AT504588B1 - Nukleinsäure-promotor - Google Patents

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Description

2 AT 504 588 B1
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure-Sequenzen, die transkriptionelle Regulationseigenschaften aufweisen.
Mitochondriale alternative Oxidasen (AOX oder AOD) sind Schlüsselenzyme für eine „Abkürzung“ („short cut“) zum Standardatemweg bei Pflanzen, vielen Pilzen und Hefen. Diese terminalen Oxidasen übertragen Elektronen direkt aus dem mitochondrialen Ubichinonpool zum Sauerstoff. Dies ermöglicht eine Atmung sogar in der Anwesenheit von Komplex-Ill- und -IV-lnhibitoren wie Antimycin A oder Cyanid. Die resultierende freie Energie wird als Wärme freigesetzt. Im Gegensatz zur Cytochrom-C-Oxidase, welche die terminale Oxidase des Standardatmungswegs ist, pumpt die alternative Oxidase keine Elektronen durch die mitochondriale Membran. Somit ist die Versorgung mit kleinen metabolischen Zwischenprodukten durch die zentralen metabolischen Wege von der zellulären Energieproduktion losgekoppelt. Die respiratorische ATP Produktion hängt dann von der Komplex-I-Aktivität ab. Cyanid-resistente Atmung ist bei Crabtree-negativen Hefen üblich, die nicht zur aeroben Fermentation fähig sind.
Die angenommenen biologischen Funktionen der alternativen Oxidasen bei unterschiedlichen Organismen scheinen genauso vielfältig zu sein wie die entsprechenden Induktionsarten. Alternative Atmung wird zum Beispiel durch osmotischen Stress, Kälteeinwirkung, Verletzung, Angriff von Pathogenen, Behandlung mit H202 oder Inhibitoren der Hauptatmungskette, wie Cyanid und Antimycin A, induziert. Experimentelle Daten bestätigen deutlich die heutige Rolle der alternativen Oxidase als Schützer der Zelle gegen reaktive Sauerstoffarten oder bei der Schaffung einer gewissen metabolischen Flexibilität. Es wird allgemein in Betracht gezogen, dass sie die Kontrolle der ATP-Synthese ermöglichen, um die Wachstumsratenhomöostase beizubehalten und einen ständigen Umsatz des Citratzyklus (TCA-Kreislauf) unter hoher Energieaufladung zu sichern. Die Aktivität der alternativen Oxidase ermöglicht eine nicht reprimierte Glykolyse und einen nicht reprimierten TCA-Kreislauf-Umsatz, was, zum Beispiel, wiederum im Falle von Aspergillus niger WU-2223L zu der hohen Produktivität von extrazellulärer Zitronensäure beiträgt.
Die Struktur und Funktion von alternativen Oxidasen aus Pflanzen und Pilzen wurde einige Jahrzehnte lang intensiv studiert. Jedoch wurde bislang keine stabile und aktive Form des Enzyms gereinigt.
In Pichia pastoris wurde bereits eine Cyanid-resistente Atmung (cyanide-resistant respiration -CRR) festgestellt, wie dies auch für Crabtree-negative Hefe erwartet wird. Allerdings war ein Zwangsbelüften der ruhenden Zellen notwendig, um eine messbare CRR zu induzieren. Bislang wurde kein Gen beschrieben, das für eine alternative Oxidase der Pichia pastoris oder ihrer Expression kodiert. Ganz im Gegenteil, bei einem kürzlichen Versuch, die energetischen Eigenschaften von isolierten Pichia pastoris Mitochondrien zu charakterisieren, wurde keine Aktivität der alternativen Oxidase unter den angewandten Wachstumsbedingungen nachgewiesen. Es wurde beschrieben, dass es der eng verwandten Hefe Pichia angusta (Hansenula polymorpha) unter den untersuchten Bedingungen an einer Cyanid-resistenten Atmung fehlt.
Im Pichia-System werden die meisten fremden Gene unter transkriptioneller Kontrolle des P.-pastoris-Alkoholoxidase-1-Gen-promotors (Paoxi) exprimiert, wobei dessen Regulationseigenschaften für diesen Zweck gut geeignet sind. Der Promotor wird während des Hefewachstums auf den meisten üblichen Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Glycerin oder Ethanol, stark reprimiert, aber während des Wachstums auf Methanol (s. z.B. US 4,855,231) stark induziert. PAoxrkontrollierte Expressionsstämme werden für die Produktion von fremden Proteinen anfänglich auf einer reprimierenden Kohlenstoffquelle gezüchtet, um Biomasse zu erzeugen, und danach wird auf Methanol als die einzige Kohlenstoff- und Energiequelle gewechselt, um die Expression des Fremdgens zu induzieren. Ein Vorteil des PAoxrRegulationssystems besteht darin, dass die P.-pastoris-Stämme, die mit fremden Genen, deren Expressionsprodukte für die Zellen toxisch sind, transformiert wurden, durch Züchtung unter den Repressionsbedingungen erhalten werden können. 3 AT 504 588 B1
Obwohl viele Proteine unter Verwendung von PAOxi erfolgreich produziert wurden, ist dieser Promotor nicht für alle Situationen geeignet oder günstig, Zum Beispiel bei Schüttelkolbenkulturen verdampft das Methanol schnell und es ist unpraktisch, die Methonalkonzentrationen zu überwachen und die Verbindung dem Medium wiederholt zuzusetzen. Darüber hinaus stellt die Lagerung von großen Mengen an Methanol, die für das Wachstum und die Induktion von PAOXi-kontrollierten Expressionsstämmen in großvolumigen Fermenterkulturen mit hoher Dichte benötigt werden, eine potentielle Brandgefahr dar. Deshalb besteht der Bedarf an einem alternativen Promotor zu PAOxi, der sowohl in transkriptioneller Hinsicht effizient ist, als auch durch weniger volatile und entflammbare Induktoren reguliert werden kann.
Ellis et al. (Mol Cell Biol 5 (1985): 1111-1121) betrifft die Isolierung eines Alkoholoxygenase-Gens und zweier anderer Methanol-regulierbaren Gene aus Pichia pastoris.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Nukleinsäure-Sequenzen mit transkriptioneller Regulationsaktivität und Expressionssystemen zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile der üblicherweise angewandten Expressionssysteme, welche den Zusatz von leicht entflammbaren Substanzen, wie Methanol, erfordern, um ein fremdes Peptid, Polypeptid oder Protein in einem Wirten effizient zu exprimieren, überwinden. Weiters herrscht im Stand der Technik ein großer Bedarf an Regulationssequenzen, die erlauben, die Peptide und Proteine stark reguliert zu exprimieren und die Expression auf einfachem, effizienten und schnellen Wege ein- und auszuschalten.
Deshalb bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Nukleinsäure-Promotor umfassend eine Sequenz, die zumindest zu 70 % mit der SEQ ID Nr. 1 oder einem Fragment davon ident ist, oder eine Sequenz, die daran unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Upstream (5'-Stelle) Region der mitochondrialen alternativen Oxidase (AOD; Genbank Hinterlegungsnr. DQ465985), die aus der Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1 besteht, einen Promotor umfasst, der durch die Zugabe von Glucose oder anderen Kohlenstoffquellen, die eine zelluläre Atmung ermöglichen (z.B. Glycerin), zum Medium induziert werden kann (Zellwachstum und Induktion treten vorzugsweise durch Zugabe von 0,05 bis 20 g, vorzugsweise 1 bis 10 g, Glucose oder 0,05 bis 10 g, vorzugsweise 0,1 bis 5 g, Glycerin auf, wenn zum Beispiel Pichia pastoris verwendet wird). Folglich kann dieser Promotor durch die Zugabe oder Entfernung von Glucose oder durch Variieren der Glucosekonzentration im Medium gesteuert (induziert oder reprimiert) werden. Dies ermöglicht eine effiziente Produktion von Peptiden, Polypeptiden, Proteinen oder funktionellen Nukleinsäuremolekülen, welche mit dem Promotor der vorliegenden Erfindung funktionell verknüpft sind. Das ist besonders überraschend, da es aus dem Stand der Technik bekannt ist, dass Hefezellen die Expression von alternativen Oxidasen einschalten, wenn sie Stress ausgesetzt werden (Gonzalez-Meler, M.A., et al., Plant Physiol 120(3) (1999): 765-72; Veiga, A. et al., J. Appl. Microbiol 95(2) (2003): 364-71; Simons, B.H., et al., Plant Physiol 120(2) (1999):529-38 und Kirimura, K. et al., FEMS Microbiol Lett, 141(2-3) (1996): S. 251-4). Deshalb könnte davon ausgegangen werden, dass ein Promotor in der Upstream-Region der mitochondrialen alternativen Oxidase auch durch Stressinduktion aktiviert werden könnte. Die Expression der mitochondrialen alternativen Oxidase wird allerdings in der Anwesenheit von Glucose induziert und wird nicht induziert, wenn keine Glucose im Kulturmedium vorhanden ist. Eine unzureichende Zufuhr einer Kohlenstoffquelle, d.h. ein Glucosemangel, ruft für gewöhnlich eine Stressreaktion in den Zellen und somit eine Expression von alternativen Oxidasen hervor. Im vorliegenden Fall konnte ein überraschender gegenteiliger Effekt gezeigt werden.
Der Promotor der vorliegenden Erfindung ist der erste alternative Oxidasenpromotor, der bei methylotropher Hefe entdeckt wurde, welcher durch die Anwesenheit von Glucose aktiviert und durch ihre Abwesenheit deaktiviert wird. Weiters werden andere Promotoren, die durch Glucose aktiviert werden können, nicht gänzlich oder effizient durch die Abwesenheit oder den vollständigen Verbrauch im Laufe eines Glucosefermentationsprozesses reprimiert (z.B. GAP-Promotor 4 AT 504 588 B1 (pGAPZ A, B, und C Manual von Invitrogen; Katalognr. V200-20 und V205-20; Waterham, H.R., et al., Gene 186(1997) :37-44)).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch funktionelle Fragmente des Promotors mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1. Diese funktionellen Fragmente können identifiziert werden durch Isolieren einer Region der SEQ ID Nr. 1, funktionelles Verknüpfen dieser Region mit dem zu transkribierenden Nukleinsäure-Abschnitt, Einführen des erhaltenen Konstrukts in einen Vektor und/oder Wirt und Induzieren des Promotors mit potentiellen Induktors (z.B. Glukose). Die Menge des Transkripti-ons- und/oder des Translationsprodukts zeigt die Aktivität der funktionellen Promotorfragmente an.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird unter „Identität“ Ähnlichkeit der Nukleinsäure-Sequenz verstanden. Sequenzen mit Identität teilen identische Nukleotide an definierten Positionen innerhalb des Nukleinsäure-Moleküls. Somit müssen bei einer Nukleinsäure-Sequenz, die zumindest 70 % Nukleinsäure-Sequenz-Identität mit einer Referenzsequenz (d.h. SEQ ID Nr. 1) gemein hat, nach Ausrichtung einer Nukleinsäure-Sequenz mit der Referenzsequenz, zumindest 70 % der Nukleotide in der Nukleinsäure-Sequenz mit den entsprechenden Nukleotiden in der Referenzsequenz ident sein.
Sequenzen werden für Identitätsberechnungen anhand eines mathematischen Algorithmus ausgerichtet, wie der Algorithmus von Karlin und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990): 2264-2268), modifiziert wie in Karlin und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) :5873-5877). Ein solcher Algorithmus ist in die XBLAST-Programme von Altschul et al. eingearbeitet (J. Mol. Biol. 215 (1990):403-410). Um eine Ausrichtung mit Lücken („gapped alignments“) zu erhalten, können Gapped BLAST verwendet werden, wie es in Altschul et al. beschrieben ist (Nucleic Acids Res. 25 (1997) :3389-3402). Bei der Benützung von BLAST- und Gapped-BLAST-Programmen können die Standardparameter des jeweiligen Programms verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiters Varianten und Derivate des Promotors der vorliegenden Erfindung, wie in SEQ ID Nr. 1 dargelegt. Bei diesen Varianten werden die Nukleotide des Promotors der vorliegenden Erfindung substituiert, deletiert oder in jeglicher Kombination zugefügt. Natürlich und nicht natürlich vorkommende Varianten sind in der Erfindung miteingeschlossen und können durch Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese produziert werden.
Mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren können ebenfalls Varianten generiert werden, um die Charakteristika des Nukleinsäure-Promotors der vorliegenden Erfindung zu verbessern oder zu verändern. Solche Varianten umfassen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Repeats und Substitutionen, die gemäß den allgemein im Stand der Technik bekannten Regeln ausgewählt werden. „Hybridisierend“, wie hier verwendet, ist so zu verstehen, dass Nukleinsäuremoleküle unter den üblichen (stringenten) Hybridisierungsbedingungen hybridisieren (s., z.B. Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). „Stringente Bedingungen“ und Verfahrensschritte, wie sie insbesondere hier verwendet werden, können zum Beispiel sein: (1) Anwendung von niedriger lonenstärke und hoher Temperatur zum Waschen, z.B. 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/ 0,1 % Natriumdodecylsulfat, bei 50°C; (2) Anwendung eines Denaturierungsmittels während der Hybridisierung, wie Formamid, z.B. 50 % (V/V) Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) Anwendung von 50 % Formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCI, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 x Denhardt's Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 pg/ml), 0,1 % SDS, und 10 % Dextransulfat bei 42°C, mit Waschungen bei 42°C in 0,2 x SSC (Natriumchlo- 5 AT 504 588 B1 rid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55°C, gefolgt von einer Waschung mit hoher Strin-genz, die aus 0,1 x SSC enthaltend EDTA besteht, bei 55°C.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Promotorfragment aus den Nukleotiden 501 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1001 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1242 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1499 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1681 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1816 bis 2000, der SEQ ID Nr. 1.
Diese besonders bevorzugten Fragmente der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 umfassen jene Elemente oder Abschnitte, die für die Regulierung des Promotors notwendig sind. Es ist selbstverständlich auch möglich, die Länge oder die Nukleotidsequenz der einzelnen Fragmente zu variieren, vorausgesetzt, dass sie ihre Promotorfunktion im Wesentlichen bewahren. Das aus den Nukleotiden 1816 bis 2000 der SEQ ID Nr. 1 bestehende Promotorfragment ist besonders bevorzugt, da dieses Fragment insbesondere hohe Promotoraktivität aufwies.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das funktionelle Fragment ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 und 15.
Alle Promotoren und Promotorvarianten der SEQ ID Nr. 1 bis 15, wobei alle Promotorvarianten mit der SEQ ID Nr. 2 bis 15 von SEQ ID Nr. 1 hergeleitet sind, zeigen dasselbe oder zumindest ein ähnliches transkriptioneiles Verhalten bei Anwesenheit und Abwesenheit von Glucose.
Die Promotoren und Varianten und Fragmente davon können mit anderen Nukleinsäure-Fragmenten oder -Molekülen, die vorzugsweise von anderen Promotoren (z.B. Promotorelementen) hergeleitet sind, verbunden sein, wie AOX2, ZZA1, CUP1, GAP, FLD, TEF1, TEF2. Es ist darüber hinaus natürlich auch möglich, Nukleinsäure-Moleküle zur Verfügung zu stellen, die mehr als ein von SEQ ID Nr. 1 hergeleitetes Promotorfragment umfassen. Solche Promotorhybriden können erhöhte (z.B. multiplizierte) spezifische Promotoraktivität zeigen. Wenn der Promotor mit SEQ ID Nr. 1 mit Promotorfragmenten anderer Promotoren fusioniert wird, kann der neu erhaltene Promotor multiple Spezifitäten aufweisen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Expressionskassette, welche einen Nukleinsäure-Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, der mit zumindest einem Nukleinsäuremolekül funktionell verknüpft ist, das ein Peptid, Polypeptid, Protein oder eine funktionelle Nukleinsäure kodiert.
Der Promotor, der durch die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder funktionelle Fragmente oder Derivate davon kodiert ist, kann zur Fierstellung einer Expressionskassette verwendet werden, die in Vektoren, in chromosomale DNA etc., eingeführt werden kann. Die Expressionskassette umfasst weiters zumindest ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Peptid, Polypeptid, Protein oder eine funktionelle Nukleinsäure kodiert. Dieses weitere Nukleinsäuremolekül ist mit dem Promotor funktionell verknüpft, um die Transkription dieses Nukleinsäuremoleküls unter Promotorkontrolle zu ermöglichen.
Der Begriff „Kassette“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die ein besonderes Gen exprimieren kann, wenn dieses Gen insertiert wird, um mit einer oder mehreren Regulationssequenz(en), die in der Nukleotidsequenz vorhanden ist/sind, funktionell verknüpft zu werden. Somit kann die Expressionskassette, zum Beispiel, ein heterologes Gen umfassen, von dem erwünscht ist, dass es durch Glucoseinduktion exprimiert werden soll. Die Expressionskassetten und Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung sind deshalb zur Förderung der Expression jedweder Anzahl an heterologen Genen nach der Glucoseinduktion nützlich. Des Weiteren kann die Kassette der vorliegenden Erfindung auch einen DNA-Abschnitt enthalten, der für ein Signalpeptid kodiert, welches die Sekretion des daran fusionier- 6 AT 504 588 B1 ten Polypeptids, Peptides und/oder Proteins ermöglicht. Eine solche Kassette ist gemäß der vorliegenden Erfindung dazu bestimmt, eine „Sekretionskassette“ zu sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der einen Nukleinsäure-Promotor oder eine Expressionskassette gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Promotor sowie die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung können durch bekannte rekombinante Techniken in einen Vektor eingeführt werden. „Vektor“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Träger-DNA-Molekül, in welches eine Nukleinsäuresequenz zur Einführung in eine neue Wirtszelle insertiert werden kann, wo sie in das Genom integriert, repliziert und/oder exprimiert wird. Der Vektor kann, zum Beispiel, in der Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen verwendet werden. Die passende Nukleinsäure-Sequenz kann in den Vektor durch eine Vielzahl von Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktion-Endonuklease-Stelle(n) durch aus dem Stand der Technik bekannte Techniken insertiert.
Der Vektor umfasst weiters vorzugsweise zumindest eine Klonierungsstelle, zumindest ein Gen oder Genfragment, welches für einen selektierbaren Marker kodiert, eine Sekretionskassette und/oder zumindest einen Replikationsursprung.
Die Vektorkomponenten schließen im Allgemeinen eines oder mehrere von einer Signalsequenz, einem Replikationsursprung, einem oder mehreren Markergen(en), einem Promotor, einer Transkriptionsterminationssequenz und einer Sekretionskassette zur Ermöglichung der Sekretion eines translatierten Produkts, welches durch ein mit dem Promotor des Vektors funktionell verknüpftes Gen kodiert ist, ein, sind jedoch darauf nicht beschränkt. Passende Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponente (n) enthalten, werden unter Verwendung von den dem Fachmann bekannten Ligationstechniken konstruiert. Wenn der Vektor oder Teile davon in ein Wirtsgenom, vorzugsweise einen Hefewirt, mehr bevorzugt einen Pichia-pastoris-Wirt, integriert werden soll(en), muss der Vektor nicht unbedingt einen Replikationsursprung umfassen. Für eine chromosomale Integration sind auch lineare Vektoren möglich, z.B. zusammengefügt durch PCR (z.B. Überhangsverlängerungs-PCR - Overlap Extension PCR) oder synthetische lineare DNA-Fragmente und bei denen jeglicher Replikationsursprung fehlt. Im Falle eines Hefeplasmids kann der Vektor zumindest eine autonome Replikationssequenz (ARS) aufweisen.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) eine Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat, Zeo-cin, Geneticin oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel ausgleichen oder (c) wichtige Nährstoffe liefern, die von den komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen, welches D-Alanin-Racemase für Bazillen kodiert. Ein passendes Selektionsgen für die Verwendung bei Hefe ist das trp1-Gen. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutationsstamm von Hefe zur Verfügung, die nicht in Tryptophan wachsen kann. Weitere Selektionsmarker würden im vorliegenden Fall Zeocin (Bleomycin), Geneticin (kanMX) oder Blastizidin sein. Darüber hinaus können auch Enzyme als Selektionsmarker verwendet werden, die die für das Wachstum der Wirtszellen notwendigen Zellnährstoffe liefern können. Zum Beispiel kann Inver-tase (SUC2) als Selektionsmarker verwendet werden, was durch das Entfernen der Saccharose (z.B. Sreekrishna K., et al., Gene 59 (1) (1987): 115-25) eine Kohlenstoffquelle liefert. Die Sekretionskassette der vorliegenden Erfindung, die den Promotor der vorliegenden Erfindung umfasst, kann jedoch auch in einen Wirt ohne einen Selektionsmarker eingeführt werden. In diesem Fall kann ein Selektionsmarker durch Ko-Transformation einer zweiten DNA (z.B. Plasmid), die einen Selektionsmarker umfasst, in einen Wirt eingeführt werden.
Der Vektor weist zumindest einen zweiten Nukleinsäure-Promotor auf, der mit zumindest einem 7 AT 504 588 B1 zweiten Nukleinsäuremolekül, das für ein Peptid, Polypeptid, Protein oder eine funktionelle Nukleinsäure kodiert, funktionell verknüpft ist.
Das Bereitstellen zumindest eines weiteren Promotors in einem Vektor der vorliegenden Erfindung erlaubt die Transkription/Expression eines zweiten, mit dem weiteren Promotor funktionell verknüpften, Gens. Wenn dieser Promotor durch andere Substanzen oder Faktoren als durch den Promotor der vorliegenden Erfindung induziert werden kann, ist es möglich, einen Vektor zu erhalten, der unterschiedliche Gene unter unterschiedlichen Induktionsbedingungen expri-mieren kann. Zum Beispiel können in einem erfindungsgemäßen Vektor zwei Promotoren verwendet werden, wobei der erste Promotor ein Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung ist und durch die Zugabe von Glucose induziert und durch dessen Entfernung reprimiert werden kann. Als zweiter Promotor kann zum Beispiel der AOX1 -Promotor, welcher durch die Zugabe von Methanol induziert und durch die Zugabe von Glucose reprimiert werden kann, eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der zumindest eine zweite Nukleinsäure-Promotor aus der Gruppe bestehend aus Alkoholoxidasel-Promotor (AOX1-Promotor), AOX2, ZZA1, CUP1, GAP, FLD, TEF1, TEF2 oder Varianten davon, ausgewählt.
Der zumindest eine zweite Promotor kann bevorzugterweise ein AOX1-Promotor sein. Dieser Promotor kann nativ sein oder jegliche Mutationen umfassen. Besonders bevorzugte Promotoren sind zum Beispiel in der WO 2006/089329 zu finden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die einen Nukleinsäure-Promotor, eine Expressionskassette und/oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Nukleinsäure-Promotor oder die Expressionskassetten oder die Vektoren, die den Promotor umfassen, können zum Beispiel durch Transformation in eine Wirtszelle eingeführt werden. Verfahren zur Transformation von Wirtszellen mit einer Fremd-DNA sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Wirtszelle ist vorzugsweise eine Eukaryot, vorzugsweise ein Pilz, mehr bevorzugt ein Pilz der Gattung Aspergillus, oder eine Hefe, mehr bevorzugt eine Hefe der Gattung Pichia, insbesondere Pichia pastoris, Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Hansenula, insbesondere Hansenula polymorpha, oder Candida.
Die Wirtszelle der vorliegenden Erfindung umfasst die Expressionskassette, vorzugsweise in die genomische DNA integriert oder extrachromosomal im Zytoplasma.
Um die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung, welche einen Promotor und ein damit funktionell verknüpftes, zu transkribierendes Gen umfasst, in die Wirtszelle stabil einzuführen, wird das die Expressionskassette umfassende Nukleinsäuremolekül vorzugsweise in das Chromosom der Wirtszelle integriert.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Produktion und die fakultative Isolierung zumindest eines Peptides, Polypeptides, Proteins oder einer funktionellen Nukleinsäure, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, b) Inkubieren der Wirtszelle in einem ersten Kulturmedium, c) fakultatives Inkubieren der Wirtszelle in einem zweiten Kulturmedium, und d) fakultatives Isolieren des Peptids, Polypeptids, Proteins oder der funktionellen Nukleinsäure aus dem Überstand oder aus den Wirtszellen, 8 AT 504 588 B1 wobei das erste und/oder zweite Kulturmedium für die Induktion der Expression des zumindest einen Peptids, Polypeptids, Proteins oder der funktionellen Nukleinsäure Glucose umfasst.
Der erfindungsgemäße Promotor kann insbesondere für die Produktion von rekombinanten Peptiden, Polypeptiden und/oder Proteinen oder funktionellen Nukleinsäuremolekülen (z.B. Ribozymen) sowie zur Kaskadenexpression, Zelldifferenzierung, synthetischen Regulationskreisläufen und zur Produktion von kleinen Molekülen und metabolischem Engineering (ME) verwendet werden. Ein typisches Protokoll für die Produktion solcher Moleküle kann die Propagierung eines passenden Klons involvieren, der nach der Induktion das Molekül, an dem ein Interesse besteht, exprimieren oder produzieren kann. Der Klon kann in einem ersten Kulturmedium gezüchtet werden, bis eine definierte Zellkonzentration erreicht ist. Infolgedessen wird die Transkription des Gens, das mit dem erfindungsgemäßen Promotor funktionell verknüpft ist, durch die Zugabe eines Induktors (z.B. Glucose) induziert. Die Induktion der Expression wird durch Entfernen des Induktors (z.B. Verbrauch der Glucose durch die Zellen führt ebenfalls zu einer Entfernung der Glucose) oder durch Transferieren der Zellen in ein zweites Kulturmedium gestoppt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das erste und/oder zweite und/oder zumindest eine weitere Kulturmedium zumindest einen weiteren Induktor für den zumindest einen zweiten Nukleinsäure-Promotor.
Natürlich ist es auch möglich, zumindest ein zweites Molekül unter der Kontrolle eines weiteren oder desselben Promotors zu produzieren.
Der zumindest eine weitere Induktor ist vorzugsweise Methanol, wenn der zumindest eine zweite Nukleinsäure-Promotor ein AOX1-Promotor, DAS1, DAS2, FDH oder FLD oder Methylamin oder Cholin ist, wenn der zumindest eine zweite Nukleinsäure-Promotor ein FLD-Promotor ist.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit für die rekombinante Produktion von zumindest einem Peptid, Polypeptid, Protein oder einer funktionellen Nukleinsäure, umfassend: - einen Vektor der einen Nukleinsäure-Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, und - eine Wirtszelle.
Der Kit der vorliegenden Erfindung kann insbesondere für die rekombinante Produktion von Molekülen verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle eine Eukaryot, vorzugsweise eine Hefe, mehr bevorzugt eine Hefe der Gattung Pichia, insbesondere Pichia pastoris.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele näher erläutert, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Fig. 1 zeigt die Messungen des Sauerstoffverbrauchs von exponentiell wachsenden Pichia pastoris X-33 Zellen. A: Kontrollmessung. B: Zugabe von Antimycin A (10 pg ml'1 Endkonzentration) beim Zeitpunkt 0. Die Atmung des Kontrollstamms wurde durch die Zugabe von Cyanid beeinträchtigt, jedoch konnte ein niedriger Basislevel an Cyanid-resistenter Atmung (CRR) beobachtet werden. Die Zugabe von Antimycin A hob die Atmung zu einem großen Teil auf und induzierte die Expression der alternativen Oxidase. Der Effekt von Cyanid auf die gesamte respiratorische Aktivität wurde mit der Zeit schwächer. 2 Stunden nach der Induktion war die respiratorische Aktivität wieder voll hergestellt. 9 AT 504 588 B1
Fig. 2 zeigt die Ausrichtung des konservierten C-terminalen Teils der alternativen Oxidasen aus Candida albicans (AAF21993) , AOX1b), Pichia stipitis (AAF97475), Pichia anomala (BAA90763), Aspergillus niger (074180), Aspergillus nidulans (EAA64931), Neurospora crassa (AAN39882), Sauromatum guttatum (CAA78823), Arabidopsis thaliana (BAA22624) und Pichia pastoris.
Die hochkonservierten Reste unter den alternativen Oxidasen sind umrandet.
Fig. 3 zeigt den Zeitverlauf der Expression von alternativer Oxidase bei unterschiedlichen Glucosekonzentrationen im Medium. A: 1 % Glucose. B: 5 % Glucose. Die Expression des alternativen Oxidase-GFP-Fusionsproteins folgte der gleichen Expressionsart bei beiden Glucosekonzentrationen. Die relativen Fluoreszenzwerte (Mittelwerte aus 3 Messungen) stiegen konstant an und erreichten das Maximum kurz nach dem Zeitpunkt der Glucoseabreicherung. Nach diesem Zeitpunkt fielen die Fluoreszenzwerte aufgrund des Abbaus des Fusionsproteins ab.
Fig. 4 zeigt die Fluoreszenz pro optischer Dichte. Pichia pastoris wurde in einem Medium gezüchtet, das 1 % oder 5 % Glucose zum Zeitpunkt der Impfung enthielt. Die erhaltenen Fluores-zenzlevel (Mittelwerte aus drei Messungen) wurden bis zur optischen Dichte des jeweiligen Stammes (Mittelwerte aus zwei Messungen) zu gegebenen Zeitpunkten normalisiert, was somit die Enzymmenge pro Zelle widerspiegelt. Die Ansammlung und der Abbau des Proteinkomplexes fanden in der gleichen Geschwindigkeit unter der Kontrolle des alternativen Oxidasepromotors statt, unabhängig von der anfänglichen Glucosekonzentration. Das Fusionsprotein sammelte sich bei Verwendung des konstitutiven GAP-Promotors stetig an. Die Fluoreszenzspitze ungefähr zum Zeitpunkt der Glucoseabreicherung spiegelt eine für den GAP-Promotor charakterisistische Expression wieder.
Fig. 5 veranschaulicht die relativen Raten des Sauerstoffverbrauchs (die respiratorische Aktivität vor der Zugabe jeglichen Inhibitors wurde als 100 % definiert). Der Kontrollstamm X-33 zeigte einen niedrigen CRR-Level, SHAM beeinflusste die respiratorische Aktivität nicht. Der Stamm, der die alternative Oxidase überexprimiert (X-33 PpAOD), wurde weder durch Cyanid, noch durch SHAM beeinflusst. Beide respiratorischen Systeme konnten die gesamte respiratorische Aktivität aufrecht erhalten. Die Disruption des alternativen Oxidasegens führte zu einer Beeinträchtigung der CRR. Messungen des X-33- und des X-33-PpAOD-Stammes wurden im Triplikat durchgeführt, Messungen des X-33APpAOD-Stammes im Duplikat. Die berichteten Werte stellen Mittelwerte dar, Fehlerbalken Standardabweichungen.
Fig. 6 zeigt die Schüttelkolbenkulturen von X-33, X-33 PpAOD und X-33 APpAOD in Medien bei verschiedenen Glucosekonzentrationen. A: BMD1 %. B: BMD5 %. Die Überexpression der alternativen Oxidase resultierte in einer geringeren finalen optischen Dichte des rekombinanten Stamms. Das Wachstumsverhalten war zu den beiden anderen Stämmen unterschiedlich, gekennzeichnet durch eine Unterbrechung in der exponentiellen Wachstumsphase. Dieser Stamm trat früher in die stationäre Wachstumsphase ein als der Kontroll- oder der X-33-APpAOD-Stamm. Nach Erreichen der stationären Wachstumsphase nahm die optische Dichte des X-33-APpAOD-Stammes im Vergleich zum Kontrollstamm ab. Während die Überexpression der alternativen Oxidase in einer erhöhten Ethanolproduktion resultierte, produzierte der Stamm X-33 APpAOD die niedrigste Menge an Ethanol. Die höchsten gemessenen Etha-nolkon-zentrationen für jeden Stamm sind auch in Tabelle 1 angeführt.
Fig. 7 zeigt die Bewertung der Zelltod-Phänomene, die mit der Überexpression oder der Disruption der alternativen Oxidase der Pichia pastoris in Verbindung stehen. A: Prozentsatz der Zellen, die Rhodamin-vermittelte Fluoreszenz zeigen. B: Prozentsatz der Tunel-positiven Zellen. Disruption sowie Überexpression der alternativen Oxidase führten zu einem vermehrten Auftreten von apoptotischen Markern. Die genannten Werte sind Mittelwerte aus zumindest vier Bildern pro Zeitpunkt von zwei unabhängigen Objektträgern („slides“), Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen dar. 1 0 AT 504 588 B1
Fig. 8 zeigt die Nukleinsäure-Promotoren und Fragmente und Varianten davon, wie hier geof-fenbart. BEISPIELE:
Die Expression der alternativen Oxidase bei Pichia pastoris wurde analysiert, um die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Promotors, durch variierende Glucosekonzentrationen kontrolliert zu werden, zu zeigen. Die Aktivität der alternativen Oxidase wurde mit einer Clark-Elektrode während der Übergangsphase zwischen dem exponentiellen und stationären Wachstum ohne Vorbehandlung der Zellen mit einem Induktor gemessen. Ein GFP-Fusionsprotein wurde erfolgreich für die Charakterisierung des Zeitverlaufs der Expression der alternativen Oxidase bei Pichia pastoris angewandt. Die Deregulation der alternativen Atmung entweder durch Überexpression oder Disruption des alternativen Oxidasegens beeinflusste die Biomasseausbeute und die Zelllebensfähigkeit negativ, wohingegen die Wachstumsraten und die Glucoseaufnahmeraten schwach erhöht wurden.
Stämme und Medien
Pichia pastoris X-33 (Invitrogen, USA) wurde als Plattformstamm für alle konstruierten Pichia-Stämme verwendet. E. coli XL-1 blue (Stratagene, USA) wurde für alle Klonierungsverfahren von E. coli benützt. Alle Komponenten für E.-Coli-Medien wurden von der Carl Roth GmbH (Deutschland) erworben, alle Komponenten für Pichia-pastoris-Medien von Becton, Dickinson and Company (USA). Medien und elektro-kompetente Pichia-pastoris-Zellen wurden gemäß dem „Pichia Expression Kit“-manual (Invitrogen) präpariert.
Von InvivoGen (USA) erworbenes Zeocin wurde Agarplatten zur Selektion zugegeben (100 pg ml'1 für Pichia pastoris und 25 mg ml'1 für E. coli). Ampicillin (Sigma-Aldrich, Österreich) wurde den E.-coli-Medien zu einer Endkonzentration von 100 pg ml'1 zugegeben.
Beispiel 1: Klonierung, Isolierung und Herstellung der DNA
Die Standardverfahren der Molekularbiologie wurden gemäß Ausubel et al. (2006, Current protocols in Molecular Biology) durchgeführt. Genomische DNA aus Pichia pastoris wurde gemäß „Easy-DNA™ Kit“ (Invitrogen) hergestellt. Plasmid-DNA und PCR-Produkte wurden mit dem „Wizard® Plus SV Minipreps“-Kit bzw. „Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System“-Kit von Promega GmbH (Deutschland) hergestellt und gereinigt. Alle Restriktionsenzyme und die T4-DNA-Ligase wurden von der MBI Fermentes GmbH (Deutschland) erworben. PCR-Reaktionen wurde mit „Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase" von Finnzymes (Finnland) gemäß dem zur Verfügung gestellten Handbuch in einem GeneAmp® PCR System 2700 von Applied Biosystems (USA) durchgeführt. Alle Überhangsverlängerungs-PCR-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt:
Eine 50-pl-PCR-Reaktionsmischung ohne Primer wurde hergestellt. Diese Lösung enthielt die Matrizen mit den überlappenden Regionen bei equimolaren Konzentrationen. Ein 35-Zyklen-PCR-Programm wurde gemäß den Spezifikationen der angewandten Polymerase entwickelt. Die Anlagerungszeit („annealing time“) wurde so festgelegt, dass die zum Tm der überlappenden Regionen und zum Tm der Primer passte. Die Verlängerungszeit wurde für die Amplifikation des Produkts der ganzen Länge festgelegt. Nach 10-12 Zyklen wurden 10 pl einer Mischung enthaltend die Primer (0,2 pMol pl'1 Endkonzentration) , Puffer, Polymerase und dNTPs, der PCR-Reaktion zugegeben und die finalen Zyklen durchgeführt.
Beispiel 2: Amplifikation und Klonierung des alternativen Oxidasegens der Pichia pastoris 1 1 AT 504 588 B1
Der offene Leserahmen des Pichia-pastoris-AOD-Gens wurde durch PCR aus der genomischen DNA vom Stamm X33 mit den Primern 5'-cagaattcaaaacaatgttaaaactgtacgcaataagg-3’ (EcoRI-PpAOD-f; SEQ ID Nr. 16) und 5'-cagaattcactcgagtttataaaacgagctcatctctttccc-3' (Xhol-PpAOD-r; SEQ ID Nr. 17) amplifiziert. Das Stopkodon des Gens wurde von TGA auf TAA verändert. Das Gen wurde in den pGAPZ-A-Vektor von Invitrogen über die Restriktionsstellen EcoRI und Xhol kloniert. Das resultierende Plasmid pGAPZ-A(PpAOD) wurde in E. coli XL-1 blue transformiert. Die Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung kontrolliert. Dieses Konstrukt wurde für die konstitutive Expression von AOD in Pichia pastoris verwendet.
Beispiel 3: Konstruktion der Disruptionskassette der alternativen Oxidase
Die AOD-Disruptionskassette wurde durch Überhangverlängerungs-PCR konstruiert. Die Zeo-cin-Resistenzkassette aus pGAPZ-A wurde anhand der Primer 5'-gttcggattgatgcgtagtctcagggcccacacaccatagcttcaaaatg-3' (TefZeo1-f; SEQ ID Nr. 18) und 5'-ggtagtgtaagtatacacagcttcctcagtcc tgctcctcggccacg-3' (TefZeo2-r; SEQ ID Nr. 19) amplifiziert. Eine 5'-flankierende Region (die 5' 374bp des AOD-Gens) wurde aus der genomischen DNA mit den Primern 5'-ctcaaagatgttaaaactgtacgcaataaggcc-3' (PpAOD-atg-f; SEQ ID Nr. 20) und 5'-cattttgaagctatggtgtgtgggccctgagactacgcatcaatccgaac-3' (TefZeo1-r; SEQ ID Nr. 21) amplifiziert. Eine 3'-flankierende Region bestehend aus dem 3' 328bp des alternativen Oxidasegens und zusätzlichen 145bp downstream vom Stopkodon wurde mit den Primern 5'-cgtggccgaggagcaggactgaggaagctgtgtatacttacactacc-3' (TefZeo2-f; SEQ ID Nr. 22) und 5'-tagttgacgttcgcggacatag-3' (PpAOD-Ä-r; SEQ ID Nr. 23) amplifiziert. Die TefZeo-Primer hatten Komplementärsequenzen und wurden zur Einführung von homologen Regionen für die folgende Überhangsverlängerungs-PCR mit den drei PCR-Produkten verwendet. Die zwei äußeren Primer 5'-ctcaaagatgttaaaactgtacgcaataaggcc-3' (PpAOD-atg-f (SEQ ID Nr. 24) und 5'-tagttgacgttcgcggacatag-3' (PpAOD-A-r; SEQ ID Nr. 25) wurde nach Zyklus 10 zugegeben, um die Amplifikation des Produkts in voller Größe zu ermöglichen. Die Gel-Elektrophorese zeigte ein Produkt von 1701 bp. Das gereinigte Produkt wurde in das Plasmid pCR®4Blunt-TOPO™ gemäß dem Handbuch „"Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit for Sequencing“ (Invitrogen) (Shuman, S., Proc. Natl. Acad. Sei USA 88 (1991): 10104-10108; Shuman, S., J. Biol. Chem. 269 (1994):32678-32684) kloniert und in E. coli transformiert. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung kontrolliert.
Beispiel 4: Konstruktion einer PpAOD-GFP-Fusion
Das alternative Oxidasegen wurde aus dem Plasmid pGAPZ-A(PpAOD) mit den Primern 5'-cagaattcaaaacaatgttaaaactgtacgcaataagg-3’ (EcoRI-PpAOD-f; SEQ ID Nr. 26) und 5'-agcacccaacaactttggatcaacagcagcagctaaaacgagctcatctctttccc-3' (Linker-PpAOD-r; SEQ ID Nr. 27) amplifiziert. Der zweite Primer enthielt zusätzliche 33 Basen, die für eine 11-Aminosäure-Linkerregion kodieren, und wurde auch zum Löschen des Stopkodons des alternativen Oxidasegens verwendet. Das für GFP kodierende Gen wurde mit den Primern 5'-gctgctgctgttgatccaaagttgttgggtgctatggctagcaaaggagaagaac-3' (Linker-GFP-f; SEQ ID Nr. 28) und 5'-cactcgagtttaatccatgccatgtgtaatccc-3' (wtGFP-Xhol-r; SEQ ID Nr. 29) amplifiziert. Die beiden PCR-Produkte fanden in einer Überhangsverlängerungs-Reaktion Verwendung. Schließlich wurde das Gesamtlängenprodukt gereinigt und über EcoRI und Xhol in ein pGAPZ-A kloniert. Das resultierende Plasmid pGAPZ-A(PpAOD-GFP) für die konstitutive Expression der AOD-GFP-Fusion in Pichia pastoris wurde aus E.-coli-Transformanten isoliert und sequenziert. Für die Integration hinter dem nativen AOD-Promotor wurde die PpAOD-GFP-Integrationskassette aus diesem Plasmid unter Verwendung der Primer 5'-cgttggttacttagaggaggaagctg-3' (PpAOD-infor; SEQ ID Nr. 30) und 5'- agcttgcaaattaaagccttcgagc-3' (Cyc1TT-r; SEQ ID Nr. 31) amplifiziert. Der Primer PpAOD-infor befindet sich innerhalb des ORF des AOD-Gens. Der Cyc1TT-r-Primer bindet an das Ende des CYC1-Transkriptionsterminators des Vektors pGAPZ-A. 1 2 AT 504 588 B1
Beispiel 5: Analyse der Sequenz des alternativen Oxidasegens
Die Nukleotidsequenz des alternativen Oxidasegens der Pichia pastoris wurde gemäß Claras and Vincenc (Eur J Biochem, 241 (1996): 779-786) für mitochondriale Targeting-Sequenzen analysiert, die Proteinparameter wurden, wie von Gasteiger et al. (2005) beschrieben, analysiert. Die hergeleitete Aminosäuresequenz des ORF wurde für eine Ausrichtung mit anderen bekannten Sequenzen der alternativen Oxidasen aus 3 Hefen, 3 Pilzen und 2 Pflanzen anhand von ClustalW (Thompson, J.D., et al., Nucleic Acids Res, 22(22) (1994): 4673-80) verwendet.
Beispiel 6: Transformation von Pichia pastoris
Eine Transformation von Pichia pastoris und E. coli wurde durch Elektroporation gemäß den „Electrocomp Kits (Version G)“ von Invitrogen mit einem Gene-Pulser und Gene-Pulser-Küvetten 0,2 cm von Bio-Rad Laboratories (Österreich) durchgeführt. Die Plasmide pGAPZ-A(PpAOD) und pGAPZ-A(PpAOD-GFP) wurden mit Avril (XmaJI; Blnl) vor der Transformation linearisiert, um die Integration in den GAP-Locus zu vereinfachen. Die AOD-Disruption und PpAOD-GFP-lntegrationskassetten wurden durch PCR amplifiziert, gereinigt und direkt für die Transformation verwendet. Die Integration von pGAPZ-A(PpAOD) und die Disruption des AOD-Gens wurden durch Messungen der Kolonie-PCR und des Sauerstoffverbrauchs bestätigt. Die resultierenden Stämme wurden X33 PpAOD (der die alternative Oxidase überexprimierende Stamm) bzw. X33 APpAOD (der Stamm mit der zerstörten alternativen Oxidase), X33 PpAOD-GFP (P-GAP) (der Stamm, der das PpAOD-GFP-Konstrukt unter Kontrolle des konstitutiven GAP-Promotors überexprimiert) bzw. X33-PpAOD-GFP(P-AOD) (der Stamm, der das PpAOD-GFP-Konstrukt unter der Kontrolle des nativen alternativen Oxidasepromotors exprimiert) genannt.
Beispiel 7: Schüttelkolbenkulturen von Pichia-pastoris-Stämmen 50 ml gepufferte Minimalmedien enthaltend 1 % bzw. 5 % Glucose (BMD1% oder BMD5%), in 250 ml Umlenk-Schüttelkolben mit weitem Hals mit Übernacht-Kulturen zu einer optischen Dichte von OD600~0,1 geimpft. Die optischen Dichten wurden bei 600 nm gegen Minimalmedien auf einem Beckman Coulter Conter DU®800 (Beckman Coulter Inc., USA) gemessen. Die Kulturen wurden bei 28°C und 80 % relativer Feuchtigkeit unter konstantem Schütteln (140 Umdrehungen/min) in einem Infors Multitron II Shaker (Infors AG; Schweiz) inkubiert. Pichia pastoris X-33 wurde für Induktionsexperimente verwendet, um den Zeitablauf der Aktivität der alternativen Oxidase nach der Induktion mit Antimycin A (Sigma-Aldrich) zu studieren. Der Stamm wurde in BMD2% gezüchtet, bis eine optische Dichte zwischen 3 und 4 erreicht war. Antimycin A wurde dann den exponentiell wachsenden Kulturen zu einer Endkonzentration von 10 pg/ml"1 zugegeben. Die Stämme X-33, X33 APpAOD und X33 PpAOD wurden gezüchtet, um die Effekte einer Überexpression und Disruption der alternativen Oxidase auf das Wachstumsverhalten und die Lebensfähigkeit von Pichia pastoris zu studieren. Die Stämme X-33, X33 PpAOD-GFP(P-AOD) und X33 PpAOD-GFP(P-GAP) wurden gezüchtet, um die Regulation der Expression der alternativen Oxidase zu untersuchen. Der Expression und dem Abbau des Proteins folgten Fluoreszenzmessungen. Die Werte der Hintergrundfluoreszenz der nicht transformierten Pichia pastoris X-33 wurden von den Werten der X33 PpAOD-GFP (P-AOD) und X33 PpAOD-GFP(P-GAP) subtrahiert. Die Differenzen in der optischen Dichte der Kulturen zu gegebenen Zeitpunkten waren vernachlässigbar und wurden deshalb nicht in Betracht gezogen. Alle Schüttelkolbenexperimente wurden im Duplikat durchgeführt.
Beispiel 8: Probenherstellung und -messungen 1-ml-Proben wurden aus den Schüttelkolbenkulturen zu vorgegebenen Zeitpunkten genommen. Nach dem Zentrifugieren für 1 Minute bei 13200 Umdrehungen/min in einer Eppendorf 5415R-Zentrifuge bei 4°C wurden Ethanol- und Glucosekonzentrationen im Überstand bestimmt. Glucose- und Ethanolkonzentrationen wurden in den Medien mit der "Glucose UV Hexokinase 1 3 AT 504 588 B1
Method" (DIPROmed, Österreich) bzw. der "Ethanol UV Method" (Hoffmann-La Roche, Schweiz) gemessen. Beide Protokolle wurden auf ein Gesamtvolumen von 200 μΙ herunterskaliert, um Messungen mit einem SPECTRAmax Plus384 Plattenleser (Molecular Devices, Deutschland) in UV-Mikroplatten (Greiner Bio-One GmbH, Deutschland) zu ermöglichen. Die Glucoseabreicherung in den Medien während der Zellzüchtung wurde als die Glucoseaufnahmerate (qS) der Zellen definiert. Die GFP-Messungen wurden in schwarzen Mikrotiterplatten von Greiner Bio-One enthaltend 200 μΙ Zellen pro Well mit einem SPECTRAmax® Gemini XS Spectrofluorometer von Molecular Devices durchgeführt. Die Fluoreszenz wurde bei 507 nm gemessen, die Wellenlänge der Erregung war 395 nm und der Ausschlussfilter wurde auf 495 nm eingestellt. Alle Messungen und die entsprechenden Kalibrierungskurven wurden mindestens im Duplikat durchgeführt.
Beispiel 9: Messungen des Sauerstoffverbrauchs Für Messungen des Sauerstoffverbrauchs der Proben aus dem Induktionsexperiment mit Anti-mycin A wurden Zellen zu einer OD600 zwischen 3 und 4 in BMC2% gezüchtet. Dann wurden 200 μΙ der Zelllösung für die Messungen des Sauerstoffverbrauchs in einem Gesamtvolumen von 1 ml verwendet. Das Volumen wurde mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH=6) eingestellt.
Die erfolgreiche Überexpression und Disruption des alternativen Oxidasegens der Pichia pasto-ris wurde auch durch die Messungen des Sauerstoffverbrauchs mit einem Clark electrode Dual Digital Model 20 von Rank Brothers Ltd. (Bottisham, UK) funktionell verifiziert. Der Einfluss der Überexpression oder der Disruption des alternativen Oxidasegens auf die respiratorische Aktivität wurde durch die Zugabe von Kaliumcyanid (KCN) oder Salicylhydroxamin-Säure (SHAM) zu einer Endkonzentration von 2 mM gemessen. KCN wurde von Sigma-Aldrich erworben, SHAM von Fluka. Beide Chemikalien wurden für alle Messungen frisch hergestellt. SHAM wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Roth) aufgelöst, KCN in Wasser mit einem auf 10,5 eingestellten pH. Die Messungen der X-33- und der X-33-PpAOD-Stämme wurden im Triplikat durchgeführt, Messungen des ÄPpAOD-Stamms im Duplikat.
Beispiel 10: Tests für apoptotische Marker
Der TdT-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL)-Test wurde angewandt, um die Effekte einer Überexpression und Disruption des alternativen Oxidasegens auf die Zelllebensfähigkeit der rekombinanten Stämme durch die Untersuchung von apoptotischen Phänomenen mit dem „In Situ Cell Death Detection Kit, POD“ (Roche Diagnostics GmbH) zu bestimmen. Diese Methode erkennt apoptotische Zellen in situ anhand der terminalen Desoxynucleotidyl-Transferase(TdT), um Biotin-dUTP zu den Strangunterbrechungen der DNA zu transferieren. Die Biotin-markierten Spaltungsstellen wurden dann mit einer Farbreaktion detektiert. Di-hydrorhodamin 123 (Sigma-Aldrich) wurde verwendet, um die freien intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezien (ROS) zu detektieren. Die Zellen wurden wie zuvor beschrieben behandelt. Die Gesamtzahl der Zellen und die Anzahl der Zellen, die pro Bild ein positives Signal geben, wurde gezählt und zur Berechnung des Prozentsatzes jener Zellen verwendet, die Anzeichen der ROS-Akkumulation zeigen. Zumindest vier Bilder pro Stamm und Zeitpunkt wurden aus zwei unabhängigen Objektträgern („slides“) für die Berechnungen herangezogen.
Beispiel 11: Induktion der alternativen Oxidase von Pichia pastoris mit Antimycin A
Die Zugabe von Antimycin A zu einer exponentiell wachsenden Kultur von Pichia pastoris X-33 führte zu einer Wachstumsbeeinträchtigung. Die Raten des Sauerstoffverbrauchs in Fig. 1 veranschaulichen den Zeitablauf der Aktivität der alternativen Oxidase während des logarithmi-schem Zellwachstums. Die Cyanidunempfindliche Atmung stieg nach der Zugabe von Antimycin A rapide an und das Zellwachstum war nach 2 h zur Gänze wiederhergestellt. Die Zugabe von SHAM zur Kontrolle übte praktisch keinen Effekt auf die respiratorische Aktivität aus. Ein kleiner Beitrag der alternativen Oxidase zur gesamten respiratorischen Aktivität der Zelle konnte nach 14 AT 504 588 B1 der Zugabe von KCN beobachtet werden, welches den Sauerstoffverbrauch des Kontrollstam-mes nicht völlig inhibierte. Ein Basislevel der alternativen Atmung wurde sowohl im unbehandelten Kontrollstamm als auch in der inhibierten Kultur sofort nach der Zugabe von Antimycin A beobachtet, was bedeutet, dass zumindest eine kleine Menge des aktiven Enzyms während des exponentiellen Wachstums von Pichia pastoris auf Glucose beobachtet wurde.
Beispiel 12: Klonierung und Sequenzanalyse des alternativen Oxidasegens der Pichia pastoris
Die hergeleiteten Aminosäuresequenzen des alternativen Oxidasegens der Candida albicans AOX1 (AF031229), AOX2 (AF116872) und des Pichia-stipitis-SHAM-empfindlichen terminalen Oxidase-(ST01)-Gens (AY004212) wurden an Integrated Genomics zur Suche nach Homologen in der vorläufigen Genomsequenz von Pichia pastoris IG66 geschickt. Eine BLAST-Suche lieferte Übereinstimmungen für alle drei Anfragen in derselben Contig (contig3604). Contig3604 wurde auf putative offene Leserahmen untersucht, wobei ein ORF gefunden wurde, der hohe Sequenzähnlichkeit zur gesamten Kodierungsregion anderer alternativen Oxidasen zeigte. Der offene Leserahmen wurde aus der genomischen DNA von Pichia pastoris X33 durch PCR, wie in Materialien und Methoden beschrieben, amplifiziert. Das resultierende PCR-Produkt wurde direkt sequenziert und es wurde befunden, dass es mit der Kodierungssequenz in contig3604 der Genomsequenz von Pichia pastoris absolut ident ist.
Der nicht unterbrochene alternative Oxidase-ORF (AOD) aus Pichia pastoris hatte eine Länge von 1089 Nukleotiden. Die Nukleotidsequenz wurde in der GenBank-Datenbank mit der Hinter-legungsnr. DQ465985 hinterlegt. Die translatierte Proteinsequenz besteht aus 362 Aminosäuren und enthält die typischerweise hochkonservierten Regionen NERMHL, LEEEA und RA-DEA.H. Die Ausrichtung von multiplen Proteinsequenzen der alternativen Oxidase von Pichia pastoris mit Sequenzen aus anderen Hefen, Pilzen und Pflanzen zeigte eine signifikante Identität im C-terminalen Teil (Fig. 2), wohingegen der N-terminale Teil eine sehr geringe Identität aufwies, was aller Wahrscheinlichkeit nach auf die degenerierte Natur der mitochondrialen Targeting-Sequenzen zurückzuführen ist. Das Protein hat ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 41833Da. Eine vorhergesagte spaltbare mitochondriale Targeting-Sequenz besteht aus den ersten 26 N-terminalen Aminosäuren. Deshalb hat das prozessierte Protein ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 38776Da.
Reporter-Fusionsproteine wurden mit großem Erfolg angewandt, um die Expression und Lokalisierung von Proteinen zu studieren. Um das vorhergesagte Targeting der alternativen Oxidase in die Mitochondrien zu verifizieren, wurde ein Fusionsprotein konstruiert, wobei das grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) C-terminal mit der alternativen Oxidase verbunden wird. Diese AOD-GFP-Fusion wurde mit Hilfe des starken konstitutiven GAP-Promotors exprimiert. Die Fluoreszenz-Mikroskopie der resultierenden Transformanten enthüllte lokale GFP-Fluoreszenz, wie es für gewöhnlich bei einer typischen mitochondrialen Lokalisierung des grünen Fluoreszenz-Proteins von Hefe auf den Mitochondrien beobachtet wird. Die Messungen der Raten des Sauerstoffverbrauchs des Stammes X-33 PpAOD-GFP(P-GAP) zeigten, dass der Alternative-Oxidase-Teil des Fusionsproteins völlig funktionell ist. Die Ergebnisse sind jenen des X-33-PpAOD-Stammes ähnlich, der die alternative Oxidase von Pichia pastoris konstitutiv überexprimiert.
Beispiel 13: Expressionsanalyse von AOD-GFB-Fusionen GFP wurde auch als ein Reporter angewandt, um den Zeitablauf und den Expressionslevel der alternativen Oxidase von Pichia pastoris unter den Standardlaborbedingungen in Schüttelkolbenkulturen zu verfolgen. Das Fusionsprotein wurde sowohl unter Kontrolle des nativen alternativen Oxidasepromotors von Pichia pastoris als auch des PGAP exprimiert. Die Fluoreszenz wurde zu gegebenen Zeitpunkten gemessen und mit den Daten verglichen, die von der untrans-formierten Pichia pastoris X33 erhalten wurden. Die resultierenden Fluoreszenz-Kurven verlie- 1 5 AT 504 588 B1 fen mit den Wachstumskurven fast parallel bis zum Punkt der vollständigen Glucoseabreicherung in den Medien (Fig. 3), was wiederum auf einen niedrigen Expressionslevel des Enzyms in Anwesenheit von Glucose hindeutet. Sogar nach der Normalisierung der Fluoreszenzwerte durch die optische Dichte von Pichia pastoris X33-PpAOD-GFP(P-AOD) konnte mit der Zeit eine steigende Menge des AOD-GFP-Enzyms in den Zellen beobachtet werden (Fig. 4); zumindest solange die Glucose nicht abgereichert war. Überraschenderweise nahm die Fluoreszenz nach der Abreicherung der Kohlenstoffquelle sehr rapide ab. Dies führte zu zwei möglichen Erklärungen. Die Expression der alternativen Oxidase wurde durch Glucose induziert und auf einem konstanten Level gehalten. Somit akkumulierte sich das Enzym in den Mitochondrien, bis es nach der Glucoseabreicherung im Medium zum Stop der Transkription des alternativen Oxidasegens kam und der Abbau des Enzyms einsetzte. Da es laut dem berechneten Instabilitätsindex des bearbeiteten Proteins (41.40), wie durch die Algorithmen von Gasteiger et al. bestimmt, als instabil klassifiziert ist, ist es wahrscheinlich, dass das Enzym einem permanenten Abbau ausgesetzt ist, der erst nach dem Niederregulieren der Transkription sichtbar wurde. Das impliziert weiters, dass der Expressionslevel des Enzyms während des Wachstums auf Glucose konstant anstieg. Ansonsten kann die Akkumulation des AOD-GFP-Fusionsproteins nur durch einen Anstieg der Mitochondrien erklärt werden, die eine höhere Wirtskapazität für das Fusionsprotein schaffen. Jeder der beiden Fälle hob eine exakte Regulation der Expression der alternativen Oxidase auf einem transkriptionellen Level hervor. Die Zugabe von Methanol (1 % Endkonzentration) zur Kultur mit 5 % anfänglicher Glucosekonzentration 70 Stunden nach der Impfung induzierte keine Expression der alternativen Oxidase. Die steigende optische Dichte der Kulturen bestätigte die Verwendung von Methanol als Kohlenstoffquelle, jedoch wurde keine Fluoreszenz gemessen.
Die Expression des Fusionsproteins unter Kontrolle des GAP-Promotors wurde auch für 5 % Glucose durchgeführt. Dies führte zu einem konstanten Anstieg der Fluoreszenz bis zu 80 h der Züchtungszeit. Es wird deshalb angenommen, dass die alternative Oxidase permanent abgebaut werden muss und die Expression auf dem Level der Transkription kontrolliert wird. Interessanterweise wurde ein Fluoreszenzanstieg zum Zeitpunkt des Substratabbaus während der durch PGAP-erzwungenen Expression sichtbar. Das ist ein Merkmal dieses „konstitutiven“ Promotors, das im Laboratorium in mehreren Fällen zuvor beobachtet wurde. Nach der Glucoseabreicherung erhöhte sich die durch diesen Promotor vermittelte Expression, was zu einer steileren Neigung in der jeweiligen Produktkurve für kurze Zeit, üblicherweise zwei Verdoppelungszeiten, führte. Das ist ein Kennzeichen des GAP-Promotors, der perfekt zu den Strategien einer ständigen Proteinproduktion passt, bei der ein Teil der Kultur wiederholt durch frisches Medium ersetzt wird.
Beispiel 14: Konstitutive Expression und Disruption des AOD-Gens
Die Anwendung von Messungen des Sauerstoffverbrauchs, die konstitutive Expression der funktionellen alternativen Oxidase bzw. ihre Disruption wurden gezeigt. Die relativen Atmungsraten (nicht-inhibierte Atmung gilt als 100 %) der rekombinanten Stämme und des Kontroll-stammes sind in Fig. 5 gezeigt. Der starke inhibitorische Effekt von KCN auf die Atmung des Kontrollstammes Pichia pastoris X-33 zeigte eine marginale, jedoch messbare Bindung der alternativen Oxidase an die Atmung während des Wachsens auf Glucose. Der Effekt von SHAM auf die gesamte Atmungsrate war vernachlässigbar und ist somit ein weiterer Beweis dafür, dass eine geringe Aktivität der alternativen Oxidase nicht signifikant zur gesamten Atmung während des logarithmischen Zellwachstums auf Glucose beiträgt. Der Disruptionsstamm X-33-AAOD war nicht zur Cyanid-unempfindlichen Atmung fähig und folglich beeinflusste die Zugabe von SHAM die respiratorische Aktivität nicht. Da die Disruption eines einzelnen Gens die Cyanid-resistente Atmung bei Pichia pastoris aufhob, war es offensichtlich, dass ein einzelnes Gen die alternative Oxidase kodierte.
Die respiratorische Aktivität des überexprimierenden X-33-PpAOD-Stammes war durch keinen 16 AT 504 588 B1 der angewandten Inhibitoren beeinflussbar. Die KCN-Endkonzentration wurde auf 6 mM erhöht, ohne die gesamte respiratorische Aktivität des X-33-PpAOD-Stammes signifikant zu verändern. Auch Konzentrationen von 2 mM jeder der Inhibitoren SHAM und KCN waren nicht ausreichend, um die Atmung vollständig zu reprimieren. Somit war das konstitutiv überexprimierte alternative respiratorische System fähig, die gesamte respiratorische Aktivität unter Bedingungen zu erhalten, unter welchen die Atmung des nicht-transformierten Pichia-pastoris-Stammes zur Gänze inhibiert wurde. Aufgrund eines Überexpressionseffekts war auch eine vollständige Inhibition durch SHAM kaum möglich. Die gesamte respiratorische Aktivität der rekombinanten Stämme vor der Zugabe der Inhibitoren wurde verglichen mit dem Kontrollstamm nicht wesentlich verändert. Es wurden aufgrund der eingeführten genetischen Veränderungen mit der Standard Transmitted Light Microscopy keine morphologischen Veränderungen beobachtet. Während des Wachstums glichen die konstruierten Zellen den Wildtyp-Zellen in Größe und Form.
Beispiel 15: Wachstumscharakteristika der Pichia-pastoris-Stämme mit deregulierter A OD-Expression Überraschenderweise waren die maximale Wachstumsrate (pmax) und die Substrat-Aufnahmerate (qS) des X33-PpAOD-Stammes leicht erhöht (Tabelle 1) . Das Wachstum des Stammes, der AOD konstitutiv exprimiert, wurde während der logarithmischen Phase verlangsamt und trat früher in die stationäre Wachstumsphase ein, da auch Glucose in dieser Kultur früher aufgebraucht war als von den beiden anderen Stämmen (Fig. 6). Das ähnliche Wachstumsverhalten zwischen dem Kontrollstamm X33 und X-33APpAOD in dieser Wachstumsphase, wies darauf hin, dass dieses Phänomen ein durch AOD-Überexpression hervorgerufener spezifischer Effekt ist. Die Biomasseausbeute fiel aufgrund von konstitutiver und zerstörter Aktivität der alternativen Oxidase bei geringen und hohen Glucosekonzentrationen (Fig. 6) niedriger aus. Der AOD-Disruptionsstamm zeigte nur geringe Abweichungen vom Kontrollstamm hinsichtlich der finalen optischen Dichte bei 1 % Glucose, wohingegen die Differenz bei 5 % Glucose stärker war. Da pmax und qS gegenüber den Wildtyp-Werten nicht signifikant verändert waren, konnte die Varianz der Endbiomasse, die indirekt durch die optische Dichte bestimmt wurde, diesen physiologischen Parametern nicht zugeschrieben werden. Weiteres traten die Unterschiede in einer späteren Wachstumsphase ein als jene, die beim X33-PpAOD-Stamm beobachtet wurden. Dank der Literatur, die die Aktivität der alternativen Oxidase mit der Stressantwort und somit mit der Zelllebensfähigkeit in Verbindung sieht, wird das erhöhte Zelltod-Phänomen als mögliche Erklärung für diese Diskrepanz erachtet.
Zusätzlich zu den beobachteten Änderungen im Wachstumsverhalten, führte die Überexpression der alternativen Oxidase auch zu einer erhöhten Ethanolproduktion, eine Disruption des Gens hingegen zu niedrigeren Ethanolkonzentrationen. Auch diese Unterschiede fielen in den Experimenten mit einer höheren Glucosekonzentration stärker aus.
Beispiel 16: von der alternativen Oxidase abhängige Zelltod-Phänomene
Reaktive Sauerstoffspezien (ROS) werden in jedem Orgasmus gebildet, der molekularem Sauerstoff ausgesetzt ist und sind die Initiatoren von Apoptose. Es wurde beschrieben, dass zumindest die Überexpression der alternativen Oxidase bei Pflanzen die intrazellulären ROS-Konzentrationen reduziert. Verringerte Expression führte zu ROS-Akkumulation. ROS-Akkumulation und Induktion von Apoptose nach Disruption des alternativen Oxidasegens bei Pichia pastoris war somit erwartet. Folglich sollte eine Überexpression der alternativen Oxidase die respiratorische ROS-Produktion senken und die Zelllebensfähigkeit begünstigen. Um diese Hypothese zu testen, wurde nicht-fluoreszierendes Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) verwendet, das intrazellulär durch ROS zu dem fluoreszierenden Rhodamin 123 (Rh 123) oxidiert wird, um den Effekt der Aktivität der alternativen Oxidase auf die ROS-Produktion zu untersuchen. Darüber hinaus wurde die Fraktion der apoptotischen Zellen in flüssigen Kulturen anhand des Tunel-Tests bestimmt, der den Abbau von genomischer DNA, einem typischen Kennzeichen von Apoptose, verfolgt. Bei einer Glucosekonzentration von 1 % in den Kulturmedien wurden 1 7 AT 504 588 B1 weder statistisch relevante, Rh-123-vermittelte Fluoreszenz, noch apoptotische Zellen mit dem Tunel-Test gefunden. Diese Resultate entsprachen den früheren Ergebnissen von Weis et al. (FEMS Yeast Res 5 (2004) :179-189), welche berichteten, dass 1 % die optimale Glucosekonzentration für die Minimierung des Zelltod-Phänomens bei Pichia pastoris in Schüttelkolben-und Deep-Well-Plattenkulturen ist.
In Medien, die 5 % Glucose enthalten, waren die ROS-Produktion und die Fraktion der apopto-tischen Zellen bei beiden konstruierten Stämmen im Vergleich zum untransformierten Stamm X-33 (Fig. 7) erhöht. Während des ganzen Zeitverlaufs des Experiments führte die AOD-Disruption zu einer größeren Fraktion an apoptotischen Zellen und höheren ROS-Konzentration als ihre Überexpression. Nichtsdestotrotz hatten bei Pichia pastoris beide Extreme der deregulierten AOD-Expression offensichtlich negative Effekte. Beim zerstörten Stamm X-33-APpAOD war die ROS-Produktion bereits nach 15 h Wachstum erhöht. Im zerstörten Stamm X-33APpAOD und auch im Überexpressionsstamm steigerte nahm diese mit der Zeit zu, wohingegen die ROS-Produktion in der Kontrolle niedrig war. Für den Tunel-Test, der die apoptotischen Zellen aufzeigt, wurden erste Signale später als beim ROS-Test, d.h. nach 39 h Wachstum, gefunden. Obwohl sie den gleichen Trend wie die ROS-Akkumulation zeigen, sind die Unterschiede zwischen den analysierten Stämmen in den Resultaten des empfindlicheren Tunel-Tests stärker. Die außerordentlich hohe ROS-Konzentration vom letzten Messpunkt könnte ein Artefakt sein, dass durch eine größere Fraktion von falsch-positiven Signalen hervorgerufen wurde. Beide Lebensfähigkeitstests und deren Korrelation legten deutlich nahe, dass die alternative Oxidase bei der Verhinderung von ROS-Produktion und programmiertem Zelltod eine wichtige Rolle spielt. Jedoch gibt es auch negative Effekte aufgrund der Überexpression von alternativer Oxidase bei ihrer Disruption. Um für eine hohe Zelllebensfähigkeit optimal zu sein, muss die alternative Oxidase von Pichia pastoris in der richtigen Menge und exakt zum benötigten Zeitpunkt exprimiert werden.
Beispiel 17: Identifizierung des AOD-Promotors (pAOD)
Die hergeleiteten Aminosäuresequenzen des alternativen Oxidasegens der Candida albicans AOX1 (AF031229), AOX2 (AF116872) und des Pichia-stipitis-SHAM-empfindlichen terminalen Oxidase (STOI)-Gens (AY004212) wurden mit dem Contigs eines Genomsequenzierungsprojektes von Intergrated Genomics verglichen. Die Sequenzen wurden für Protein- vs. DNA-BLAST-Suchen in der Genomsequenz von Pichia Pastoris IG-66 verwendet. Die BLASTS lieferten den gleichen contig (contig3604) für alle drei Anfragen. Contig3604 wurde auf putative Kodierungssequenzen untersucht und einer BLASTX-Suche unterzogen. Eine Region zeigte hohe Identität mit den alternativen Oxidasen von mehreren Mikroorganismen. Primer wurden gemäß dieser Sequenz entworfen. Genomische DNA aus Pichia pastoris X-33 wurde als Matrize für eine PCR verwendet. Das resultierende PCR-Produkt wurde direkt sequenziert und es wurde befunden, dass es mit der Kodierungssequenz in contig3604 absolut ident ist.
Um die Promotorregion der neu identifizierten alternativen Oxidase zu bestimmen, wurde die Upstream-Region (ausgehend von ATG des alternativen Oxidasegens) sequenziert (-2000 nt).
Beispiel 18: Identifizierung eines funktionellen pAOD-Fragments
Um funktionelle pAOD-Fragmente zu identifizieren, wurden die Promotor-Varianten mit den SEQ ID Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14 und 15 mit GFP fusioniert, unter Verwendung geeigneter Primer, wie in Beispiel 4 beschrieben. Expressionsstudien, wie in Beispiel 13 durchgeführt, zeigten, dass alle klonierten pAOD-Fragmente zur Produktion von GFP unter denselben Bedingungen wie der native AOD-Promotor fähig sind. 1 8
Sequenzprotokoll <110> Technische Universität Graz
Forschungsholding TU Graz GmbH <120> Nucleic Acid Promoter <130> R 48022 <160> 31 <170> Patentin Version 3.3 <210> 1 <211> 2030
<212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 1 ctagttttca aaaccgaatc acgataaagg gccagtgaaa atgctaaaaa catgttgagc atcatcaaat tagcataaga tagatgatgc gatttgcctt tgcctcttcc ctgtgattcg caatatactt ctagcaaagc gagctgctca tttgtatcga tggggtatag tgattgggat acataggaaa aaagaaactt caataatcct aaagatatat tttttggaaa aagtggctgt aagtcactag gctgaattgg ctcgatccat agagtgaacg agtatgaaac atagtttgcg aacatatgtc ttaagttctt attgattatt tctaaatgtt cgcttttcat ttttgagact aaccattctt gtccctcttt agaaaataaa gaaaatgaac agtactcagc gaagaatgag tcgaagcact cggtctttcg atgagcaaac tggagagtgg catcggaaca gcttgtcttt ccatttgaag aaaatggggt aacctctctg gaaagaccat tcaactcctt ttggtcggtt ttcttattcg tactgggttg caaatgggca tcattctcgg cctgtgtaga gtcgctctca tcgtcatcgg tagtttcttc attgtgttga atacgtgaaa ctggtactac agagttagaa gagcctaact gcgtaacaag tgactcaatc attagttcca gccgctccaa tctgtcatcc acttcctttg acctttttgg cgaacttttc ttatctgtgg tccgtcgttt cttgacatgg ttatatgtac aggaagtttt gcaggaaata cagttattac acggctgttc tccgtcacat cgtactttct tcgaacggca gtagtcgcaa gccttggcta ccctttgacg tttggcttct gctctcttct cacgttttcc atttggcatt ctgttcagac aaatggtggc gcggggtgaa gggcatgtct cgcacaatgg gtctaggggt tcagatatat atgaaagcgc gaaagagaga gatcaaaggg cttcaggaac aataggaaac gagatgaagt gtcgtaaagt aagacatttg gcagaatgaa gggaaaagag ttatgctcca caataagtag agaccaggga tcgaacaaag actagggagt cattcgtcta caaataaccc aaagttcgca atatccgggc tatccgaaac ccatagggct atttgctctt tccgttcaat tccgaatatc aaacccggtc agaaacctaa tcactaaacg gtcgtacctt tctcccattt ttttcgcctg taagttaagg cgattttggg tgttgaagcc ataccgggta atttcgggcg ttcatcgaac tgagttcccc agaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctgaactact gggatactct gggtcttcat tgcgattgct tctaagctgc agtaggaact tcctaggttc aattgttctc tgcttcctca acaatcgatg aacaccgtca agactacagc ctcttagagc tttctaaaag ggttttggca atgtaatgtg acgttacgta 1 9 185 DNA Artifi cial
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EcoRl restriction site ttggtcggtt ttcttattcg tactgggttg gtcgctctca tcgtcatcgg tagtttcttc agagttagaa gagcctaact gcgtaacaag tctgtcatcc acttcctttg acctttttgg cttgacatgg ttatatgtac aggaagtttt tccgtcacat cgtactttct tcgaacggca tttggcttct gctctcttct cacgttttcc gcggggtgaa gggcatgtct cgcacaatgg gaaagagaga gatcaaaggg cttcaggaac aagacatttg gcagaatgaa gggaaaagag tcgaacaaag actagggagt cattcgtcta tatccgaaac ccatagggct atttgctctt agaaacctaa tcactaaacg gtcgtacctt cgattttggg tgttgaagcc ataccgggta agaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctgaactact tctaagctgc agtaggaact tcctaggttc aacaccgtca agactacagc ctcttagagc acgttacgta ctgcaccatc aggtcgcggt gaccagcagc cttgcctaga tcccccgatg accaacatgc ccacactcaa atcccgaaca cttcgttttt catgtccttg aggctattct tgtaataatc gctggaccgt ttcgatgcaa aaaccttaac aattaactct aaatggcatg ctttgacggg aaagtgactg cataggtaac cacttggcct gctctaatct attctcaaag 25 <220> <223> P-AOD_7 (2000nt), without <400> 14 ctagttttca aaaccgaatc acgataaagg atcatcaaat tagcataaga tagatgatgc caatatactt ctagcaaagc gagctgctca acataggaaa aaagaaactt caataatcct aagtcactag gctgaattgg ctcgatccat aacatatgtc ttaagttctt attgattatt aaccattctt gtccctcttt agaaaataaa tcgaagcact cggtctttcg atgagcaaac ccatttgaag aaaatggggt aacctctctg ttcttattcg tactgggttg caaatgggca tcgtcatcgg tagtttcttc attgtgttga gagcctaact gcgtaacaag tgactcaatc acttcctttg acctttttgg cgaacttttc ttatatgtac aggaagtttt gcaggaaata cgtactttct tcgaacggca gtagtcgcaa gctctcttct cacgttttcc atttggcatt gggcatgtct cgcacaatgg gtctaggggt gatcaaaggg cttcaggaac aataggaaac gcagaatgaa gggaaaagag ttatgctcca actagggagt cattcgtcta caaataaccc ccatagggct atttgctctt tccgttcaat tcactaaacg gtcgtacctt tctcccattt tgttgaagcc ataccgggta atttcgggcg aaaaaaaaaa ctgaactact gggatactct agtaggaact tcctaggttc aattgttctc agactacagc ctcttagagc tttctaaaag ctgcaccatc aggtcgcggt atcaacgctg cttgcctaga tcccccgatg gtcattgagg ccacactcaa atcccgaaca gaagttcagg catgtccttg aggctattct tactctctac gctggaccgt ttcgatgcaa ctcctcctaa aattaactct aaatggcatg aagacttacc aaagtgactg cataggtaac tggaggttta
EcoRI restriction site gccagtgaaa atgctaaaaa catgttgagc gatttgcctt tgcctcttcc ctgtgattcg tttgtatcga tggggtatag tgattgggat aaagatatat tttttggaaa aagtggctgt agagtgaacg agtatgaaac atagtttgcg tctaaatgtt cgcttttcat ttttgagact gaaaatgaac agtactcagc gaagaatgag tggagagtgg catcggaaca gcttgtcttt gaaagaccat tcaactcctt ttggtcggtt tcattctcgg cctgtgtaga gtcgctctca atacgtgaaa ctggtactac agagttagaa attagttcca gccgctccaa tctgtcatcc ttatctgtgg tccgtcgttt cttgacatgg cagttattac acggctgttc tccgtcacat gccttggcta ccctttgacg tttggcttct ctgttcagac aaatggtggc gcggggtgaa tcagatatat atgaaagcgc gaaagagaga gagatgaagt gtcgtaaagt aagacatttg caataagtag agaccaggga tcgaacaaag aaagttcgca atatccgggc tatccgaaac tccgaatatc aaacccggtc agaaacctaa ttttcgcctg taagttaagg cgattttggg ttcatcgaac tgagttcccc agaaaaaaaa gggtcttcat tgcgattgct tctaagctgc tgcttcctca acaatcgatg aacaccgtca ggttttggca atgtaatgtg acgttacgta gatcgtgaca gtgccatcat gaccagcagc tcgttacttt atgcaaaact accaacatgc tttctagagg ttcaccttca cttcgttttt ggtgtcggtt aacaacaacc tgtaataatc aactacatcg attgtagttc aaaccttaac ttccgtgata tcaaatcggc ctttgacggg taaactctct cttttccttt cacttggcct 26 gctctaatct attctcaaag <210> 15 <211> 64
<212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 15 actggaggtt tataaactct ctcttttcct ttcacttggc ctgctctaat ctattctcaa gatg <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <2 2 3> Primer <400> 16 cagaattcaa aacaatgtta aaactgtacg caataagg <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 cagaattcac tcgagtttat aaaacgagct catctctttc cc <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> Primer <400> 18 gttcggattg atgcgtagtc tcagggccca cacaccatag cttcaaaatg <210> 19 <211> 47 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer <400> 19 ggtagtgtaa gtatacacag cttcctcagt cctgctcctc ggccacg <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <22 3> Primer 27 AT 504 588 B1 <400> 20 ctcaaagatg ttaaaactgt acgcaataag gcc 33 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artifi cial <220> <2 2 3> Primer <400> 21 cattttgaag ctatggtgtg tgggccctga gactacgcat caatccgaac 50 <210> 22 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 22 cgtggccgag gagcaggact gaggaagctg tgtatactta cactacc 47 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 23 tagttgacgt tcgcggacat ag 22 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 24 ctcaaagatg ttaaaactgt acgcaataag gcc 33 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 25 tagttgacgt tcgcggacat ag 22 50 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial 55

Claims (16)

  1. 28 AT 504 588 B1 <220> <22 3> Primer <400> 26 cagaattcaa aacaatgtta aaactgtacg caataagg 38 <210> 27 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 27 agcacccaac aactttggat caacagcagc agctaaaacg agctcatctc tttccc 56 <210> 28 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 28 gctgctgctg ttgatccaaa gttgttgggt gctatggcta gcaaaggaga agaac 55 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> Primer <400> 29 cactcgagtt taatccatgc catgtgtaat ccc 33 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 30 cgttggttac ttagaggagg aagctg 26 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 31 agcttgcaaa ttaaagcctt cgagc 25Patentansprüche: 1. Nukleinsäure-Promotor umfassend eine Sequenz, die zumindest zu 70 % mit der SEQ ID 29 AT 504 588 B1 Nr. 1 oder einem funktionellen Promotorfragment davon ident ist, oder eine Sequenz, die daran unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
  2. 2. Nukleinsäure-Promotor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionelle Fragment aus den Nukleotiden 501 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1001 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1242 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1499 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1681 bis 2000, vorzugsweise aus den Nukleotiden 1816 bis 2000, der SEQ ID Nr. 1 besteht.
  3. 3. Nukleinsäure-Promotor gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleinsäure-Promotor oder das funktionelle Fragment aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 und 15, ausgewählt ist.
  4. 4. Expressionskassette umfassend einen Nukleinsäure-Promotor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, der mit zumindest einem, für ein Peptid, Polypeptid, Protein oder eine funktioneile Nukleinsäure kodierenden Nukleinsäure-Molekül funktionell verknüpft ist.
  5. 5. Vektor umfassend einen Nukleinsäure-Promotor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4.
  6. 6. Vektor gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor weiters zumindest eine Klonierungsstelle, zumindest ein Gen oder Genfragment, welches für einen Selektionsmarker kodiert, eine Sekretionskassette und/oder zumindest einen Replikationsursprung umfasst.
  7. 7. Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor zumindest einen zweiten Nukleinsäure-Promotor umfasst, der mit zumindest einem zweiten Nukleinsäuremolekül, das für ein Peptid, Polypeptid, Protein oder eine funktionelle Nukleinsäure kodiert, funktionell verknüpft ist.
  8. 8. Vektor gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein zweiter Nukleinsäure-Promotor aus der Gruppe bestehend aus Alkoholoxidase-1 -Promotor (AOX1-Promotor), AOX2, ZZA1, CUP1, GAP, FLD, TEF1, FEF2, DAS1, DAS2 oder Varianten davon, ausgewählt ist.
  9. 9. Wirtszelle umfassend einen Nukleinsäure-Promotor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4 und/oder einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8.
  10. 10. Wirtszelle gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt eine Eukaryot, vorzugsweise ein Pilz, mehr bevorzugt ein Pilz der Gattung Aspergillus, oder eine Hefe, mehr bevorzugt eine Hefe der Gattung Pichia, insbesondere Pichia pastoris, Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Hansenula, insbesondere Hanse-nula polymorpha, oder Candida, ist.
  11. 11. Wirtszelle gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionskassette in die genomische DNA der Wirtszelle integriert ist.
  12. 12. Verfahren zur rekombinanten Produktion und fakultativen Isolierung von zumindest einem Peptid, Polypeptid, Protein, Metaboliten oder einer funktionellen Nukleinsäure, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, b) Inkubieren der Wirtszelle in einem ersten Kulturmedium, c) fakultatives Inkubieren der Wirtszelle in einem zweiten Kulturmedium, und d) fakultatives Isolieren des Peptids, Polypeptids, Proteins, Metaboliten oder der funk- 30 AT 504 588 B1 tionellen Nukleinsäure aus dem Überstand oder aus den Wirtszellen, wobei das erste und/oder zweite Kulturmedium eine Kohlenstoffquelle, vorzugsweise Glucose oder Glycerin, für die Induktion der Expression des zumindest einen Peptids, Polypeptids, Proteins oder der funktionellen Nukleinsäure umfasst.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das erste und/oder zweite und/oder zumindest ein weiteres Kulturmedium zumindest einen weiteren Induktor für den zumindest einen zweiten Nukleinsäure-Promotor umfasst.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine weitere Induktor Methanol ist, wenn der zumindest eine zweite Nukleinsäure-Promotor ein AOX1-Promotor, DAS1, DAS2, FDH oder FLD oder Methylamin oder Cholin ist, wenn der zumindest eine zweite Nukleinsäure-Promotor ein FLD-Promotor ist.
  15. 15. Kit für die rekominante Produktion von zumindest einem Peptid, Polypeptid, Protein oder einer funktionellen Nukleinsäure, umfassend: einen Vektor, der einen Nukleinsäure-Promotor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst, und eine Wirtszelle.
  16. 16. Kit gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ein Eukaryot, vorzugsweise eine Hefe, mehr bevorzugt eine Hefe der Gattung Pichia, insbesondere Pichia pastoris, ist. Hiezu 10 Blatt Zeichnungen
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