JPS61108390A - 自律複製配列を有するｄｎａ断片、同断片を含有するハイブリツドプラスミド、同ハイブリツドプラスミドにより形質転換した大腸菌及び当該ｄｎａ断片の製造方法 - Google Patents

自律複製配列を有するｄｎａ断片、同断片を含有するハイブリツドプラスミド、同ハイブリツドプラスミドにより形質転換した大腸菌及び当該ｄｎａ断片の製造方法

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JPS61108390A
JPS61108390A JP60243781A JP24378185A JPS61108390A JP S61108390 A JPS61108390 A JP S61108390A JP 60243781 A JP60243781 A JP 60243781A JP 24378185 A JP24378185 A JP 24378185A JP S61108390 A JPS61108390 A JP S61108390A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は組換ＤＮＡについての技術分野に関する。こ
の発明の一つの側面は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の宿
主において染色体外要素として保持されるＤＮＡＩｔ片
に関する。この発明の他の側面は、上述のＤＮＡ断片を
組み込んだベクターの発現に関する。更にもう一つのこ
の発明の側面は、上述の発現ベクターで形質転換したｖ
ＩＴＭな微生物に関するものである。更にもう一つの側
面はこの発明に係る新規のＤＮＡ断片を分離する方法に
関する。
組換ＤＮＡ技術において使用される基本的な技術は当業
者には既知のことである。組換ＤＮＡ技術の実施に必要
な宿主微生物に望まれる要素としては次のものがあるが
、これのみに限定されるわ（２１ベクター、通常はプラ
スミドであるが、そターは細胞中への遺伝子の導入を可
能にし、細胞中でＤＮＡ配列を保持するのに役立つ。
そのベクター中に自律複製配列が含まれている場合は、
細胞あたり当該ベクターの多数のコピーが得ら′れ、上
述の遺伝子の発現も高水準となる。
（３）　　適切なる宿主微生物で、かっこの宿主は所望
の遺伝子を有するベクターで形質転換することができ、
またその宿主微生物は挿入された遺伝子により暗号化さ
れている情報の発現を許す細胞質の器具を有しているこ
と。
で、ある種の微生物内で見出されたものである。
天然に微生物中に存在するとして見出されたプラスミド
の場合、細胞１個あたり多数のコピーがしばしば存在す
ることが見出されている。天然に存在するプラスミドに
加えて、種々の人ニブラスミドやハイブリッドベクター
も作成されている。プラスミドＤＮＡ中に暗号化されて
いる情報中に含まれているもので、娘細胞中でプラスミ
ドを再生ずるとぎに必要とされるもの、それは自律複製
配列である。一つ又はそれ以上の遺伝子表現型の淘汰特
性が、プラスミドＤＮＡ中に暗号化されている情報中に
含まれていなければならない。この遺伝子表現型の淘汰
特性は、淘汰培地中で細胞の優先的成育により区別され
、選抜されうる利益を有する当該プラスミドを含有する
宿主細胞のクローン化を可能とする。
プラスミドの利用性は、一種又は他の種類の制限エンド
ヌクレアーゼ又は制限酵素、いずれも当該プラスミド上
に定まった特異的切断部位を認識するのであるが、その
酵素により特定の個所で切断されるという事実に存する
。切断した後、同病、又は宿主以外の微生物由来の外来
性の、遺伝子、あるいは遺伝子断片を、切断部位又は切
断部位に隣接し再構築された部位で、切断されたプラス
ミドと所望の遺伝子材料との末端を結合させることによ
り挿入する。生成した１１換ＤＮＡはハイブリッドベク
ターと称することもできる。
ＤＮＡ組換は宿主微生物の菌体外で行なわれる。
生成したハイブリッドベクターは形質転換として知られ
ている過程により宿主微生物へと導入される。形質転換
された微生物を成育させることにより大口のハイブリッ
ドベクターを得ることができ　　　′る。遺伝子がその
ＤＮＡ中に暗号化されている情報の転写及び翻訳をつか
さどるプラスミド中の場所に関して正しく挿入された場
合は、生成したハイブリッドベクターは挿入遺伝子をコ
ード化したポリペブタイド配列の生産を指示するために
使用することができる。ポリペプチドのこの方法による
生産を遺伝子発現という。
現在まで、種々のポリペプチドを生産するために組換Ｄ
ＮＡ技術を商業的に使用しようとする試みは宿主生物と
して大腸菌を用いるものに集中している。しかし、ある
場合には大腸菌は宿主として適切でないということが判
明している。例えば、大腸菌は医薬品として有用なポリ
ペプチドから除外しなければならない有害な発熱因子を
多数含有している。この精製が良好に実施されるための
効率は、勿論、特定のポリペプチドにより異なる。
更に、大腸菌の蛋白分解能がある種の有用な製品の収率
を著るしく制限する。これら及びその他の点を配慮し、
代替宿主、特にポリペプチドの生産のために真核生物を
使用することに興味の対象が移りつつある。
真核系すなわち酵母におけるポリペプチド製品の生産の
手段が存在することは、組換ＤＮＡによ点を提供できる
こととなった。Ｐ３母は、大腸菌の大規模醗酵が比較的
最近になり到来したのに比し、数世紀にもわたり大規模
醗酵に使用されてきている。酵母は、細菌に比較して一
般的に高い菌体濃度でも成長でき、連続ＰＩＪ酵工程に
も応用されている。事実、ピキア　パストリス （Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵ａｔ　
ハ、極メチ高イ細胞濃度、すなわち１０（１／４１を越
える細胞濃度でも成育できることが米国特許 第４．４１４，３２９号（フィリップス石油（株）所有
）にウニブナ−により開示されている。酵母宿主の別の
利点の中には、生物の多くの臨界的機能、例えば酸化的
リン酸化反応が細胞機関の中に存在するので、そのため
野生型の宿主細胞にとっては異物であるポリペプチドの
当該生物による生産により、場合によっては起りうる恐
ろしい作用にさらされることがないという事実も含んで
いる。
真核生物として、酵母は発現されたポリペプチド生産物
をグルコース附加ができ、そのグルコース附加はポリペ
プチド生産物の生物活性にとっては重要である。真核生
物として酵母は高等生物と同種のコードン優位性を示し
、哺乳動物の遺伝子又は例えば哺乳動物のｍＲＮＡから
の逆転、写により得られた相補的ＯＮへ（ｃＤＮＡ）由
来の発現製品の効率的生産へと向うこともまた可能であ
る。
充分に特性が明らかにはされていない酵母類の宿主／ベ
クター系としての開発は形質転換条件についての知識の
欠如と適用なベクターが存在していないことによりずい
ぶんと妨害された。更に、栄養要求突然変異株はしばし
ば人手出来なく、このため栄養要求的補体により形質転
換体を直接選抜することを不可能としている。もしも、
組換ＤＮＡ技術が充分にその約束をはだせたら、ＤＮＡ
の操作を可能とし挿入したＤＮＡ配列の発現を適正化し
、その結果、所望のポリブベチド製品が制御された条件
下で、かつ、高収率で調製出来ることとなる新しい宿主
／ベクター系が発明されるにちがいない。
この発明により、本発明者は、染色体外要素として組換
ＤＮＡ材料を１１胞あたり多数コピー保持することを助
【プる自律″ａ製製列列発見、分離及び特性を明らかに
した。更に、いかなる給源からのＤＮＡでもピキア属の
酵母中で自律複製する能力を有するＤＮＡ配列を分離す
る方法を提供するものである。
この明ａｍ中では次の略号で使用した制限酵素を表わし
た。
省略記号　　　　　　　制限酵素 Ａ　　　　　　　　　ＡＩｕＩ Ａｈ　　　　　　　　Ａｈａｎ［ ＡＶ　　　　　　　　　ＡＶａＩ Ｂ　　　　　　　　　　ＢａｍＨＩ ３２　　　　　　　８ＱＩＩ ＣＣ１ａＩ Ｒ２Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｍ Ｈ３Ｈ＋　ｎ　ｄ　ｍ Ｍｂ　　　　　　　　ＭｂＯ■ Ｎｒ　　　　　　　　ＮｒｕＩ ＰＳ　　　　　　　　　ＰｓｔＩ Ｐ■２　　　　　　　ＰＶｕＩＩ Ｒ８Ｒ５ａＩ ＲＩ　　　　　　　　Ｅ　ＣＯＲＩ ３−　　　　　　　　　ＳａｌＩ Ｓｍ　　　　　　　　Ｓｍａ工 Ｓｐ　　　　　　　　Ｓｐｈ工 Ｓ　３　　　　　　　　　Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａ　ＩＴ　
　　　　　　　　　Ｔａａ　Ｉ Ｘｈ　　　’　　　　　　ＸｈｏＩ 添付した図面の中で、ＤＮＡの操作に使用した制限部位
でリゲーションの際破壊したところは、破壊部位に対応
する省略記号をカッコで囲んで表示した。核酸配列によ
り予測しうる！ｌＪ限部位ではあるが、実際の制限酵素
処理により立証されていない個所は、星印を当該制限部
位につけて表示した。
この発明は、ピキア属の宿主中で染色体外要素としてプ
ラスミドを保持する、自ｔＩ複製配列を含む新規なりＮ
Ａ断片を提供するものである。
更にこの発明は、ピキア属の宿主中で自律複製力を有す
るＤＮＡの配列を、給源のいかんをとすす、分離する方
法を提供するものである。
この発明の実施に使用することのできる宿主生物はピキ
ア属に属する様々な種を含む。有用な宿主のグループと
しては栄養要求性の突然変異株である。すなわち、成長
のために一つ以上のアミノ酸、ビタミン又は他の栄養素
を補充する必要のある変異株である。このような変異株
の形質転換体は、変異株宿主の形質転換に使用する組換
ＤＮＡ材料の一部として、失われた遺伝子製品の生産を
暗号化しているＤＮＡ配列を使用す−ることにより選抜
できる。
最も好ましい宿主酵母は変異株く土ｌ　バスト１Ｊ２Ｇ
ｓ１１５株であり、これはヒスチジンを生産す４る能力
を欠く変異株で、変異株遺伝子型ｈｉｓ４を有している
と同定交れている。Ｇ５１１５株はく土１　氏スエ旦２
ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３０より誘導化されたもので、
この発明が特許されたとき公衆が自由に入手出来ること
を確実とするため米国イリノイ州ベオリア市にある米国
農務省の北方地区研究センター（ＮｏｔｈｅｒｎＲｅｇ
ｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託
している。【王ｌ　バストリスＧ５１１５株には１９８
４年８月３１日現在、ＮＲＲＬ　　Ｙ１５８５１の寄託
番号が付されている。、この特異な宿主は、ヒスチジン
代謝経路における欠陥を有する栄養要求性変異株である
ので、有用である。勿論、当業者にとってはピキアの代
謝経路において重要な他の多くの遺伝子に関しての変異
株が存在し、また分離することができることは容易に認
めつるところである。
′　それ故、他の多くの宿主がピキア属の形質転換体と
して（使用）可能であり、変異株宿主が欠損している遺
伝子製品の生産を暗号化している遺伝子が入手可能であ
るか、その遺伝子を分離する能力を有しているかにより
制限されるにすぎない。
ピキア　パストリスＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１はヒス
チジノール脱水−素酵素の生産能を欠く変異株であると
同定されている。このル１定は、ヒスチジノール脱水素
酵素の基質、ヒスチジノールの存在下でＮＲＲＬ　　Ｙ
−１５８５１の１ｆＡｒｎからの蛋白抽出物でニコチン
酸アミド　アデニン　ジヌクレオチド（ＮＡＤ）の還元
を測定することにより達成された。互２・セレビシェ（
Ｓ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に使用されている命名
法にちなんで、ＮＲＲＬＹ−１５８５１における欠損を
ｈｉｓ４ｃ変異と称する。
亘・パストリスＮＲＲＬ　　Ｙ　　１１３４０株から全
染色体ＤＮＡの３ａｕ３Ａによる一部消化及び引き続い
ての庶糖濃度勾配遠心法によるＨＩＳ４遺伝子の分離を
行なった。ニス・セレビシェ−大腸菌シャトルベクター
ＹＥｐ１３　（ＡＴＣＣ３７１１５；第３図参照）の３
８ｍＨＩ切断部位５７９９−４Ｄ株（ＮＲＲＬ　　Ｙ−
１５８５９）、ｈ　ｉ　５４ＡＢＣ変異株のスフェロプ
ラストを約１μグのヒンネン等の方法によるＹＥｐ１３
ピキアＤＮＡライブラリーと混合し、ヒスチジン欠損培
地で再生させた。全再生スフェロプラスト５Ｘ１０’個
から、形質転換体としては、約１Ｘ１０３コロニーの原
栄養性酵母が得られた。
ＤＮＡなしで培養した比較対照サンプルではコロニーの
発生はなかった。２０のＨＩＳ＋コロニーから全醇母Ｄ
ＮＡを抽出し、大腸菌を逆形質転換させた。１７の酵母
すＮＡ：Ａ製動がアンピシリン抵抗性コロニーを形成し
た。これらのクローン化された断片は制限酵素（切断物
の）大きざ及び地図化並びに比較的厳格でない条件下で
標識されたニス・セレビシェＨＩＳ４断片とクロスハイ
ブリダイゼーション（ボストハイブリダイゼーション洗
浄は５５℃でＳＳＣで２回実施）能により更に特性が明
らかとされた。このＨＩＳ４含有断片はそれぞれが１つ
以上のニス・セレビシェＨＩＳ４遺伝子とハイブリット
化した断片を含有していた。
そのうちの１つのＨＩＳ４含有プラスミドを再びクロー
ン化して、Ｃ）ＹＪ８と命名したＨＩＳ４含有プラスミ
ドが得られたが、それは第４図に示している。プラスミ
ドｐＹＪ８はｐＢＲ３２５配列を含有し、この配列はク
ロラムフェニコール及びアンピシリン抵抗性遺伝子と更
にピキアＨＩＳ４遺伝子を含んでいる。
１）ＹＪ８からの６．０ＫｂｏピキアＤＮＡ断片をサブ
クローン化することにより、この２．７’　　　Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片はピキア又はサツカロミセスをＨｌ５４Ａ
、ｌ−１１８４Ｂ又はＨＩＳ４Ｇ道伝子を暗号化させた
活性に欠損を持つ菌株に形質転換する能力を保有してい
ることが判明した。それ故、例えばｈｉｓ４変異株であ
るピキア　パスｉ・リスＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１（
ＧＳ−１１５＞株は、プラスミドｐＹＪ３０及びｐＹＪ
３２で形質転換するとヒスチジンの添加されていない培
地中でも成育できる。（第７図及び第８図参照）。これ
らの二つのプラスミドは、ピキア染色体ＤＮＡの２．７
Ｋｂｐ　　８ｇ４１　ＩＩ断片をそれぞれ含有し、とも
にＨＩＳＪｍ伝子機能金子機能して保有している。
ピキア　パストリアの形質転換操作の実験的操工 作は詳細に以下に述べる（実施例中）。ビー・パストリ
アの形質転換系の開発のために、栄養要求性変異株Ｇ５
１１５（ＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１）を分離し、当該
菌株が検出しつるヒスチジオール脱水素酸素活性を有し
ていないことからヒスチジン代謝系において欠点を有し
ていることが判明した。
Ｇ５−１１５（ＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１）はスフェ
ロプラストを生成する細胞壁の酵素分解により形質転換
することが出来る。そのスフェロプラストは形質転換組
換ＤＮＡ材料と混合し、カルシュラムイオンとポリエチ
レングリコールの存在下でインキュベートし、ヒスチジ
ンを欠く淘汰用培地で再生させる。形質転換ＤＮＡはＨ
ＩＳ４遺伝子を含有し、宿主株は当該遺伝子を欠くため
、使用した淘汰用培地上では形質転換された細胞のみが
生存する。
１１５（ＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１）の形質転換頻度
と共にピキア属の酵母中で安定な染色体外要素としての
ベクターの保持力を高める。これらの自律複製配列は、
Ｉ、（−セレビシェから分離した公知の自律複製配列（
ＡＲ３）はピキア属の宿主では機能しないために、有用
である。それ故、酵母中でのポリペプチド製品の生産に
使用可能な発現系としてピキアを開発するためには、ピ
キア中でＡＲ８能を有するＤＮＡ配列を分ｌ１ＩＩする
ことか必要となった。
ピキア用ＡＲ８を探し出すため、ＴａｑＩで原キア　バ
ストリスＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１由来のＤＮＡを一
部消化し、５ないし１０Ｋｂｐの断片を分離し、ｐＹＪ
８ΔＣρａの特異的ＣＡａ■部位へとクローン化した（
第５図参照）。プラスミドＤＮＡを大腸菌内で増幅し、
回収し、ピキア氏ス立ユ２ＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１
の形質転換に使用した。プラスミドＤＮＡを約１０，０
００のＨｉｓ＋コロニーから回収し、大腸菌を再形質転
換するのに使用した。約１０，０００のアンピシリン抵
抗性大腸菌コロニーからプラスミドを分離し、く二・バ
ストリスＮＲＲＬＹ− １５８５１（ＧＳｌｌ　５、ｈ　ｉ　ｓ４）を逆形質転
換した。このナブライブラリー形質転換体からの４０の
Ｈｉｓ）酵母コロニーを淘汰用培地上に塗布し、それぞ
れ独立に淘汰培地上で成育させた。
これらの４０の培養物から全酵母ＤＮＡを抽出し、大腸
菌を形質転換した。二つのプラスミド、ＰＡＲ８１を含
有するｐＹＡ６３及びＰＡＲ８２を含有する。ＹＡ９０
を更に解析するために選抜した。これらのプラスミドは
両者ともピキア　バストリスＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５
１（ＧＳ−１１５）を非常に高い頻度で形質転換し、自
律要素として保持され、それぞれ＜二・バストリスＤＮ
Ａの新規断片を含有していた。
ｐＹＡ６３及びｐＹＡ９０からの新規な自律複製配列を
プラスミドｐＹＭ４の特異的ＣＪｌａ■部位（第６図参
照）へとサブクローン化したところプラスミドｐＹＪ３
０及びｐＹＪ３２がそれぞれ得られた。プラスミドｐＹ
３０は第７図に詳細に示し、プラスミドｐＹＪ３２は第
８図において同様に示しである。この両プラスミドで大
ＩＩ！菌宿主を形質転換し、この出願が特許されたとき
大衆が自由に入手出来るようにするためにイリノイ州ペ
オリア市米国農務省北方地区研究センターに寄託しであ
る。寄託した菌株は次の寄託番号が付与されている。
プラスミド　宿主菌株　　ＮＲＲＬ奇託番号ｐＹＪ３０
　　ＬＥ３９２　　ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５８９０１）Ｙ
Ｊ３２　　ＬＥ３９２　　ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５８９１
この発明の自律複製配列、ＰＡＲ８１及びＰＡＲ３２は
それぞれ１）ＹＪ３０及びＩ）ＹＪ　３２から両プラス
ミドを制限酵素ＥＣ０ＲＩ及びＨｉｎｄｌ［Ｉで処理す
ることにより簡単に回収可能である。所望のＡＲ８要素
は５′末端（Ｒ１部位の隣り）での約２３個の余分の塩
基対と、３′未当業者ならば第７図及び同８因に示した
制限地図を検査することにより容易に認識できるように
ｐＹＪ３０及びｐＹＪ３２を他のｉｌ限酵素を種々組合
せて、当該プラスミドを処理することによっても得るこ
とができる。Ｐ　Ａ　ＲＳ　１及びＰＡＲ８２挿入は制
限酵素の地図化により特性が明らかとされている。これ
らの二つのＤＮＡ断片は第１図及び第２図にそれぞれ示
しである。
これらのＤＮＡ断片は比較的小さいため、完全な配列が
明らかになっている。ＰＡＲ８１の核酸の配列は次の通
りであ、ると決定されている。
５’−ＴＣＧＡＧＡＴ晶Ｇ　　　　ＣＴＧＧＧＧＧＡＡ
ＣＡＩＴＣＧＣＧＡ八Ａ　　　　ＡへＧＡＡＡＣ八八Ｇ
ＴＣＧへへＴＧ丁ＴＡ　　　　ＴＡＧ丁Ａ丁ＡＴＴＴ　
　　　ＡＴＴＡＴＡＡＴＡ丁　　　ＴＧＡＡＡＧＡＴＣ
丁ＴＣＧＡ−３゜ ＰＡＲ３２の核酸配列も次の通りであると決定されてい
る。
５°−ＴＣＧ八＾へＡＴＡＧ　　　　ＴＣＣＧＩＣＣＣ
ＣＧ　　　　ＧＧＧＧＡＡＧ八ＴＴ　　　へＴＡＴＴＧ
ＴＣＴＣＡＡＡＡＧＧＴＣ八八Ｔ　　　　ＴＴＣＡＴＡ
ＴＴＴへへ　　　へ■へＴＧＣへＴＴＣへＡＴＡＣＴＴ
ＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴへＡＴ　　　　ＴＴＡＧＣＴＴＧ
ＡＣＴへＣＧへ［ＧＣ八へ　　　へ丁へ＾１’ＴＴ’ｌ
’ＡＡ丁Ｔ１’ＴＡＴＴＴＴＡ　　　　ＡへＴＴＡＴＡ
Ｔへｒ　　　　ＧＡＧＧＴＡＡＧＡＧ　　　　丁Ａ丁Ａ
ＡＣＴＣｒＡＡＡＣＣＴ＾へＴＡＡ　　　　ＡＴＡＴＡ
ＴＡＡ丁丁　　　ＡＡＩＴＡＴ八ＣＧＣへ　　ＡＡＴ八
ＧへＴＡ八八へへＡｒＡＧＡ１’ｌ八　　　ＡＦＴ八Ｃ
へＡＣＴ八　へ　ＡｒＣＣＴ丁ｒｃＧｒ　　　　ＡＣＴ
ＡＡＧ丁ＴＧＴ八八ＴＣＣへへＴＡＴ　　　　ＴＧＡＣ
ＡＴＴＴＣＣＣ１八八ＡＧＣＡＧ＾　　　ＴＡＧ八八へ
へへＡ’ｒＡＣＴＧｒＣＴＣＡＣＧへＣＴＡｒＴＡＡＡ
　　　　ＣＣＣＡＡＣＴＣＡＣＧＴＡＡＣＣ丁ＴＴＴ当
該ＰＡＲ８がピキア中の自律要素としてプラスミドを保
持する能力を測定するために、プラスミドｐＹＪ３０及
びｐＹＪ３２で形質転換した酵母細胞の培養物を淘汰用
培地中で成育ざゼ、定期的にサンプルを採った。細胞中
でのプラスミド配列の状態は放射能で標識したｐＢＲ３
２２とυ）限酵素を作用させてない酵母のＤＮＡとサザ
ンハイプリダイゼーションにより決定した。プラスミド
ｐＹＪ３０及びｐＹＪ３２は、淘汰用培地中で少くとも
５０世代ピキア中での自律要素として保持されていた。
ピキア　パストリスの細胞あたりの平均プラスミドコピ
ー数は、ピキアＨＩＳＩ！伝子のゲノムコピー数とプラ
スミド由来のＨＩＳＪＷ伝子のそれとの比から導びき出
された。ｐＹＡ６３及びｐＹＪ３０　（それぞれＰＡＲ
８Ｉを含有）とｐＹＡ９０及びｐＹＪ３２（それぞれＰ
ＡＲ８２を含有）で形質転換したピキア　バストリス細
胞の場合では、ピキアの染色体ＨＩＳ４１伝子のコピー
に対するｅ’土７ＨＩｓ４遺伝子を含むプラスミドの平
均コピー数の比は約１０〜１５であった。
ここに記載した如く、誘導されたコピー数は、細胞あた
りのプラスミドコピー数に対する最小推定値を示すもの
であること、は、当業者には認識されている。
一般に、ピキア属の宿主中で自律複製能力を有　　　□
するＤＮＡ配列は、マーカー遺伝子を他のＤＮＡ配列の
間に含有しているが、ピキア内でＡＲ８能を有するＤＮ
Ａ配列を含まないベクター内に構築されたＤＮＡ断片の
ライブラリーで、ピキア宿主を形質転換することにより
分離できる。使用したマーカー遺伝子は、宿主の酵母に
選抜しつる遺伝表現型を与える。当該ベクターでの宿主
菌株の形質転換の発生頻度は、ＡＲ８能を有するＤＮＡ
配列がベクター中に存在するときに、修飾していないベ
クターでの形質転換の発生頻度と比較して、１ないしそ
れ以上のオーダーで増加する。それ故、形質転換された
宿主の選抜及び分離は、ＡＲ３能を有する挿入ＤＮＡ配
列をもつプラスミドを保有する生物を提供する。この方
法で、ＡＲ３能をく＝Ｅ７内で有するＤＮＡはいかなる
給源からのものでも容易に分離することができる。
実施例 以下の実施例で使用する緩衝液及び溶液は次の組成を有
する。
１モルトリス緩衝液： ８００−の水に１２１．１ＳＪのトリス塩基、ｐＨを所
望の値に濃塩酸（３５％）を加えて調整。
最終ｐＨ調整前に溶液を室温まで冷却し、最終液凹を１
１とする。
Ｔ、Ｅ緩衝液； １．０ミリモルＥＤＴＡを０．０１モルのトリス緩衝液
（ｐＨ＝７．０）に添加ＳＳＣ： ０．１５モルのＮａＣ１ １５ミリモルのクエン酸ソーダ ｐＨをＮａＯＨで７．０に調整 デンハート（ｐｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）氏溶液：５ｇのフ
ァイコール（Ｆｉｃｏｌｌ） ５ｇのポリビニルピロリドン ５ｇの牛の血精アルブミン（ＢＳＡ　：ペレ ンタツクス　フラク喝ヨンＶ） 水で全量を５００ｄとする。
Ｌ　Ｂ　（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　）培地：５ｇ
のバタトートリプトン ５ｇのバクトーイースト抽出物 ２．５ｇのＮａＣ１ を１ｆＪの水に含み、ｐＨは７．５に ＮａＯＨで調整 ＹＦ’Ｄ培地： １％のバクトーイースト抽出物 ２％のバタトーベブトン ２％のデキストローズ Ｓｌ地： ６．７５９のアミノ酸を含まない酵母用窒素源′（ｐｒ
ＦＣＯ装〉 ２％のデキストローズ を１ｊの水に含む ＳＥＤ　： １モルのソルビトール ２５ミリモルのＥＤＴＡ ５０ミリモルの０丁丁 ＳＣＥ緩衝液二 ９．１ｇのソルビトール １．４７ｇのクエン酸ソーダ ０．１６８ｇのＥＤＴＡ ５０−のＨ２Ｏ ｊｕｌｌをＨＣｆＪで５．８とする。
ＣａＳ　　： １モルのソルビトール １ミリモルのＣａＣｌ２ 濾過後、滅菌 Ｐ　Ｅ−Ｇ溶液： ２０％のポリエチレングリコール− １０ミリモルのＣａＣｌ１２ １０ミリモルのトリス塩酸塩（ｐＨ７，４＞濾過後、滅
菌 ＳＯＳ　： １モルのソルビトール ０．３倍のＹＰＤ培地 １０ミリモルのＣａ（Ｊ２ 次の略号を実施例で使用しているが、以下の意味を有す
るものである。
ＥＤＴＡ＝エチレンジ７ミン　テトラ酢酸５ＤＳ＝ドデ
シル硫酸ソーダ ＤＴＴ−ジチオスレイトール（ｄｉｔ旧ｏｔｈｒｅｉｔ
ｏｌ）数種類の操作手順をルーチン的に以下に詳細にの
べる標準手順にもとづき用いた。
遠心分離は澄明な上澄液が得られるに充分な回転速度で
、充分な時間をかけて行なった。一般には、酵母細胞の
遠心分列は少なくとも１．５００Ｇで少なくとも５分間
行なった。
核酸のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ルでの抽出は、フェノール、クロロホルム及びイソアミ
ルアルコールの、容お比で５８：４８：２の混合液を核
酸を含む溶液と等顔接触させることを含む。クロロホル
ム／イソアミルアルコールでの抽出は、クロロホルムと
イソアミルアルコールの容量比で４８：２の涙液を処理
すべき液と等量接触させることを含む。
ゲル、フィルターなどを特定の溶液で洗浄又は浸漬した
と記述している場合は、ゲル、フィルターなどの全体を
、当該ゲル、フィルター等の全表面を当該溶液に接触さ
せるために適当な容器（パン、皿、バイアルなど）のな
かにひたした。
エタノールによる核酸の沈澱はまず核酸を含む溶液の塩
類濃度を調整し、必要に応じ、二倍ａ）の冷エタノール
で溶液を接触させ、次いで遠心分離によ−り沈澱物を回
収することを含む。
Ａ、ＩＩＩ胞の成育 １、ＹＰＤ培地約１０ｄ中ヘビキア　パストリ２ＧＳ１
１５（ＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１）のコロニーを植え
つけ、３０”Ｃで１２−２０時間撮どう培養する。
２、約１２−２０時間後、０Ｄ６ｏｏで約０．０１から
０．１となるように細胞を希釈し、３、約６〜８時間後
、ｏＤ６ｏｏで約０．１　（又はその相当量）の種培養
０．５ｍを、ＹＰＤ培地１ｏｏｙに植付ケル。３０’Ｃ
Ｆ約１２−２０時間娠とう培養する。
４．０Ｄ６ｏｏが約０．２−０．３となったとぎ（約１
６−２０時間後）培養物を１５００ＧＦ５分間遠心分ｇ
ｌｔ　ｔ、、回収する。
Ｂ、スフェロプラストの調製 １．細胞を１度１０−の滅菌水中で洗う（ステップ１な
いし５の遠心分離は、すべて１５００Ｇ１５）分間であ
る）。
２、新たに調製したＳｌ：Ｄ１０ｄ中で細胞を洗う。
３、滅菌１モルソルビトール溶液１０ｄ中で細胞を２度
洗う。
４．１０ｄのＳＣＥ緩衝液に細胞を再分散する。
５、チモリアーゼ６０．０００　（マイルズ　ラボラト
リーズ社製）ｄ当り４　Ｑ含む溶液を５−１０μｐ加え
る。約３０−６０分、３０℃で細胞をインキュベートす
る。
スフェロプラストの調製は形質転換手順においては、危
険をはらんだ工程であるため、スフェロプラストの形成
を次の如くモニターする必要がある。細胞（を含む液）
１００μｍを９００μｐの５％ＳＯ８及び９００μｍの
１モルのソルビトールに、チモリアーゼの添加前又は添
加直後及びインキュベート期間中種々な間隔で加える。
ＳＤＳ中では細胞が溶解するが、ソルビトール中では溶
解しない点（通常３０から６０分のインキュベーション
）でインキュベーションを停める。
６、スフェロプラストを滅菌した１モルのソルビトール
１０ＩＩＩｉ！中で、１．０ＯＯＧで５−１０分遠心分
離しながら二度洗浄する（遠心分離のための時間及び速
度は変動する。スフェロプラストがペレット化するに充
分なだけ遠心分離する、しかし、その力で破壊されるほ
どであってはならない）。
７６滅菌したＣａ５１０ｄ中で１度洗う。
８、全量で０．６ｄのＣａＳに細胞を再分散させる。
Ｃ０形質転換 １、ＤＮＡのサンブイレ（２０μｍの客間まで）を１２
Ｘ７５ｍ＋の滅菌したポリプロピレン管に加える（ｐＮ
Ａは水又はＴＥ緩衝液中に分散されて　　　　゛いるこ
と：少量のＤＮＡで最大限の形質転換手順ましい）。
２゜１００μｍのスフェロプラストを各ＤＮＡサンプル
に加えて、室温で約２０分間インキュベートする。
３．１ｍｌ！のＰＥＧ溶液を冬ザンブルに１ｄ加え、’
ｆＮで約２０分間インキュベ−１・する。
４、サンプルを１５００Ｇで５〜１０分間遠心分離し、
ＰＥＧ溶液をデカンテーションにより除く。
５、サンプルを、５Ｏ３１５０μρ中に再分散し、室温
で３０分間インキュベートする。
６、滅菌した１モルのソルビトール溶液８５０μｍを加
え、以下に記載した様に少量のサンプルをとり平板培養
する。
Ｄ、スフェロプラストの再生 １□再生用寒天培地の組成 ａ、寒天−ソルビトール培地：９ｇのバクト寒天、５４
．６ｇのソルビトール、２４０ｄの水、高温滅菌する。
ｂ、グルコース１０倍培地；　２Ｃ１のデキストローズ
、１００＃！ｉ！の水、高温滅菌する。
ｃ、５ｃｉｏ倍培地：６．７５ｇのアミノ酸を含まない
酵母窒素源、１００ａｉ！の水、高温滅菌する（所望の
アミノ酸又は核酸を２００μ９／ｌｄの濃度まで高温滅
菌前又はその後に加える） ｄ、３−Ｏｄのグルコース１０倍培地及び３０ｍのビオ
チン液０．２ｄ、及び所望のアミノ酸又は核酸を２０μ
ｇ／ＩＩｉの濃度まで加える。
溶解した再生用寒天培地を５５−６０℃に保つ。
２、形質転換したサンプルの平板培養 形質転換サンプルが用意できる少なくとも３０分前に、
プレートあたり１０１１１の再生用寒天培地よりなる基
底部寒天層を注ぐ。試験管に再生用寒天培地１０ｄを、
形質転換サンプルがＳＯ８中に入れである間に、４５−
５０℃のノ＼ス上で、分散させる。再生用寒天培地の入
った試験管に適当翅の形質転換サンプルを加え、プレー
ト内の基底部寒天層上に注ぐ。４５−５０℃に保った溶
融状態の再生用寒天培地１０ａｉ！にそれぞれのサンプ
ルを適当吊用え、再生用寒天培地よりなる固まった１０
Ｉｄの基底部寒天層上にそれぞれを注ぐ。
３、スフェロプラスト調製品の品質の決定１サンプル当
り１０μｐをとり、１Ｍのソルビトール９９０μｍを加
えて１００倍に希釈する。
１００倍希釈液を１０μｇとり、９９０μｉ量の１Ｍの
ソルビトールを再び加えて更に１００倍希釈する。　　
　　　　　　′−−゛ Ｆ井ヰ千調製品中にスフェロプラスト化されずに１チジ
ンを加えた再生寒天１０ｄに、全再生可能なスフェロプ
ラストを測定するため核希釈液を１００μρ加える。形
質転換実験のための良好な値としては、−当り１−３Ｘ
１０′の全再生可能なスフェロプラストと−当り約１×
１０３の完全細胞である。
４、平板培地を３０℃で３−５日間培養する。
実施例？ ピキア　バストリス自律複製配列の分離及び特性決定 Ａ、１旦 使用した菌株は次の通りである。
（ａ）ピキア　パストリス　ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３
０株 （ｂ）　　ピキア　パストリス　ＮＲＲＬ　　Ｙ−１５
８５１（ＧＳ１１５−ｈｉｓ４）、及び（ｃ）大腸菌８
４８株（Ｆ　”　ｌｅｔ　ｔｈｉ　ｇａｌ−ｒ１Ｒφ８
０ＳｈｓｄＲ−ｈｓｄＭ＋） Ｂ、プラスミド ｐＹ〜イ第９図参照）は、Ｉ）　Ｂ　Ｒ３２−５のＰＳ
ｔＩ部位に挿入さ、れた９、３Ｋｂ　　ＰｓｔＪ断片上
のＬ２・セレビシェのＨＩＳ４ｍ伝子より構成されて居
り、それは互２・セレビシェＨＩＳ４遺伝子断片の給源
であり、大腸菌宿主に移入してあり、ＮＲＲＬ　　Ｂ−
１５８７４として公衆が入手可能である。
ｐＹＪ８ΔＣＪ　ａ　（第５図参照）はｐＹＪ８のｍ１
体であり、ｐＹＪ８のＣ１ａ■消化及びリゲーションに
より作り出されたものである。
ｃ、Ｌｔ！！ ピキア　パストリスはＹＰＤ（富裕）培地又はＩＭＧ（
最少）培地で成育させた。ＩＭＧ最少培地は次のちのよ
り構成されている。
１．１Ｍ１塩類、最終濃度で３６．７ミリモルのＫＨＰ
Ｏ４，２２，７ミリモルの （ＮＨ）　　Ｓ・０　．２．０ミリモルのＭｇｎｏ　　
・７Ｈ２０，６，７ミリモルのＫＣＩ、０．７ミリモル
のＣａＣｊ！　　−２Ｈ２０：１０倍の貯蔵液として調
製し、高温滅菌したもの２、微ｆｆｉ塩類、最終′ａ度
で０．２マイクロモルのＣｕＳ０　・５Ｈ２０１１，２
５マイクロモルのＫｌ、４．５マイクロモルの Ｍｎ５Ｏ・Ｈ２，０１２，ＱｖイクロモルのＮａＭＯｏ
　・２Ｈ２０，０，７５？イクロモルのＨ８０，１７，
５マイクロモルの ＺｎＳ０　・７Ｈ２０，４４，５’？イクロモルのＦｅ
ＣＪ　　−６ＨＯ４００倍貯蔵液として調製し、濾液を
滅菌した。
３．０．４μｇ／ｄのビオチン及び ４．２％デキストローズ 大腸菌はＬＢ培地又は２Ｂ培地（ｏ，２％ＮＨＰＯ，１
，２％ｌ’、ｌａ　　ＨＰＯ４，０，０１３％Ｍｏｎｏ
　　・７日２０．０．０７４％ＣａＣｊｌ　・２Ｈ２０
Ｓａｉ！当り１マイクログラムのチアミン及び０．４％
デキストリン）、１００μｊ！／ｄのトリプトファン及
び０．２％カザミノ酸を追加添加したもので培養した。
Ｄ、ＤＮＡ分離 ＤＮＡ調製物は酵母細胞を八〇ｏｏが１−２となるまで
最小培地１００ｄを成育させ、次いで２．０ＯＯＧで５
分間遠心分離して細胞を回収する。当該細胞を水、ＳＥ
Ｄ、１モルのソルビトール中でそれぞれ１度洗浄し、次
いで１Ｍのソルビトールに分散した細胞を５ｄの０．１
モルのトリス一端１１（ｐＨ＝７．０）に分散した。細
胞をチモラーゼ６０，０００　（マイルズ　ラボラトリ
ーズ社製）の４ｑ／ｄ溶液５０−１００／μｍと混合し
て、細胞壁を消化するために１時間３０℃でインキュベ
ートした。スフェロプラスト調製品を１．０ＯＯＧで５
−１０分間遠心分離し、溶菌用ｇ耐液（ｏ，１％ＳＤＳ
、１０ミリモルのトリス−塩酸（ｐＨ７，４）　、５ミ
リモルのＥＤＴＡ及び５０ミリモルのＮａＣｆＪ）に懸
濁した。プロテナー１２Ｋ（ベーリンガーマンハイム社
製）及びＲＮア チーゼＡ（シグマ社製）をそれぞれ１００μｆＪ／−の
割合で加え、混合物を３７℃３０分間インキュベートし
た。ＤＮＡは、イソアミルアルコールを含有するクロロ
ホルムを調製物と等量しずかに混合し、蛋白を除き、各
相を１２．０ＯＯＧで２０分間遠心分離することにより
分離した。上の（水）相を新しい試験管に移し、当量の
フェノール／クロロホルム／インアミルアルコール混合
液で抽出した。各相を前と同様分離し、最上相を２−３
０但の冷１００％エタノールを含む試験管に入れた。サ
ンプルをしずかに混合し、ＤＮＡをプラスチック１捧の
上にまきつけて回収した。当該ＤＮＡをただちに１ｊ１
１！のＴＥ緩衝液に溶解し、１００倍屋０ＴＥｕｉ液で
４０℃で１晩透析した。
２、小量　酵母ＤＮＡＩ製動 Ａ６ｏｏで１−５でなるまで５ｙｄの酵母の培養物を最
少培地で成長させ、次いで２，０ＯＯＧで５分間遠心分
離し、回収した。細胞を１１ＩｄｌのＳＥＤに懸濁し、
１．５ｄの極小遠心管に移し、１モルのソルビトール中
で１度洗い、１モルのソルビトールに分散させた細胞を
０．１モルトリス塩酸（ｐＨ７，４）０．５ｄ中に懸濁
した。チモリアーゼ６０，０００　（マイル　ラボラト
リーズ社＝４ｑ／ｌｔｄの溶液を１０μ、１）各サンプ
ルに加え、当該細胞を３０℃モ、３０−６０分間インキ
ュベートした。１胞は次いで１分間遠心分離し、溶菌用
　　　・。
緩衝液中に懸濁し、６５−７０℃でインキュベートした
。１５分後にサンプルを５モルの酢酸カリウム１００μ
ｍと混合し、来泊中に１５分間保持し、５分間遠心分離
した。上澄液を１００％のエタノール１ａｌｔを含む新
しい極小遠心管中ヘデカンテーションし、混合後ただち
に１０秒間遠心分離した。最終的にベレットを１０−１
５分間風乾し、５０μＡのＴＥ援衝耐液溶かした。
３、大規模大腸菌ＤＮＡの分Ｎｔ 大規模（ｏ，５−１１）の７ラスミド調製物用の大腸菌
の培養物は、上述の如く補足され、かつ適当な抗生物質
を含む２Ｂ培地中で３７℃で振どう培養により成育させ
た。ｐＢＲ３２２由来のプラスミドを含む細胞の場合に
は、Ａ３５ｏで約０．７まで培養し、その時点で１００
μｇ／ｄとなるように充分量のクロラムフェニコールを
加え、細胞をおおよそ１５時間後に回収する。ｐＢＲ３
２５由来のプラスミドを含む菌株は、補足された２Ｂの
培地中に、当初のＡ３５ｏが約０．０１−０．０５とな
るよう移植し、回収前２０−２４時間３７℃で振とうイ
ンキュベートした。プラスミドをビルンボイム（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ）及びドーリ−（ｐＯＩＶ）のアルカリ溶菌
法（１９７９年）により分離した。
４、小規模大腸菌ＤＮＡ調製物 小量の迅速プラスミド分離のために、抗生物質を含み、
補充した２Ｂ培地中の２Ｉｌ！ｉ！の培養物を３７℃で
振どう培養し、１．５ｍの極小遠心管中で遠心分離によ
り回収した。プラスミドはビルンボイム及びドーリ−の
アルカリ溶菌法（１９７９年）により分離した。
Ｅ、ＤＮＡの制限（酵素）及び断片の　離制限酵素はニ
ュー・イングランドバイオラボズ及びベセスダ（８ｃｔ
ｈｅｓｄａ　）リサーチラボラトリーズから入手し、消
化は常套手段により行なった。
制限（酵素）の地図化は、挿入ＤＮＡを有するか又は有
しないプラスミドの並行消化物の比較により実施した。
制限断片はアガロースゲルから透析管材料でバックアッ
プされたワットマン３ＭＭ紙片への電気溶出により純化
した。断片は、紙及び管材料から０．１モルのＮａＣＪ
１５０ミリモルのトリス−塩Ｍ（＋）Ｈ８，Ｏ）と１ミ
リモルのＥＤＴＡを含む溶液０．１ないし０．２ｄを用
い、３〜４回洗浄し、回収した。最後に、断片をフェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、
エタノールで沈澱させ、少缶のＴＥ緩衝液に再溶解した
。
ｐ、ｅ’二・パストリス自律複製配列ライブラリーの大
腸菌での構築 ピキア　パストリスＤＮＡ−１）ＹＪＢΔＣｊｌａライ
ブラリー構築のために、５０μびのｐＹＪ８ΔＣｌａを
Ｃｊ！ａＩＦ完全に消化し、仔牛の腸アルカリン　フォ
スファターゼで処理し、ＤＮＡから末端の５′ホスフエ
ートを除去した。
く土ｌバストリスＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５１からのＤ
ＮＡ１００μグを、全量で１１ｒ１．とじ、２０単位−
のＴａｑ　Ｉを用いて、６５℃で５分間インキュベート
することにより一部消化を行なった。５ないし１０Ｋｂ
ｐの断片を０．５％アガロースゲルから電気溶出により
（本実施例、Ｅ項参照）大きさにより分離した。当該ベ
クターの１μびと２μびのピキア　ＴａｑＩ断片とを、
総容量２００μｐ中で７４ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ　
リサーベートすることにより形質転換した。混合物を５
分間で３７℃までに加温し、その時間経過後ＬＢ培地４
０ｍを加え、３７℃のインキュベーションを更に１時間
つづけた。次いで７ンピシリンを加え、全濃度で１００
μｇ／ｍとし、インキュベーションを再び１時間つづけ
た。最後に、細胞を３．０ＯＯＧで１０分間遠心分離し
、新しいＬＢ培地１１ｄｌ中に再び懸濁させ、１００μ
ｇ／ｄのアンピシリンを含む１０個のＬ８寒天平板培地
上に等量づつ広ろげた。結果として約ｉｏ、ｏｏｏコロ
ニーが発生したが、それを平椴培地からかき取り、細胞
の１部分を、当初のＡ５５゜が約０．１となるまで５０
０ｄの補充した２Ｂ培地に植えた。
培養物を成育させ、プラスミドを上述の方法により抽出
した。
Ｇ、サザンハイプリダイゼーション ハイプリダイゼーションはサザンの方法（１９７５年）
により実施した。大きい、又はスーパーコイル型ＤＮＡ
分子のニトロセルローズへの移転には、アルカリ変性に
先立って、アガロースゲルを１０分間０．２５モルの１
−ＩＣｊ中に浸漬することによりＤＮＡをまず一部加水
分解した。
昼・セレビシェのＨＩＳ４ｍ伝子由来０標識した断片の
、ピキア　バストリス　ＤＮＡへのハイブリダイゼーシ
ョンは５０％のホルムアミド、６０椿の５ＳＣ１５倍軸
のデンハルト氏液、０．１％ＳＤＳ　　１ミリモルのＥ
ＤＴＡ、１００μｇ／蔵の変性したニシンの精子ＤＮＡ
の存在下で４２℃で行なった。ハイブリダイゼーション
後の洗浄は、２倍ｉの５ＳＣ１１ミリモルのＥＤＴＡ。
０．１％のＳＯ８及び１．０％のピロリン酸ソーダ中で
５５℃で行なった。
Ｈ、３２ｐ−標識 ニック翻訳はリグビイ（Ｒｉｃ＋ｂｙ　）らの方法（１
９７７＞で実施した。
１、ＤＮＡ配列の決定 ＤＮＡ配列の決定はサンガー（’Ｓａｎｇｅｒ）等のジ
デオキシヌクレオチドチェーン　ターミナーション方法
（１９８０年）によった。
Ｊ、ピキアの自律ＩＩ製配列 上記Ｆ項に記載した如く構築されたピキア　ライブラリ
ーを用いてピキア　ｔ＜Ｘ上ＩＨＮＲＲＬ　　Ｙ−１５
８５１を形質転換した。プラスミドＤＮＡを大腸菌内で
増幅し、回収し、ピキＺ　パストリス　ＮＲＲＬ　　Ｙ
−１５８５１を形質転換するのに使用した。プラスミド
は、次いで、約１０．０００のＨｉｓ＋ピキア　コロニ
ーがらし。
回収券４大腸菌の形質転換に用いた。
１０．０００のアンピシリン抵抗性大腸菌コロニーを分
離し、り二・バストリスＮＲＲＬ　　’／−１５８５１
（ＧＳＩ　１，５；ｈｉｓ４）へと逆形質転換した。こ
のサブライブラリー形質転換体がら４０のＨｉｓ”ｉｌ
母コロニーを淘汰用培地に別々に塗布し、独立して淘汰
用培地中で成育させた。
全酵母ＤＮＡをこの４ｏの培養物の各々から抽出し、大
腸菌を形質転換した。二つのプラスミド、ずなわち、Ｐ
ＡＲ８Ｉを含むｐＹＡ６３及びＰＡＲ８２を含むｐＹＡ
９０を更に解析するために選抜した。このプラスミドは
両者ともピキアバストリアスＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８５
１（ＧＳ１１５）を高頻度で形質転換でき、自律要素と
して保持され、それぞれζ二・バストリスＤＮＡの新規
断片を含有していた。
ピキア　ＡＲ８含有プラスミドをピキア　ｔ＜Ｘトリス
ｌ０ＩＩｌｉ中での自律要素として保持されうる能力に
ついて次の如き方法で決定した。形質転換体のコロニー
を再生寒天平板培地からとり、ＳＤ寒天培地上に塗布し
、液体ＩＭＧ培地へと移植した。
そのＳＤ平板培地を３０℃で３日間培養し、その時点で
一つのコロニーを平板培地からつまみとり、再びＳＤ平
板培地上に塗布し、ＩＭＧ培地を含むフラスコへ再度植
え継いだ。この過程を３回繰返した。この３個のＩＭＧ
＠ｉ物を３０℃でＡ６ｏ。
で約１−２となるまで振とうしながら成育させ、３０ボ
ルト、３０ミリアンペアで１０ないし１５時間０．８％
アガロースゲルへと電気泳動し、次いでニトロセルロー
スへと移転させ、上述の如く３２Ｐ−標識のｐＢＲ３２
２又はｐＢＲ３２５にハイブリダイゼーションした。対
照として大ａｍから分離したプラスミド１０ｎｏを含む
サンプルと形質転換してないピキア　バストリスＮＲＲ
Ｌ　　Ｙ−１５８５１（ＧＳＩ　１５）ＤＮＡを１−２
μび含むサンプルを実験サンプルと一緒に電気泳動させ
た。
検査したピキア　ＰＡＲ８含有プラスミド形質転換体の
各々とは、標識したプローブは、大股筒から分離したプ
ラスミドと同一のパターンで、ハイブリッド化した。対
照として、 ｐＹＪ８ΔＣＪ　ａ　（ピキア中ではＡＲ８活性を有す
る統合的形質転換ベクター）で形質転換した場合、標識
したプローブはピキア　パストリスＮＲＲＬ　　Ｙ−１
５８５１（ＧＳ１１５）からの大きな分子量の染色体Ｄ
ＮＡにハイブリダイゼーションすることが見出された。
プローブは形質転換されていないＮＲＲＬ　　Ｙ−１５
８５１からのＤＮＡとハイブリダイゼーションしながっ
た。
ピキア中で自律要素としてプラスミドを保持するための
ＰＡＲ３活性のより定量的手段として、１）ＹＪ３０及
びｐＹＪ３２プラスミドで形質転換した酵母の培養株を
淘汰用培地で成育させ、定期的にサンプル採取した。細
胞中のプラスミド配列の状態は、ｔｌＪ限酵素未処理の
酵母のＤＮＡを放射能で標識したｐＢＲ３２２にサザン
ハイブリダイゼーションすることにより、決定した。プ
ラスミドｐＹＪ３０及びｐＹＪ３２は、ピキア中でずく
なくとも５０世代淘汰培地中で自律要素として保持され
た。
Ｌ　、プラスミドコピー数の決定 く二・バストリス細胞あたりの平均コピー数は、く二・
パストリスＨＩＳ４のゲノムコピーの酊とプラスミド由
来のＨＩＳ４ｆｆｌ伝子の最の比がら導びき出された。
検査対象菌株は、ビキアト１１８４Ｗ伝子を含むプラス
ミドを含有しているので、ＤＮＡを抽出し、制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、ニトロセルロースフィルターに
移転し、く土ｌ　ＨＩＳ４遺伝子を含有する２、７Ｋｂ
。
の　Ｐ−標識のＬＳ；Ｌ！ＬＩ［断片でハイブリダイゼ
ーションした。ボストハイブリダイゼーションの洗浄後
、一連のＸ−線フィルムを一定時間フイルターに曝露し
、平板ゲルのためのコムプセットモジュール（ｃａｍｐ
ｕｓｅｔ　Ｍｏｄｕｌｅ　）でプログラム化したベック
マンｏｕ−ａｓスペクトロホトメーター上で走査した。
結果は表にまとめて示す。
表 ＰＡＲ３ピゝア　バスト１ス３′ＦＨ４の＃性プラス　
　　自律複製　　９照図　自律要素　コピミ　ド　　　
配　　列　　　　　　　としての　−数□　　　　　　
　　′　　□　１Ｊ■１−−ＰＹＭ４　　　　　　　　
　　　６　　　　　−　　−ｐＹＪ３０　　ＰＡＲ３Ｉ
　　　　７　　　　　５０　１３−ｐＹＪ３２　　ＰＡ
Ｒ３２８５０１３下記の文献を水明１ＢＴＢ中で引用し
た。
ピルボイム及びドーリ−（１９７９年）核酸研究７巻、
１５１３−１５２３頁 ［Ｂｉｒｎｂｏｉｓ　ａｎｄ　０ｏｌｙ（１９γ９）Ｎ
ｕｃｌ、　ＡＣｉｄｓ　Ｒｅｓ、　７゜１５１３−１５
２３　；　］ ヒンネン等（１９７８年）米国国立教養学会大会講演集
、７５巻、１９２９−１９３３頁【旧ｎｎｅｎ　ｅｔ　
ａｌ（１９７８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、、ｕｓＡ７５、１９２９−１９３３］ リグビイ等（１９７７年）分子微生物学部、１１３巻、
２３７頁 （Ｒｉａｂｙ　ｅｔ　ａｌ（１９７７）Ｊ、Ｈｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、　１１３，２３７］サザン（１９７５年）分子
微生物学部、９８巻５０３−５１７頁 ［５ｏｕｔｈａｒｎ（１９７５）Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ
、９８，５０３−５１７］サンガー等（１９８０年）分
子微生物学部、１４３巻、１６１−１７８頁 ［Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ　（１９８０）Ｊ、Ｈｏ１
．Ｂｉｏｌ、　１４３，１６１−１７８］
【図面の簡単な説明】
第１因はこの発明の自健Ｗ製配列（ＰＡＲＳｌ＞の制限
酵素！！！！図を示す。 第２因はこの発明の自噴複製配列（ＰＡＲ３２）　　　
　“の１ｓＩｆＪｉ界素地図を示す。 第３図はプラスミドＹＥρ１３の邦１湿醇素地図を、第
４図はプラスミドρＹＪ８の１ｉｌｌ限酵清！！！図を
、第５因はプラスミドρＹＪ８ΔＣＮ旦の制限醇素地口
を、第６図はプラスミドＯＹＭ４の制限酵素地固を、第
７０はプラスミドｐＹＪ３０のシ１限酵素地図を、第８
因はプラスミドｐＹＪ３２の制限＃素地図を、第９図は
プラスミド０ＹＡ２の制限扉素地因を示す。

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）￥ピキア￥属の宿主内で、染色体外要素として１
    細胞あたり数多くのコピー数のプラスミドを保持する自
    律複製配列よりなるＤＮＡ断片であつて、当該ＤＮＡ断
    片を含むベクターでの当該宿主の形質転換頻度を当該Ｄ
    ＮＡ断片を含まないベクターでの当該宿主のそれと比較
    して増加させることのできるＤＮＡ断片。
  2. （２）当該自律複製配列が酵母由来である特許請求の範
    囲第１項記載のＤＮＡ断片
  3. （３）当該酵母が￥ピキア￥属より選ばれたものである
    特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ断片
  4. （４）当該酵母が￥ピキア￥　￥パストリス￥種の一員
    である特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ断片
  5. （５）当該酵母が￥ピキア￥　￥パストリス￥ＮＲＲＬ
    　Ｙ１１４３０である特許請求の範囲第４項記載のＤＮ
    Ａ断片
  6. （６）当該ＤＮＡ断片が第１図の図（ＰＡＲＳ１）の制
    限地図に示したように特性が明らかにされた特許請求の
    範囲第１項記載のＤＮＡ断片
  7. （７）当該ＤＮＡ断片が第２図の図（ＰＡＲＳ２）の制
    限地図に示したように特性が明らかにされた特許請求の
    範囲第１項記載のＤＮＡ断片
  8. （８）当該断片が次のヌクレオチド配列か、機能的同等
    物又はそれらの合理的な変形である特許請求の範囲第６
    項記載のＤＮＡ断片： 【ＤＮＡ配列があります】
  9. （９）当該断片が次のヌクレオチド配列か、機能的同等
    物又はそれらの合理的変形である特許請求の範囲第７項
    記載のＤＮＡ断片 【ＤＮＡ配列があります】
  10. （１０）￥ピキア￥属の宿主を形質転換でき、当該宿主
    内に染色体外要素として保持されている自律複製配列を
    含むハイブリッドプラスミド
  11. （１１）当該自律複製配列が第１図の図の制限地図に示
    されたように特性が明らかにされた特許請求の範囲第１
    ０項記載のハイブリッドプラスミド
  12. （１２）当該自律複製配列が第２図の図に示されたよう
    に特性が明らかにされた特許請求の範囲第１０項記載の
    ハイブリッドプラスミド
  13. （１３）当該プラスミドが第７図の図（ｐＹＪ３０）の
    制限地図に示したように特性が明らかにされた特許請求
    の範囲第１１項記載のハイブリッドプラスミド
  14. （１４）当該プラスミドが第８図の図（ｐＹＪ３２）の
    制限地図に示されたように特性が明らかにされた特許請
    求の範囲第１２項記載のハイブリッドプラスミド
  15. （１５）￥ピキア￥属に属する宿主に染色体外要素とし
    て保持されている組換ＤＮＡ材料用の、当該宿主である
    形質転換された酵母
  16. （１６）当該組換ＤＮＡ材料が第７図の図にあらわにし
    た制限地図を有するプラスミドｐＹＪ３０である特許請
    求の範囲第１５項記載の形質転換した酵母
  17. （１７）当該組換ＤＮＡ材料が第８図の図にあらわされ
    た制限地図を有するプラスミドｐＹＪ３２である特許請
    求の範囲第１５項記載の形質転換された酵母
  18. （１８）（ａ）大腸菌ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８９０（ＬＥ
    ３９２−ｐＹＪ３０）を栄養培地中で培養し、 （ｂ）培養して得られた細胞を粉砕し、 （ｃ）粉砕した細胞よりプラスミッドｐＹＪ３０を回収
    し、 （ｄ）制限酵素の組合せＥｃｏＲ I −ＨｉｎｄIII又は
    Ｔａｑ I のうちの一つで消化し、 （ｅ）第１図の図（ＰＡＲＳ１）における制限地図によ
    り特性が明らかにされたＤＮＡ断片を回収する ことよりなる同断片の分離方法
  19. （１９）（ａ）大腸菌ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８９１（ＬＥ
    ３９２−ｐＹＪ３２）を栄養培地中で培養し、 （ｂ）培養して得られた細胞を粉砕し、 （ｃ）粉砕した細胞よりプラスミドｐＹＪ３２を回収し
    、 （ｄ）制限酵素の組み合せＥｃｏＲ I −ＨｉｎｄIII、
    Ｃｌａ I −ＨｉｎｄIII又はＴａｑ I のうちの一つで
    消化し、 （ｅ）第２図の図（ＰＡＲＳ２）における制限地図によ
    り特性が明らかにされたＤＮＡ断片を回収する ことよりなる同断片の分離方法
  20. （２０）￥ピキア￥属に属する宿主酵母中で自律複製配
    列活性を有するＤＮＡ配列を、その給源のいかんにかか
    わらず、分離する方法において、 （ａ）当該宿主酵母内で選抜しうる遺伝表現型を授ける
    機能遺伝子よりなるマーカー遺伝子を含むベクターで、
    そのマーカー遺伝子と当該ベクターで細菌を形質転換し
    、細菌宿主中で当該ベクターを増幅し、形質転換された
    細菌宿主を選抜しうる細菌性配列を有し、本質的には酵
    母由来の自律複製配列能を有さないベクター中にＤＮＡ
    断片のライブラリーを用意し、 （ｂ）当該マーカー遺伝子を当該酵母中で選抜できる、
    当該ライブラリーで当該酵母を形質転換し、 （ｃ）ステップ（ｂ）で得られた形質転換した酵母を回
    収し、淘汰条件下で成育させ、 （ｄ）淘汰条件下で生存する細胞から全ＤＮＡを抽出し
    、 （ｅ）ステップ（ｄ）で得た全ＤＮＡでコンピテント大
    腸菌細胞を形質転換し、 （ｆ）ステップ（ｅ）で得た形質転換された大腸菌細胞
    を当該細菌性配列が抵抗性を提供する抗生物質を含む培
    地よりなる淘汰条件下で成育させ、 （ｇ）当該形質転換された大腸菌細胞からプラスミドを
    回収し、 （ｈ）ステップ（ｇ）で回収したプラスミドで当該酵母
    を形質転換し、 （ｉ）ステップ（ｈ）で得られた形質転換した酵母宿主
    を淘汰条件下で成育させ、 （ｊ）ステップ（ｉ）の淘汰条件下で順調に成長したコ
    ロニーを回収、純化し、 （ｋ）純化したコロニーを液体培地に移し、淘汰条件下
    で成育させ、 （ｌ）液体培地中で成育した培養体から全ＤＮＡを回収
    し、 （ｍ）ステップ（ｌ）で回収したＤＮＡでコンピテント
    大腸菌細胞を形質転換し、 （ｎ）ステップ（ｍ）でもつとも高い形質転換頻度を与
    えたコロニーを選抜し、 （ｏ）ステップ（ｎ）で選抜したコロニーからプラスミ
    ドを回収し、そして （ｐ）ステップ（ｏ）で回収したプラスミド中に含まれ
    ている挿入ＤＮＡ断片を取り、特性づけることよりなる
    当該ＤＮＡの分離方法
  21. （２１）当該ベクターが第５図の図に示したようなｐＹ
    Ｊ８ΔＣｌａである特許請求の範囲第２０項記載の方法
  22. （２２）当該ベクターが第６図の図に示したようなｐＹ
    Ｍ４である特許請求の範囲第２０項記載の方法
  23. （２３）当該宿主が栄養要求性￥ピキア￥　￥パストリ
    ス￥ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１（ＧＳ１１５）である特
    許請求の範囲第２０項ないし２２項記載の方法
  24. （２４）大腸菌ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８９０（ＬＥ３９２
    −ｐＹＪ３０）
  25. （２５）大腸菌ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８９１（ＬＥ３９２
    −ＰＹＪ３２）
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