CN1042566A

CN1042566A - 水稻总dna自主复制顺序的分离方法

Info

Publication number: CN1042566A
Application number: CN 88107498
Authority: CN
Inventors: 任大明; 石红; 庞坚
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 1988-11-08
Filing date: 1988-11-08
Publication date: 1990-05-30

Abstract

以能在大肠杆菌复制，但不能在酵母菌中复制的YI_p5质粒作为克隆载体，鸟枪法克隆了水稻总DNA中的ARS顺序。本发明采用了两步转化法，即首先用连接反应液转化大肠杆菌，再用大肠杆菌转化子的混合质粒库去转化酵母菌，起了“放大”作用，增加了筛选转化子的机会。改进的酵母再生培养基提高了转化频率。

Description

本发明属于植物分子遗传工程领域。

在酵母细胞中进行的自主复制的真核生物DNA的特定DNA顺序被简称为ARS。水稻总DNA中ARS的分离和人工染色体的构建为植物遗传工程提供了可能的载体，为选择生物优良品种打下了基础。

目前，一般真核生物的ARS顺序的分离均以YIp5（pBR322加酵母菌的URA3基因）为克隆载体。已有人从非洲爪蟾的线粒体DNA中分离出ARS顺序（见V.A.Zakian PNAS，78，pp3128-3132，1981）。也有人从衣藻叶绿体DNA中分离出ARS顺序（见T.Yamada et al.，Plant Molecular Biology，6，pp245-52，1986）。但尚没有报道从水稻总DNA中分离ARS顺序的工作。

此外，传统分离ARS的步骤一般为，将载体质粒DNA和供体DNA连接混合物直接去转化酵母菌，最后选择转化子。这种方法的缺点是需要的DNA量较大，内切酶、连接酶消耗较大，得到的转化子数量不多，因而灵敏度低。

本发明以水稻总DNA为供体，将载体和供体DNA分别酶切、连接混合后首先转化大肠杆菌HB101，再将混合的大肠杆菌转化子制备成混合的质粒DNA库，然后再用这些扩增的质粒DNA去转化酵母菌，最后再筛选转化子。由于大肠杆菌的转化方法简便，而且转化频率高，质粒DNA经这样一次“放大”后再去转化酵母菌，就大大提高了酵母菌转化子的得到频率。

同时本发明对传统的酵母菌原生质体转化中采用的转化用再生培养基进行了改进。降低了再生培养基中的琼脂比例，从传统的3.1%琼脂下降至1.2%～1.5%琼脂。同时适量增加了传统的酵母菌再生培养基中不用的牛血清白蛋白，其含量为0.1%～0.2%，使酵母菌的转化频率提高2～3倍，有利于转化子的筛选。

本发明的实施例如下：

将1～2μg的质粒YIp5DNA和10～20μg的水稻总DNA分别用10单位～50单位的HindⅢ完全酶切，然后用65°～70℃高温使反应液中的内切酶失活，用酒精沉淀法回收酶切后的质粒DNA和水稻总DNA，最后混合后用10-20单位的T4连接酶连接。连接反应结束后，用连接反应液去转化制备好的感受态大肠杆菌HB101。在含有50μg～100μg/ml氨苄青霉素的LB平皿上得到大量转化子，将所有的转化子用LB液体洗下，35℃～37℃培养10～15小时后，立即抽提质粒DNA，这样得到的质粒DNA实际上是一个混合的质粒DNA库，由琼脂糖凝胶电泳检查，呈现一条十分宽阔的质粒带。再将这个混合的质粒DNA库去转化酵母菌。酵母菌原生质体的转化过程如下：将酵母菌8534-8C用YEPD培养液培养至OD＝0.264～0.3，4，000g～5，000g离心5～10分钟收集细胞，细胞用1.0～1.2M的山梨醇洗2～3次。200ml的细胞用15ml～20ml的山梨醇。最后将细胞悬浮在4～5ml的1.0～1.2M山梨醇中。加5～10μl的基乙醇，100～150μl的蜗牛酶（200单位～300单位），30℃～32℃中保温2～3小时，脱细胞壁成原生质体，在这段时间中2～3次温和地摇动溶液。2000g～3000g离心3～5分钟收集原生质体。5～10ml的1.0～1.2M山梨醇洗原生质体两次。最后将原生质体悬浮在1.0～1.5ml的1.0～1.2M山梨醇悬浮液〔10-15mM Tris-Cl（pH7.0～7.5），10～15mM CaCl₂〕，每0.1ml的悬浮液中加入待转化的质粒DNA（1～2μg），加0.8～1.0ml的40%～45%的PEG溶液〔10-15mM Tris-Cl，pH7.0-7.5，10～15mM CaCl₂〕，2，000g～3，000g离心3～5分钟，收集原生质体，用0.5～1.0ml的1.0～1.2M山梨醇〔10～15mM Tris-Cl pH7.0～7.5，10～15mM CaCl₂〕悬浮，和15～20ml再生培养基混匀后倒平皿，30℃～32℃中培养2～3天。从而得到很多酵母菌转化子。制备单个酵母转化子的总DNA，再去转化大肠杆菌HB101，从各个酵母菌得到的总DNA，再转化得到一系列不同的大肠杆菌转化子，再单独分别地抽提这些不同的大肠杆菌转化子的质粒DNA，再分别地去转化酵母菌，看其是否能高频率地转化酵母菌，如果能，则说明该质粒DNA上带有能自主复制的ARS顺序，也即得到了能在酵母菌中的自主复制的从水稻总DNA中分离出来的DNA片段。根据上述的方法，同样能方便地得到从水稻叶绿体DNA中分离出来的、从水稻线粒体DNA中分离出来的，从水稻染色体DNA中分离出来的能在酵母菌中自主复制的DNA片段，以及从水稻总DNA中分离得到的能自主复制顺序所构成的人工染色体。

本发明将作为水稻遗传工程的有用载体，输送一系列高产、抗病、抗虫害等有利基因进入水稻，改良现有的水稻品种，它们必将产生巨大的经济效益。

Claims

1、一种将载体质粒DNA和供体DNA经完全酶切，然后混合连接去转化酵母菌，并筛选转化子以分离水稻总DNA中ARS顺序的分离方法，其特征在于，上述的供体DNA为水稻总DNA，且载体和供体DNA分别酶切，连接后首先转化大肠杆菌，再将混合的大肠杆菌转化子制备成混合的质粒DNA库，然后再用这些扩增后的质粒DNA去转化酵母菌，最后再筛选转化子。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述转化酵母菌使用的再生培养基中的琼脂比例为1.2～1.5%，且再生培养基中含有0.1～0.2%的牛血清白蛋白。

3、一种能在酵母菌中自主复制的DNA片段，其特征在于该DNA片段是从水稻总DNA中分离出来的。