PT81400B

PT81400B - Processo de preparacao de sequencias de replicacao autonoma para estirpes de leveduras do genero pichia

Info

Publication number: PT81400B
Application number: PT81400A
Authority: PT
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1984-10-30
Filing date: 1985-10-30
Publication date: 1987-11-11
Also published as: ES548304A0; IL76762A0; JPH0686680A; CA1273882C; IL76762A; DK496185D0; AU4875785A; NO854332L; NO177269C; CA1273882A; EP0180899A3; AU563860B2; EP0180899B1; FI854143L; DK496185A; NO177269B; US4837148A; DE3585206D1; IE852472L; IE58216B1

Description

Descrição das Figuras

A Fig. 1 é um mapa de restrição de uma sequência de re plicação autónoma do invento (FARS1).

A Fig. 2 é um mapa de restrição de uma sequência de re plicação autónoma do invento (FARS2).

A Fig. 3 é uma mapa de restrição do plasmídeo YEpl3.

A Fig. 4 é um mapa de restrição do plasmídeo pYJ8.

A Fig. 5 é um mapa de restrição do plasmídeo pYJ8/\ Cia.

A Fig. 6 é um mapa de restrição do plasmídeo pYm4.

A Fig. 7 é um mapa de restrição do plasmídeo pYJ3O.

A Fig. 8 é um mapa de restrição do plasmídeo pYJ32.

A Fig. 9 é um mapa de restrição do plasmídeo pYA2.

As seguintes abreviaturas são aqui usadas para represen tar os enzimas de restrição utilizados:

Abreviatura

A

Ah

Av

B

Enzima de Restrição

Alui

Ahalll

Aval

BamHI

BglII

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-9-

c	Ciai
^H2	HindII
^H3	HindIII
Ilb	IlboII
Nr	NruI
Ps	PstI
Pv₂	PvuII
PlS	Rsal
“i	EcoRI
5	Sall
Sm	Smal
Sp	Sphl
SJ	Sau3AI
T	Taql
Zh	Zhol

Nas figuras apensas, os locais de restrição utilizados para a manipulação do ADN mas que são destruídos após ligação, são indicados incluindo a abreviatura do local destruído, entre parêntesis. Os locais de restrição, previstos por informação sobre a sequência de ácidos nucleicos mas que não tenham sido verificados pelo tratamento do enzima de restrição, são assinalados, nos locais de restrição designados, por um asterístieo.

Descrição Detalhada do Invento

De acordo com o presente invento, preparam-se fragmentos de ADN compreendendo sequências de replicação autónoma que man têm os plasmideos como elementos extraeromossóaicos em hospedeiros do género Pichia.

Ainda de acordo com o presente invento, apresenta-se um processo para isolar sequências de ADN de quaisquer fontes que tenham propriedades de replicação autónoma num hospedeiro do gé nero Pichia.

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Organismos Hospedeiros

Os organismos hospedeiros úteis para prática do presen te invento incluem várias espécies do género Pichia. Uma cias, se de hospedeiros úteis são os mutantes auxotróficos, isto é, estirpes mutantes que necessitam de suplementação com um ou mais aminoácidos, vitaminas ou outros nutrientes para crescimento. A transformação de um destes mutantes pode ser facilmente seleccionada utilizando, como parte do material ADN recombinante usado para transformar o hospedeiro mutante, as sequências ADN que codificam a produção do produto do gene em falta.

Uma estirpe de levedura hospedeira espeeialmente prefe rida é a mutante Pichia pastoris G-S115, que é uma mutante defeituosa quanto à capacidade de produzir histidina e foi identi ficada como tendo o genotipo mutante his4. A GS115 derivou por mutagenese da Pichia pastoris NRRL Y-11430 e foi depositada no "Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture" em Peoria, Illinois, com vista a garantir o livre acesso pelo público ao hospedeiro, após publi cação deste pedido de patente. A Pichia pastoris GS115 foi assinalada com o número de acesso NRRL Y-15851, de 31 de Agosto de 1984. Este particular hospedeiro é útil por ser um mutante auxotrófico defeituoso na síntese de histidina. Ê evidente pa ra os peritos da arte que mutantes em muitos outros genes importantes no metabolismo da Pichia, também existem ou podem ser isolados. Assim muitos outros hospedeiros são possíveis para a transformação da Pichia, limitados apenas pela sua disponibilidade ou pela capacidade de isolar genes que codifiquem a produção do produto de gene no qual 0 hospedeiro mutante é defeituoso.

A Pichia pastoris NRRL Y-15851 foi identificada como mutante defeituosa na produção de histidinol dehidrogenase. Ss, ta identificação foi conseguida medindo a redução do dinucleóti

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-lido de nieotinamida adenina (NAD) por um extracto proteico das células de NRRL Y-15851 na presença do substracto histidinol dehidrogenase, 0 histidinol. Por analogia com a nomenclatura utilizada com a £>. oerevisiae, 0 defeito na NRRL Y-15351 é re ferido como mutação his40.

Isolamento e caracterização do gene H1S4 da Pichia pastoris

0 gene HIS4 foi isolado a partir da estirpe NRRL Y-11430 por digestão parcial do ADN cromossómico total pelo Sau3A seguida de centrifugação por gradientes de sucrose. Foram elonados fragmentos de 5 a 20 kbp no local de cisão BamHI do ve£ tor de transporte S. cerevisiae-E. coli (ATCC 37115; Figura 3) e transformados em E. coli. Foram seleccionadas cerca de 50 000 colónias que se juntaram, extraindo-se depois 0 ADN t£ tal do plasmideo. l„iaturaram-se esferoplastos da estirpe 5793-4D (NRRL Y-15859) da S. oerevisiae, um mutante his4AB0, eom cerca de 1 y«g da colecção de ADN da Pichia YEpl3 pelo pr£ cesso de Hinnen et al (1978) e deixados regenerar num meio d£ ficiente ea histidina. A transformação resultou em cerca de IxlO³ de colónia de levedura prototrofica de uma população de 5x10' de esferoplastos totalmente regeneráveis. Hma amostra de controlo, em paralelo, incubada sem ADN não produziu colónias. 0 ADN total da levedura foi extraído de 20 das colónias His+ e retransformado em E. coli. Dezassete das preparações de ADN da levedura produziram colónias resistentes â ampicili. na. Estes fragmentos clonados foram depois caracterizados por medição do enzima e pelo mapa de restrição bem como pela sua capacidade de hibridação cruzada com um fragmento marcado HIS4 de S. oerevisiae em.condições brandas (lavagens post-hibridação em 2xSSC a 55²C). 0 fragmento contendo HIS4 continha,

caixa um, um ou mais fragmentos que hibridaram com 0 gene HIS4 da S. oerevisiae. Este plasmideo contendo HIS4 foi reclonado para dar um plasmideo designado por pYJ8, contendo HIS4, e e£ tá indicado na Figura 4. 0 plasmideo pYJ8 contém sequências

pBR325, incluindo genes com resistência funcional à ampicilina e cloranfenicol, bem como 0 gene HIS4 da Pichia.

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-12Sub-clonando o fragmento ADN de 6,0 kbp da Pichia a partir de pYJ8, determinou-se que um fragmento de 2,7 kbp des, te ADN retinha a capacidade de transformar quer as estirpes de Pichia ou de Saccharomyces deficientes nas actividades codificadas pelos genes HIS4, HIS4S ou HIS40. Assim, por exemplo, a Pichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115), um mutante his4, é capaz de se desenvolver em meios sem suplementação de histi dina quando transformados com plasmídeos pYJ3G e pYJ32 (ver Piguras 7 e 8, respectivamente). Sstes dois plasmídeos, cada Uui dos quais continha o fragmento BglII de 2,7 kbp do ADN cromossómico da Pichia, codificando ambos a função do gene HIS4.

Processo de Transformação da Pichia pastoris

Qs processos experimentais para transformar a Pichia pastoris estão apresentados em maior detalhe, abaixo, no Sxemplo I. Para desenvolver um sistema de transformação para a Z· pastoris, isolou-se o mutante auxotrófico GS115 (NRRL Y-I585I) e verificou-se ser defeituoso na síntese de histidina por a estirpe não possuir actividade detectável de histidinol dehidrogenase.

0 G8115 (NRRL Y-15851) pode ser transformado por diges. tão enzimática das paredes das células para dar esferoplastos; os esferoplastos são então misturados com 0 material ADN recom binante transformador e incubados na presença de iões de cálcio e de polietileno glicol, e depois regenerados num meio de crescimento selective deficiente em histidina. C ADN transformador inclui 0 gene HIS4 no qual a estirpe hospedeira é defeituosa, donde apenas as células transformadas sobrevivem

no meio de crescimento selectivo utilizado.

Isolamento de Sequências de Replicação Autónoma de Pichia

nastoris

Os vectores do presente invento contêm sequências âe

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replicação autónoma derivadas da lichia (PARSs) que tanto melhoram a frequência de transformação da G3115 (NRRL 1-15851) como a manutenção dos vectores como elementos extracromossóiticos estáveis em leveduras do género Pi chi a. Estas sequênci as de replicação autónoma são úteis porcue os elementos conhecidos ARS de levedura isolados

3. cerevisiae não funcio

nam em hospedeiros do género 11 chi a. Assim comi vista a tornar a Pich-ia num sistema de expressão útil para a produção de pro. dutos polipeptídicos nas leveduras, tornava-se necessário iso. lar as sequências ADN com actividade APS na 11chia.

Iara procurar os ARSs da 11 chia-, o ADN da li chia- pastoris NRRL Y-15851 foi parcialmente digerido com. 5aql, isolaram -se fragmentos de 5 a IC kbp e clonaram-se no único local Clal da pYJ8A da (ver Fig. 5)· 0 plasmideo ADN foi aumentado em

E. coli, recolhido e usado para transformar a Pichia pastoris NRRL Y-15851. 0 plasmideo ADN foi então recuperado de cerca

de 10 000 colónias His+ da li chi a e usado pare, retransformar

I solar amic Ό

lasmídeos de cerca de 10 000 colónias de E. coli resistentes a ampicilina e retransformaram-se em 1. pastoris NRRD Y-15851 (GSU5j his 4)· Quarenta das co lónias His+ det levedura desta sub-eolecção de transformação foram separadamente riscadas sobre meios selectivos e desenvolveram-se independentemente do meio selectivo. 0 ADN total da levedura foi extraído de cada uma destas 40 culturas e transformado em E. coli. Dois plasmideos, pYA63, contendo 1ARS1 e pYA90 contendo 1ARS2, foram escolhidos para posterior análise. Ambos estes plasmideos transformaram a lichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115) a uma frequência muito elevada, fo. ram mantidos como elementos autónomos e cada um continha um novo fragmento de ADI" de 1. pastoris.

Estas sequências de replicação autónoma de pYA63 e pYA90 foram subclonadas no único local Clal do plasmideo pYR4 (ver Fig. 6) obtendo-se os plasmideos pYJ30 e píYJ32, respecti

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-14*

vamente. 0 plasmídeo pYJ3O está pormenorizadamente indicado na Fig. 7 enquanto que o 'plasmídeo pYJ32 está analogamente descrito na Figura 8. Os plasmídeos, transformados num hospedeiro 3. coli, foram depositados no "Northern Regional Re se. arch Center of the U.S. Department of Agriculture" em Peoria, Illinois, para assegurar livre acesso ao público após publicação deste pedido de patente. As estirpes de depósito foram assinaladas com os seguintes números de acesso:

Plasmídeo

pYJdO

pYJ32

Estirpe hospedeira

DE392

IS392

IT2. de Acesso PERL·

HERL E-15890 PERL B-I589I

Caracterização das Sequências de Replicação

pastoris

autónoma de Pichia

As sequências de replicação autónoma preparadas pelo invento, PARS1 e PARS2, podem ser convenientemente recolhidas de pYJ3O e pYJ32, respectivamente, tratando os plasmídeos com os enzimas de restrição EcoRI e HindIII. O desejado elemento ARS é então obtido cora cerca, de 23 pares de base extra no extremo 5' (adjacente ao local P.^) e com cerca de 5 pares de base extra no extremo 3' (adjacente ao local Hj). As inserções PARS1 e PARS2 podem, evidentemente, ser também recupe. rados a partir de pYJ3O e pYJ32 por tratamento dos plasmídeos com uma diversidade de outros enzimas de restrição, como facilmente reconhecerão os peritos da arte após inspecção dos mapas de restrição indicados nas Figuras 7 e 8. As inserções PARS1 e PARS2 foram caracterizadas por mapas de enzimas de restrição. Estes dois fragmentos de ADN estão indicados nas Figuras 1 e 2, respectivamente.

Devido ao relativamente pequeno tamanho destes fragmen. tos de ADN, têm sido completamente determinadas as suas sequências. A sequência de nucleôtidos para 0 PARS1 foi determinada como sendo:

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5'-TCGAGATAAG	CTGGGGGAAC	ATTCGCGAAA	ATGAAACAAG
TCGGCTGTTA	TAGTATATTT	ATTATAATAT	TGAAAGATGT
CAAAAGACTA	CTTATTTTTG	AATGAACCAA	GTATGAAATC
AACCTATTTG	GGGTTGACCA	AAATAAGTAA	ATATTAATTG

TCGA-3’

A sequência de nucleótidos para PARS2 foi determinada como sendo:

5' -TCGAACATAG	TCCGTCCGCG·	GGGGAÁGATT	TATTGTCTCA
AAAGGTCAAT	TTCATATTTT	ATATGCATTC	AATACTTATT
TATTATTAAT	TTAGCTTGAC	TACGATGCAT	ATAATTTTAA
TTTTATTTTA	AATTATATAT	GAGGTAAGAG	TATAACTCTA
AACCTAATAA	ATATATAATT	AATTATACGC	AATAGTTAAA
CCATAGATTA	ATTACAACTA	ATCCTTTCGT	ACTAAGTTGT
AATCCTTTAT	TGACAITTCC	CTAAAGCAGA	TAGAAACCAT
ACTGTCTOAC	GACTATTAAA	CCCAACTCAC	GTAACCTTTT
AATTGAGGAA	CAGTCAAACC	GTTATGAGGG	TGTGCTACCA
ATAGGATAGG	TTGAGTCGAC	ATCGA-3'
Como medida	da capacidade	í dos PARSs	de manter os pias-
mídeos como elementos autónomos	na Pichia, transformaram-se
culturas de células	s de levedura	com plasmíd	eos pYJ30 e pYJ32

e desenvolveram-se em. meio selectivo, sendo periodicamente amostradas. As características das sequências dos plasmideos nas células foram determinadas por hibridação de Southern de ADNs de leveduras sem restrições com pER322 radioactivamente marcado. Os plasmideos pYJ3O e pYJ32 foram mantidos como ele. mentos autónomos na Pichia durante pelo menos 50 gerações no meio selectivo.

Um número médio de cópias de plasmídeo por célula de Pichia pastoris resultou da relação entre as quantidades de cópia genómica do gene HIS4 da Pichia e do gene HIS4 trazido no plasmídeo. Para as células de Pichia pastoris transformadas pelo pYA63 e pYJ30 (contendo cada um PARS1) e pYA90 e pYJ32 (contendo cada PARS2), a relação entre o número médio de cópias âo ADN do plasmídeo contendo o gene HIS4 da Pichia e o

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-16-

número de cópias do gene HIS4 cromossómico da Pichia, foi de aproximadamente 10-15· Os peritos da arte sabem oue o valor do número de cópias obtido como aqui se descreveu representa um mínimo para o número de cópias de plasmideo por célula.

Em geral as sequências de ADN com actividade de replica ção autónoma num hospedeiro do género Pichia podem ser isoladas transformando a Pichia hospedeira com uma. colecção de fragmentos ADN construídos num vector que contenha, entre outras sequências de ADN, um gene marcador mas que não contenha nenhuma das sequências de ADN com actividade ARS na Pichia·. 0 gene marcador utilizado vai conferir um fenotipo seleccionável sobre a estirpe hospedeira de levedura. À frequência de transformação da estirpe hospedeira com o vector, poderá ser aumentada, por uma ou mais ordens de grandeza, quando as sequências de ADN com actividade ARS estão presentes no vector, quando se compara com. a frequência de transformação com um vector não modificado. Assim, a selecção e isolamento da ho.s pedeira transformada fornecerá organismos portadores de plasmídeos com sequências de ADN inseridas que tenham actividade ARS. Deste modo podem ser facilmente isoladas sequências de ADN de quaisquer origens que tenham actividade ARS na Pichia.

EXEMPLOS

Os tampões e soluções utilizados nos exemplos seguintes, têm as composições abaixo indicadas:

Tampão 1 M Tris 121,1 g de base Tris em 800 ml de

H₂0;

ajuste o pH até ao desejado valor por adição de H01 aquoso concentrado (35$);

deixe a solução arrefecer até à temperatura ambiente antes de qualquer ajustamento final do pH; dilua até ao volume final de 1 1.

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Tampão TE

ssc

-171,0 Dg EDTA em 0,01 M (pH

0,15 M NaCl 15 ng citrato ajustado a pH

7,4) de tampão Tris

de sódio

7,0 com NaOH

Solução de Denbardts (50x)

5 g Picoll

Meio IB (luria-Bertani)

Meio YPD

Meio SB

SED

Tampão SCE

5 g polivinilpirroliâona 5 g albumina de soro bovino (BSA; Pentax Pracção V)

levar a um volume total de 600 ml com. água

5 g Bacto-triptona

5 g Bacto-extracto de levedura 2,5 g NaCl

em. 1 1 de água, ajustado a pH 7,5 com NaOH

1% Bacto-extracto de levedura 2% Bacto-peptona 2% Dextrose

6,75 g base azotada de levedura sem ácidos aminados (DIPCO)

2% Dextrose

em 1 1 de água

1 K Sorbitol

25 ng EDTA

50 ng DTT

9,lgSorbitol

1,4 g citrato de sódio

0,168 g EDTA

50 ml H₂0

ρΗ a 5,8 com. HCl

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-18ra

CaS

Solução PEGSOS

1 g Sorbitol

10 mV CaCl2

esterilize por filtração

20% polietilenoglicol 3350 10 nl'- OaOl^

10 mg Tris-HCl (pH 7,4) esterilize por filtração

1 h Sorbitol 0,3x meio YPD

10 mK CaCl₀

— £

As seguintes abreviaturas são usadas ao longo dos exem pios com. o seguinte significado:

EDTA Acido etilenodiaminatetraacético

SDS Dodecilsulfato de sódio

DTT Ditiotreitol

Vários processos realizados numa base de rotina seguem, um. protocolo padrão que será aqui detalhado.

A centrifugação realiza-se por urn. xr.eríodo de tempo e a uma rotação tais que sejam suficientes para se obter um sobre, nadante límpido. Geralmente a centrifugação das células de levedura realiza-se pelo menos a 15CO g durante pelo menos 5 minutos.

As extraeções de ácidos nucleicos com fenol/clorofórmio/alcool isoamílico envolvem pôr em contacto a solução contendo ácidos nucleicos com um igual volume de uma mistura na proporção 50:48:2, em volume, de fenol clorofórmio e álcool

isoamílico, respectivamente. As extraeçães eom clorofórmio/ /álcool isoamílico envolvem pôr em contacto a solução a ser tratada com um volume igual duma mistura, na proporção de 43:2, ea volume, de clorofórmio e álcool isoamílico.

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Quando são descritas lavagens ou mergulhos de geles, filtros, etc., su soluções.específicas, a totalidade do gel, o filtro ou outro, é imerso num vaso adequado (caldeira, prato, pequeno frasco, etc.) com vista a pôr em contacto toda a superfície do gel, filtro ou outro, com a solução em causa.

A precipitação pelo etanol dos ácidos nucleicos envolve um primeiro ajuste do teor de sal da solução que contém os ácidos nucleicos, se tal for necessário, e pondo depois em contacto a solução com dois volumes de etanol frio, e recolhendo o precipitado por centrifugação.

Maieio 1

Processo de Transformação da Dichia pastoris

A· Crescimento das Células

1. Inocule uma colónia de gichia pastoris G-S115 (íEíRL Y-I585I) em cerca de 10 ml de meio YPD e agite a cultura durante 12-20 horas a 3020.

2. Depois de cerca de 12-20 horas, dilua as células

até uma de cerca de 0,01-0,1 e mantenha as células em fa

se de crescimento logarítmico em meio YPD a 3020 durante cerca de 6-8 horas.

3. Após cerca de 6-8 horas, inocule 100 ml âe meio YPD

com 0,5 ml de cultura de sementeira a uma de cerca de

0,1 (ou quantidade equivalente). Agite a 3020 durante cerca de 12-20 horas.

4. Recolha a cultura quando a ODfor de cerca, de 0,2-0,3 (após aproximadamente 16-20 horas) por centrifugação a 1500 g durante 5 minutos.

B. Preparação de Esferoplastos

1. Lave as células uma vez em 10 ml de água estéril.

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-20(Todas as centrifugações para as etapas 1-5 rante 5 minutos).

2. Lave as células unia vez em 10 ml

são a 1500 g dude S'SD recentsmen

te preparado.

3. Lave as células duas vezes em 10 ml de 1 L Sorbitol estéril.

4. Suspenda as células ea 10 ml de tampão SOB.

5. Junte 5-10 /1 âe 4 mg/ml de Zymolyase 60 000 (Hiles Laboratories). Incube as células a 30-°-0 durante cerca de 30-60 minutos. Uma vez que a preparação de esferoplastos é uma etapa crítica no processo de transformação, deve-se controlar a formação de esferoplastos do seguinte modo: junte aliquotas de 100 yJL de células a 900 fú. de 5% SDS e SOO de 1 K Sorbitol antes ou logo a seguir á adição de Symolyase e a vários intervalos durante 0 período àe incubação. Pare a incubação no ponto em que as células lisam ea SDS mas não em sorbitol (usualmente entre 30 e 60 minutos de incubação).

6. lave os esferoplastos duas vezes ea 10 ml de 1 K Sorbitol estéril por centrifugação a 1000 g durante 5-10 minu. tos (0 tempo e velocidade de centrifugação podem variarj cen. trifugue 0 suficiente para peletizar os esferoplastos mas não demasiado de modo a quebrá-los),

7· Lave as células uma vez em 10 ml ds CaS estéril.

8. Suspenda as células num total de 0,6 ml de OaS.

0. Transformação

1. Junte amostras de ADH (até volume de 20 yU.) a tubos 12x75 mm de polipropileno estéril. (0 ADH deve estar em água ou em tampão TE; para obter frequências máximas de transformação com pequenas quantidades de ADH, é aconselhável juntar cerca de 1 ul de 5 mg/ml de ADH de Ξ. coli, tratada por ultrasons, a cada amostra).

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-212. Junte 100 de esferoplastos a cada amostra de ADN e incube à temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos.

3. Junte 1 ml de solução PEG a cada amostra e incube à temperatura ambiente durante cerca de 15 minutos.

4. Centrifugue as amostras a 1000 g durante 5-10 minu tos e decante a solução PEG.

5. Suspenda as amostras em 150 yJL de SOS e incube-as durante 30 minutos à temperatura ambiente.

6. Junte 850 yul de 1 M Sorbitol estéril e ponha em placas alíquotas das amostras como abaixo se descreve.

D. Regeneração de Esferoplastos

1. Formulação do Meio de Agar de Regeneração;

a. Agar-Sorbitol 9 g Bacto-agar; 54,6 g Sorbitol;

240 ml HgO, autoclave.

b. 10X Glucose 20 g Dextrose, 100 ml HgO, autoclave.

c. 10Ί SC- 6,75 g Base Azotada de Levedura sem aminoácidos, 100 ml H₂Q, autoclave. (Junte qualquer aminoácido ou ácido nucleico desejado até uma concentração de 200 yug/ml an tes ou depois da operaçSo em autoclave).

d. Junte 30 ml de 10X Glucose e 30 ml de 10X SO a 300 ml de solução de Sorbitol-Agar fundido. Junte 0,6 ml de 0,2 mg/ml biotina e qualquer outro aminoácido ou ácido nucleico de sejado até uma concentração de 20 ^ug/ml. Mantenha a 55-6020 0 Agar de Regeneração Fundido.

2. Colocação em placas de amostras ds transformação.

Verta uma camada de fundo de agar, de 10 ml de Agar de Regeneração por placa, pelo menos 30 minutos antes das amostras de transformação estarem prontas. Destribua alíquotas de 10 ml de Agar de Regeneração a tubos num banho a 45-502 0 duran. te 0 período em que as amostras de transformação estão em 303.

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-22Junte alíquotas das amostras de transformação acima descritas aos tubos cora Agar de Regeneração e verta sobre a camada de a gar do fundo das placas. Junte uma quantidade de cada amostra a alíquotas de 10 ml de Agar de Regeneração Pundido manti do a 45-5020, e verta cada uma sobre placas contendo um fundo sólido de 10 ml de Agar de Regeneração.

3.

plastos.

Determinação da Qualidade da Preparação

EsferoRetire 10 yul de uma amostra e dilua 100 vezes por adi, ção a 990 ^ul de 1 LI Sorbitol. Retire 10 da diluição 100X e dilua mais 100X por adição a uma segunda alíquota de 990 yZL de 1 m Sorbitol. Espalhe por placas 100 jZL de ambas as dilui, ções sobre meio de agar YPD para determinar a concentração de células inteiras sem esferoplastos, que permanecem na prepara ção. Junte 100 y*l de cada diluição a 10 ml de Agar de Regeneração suplementado com 40 yug/ml histidina para determinar os esferoplastos regeneráveis totais. São bons valores para uma experiência de transformação 1-3x10 de esferoplastos totais recuperáveis/ml e cerca de lxlO^J de células inteiras/ml.

4. Incube as placas a 30²0 durante 3-5 dias.

ÍXEMPIO II

Isolamento e Oaracterização de Sequências de Replicação Autónoma da Pichia pastoris

A. Estirpes

As estirpes usadas incluem:

(a) estirpe da Pichia pastoris ERRE Y-11430

(b) Pichia gastoris ERRL Y-15851 (G8115-his4); e

(c) estirpe 848 de E. coli (P“ met thi gal OR φ30 hsdR hsdM⁺).

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-23B. Plasmídeos

pYA2 (Pigura 9) que consiste no gene

da S. cerevisiae num fragmento PstI de 9,3 kb inserido no local PstI de pBR325, foi a fonte de fragmentos de genes HIS4 da J3. cerevisiae e foi depositado num hospedeiro de E. coli e está disponível para o público como 31131 3-15874.

pYJ8/\ Cia (Pigura 5) que é um derivado de pYJ8 (Pigura 4) foi criado pela digestão por Clal do pYJ8 e ligação.

C. Meios

A Pichia pastoris foi desenvolvida em YED (rico) ou IMG (meio pobre). IMG, um meio pobre consiste no seguinte:

1,

Sais IL·, a uma concentração final de 36,7 mli EHgPO^,

22,7 ng (NH₄)₂SO₄, 2,0 mM MgS0₄.7H₂0, 6,7 mM EC1, 0,7 aO CaClg, .2H₂0, preparados como uma solução mãe 10Σ e autoclavada;

2. "Trace Salts" a uma concentração final de 0,2

CuSO₄.5H₂O, 1,25 ytM EI, 4,5 MnS0₄.H₂0, 2,0 >uE TTalio0₄.

.2H₂0, 0,75 ytií H₃BO₃, 17,5 y+M ZnSQ₄.7H₂0, 44,5 yM PeCly .6H₂0, preparados como uma solução mãe 400Σ e esterilizada por filtração;

3. 0,4 yg'/ml biotina; o

4. 2% dextrose.

E. coli foi desenvolvida quer em meio 13 quer em meio 2B (0,2% NE₄?0₄, 1,2% Na₂HP0₄, 0,013% Kg30₄.7H₂0, 0,074% CaCl₂.2H₂0 1 /g‘/ml tiamina e 0,4% dextrose) suplementado com 100 yg/ml triptofano, e 0,2% ácidos de Oasamino.

P. Isolamento de AM

1. Preparações em Larga Escala de AM de levedura

Tanto as preparações de ADN da Pichia pastoris como de S. cerevisiae foram realizadas fazendo crescer células de leve

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-24dura em 100 ml de meio pobre até Α^θ igualar 1-2 e colhendo então as células por centrifugação a 2000 g durante 5 minutos. As células foram lavadas uma vez em N/), uma vez em SHD, uma vez em 1 ¥ Sorbitol e foram, então suspensas em 5 ml de 0,1 Ll Tris-HOI (pH 7,0) que é 1 m em sorbitol. As células foram misturadas com 50-100 Λ¹ de uma solução a 4 mg/ml de Zymolya se 60 000 (miles Laboratories) e incubadas a 303 0 durante uma hora para digerir as paredes das células. A preparação de es, feroplastos foi então centrifugada a 1000 g durante 5-10 minu tos e suspensa em tampão Ãysis (0,1/ SDS, 10 mIL Tris-HOI,

(pH 7,4), 5 A_1 EDTA e 50 mH NaCl). A proteinase K (Boehringer Mannheim) e RNase A (sigma) foram, cada uma, adicionada até 100 ^ig/ml e as misturas incubadas a 37-0 durante 30 mira; tos. 0 ADN foi ô.esproteinizado por mistura cuidadosa da preparação com um volume igual de clorofórmio contendo álcool isoamílico e as fases foram separadas por centrifugação a 12 OCO g durante 20 minutos. A fase superior (aquosa) foj. re tirada, para um novo tubo e extraída golí. um volume igual de fe. nol/cloroférmio/alcool isoamílico. As fases foram separadas como anteriormente e a fase de topo foi colocada num tubo con. tendo 2-3 volumes de 100/ de etanol frio. A amostra foi euidadosamente misturada e o ADN foi recoliido enrolando-o numa vareta ds plástico. 0 ADN foi imedi&tamente dissolvido em 1 ml de tampão ΤΞ e dialisado durante a noite a 4^SC contra 100 volumes de tampão TP.

2. Prepara.çãss em pequena, escala de ADN ds levedura

5 ml de culturas de levedura em meio pobre

cendo até A

h.g

igualar

ção a 2000 g durante 5

1-5 e foram recolhidas por minutos. As células foram.

1 ml de SED e transf ei'idas para um tubo de 1,5 nl

foram erascentrifugasuspensas em de mi crof liga, lavadas uma vez em. 1 í_ Sorbitol e suspensas em 0,5 ml de 0,1 m Tris-HCl (ρΚ 7,4) que seja 1 L/iorbitoI. Juntou-se Zy64 243

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-25molyase 60 000 (Eiles Laboratories; 10 J de uma. solução &

4 mg/ml) a cada amostra e as células foram incubadas durante 30-60 minutos a 302 C. As células foram então centrifugadas durante 1 minute, suspensas es. tampão lysis e incubadas a 65-7020. 15 minutos depois as amostras foram misturadas coa

ICO A¹- de 5 A. acetato de potássio, mantido em banho de gelo durante 15 minutos e centrifugado durante 5 minutos. Os sobre nadantes foram decantados num novo tubo de microfuga contendo 1 ml de etanol a 1CO%, misturados e imediatamente centrifugados durante 10 segundos. Pinalmente os peletizados de ADH f£ ram secos ao ar durante 10-15 minutes e dissolvidos em 50 yJ de tampão TE.

3. Isolamento em larga escala de ADN de E. coli

Culturas de 3. coli para preparações em grande escala (0,5-1 1) de plasmideos, foram desenvolvidas a 37^a 0 sob agita ção em meio 2B suplementado como aeima se descreveu e com 0 antibiótico adequado. Para as células que continham plasmíde os derivados de pBH322, as culturas foram desenvolvidas até ua

de cerca cie 0,7, juntando-se então suficiente eloranfeni. col para se obter uma concentração de 100 ytg/ml e colheram-se as células aproxin-adamente 15 horas depois. As estii*pes que continham plasmideos derivados de pBR325 foram inoculadas num meio 2B suplementado a uma Α^θ inicial de cerca de 0,01-0,05 θ incubadas sob agitação a 37^a 0 durante 20-24 horas ante da colheita. Os plasmideos foram isolados pelo método da lise alcalina descrito por Birnboim e Doly (1973)·

4. Preparações em pequena escala de ADN da 3. coli

Para isolamentos rápidos em pequena escala, ds plasmídeos, desenvclveram-se durante a noite, a 37^aC, sob agitação,

2 ml de culturas em meio 23 suplementado, eom antibiótico, que foram recolhidas por centrifugação em tubos de microfuga de 1,5 ml. Os plasmideos foram isolados pelo método da lise alcalina descrito por Birnbcim e Loly (1979).

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Restrição do ASI/e _isolamentc áe fragmentos

Os enzimas de restrição foram obtidos dos "New England Biolabs" e "Bethesda. Research Laboratories" e as digestões fo ram realizadas por técnicas de rotina. Os mapas de restrição foram realizados por comparação de digestões paralelas de plasmideos com e sem ASN inserido. Os fragmentos de restrição foram purificados por electroeluição de geles de agarose em. fitas de papel V.-hatman 3 11- confirmada por tubos de diálise Os fragmentos foram retirados do papel e tubos por 3-4 lavagens con; volumes de 0,1-0,2 ml õe uma solução que continha 0,1 M NaCl, 50 mh Tris-HCl (pE 8,0) e 1 ffiM ESTA. Pinalmente os fragmentes foram extraídos com. fenol/clorofórmio/alcool isoamílico, precipitados com etanol e redissolvidos num peque no volume de tampão ΤΞ.

P· Construção ea E. coli de uma colecção ("library") de

sequências de replicação autónoma de P. pastoris

Para a construção de uma colecção de ADN-pYJ8A Oln- de Pichia pastoris, 50 yg de pYJS/y Cia foram, completamente digeridos por Ciai e tratados com. fosfatase alcalina do intesti no da vitela para retirar do ASN o fosfato do terminal 5'·

Uma alíquota de 100 y*g de ASN da Pichia pastoris NRRL Y-15851 foi parcialmente digerida com 20 unidades de Taql por incubação durante 5 minutos a 65⁸C num volume total de 1 ml. Os fragmentos de 5 a 10 kbp foram seleccionados em tamanho por electroeluição, de um gel de agarose a 0,5$ (ver Exemplo II, Secção E). Misturaram-se um. y*g do vector e 2 de fragmen tos Taql da Pichia, com 20 unidades de ligase "T4 SNA" ("Bethesda Research Laboratories") num volume total de 200 JÃÃ e incubaram-se durante a noite a 4⁸C. Os ADNs ligados foram transformados em E. coli juntando toda, a mistura reagente de ligação, a 2 ml de células qualificadas 848 de E. coli e incu

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-27bando durante 15 minutos a Q2C. Aqueceu-se a misturo, até 37^SC durante 5 minutos, após o que se juntaram 40 ml de meio EB, continuando a incubação a 37-C por mais una hora, Juntou-se

mente as células foram centrifugadas durante 10 minutos a 3000 g, suspensas em 1 ml de meio LB fresco, e dividido em alíquotas iguais por placas 10 IB de agar contendo 100 de a pieilina. Resultaram, aproximadamente 10 000 colónias que fo ram retiradas das placas e inoculou-se uma porção de células

em 500 ml de meio 2B suplementado, a uma Ap^ inicial de cerca de 0,1. A cultura desenvolveu-se e o plasmídeo foi extraí do como acima se descreveu.

G. Hibridações de Southern

por Southern (1975)· Para transferir moléculas de ADN muito grandes ou muito enroladas, para a nitrocelulose, o ADN foi primeiro parcialmente hidrolisado mergulhando geles de agarose

cerevisiae com o ADN da Pichia pastoris foi conduzido, na. presença de 50$ formamida, 6x SSC, 5x solução de Denhardt, 0,1$ SDS, 1 mM EDTA e 100 yug/rnl de ADN de esperma de arenque desnaturado a 4220. As lavagens post-hibridação fizeram-se em

A tradução pontual foi executada pelo método descrito por Rigby et al (1977)·

I· Sequenciamento de ADN

0 sequenciamento do ADN foi obtido pelo método de terminação da cadeia por dideoxinucleótidos, de Sanger et al (1980).

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28-

J. Isolamento das Sequências de Replicação Autónoma da Pichia

A colecção de Pichia construída como se descreveu na Secção P, acima, foi usada para transformar a Pichia pastoris NRRI Y-I585I. 0 ADN do plasmídeo foi aumentado em E. coli,

recolhido e usado para transformar a Pichia pastoris NRRI Y-15851. 0 ADN do plasmídeo foi então recolhido de cerca de

10 000 colónias de Pichia His+ e usado para retransformar a E. coli. Os plasmideos de cerca de 10 000 colónias de E. coli resistentes à ampicilina foram isolados e depois retransforma dos em P. pastoris HRRL Y-I585I (GS115; his4) . Quarenta das colónias de levedura His+ desta subeolecção transformada, foram então "riscadas” separadamente sohre meio selectivo e desenvclveram-se independentemente do meio selectivo. 0 ADN t£ tal da levedura foi extraído de cada uma destas 40 culturas e transformado em E. coli. Para análise posterior escolheram-se dois plasmideos, 0 pYA63 contendo PAR31 e 0 pYAÇSO contendo PARS2. Ambos os plasmideos transformaram a Pichia pastoris NKRL Y-I585I (GS115) a frequências muito altas, foram mantidos corno elementos autónomos e cada um continha· um novo fragmento de ADN da P. pastoris.

E.

Análise dos transformadores, de Pichia pastoris, de seouêneias de replicação autónoma

A capacidade dos plasmideos contendo ARS da Pichia se manterem corno elementos autónomos nas células da Pichia nasto—IHI—.M-l—I— I ............

ris foi determinada do modo seguintes uma colónia transforma

dora foi picada da placa de agar de regeneração e riscada sobre uma placa de agar com meio SD e inoculada em. meio líquido PG. A placa SD foi incubada a 302C durante 3 dias após 0 que se picou uma única colónia desta placa, se riscou sobre uma segunda placa SD e se inoculou num segundo balão de meio Ti G. 0 processo foi repetido uma terceira vea. As três culturas IMG desenvolveram-se a 302 C _sob agitação até uma Ag_nnde cerca de 1-2 e foram então recolhidas por centrifugação.

0

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AON das culturas de levedura foi extraído como se descreveu aci.

ma, executada, a electroforese a 3G volts e 30 mAmps durante 10-15 horas em geles de agarose a 0,8%, transferiô.o para ni troce o o

lulose e hibridado com. pPR322 ou pBR325 marcados com “"‘T? como acima se descreveu, como controlo- uma amostra contendo 10 ng de plasmídeo isolado da. Ξ. coli e uma amostra, contendo 1-2 yg de ADN de Pichia, pastoris NRRL Y-15851 (GS115) não transforma da, foram submetidas a electroforese em paralelo com as amostras experimentais.

Em cada um dos plasmídeos transformadores examinados, contendo PARS da Pichia, a sonda marcada hibridou num esquema idêntico ao do plasmídeo ADN isolado da E. coli. Oomo contro. lo, verificou-se que a sonda -marcada hibri dava com ADN eromos. sómico ds elevado peso molecular da Pichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115) quando transformada coa pYJ8A Cia (um vector transformador integrante que não tem actividade ARS na Pichia). A sonda não hibridou com ADN da NRRL Y-15851 não transformada.

Como medida mais quantitativa da capacidade dos PARSs manterem os plasmídeos como elementos autónomos na Pichia, desenvolveram-se culturas de células de levedura que tinham sido transformadas com. plasmídeos pYJ30 e pYJ32, em meio selectivo e foram periodicamente amostradas. 0 estado das sequ ências de plasmídeo nas células foi determinado por hibridação de Southern, de ADNs de leveduras sem restrições eom pBR 322 marcado radioactivamente. Os plasmídeos pYJ30 e pYJ32 mantiverara-se como elementos autónomos na Pichia durante pelo menos 50 gerações em meio .selectivo.

1. Determinação do Número de Cópias do Plasmídeo

Um número médio de cópias de plasmídeo por célula de P. pastoris foi obtido da relação entre a quantidade de cópia ge nómica do gene HI34 da Pichia pastoris e a do gene H1S4 fixado ao plasmídeo. Como as estirpes examinadas continham plasmídeos

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-30com o gene HIS4 da Pichia, os ADNs foram extraídos, digeridos

com endonucleases de restrição, submetidos a electroforese em

gel de agarose, transferidos para um filtro de nitrocelulose 32

e hibridados com o fragmento BglII de 2,7 kbp, marcado com P contendo o gene HIS4 da Pichia. kpós lavagem de post-hibrida ção, uma série de filmes de raios X foi exposta ao filtro por períodos determinados e analisada num espectrofotómetro Beckman DU-8B programado com um Módulo Compuset para geles em pas tilha. Os resultados estão resumidos no Quadro.

Quadro

Caracterização de transformadores de Pichia pastoris contendo PARS

Plasmideo	Sequência de Replicação Autónoma	Pig. de Ref 2.	Gerações co mo Elemento Autónomo	Número de cópias
pYM4	—	6	—	—
pYJ30	PARS1	7	50	13
pYJ32	PARS2	8	50	13

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de manutenção de plasmideos como elementos extracromossómicos em hospedeiros do género Pichia caracterizado por se incorporar no dito plasmídeo um fragmento ADN compreendendo uma sequência de replicação autónoma; onde o referido fragmento ADN pode manter um plasmídeo como elemento extracromossómico em multicópias por célula num hospedeiro do género Pichia; e onde o referido fragmento ADN provoca uma maior frequência de transformação do referido hospedeiro com um vector contendo o referido fragmento ADN quando comparada com a frequência de transformação do referido hospedeiro com um vector que não contenha o referido fragmento ADN sendo de preferência o referido fragmento de ADN ohtido através das se. guintes etapas:

(a) preparação de uma biblioteca de fragmentos ADN num vector; onde o referido vector compreende:

(i) um gene marcador; onde o referido gene marcador compreende um gene funcional que confere um fenotipo seleccio nável sobre a referida levedura hospedeira,

(ii) sequências bacterianas que permitem a transformação das bactérias com o referido vector, amplificação do refe rido vector num hospedeiro bacteriano e selecção u.o hospedeiro bacteriano transformado, mas

(iii) substancialmente nenhuma actividade sequencial de replicação autónoma da levedura;

(b) transformação da referida levedura hospedeira com a referida biblioteca; onde o referido gene marcador pode ser escolhido na referida levedura hospedeira;

(c) recolha das colónias transformadas produzidas na etapa (b) e seu crescimento sob condições seloctivas;

(d) extracção total do ADN das células que sobrevivem

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às condições de crescimento selectivo;

(e) transformação das células adequadas de E. coli com o ADN total obtido na etapa (d);

(f) crescimento das células transformadas de Ξ. coli obtidas na etapa (e) sob condições de crescimento selectivo, onde as referidas condições de crescimento selectivo compreendem meios adicionados de antibiótico ao qual as referidas sequências bacterianas oferecem resistência;

(g) recolha de plasmídeo das referidas células transformadas de E. coli;

(h) transformação da referida levedura hospedeira com o plasmídeo recolhido na etapa (g);

(i) promoção do crescimento da levedura hospedeira transformada obtida na etapa (h) sob condições de crescimento selectivo;

(j) selecção e purificação de colónias que crescem bem sob as condições de crescimento selectivo da etapa (i);

(k) transferência das colónias purificadas para a cul tura líquida e crescimento sob condições de crescimento selec. tivo;

(l) extracção total do ADN das culturas que crescem na cultura líquida;

(m) transformação das células adequadas de E. coli com o ADN isolado na etapa (1);

(n) selecção das colónias que dão a maior frequência da transformação de Ξ. coli na etapa (m);

(o) recolha do plasmídeo das colónias seleccionadas na etapa (n); e

(p) remoção e caracterização do fragmento de ADN in.se. rido contido no plasmídeo recolhido na etapa (o).

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, onde a referida sequência de replicação autónoma provém de uma leve64 243

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dura.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 2 onde a

referida levedura é seleccionada entre as do género Pichia.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, onde a

referida levedura é um membro das esioécies Pi chia pastoris.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, onde a re,

ferida levedura é a Pi chi a pastoris NRRIi Y-11430.

6 - Processo de acordo com qualquer urna das reivindicações 1 a 5, onde o referido fragmento é caracterizado pelo seguinte mapa de restrições

Ba

Ha

(PARS1)

7 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 onde o referido fragmento é caracterizado pelo seguinte mapa de restrições

(PARS2)

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-348 - Processo de acordo com a reivindicação 6 onde o

erido fragmento tem a sequência de nucleétidosi 5'-TCGAGATAAG OTGGGGGAAC ATTCGCGAAA ATGAAACAAG TCGGCTGTTA TAGTATATTT AITATAAIAI TGAAAGATCT CAAAAGACTA OTTÀTTTTTG AATGAACCAA GTATGAAATO AACCTATTTG GGGTTGACCA AAATAAGTAA ATATTAATTG TGGA-3'·

9 - Processo de acordo com a reivindicação 7 onde o re

ferido fragmento tem a sequência de nucleótidos: 5'-TCGAACATAG TCOGTCCCCG GGGGAAC-ATT TATTGTCTCA AAAGGTCAAT TTCATATTTT ATATGCATTC AATACTTATT TATTATTAAT TTAGCTTGAO TACGATGCAT ATAATTTTAA TTTTATTTTA AATTATATAT GAGGTAAGAG TATAACTCTA AACCTAATAA ATATATAATT AATTATACGC AATAGTTAAA CCATAGATTA ATTACAACTA ATCCTTTCGT ACTAAGTTGT AATCOTTTAT TGACATTTCC CTAAAGCAGA TAGAAACCAT ACTGTCTCAC GACTATTAAA CCCAAOTOAO GTAACCTTTT AATTGACGAA CAGTCAAACC CTTATCAGCG TGTGCTACOA ATAGGATAGG TTGAGTCGAC ATCGA-3'.

10 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto do referido plasmideo ser um plasmideo híbrido caracterizado pelo seguinte mapa de restrição

(segue mapa)

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-35pBR322

(pYJ30)

11 - Processo de acordo com qualquer unia das reivindicações 1 a 5 θ 7» caracterizado pelo facto do referido plasmí deo ser um plasmídêo híbrido caracterizado pelo seguinte mapa de restrição

(segue mapa)

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-36-

(pYJ32)

12 - Processo âe acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto do referido plasmídeo híbrido ser obtido por fermentação da Escherichia coli ERRL B-15890 (LE392-pYJ3O).

13 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto do referido plasmídeo híbrido ser obtido por fermentação da Esoherichia coli ERRL 3-15891 (LE392-pYJ32).

14 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte rizado pelo facto do referido fragmento ser obtido por digestão do plasmídeo pYJ30 com uma das combinações de enzimas de restrição seleecionadas do grupo consistindo em

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•37-

EcoRI-HindIII, e Taql;

de modo a obter o referido fragmento ADN.

15 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto do referido fragmento ADN ser obtido por digestão do plasmídeo pYJ32 com uma das combinações de enzimas de restrição seleccionadas do grupo consistindo em

EcoRI-HindIII, Clal-HindIII, e Taql;

de modo a obter o referido fragmento ADN

16 - Processo de acordo com a reivindicação 1 onde o referido vector é pYJ8/\ Cia com o seguinte mapa de restrição

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-3817 - Processo de acordo com a reivindicação 1 onde o re ferido vector é ρϊΉ4 com o seguinte mapa de restrição

pBR322

18 - Processo de referido hospedeiro é o líERL Y-15851 (GS115).

acordo com a reivindicação 1 onde o mutante auxotrófico Pichia pastoris