４４．５マイクロモルのＦｅＣｌ 3 ・６Ｈ2 Ｏ
４００倍貯蔵液として調製し、濾液を滅菌した。 ３．０．４μｇ／ｍｌのビオチン及び ４．２％デキストローズ 大腸菌はＬＢ培地又は２Ｂ培地（０．２％ ＮＨ4 ＰＯ
4 、１．２％Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．０１３％ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ、０．０７４％ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2Ｏ、ｍｌ
当り１マイクログラムのチアミン及び０．４％デキスト
リン）、１００μｌ／ｍｌのトリプトファン及び０．２
％カザミノ酸を追加添加したもので培養した。
【００３７】Ｄ．ＤＮＡ分離 １．酵素ＤＮＡの大規模調製 ピキア パストリス及びエス・セレビシエ ＤＮＡ調製
物は酵母細胞をＡ600が１−２となるまで最小培地１０
０ｍｌを成育させ、次いで２，０００Ｇで５分間遠心分
離して細胞を回収する。当該細胞を水、ＳＥＤ、１モル
のソルビトール中でそれぞれ１度洗浄し、次いで１Ｍの
ソルビトールに分散した細胞を５ｍｌの０．１モルのト
リス−塩酸（ｐＨ＝７．０）に分散した。細胞をチモラ
ーゼ６０，０００（マイルズ ラボラトリーズ社製）の
４ｍｇ／ｍｌ溶液５０−１００／μｌと混合して、細胞
壁を消化するために１時間３０℃でインキュベートし
た。スフェロプラスト調製品を１，０００Ｇで５−１０
分間遠心分離し、溶菌用緩衝液（０．１％ＳＤＳ、１０
ミリモルのトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、５ミリモルの
ＥＤＴＡ及び５０ミリモルのＮａＣｌ）に懸濁した。プ
ロテナーゼＫ（ベーリンガーマンハイム社製）及びＲＮ
アーゼＡ（シグマ社製）をそれぞれ１００μｌ／ｍｌの
割合で加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベート
した。ＤＮＡは、イソアミルアルコールを含有するクロ
ロホルムを調製物と等量しずかに混合し、蛋白を除き、
各相を１２，０００Ｇで２０分間遠心分離することによ
り分離した。上の（水）相を新しい試験管に移し、当量
のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混
合液で抽出した。各相を前と同様分離し、最上相を２−
３倍量の冷１００％エタノールを含む試験管に入れた。
サンプルをしずかに混合し、ＤＮＡをプラスチック製棒
の上にまきつけて回収した。当該ＤＮＡをただちに１ｍ
ｌのＴＥ緩衝液に溶解し、１００倍量のＴＥ緩衝液で４
０℃で１晩透析した。
【００３８】２．小規模酵母ＤＮＡ調製物 Ａ600 で１−５でなるまで５ｍｌの酵母の培養物を最少
培地で成長させ、次いで２，０００Ｇで５分間遠心分離
し、回収した。細胞を１ｍｌのＳＥＤに懸濁し、１．５
ｍｌの極小遠心管に移し、１モルのソルビトール中で１
度洗い、１モルのソルビトールに分散させた細胞を０．
１モルトリス塩酸（ｐＨ７．４）０．５ｍｌ中に懸濁し
た。チモリアーゼ６０，０００（マイル ラボラトリー
ズ社；４ｍｇ／ｍｌの溶液を１０μｌ）各サンプルに加
え、当該細胞を３０℃で、３０−６０分間インキュベー
トした。細胞は次いで１分間遠心分離し、溶菌用緩衝液
中に懸濁し、６５−７０℃でインキュベートした。１５
分後にサンプルを５モルの酢酸カリウム１００μｌと混
合し、氷浴中に１５分間保持し、５分間遠心分離した。
上澄液を１００％のエタノール１ｍｌを含む新しい極小
遠心管中へデカンテーションし、混合後ただちに１０秒
間遠心分離した。最終的にペレットを１０−１５分間風
乾し、５０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。
【００３９】３．大規模大腸菌ＤＮＡの分離 大規模（０．５−１リットル）のプラスミド調製物用の
大腸菌の培養物は、上述の如く補足され、かつ適当な抗
生物質を含む２Ｂ培地中で３７℃で振とう培養により成
育させた。ｐＢＲ３２２由来のプラスミドを含む細胞の
場合には、Ａ55 0 で約０．７まで培養し、その時点で１
００μｇ／ｍｌとなるように充分量のクロラムフェニコ
ールを加え、細胞をおおよそ１５時間後に回収する。ｐ
ＢＲ３２５由来のプラスミドを含む菌株は、補足された
２Ｂの培地中に、当初のＡ550 が約０．０１−０．０５
となるよう移植し、回収前２０−２４時間３７℃で振と
うインキュベートした。プラスミドをビルンボイム（Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ）及びドーリー（Ｄｏｌｙ）のアルカリ
溶菌法（１９７９年）により分離した。
【００４０】４．小規模大腸菌ＤＮＡ調製物 小量の迅速プラスミド分離のために、抗生物質を含み、
補充した２Ｂ培地中の２ｍｌの培養物を３７℃で振とう
培養し、１．５ｍｌの極小遠心管中で遠心分離により回
収した。プラスミドはビルンボイム及びドーリーのアル
カリ溶菌法（１９７９年）により分離した。
【００４１】Ｅ．ＤＮＡの制限（酵素）及び断片の分離 制限酵素はニュー・イングランドバイオラボズ及びベセ
スダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）リサーチラボラトリーズから
入手し、消化は常套手段により行なった。制限（酵素）
の地図化は、挿入ＤＮＡを有するか又は有しないプラス
ミドの並行消化物の比較により実施した。制限断片はア
ガロースゲルから透析管材料でバックアップされたワッ
トマン３ＭＭ紙片への電気溶出により純化した。断片
は、紙及び管材料から０．１モルのＮａＣｌ、５０ミリ
モルのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）と１ミリモルのＥＤ
ＴＡを含む溶液０．１ないし０．２ｍｌを用い、３〜４
回洗浄し、回収した。最後に、断片をフェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、エタノール
で沈澱させ、少量のＴＥ緩衝液に再溶解した。
【００４２】Ｆ．ピー・パストリス自律複製配列ライブ
ラリーの大腸菌での構築 ピキア パストリスＤＮＡ−ｐＹＪＢΔＣｌａライブラ
リー構築のために、５０μｇのｐＹＪＢΔＣｌａをＣｌ
ａＩで完全に消化し、仔牛の腸アルカリン フォスファ
ターゼで処理し、ＤＮＡから末端の５′ホスフェートを
除去した。ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５
１からのＤＮＡ１００μｇを、全量で１ｍｌとし、２０
単位のＴａｑＩを用いて、６５℃で５分間インキュベー
トすることにより一部消化を行なった。５ないし１０Ｋ
ｂｐの断片を０．５％アガロースゲルから電気溶出によ
り（本実施例、Ｅ項参照）大きさにより分離した。当該
ベクターの１μｇと２μｇのピキア ＴａｑＩ断片と
を、総容量２００μｌ中でＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベセス
ダ リサーチ ラボラトリーズ）の２０単位と混合し、
４℃で１晩インキュベートした。当該リゲートしたＤＮ
Ａで大腸菌を、同８４８菌細胞液２ｍｌに全リゲーショ
ン反応混液を加え、０℃で１５分間インキュベートする
ことにより形質転換した。混合物を５分間で３７℃まで
に加温し、その時間経過後ＬＢ培地４０ｍｌを加え、３
７℃のインキュベーションを更に１時間つづけた。次い
でアンピシリンを加え、全濃度で１００μｌ／ｍｌと
し、インキュベーションを再び１時間つづけた。最後
に、細胞を３，０００Ｇで１０分間遠心分離し、新しい
ＬＢ培地１ｍｌ中に再び懸濁させ、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含む１０個のＬＢ寒天平板培地上に等量
づつ広ろげた。結果として約１０，０００コロニーが発
生したが、それを平板培地からかき取り、細胞の１部分
を、当初のＡ550 が約０．１となるまで５００ｍｌの補
充した２Ｂ培地に植えた。培養物を成育させ、プラスミ
ドを上述の方法により抽出した。
【００４３】Ｇ．サザンハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションはサザンの方法（１９７５年）
により実施した。大きい、又はスーパーコイル型ＤＮＡ
分子のニトロセルローズへの移転には、アルカリ変性に
先立って、アガロースゲルを１０分間０．２５モルのＨ
Ｃｌ中に浸漬することによりＤＮＡをまず一部加水分解
した。エス・セレビシエのＨＩＳ４遺伝子由来の標識し
た断片の、ピキア パストリス ＤＮＡへのハイブリダ
イゼーションは５０％のホルムアミド、６倍のＳＳＣ、
５倍のデンハルト氏液、０．１％ＳＤＳ １ミリモルの
ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌの変性したニシンの精子Ｄ
ＮＡの存在下で４２℃で行なった。ハイブリダイゼーシ
ョン後の洗浄は、２倍のＳＳＣ、１ミリモルのＥＤＴ
Ａ、０．１％のＳＤＳ及び１．０％のピロリン酸ソーダ
中で５５℃で行なった。
【００４４】Ｈ． 32Ｐ−標識 ニック翻訳はリグビイ（Ｒｉｇｂｙ）らの方法（１９７
７）で実施した。 Ｉ．ＤＮＡ配列の決定 ＤＮＡ配列の決定はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等のジデ
オキシヌクレオチドチェーン ターミナーション方法
（１９８０年）によった。
【００４５】Ｊ．ピキアの自律複製配列 上記Ｆ項に記載した如く構築されたピキア ライブラリ
ーを用いてピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１５８
５１を形質転換した。プラスミドＤＮＡを大腸菌内で増
幅し、回収し、ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１
５８５１を形質転換するのに使用した。プラスミドは、
次いで、約１０，０００のＨｉｓ + ピキア コロニーか
ら回収し、大腸菌の形質転換に用いた。１０，０００の
アンピシリン抵抗性大腸菌コロニーを分離し、ピー・パ
ストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ−１１５；ｈ
ｉｓ４）へと逆形質転換した。このサブライブラリー形
質転換体から４０のＨｉｓ+ 酵母コロニーを選抜用培地
に別々に塗布し、独立して選抜用培地中で成育させた。
全酵母ＤＮＡをこの４０の培養物の各々から抽出し、大
腸菌を形質転換した。一つのプラスミド、すなわち、Ｐ
ＡＲＳ２を含むｐＹＡ９０を更に解析するために選抜し
た。このプラスミドはピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ
−１５８５１（ＧＳ−１１５）を高頻度で形質転換で
き、自律要素として保持され、ピー・パストリスＤＮＡ
の新規断片を含有していた。
【００４６】Ｋ．自律複製配列に関するピキア パスト
リス形質転換体の解析 ピキア ＡＲＳ含有プラスミドをピキア パストリス細
胞中での自律要素として保持されうる能力について次の
如き方法で決定した。形質転換体のコロニーを再生寒天
平板培地からとり、ＳＤ寒天培地上に塗布し、液体ＩＭ
Ｇ培地へと移植した。そのＳＤ平板培地を３０℃で３日
間培養し、その時点で一つのコロニーを平板培地からつ
まみとり、再びＳＤ平板培地上に塗布し、ＩＭＧ培地を
含むフラスコへ再度植え継いだ。この過程を３回繰返し
た。この３個のＩＭＧ培養物を３０℃でＡ600 で約１−
２となるまで振とうしながら成育させ、次いで遠心分離
により収集した。この酵母培養物からのＤＮＡを上述の
方法により抽出し、３０ボルト、３０ミリアンペアで１
０ないし１５時間０．８％アガロースゲルへと電気泳動
し、次いでニトロセルロースへと移転させ、上述の如く
32Ｐ−標識のｐＢＲ３２２又はｐＢＲ３２５にハイブリ
ダイゼーションした。対照として大腸菌から分離したプ
ラスミド１０ｎｇを含むサンプルと形質転換してないピ
キア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ−１
１５）ＤＮＡを１−２μｇ含むサンプルを実験サンプル
と一緒に電気泳動させた。検査したピキア ＰＡＲＳ含
有プラスミド形質転換体とは、標識したプローブは、大
腸菌から分離したプラスミドと同一のパターンで、ハイ
ブリッド化した。対照として、ｐＹＪ８ΔＣｌａ（ピキ
ア中ではＡＲＳ活性を有する統合的形質転換ベクター）
で形質転換した場合、標識したプローブはピキア パス
トリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ−１１５）から
の大きな分子量の染色体ＤＮＡにハイブリダイゼーショ
ンすることが見出された。プローブは形質転換されてい
ないＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１からのＤＮＡとハイブリ
ダイゼーションしなかった。ピキア中で自律要素として
プラスミドを保持するためのＰＡＲＳ活性のより定量的
手段として、ｐＹＪ３２プラスミドで形質転換した酵母
の培養株を選抜用培地で成育させ、定期的にサンプル採
取した。細胞中のプラスミド配列の状態は、制限酵素未
処理の酵母のＤＮＡを放射能で標識したｐＢＲ３２２に
サザンハイブリダイゼーションすることにより、決定し
た。プラスミドｐＹＪ３２は、ピキア中ですくなくとも
５０世代選抜用培地中で自律要素として保持された。
【００４７】Ｌ．プラスミドコピー数の決定 ピー ・パストリス細胞あたりの平均コピー数は、ピー・
パストリスＨＩＳ４のゲノムコピーの量とプラスミド由
来のＨＩＳ４遺伝子の量の比から導びき出された。検査
対象菌株は、ピキア ＨＩＳ４遺伝子を含むプラスミド
を含有しているので、ＤＮＡを抽出し、制限エンドヌク
レアーゼで消化し、ニトロセルローズフィルターに移転
し、ピキア ＨＩＳ４遺伝子を含有する２．７Ｋｂｐの
32Ｐ−標識のＢｇｌＩＩＩ断片でハイブリダイゼーショ
ンした。ポストハイブリダイゼーションの洗浄後、一連
のＸ−線フィルムを一定時間フィルターに曝露し、平板
ゲルのためのコムプセットモジュール（Ｃｏｍｐｕｓｅ
ｔ Ｍｏｄｕｌｅ）でプログラム化したベックマンＤＵ
−８Ｂスペクトロホトメーター上で走査した。結果は第
１表にまとめて示す。
【００４８】
【表３】 第１表 ＰＡＲＳ含有ピキア パストリス形質転換体の特性 プラスミド 自律複製配列 参照図 自律要素としての世代数 コピー数 ｐＹＭ４ − ６ − − ｐＹＪ３２ ＰＡＲＳ２ ８ ５０ １３
【００４９】下記の文献を本明細書中で引用した。 ビルボイム及びドーリー（１９７９年）核酸研究７巻、
１５１３−１５２３頁〔Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄ
ｏｌｙ（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
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０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４３，１６１−１７８〕
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の自律複製配列（ＰＡＲＳ２）の制限
酵素地図である。
【図２】プラスミドＹＥｐ１３の制限酵素地図である。
【図３】プラスミドｐＹＪ８の制限酵素地図である。
【図４】プラスミドｐＹＪ８ΔＣｌａの制限酵素地図で
ある。
【図５】プラスミドｐＹＭ４の制限酵素地図である。
【図６】プラスミドｐＹＪ３０の制限酵素地図である。
【図７】プラスミドｐＹＪ３２の制限酵素地図である。
【図８】プラスミドｐＹＡ２の制限酵素地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ピキア属の宿主内で、染色体外要素とし
    て１細胞あたり数多くのコピー数のプラスミドを保持す
    る自律複製配列よりなるＤＮＡ断片であって、当該ＤＮ
    Ａ断片を含むベクターでの当該宿主の形質転換頻度を当
    該ＤＮＡ断片を含まないベクターでの当該宿主のそれと
    比較して増加させることができ、以下の制限地図を有す
    ることを特徴とするＤＮＡ断片： 【図１】
  2. 【請求項２】 当該自律複製配列が酵母由来である特許
    請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片。
  3. 【請求項３】 当該酵母がピキア属より選ばれたもので
    ある特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ断片。
  4. 【請求項４】 当該酵母がピキア パストリス種の一員
    である特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ断片。
  5. 【請求項５】 当該酵母がピキア パストリスＮＲＲＬ
    Ｙ １１４３０である特許請求の範囲第４項記載のＤ
    ＮＡ断片。
  6. 【請求項６】 当該断片が次のヌクレオチド配列か、機
    能的同等物又はそれらの合理的変形である特許請求の範
    囲第１〜５項のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片。 【化１】
  7. 【請求項７】 ピキア属の宿主を形質転換でき、当該宿
    主内に染色体外要素として保持されている特許請求の範
    囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載された自律複製
    配列を含むハイブリッドプラスミド。
  8. 【請求項８】 当該プラスミドが図７に示す制限地図
    （ｐＹＪ３２）を有することを特徴とする特許請求の範
    囲第７項記載のハイブリッドプラスミド。
  9. 【請求項９】 ピキア パストリス種に属する宿主を請
    求項第７項又は請求項第８項に記載のハイブリッドプラ
    スミドで形質転換したものである酵母菌株。
  10. 【請求項１０】 大腸菌ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９１（Ｌ
    Ｅ３９２−ｐＹＪ３２）。
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