JPH02242694A - インターフェロン―γの生産方法 - Google Patents
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関す
る。本発明は、１つの面におい℃、メチロトローフ酵母
によるインターフェロン−ｒ（ＩＦＮ−ｒ）タンパク質
の発現方法に関する。他の面において、本発明はＩＦＮ
−ｒをコードする新規ＤＮＡ分子およびそれにより形質
転換された新規酵母菌株に関する。
る。本発明は、１つの面におい℃、メチロトローフ酵母
によるインターフェロン−ｒ（ＩＦＮ−ｒ）タンパク質
の発現方法に関する。他の面において、本発明はＩＦＮ
−ｒをコードする新規ＤＮＡ分子およびそれにより形質
転換された新規酵母菌株に関する。
（従来の技術ノ
インターフェロンｔＩＦＮ）ｉ！抗ウつルス作用。
細胞増殖調節作用および免疫調整作用を読発する分泌タ
ンパク質である。インターフェロンは免役原注および生
物学的・化学的性質に基ついてＩＦ’Ｎ−ａ、ＩＦＮ−
βおよびＩＦＮ−ｒの６種に大別される。
ンパク質である。インターフェロンは免役原注および生
物学的・化学的性質に基ついてＩＦ’Ｎ−ａ、ＩＦＮ−
βおよびＩＦＮ−ｒの６種に大別される。
広範囲の生物活性はＩＦＮ−７がもっていると考えられ
、細胞増殖およびウィルス複製の阻止が含まれ、このこ
とはＩＦＮ−ｒが有力な抗腫瘍剤でありうることを示唆
している。
、細胞増殖およびウィルス複製の阻止が含まれ、このこ
とはＩＦＮ−ｒが有力な抗腫瘍剤でありうることを示唆
している。
このタンパク質は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ 、サル細
胞およびサツカロマイセス・セルビシェ−（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）での組換
え法により生産されたが、これらの系はそれぞれ重大な
欠点な有する。例えは、大腸菌は高度な精製によって除
かなければならない内毒素な産生じ。
胞およびサツカロマイセス・セルビシェ−（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）での組換
え法により生産されたが、これらの系はそれぞれ重大な
欠点な有する。例えは、大腸菌は高度な精製によって除
かなければならない内毒素な産生じ。
サル細胞株は酵母や細菌に比べて増殖させるのに費用が
かかり、そしてサツ力ロマイセスーセルビシエ−はＩＦ
Ｎ−ｒの発現へ導くプラスミドを自然に失う傾向がある
。
かかり、そしてサツ力ロマイセスーセルビシエ−はＩＦ
Ｎ−ｒの発現へ導くプラスミドを自然に失う傾向がある
。
従って、ＩＦＮ−γを生産するための別の方法および安
定した宿主口株を開発することは、当分野に大いに貢献
するであろう。
定した宿主口株を開発することは、当分野に大いに貢献
するであろう。
（発明が解決しようとする課題）
それ故に１本発明の目的は、メチロトローフ酵母により
１ＦＮ−γタンパク質を生産するだめの別法な提供する
ことである。
１ＦＮ−γタンパク質を生産するだめの別法な提供する
ことである。
本発明の他の目的は、ＩＦＮ−ｒタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を含む新規ベクターを提供することである
。
るＤＮＡ配列を含む新規ベクターを提供することである
。
本発明のさらに他の目的は、ＩＦＮ−ｒを生産しうるベ
クター１つ以上で形質転換された新規メチロトローフ酵
母な提供することである。
クター１つ以上で形質転換された新規メチロトローフ酵
母な提供することである。
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の記載お
よび特許請求の範囲から明らかになるであろう。
よび特許請求の範囲から明らかになるであろう。
（課題な解決するための手段）
本発明によれば、本発明者らは、メチロトローフ酵母を
、ＩＦＮ−ｒＩ７′）構造遺伝子を含む発現カセットを
有し且つ宿主に適合しうる少なくとも１つのベクターで
形質転換し、得られた形質転換細胞をＩＦＮ−ｒの生産
に適する条件下で培養する。
、ＩＦＮ−ｒＩ７′）構造遺伝子を含む発現カセットを
有し且つ宿主に適合しうる少なくとも１つのベクターで
形質転換し、得られた形質転換細胞をＩＦＮ−ｒの生産
に適する条件下で培養する。
ことから成るＩＦＮ−γの生産方法を開発した。
ＩＦＮ−ｒは当分野でよく知られ℃おり、Ｇｒａｙ 。
大腸菌およびサル細胞によるヒト免疫インターフ工ｏｙ
ｃＤＮＡの発現、 ２９５ Ｎａｔｕｒｔ３５０３（１
９８２Ｊ によりその塩基配列が決定された。従って、
ＩＦＮ−ｒの構造遺伝子はＧｒａｙの方法によりその遺
伝子をｂ分離することによって得ろことができ、また合
成することもできる。丁ＦＮ−ｒの構造遺伝子は、Ｍ６
突然変異導入法のような技術により、その遺伝子の発現
のために選ばれたベクター系および宿主に合わせるよう
修飾することができる。
ｃＤＮＡの発現、 ２９５ Ｎａｔｕｒｔ３５０３（１
９８２Ｊ によりその塩基配列が決定された。従って、
ＩＦＮ−ｒの構造遺伝子はＧｒａｙの方法によりその遺
伝子をｂ分離することによって得ろことができ、また合
成することもできる。丁ＦＮ−ｒの構造遺伝子は、Ｍ６
突然変異導入法のような技術により、その遺伝子の発現
のために選ばれたベクター系および宿主に合わせるよう
修飾することができる。
本発明の実施に際して用いられるＩＦＮ−ｒのヌクレオ
チド配列およびアミノ酸翻訳を表１に示すつ最初の約２
３個のアミノ酸はこの遺伝子のシグナル配列を構成する
。
チド配列およびアミノ酸翻訳を表１に示すつ最初の約２
３個のアミノ酸はこの遺伝子のシグナル配列を構成する
。
ｐＢＲ３２２／ＩＦＮ−ｒプラスミドは１）ＢＦ１３２
２の唯一のＰｓｔＩ部位（３６０９）に表１に示す１２
０Ｏヌクレオチド配列を挿入したｐＢＲ３２２訪導体で
あ心導体の挿入はｐＢＲ３２２のアンピシリン遺伝子を
内部で切断する。
２の唯一のＰｓｔＩ部位（３６０９）に表１に示す１２
０Ｏヌクレオチド配列を挿入したｐＢＲ３２２訪導体で
あ心導体の挿入はｐＢＲ３２２のアンピシリン遺伝子を
内部で切断する。
このプラスミドはＭ（Ｅ１０６１のような適当な大腸菌
宿主な用いて培養できろ。プラスミドＤＮＡ１’！Ｂｉ
ｒｎｂＯｉｍ ａｎｄ Ｄｏｂｙ、ＮｕＣｌｅｉＣＡＣ
ｉｄＳＲｅｓｅａｒｃｈ ７ ： １５ｔ ３（１９７
９〕 に記載される方法のような、当分野で知られた方
法な用い℃適当な宿主から回収し得る。
宿主な用いて培養できろ。プラスミドＤＮＡ１’！Ｂｉ
ｒｎｂＯｉｍ ａｎｄ Ｄｏｂｙ、ＮｕＣｌｅｉＣＡＣ
ｉｄＳＲｅｓｅａｒｃｈ ７ ： １５ｔ ３（１９７
９〕 に記載される方法のような、当分野で知られた方
法な用い℃適当な宿主から回収し得る。
本発明の実施のために用いられるｒＦＮ−ｒは。
Ｉ ＦＮ−ｒ構造遺伝子の６つの特定した変異を達成す
るために、Ｍ１３突然変異導入法により改変された。第
一の変異ではＴＡＡ終正コドンに隣接し″″ＣＥＣ０Ｒ
Ｉ制限部位を導入した（表２参照、おおよそヌクレオチ
ド５００から５１４までを表示）。
るために、Ｍ１３突然変異導入法により改変された。第
一の変異ではＴＡＡ終正コドンに隣接し″″ＣＥＣ０Ｒ
Ｉ制限部位を導入した（表２参照、おおよそヌクレオチ
ド５００から５１４までを表示）。
第二の変異ではｌト”Ｎ−ｒシグナル配列のＡＴＧのす
ぐ前にＥｃｏＲＩ部位を導入した（表２参照。
ぐ前にＥｃｏＲＩ部位を導入した（表２参照。
おおよそヌクレオチド−９から６までを表示）。
実施した第三の変異１工、シグナル配列な欠失させてＥ
ｃＯＲＩ制限部位とＡＴＧ開始コドンな導入することで
あった（表２参照、おおよそヌクレオチド５７から７６
までな表示）。
ｃＯＲＩ制限部位とＡＴＧ開始コドンな導入することで
あった（表２参照、おおよそヌクレオチド５７から７６
までな表示）。
Ｍｌ、ｌＳ突然変異導入法は当分野において公知であり
、 Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ ｓｍｉ ｔｈ 、 Ｍ １
３ベクターにクローニングしたＤＮＡフラグメントの特
定オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎ ＥｎＺｙｍＯＩＯｇ’ｙ’ 、 １００
：４６８ （１９８３）に記載される方法のような適当
な方法により実施しうる。突然変異導入に必要なＭ１３
ベクターおよび試薬類はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａｂｓ社のような商業源から入手できる。
、 Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ ｓｍｉ ｔｈ 、 Ｍ １
３ベクターにクローニングしたＤＮＡフラグメントの特
定オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎ ＥｎＺｙｍＯＩＯｇ’ｙ’ 、 １００
：４６８ （１９８３）に記載される方法のような適当
な方法により実施しうる。突然変異導入に必要なＭ１３
ベクターおよび試薬類はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａｂｓ社のような商業源から入手できる。
上記の突然変異導入は、初めにＩＦＮ−ｒｍ構造遺伝子
Ｍ１３ベクター（便用しやすいように、最適ベクターと
してＭ３ｍｐ１９が選ばれた）の二本鎖環状複製型すな
わちＲＦに挿入することにより開始された。プラスミド
ｐＢＲ３２２／ＩＦＮ−γ中ノＩＦＮ−１−構造遺伝子
は大１ｓｙｃｔｏ６１内で増殖させ、上記のＢｉｒｍｂ
Ｏｉｍ ａｎｄ ｐｏｂｙの方法を用いてプラスミドＤ
ＮＡ＝！ｚ分離した。その後、ｐＢＦｉ３２２／ＩＦｔ
Ｊ−γ プラスミドなＰｓ ｔＩ で消化した。ＩＦ
Ｎ−ｒ構造遺伝子を含む約１２００塩基対のＰｓｔＩフ
ラグメントはゲル電気泳動により分離した。このフラグ
メントな七〇）ｉＭ１３ｍｐ１９のＰＳｔＩ部位に挿入
した。この連結混合物な用いてＪＭｌｏｌ またはＪＭ
１０３のようなコンピテント細―細胞を形質転換した。
Ｍ１３ベクター（便用しやすいように、最適ベクターと
してＭ３ｍｐ１９が選ばれた）の二本鎖環状複製型すな
わちＲＦに挿入することにより開始された。プラスミド
ｐＢＲ３２２／ＩＦＮ−γ中ノＩＦＮ−１−構造遺伝子
は大１ｓｙｃｔｏ６１内で増殖させ、上記のＢｉｒｍｂ
Ｏｉｍ ａｎｄ ｐｏｂｙの方法を用いてプラスミドＤ
ＮＡ＝！ｚ分離した。その後、ｐＢＦｉ３２２／ＩＦｔ
Ｊ−γ プラスミドなＰｓ ｔＩ で消化した。ＩＦ
Ｎ−ｒ構造遺伝子を含む約１２００塩基対のＰｓｔＩフ
ラグメントはゲル電気泳動により分離した。このフラグ
メントな七〇）ｉＭ１３ｍｐ１９のＰＳｔＩ部位に挿入
した。この連結混合物な用いてＪＭｌｏｌ またはＪＭ
１０３のようなコンピテント細―細胞を形質転換した。
形質転換細胞は目的フラグメントがβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の内部な切断したことを示す色調反応に基づい
℃選択され、指示平板上に青色プラークの代わりに無色
プラークを形成するであろう。
ゼ遺伝子の内部な切断したことを示す色調反応に基づい
℃選択され、指示平板上に青色プラークの代わりに無色
プラークを形成するであろう。
挿入の方向は塩基配列決定、エンドヌクレアーゼ消化お
よびゲル電気泳動、または他の適当な手法により決定し
うる。イニシエーターメチオニンがＭ６普遇プライマー
に近接して挿入された１つのクローンを単離し、第一の
突然変異導入のために使用した。
よびゲル電気泳動、または他の適当な手法により決定し
うる。イニシエーターメチオニンがＭ６普遇プライマー
に近接して挿入された１つのクローンを単離し、第一の
突然変異導入のために使用した。
次に、下記ヌクレオチド１１列：
ＡＣＡＧＣ−ＡＴＣＣＣ；−ＡＡＴＡＡ−ＧＡＡＴＴ−
ＣＴＣ；ＣＴ−ＧＣＣＴＧ−ＣＡＡＴＡＴから成る短い
オリゴヌクレオｆ トｋ ｉｎ ｖｉｔｒ。
ＣＴＣ；ＣＴ−ＧＣＣＴＧ−ＣＡＡＴＡＴから成る短い
オリゴヌクレオｆ トｋ ｉｎ ｖｉｔｒ。
で合成した。本発明の実施に際して用いられるこの合成
配列は酵素的または化学的手段のいずれかにより製造さ
れる。適当な手段にはホスホトリエステルまたはホスフ
ァイト化学に基づいた化学的方法が含まれるか、これに
限定されない。
配列は酵素的または化学的手段のいずれかにより製造さ
れる。適当な手段にはホスホトリエステルまたはホスフ
ァイト化学に基づいた化学的方法が含まれるか、これに
限定されない。
ＩＦＮ−ｒ構造遺伝子が挿入されたＭｌ３の一本鎖型を
作製した。その鎌、ＩＦＮ−ｒ構造遺伝子のおおよそヌ
クレオチド４８７から５２１までの３′末端に部分的に
相補的である合成オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−γ構
造遺伝子を含む−本鎖Ｍ１３ベクターにアニーリングさ
せた。プライマーとして部分的に相補的な合成オリゴヌ
クレオチドを用いることにより、ＤＮＡ合成はＫｌｅｎ
ｏｗフラグメントおよびデオキシヌクレオンド三リン酸
と共に４°Ｃで１ｎｖｉｔｒｏ において実施される。
作製した。その鎌、ＩＦＮ−ｒ構造遺伝子のおおよそヌ
クレオチド４８７から５２１までの３′末端に部分的に
相補的である合成オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−γ構
造遺伝子を含む−本鎖Ｍ１３ベクターにアニーリングさ
せた。プライマーとして部分的に相補的な合成オリゴヌ
クレオチドを用いることにより、ＤＮＡ合成はＫｌｅｎ
ｏｗフラグメントおよびデオキシヌクレオンド三リン酸
と共に４°Ｃで１ｎｖｉｔｒｏ において実施される。
部分的に相補的な合成オリゴヌクレオチドはその後環状
Ｍ１３鋳型のまわりに伸長させた。この反応混合物を用
いてコンピテントＪＭＩＯ１またｊマＪＭＩ ０３ 細
胞を形質転換した。形質転換細胞１まクラークなニトロ
セルロースに移行し、変異銀とハイブリダイズするかも
との鋳型とハノーイプリダイズしないような放射性標識
オリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーションな
行うことによりスクリーニングした。その後、これらの
変異体を用いて鋳型を作り、それを用いてＪＭｌｏｌ
を形質転換した。これらの形質転換細胞は再び前のよ
うにスクリーニングした。２回目のスクリーニングから
の陽性プラークは、挿入物回収のための塩基配列決定用
ＲＦの鋳型を作るために使用した。
Ｍ１３鋳型のまわりに伸長させた。この反応混合物を用
いてコンピテントＪＭＩＯ１またｊマＪＭＩ ０３ 細
胞を形質転換した。形質転換細胞１まクラークなニトロ
セルロースに移行し、変異銀とハイブリダイズするかも
との鋳型とハノーイプリダイズしないような放射性標識
オリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーションな
行うことによりスクリーニングした。その後、これらの
変異体を用いて鋳型を作り、それを用いてＪＭｌｏｌ
を形質転換した。これらの形質転換細胞は再び前のよ
うにスクリーニングした。２回目のスクリーニングから
の陽性プラークは、挿入物回収のための塩基配列決定用
ＲＦの鋳型を作るために使用した。
このプラスミドはｐＩＮＦと命名された。
先に分離されたＭ１３はそのｉＩＦ’Ｎ−ｒのＡＴＧ開
始コドンに隣接して５′側にＥｃｏＲＩ部位を導入する
別の変異、さらにおおよそヌクレオチド３６．６７およ
び６８に第二開始コドンとＥｃｏＲＩ 部位を作ること
によりシグナル配列を欠失させる変異を、別々導入した
（表２参照）。
始コドンに隣接して５′側にＥｃｏＲＩ部位を導入する
別の変異、さらにおおよそヌクレオチド３６．６７およ
び６８に第二開始コドンとＥｃｏＲＩ 部位を作ること
によりシグナル配列を欠失させる変異を、別々導入した
（表２参照）。
ＡＴＧ開始コドンに隣接して５′側にＥｃｏＲＩ部位を
導入するために、下記配列： ＴＴＣＴＣＴＣＧＧＡ ＡＴＴＣＡ ＴＧＡＡＡ ＴＡ
ＴＡＣから成る別のオリゴヌクレオチドが合成された。
導入するために、下記配列： ＴＴＣＴＣＴＣＧＧＡ ＡＴＴＣＡ ＴＧＡＡＡ ＴＡ
ＴＡＣから成る別のオリゴヌクレオチドが合成された。
この配列は一本鎖ｐＩＦＮにアニーリングした。
このオリゴヌクレオチドは上記のよ５ＶＣＤＮＡ合成の
ためのプライマーとして使用した。変異ＩＦＮ−γ構造
遺伝子はＩＦＮ２１１と命名され１表３に示す。
ためのプライマーとして使用した。変異ＩＦＮ−γ構造
遺伝子はＩＦＮ２１１と命名され１表３に示す。
ｐＩＦＮのもう１つの変異は、おおよそヌクレオチド３
６．６７および６８に第二開始コドンおよび！ｉ：ｃｏ
ＲＩ部位を導入することによりシグナル配列を欠失させ
るために実施した。下記配列：ＴＴＧＧＧ−ＴＴＣＴＣ
−ＴＴＧＧＣ−ＧＡＡＴＴ−ＣＡＴＧＣ−ＡＧＧＡＣ−
ＣＣＡＴＡ−ＴＧＴＡ から成るオリゴヌクレオチドが合成された。
６．６７および６８に第二開始コドンおよび！ｉ：ｃｏ
ＲＩ部位を導入することによりシグナル配列を欠失させ
るために実施した。下記配列：ＴＴＧＧＧ−ＴＴＣＴＣ
−ＴＴＧＧＣ−ＧＡＡＴＴ−ＣＡＴＧＣ−ＡＧＧＡＣ−
ＣＣＡＴＡ−ＴＧＴＡ から成るオリゴヌクレオチドが合成された。
このオリゴヌクレオチドは上記のようにＤＮＡ合成のた
めのプライマーとして使用した。この変異ＩＦＮ−ｒ構
造遺伝子１！Ｉｌｉ’ＮＯ−２と命名され１表４に示さ
れる。
めのプライマーとして使用した。この変異ＩＦＮ−ｒ構
造遺伝子１！Ｉｌｉ’ＮＯ−２と命名され１表４に示さ
れる。
先に挙げた大腸菌株の培養は適当な手段により℃達成さ
れる。大腸菌の一般的な培養法はすでに当分野で知られ
ており、これらの方法をここで用いろ菌株の特殊な必要
条件に合わせることも当業者の技量の範囲内である。
れる。大腸菌の一般的な培養法はすでに当分野で知られ
ており、これらの方法をここで用いろ菌株の特殊な必要
条件に合わせることも当業者の技量の範囲内である。
大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収は、その分子量が
小さくしかもその形が閉環状スーパーへすγクスである
ことから、いくつかの技法により達成できる。例えば、
収穫後に宿主細胞を遠心して沈澱させ、ベレットを再懸
濁して溶菌する。その溶菌液は細胞破片な除（ために遠
心され、 ＤＮＡを含む上澄が保持されるであろう。そ
の後、フェノール抽出を行っ一部ＧＤＮＡから大部分の
他の汚染物な除去する。次に、フェノール抽出されたＤ
ＮＡは密度勾配遠心またはゲルｐ過法な用い℃さらに処
理し、細菌ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離する。こ
の分離を達成するための技術は当分野でよく知られてお
り、これらの技術の実施方法も数多く知られ工いる。
小さくしかもその形が閉環状スーパーへすγクスである
ことから、いくつかの技法により達成できる。例えば、
収穫後に宿主細胞を遠心して沈澱させ、ベレットを再懸
濁して溶菌する。その溶菌液は細胞破片な除（ために遠
心され、 ＤＮＡを含む上澄が保持されるであろう。そ
の後、フェノール抽出を行っ一部ＧＤＮＡから大部分の
他の汚染物な除去する。次に、フェノール抽出されたＤ
ＮＡは密度勾配遠心またはゲルｐ過法な用い℃さらに処
理し、細菌ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離する。こ
の分離を達成するための技術は当分野でよく知られてお
り、これらの技術の実施方法も数多く知られ工いる。
プラスミドのヌクレアーゼ消化は、ＩＦＮ−ｒ構造遺伝
子の回収を容易にするような方法で所定のプラスミドを
切断する適当なエンドヌクレアーゼを選ぶことにより達
成される。用いるエンドヌクレアーゼは、ＩＦＮ遺伝子
を切り取ろうとするプラスミドに依存するであろう。例
えば、上記のＭ１３プラスミド中に含まれる変異ＩＦＮ
−ｒｍ造遺伝子はＥｃｏＲＩ フラグメントとして容易
に回収できる。
子の回収を容易にするような方法で所定のプラスミドを
切断する適当なエンドヌクレアーゼを選ぶことにより達
成される。用いるエンドヌクレアーゼは、ＩＦＮ遺伝子
を切り取ろうとするプラスミドに依存するであろう。例
えば、上記のＭ１３プラスミド中に含まれる変異ＩＦＮ
−ｒｍ造遺伝子はＥｃｏＲＩ フラグメントとして容易
に回収できる。
ＤＮＡのゲル電気泳動は多（の技法により達成される。
Ｐ、Ｇ、５ｅａｌｙ ａｎｄ Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ。
ｒｎ。
Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＡ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ（Ｄ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄａｎｄ Ｂ、Ｄ
、Ｅ（ａｍｅｓ、ｅｄｓ、Ｊ ｐ、３９ （１９８２Ｊ
を診照されたい。溶出もまたゲルに適した数多くの手
法１例えば電気泳動溶出法、拡散法、ゲル溶解法（アガ
ロースゲルノまたは物理的押出し法（アガロースゲルノ
な用いて達成しうる。高品質、低融点アガロースのよう
な一部のゲルの場合は、溶出を必要としないことがさら
に理解されよう。
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＡ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ（Ｄ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄａｎｄ Ｂ、Ｄ
、Ｅ（ａｍｅｓ、ｅｄｓ、Ｊ ｐ、３９ （１９８２Ｊ
を診照されたい。溶出もまたゲルに適した数多くの手
法１例えば電気泳動溶出法、拡散法、ゲル溶解法（アガ
ロースゲルノまたは物理的押出し法（アガロースゲルノ
な用いて達成しうる。高品質、低融点アガロースのよう
な一部のゲルの場合は、溶出を必要としないことがさら
に理解されよう。
ひとたびＩＦＮ−ｒ構造遺伝子またはその断片を含むフ
ラグメントが単離されろと、それにベクターに挿入する
前にいくつかの追加の操作か必要であるだろう。これら
の操作にはリンカ−の付加またはフラグメントの平滑末
端化などが含まれるが、これらに限定されない。
ラグメントが単離されろと、それにベクターに挿入する
前にいくつかの追加の操作か必要であるだろう。これら
の操作にはリンカ−の付加またはフラグメントの平滑末
端化などが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施においては、ＩＦＮ２１１およびｒ−ＩＦ
ＮＣ−２なそれぞれのＭ１３プラスミドからＥｃｏＲＩ
消化、その後の電気泳動により回収することが好適であ
った。Ｉ ＦＮ ２１１ ＩＦＮ−ｒ構造遺伝子はその
ＩＩＦＮ−γ分泌７允現ベクターの作製に用いられるで
あろう。ｐ’ＮＧ−２ＩＦＮ−γ構造遺伝子はその後Ｉ
Ｆ Ｎ −ｒ細胞質７晃現ベクターの作製に用いられる
であろう。
ＮＣ−２なそれぞれのＭ１３プラスミドからＥｃｏＲＩ
消化、その後の電気泳動により回収することが好適であ
った。Ｉ ＦＮ ２１１ ＩＦＮ−ｒ構造遺伝子はその
ＩＩＦＮ−γ分泌７允現ベクターの作製に用いられるで
あろう。ｐ’ＮＧ−２ＩＦＮ−γ構造遺伝子はその後Ｉ
Ｆ Ｎ −ｒ細胞質７晃現ベクターの作製に用いられる
であろう。
２種のＩＦＮ−ｒ構造遺伝子（ＩＦＮ２１１およびＩＦ
ＮＣ−２Ｊの分離後に、それぞれの遺伝子は適当なメチ
ロトローフ酵母ベクター（例、プラスミドノに挿入され
た。本発明の実施に適したベクターはビチア属、最も好
ましくはビチア・〕くストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ Ｊ ＶＣ適合しうるものである。
ＮＣ−２Ｊの分離後に、それぞれの遺伝子は適当なメチ
ロトローフ酵母ベクター（例、プラスミドノに挿入され
た。本発明の実施に適したベクターはビチア属、最も好
ましくはビチア・〕くストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ Ｊ ＶＣ適合しうるものである。
プラスミドは組換えＤＮＡ技術において使用される基本
的要素の１つになっている。プラスミドは微生物に見ら
れる染色体外比の環状二本鎖ＤＮＡである。プラスミド
は細胞１個あたり１つまたは多数のコピー数で存在する
ことが分かつている。
的要素の１つになっている。プラスミドは微生物に見ら
れる染色体外比の環状二本鎖ＤＮＡである。プラスミド
は細胞１個あたり１つまたは多数のコピー数で存在する
ことが分かつている。
プラスミドＤＮＡ＆’］！プラスミドの増殖に必要な情
報が含まれており、すなわち複製起点が細菌複製のため
に存在する。形質転換組社中のグラスミドを表現型によ
り選択する１つ以上の手段も、グラスミドにコード化さ
れた情報に組み込まれている。表現型または選択マーカ
ー（例えは、抗生物質耐性遺伝子や宿主の生化学的経路
の欠損を補う遺伝子）は形質転換された宿主細胞クロー
ンの確認１選択および維持な可能にする。
報が含まれており、すなわち複製起点が細菌複製のため
に存在する。形質転換組社中のグラスミドを表現型によ
り選択する１つ以上の手段も、グラスミドにコード化さ
れた情報に組み込まれている。表現型または選択マーカ
ー（例えは、抗生物質耐性遺伝子や宿主の生化学的経路
の欠損を補う遺伝子）は形質転換された宿主細胞クロー
ンの確認１選択および維持な可能にする。
メチロトローフ酵母内でＩＦＮ−ｒ構造遺伝子な発現さ
せるために、各遺伝子は５′調節領域および６′終結配
列（ベクターを介し℃宿主に挿入される発現カセットを
＊ｇする）に機能しうる状態で連結されねばならない。
せるために、各遺伝子は５′調節領域および６′終結配
列（ベクターを介し℃宿主に挿入される発現カセットを
＊ｇする）に機能しうる状態で連結されねばならない。
本発明のより一層の理解のために、ここで以下の用語を
定義しておく。
定義しておく。
機能しうる状態で連結された一一一各構成成分がその機
能を遂行するように並置・連結され℃いることを意味す
る。
能を遂行するように並置・連結され℃いることを意味す
る。
調節領域−ｍ−各種の刺激に応答してｍＲＮへの転写速
度に影響を及ぼすＤＮＡ配列。
度に影響を及ぼすＤＮＡ配列。
６／終結配列−−−ポリアデニル化に、Ｎ発する配列の
ような、ｍＲＮＡな安定化するよう作用し、終止コドン
の６′側に存在する配列。
ような、ｍＲＮＡな安定化するよう作用し、終止コドン
の６′側に存在する配列。
ピチア適合注−−−ビチア由来の調節領域および６′終
結配列のような、ビテアの内部でそれらの正常な機能を
果たすＤＮＡ配列を意味する。
結配列のような、ビテアの内部でそれらの正常な機能を
果たすＤＮＡ配列を意味する。
本発明を実施する場合、宿主染色体に組込まれるベクタ
ー（ｉｎｔｅｇｒａｌｔｉ’Ｖ８ ｖｅｃｔｏｒ Ｊ
、 ｉｌｌえは欧州特許出願第８６１１４７００．７号
（特許出願公開第２２６７５２号として発行〕に記載さ
れるａｒｅｇｇの線状部位特異的インテグレイティブベ
クターが適している。この稙のベクターは少なくとも１
Ｊ第一の挿入ｏｌ’能なＤＮＡフラグメント；２Ｊ選択
マーカー遺伝子；および６ノ第二の挿入可能なＤＮＡフ
ラグメントから成る連続的に配置された配列な含む。
ー（ｉｎｔｅｇｒａｌｔｉ’Ｖ８ ｖｅｃｔｏｒ Ｊ
、 ｉｌｌえは欧州特許出願第８６１１４７００．７号
（特許出願公開第２２６７５２号として発行〕に記載さ
れるａｒｅｇｇの線状部位特異的インテグレイティブベ
クターが適している。この稙のベクターは少なくとも１
Ｊ第一の挿入ｏｌ’能なＤＮＡフラグメント；２Ｊ選択
マーカー遺伝子；および６ノ第二の挿入可能なＤＮＡフ
ラグメントから成る連続的に配置された配列な含む。
第一および第二の押入可能なＤＮＡフラグメントはそれ
ぞれ少なくとも約２００ヌクレオチ）Ｖ）鎖長であり、
それらが挿入される一種のゲノムＤＮＡの部分に相同な
ヌクレオチド配列な有する。
ぞれ少なくとも約２００ヌクレオチ）Ｖ）鎖長であり、
それらが挿入される一種のゲノムＤＮＡの部分に相同な
ヌクレオチド配列な有する。
インテグレイティブベクターの各ｍ％成成分ｊ工連続的
に配置され２発現カセットと選択マーカー遺伝子とが第
一の挿入ｏｌＪ能なＤＮＡフラグメントの６′末端と第
二の挿入可能なＤＮＡフラグメントの５′末端との間に
配置される線状ＤＮＡフラグメントを形成する。第一お
よび第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント１工、それら
が親ゲノムにおいて方向づけられていたように、その連
続配＃粉状フラグメント中でも相互に対して方向づけら
れろ。
に配置され２発現カセットと選択マーカー遺伝子とが第
一の挿入ｏｌＪ能なＤＮＡフラグメントの６′末端と第
二の挿入可能なＤＮＡフラグメントの５′末端との間に
配置される線状ＤＮＡフラグメントを形成する。第一お
よび第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント１工、それら
が親ゲノムにおいて方向づけられていたように、その連
続配＃粉状フラグメント中でも相互に対して方向づけら
れろ。
第一および第二の挿入０Ｔ能なＤＮＡフラグメントとし
て有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾が起こる予定
の天然ゲノム部位のそれぞれ異なる部分と相同なヌクレ
オチド配列である。従つ℃。
て有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾が起こる予定
の天然ゲノム部位のそれぞれ異なる部分と相同なヌクレ
オチド配列である。従つ℃。
例えば、ゲノム修飾がアルコールオキシダーゼ遺伝子の
位置で起こるとすると、用いる第一および第二の挿入可
能なＤＮＡフラグメントはアルコールオキシダーゼ遺伝
子座のそれぞれ異なる部分と相同な配列であるだろう。
位置で起こるとすると、用いる第一および第二の挿入可
能なＤＮＡフラグメントはアルコールオキシダーゼ遺伝
子座のそれぞれ異なる部分と相同な配列であるだろう。
本発明によるゲノム修飾が起こるためには、２つの挿入
可能なＤＮＡフラグメントは、それらが親ゲノムにおい
て存在していたのと同じ相対的方向で、線状フラグメン
トにおいても相互に方向づけられねばならない。第一お
よび第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントとして使用さ
れるヌクレオチド配列の例はアルコールオキシダーゼ（
ＡＯＸｌ）遺伝子、 ジヒドロキシアセトンシンターゼ
（ＤＨＡＳＪ遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝
子より成る群から選ばれるヌクレオチド配列である。Ａ
ＯＸＩ遺伝子、 ＤＨＡＳ遺伝子、１）４０遺伝子およ
び）ｌＩｓ４遺伝子は欧州特許出願公開第０１８１７１
号（Ｐｈ１ｌｌｉｐＳｐｅｔｒｏ：ｔｅｕｍ社）に記載
されている。
可能なＤＮＡフラグメントは、それらが親ゲノムにおい
て存在していたのと同じ相対的方向で、線状フラグメン
トにおいても相互に方向づけられねばならない。第一お
よび第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントとして使用さ
れるヌクレオチド配列の例はアルコールオキシダーゼ（
ＡＯＸｌ）遺伝子、 ジヒドロキシアセトンシンターゼ
（ＤＨＡＳＪ遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝
子より成る群から選ばれるヌクレオチド配列である。Ａ
ＯＸＩ遺伝子、 ＤＨＡＳ遺伝子、１）４０遺伝子およ
び）ｌＩｓ４遺伝子は欧州特許出願公開第０１８１７１
号（Ｐｈ１ｌｌｉｐＳｐｅｔｒｏ：ｔｅｕｍ社）に記載
されている。
第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントは発現力セクトに
おいて利用される調節領域から成る機能性の調節領域を
含むことができる。発現カセットの調節領域として第一
の挿入可能なＤＮＡフラグメントな用いることは本発明
の好適な実施態様である。第６図は発現力セクトの調節
領域として第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントを利用
したベクターの模式図を提供する。
おいて利用される調節領域から成る機能性の調節領域を
含むことができる。発現カセットの調節領域として第一
の挿入可能なＤＮＡフラグメントな用いることは本発明
の好適な実施態様である。第６図は発現力セクトの調節
領域として第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントを利用
したベクターの模式図を提供する。
場合により、第２図に示すように、挿入部位および６′
終結配列は第一の挿入可能なフラグメントのすぐ６′側
に配置することができる。線状部位特異的インテグレイ
ティブベクターのこのコンホメーションは、適合性の３
′終結配列の導入を必要とすることなく、構造遺伝子を
いつでも挿入しうるｇ位を提供するという利点をさらに
有している。
終結配列は第一の挿入可能なフラグメントのすぐ６′側
に配置することができる。線状部位特異的インテグレイ
ティブベクターのこのコンホメーションは、適合性の３
′終結配列の導入を必要とすることなく、構造遺伝子を
いつでも挿入しうるｇ位を提供するという利点をさらに
有している。
また、宿主菌株の形質転換に用いるＤＮＡは。
少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むことが必要
である。これは形質転換用ＤＮＡを組込んだ微生物の選
択および分離を容易にする。マーカー遺伝子は宿主がも
っていなかった表現型特注。
である。これは形質転換用ＤＮＡを組込んだ微生物の選
択および分離を容易にする。マーカー遺伝子は宿主がも
っていなかった表現型特注。
飼えば非形質転換宿主菌株が特定のアミノ酸生合成経路
に欠＃Ｊｌ有する場合その特定アミノａ！す生産する能
力の回復、または抗生物質に対する耐性。
に欠＃Ｊｌ有する場合その特定アミノａ！す生産する能
力の回復、または抗生物質に対する耐性。
などを形質転換細胞に付与する。
代表的な選択マーカー遺伝子はピチア・パストリスおよ
びサッカロマイセス・セルビシェー由来のＨＩＳ４遺伝
子およびＡＰＩ（１，４遺伝子、サッカロマイセス・セ
ルビシェー由来のインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２Ｊ、
または大腸菌の転位因子Ｔｎ６０１またはＴｎ９０３由
来のＧ４１８ホスホトランスフエラーゼ遺伝子より成る
群から選ばれる。
びサッカロマイセス・セルビシェー由来のＨＩＳ４遺伝
子およびＡＰＩ（１，４遺伝子、サッカロマイセス・セ
ルビシェー由来のインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２Ｊ、
または大腸菌の転位因子Ｔｎ６０１またはＴｎ９０３由
来のＧ４１８ホスホトランスフエラーゼ遺伝子より成る
群から選ばれる。
当業者は、細歯プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージ
ＤＮＡ、および合成配列（例、ポリリンカー］のような
他のＤＮＡも本発明の実施に用いられるベクター中に組
み入れることができることを認めろであろう。これらの
配列は遺伝子の挿入。
ＤＮＡ、および合成配列（例、ポリリンカー］のような
他のＤＮＡも本発明の実施に用いられるベクター中に組
み入れることができることを認めろであろう。これらの
配列は遺伝子の挿入。
細菌宿主内でのこれらのベクターの増殖および維持を容
易にする。
易にする。
第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントが調節領域を含ま
ない場合、適当な調節領域は機能性の発現カセットを得
るために、構造遺伝子に機能しうる状態で連結させて挿
入する必要があるだろう。
ない場合、適当な調節領域は機能性の発現カセットを得
るために、構造遺伝子に機能しうる状態で連結させて挿
入する必要があるだろう。
同様に、６′終結配列が挿入部位に存在せず、発現カセ
ットが完成しない場合は、６′終結配列を、挿入すべき
構造遺伝子に機能しうる状態で連結しなければならない
だろう。
ットが完成しない場合は、６′終結配列を、挿入すべき
構造遺伝子に機能しうる状態で連結しなければならない
だろう。
性状決定がなされ且つメチロトローフ酵母と共に使用で
きる調節領域は当業者に多数知られている。代表的な調
節領域にはパン酵母から分離された酸ホスファターゼ、
ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チト
クロムＣ，α接合因子およびグリセルアルデヒド−６−
リン酸デヒドロゲナーゼの調節領域；ピチア・パストリ
スから誘導された第一アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ
ｌＪ。
きる調節領域は当業者に多数知られている。代表的な調
節領域にはパン酵母から分離された酸ホスファターゼ、
ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チト
クロムＣ，α接合因子およびグリセルアルデヒド−６−
リン酸デヒドロゲナーゼの調節領域；ピチア・パストリ
スから誘導された第一アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ
ｌＪ。
ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ〕、ｐ４０
訓節領域、およびＨＩＳ４調節領域が含まれ。
訓節領域、およびＨＩＳ４調節領域が含まれ。
これらに限定されない。本発明実施に際し℃用いられる
目下の好適な調節領域は、メタノール含有培地に応答す
るそれらの能力により特徴づけられるものであり、この
ような調節領域は欧州特許出Ｍ公開第０１８３０７１号
Ｋ１１ｅｉｌｔＬるＡＯＸｌ。
目下の好適な調節領域は、メタノール含有培地に応答す
るそれらの能力により特徴づけられるものであり、この
ような調節領域は欧州特許出Ｍ公開第０１８３０７１号
Ｋ１１ｅｉｌｔＬるＡＯＸｌ。
ＤＨＡＳおよびｐ４０より成る群から選ばれる。
本発明の実施に最も適した調節領域はＡＯＸ ｉ調節領
域である。
域である。
６′終結配列は発現カセットにおいて利用されるか、ま
たは先に論じたベクターの一部でありうる。
たは先に論じたベクターの一部でありうる。
３′終結配列服遺伝子に機能しうる状態で連結された場
合、構造遺伝子によりコードされるｍＲＮＡな終結させ
、ボＩＪ Ａ化し、かつ／また安定化するように作用す
る。本発明の実施に用いられる代表的な６′終結配列源
の２．６の例はサッカロマイセス・セルビシェー ハン
セヌラｅポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａ ） 、オヨびビチアの６′終結配列であ
り、これらに限定されない。好適な６′終結配列はビチ
ア・ノくス） ＩＪスから誘導され、ｆｌＲＪエバＡ
ＯＸ Ｉ Ｍ伝子、 Ｄ ＨＡ Ｓ 遺伝子。
合、構造遺伝子によりコードされるｍＲＮＡな終結させ
、ボＩＪ Ａ化し、かつ／また安定化するように作用す
る。本発明の実施に用いられる代表的な６′終結配列源
の２．６の例はサッカロマイセス・セルビシェー ハン
セヌラｅポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａ ） 、オヨびビチアの６′終結配列であ
り、これらに限定されない。好適な６′終結配列はビチ
ア・ノくス） ＩＪスから誘導され、ｆｌＲＪエバＡ
ＯＸ Ｉ Ｍ伝子、 Ｄ ＨＡ Ｓ 遺伝子。
Ｑ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子の６′終結配列より
成る群から選ばれる。ＡＯＸｉ遺伝子の６′終結配列が
特に好ましい。
成る群から選ばれる。ＡＯＸｉ遺伝子の６′終結配列が
特に好ましい。
本発明の実施においては、第２図に示すベクターのＢｇ
ｔロフラグメントのような線状形質転換ベクターを用い
ることが目下のところ好適である。
ｔロフラグメントのような線状形質転換ベクターを用い
ることが目下のところ好適である。
適当なベクターへのＩＦＮ２１１またはＩＦＮＣ−２構
造遺伝子の挿入は、所定のベクターを適切な部位で切断
して、ＩＦＮ２１１ またはＩＦ’ＮＧ−２構造遺伝子
を含む少なくとも１つの機能的な発現カセットをベクタ
ー中に存在させる適当な技術により達成できる。
造遺伝子の挿入は、所定のベクターを適切な部位で切断
して、ＩＦＮ２１１ またはＩＦ’ＮＧ−２構造遺伝子
を含む少なくとも１つの機能的な発現カセットをベクタ
ー中に存在させる適当な技術により達成できる。
ＩＦＮ２１１またはＩＦＮＧ−２構造遺伝子の連結は、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼな利用するような適当な連結技術に
より達成されろ。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼな利用するような適当な連結技術に
より達成されろ。
ベクター内のＩＦＮ２１１またはＩＦ’ＮＯ−２構造遺
伝子の連結混合物の初期選択、増殖および任意の増幅は
好ましくは大腸菌のような細菌宿主へその混合物を形質
転換することにより行われる。大腸菌の形質転換技術は
当分野で公知である。さらに１選択マーカーおよび細菌
宿主中のベクターの維持に必要な他山複製起点も当分野
でよく知られている。
伝子の連結混合物の初期選択、増殖および任意の増幅は
好ましくは大腸菌のような細菌宿主へその混合物を形質
転換することにより行われる。大腸菌の形質転換技術は
当分野で公知である。さらに１選択マーカーおよび細菌
宿主中のベクターの維持に必要な他山複製起点も当分野
でよく知られている。
発現系中にＩＦＮ２１１またはＩＦＮＣ−２構造遺伝子
を含む目的プラスミドの分離および／また１ま精製は、
宿主ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離する適当な方法
により達成される。
を含む目的プラスミドの分離および／また１ま精製は、
宿主ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離する適当な方法
により達成される。
同様に、連結によって形成されたベクターは。
好ましくは増殖後に、目的とする構造遺伝子の存在およ
び調節領域と３′終結配列へのその機能しうる状態での
結合を証明するために試験される。これはエンドヌクレ
アーゼ消化、ゲル電気泳動、またはエンドヌクレアーゼ
消化−サザンノーイプリダイゼーシッンを含む（これら
に限定されない）いろいろな技法により達成しうる。
び調節領域と３′終結配列へのその機能しうる状態での
結合を証明するために試験される。これはエンドヌクレ
アーゼ消化、ゲル電気泳動、またはエンドヌクレアーゼ
消化−サザンノーイプリダイゼーシッンを含む（これら
に限定されない）いろいろな技法により達成しうる。
酵母宿主への環状プラスミドまたは線状ベクターの形質
転換に’ｓ、 Ｈｉｎｎｆ３ｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ。
転換に’ｓ、 Ｈｉｎｎｆ３ｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、ｓｃｌ −７５、（１９７Ｂ）１９２９ ：
Ｉｔ” ｅｔ ａｌ。
Ｉｔ” ｅｔ ａｌ。
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １５３ 、（１９８３Ｊ
１６３： Ｃｒｅｇｇｅｔ ａｌ Ｍｏ１．Ｃｅ１
ｌ Ｂｉｏｌ、５（１９８５〕ｐｇ。
１６３： Ｃｒｅｇｇｅｔ ａｌ Ｍｏ１．Ｃｅ１
ｌ Ｂｉｏｌ、５（１９８５〕ｐｇ。
３３７６；まりに！５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａ
ｌ、 Ｃｅｎｅ。
ｌ、 Ｃｅｎｅ。
３９、（１９８７）ｐｇ、ｔｉｓ により教示された技
術を含めた（これらに限定されない）適当な形質転換法
により達成できる。本発明の実施にはＣｒｅｇｇの形質
転換技術が適している。線状ベクターを過剰に使用して
、多重挿入を有する菌株なサザン・・イブリダイゼーシ
ッンにより同定することが本発明の実施にとって望まし
い。
術を含めた（これらに限定されない）適当な形質転換法
により達成できる。本発明の実施にはＣｒｅｇｇの形質
転換技術が適している。線状ベクターを過剰に使用して
、多重挿入を有する菌株なサザン・・イブリダイゼーシ
ッンにより同定することが本発明の実施にとって望まし
い。
部位特異的な線状形質転換ベクターは宿主ゲノムのある
部位に優先的に挿入されるが１本発明の実施においては
低頻度で他の部位にも組み込まれ得ることが認められる
。さらに、相同なＤＮＡ領域内で、各ベクターはわずか
に異なる配置で挿入されうろことが認められろ。同様に
、異なる多重挿入も起こりうる。
部位に優先的に挿入されるが１本発明の実施においては
低頻度で他の部位にも組み込まれ得ることが認められる
。さらに、相同なＤＮＡ領域内で、各ベクターはわずか
に異なる配置で挿入されうろことが認められろ。同様に
、異なる多重挿入も起こりうる。
形質転換用の酵母宿主は適当なメチロトローフ酵母であ
りうる。メチロトローフ酵母に１まハンセヌラ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ）、ク
ロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ）、ビｆ ７ （Ｐ
ｉ Ｃｈ ｉ ａ ）、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ） 、 ） ル。
りうる。メチロトローフ酵母に１まハンセヌラ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ）、ク
ロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ）、ビｆ ７ （Ｐ
ｉ Ｃｈ ｉ ａ ）、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ） 、 ） ル。
プシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）およびロドトルラ（Ｒ
ｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ） より成る群から選ばれる
メタノール上で増殖可能な酵母が含まれろが、これらに
限定されない。この種類の酵母な代表する特定菌種の一
覧表はＣ，Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
−ｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ、
２６９ （１９８２Ｊに記載されている。目下のとこ３
、ビテア属のメチロトローフ酵母が好適である。特にピ
チア・バストリスが好ましい。また、栄養要求性のメチ
ロトローフ酵母１例えは栄養要求変異種ピチア・パスト
リスＧ３１１５（ＮＲＲＬＹ−１５８５１）、はそれら
の選択のし易さゆえに本発明の実施に有利である。適当
な形質転換用マーカー遺伝子（例えは。
ｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ） より成る群から選ばれる
メタノール上で増殖可能な酵母が含まれろが、これらに
限定されない。この種類の酵母な代表する特定菌種の一
覧表はＣ，Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
−ｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ、
２６９ （１９８２Ｊに記載されている。目下のとこ３
、ビテア属のメチロトローフ酵母が好適である。特にピ
チア・バストリスが好ましい。また、栄養要求性のメチ
ロトローフ酵母１例えは栄養要求変異種ピチア・パスト
リスＧ３１１５（ＮＲＲＬＹ−１５８５１）、はそれら
の選択のし易さゆえに本発明の実施に有利である。適当
な形質転換用マーカー遺伝子（例えは。
ピチア・パストリスなショ糖上で増殖しうる菌株へ形質
転換する５ＵＣ２の使用）を選択するが。
転換する５ＵＣ２の使用）を選択するが。
あるいは抗生物質耐性マーカーな用いるならば。
野生型のメチロトローフ酵母菌株も使用できることが理
解されるであろう。
解されるであろう。
形質転換されたメチロトローフ酵母細胞は、（細胞の栄
養要求性ゆえに）必要とされろ生化学的産物の不在下で
形質転換後の栄養要求性細胞を培養すること、新しい表
現型（１メタノール遅増殖”）の検出により選択するこ
と、または形質転換細胞に含まれろ耐性遺伝子の不在下
では酵母にとって有毒である抗生物質の存在下で培養す
ること、を含む（しかしこれらに限定されない）適当な
手法を用いて選択することができる。
養要求性ゆえに）必要とされろ生化学的産物の不在下で
形質転換後の栄養要求性細胞を培養すること、新しい表
現型（１メタノール遅増殖”）の検出により選択するこ
と、または形質転換細胞に含まれろ耐性遺伝子の不在下
では酵母にとって有毒である抗生物質の存在下で培養す
ること、を含む（しかしこれらに限定されない）適当な
手法を用いて選択することができる。
分離後の形質転換メチロトローフ酵母細胞は、適当な発
酵技術２例えば振と５フラスコ発酵、高密度発酵、また
はＣｒｅｇｇ ａｔ ａｌ、 、 メチロトローフ酵
母のピチア・バストリスによるＢ型肝炎表面抗原の高レ
ベル発現および効率のよいアセンブリー、５Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７９ （１９８７Ｊｖｃ記載さ
れる技術により培養される。
酵技術２例えば振と５フラスコ発酵、高密度発酵、また
はＣｒｅｇｇ ａｔ ａｌ、 、 メチロトローフ酵
母のピチア・バストリスによるＢ型肝炎表面抗原の高レ
ベル発現および効率のよいアセンブリー、５Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７９ （１９８７Ｊｖｃ記載さ
れる技術により培養される。
遺伝子発現は用いられた調節領域に適する方法により達
成される。好ましくは、メタノール応答性調節領域が用
いられる場合、ＩＦＮ遺伝子の発現は栄養培地中の形質
転換細胞をＡＯＸ１調節領域のだめの適当なアルコール
（例、メタノールノにさらすことにより達成される。
成される。好ましくは、メタノール応答性調節領域が用
いられる場合、ＩＦＮ遺伝子の発現は栄養培地中の形質
転換細胞をＡＯＸ１調節領域のだめの適当なアルコール
（例、メタノールノにさらすことにより達成される。
ＩＦＮ−γタンパク質は、十分な期間誘導された形質転
換細胞な、ビーズ破砕および細胞破片な除くための遠心
のような標準方法を用いて溶菌すること罠より、細胞質
型のγ−ＩＦＮ構造遺伝子を発現する菌株から粗生産物
の形で回収されろ。
換細胞な、ビーズ破砕および細胞破片な除くための遠心
のような標準方法を用いて溶菌すること罠より、細胞質
型のγ−ＩＦＮ構造遺伝子を発現する菌株から粗生産物
の形で回収されろ。
これとは別に、ｒ−ＩＦＮタンパク質は分泌型のｒ −
Ｉ ＦＮ構造遺伝子を発現する菌株を増殖させた培地か
ら回収しうる。単細胞宿主生物からの異種タンパク質の
抽出に利用され、上記の一般的抽出方法またはその後の
精製に代わりうる方法は当業者に数多く知られている。
Ｉ ＦＮ構造遺伝子を発現する菌株を増殖させた培地か
ら回収しうる。単細胞宿主生物からの異種タンパク質の
抽出に利用され、上記の一般的抽出方法またはその後の
精製に代わりうる方法は当業者に数多く知られている。
他の適当な手法の例を実施例ｖｍに示す。
以下の非限定的実施例は本発明の実施な詳しく例示する
ためのものである。
ためのものである。
（実施例］
菌株
ピチア・バストリスＣ）、Ｓ １１５ （ｈｉｓ４）
ＣＮＲＦｉＬＹ−１５８５１）はこれらの実施的で用い
た宿主酵母菌株であった。
ＣＮＲＦｉＬＹ−１５８５１）はこれらの実施的で用い
た宿主酵母菌株であった。
大腸菌ＪＭＩ０３デにり（ｌａｃ ｐｒｏ ） ｔｈｉ
ｒｐｓｌ（５ｔｒＡ）ｓｕｐＥ ｅｎｄＡ ５ｂ
ｃＢ ｈｓｄＲ。
ｒｐｓｌ（５ｔｒＡ）ｓｕｐＥ ｅｎｄＡ ５ｂ
ｃＢ ｈｓｄＲ。
大腸ｔｌｉＫ１２ ＭＣｔ０６ｔ ＮＲＲＬ−１８０
１６ＣＦ’−ノａｒａＤ１３９デｈり（１ａｃ１ＰＯＺ
Ｙ）ｘ７４ ｇａｌｋｇａｌｕ ｈｓｒ ｈｓｍ（十
Ｊ ｒｐｓＬデルタ（ａｒａＡＢＯＩｃ１８ｕＪ７６９
７゜ 緩衝液、溶液および培地 以下の実施例で使用した緩衝液および溶液１ま下記の組
成な有する： ｄＨＯミリ−Ｑ（ミリボアノ試薬水システムで処理した
脱イオン水 ＩＭ）リス緩衝液 ＨｚＧＳ００ｍＡ中のトリス塩基１
２１．１？；−（３５％）ＨＣ１水溶液の添加によりｐ
Ｈを所望の値に 調整；耐液を室温まで冷却させた 後最終的なｐＨＦＡ整；最終容量１ ｔに希釈 ＴＥ緩衝液 ０．０１ Ｍ （ｐＨ８，０） トリス緩
衝液中ノ１． ＯｍＭ ＥＤＴＡ ＳＥＤ １Ｍソルビトール ２５ ｍＭ ＥＤＴＡ ５［１ｍＭＤＴＴ ・・・ ｐＨ８に調整 ＳＣＥ ９．１？ンルビトール １．４７Ｐクエン酸ナトリウム ０．１６８Ｐ ＥＤＴＡ −ｄＨ２０５０ｍ１中のＨＣｌでｐＨ ５，８に調整、オートクレーブ滅菌 （ａＳ １Ｍソルビトール １０ｍＭ ＣａＣｌ２ ・・・ −過滅菌 ＰＥＧ溶液 ２０％ポリエチレングリコール−１０ｍＭ
ｃａｃｚ２ １０ｍＭ） リス−）１０ｔ（ｐＨ７，４Ｊ・・・ 濾
過滅菌 溶液Ａ ０．２Ｍ）リス−ＨＧｔ＜ ｐ）ｌ ７
．５ノＱ、ｉ Ｍ ＭｇＣＡ２ ０．５Ｍ ＮａＣｚ ０．０１Ｍ ジテオトレイトール（ＤＴＴ）耐液Ｂ
Ｏ，２Ｍ）リス−ＨＣ，ｔ（ｐＨ７，５）０、
Ｉ Ｍ ＭｇＧｔ２ Ｑ、１ＭＤＴＴ 溶液Ｃ（氷上に保持）４μを溶・液Ｂ ４ｐＬ ＩＱｍＭ ｄＡＴＰ ４ｐｔ １０ｍＭ ｄＴＴＰ ４ｐｔ １０ｍＭ ｄＧＴＰ ４ｐｔ １０ｍＭ ａｃ’ｒｐ ４ｐＬ １０ｍＭ ＡＴＰ ６ｐｔ Ｔ４ リガーセ＜２Ｕ／、ａｔ）１２μｔ
Ｈ２０ 溶液ＣノＴｈ［はＺｏｌ工ｅｒ ＆Ｓｍ１ｔｈから変史した ２０Ｘ ５ＳＰＥ ４．４ｙ Ｎａ０Ｅ（７，４５
’ Ｎａ２ＥＤＴＡ ２７．６５’ ＮａＨ２ＰＯ，−Ｈ２Ｏ２１ＱｙＮａＣ
４ −ＮａＯＨテｐＨ７，５〜８．０１Ｃ１４ｋ・・・Ｈ２
Ｏを加えて１ｔにする ５ＱＸ Ｄ８ｎｈａｒｄｔ’ｓ ５？ ７４：Ｉ
−／Ｌ’４００５１ ポリビニルピロリドン ５ＳＬ ＢＳＡＣ画分ＶＪ ・・・Ｈ２Ｏを加えて５００１１１Ｊにする２０Ｘ
８８０ １７５，３？ ＮａＣｔ８８２１ クエン酸
ナトリウム −ＮａＯＨでｐＨ７，ＯＫ副調 整・・Ｈ２Ｏを加えて１ｔにする 培地組成 ４８０？ グリセロール （７，０ｔ］ ４０〜 ビオチン １３４ｔｘｌ Ｈａ Ｐ Ｏ４（８５％〕５．８？ Ｇ
ａＳＯ４−２Ｈ２０ ９２？ Ｋ２ＳＯ３ ７ｓｙ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ２１？ＫＯＨ ！Ｍ１倣１［溶ｉ ０．０６ｔ （ｆｉｔｒＩ！第二
銅・５Ｈ２０（１ｔ］ ０．ＧＳ？ ヨウ化
カリウム０．３０） ｋｉ酸−ｑンｉ７”Ｈ２゜ｂ、２
ｏｙ モリブデン酸ナトリウム０．０２） ホウ酸 ２．００ ？硫酸亜鉛・Ｈ２Ｏ ４，８？ 塩化第二鉄・Ｈ２Ｏ ３，００ｔｘｌ／ Ｌ硫酸 ＬＢ培地 ５．０？酵母エキス （１ｔ） １０．０Ｓｌ’）リプトン５、Ｑｉ
ＮａＣ６ １０Ｘトランスフアー緩衝液 ９６．８５’ ）リズ
マ塩基９７４？ グリシン 水を加えて１ｔにする タンク用トランスファー緩ｇ＃液 ５００Ｉｌ／ １０Ｘ トランスファー緩衝液ｉＱＱＱ
ｍ／メタノール ３５００ｍｌ水 ウェスタン緩衝液 水１００１１中の初めにマイクロ波
処理（１ｔ） により溶かしたゼラチン２．５１
１００ｍ１１０Ｘ ＰＢＳ ｌｉｄ／ ５０％ツイーン２０ ４ｍ１ ５％アジ化ナトリウム ｄＨ２０を加えて１ｔにする 実施例 １ Ａ、ＩＦＮ−ｒ挿入物の突然変異導入 ＩＦＮ−ｒｔｔコードするＤＮＡは実施例口に記載する
よ５なＰｓｔＩ消化によりｐＢＲ３２２／ＩＦＮ−γか
ら得られ、ｉ、２Ｋｂフラグメントは ０．８％分離用
アガロースゲル電気泳動により回収した。
１６ＣＦ’−ノａｒａＤ１３９デｈり（１ａｃ１ＰＯＺ
Ｙ）ｘ７４ ｇａｌｋｇａｌｕ ｈｓｒ ｈｓｍ（十
Ｊ ｒｐｓＬデルタ（ａｒａＡＢＯＩｃ１８ｕＪ７６９
７゜ 緩衝液、溶液および培地 以下の実施例で使用した緩衝液および溶液１ま下記の組
成な有する： ｄＨＯミリ−Ｑ（ミリボアノ試薬水システムで処理した
脱イオン水 ＩＭ）リス緩衝液 ＨｚＧＳ００ｍＡ中のトリス塩基１
２１．１？；−（３５％）ＨＣ１水溶液の添加によりｐ
Ｈを所望の値に 調整；耐液を室温まで冷却させた 後最終的なｐＨＦＡ整；最終容量１ ｔに希釈 ＴＥ緩衝液 ０．０１ Ｍ （ｐＨ８，０） トリス緩
衝液中ノ１． ＯｍＭ ＥＤＴＡ ＳＥＤ １Ｍソルビトール ２５ ｍＭ ＥＤＴＡ ５［１ｍＭＤＴＴ ・・・ ｐＨ８に調整 ＳＣＥ ９．１？ンルビトール １．４７Ｐクエン酸ナトリウム ０．１６８Ｐ ＥＤＴＡ −ｄＨ２０５０ｍ１中のＨＣｌでｐＨ ５，８に調整、オートクレーブ滅菌 （ａＳ １Ｍソルビトール １０ｍＭ ＣａＣｌ２ ・・・ −過滅菌 ＰＥＧ溶液 ２０％ポリエチレングリコール−１０ｍＭ
ｃａｃｚ２ １０ｍＭ） リス−）１０ｔ（ｐＨ７，４Ｊ・・・ 濾
過滅菌 溶液Ａ ０．２Ｍ）リス−ＨＧｔ＜ ｐ）ｌ ７
．５ノＱ、ｉ Ｍ ＭｇＣＡ２ ０．５Ｍ ＮａＣｚ ０．０１Ｍ ジテオトレイトール（ＤＴＴ）耐液Ｂ
Ｏ，２Ｍ）リス−ＨＣ，ｔ（ｐＨ７，５）０、
Ｉ Ｍ ＭｇＧｔ２ Ｑ、１ＭＤＴＴ 溶液Ｃ（氷上に保持）４μを溶・液Ｂ ４ｐＬ ＩＱｍＭ ｄＡＴＰ ４ｐｔ １０ｍＭ ｄＴＴＰ ４ｐｔ １０ｍＭ ｄＧＴＰ ４ｐｔ １０ｍＭ ａｃ’ｒｐ ４ｐＬ １０ｍＭ ＡＴＰ ６ｐｔ Ｔ４ リガーセ＜２Ｕ／、ａｔ）１２μｔ
Ｈ２０ 溶液ＣノＴｈ［はＺｏｌ工ｅｒ ＆Ｓｍ１ｔｈから変史した ２０Ｘ ５ＳＰＥ ４．４ｙ Ｎａ０Ｅ（７，４５
’ Ｎａ２ＥＤＴＡ ２７．６５’ ＮａＨ２ＰＯ，−Ｈ２Ｏ２１ＱｙＮａＣ
４ −ＮａＯＨテｐＨ７，５〜８．０１Ｃ１４ｋ・・・Ｈ２
Ｏを加えて１ｔにする ５ＱＸ Ｄ８ｎｈａｒｄｔ’ｓ ５？ ７４：Ｉ
−／Ｌ’４００５１ ポリビニルピロリドン ５ＳＬ ＢＳＡＣ画分ＶＪ ・・・Ｈ２Ｏを加えて５００１１１Ｊにする２０Ｘ
８８０ １７５，３？ ＮａＣｔ８８２１ クエン酸
ナトリウム −ＮａＯＨでｐＨ７，ＯＫ副調 整・・Ｈ２Ｏを加えて１ｔにする 培地組成 ４８０？ グリセロール （７，０ｔ］ ４０〜 ビオチン １３４ｔｘｌ Ｈａ Ｐ Ｏ４（８５％〕５．８？ Ｇ
ａＳＯ４−２Ｈ２０ ９２？ Ｋ２ＳＯ３ ７ｓｙ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ２１？ＫＯＨ ！Ｍ１倣１［溶ｉ ０．０６ｔ （ｆｉｔｒＩ！第二
銅・５Ｈ２０（１ｔ］ ０．ＧＳ？ ヨウ化
カリウム０．３０） ｋｉ酸−ｑンｉ７”Ｈ２゜ｂ、２
ｏｙ モリブデン酸ナトリウム０．０２） ホウ酸 ２．００ ？硫酸亜鉛・Ｈ２Ｏ ４，８？ 塩化第二鉄・Ｈ２Ｏ ３，００ｔｘｌ／ Ｌ硫酸 ＬＢ培地 ５．０？酵母エキス （１ｔ） １０．０Ｓｌ’）リプトン５、Ｑｉ
ＮａＣ６ １０Ｘトランスフアー緩衝液 ９６．８５’ ）リズ
マ塩基９７４？ グリシン 水を加えて１ｔにする タンク用トランスファー緩ｇ＃液 ５００Ｉｌ／ １０Ｘ トランスファー緩衝液ｉＱＱＱ
ｍ／メタノール ３５００ｍｌ水 ウェスタン緩衝液 水１００１１中の初めにマイクロ波
処理（１ｔ） により溶かしたゼラチン２．５１
１００ｍ１１０Ｘ ＰＢＳ ｌｉｄ／ ５０％ツイーン２０ ４ｍ１ ５％アジ化ナトリウム ｄＨ２０を加えて１ｔにする 実施例 １ Ａ、ＩＦＮ−ｒ挿入物の突然変異導入 ＩＦＮ−ｒｔｔコードするＤＮＡは実施例口に記載する
よ５なＰｓｔＩ消化によりｐＢＲ３２２／ＩＦＮ−γか
ら得られ、ｉ、２Ｋｂフラグメントは ０．８％分離用
アガロースゲル電気泳動により回収した。
このＤＮＡは次の変異：すなわち１ＪＩＦＮ−ｒｃＤＮ
ＡのＴＡＡ終止コドンに隣接してＥｃｏＲＩ制限部位を
導入する。２）ＩＦＮ−ｒシグナル配列のＡＴＧのすぐ
前にＥｃｏＲＩ制限部位を導入する（分泌ベクターのた
め）、および６ノ シグナル配列を欠失させる（細胞質
発現ベクターのため）、を導入するために以下の方法に
より突然変異処理を行った。
ＡのＴＡＡ終止コドンに隣接してＥｃｏＲＩ制限部位を
導入する。２）ＩＦＮ−ｒシグナル配列のＡＴＧのすぐ
前にＥｃｏＲＩ制限部位を導入する（分泌ベクターのた
め）、および６ノ シグナル配列を欠失させる（細胞質
発現ベクターのため）、を導入するために以下の方法に
より突然変異処理を行った。
突然変異処理に用いたオリゴヌクレオチドは次のもので
あり： １）ＥｃｏＲＩを導入する６′突然変異処理ＡＧＡＧＣ
−ＡＴＣＣＣ−ＡＡＴＡＡ−ＧＡＡＴＴ−ＣＴＣＣＴ−
ＣＣＣＴＧ−ＣＡＡＴＡＴ ２ノ シグナルの前にＥｃｏＲＩを導入する５′ 突然
変異処理（分泌） ＴＴＣＴＧ−ＴＣＧＧＡ−ＡＴＴＯＡ−ＴＧＡＡＡ−Ｔ
ＡＴＡＣ６ノシグナルを欠失させてＥｃｏＲＩ ＆導入
する５′突然変異処理（細胞質） ＴＴＧＧＧ−ＴＴＣＴＣ−ＴＴＧＧＣ−ＧＡＡＴＴ−Ｃ
ＡＴＣ，Ｃ−ＡＧＧＡＣ−ＣＣＡＴＡ−ＴＧＴＡ これらのオリゴヌクレオチド−ＩＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
Ｂｌｏ−５ｙｓｔｅ Ｄ Ｎ Ａ合成機６８０Ａ型を用
いてシアノエチルホスホルアミダイト法により合成した
。
あり： １）ＥｃｏＲＩを導入する６′突然変異処理ＡＧＡＧＣ
−ＡＴＣＣＣ−ＡＡＴＡＡ−ＧＡＡＴＴ−ＣＴＣＣＴ−
ＣＣＣＴＧ−ＣＡＡＴＡＴ ２ノ シグナルの前にＥｃｏＲＩを導入する５′ 突然
変異処理（分泌） ＴＴＣＴＧ−ＴＣＧＧＡ−ＡＴＴＯＡ−ＴＧＡＡＡ−Ｔ
ＡＴＡＣ６ノシグナルを欠失させてＥｃｏＲＩ ＆導入
する５′突然変異処理（細胞質） ＴＴＧＧＧ−ＴＴＣＴＣ−ＴＴＧＧＣ−ＧＡＡＴＴ−Ｃ
ＡＴＣ，Ｃ−ＡＧＧＡＣ−ＣＣＡＴＡ−ＴＧＴＡ これらのオリゴヌクレオチド−ＩＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
Ｂｌｏ−５ｙｓｔｅ Ｄ Ｎ Ａ合成機６８０Ａ型を用
いてシアノエチルホスホルアミダイト法により合成した
。
二本鎖Ｍ１３ｍｐ１８は実施例１に記載したようにＰｓ
ｔＩ で消化して脱リン酸化し、先に単離した１、
２ｋｂの）’８ｔＩフラグメントと連結させた。
ｔＩ で消化して脱リン酸化し、先に単離した１、
２ｋｂの）’８ｔＩフラグメントと連結させた。
この連結混合物はコンビテン）ＪＭ１０３細胞に形質転
換した（コンピテントＪＭ１０３はＭＣ１０６１につい
て実施例１１に記載した通りに作製した）。
換した（コンピテントＪＭ１０３はＭＣ１０６１につい
て実施例１１に記載した通りに作製した）。
その後、この混合物はＩＰＴＧおよびｘ−ｇａｔを含む
ＬＢ培堆にまき、透明なプラークなスクリーニングした
。
ＬＢ培堆にまき、透明なプラークなスクリーニングした
。
Ａ、大規模ミニプレプ（ｍ１ｎｉ、ｐｒ８ｐ ）はＬ培
地２１Ｒ／中で約７時間インキュベートした陽性プラー
クに対して実施した。新たに増殖させたＪｈＡ１０３細
胞２５０μｔなＬＢ培地２５ｓ＋／に接種した。この培
養物を１時間増殖させ、そして７時間経過した古いプラ
ーク培養物１００．ｕｔを接種した。その後この培養物
を一晩増殖させた。次いで、この培養物ｋｔ ５ｏｒｖ
ａｌｌ ＲＣ−５８ローター５ｓ３４を用いて１０，０
００ ｒｐｍで１０分間ずつ２回遠心して上清を漬明化
した。２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣ６３，５１Ｒ／
を培養物に加え、それを４℃で５時間インキエペートシ
た。その区、培養物を再度上記のように１０分間遠心し
た。上清な捨て、ペレッＩｆＴＥｌｉｉ液２ＩＩＩ／に
再懸濁した。このペレットを７エノールで抽出し、ＴＥ
で平衡化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＣＨ
ＣＬ３で２回およびエーテルで１回抽出した。８Ｍ Ｌ
ｉＣｔを加えて最終−度を０．８Ｍとした。６倍容量の
エタノールな加え、この溶液を２０℃で一晩放置してＤ
ＮＡを沈殿させた。次に、溶液を上記のように１０．０
０ Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、７０％エタノールで洗
った。沈殿物Ｓ’！１０ｍＭ）リスＣｐＨ７，４）１５
０ｐｌに再懸濁した。
地２１Ｒ／中で約７時間インキュベートした陽性プラー
クに対して実施した。新たに増殖させたＪｈＡ１０３細
胞２５０μｔなＬＢ培地２５ｓ＋／に接種した。この培
養物を１時間増殖させ、そして７時間経過した古いプラ
ーク培養物１００．ｕｔを接種した。その後この培養物
を一晩増殖させた。次いで、この培養物ｋｔ ５ｏｒｖ
ａｌｌ ＲＣ−５８ローター５ｓ３４を用いて１０，０
００ ｒｐｍで１０分間ずつ２回遠心して上清を漬明化
した。２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣ６３，５１Ｒ／
を培養物に加え、それを４℃で５時間インキエペートシ
た。その区、培養物を再度上記のように１０分間遠心し
た。上清な捨て、ペレッＩｆＴＥｌｉｉ液２ＩＩＩ／に
再懸濁した。このペレットを７エノールで抽出し、ＴＥ
で平衡化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＣＨ
ＣＬ３で２回およびエーテルで１回抽出した。８Ｍ Ｌ
ｉＣｔを加えて最終−度を０．８Ｍとした。６倍容量の
エタノールな加え、この溶液を２０℃で一晩放置してＤ
ＮＡを沈殿させた。次に、溶液を上記のように１０．０
０ Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、７０％エタノールで洗
った。沈殿物Ｓ’！１０ｍＭ）リスＣｐＨ７，４）１５
０ｐｌに再懸濁した。
Ｂ、Ｍ１３組換え鋳型１ ｐｍｏｌｅはオリゴヌクレオ
チド１（ＥＣＯＲＩを導入する６′突然変異処理で用い
るもの）２０ｐｍｏｌｅおよび溶液Ａ１μｔと混合し、
ｄＨ２０を加えて最終容量を１０μＬとした。この試料
は６５℃で５分インキュベートし。
チド１（ＥＣＯＲＩを導入する６′突然変異処理で用い
るもの）２０ｐｍｏｌｅおよび溶液Ａ１μｔと混合し、
ｄＨ２０を加えて最終容量を１０μＬとした。この試料
は６５℃で５分インキュベートし。
次いで温度な３０分間６７℃に下げた。
Ｃ０その後試料に下記成分を加え：
溶液Ｂ １μｔ
１ ［］ｍＭ ｄＡＴＰ １ ｐｔｌ ０ｍＭ ｄ
ｌｃＴＰ ｌ 、ｕｌｌＱｍＭ ｄＧＴＰ １
ｐｔ ｌ ＱｍＭ ｄＴＴＰ １ ｐＬ５ｕ／μｔｋｌ
ｅｎｏｗ ２．ｕｔ ｄ）１２０ ５．ｕｔ ２０μｔ １５℃で少なくとも４〜６時間インキュベートした。
ｌｃＴＰ ｌ 、ｕｌｌＱｍＭ ｄＧＴＰ １
ｐｔ ｌ ＱｍＭ ｄＴＴＰ １ ｐＬ５ｕ／μｔｋｌ
ｅｎｏｗ ２．ｕｔ ｄ）１２０ ５．ｕｔ ２０μｔ １５℃で少なくとも４〜６時間インキュベートした。
Ｄ、試料をその後ｄＨ２０で１：４０に希釈した。
５μｔ’ｒ：用い１６本のチューブのコンビテン）ＪＭ
１０６細胞（各々２００μｍ）を形質転換した。形質転
換したＪＭ１０３細胞は栄養培地上の軟′ｉＩ寒天上層
中にまいた。
１０６細胞（各々２００μｍ）を形質転換した。形質転
換したＪＭ１０３細胞は栄養培地上の軟′ｉＩ寒天上層
中にまいた。
Ｅ、その汲、陽性プラークをフィルターノ・イブリダイ
ゼーシ田ンによりスクリーニングした。
ゼーシ田ンによりスクリーニングした。
全１２５μを中の相補オリゴヌクレオチド１５ｐｍｏｌ
ｅのハイブリダイゼーションプローブは６５℃で１０分
間加熱した。この試料に１０Ｘキナーゼ緩衝液（Ｍａｎ
ｉａｔｉＳ Ｊ ３１’ｌ、ｒ−ＡＴＰ１μｔおよびポ
リヌクレオチドキナーゼ（１００ｔＪ ／μ／、Ｊ１μ
ｔを加えた。試料を６７℃で１時間インキュベー）Ｌ、
Ｇ−５Ｑフアインセフアデツクスな通過させた。カラム
から出た最初のピークを集めた。
ｅのハイブリダイゼーションプローブは６５℃で１０分
間加熱した。この試料に１０Ｘキナーゼ緩衝液（Ｍａｎ
ｉａｔｉＳ Ｊ ３１’ｌ、ｒ−ＡＴＰ１μｔおよびポ
リヌクレオチドキナーゼ（１００ｔＪ ／μ／、Ｊ１μ
ｔを加えた。試料を６７℃で１時間インキュベー）Ｌ、
Ｇ−５Ｑフアインセフアデツクスな通過させた。カラム
から出た最初のピークを集めた。
ニトロセルロースフィルターは上記プローブとのハイブ
リダイゼーションのために、フィルターを形質転換プレ
ート上に５〜１０分間静置し、その位置を定めることに
より作製した。その後、プレートからフィルターをはが
し、その裏面が変性溶液（１，５Ｍ ＮａＣ４，Ｑ、５
Ｎ Ｎａ０Ｈ） ノ表面と接触するようにその溶液上［
３分間浮がはせた。次に、フィルターは変性溶液中［５
分間沈めた。続いテ、ソのニトロセルロースフィルター
を中和溶液（１Ｍトリｙ、−ＨＩＣ２，ｐＨ８； １．
５Ｍ ＮａＣｔ〕で５分間処理した。中和したフィル
ターは２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ）１５０ｍＭ ＮａＣｚ
、１５ｍＭ クエンａ！ＮａであるＪで５分間処理した
。その後フィルターな自然乾燥させ、真空下に８０°Ｃ
で１時間焼きつけた。このフィルターは５ ｍｌ ／フ
ィルターのハイブリダイゼーション酸ｍＷ （１０ＸＤ
ｅｎｈａｒｄｔｓ（ＩＸＤｅｎｈａｒｄｔｓは０．０２
％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．
０２％ウシ血清アルブミンである） 、 ０．５％Ｓ
Ｄ Ｓオヨび５ＸＳＳＰＥ’）を含む密封したプラステ
ヴクバッグの中で６５℃で１時間ブレハイブリダイズさ
せた。このハイブリダイゼーション緩衝液ｋ ５ ｍａ
ｌ ／フィルターのや［しいハイブリダイゼーション緩
衝液と敗り換えた。
リダイゼーションのために、フィルターを形質転換プレ
ート上に５〜１０分間静置し、その位置を定めることに
より作製した。その後、プレートからフィルターをはが
し、その裏面が変性溶液（１，５Ｍ ＮａＣ４，Ｑ、５
Ｎ Ｎａ０Ｈ） ノ表面と接触するようにその溶液上［
３分間浮がはせた。次に、フィルターは変性溶液中［５
分間沈めた。続いテ、ソのニトロセルロースフィルター
を中和溶液（１Ｍトリｙ、−ＨＩＣ２，ｐＨ８； １．
５Ｍ ＮａＣｔ〕で５分間処理した。中和したフィル
ターは２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ）１５０ｍＭ ＮａＣｚ
、１５ｍＭ クエンａ！ＮａであるＪで５分間処理した
。その後フィルターな自然乾燥させ、真空下に８０°Ｃ
で１時間焼きつけた。このフィルターは５ ｍｌ ／フ
ィルターのハイブリダイゼーション酸ｍＷ （１０ＸＤ
ｅｎｈａｒｄｔｓ（ＩＸＤｅｎｈａｒｄｔｓは０．０２
％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．
０２％ウシ血清アルブミンである） 、 ０．５％Ｓ
Ｄ Ｓオヨび５ＸＳＳＰＥ’）を含む密封したプラステ
ヴクバッグの中で６５℃で１時間ブレハイブリダイズさ
せた。このハイブリダイゼーション緩衝液ｋ ５ ｍａ
ｌ ／フィルターのや［しいハイブリダイゼーション緩
衝液と敗り換えた。
先に作製した放射性標識相補オリゴヌクレオチドは初め
に６５℃で５分間インキュベートし５次にフィルターを
含む新しいハイブリダイゼーション緩衝液に十分量のグ
ローブを加えてＩ Ｘ １０ Ｃｐｍ／ａｔとした。ハ
イブリダイゼーションはグローブの計算上の融解温度よ
り５°Ｃ低い温度で４時間行った。
に６５℃で５分間インキュベートし５次にフィルターを
含む新しいハイブリダイゼーション緩衝液に十分量のグ
ローブを加えてＩ Ｘ １０ Ｃｐｍ／ａｔとした。ハ
イブリダイゼーションはグローブの計算上の融解温度よ
り５°Ｃ低い温度で４時間行った。
フィルターはその１６ｘｓｓｃを用いて室温で１０分間
ずつ６回洗った。最後に、ハイブリダイゼーション温度
におい′″Ｃ６Ｘ５ＳＣで１回洗った。
ずつ６回洗った。最後に、ハイブリダイゼーション温度
におい′″Ｃ６Ｘ５ＳＣで１回洗った。
フィルターは３ＭＭ Ｗａｔｍａｎ Ｆ紙の上ＫＩｉｌ
イテ乾燥させ、フィルム（位置について印を付ける〕に
−晩感元させた。
イテ乾燥させ、フィルム（位置について印を付ける〕に
−晩感元させた。
６つの陽性プラークはそれぞれ採取して、別々にＬＢ培
地２ｍｌ中３７℃で５時間増殖させた。
地２ｍｌ中３７℃で５時間増殖させた。
Ｆ、ミニ鋳型プレプはこれらの陽性プラークのそれぞれ
に対して実施した。
に対して実施した。
プラーク培養物１ｆｆｉ７！は工ヴペンドルフチューフ
に移り、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ’ ５４１４型遠心機を使
用して５分間遠心した。上清８００μｔを回収し、そこ
ｍ２ｏ％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣ１２００ｐｔ ｋｌ
ＪＤ工ｆ：。
に移り、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ’ ５４１４型遠心機を使
用して５分間遠心した。上清８００μｔを回収し、そこ
ｍ２ｏ％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣ１２００ｐｔ ｋｌ
ＪＤ工ｆ：。
その上清を室温で１０分間インキ、ベートした。
前に使用したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で上清な１０分
遠心した。吸引により上清を除き、遠心により形成すｉ
ｔ タヘ１／ ２トＹＴＥ（１０ｍＭ）リス、ｐＥ（ｚ
４；１ｍＭＥＤＴＡ）２００ｐｔ ＶＣ再溶解した。
遠心した。吸引により上清を除き、遠心により形成すｉ
ｔ タヘ１／ ２トＹＴＥ（１０ｍＭ）リス、ｐＥ（ｚ
４；１ｍＭＥＤＴＡ）２００ｐｔ ＶＣ再溶解した。
その後。
再溶解ベレツトをフェノール／クロロホルムで抽出し、
上部水相中の鋳型ＤＮＡは０．８ Ｍ １１１度になる
までＬｉＣ４溶液を加え工沈殿させた。２．５〜６倍容
量のエタノールを加え、ドライアイス上で５分間沈殿さ
せた。この沈殿物を先に述べたＥｐｐｅｎ−ｄｏｒｆ遠
心機を用いて１０分遠心した。最終容量はＴＥ１５０μ
ｔとした。
上部水相中の鋳型ＤＮＡは０．８ Ｍ １１１度になる
までＬｉＣ４溶液を加え工沈殿させた。２．５〜６倍容
量のエタノールを加え、ドライアイス上で５分間沈殿さ
せた。この沈殿物を先に述べたＥｐｐｅｎ−ｄｏｒｆ遠
心機を用いて１０分遠心した。最終容量はＴＥ１５０μ
ｔとした。
Ｇ、コンピテントＪＭ１０３細１ｔ１２００μｍ＋工回
収したＤＮＡで形質転換した。１μｔおよび単離したフ
ァージＤＮＡの１／１０希釈物１．ａｔを形質転換にお
いて使用した。
収したＤＮＡで形質転換した。１μｔおよび単離したフ
ァージＤＮＡの１／１０希釈物１．ａｔを形質転換にお
いて使用した。
Ｈ０形質転換混合物を培地にまき、工程Ｅで先に記載し
たオリゴヌクレオチドな用いてプラークをスクリーニン
グした。
たオリゴヌクレオチドな用いてプラークをスクリーニン
グした。
■、大規模ミニプレプはＬ培地２ｍｌ中で約７時間イン
キュベートした陽性プラークに対して実施した。ＬＢ培
地２５！ｎｌに新たに増殖させたＪＭ１０３細胞２５０
μｔを条種したうこの培養物を１時間増殖させ、７時間
経過したプラーク培養物１００Ｐｔを接種した。その後
培養物を一晩増殖させた。次＆？［賽物に２Ｓｏｒｖａ
ｌｌ ＲＣ−５Ｂ ｏ−ター５ｓ３４を使用して１０，
０００ｒｌ）ｍで１０分間ずつ２回遠心して上清を温間
にした。２０％ＰＥＧ／２．５ＭＮａＣ６３，５ｍｌを
培養物に加え、４℃で５時間インキュベートした。この
培養物を再度上記のように１０分間遠心した。上清を捨
て、ベレヴトｆｊ！：ＴＥ緩衝液２ゴに再懸濁した。ベ
レットはフェノールで抽□出し、ＴＥで平衡化し、フェ
ノール／クロロホルムで抽出し、ＣＨＣＬ３で２回およ
びエーテルで１回抽出した。３ＭＬｉＣ６を加えて最終
濃度を０．８Ｍとした。３倍容敏のエタノールを加え、
この溶液を一晩静置して存在するＤＮＡを沈殿させた。
キュベートした陽性プラークに対して実施した。ＬＢ培
地２５！ｎｌに新たに増殖させたＪＭ１０３細胞２５０
μｔを条種したうこの培養物を１時間増殖させ、７時間
経過したプラーク培養物１００Ｐｔを接種した。その後
培養物を一晩増殖させた。次＆？［賽物に２Ｓｏｒｖａ
ｌｌ ＲＣ−５Ｂ ｏ−ター５ｓ３４を使用して１０，
０００ｒｌ）ｍで１０分間ずつ２回遠心して上清を温間
にした。２０％ＰＥＧ／２．５ＭＮａＣ６３，５ｍｌを
培養物に加え、４℃で５時間インキュベートした。この
培養物を再度上記のように１０分間遠心した。上清を捨
て、ベレヴトｆｊ！：ＴＥ緩衝液２ゴに再懸濁した。ベ
レットはフェノールで抽□出し、ＴＥで平衡化し、フェ
ノール／クロロホルムで抽出し、ＣＨＣＬ３で２回およ
びエーテルで１回抽出した。３ＭＬｉＣ６を加えて最終
濃度を０．８Ｍとした。３倍容敏のエタノールを加え、
この溶液を一晩静置して存在するＤＮＡを沈殿させた。
次いで、この溶液を上記のように１０．００Ｏｒｐｍで
１０分遠心し、７０％エタノールで洗った。
１０分遠心し、７０％エタノールで洗った。
沈殿物は１３ｍＭ）リス（Ｔ）Ｈ７，４Ｊ １５０μを
中に再懸濁した。
中に再懸濁した。
Ｊ、陽性プラークは正しい変異をもつＭ１３＊築物な見
つけるためにジデオキシ法で塩基配列を決定した。１つ
の正確なＭ１３構築物をｐＥＦＮと名づけだ。
つけるためにジデオキシ法で塩基配列を決定した。１つ
の正確なＭ１３構築物をｐＥＦＮと名づけだ。
Ｋ、鋳型としてｐＩＦＮを、５′突然変異処理用プライ
マーとして第二オリゴヌクレオチドを用いて工程Ｂ−Ｊ
を繰り返した。正確な変異体をｐＩＦＮ２１１ と命名
した。
マーとして第二オリゴヌクレオチドを用いて工程Ｂ−Ｊ
を繰り返した。正確な変異体をｐＩＦＮ２１１ と命名
した。
Ｌ、鋳型とし℃ｐｌＦＮ＆、５’突然変異処理用ブライ
マーとして第三オリゴヌクレオチドを用いて工程Ｂ−Ｊ
を繰り返した。正確な変異体を１ ＩＦＮＣ−２ト命名
シｆ：。
マーとして第三オリゴヌクレオチドを用いて工程Ｂ−Ｊ
を繰り返した。正確な変異体を１ ＩＦＮＣ−２ト命名
シｆ：。
Ｍ、 ＭａｎｉａｔｉＳ のアルカリ溶菌法な用い℃
ｐｌ’ＮＣ−２およびｐＩＦＮ２１１のＲＦ ＤＮＡ
な回収した。
ｐｌ’ＮＣ−２およびｐＩＦＮ２１１のＲＦ ＤＮＡ
な回収した。
実施例 Ｕ
ｐＡＯ８０１！イリノイ州ビオ−リア、米国農務省ノＮ
ｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉＯｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒから寄託番号Ｂ−１８１１４として大腸
菌宿主より入手できる。ｐＡＯ８０４はプラスミドＤＮ
Ａを分離し、ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル電気泳動にかけ
て約７．５ Ｋ ｂフラグメント（その唯一のＥｃｏＲ
Ｉｆｇ位で切断された線状ｐＡ○８０４である）を単離
することにより回収された。
ｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉＯｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒから寄託番号Ｂ−１８１１４として大腸
菌宿主より入手できる。ｐＡＯ８０４はプラスミドＤＮ
Ａを分離し、ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル電気泳動にかけ
て約７．５ Ｋ ｂフラグメント（その唯一のＥｃｏＲ
Ｉｆｇ位で切断された線状ｐＡ○８０４である）を単離
することにより回収された。
ｐＡＯ８０４はＰ、バストリスＡＯＸｉ遺伝子座の部位
特異的破壊が可能なベクターである。それ１ま次の要素
：唯一のＥｃｏＲＩクローニング部位により隔てられた
ＡＯＸｌプロモータおよび転写ターミネータ−；野生型
ビチアＨＩＳ４遺伝子；転写ターミネータ−の下流のＡ
ＯＸｉ遺伝子座の６′末端からのゲノムＤＮＡセグメン
ト；細菌宿主内での選択および複製に必要な配列を含ん
でいる。これらの構成成分は、このプラスミドのＢｉｔ
ロ 制限消化物が発現カセットおよび選択マーカーを
含むＤＮＡフラグメント（その両末端はゲノムの連続部
分、すなわちＡＯＸＩ遺伝子座、に相同である）を放出
し且つ形質転換の間に染色内に簀定した状態で挿入され
得るように配列されている。
特異的破壊が可能なベクターである。それ１ま次の要素
：唯一のＥｃｏＲＩクローニング部位により隔てられた
ＡＯＸｌプロモータおよび転写ターミネータ−；野生型
ビチアＨＩＳ４遺伝子；転写ターミネータ−の下流のＡ
ＯＸｉ遺伝子座の６′末端からのゲノムＤＮＡセグメン
ト；細菌宿主内での選択および複製に必要な配列を含ん
でいる。これらの構成成分は、このプラスミドのＢｉｔ
ロ 制限消化物が発現カセットおよび選択マーカーを
含むＤＮＡフラグメント（その両末端はゲノムの連続部
分、すなわちＡＯＸＩ遺伝子座、に相同である）を放出
し且つ形質転換の間に染色内に簀定した状態で挿入され
得るように配列されている。
ＺＦＮ−γの細胞質生産をコードする遺伝子を含むベク
ター＄！ｐＡＯ８０４およびｒＩＦＮＯ−２から作製さ
れた。 ｐＡＯ８０４はＥＣ０ＲＩで消化し、両末端を
アルカリ性ホスファターゼで処理して（５０ｍＭ）す：
ｘ、 −Ｈｃｚｃ ｐＨ９，０）、１ ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、ｌ Ｑ Ｑ ｍＭ ＺｎＣｌ２．１ｍＭスベール
ミジン中１Ｕの酵素を用いて６７℃で１時間ノ脱リン酸
化した。
ター＄！ｐＡＯ８０４およびｒＩＦＮＯ−２から作製さ
れた。 ｐＡＯ８０４はＥＣ０ＲＩで消化し、両末端を
アルカリ性ホスファターゼで処理して（５０ｍＭ）す：
ｘ、 −Ｈｃｚｃ ｐＨ９，０）、１ ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、ｌ Ｑ Ｑ ｍＭ ＺｎＣｌ２．１ｍＭスベール
ミジン中１Ｕの酵素を用いて６７℃で１時間ノ脱リン酸
化した。
ｒＩＦＮｃ−２もＥｃｏＲＩで消化し、’ＥＦＮ−ｒｔ
ｔコードする４４５ｂｐ フラグメントな放出させた。
ｔコードする４４５ｂｐ フラグメントな放出させた。
このフラグメントは０．８％分離用アガロースゲル電気
泳動により精製した。この７ラグメント５０ｎ？は１０
μｔの反応容量で１ワイス単位のＴ４リガーゼを用イテ
、 ３６ ｍＭ ）リス−ＨＣ６（ｐＨ７，４Ｊ、５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２．５ｍＭジーｙ−オドレイトール、Ｉ
ｍＭＡＴＰ中２６℃で１時間インキュベートすることに
よりｐＡＧＳ０４ ５ｎ？に連結させた。連結反応混合
物を用いてコンビテン）ＭＣ１０６１細胞をアンピシリ
ン耐性へ形質転換した。
泳動により精製した。この７ラグメント５０ｎ？は１０
μｔの反応容量で１ワイス単位のＴ４リガーゼを用イテ
、 ３６ ｍＭ ）リス−ＨＣ６（ｐＨ７，４Ｊ、５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２．５ｍＭジーｙ−オドレイトール、Ｉ
ｍＭＡＴＰ中２６℃で１時間インキュベートすることに
よりｐＡＧＳ０４ ５ｎ？に連結させた。連結反応混合
物を用いてコンビテン）ＭＣ１０６１細胞をアンピシリ
ン耐性へ形質転換した。
ＭＣ１０６１は次のようにして形質転換の際に外来ＤＮ
Ａを取込みうる状態（すなわちコンピテントフにした。
Ａを取込みうる状態（すなわちコンピテントフにした。
大腸菌ＭＣ１０６１の中間対数期培養物５０ｍＡＪ！Ｉ
ＥＣＤＰＲ６００臨床用遠心機を用いて３０００ ｒｐ
ｍで５分遠心することにより集菌し、１０ｍＭ Ｎａ
Ｃ６で洗った。 この培養物を５０ｍ Ｍ Ｃａ Ｃ４
ｚ ２５ ｍｌ中に０℃で３０分間懸濁した。
ＥＣＤＰＲ６００臨床用遠心機を用いて３０００ ｒｐ
ｍで５分遠心することにより集菌し、１０ｍＭ Ｎａ
Ｃ６で洗った。 この培養物を５０ｍ Ｍ Ｃａ Ｃ４
ｚ ２５ ｍｌ中に０℃で３０分間懸濁した。
この細胞な前のように遠心し、 ５３ ｍＭ ＣａＣ
ｚ２２１１ｔ中に再懸濁した。形質転換のために、この
コンピテント細胞懸濁体２００μｔに連結混合物を加え
、氷上０°Ｃで１５分インキュベートし、６７℃で５分
間熱ショック処理を行い、その後２３℃で５分間インキ
ュベートした。細胞は５ｏμｔ ／ａｔアンピシリンを
含むＬＢ寒天培地に直接まい℃、３７℃で１０〜１６時
間インキエペートした。得られたコロニーはＡｍｐＲで
あった。 耐性コロニーを回収し、制限消化により同定
したつ細胞は５゜μｔ ／ａＩｅアンピシリンな含むＬ
培地５ＩＩＩｌ中６７℃で５時間増殖さ−Ｌ Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ ［：ＮｕｃｌｅｉＣＡｃ
１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７ ： １５１
３（１９７９Ｊ）に記載の方法によりＤＮＡｙａ−調製
した。５ｓｐＩ消化の際に１８００ｂｐフラグメントと
１３１５ｂｐフラグメン）ｆもたらすミニプレプを選択
し２ｐＩＦＮ６と命名した。
ｚ２２１１ｔ中に再懸濁した。形質転換のために、この
コンピテント細胞懸濁体２００μｔに連結混合物を加え
、氷上０°Ｃで１５分インキュベートし、６７℃で５分
間熱ショック処理を行い、その後２３℃で５分間インキ
ュベートした。細胞は５ｏμｔ ／ａｔアンピシリンを
含むＬＢ寒天培地に直接まい℃、３７℃で１０〜１６時
間インキエペートした。得られたコロニーはＡｍｐＲで
あった。 耐性コロニーを回収し、制限消化により同定
したつ細胞は５゜μｔ ／ａＩｅアンピシリンな含むＬ
培地５ＩＩＩｌ中６７℃で５時間増殖さ−Ｌ Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ ［：ＮｕｃｌｅｉＣＡｃ
１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７ ： １５１
３（１９７９Ｊ）に記載の方法によりＤＮＡｙａ−調製
した。５ｓｐＩ消化の際に１８００ｂｐフラグメントと
１３１５ｂｐフラグメン）ｆもたらすミニプレプを選択
し２ｐＩＦＮ６と命名した。
ＩＦＮ−ｒ分泌ベクターを作製するために、ｐＩＦＮ２
１１から５ＧＳｂｐフラグメントを分離し、上記のよう
にしてｐＡＯ８０４に挿入した。ＡｍｐＲコロニーから
プラスミドＤＮＡを単離して、５ｓｐＩで消化した。１
８００ｂｌ）フラグメントと１３７５ｂｐフラグメント
をもたらすクローンがｐＩＦＮ−２１１４と命名された
。
１１から５ＧＳｂｐフラグメントを分離し、上記のよう
にしてｐＡＯ８０４に挿入した。ＡｍｐＲコロニーから
プラスミドＤＮＡを単離して、５ｓｐＩで消化した。１
８００ｂｌ）フラグメントと１３７５ｂｐフラグメント
をもたらすクローンがｐＩＦＮ−２１１４と命名された
。
実施例 −
実施９１Ｊ Ｉｆに記載したベクターを含むビテア・パ
ストリス菌株は以下の方法により作製した。メタノール
利用欠損（Ｍｕｔ−）菌株および野生型メタノール利用
（Ｍｕｔ＋Ｊ＄株が発生した。
ストリス菌株は以下の方法により作製した。メタノール
利用欠損（Ｍｕｔ−）菌株および野生型メタノール利用
（Ｍｕｔ＋Ｊ＄株が発生した。
ピチア・パストリスＧ５１１５株（ｈｉｓ４；ＮＲＨＬ
Ｙ−１５８５１月’！、Ｃｒｅｇｇｅｌｔ ａｌ、 、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ ５ ： ４７９−
４８５ （１９８７Ｊ ［記載すｎるスフェロプラスト
形質転換法な用いてｐＩＦＮ６のＢｇｔｌ消化物５μ？
で形質転換した。形質転換細胞は最少培地上で生育させ
て、次の方法により適当なメタノール利用欠損表現型に
ついてスクリーニングした。形質転換細胞は滅菌蒸留水
の存在下に培地表面馨こすり取ることにより集菌し、低
出力の超音波で１５秒間処理した。続いて、それらｋＡ
６００＝０．１に希釈し、炭素源としてグリセロールを
含む最少培地上に２通りずつ１０−３および１０−４の
希釈度でまき、６０℃で２〜６日間インキエヘートした
。その後、それらは気相中にメタノール１００μｔを加
えた最少培地上でレプリカ培養した。６０℃で２４時間
インキュベートした後、４％の形質転換細胞が残りの形
質転換細胞よりも明らかに遅くメタノール上で増殖して
いた。
Ｙ−１５８５１月’！、Ｃｒｅｇｇｅｌｔ ａｌ、 、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ ５ ： ４７９−
４８５ （１９８７Ｊ ［記載すｎるスフェロプラスト
形質転換法な用いてｐＩＦＮ６のＢｇｔｌ消化物５μ？
で形質転換した。形質転換細胞は最少培地上で生育させ
て、次の方法により適当なメタノール利用欠損表現型に
ついてスクリーニングした。形質転換細胞は滅菌蒸留水
の存在下に培地表面馨こすり取ることにより集菌し、低
出力の超音波で１５秒間処理した。続いて、それらｋＡ
６００＝０．１に希釈し、炭素源としてグリセロールを
含む最少培地上に２通りずつ１０−３および１０−４の
希釈度でまき、６０℃で２〜６日間インキエヘートした
。その後、それらは気相中にメタノール１００μｔを加
えた最少培地上でレプリカ培養した。６０℃で２４時間
インキュベートした後、４％の形質転換細胞が残りの形
質転換細胞よりも明らかに遅くメタノール上で増殖して
いた。
これらの菌株）”；！Ｇ−ＧＩＦ００ＯＣと命名された
。
。
分泌グラスミドｐＩＦＮ−２１１４は同様な方法でピチ
ア・パストリスＧ３１１５株に形質転換された。
ア・パストリスＧ３１１５株に形質転換された。
これらの菌株はＧ−ＧＩＦ２１１ｓと命名された。
より速（増殖するＭｕｔ十細胞餉ＩＦＮ−γビチア菌株
は、Ｇ５１１５を環状ｐＩＦＮ（５５μｍで形質転換す
ることにより開発され、それら％ｔＧ＋ＧＩＦｏｏｏｃ
と呼はレタ。Ｍｕｔ士分泌―株Ｓ！Ｇ５１１５を環
状ｐＩＦＮ−２１１４５μ？で形質転換することにより
開発され２それらはＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓと呼ばれた。
は、Ｇ５１１５を環状ｐＩＦＮ（５５μｍで形質転換す
ることにより開発され、それら％ｔＧ＋ＧＩＦｏｏｏｃ
と呼はレタ。Ｍｕｔ士分泌―株Ｓ！Ｇ５１１５を環
状ｐＩＦＮ−２１１４５μ？で形質転換することにより
開発され２それらはＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓと呼ばれた。
実施例 ■
１０４細’／＠ ／ ａｔはＹ Ｐ ０５ ａｌ中に３
０℃で一晩培養し、Ｄａｍｏｎ ＩＥＣＤＰＲ６００臨
床用遠心機を用い’ｃ３ｏｏｏｒｐｍで５分遠心した。
０℃で一晩培養し、Ｄａｍｏｎ ＩＥＣＤＰＲ６００臨
床用遠心機を用い’ｃ３ｏｏｏｒｐｍで５分遠心した。
ペレットは１Ｍツルピトーに０．５ｍ１． ０．５Ｍ
ＥＤＴＡｏ、１１ＲＡ！［１）１８Ｊに懸濁し、この
試料を１．５ ａｔ微量遠心チューブに移した。２．５
■／ａｔテモリアーゼ１ＱＯＩ１００（Ｚｙｍｏｌｙａ
ｓｅ ； Ｍｉｌｅｓ ＬａｂＯｒａｔＯｒｉｅＳ Ｊ
Ｏ，０２ｍ／’＆加え、３７℃で６０分間インキュベー
トした。細胞は微量遠心機を用いて高速で１分沈殿させ
、その後５０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐ）ｌ ７．４Ｊ
２０ ｍＭ ＥＤＴＡ ０．５ｍＪ中に懸濁した。
ＥＤＴＡｏ、１１ＲＡ！［１）１８Ｊに懸濁し、この
試料を１．５ ａｔ微量遠心チューブに移した。２．５
■／ａｔテモリアーゼ１ＱＯＩ１００（Ｚｙｍｏｌｙａ
ｓｅ ； Ｍｉｌｅｓ ＬａｂＯｒａｔＯｒｉｅＳ Ｊ
Ｏ，０２ｍ／’＆加え、３７℃で６０分間インキュベー
トした。細胞は微量遠心機を用いて高速で１分沈殿させ
、その後５０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐ）ｌ ７．４Ｊ
２０ ｍＭ ＥＤＴＡ ０．５ｍＪ中に懸濁した。
１０％Ｓ Ｄ Ｓ ０．０５ ｍｌを加え、混合し、６
５℃で６０分間インキュベートした。５Ｍ酢酸カリウム
（ｐＨ５，２） ０．２ｔｎｔｋ加え、この試料を氷上
で６０分インキュベートした。試料は再度微量遠心機を
用いて高速で５分遠心した。
５℃で６０分間インキュベートした。５Ｍ酢酸カリウム
（ｐＨ５，２） ０．２ｔｎｔｋ加え、この試料を氷上
で６０分インキュベートした。試料は再度微量遠心機を
用いて高速で５分遠心した。
上清は新しい１．５ ｔｔｉｌ倣置遠装チューブに移し
、室温で１容量のインプロパツールな加えた。この試料
を混合し、室温で５分間静置し、その後微量遠心機を用
いて高速で極めて短時間（１０秒）遠心した。上清を除
き、ペレットを自然乾燥させた。
、室温で１容量のインプロパツールな加えた。この試料
を混合し、室温で５分間静置し、その後微量遠心機を用
いて高速で極めて短時間（１０秒）遠心した。上清を除
き、ペレットを自然乾燥させた。
ぺｖ ＋７トな１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）
。
。
１ ｍＭＥＤＴＡ Ｏ，５ａｔ中に懸濁した後、膵臓Ｒ
Ｎａｓａの１１Ｎｉ／ｒａｔ溶液１５．ｔｉｔを加え、
この試料を６７℃で６０分インキュベートした。３Ｍ酢
酸ナトリウム０．０６ｍｌを加え、試料を混合し、イン
グロバノールＱ、 ２ｔｎｌを加えた。試料を微量遠心
機で高速遠心し、ＤＮＡペレットを得た。その陵。
Ｎａｓａの１１Ｎｉ／ｒａｔ溶液１５．ｔｉｔを加え、
この試料を６７℃で６０分インキュベートした。３Ｍ酢
酸ナトリウム０．０６ｍｌを加え、試料を混合し、イン
グロバノールＱ、 ２ｔｎｌを加えた。試料を微量遠心
機で高速遠心し、ＤＮＡペレットを得た。その陵。
上清を排出し、ペレットを乾かし、０．１〜Ｑ、３ ｍ
ｌの１ （１ｍＭ ）す２− ＨＣｔ （ｐＨ７，４）
、１ｍＭＦ、ＤＴＡに懸濁した。（注意二制限消化にお
い又ＤＮＡを用いる前に、その溶液な微量遠心機で１５
分間高速遠心し℃消化を妨げうる不溶性物質を除く必要
があるかも知れない。） 実施例 Ｖ させ、どこに組込みが起こったかを調べた。組込み部位
は所定の形質転換細胞と野生型株とのノ・イブリダイゼ
ーシ！Ｉ／スペクトルを比較することにより決定された
。野生型バンドの大きさの変化はその部位での組込みの
証拠であった。サザンノＮイブリダイゼーシジンおよび
菌株の特注決定の要約を表５に示す。
ｌの１ （１ｍＭ ）す２− ＨＣｔ （ｐＨ７，４）
、１ｍＭＦ、ＤＴＡに懸濁した。（注意二制限消化にお
い又ＤＮＡを用いる前に、その溶液な微量遠心機で１５
分間高速遠心し℃消化を妨げうる不溶性物質を除く必要
があるかも知れない。） 実施例 Ｖ させ、どこに組込みが起こったかを調べた。組込み部位
は所定の形質転換細胞と野生型株とのノ・イブリダイゼ
ーシ！Ｉ／スペクトルを比較することにより決定された
。野生型バンドの大きさの変化はその部位での組込みの
証拠であった。サザンノＮイブリダイゼーシジンおよび
菌株の特注決定の要約を表５に示す。
実施例■に記載したように形質転換ビテア細胞および野
生型ビチア細飽からＤＮＡを調製し。
生型ビチア細飽からＤＮＡを調製し。
ＥｃｏＲＩで消化した。試料を０．８％アガロースゲル
で電気泳動にかけ、サザンブロッ） （Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎｂｌｏｔｓ ； ＭａｎｉａｔｉＳ ｅｔ ａｌ、
１９８２参照）を実施した。フィルターはＡＯＸ１特異
的プローブまたはＨＩＳ４特異的プローブとノ・イブリ
ダイズＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ３ Ｇ−ＧＩＦ２１１８５ Ｃ−ＧＩＦ２１１Ｓ６ Ｇ−ＧＩＦ２ｉ １８８ Ｇ−ＧＩＦ２１１８４ Ｇ−ＧＩＦ２１１Ｓ７ Ｇ−ＧＩＦ２１１Ｓ９ Ｇ−ＧＩＦＱＱ［ｌＣ６ Ｇ−ＧＩＦ００ＯＣ５ Ｇ−ＧＩＦ００ＯＣ７ ｃｍＩＩＦ２１１ｓＩ Ｇ＋Ｇ！Ｆ２１１８７ Ｇ＋ＧＩＦ２１１Ｓ８ Ｇ＋ＧＩＦ２１１Ｓ２ Ｇ＋（１，ｌＦ２１１ｓ９ Ｇ＋ Ｇ−ＩＦ２１１３３ Ｇ＋ＧＩＦ２１１８４ Ｇ＋ＧＩＦ２１１３５ Ｇ＋ＧＩＦ００ＯＣ４ Ｃ，＋ＧＩＦＤ００Ｃ７ Ｇ＋ＣＩＦ００ＯＣ８ 表５ ＡＯＸｌ＆恐らく他の部位 ＡＯＸｌ＆恐らく他の部位 ＡＯＸｌ＆恐らく他の部位 ＡＯＸｉ＆未知の部位 ＯＸｉ ＯＸ Ｉ ＯＸ１ ＯＸ１ ＯＸ１ ０Ｘ１ ）ｉＩｓ４ ）１ｔＳ４ ）ＩＩｓ４ ＯＸ Ｉ ＯＸＩ ＩＳ４ ＯＸＩ ＯＸ Ｉ ＯＸＩ ＯＸ Ｉ ＯＸＩ 実施例 ■ 発酵に先立って１表５に示した全ての菌株は発現レベル
を確かめるために振と５フラスコで増殖させた。−船釣
に、形質転換細胞は２〜５％グリセロールを含む０．６
７％酵母含窒素塩基中にまき。
で電気泳動にかけ、サザンブロッ） （Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎｂｌｏｔｓ ； ＭａｎｉａｔｉＳ ｅｔ ａｌ、
１９８２参照）を実施した。フィルターはＡＯＸ１特異
的プローブまたはＨＩＳ４特異的プローブとノ・イブリ
ダイズＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ３ Ｇ−ＧＩＦ２１１８５ Ｃ−ＧＩＦ２１１Ｓ６ Ｇ−ＧＩＦ２ｉ １８８ Ｇ−ＧＩＦ２１１８４ Ｇ−ＧＩＦ２１１Ｓ７ Ｇ−ＧＩＦ２１１Ｓ９ Ｇ−ＧＩＦＱＱ［ｌＣ６ Ｇ−ＧＩＦ００ＯＣ５ Ｇ−ＧＩＦ００ＯＣ７ ｃｍＩＩＦ２１１ｓＩ Ｇ＋Ｇ！Ｆ２１１８７ Ｇ＋ＧＩＦ２１１Ｓ８ Ｇ＋ＧＩＦ２１１Ｓ２ Ｇ＋（１，ｌＦ２１１ｓ９ Ｇ＋ Ｇ−ＩＦ２１１３３ Ｇ＋ＧＩＦ２１１８４ Ｇ＋ＧＩＦ２１１３５ Ｇ＋ＧＩＦ００ＯＣ４ Ｃ，＋ＧＩＦＤ００Ｃ７ Ｇ＋ＣＩＦ００ＯＣ８ 表５ ＡＯＸｌ＆恐らく他の部位 ＡＯＸｌ＆恐らく他の部位 ＡＯＸｌ＆恐らく他の部位 ＡＯＸｉ＆未知の部位 ＯＸｉ ＯＸ Ｉ ＯＸ１ ＯＸ１ ＯＸ１ ０Ｘ１ ）ｉＩｓ４ ）１ｔＳ４ ）ＩＩｓ４ ＯＸ Ｉ ＯＸＩ ＩＳ４ ＯＸＩ ＯＸ Ｉ ＯＸＩ ＯＸ Ｉ ＯＸＩ 実施例 ■ 発酵に先立って１表５に示した全ての菌株は発現レベル
を確かめるために振と５フラスコで増殖させた。−船釣
に、形質転換細胞は２〜５％グリセロールを含む０．６
７％酵母含窒素塩基中にまき。
中間ないし後期対数期へ６０℃で増殖させた。その後、
細胞４！Ｄａｍｏｎ ＩＥ！；ＣＤＰＲ６００臨床用
遠心機を使って３０００ｒＴ）ｍで５分遠心して集―し
た。ペレットを滅菌水で２回洗い、１％メタノールを含
む０．６７％ＹＮＢ中１ｃ１．０（Ｍｕｔ’″）またに
！ ０．０５ （Ｍｕｔ”、） Ａ ６００単位／ｌｎ
ｌの密度でまき、５０℃で適度に振とうしながら４−６
日間（Ｍｕｔ−株の場合）または６０時間（Ｍｕｔ十株
の場合）増殖させた。この問いろいろな時点に、５０Ａ
６００単位の７リコートを採取し、−２０℃で貯蔵した
。振と５フラスコ培養物は実施例糧に記載するようなＲ
ＩＡおよびクエスターンブロ咋トにより細胞質ＩＦＮ−
ｒおよび分泌ＩＦＮ−ｒについて分析した。
細胞４！Ｄａｍｏｎ ＩＥ！；ＣＤＰＲ６００臨床用
遠心機を使って３０００ｒＴ）ｍで５分遠心して集―し
た。ペレットを滅菌水で２回洗い、１％メタノールを含
む０．６７％ＹＮＢ中１ｃ１．０（Ｍｕｔ’″）またに
！ ０．０５ （Ｍｕｔ”、） Ａ ６００単位／ｌｎ
ｌの密度でまき、５０℃で適度に振とうしながら４−６
日間（Ｍｕｔ−株の場合）または６０時間（Ｍｕｔ十株
の場合）増殖させた。この問いろいろな時点に、５０Ａ
６００単位の７リコートを採取し、−２０℃で貯蔵した
。振と５フラスコ培養物は実施例糧に記載するようなＲ
ＩＡおよびクエスターンブロ咋トにより細胞質ＩＦＮ−
ｒおよび分泌ＩＦＮ−ｒについて分析した。
実施ｆｌＪ Ｖｌ
好適なＩＦＮ−１生産方法を工、分泌株Ｇ−ＧＩＦ２１
１３８ まｒ：ハ細胞質株Ｇ−ＧＩＦ００ＯＣ６を用
いる以下のメタノール供給バッチ発酵プロトコールであ
る。
１３８ まｒ：ハ細胞質株Ｇ−ＧＩＦ００ＯＣ６を用
いる以下のメタノール供給バッチ発酵プロトコールであ
る。
２つの１０を発酵な次のように行った。Ｆ’ｅｒｎ−ｂ
ａｃｋフラスコ中の５００ｍ／のリン酸緩衝化含窒素塩
基（ＹＮＢＪ＋２％グリセロールは種培養物またはその
培養物の最少グルコースプレートから接種された。（プ
レートは検出しうる菌株の変質なしに月１回の継代培養
により維持できる。〕２００ ｒｐｍ、６０℃で１日振
と５後、その接種物は４８０？グリセロール、４０〜ビ
オチ／、および４Ｑｍｌ微量塩溶液を含む最少培地７ｔ
に植えた。
ａｃｋフラスコ中の５００ｍ／のリン酸緩衝化含窒素塩
基（ＹＮＢＪ＋２％グリセロールは種培養物またはその
培養物の最少グルコースプレートから接種された。（プ
レートは検出しうる菌株の変質なしに月１回の継代培養
により維持できる。〕２００ ｒｐｍ、６０℃で１日振
と５後、その接種物は４８０？グリセロール、４０〜ビ
オチ／、および４Ｑｍｌ微量塩溶液を含む最少培地７ｔ
に植えた。
発酵槽’１５０℃、１）８５．５ に維持し、その間
培養物はグリセロールが消費されるまで（１８〜２４時
間ノバッチ方式で増殖させた。ｐＨはＮＨ３の添加によ
り制御した。グリセロールの枯渇は溶存酸素の急激な上
昇（または酸素取込み率の減少〕により分かった。メタ
ノールの供給は１１３ｍ１１時で開始し、発酵槽レベル
を約０．５％ＭｅＯＨとなし。
培養物はグリセロールが消費されるまで（１８〜２４時
間ノバッチ方式で増殖させた。ｐＨはＮＨ３の添加によ
り制御した。グリセロールの枯渇は溶存酸素の急激な上
昇（または酸素取込み率の減少〕により分かった。メタ
ノールの供給は１１３ｍ１１時で開始し、発酵槽レベル
を約０．５％ＭｅＯＨとなし。
このレベルに維持した。流速（工実際のＭｅＯＨ消費速
度に応じて調整した。微量塩の２０ｒｎｌアリコートを
大体２日おきに加えてメタノール消費速度を維持した。
度に応じて調整した。微量塩の２０ｒｎｌアリコートを
大体２日おきに加えてメタノール消費速度を維持した。
ＩＦＮ−ｒのレベルはメタノールの供給により７〜８日
間増加した。１リットル発酵（＃３５１；分泌月ま次の
ように変更することにより比例してスケールダウンされ
た：すなわち初期容量が１ｔであり、グリセロール濃度
が２．０％であった。
間増加した。１リットル発酵（＃３５１；分泌月ま次の
ように変更することにより比例してスケールダウンされ
た：すなわち初期容量が１ｔであり、グリセロール濃度
が２．０％であった。
実施例 鴇
発酵槽実験＃３３９、（メタノール遅増殖；分泌； Ｇ
−ＧＩＦ２１１３８］から約７．９１を回収した。
−ＧＩＦ２１１３８］から約７．９１を回収した。
細胞は１ミクロンセラミックカートリッジを通して濾過
することにより除去した。無細胞培地は電導率を下げ且
つ低分装置不純物な除（ためにスビラルカートリッジ（
ＭＷＣＯ３，０００Ｊで透析した。
することにより除去した。無細胞培地は電導率を下げ且
つ低分装置不純物な除（ためにスビラルカートリッジ（
ＭＷＣＯ３，０００Ｊで透析した。
透析済培地の容量はこの時点で減少しなかった。
必要に応じ℃、培地は小型スビラルカートリッジまたは
Ａｍ１ＣＯｎ 撹拌セル（ＭＷＣＯ１０，０００メンブ
レ／Ｊな用いて濃縮した。１を発酵種実＃＃ ３５［ｊ
、！１５１．３７７および６７８からのより少ない容量
の培地を使用した場合、細胞は遠心（１０，００Ｏｒｐ
ｍ、ＧＳＡローターノおよび０．４５ミクロンフィルタ
ーを通す濾過により除いた。無細胞培地は小型スピラル
カートリッジおよび撹拌セルで凝縮した。
Ａｍ１ＣＯｎ 撹拌セル（ＭＷＣＯ１０，０００メンブ
レ／Ｊな用いて濃縮した。１を発酵種実＃＃ ３５［ｊ
、！１５１．３７７および６７８からのより少ない容量
の培地を使用した場合、細胞は遠心（１０，００Ｏｒｐ
ｍ、ＧＳＡローターノおよび０．４５ミクロンフィルタ
ーを通す濾過により除いた。無細胞培地は小型スピラル
カートリッジおよび撹拌セルで凝縮した。
Ｂ５抽出
細胞は洗浄して、１３ｘ１０ｏａｊガラスチユーブ中［
２５０Ｄまたは１０００Ｄアリコートとして分割し、抽
出に供するまで凍結させた。細胞を解凍し、緩衝液（０
，５Ｍ ＮａＣｚｌｏ、 １％トリトンＸ−１００／
１０ｍＭ Ｎａ ＰＯ４ｐｉ（７，５）で２回洗った。
２５０Ｄまたは１０００Ｄアリコートとして分割し、抽
出に供するまで凍結させた。細胞を解凍し、緩衝液（０
，５Ｍ ＮａＣｚｌｏ、 １％トリトンＸ−１００／
１０ｍＭ Ｎａ ＰＯ４ｐｉ（７，５）で２回洗った。
細胞の１０００Ｄアリコートはガラスピーズ０．５？お
よび破砕緩衝液（２ｍＭ ＰＭＳＦを含む洗浄緩衝液）
６５０μｔを用いて破砕した。
よび破砕緩衝液（２ｍＭ ＰＭＳＦを含む洗浄緩衝液）
６５０μｔを用いて破砕した。
細胞は多重サンプルポルテックスで１分のボルテヴクス
後氷上に１分置くことを４サイクル行うことにより抽出
した。そのｆｉ体を工ｌベンドルフチ、−プに移しくプ
ラスチックピペットの先端な使用ハビーズは追加の破砕
緩衝液６５０μｔを用いて１分ポルテックスすることに
よりｉｖｌ、りな。洗ｉをエッペンドルフチューブに加
え、１５分遠心した。上清はインターフェロンがＲＩＡ
によって測定されるまで氷上で貯蔵した。細醸の２５０
Ｄアリコートは破砕緩衝液１７５μを中でガラスピーズ
０．５１により破砕し、追加の１７５μｔで洗った。
後氷上に１分置くことを４サイクル行うことにより抽出
した。そのｆｉ体を工ｌベンドルフチ、−プに移しくプ
ラスチックピペットの先端な使用ハビーズは追加の破砕
緩衝液６５０μｔを用いて１分ポルテックスすることに
よりｉｖｌ、りな。洗ｉをエッペンドルフチューブに加
え、１５分遠心した。上清はインターフェロンがＲＩＡ
によって測定されるまで氷上で貯蔵した。細醸の２５０
Ｄアリコートは破砕緩衝液１７５μを中でガラスピーズ
０．５１により破砕し、追加の１７５μｔで洗った。
抽出後、細胞ペレー１日まＬａｅｍｍｌ ｉ緩衝液 （
Ｌａｅｍｍｌ ｉ 、Ｎａｔｕｒｅ ２２７ ： ６
８０−６８５ （１９７０Ｊ］５００μｔ（１０００Ｄ
細胞）または６５０μｔ（２５０Ｄｍ胞）中に懸濁し、
５分間沸騰させ。
Ｌａｅｍｍｌ ｉ 、Ｎａｔｕｒｅ ２２７ ： ６
８０−６８５ （１９７０Ｊ］５００μｔ（１０００Ｄ
細胞）または６５０μｔ（２５０Ｄｍ胞）中に懸濁し、
５分間沸騰させ。
その後５分間遠心した。上清は以下で説明するウェスタ
ーン分析のために使用した。
ーン分析のために使用した。
Ｃ４最適抽出
細胞は上記のように溶菌したが、但しチュプは１分の撹
拌後氷上に１分置くことを交互に５回行い、続いて発泡
を少なくするために臨床用遠心機で遠心した。いくつか
の場合には、０．７ｍ１（ｎ代わりに１．４コの全破砕
容量を用いた。多重抽出はベレットにそれぞれの緩衝液
１．Ｑ ｍｌな加え、短時間ボルナ１クスを行い、微量
遠心機で遠心することにより行われた。この方法は６回
まで繰り返すした。最終ベレットは前のように処理した
。
拌後氷上に１分置くことを交互に５回行い、続いて発泡
を少なくするために臨床用遠心機で遠心した。いくつか
の場合には、０．７ｍ１（ｎ代わりに１．４コの全破砕
容量を用いた。多重抽出はベレットにそれぞれの緩衝液
１．Ｑ ｍｌな加え、短時間ボルナ１クスを行い、微量
遠心機で遠心することにより行われた。この方法は６回
まで繰り返すした。最終ベレットは前のように処理した
。
試料は０゜７５Ｘ６Ｘ９ｃｍＳＤＳ−１５％ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離した。そのゲルを０．４５μ＝ト
ロセルロースペーパー［２００ｍＡで９０分分間性させ
た。プロットはＧＢＢ（０，２５％ゼラチン／ｌＱｍＭ
リン酸緩衝液１０．１５ＭＮａ１Ｃ４１０，０５％ツイ
ー７２０１０．０２％アジ化ナトリウムノで６０分間遮
断した。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体（Ｉ
ｎｔｅｒｆ’ｅｒｏｎＳｃ ｔｅｎｃｅｓ社］はＧＢＢ
Ｂ１０１０００に希釈し、室温で一晩プロットと共にイ
ンキュベートした。
ルアミドゲル上で分離した。そのゲルを０．４５μ＝ト
ロセルロースペーパー［２００ｍＡで９０分分間性させ
た。プロットはＧＢＢ（０，２５％ゼラチン／ｌＱｍＭ
リン酸緩衝液１０．１５ＭＮａ１Ｃ４１０，０５％ツイ
ー７２０１０．０２％アジ化ナトリウムノで６０分間遮
断した。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体（Ｉ
ｎｔｅｒｆ’ｅｒｏｎＳｃ ｔｅｎｃｅｓ社］はＧＢＢ
Ｂ１０１０００に希釈し、室温で一晩プロットと共にイ
ンキュベートした。
ポリクローナル抗体は内因性ビテアタンパク質からのパ
ックグラウンドを低下させるために、ｐＡＯ８０４細胞
からの溶菌液（１η／ｍｌ）で予備処理した。インキュ
ベーシヨン後、プロットヲ洗イ。
ックグラウンドを低下させるために、ｐＡＯ８０４細胞
からの溶菌液（１η／ｍｌ）で予備処理した。インキュ
ベーシヨン後、プロットヲ洗イ。
１％ＢＳＡ含有ＧＢＢ中で６０分間インキュベートした
。モノクローナル抗体を用いる場合、プロットはプロテ
ィンＡを結合させるためにウサギ抗マウス抗体（１：１
０００希釈）と共［９０分間インキュベートした。プロ
ットは洗浄ＩＧＢＢ中でインキュベートシた。プロティ
ンＡ１２５Ｉ （０，１μＣｉ／４０ｒＲ１Ｇ Ｂ Ｂ
）を加え、インキュベーションｆｆ４５分間続けた。
。モノクローナル抗体を用いる場合、プロットはプロテ
ィンＡを結合させるためにウサギ抗マウス抗体（１：１
０００希釈）と共［９０分間インキュベートした。プロ
ットは洗浄ＩＧＢＢ中でインキュベートシた。プロティ
ンＡ１２５Ｉ （０，１μＣｉ／４０ｒＲ１Ｇ Ｂ Ｂ
）を加え、インキュベーションｆｆ４５分間続けた。
プロットは洗浄ｆｋＧＢＢ中で４５分間インキュベート
し、続いてプロットの再使用のために抗体のその後の除
去な容易にすべく５％無脂肪ドライミルクで短時間処理
した。プロットな自然乾燥させ℃フィルムに感光させた
。上記方法の場合、５１０標準ｒ−インターフェロンが
検出可能である。
し、続いてプロットの再使用のために抗体のその後の除
去な容易にすべく５％無脂肪ドライミルクで短時間処理
した。プロットな自然乾燥させ℃フィルムに感光させた
。上記方法の場合、５１０標準ｒ−インターフェロンが
検出可能である。
Ｅ０発現レベル
ＩＦＮ−ｒのレベルはＲＩＡＫよって測定した。これら
の値は表６および７に報告され、細胞密度について補正
された。
の値は表６および７に報告され、細胞密度について補正
された。
Ｆ、培地および溶菌液のＥｎｄｏＨ処理−縮し、透析し
た＃６３９、培地または溶菌液１００μｔは０，１Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，２）、ｉ ｍＭ ＥＤＴＡ、＋
／−０，１％ＳＤＳの存在下ニ３７℃で２時間Ｅｎｄｏ
Ｈ３７ｎ７により処理した。各試料１０μｔをウェス
ターンプロット分析にかけた。
た＃６３９、培地または溶菌液１００μｔは０，１Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，２）、ｉ ｍＭ ＥＤＴＡ、＋
／−０，１％ＳＤＳの存在下ニ３７℃で２時間Ｅｎｄｏ
Ｈ３７ｎ７により処理した。各試料１０μｔをウェス
ターンプロット分析にかけた。
Ｇ、結果
１、分泌ＩＦＮ−ｒ：
これらのＭｕｔ−株から培地中に分泌された免疫反応性
ＩＦＮは、見掛は分子量約６５〜３３ＫＤを有する少な
（とも６本のバンドの集まりとして５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上を泳動する。大腸菌により生産されたヒ
トｒ−ＩＦＮ標準品（Ａｍｇｅｎ社Ｊ４’！、１７ＫＤ
および３４ＫＤ（それぞれ非グリコジル化七ツマ−およ
ヒタイマーを表す］の２本のバンドを示す。上記のよう
にＥｎｄＯＢで処理する場合、ピチアにより生産された
バンドは３２ＫＤと１６ＫＤの２本の別々のバンドに分
かれる。１６ＫＤバンドの出現は若干の限定されたタン
パク質加水分解が起こったことを示唆し℃いる。オリゴ
糖の部分的除去は１７ＫＤの追加のバンドなもたらｆ。
ＩＦＮは、見掛は分子量約６５〜３３ＫＤを有する少な
（とも６本のバンドの集まりとして５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上を泳動する。大腸菌により生産されたヒ
トｒ−ＩＦＮ標準品（Ａｍｇｅｎ社Ｊ４’！、１７ＫＤ
および３４ＫＤ（それぞれ非グリコジル化七ツマ−およ
ヒタイマーを表す］の２本のバンドを示す。上記のよう
にＥｎｄＯＢで処理する場合、ピチアにより生産された
バンドは３２ＫＤと１６ＫＤの２本の別々のバンドに分
かれる。１６ＫＤバンドの出現は若干の限定されたタン
パク質加水分解が起こったことを示唆し℃いる。オリゴ
糖の部分的除去は１７ＫＤの追加のバンドなもたらｆ。
１１、細胞質ＩＦＮ−ｒ：
細胞質味からの溶菌液のウェスターンプロット分析は、
そのＩＦＮが標準ＩＦＮと区別し得ないモノマー（１７
ＫＤＪおよびダイマー（６４ＫＤ〕から成ることを示し
た。
そのＩＦＮが標準ＩＦＮと区別し得ないモノマー（１７
ＫＤＪおよびダイマー（６４ＫＤ〕から成ることを示し
た。
【図面の簡単な説明】
第１図はｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ 部位に挿入されたＩ
ＦＮ−γ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＲ３２２／Ｉ
ＦＮ−ｒ を示す。 第２図はＢｇｔｌからＢｇ、ｔｌＩ までの時計回りの
フラグメント中に線状の部位特異的インテグレイティブ
ベクターを含むプラスミドｐＡＯ３０４を示す。ＩＦＮ
−ｒ構造遺伝子ＩＦＮ２１１およびＩＦＮＣ−２はこの
ベクターの唯一のＥｃｏＲＩ部位に挿入された。（角か
っこは部位が破壊されたことを示す。） 第６図はＥｃｏＲ１部位に挿入された修飾ＩＦ’Ｎ−ｒ
遺伝子を含むｐＡＯ８０４誘導プ２スミドであるベクｆ
ｉ−ｐＩＦＮ６ の作製を示すフローチャートである
。 第４図はＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＩＦＮ−ｒ構造遺
伝子を含むｐＡＯ８０４誘導グラスミドであルヘクター
ｐＩＮＦ−２１１４の作製な示ｊ７０−チャートである
。 （外４名） ＦＩｏ、 １ ＦＮ−７
ＦＮ−γ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＲ３２２／Ｉ
ＦＮ−ｒ を示す。 第２図はＢｇｔｌからＢｇ、ｔｌＩ までの時計回りの
フラグメント中に線状の部位特異的インテグレイティブ
ベクターを含むプラスミドｐＡＯ３０４を示す。ＩＦＮ
−ｒ構造遺伝子ＩＦＮ２１１およびＩＦＮＣ−２はこの
ベクターの唯一のＥｃｏＲＩ部位に挿入された。（角か
っこは部位が破壊されたことを示す。） 第６図はＥｃｏＲ１部位に挿入された修飾ＩＦ’Ｎ−ｒ
遺伝子を含むｐＡＯ８０４誘導プ２スミドであるベクｆ
ｉ−ｐＩＦＮ６ の作製を示すフローチャートである
。 第４図はＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＩＦＮ−ｒ構造遺
伝子を含むｐＡＯ８０４誘導グラスミドであルヘクター
ｐＩＮＦ−２１１４の作製な示ｊ７０−チャートである
。 （外４名） ＦＩｏ、 １ ＦＮ−７
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）メチロトローフ酵母を、調節領域および３′終
結配列に機能しうる状態で連結させたＩＦＮ−γの構造
遺伝子を含む発現カセット少なくとも１つを有するベク
ター少なくとも１つで形質転換し；そして ｂ）得られた形質転換酵母菌株をＩＦＮ−γの生産に適
する条件下で培養する ことから成る、改良されたＩＦＮ−γの生産方法。 ２、ベクターはプラスミドまたは線状の部位特異的イン
テグレイティブベクターより成る群から選ばれる、請求
項１記載の方法。 ３、ベクターは線状の部位特異的インテグレイティブベ
クターである、請求項２記載の方法。 ４、線状の部位特異的インテグレイティブベクターは次
の連続配置： ａ）第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント；ｂ）マーカ
ー遺伝子、および調節領域と３′終結配列に機能しうる
状態で連結された。 ＩＦＮＣ−２およびＩＦＮ２１１より成る群から選ばれ
るＩＦＮ−γ構造遺伝子を含む発現カセット少なくとも
１つ； ｃ）第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント を含み、その際成分（ｂ）のマーカー遺伝子と発現カセ
ットの順序は相互に入れ換えることができる、請求項３
記載の方法。 ５、第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントおよび第二の
挿入可能なＤＮＡフラグメントはピチア・パストリス（
Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）から分離されたＡＯＸ
＿１、ｐ４０、ＤＨＡＳおよびＨＩＳ４より成る群から
選ばれる遺伝子のＤＮＡ配列から誘導される、請求項４
記載の方法。 ６、発現カセットは ａ）ピチア・パストリスから分離された ＡＯＸ＿１、ｐ４０、ＤＨＡＳ、およびＨＩＳ４；サッ
カロマイセス・セルビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から分離された酸ホスファ
ターゼ、ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、チトクロムＣ、α接合因子、およびグリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼより成る群から選ば
れる、下記成分（ｂ）に機能しうる状態で連結された調
節領域； ｂ）ＩＦＮＣ−２およびＩＦＮ２１１より成る群から選
ばれる、下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結された
ＩＦＮ−γの構造遺伝子； ｃ）ＡＯＸ＿１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＤＨＡＳ遺伝子
およびＨＩＳ４遺伝子から分離された３′終結配列より
成る群から選ばれる、ピチア・パストリス由来の３′終
結配列 を含む、請求項４記載の方法。 ７、マーカー遺伝子はピチア・パストリスから分離され
たＨＩＳ４およびＡＲＧ４；サッカロマイセス・セルビ
ジェーから分離されたＳＵＣ２；並びにＴｎ９０３およ
びＴｎ６０１のＧ４１８＾Ｒ遺伝子より成る群から選ば
れる、請求項４記載の方法。 ８、ベクターは ａ）ピチア・パストリスから分離された約１キロ塩基の
５′ＡＯＸ＿１調節領域である、下記成分（ｂ）に機能
しうる状態で連結された第一の挿入可能なＤＮＡフラグ
メント； ｂ）ＩＦＮＣ−２およびＩＦＮ２１１より成る群から選
ばれる、下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結された
ＩＦＮ−γの構造遺伝子； ｃ）下記成分（ｄ）に連結された、ピチア・パストリス
から分離されたＡＯＸ＿１の３′終結配列；ｄ）下記成
分（ｅ）に連結された、ピチア・パストリスから分離さ
れたＨＩＳ４であるマーカー遺伝子； ｅ）約０．６５キロ塩基の３′ＡＯＸ＿１終結配列であ
る第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントを含む、請求項
４記載の方法。 ９、次の連続配置： ａ）第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント；ｂ）マーカ
ー遺伝子、および調節領域と３′終結配列に機能しうる
状態で連結されたＩＦＮ−γ構造遺伝子を含む発現カセ
ット少なくとも１つ；および ｃ）第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント を含み、その際成分（ｂ）のマーカー遺伝子と発現カセ
ットの順序は相互に入れ換えることができる、線状の部
位特異的インテグレイティブベクター。 １０、第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントおよび第二
の挿入可能なＤＮＡフラグメントはピチア・パストリス
から分離されたＡＯＸ＿１、ｐ４０、ＤＨＡＳおよびＨ
ＩＳ４より成る群から選ばれる遺伝子のＤＮＡ配列から
誘導される、請求項９記載のベクター。 １１、発現カセットは ａ）ピチア・パストリスから分離された ＡＯＸ＿１、ｐ４０、ＤＨＡＳ、およびＨＩＳ４；サッ
カロマイセス・セルビシェーから分離された酸ホスファ
ターゼ、ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、チトクロムＣ、α接合因子、およびグリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼより成る群から選ば
れる、下記成分（ｂ）に機能しうる状態で連結された調
節領域； ｂ）ＩＦＮＣ−２およびＩＦＮ２１１より成る群から選
ばれる、下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結された
ＩＦＮ−γの構造遺伝子； ｃ）ＡＯＸ＿１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＤＨＡＳ遺伝子
およびＨＩＳ４遺伝子から分離された３′終結配列より
成る群から選ばれる、ピチア・パストリス由来の３′終
結配列 を含む、請求項９記載のベクター。 １２、マーカー遺伝子はピチア・パストリスから分離さ
れたＨＩＳ４およびＡＲＧ４；サッカロマイセス・セル
ビシェーから分離されたＳＵＣ２；および細菌のＴｎ９
０３およびＴｎ６０１のＧ４１８＾Ｒ遺伝子より成る群
から選ばれる、請求項９記載のベクター。 １５、ベクターは ａ）ピチア・パストリスから分離された約１キロ塩基の
５′ＡＯＸ＿１遺伝子の機能性調節領域である、下記成
分（ｂ）に機能しうる状態で連結された第一の挿入可能
なＤＮＡフラグメント； ｂ）ＩＦＮＣ−２およびＩＦＮ２１１より成る群から選
ばれる、下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結された
ＩＦＮ−γの構造遺伝子； ｃ）下記成分（ｄ）に連結された、ピチア・パストリス
から分離されたＡＯＸ＿１の３′終結配列；ｄ）下記成
分（ｅ）に連結された、ピチア・パストリスから分離さ
れたＨＩＳ４であるマーカー遺伝子； ｅ）約０．６５キロ塩基の３′ＡＯＸ＿１終結配列であ
る第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントを含む、請求項
９記載のベクター。 １４、３′終結配列に機能しうる状態で連結された、Ｉ
ＦＮ−γの構造遺伝子に機能しうる状態で連結された調
節領域から成る発現カセット少なくとも１つを含むベク
ター少なくとも１つで形質転換されたメチロトローフ酵
母。 １５、該酵母はピチア・パストリスである、請求項１４
記載のメチロトローフ酵母。 １６、該酵母はピチア・パストリスＧＳ１１５株である
、請求項１４記載のメチロトローフ酵母。 １７、該ＧＳ１１５株は次の連続配置： ａ）第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント；ｂ）下記成
分（ｃ）に機能しうる状態で連結された、マーカー遺伝
子およびＩＦＮ−γ構造 遺伝子を含むピチア適合性発現カセット少 なくとも１つ； ｃ）ピチア・パストリス由来のＡＯＸ＿１遺伝子、ｐ４
０遺伝子、ＤＨＡＳ遺伝子、およびＨＩＳ４遺伝子から
分離された３′終結配列より成る群から選ばれる３′終
結配列； ｄ）第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント を含む線状の部位特異的インテグレイティブベクター（
但し、成分（ｂ）のマーカー遺伝子と発現カセットの順
序は相互に入れ換えることができる）少なくとも１つで
形質転換されている、請求項１６記載のピチア・パスト
リスＧＳ１１５株。 １８、ベクターは ａ）ピチア・パストリスから分離された約１キロ塩基の
５′ＡＯＸ＿１調節領域である、下記成分（ｂ）に機能
しうる状態で連結された第一の挿入可能なＤＮＡフラグ
メント； ｂ）ＩＦＮＣ−２およびＩＦＮ２１１より成る群から選
ばれる、下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結された
ＩＦＮ−γの構造遺伝 子； ｃ）下記成分（ｄ）に連結された、ピチア・パストリス
から分離されたＡＯＸ＿１の３′終結配列； ｄ）下記成分（ｅ）に連結された、ピチア・パストリス
から分離されたＨＩＳ４であるマー カー遺伝子； ｅ）約０．６５キロ塩基の３′ＡＯＸ＿１終結配列であ
る第二の挿入可能なＤＮＡフラグメン を含む、請求項１７記載のピチア・パストリスＧＳ１１
５株。 １９、該ＧＳ１１５株は１より多いコピー数の線状部位
特異的インテグレイティブベクターで形質転換される、
請求項１７記載のピチア・パストリスＧＳ１１５株。 ２０、該酵母はＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ３である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２１、該酵母はＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ５である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２２、該酵母はＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ６である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２３、該酵母はＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ８である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２４、該酵母はＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ４である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２５、該酵母はＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ７である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２６、該酵母はＧ−ＧＩＦ２１１Ｓ９である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２７、該酵母はＧ−ＧＩＦ０００Ｃ６である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２８、該酵母はＧ−ＧＩＦ００Ｃ５である、請求項１４
記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ２９、該酵母はＧ−ＧＩＦ０００Ｃ７である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３０、該酵母はＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓ１である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３１、該酵母はＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓ７である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３２、該酵母はＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓ８である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３３、該酵母はＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓ２である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３４、該酵母はＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓ９である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３５、該酵母はＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓ３である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３６、該酵母はＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓ４である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３７、該酵母はＧ＋ＧＩＦ２１１Ｓ５である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３８、該酵母はＧ＋ＧＩＦ０００Ｃ４である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ３９、該酵母はＧ＋ＧＩＦ０００Ｃ７である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。 ４０、該酵母はＧ＋ＧＩＦ０００Ｃ８である、請求項１
４記載の形質転換メチロトローフ酵母。
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