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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie.
Sie betrifft insbesondere eine neue DNA-Sequenz, die Transkriptionspromotor-Aktivität besitzt,
Expressionsvektoren, die diese Sequenz enthalten, und ihre Verwendung
für die
Produktion von rekombinanten Proteinen und z.B. heterologen Proteinen.
Die Erfindung betrifft auch rekombinante Zellen, die diese DNA-Sequenz
enthalten.
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Die
Fortschritte, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie erreicht
wurden, haben es erlaubt, Mikroorganismen so zu modifizieren, dass
sie heterologe Proteine produzieren können. Zahlreiche genetische
Studien wurden insbesondere an dem Bakterium E. coli durchgeführt. Allerdings
ist die industrielle Anwendung dieser neuen Produktionsarten noch
begrenzt, insbesondere durch die Probleme der Expressionsleistungsfähigkeit der
Gene in diesen rekombinanten Mikroorganismen. Es wurden auch Forschungen
mit dem Ziel, die Leistungsfähigkeit
dieser Produktionssysteme zu erhöhen,
durchgeführt,
um starke Promotoren zu isolieren, die es ermöglichen, erhöhte Expressionslevel
von heterologen Proteinen zu erreichen. Für E. coli konnte man insbesondere
Promotoren der Tryptophan- und Lactose-Operone nennen.
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Kürzlich wurden
an der Hefe S. cerevisiae Studien über die Promotoren durchgeführt, die
von Genen abgeleitet sind, welche bei der Glycolyse involviert sind.
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Anführen kann
man insbesondere die Arbeiten über
den Promotor des Gens der 3-Phosphoglyeratkinase PGK (Dobson et
al., Nucleic Acid Res. 10, 1982, 2625; Hitzeman et al., Nucleic
Acid Research 1982, 7791), über
den des Gens der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase GAPDH (Holland
et al., J. Biol. Chem. 254, 1979, 9839; Musti et al., Gene 25, 1983,
133), über
den des Gens der Alkoholdehydrogenase 1 ADH1 (Bennentzen et al.,
J. Biol. Chem. 257, 1982, 3018; Denis et al., J. Biol. Chem. 25,
1983, 1165), über den
des Gens der Enolase 1 EN01 (Uemura et al., Gene 45, 1986, 65), über den
des Gens GAL1/GAL10 (Johnston und Davis, Mol. Cell. Biol. 4 (1984)
1440) oder über
den des Gens CYC1 (Guarente und Ptashne, PNAS 78 (1981) 2199).
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Vor
kurzem wurden genetische Werkzeuge entwickelt, damit man sich der
Hefe Kluyveromyces als Wirtszelle für die Produktion von rekombinanten
Proteinen bedienen kann. Der Beweis eines Plasmids des 2-Micron-Typs,
der aus K. drosophilarum stammt (Plasmid pKD1 –
EP 0 241 435 ) hat es ermöglicht,
ein Wirt/Vektor-System zu entwickeln, das für die Produktion von rekombinanten
Proteinen sehr wirksam ist (
EP 0
361 991 ). Allerdings wurden die in diesem System verwendeten
Promotoren bis heute nicht optimiert. Es handelt sich insbesondere
im Wesentlichen um heterologe Promotoren, d.h. die aus anderen Mikroorganismen,
wie z.B. S. cerevisiae stammen. Diese Situation kann verschiedene
Unzulänglichkeiten
verursachen und insbesondere die Aktivität des Promotors wegen des Fehlens
bestimmter Elemente der Transkriptionsmaschinerie (z.B. Transaktivatoren)
begrenzen, eine gewisse Toxizität
für die
Wirtszelle infolge des Fehlens einer Regulation darstellen und die
Stabilität
des Vektors beeinträchtigen.
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Unter
diesen Bedingungen stellt das Fehlen von starken homologen Promotoren
bei Kluyveromyces einen limitierenden Faktor bei der industriellen
Verwendung dieses Expressionssystems dar.
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Die
Anmelderin hat nun eine Region des Genoms von Kluyveromyces lactis,
die Transkriptionspromotoraktivität aufweist, identifiziert,
kloniert und sequenziert (SEQ ID NO: 1). Genauer ausgedrückt, diese
Region entspricht dem Promotor eines Gens, das für eine Transaldolase von K.
lactis codiert (als Gen K1TAL1 bezeichnet). Diese Region oder Derivate
oder Fragmente davon können
in leistungsstarker Art für
die Produktion von rekombinanten Proteinen bei den Hefen der Gattung
Kluyveromyces verwendet werden. Es ist selbstverständlich,
dass diese Sequenz auch in anderen Wirtsorganismen verwendet werden
kann.
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Im Übrigen liegt
ein Vorteil der erhaltenen Promotorregion im Fehlen einer Repression
durch Glucose, was eine Verwendung in klassischen und industriellen
Kulturmedien zulässt.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung liegt demnach in einer DNA-Sequenz,
die SEQ ID NO: 1 ganz oder einen Teil davon oder ihren komplementären Strang
oder ein Derivat davon umfasst, und die Transkriptionspromotoraktivität besitzt.
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Im
Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter Derivat jede
Sequenz, die durch Modifikation(en) genetischer und/oder chemischer
Natur unter Konservierung der Promotoraktivität erhalten wurde. Unter Modifikation
genetischer und/oder chemischer Natur versteht man jede Mutation,
Deletion, Substitution, Addition und/oder Modifikation eines Nucleotids
oder mehrerer Nucleotide. Solche Modifikationen können zu
verschiedenen Zielen und insbesondere dem, bewegliche Promotoren
herzustellen, oder dem, Promotoren herzustellen, die an eine Expression
eines besonderen Vektortyps oder Wirts angepasst sind, dem, die
Größe zu reduzieren,
die Promotoraktivität
der Transkription zu erhöhen,
induzierbare Promotoren zu bilden, das Regulierungsniveau zu verbessern
oder auch die Natur der Regulierung zu verändern, durchgeführt werden.
Solche Modifikationen können
z.B. durch in vitro-Mutagenese,
durch Einführung
zusätzlicher
Kontrollelemente oder synthetische Sequenzen oder durch Deletionen
oder Substitutionen der ursprünglichen
Kontrollelemente durchgeführt
werden.
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Wenn
ein Derivat, wie es oben definiert ist, realisiert wird, kann seine
Transkriptionspromotoraktivität auf
verschiedene Weise hervortreten, und zwar insbesondere indem ein
Reportergen, dessen Expression detektierbar ist, unter die Kontrolle
der untersuchten Sequenz gestellt wird. Jede andere Technik, die
dem Fachmann bekannt ist, kann zu diesem Effekt eingesetzt werden.
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Die
Sequenz SEQ ID NO: 1 wurde ausgehend von einer Fusionsbank zwischen
den Fragmenten des Genoms von K. lactis 2359/152 und dem Gen lacZ
von E. coli nach dem in den Beispielen beschriebenen Protokoll erhalten.
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Es
ist selbstverständlich,
dass der Fachmann diese Region durch Hybridisierung mit Hilfe einer
Sonde, die die in 1 angegebene Sequenz
oder ihren komplementären
Strang ganz oder teilweise enthält,
isolieren kann. Die Derivate gemäß der Erfindung
können
dann ausgehend von dieser Sequenz, wie es in den Beispielen beschrieben
ist, hergestellt werden.
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Ein
anderer Gegenstand der Erfindung betrifft eine rekombinante DNA,
die eine DNA umfasst, wie sie oben definiert ist.
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Diese
rekombinante DNA kann z.B. die Promotorsequenz SEQ ID NO: 1 oder
ein Derivat dieser enthalten, in die eine Restriktionsstelle insertiert
ist, welche die Verwendung dieser Sequenz als "beweglichen" Promotor erleichtert (siehe SEQ ID
NO: 3).
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Vorzugsweise
enthält
diese rekombinante DNA außerdem
ein Strukturgen oder mehrere Strukturgene. Es kann sich dabei insbesondere
um Gene handeln, die für
Proteine von pharmazeutischem oder agroalimentärem Interesse codieren. Als
Beispiele kann man die Enzyme (wie insbesondere Superoxiddismutase,
Katalase, Amylasen, Lipasen, Amidasen, Chymosin usw.), Blutderivate
(z.B. Serumalbumin, α-
oder β-Globin,
Faktor VIII, Faktor IX, von Willebrand-Faktor, Fibronectin, α-1-Antitrypsin
usw.), Insulin und seine Varianten, Lymphokine (wie z.B. Interleukine,
Interferone, Kolonien-stimulierende Faktoren [G-CSF, GM-CSF, M-CSF...],
TNF, TRF usw.), Wachstumsfaktoren (wie z.B. Wachstumshormon, Erythropoietin,
FGF, EGF, PDGF, TGF usw.), Apolipoproteine, antigene Polypeptide
zur Herstellung von Vakzinen (Hepatitis, Cytomegalovirus, Eppstein- Barr, Herpes usw.)
oder auch Fusionen von Polypeptiden, wie insbesondere Fusionen,
die einen aktiven Teil fusioniert mit einem stabilisierenden Teil
umfassen (z.B. Fusionen zwischen Albumin oder Albuminfragmenten
und dem Virusrezeptor oder einem Teil des Virusrezeptors [CD4 usw.])
nennen.
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Noch
bevorzugter enthält
die rekombinante DNA auch Signale, die die Sekretion des Expressionsproduktes
des Strukturgens oder Strukturgene ermöglichen. Diese Signale können natürlichen
Segretionssignalen des in Betracht gezogenen Proteins entsprechen,
sie können
aber auch anderen Ursprungs sein. Sekretionssignale, die von Hefegenen
stammen, können
verwendet werden, wie z.B. die Gene des Killertoxins (Stark und
Boyd, EMBO J., 5 (1986) 1995) oder des α-Pheromons (Kurjan und Herskowitz,
Cell 30 (1982) 933; Brake et al., Yeast 4 (1988) S436).
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In
einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung ist die rekombinante DNA Teil eines Expressionsplasmids,
das zur autonomen oder integrierenden Replikation fähig ist.
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Diese
Vektoren zur autonomen Replikation können insbesondere erhalten
werden, indem autonome Replikationssequenzen bei dem ausgewählten Wirt
verwendet werden. Bei der Hefe kann es sich speziell um Replikationsursprünge handeln,
die von Plasmiden (pKD1, 2μ usw.)
stammen oder auch um chromosomale Sequenzen (ARS) handeln.
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Die
integrierenden Vektoren können
insbesondere unter Verwendung von Sequenzen, die zu bestimmten Regionen des
Genoms des Wirts homolog sind, erhalten werden, was die Integration
des Vektors durch homologe Rekombination ermöglicht.
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Ein
anderer Gegenstand der Erfindung betrifft rekombinante Zellen, die
eine DNA-Sequenz, wie sie vorstehend definiert wurde, enthalten.
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Vorteilhafterweise
werden die Zellen unter den Hefen und noch bevorzugter unter den
Hefen der Gattung Kluyveromyces ausgewählt. Es ist jedoch selbstverständlich,
dass die Erfindung alle rekombinanten Zellen abdeckt, in denen die
Promotorregionen der Erfindung aktiv sind, ob es sich dabei um eukaryotische
Zellen oder prokaryotische Zellen handelt.
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Unter
den eukaryotischen Zellen kann man Pflanzenzellen, Tierzellen, die
Hefen oder Pilze nennen. Wenn es sich um Hefen handelt, kann man
insbesondere die Hefen der Gattung Saccharomyces, Pichia, Schwanniomyces
oder Hansenula nennen. Wenn es sich um Tierzellen handelt, kann
man die COS-, CHO- CI27-Zellen usw. nennen. Unter den Pilzen, die
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, kann
man insbesondere Aspergillus ssp. oder Trichoderma ssp. nennen.
Als Prokaryotenwirte kann man die Bakterien wie Escherichia coli
oder die, die zu den Gattungen Corynebacterium, Bacillus oder Streptomyces gehören, nennen.
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Die
Transkriptionspromotoraktivität
der erfindungsgemäßen Sequenzen
in diesen verschiedenen Wirten kann z.B. bewiesen werden, indem
in die betreffende Wirtszelle eine rekombinante DNA eingeführt wird, die unter
der Kontrolle der untersuchten Promotorsequenz ein Reportergen umfasst,
dessen Expression in dem betreffenden Wirt bewiesen werden kann.
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Die
rekombinanten Zellen der Erfindung können nach jeder Methode erhalten
werden, die es erlaubt, eine Fremd-DNA in eine Zelle einzuführen. Es
kann sich dabei insbesondere um Transformation, Elektroporation,
Konjugation, Fusion von Protoplasten oder jede andere Technik, die
dem Fachmann bekannt ist, handeln. Wenn es sich um Transformation
handelt, so wurden im Stand der Technik verschiedene Protokolle
beschrieben. Sie kann insbesondere verwirklicht werden, indem die
ganzen Zellen in Gegenwart von Lithiumacetat und Polyethylenglykol
nach der Technik, die von Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983) 163–168) beschrieben
ist oder in Gegenwart von Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid nach
der Technik von Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7) behandelt
werden. Ein alternatives Protokoll wurde auch in der Patentanmeldung
EP 0 361 991 beschrieben.
Wenn es sich um Elektroporation handelt, so kann sie gemäß Becker
und Guarentte (in: Methods in Enzymology Band 194 (1992) 182) durchgeführt werden.
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Ein
anderer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer DNA-Sequenz,
wie sie vorstehend definiert wurde, zur Expression von rekombinierten
Genen. Die DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung können eine
Produktion von rekombinanten Proteinen auf erhöhten Leveln ermöglichen.
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Vorteilhafterweise
können
die erfindungsgemäßen Sequenzen
zur Expression von Genen eingesetzt werden, die für Proteine
von pharmazeutischem oder agro alimentärem Interesse codieren. Als
Beispiele kann man die vorstehend aufgezählten Proteine nennen.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
die Durchführung
eines Verfahrens zur Herstellung von rekombinanten Proteinen, nachdem
man eine rekombinante Zelle, wie sie vorstehend definiert wurde,
kultiviert und das produzierte Protein isoliert. Als Beispiele für die Proteine
kann man die vorstehend aufgezählten
Proteine nennen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist vorzugsweise auf die Produktion von humanem Serumalbumin oder
einer seiner molekularen Varianten anwendbar. Unter einer molekularen
Variante des Albumins versteht man die natürlichen Varianten, die aus
dem Polymorphismus des Albumins resultieren, die verkürzten Formen oder
jedes Hybridprotein auf Albuminbasis.
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Weitere
Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der Beispiele,
die folgen, offensichtlich, wobei diese als erläuternd und nicht beschränkend anzusehen
sind.
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LEGENDE DER
FIGUREN
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1: Restriktionskarte der Plasmide pYG1018
und pYG182.
SEQ ID NO: 1: Nucleotidsequenz des Fragments mit
1,3 kb, das dem Promotor K1TAL1 von K. lactis entspricht.
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2: Herstellung des Transposons Mini Mu
MudIIZK1.
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3:
Restriktionskarte des Transposons Mini Mu MudIIZK1.
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4:
Restriktionskarte des Klons 12C4.
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5:
Restriktionskarte des Fragments BamHI-HindIII mit 2,5 kb, das den Promotor
K1TAL1 trägt.
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ALLGEMEINE
KLONIERUNGSTECHNIKEN
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Die
Methoden, die klassischerweise in der Molekularbiologie verwendet
werden, wie z.B. präparative Extraktionen
von Plasmid-DNA, Zentrifugation von Plasmid-DNA in Cäsiumchloridgradienten,
Elektrophorese auf Agarosegel oder Acrylamidgel, die Reinigung der
DNA-Fragmente durch Elektroelution, die Extraktion von Proteinen
in Phenol oder Phenol-Chloroform, die Präzipitation von DNA in Salzmedium
durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia
coli usw., sind dem Fachmann gut bekannt und in der Literatur umfangreich
beschrieben [T. Maniatis et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; F.M. Ausubel et al.
(Herausg.), "Current
Protocols in Molecular Biology", John
Wiley & Sons,
New York, 1987].
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Die
Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Biolabs) oder
Pharmacia geliefert und wurden entsprechend den Angaben der Lieferanten
verwendet.
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Die
Plasmide des Typs pBR322 und pUC sind aus dem Handel (Bethesda Research
Laboratories).
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Für Ligationen
wurden die DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe durch Elektrophorese an
Agarosegel oder Acrylamidgel getrennt, in Phenol oder ein Phenol/Chloroform-Gemisch
extrahiert, mit Ethanol präzipitiert,
dann in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Boehringer) nach
den Empfehlungen des Lieferanten inkubiert.
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Die
Auffüllung
der vorstehenden 5'-Enden
erfolgte durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E, coli
(Boehringer) entsprechend den Angaben des Lieferanten.
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Die
Zerstörung
der vorstehenden 3'-Enden
erfolgt in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs),
die nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet wurde. Die Zerstörung der
vorstehenden 5'-Enden
erfolgte durch Behandlung durch Nuclease S1.
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Die
ortsspezifische in vitro-Mutagenese durch synthetische Oligodesoxynucleotide
wird nach der Methode durchgeführt,
die von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelt
wurde.
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Die
enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die Technik,
die PCR genannt wird [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, R.K.
Saiki et al., Science 230 (1985) 1350–1354; K.B. Mullis und F.A.
Faloona, Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350], wird durchgeführt, indem
ein "DNA thermal
cycler" (Perkin
Elmer Cetus) nach den Angaben des Herstellers verwendet wird.
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Die
Bestätigung
der Nucleotidsequenzen erfolgt durch die Methode, die von Sanger
et al. entwickelt wurde [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467].
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Die
Transformationen von K. lactis werden durch jede Technik, die dem
Fachmann bekannt ist, durchgeführt
und für
die ein Beispiel im Text gegeben ist.
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Außer wenn
etwas anderes angegeben ist, sind die verwendeten Bakterienstämme E. coli
DH1 (D. Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983) 557) oder E. coli JM109::Mucts)
(Daignan-Fornier und Bolotin-Fukuhara, Gene 62 (1988) 45).
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Die
verwendeten Hefestämme
gehören
zu den Knospenhefen und insbesondere zu Hefen der Gattung Kluyveromyces.
Die Stämme
K. lactis 2359/152 und K. lactis SD6 wurden insbesondere verwendet.
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Die
Hefestämme,
die durch die Plasmide transformiert sind, werden in Erlenmeyer-Kolben
oder halbtechnischen Fermentatoren mit 2 l (SETRIC, Frankreich)
bei 28°C
in reichem Medium (YPD: 1 % Hefeextrakt, 2 % Bactopepton, 2 % Glucose;
oder YPL: 1 % Hefeextrakt, 2 Bactopepton, 2 % Lactose) unter konstantem Rühren kultiviert.
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BEISPIELE
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I – Isolierung des Promotors
K1TAL1 von K. lactis
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Die
Sequenz SEQ ID NO: 1 wurde ausgehend von einer Fusionsbank zwischen
den Fragmenten des Genoms von K. lactis 2359/152 und dem Gen lacZ
von E. coli isoliert. Dieses Beispiel beschreibt in (A) die Herstellung
der Fusionsbank und in (B) die Selektion und die Charakterisierung
eines Klons dieser Bank, der den Promotor des Gens der Transaldolase
TAL1 von K. lactis trägt.
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A/ Herstellung der Fusionsbank
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A.1. Herstellung des Transposons
Mini Mu MudIIZK1 (2 und 3)
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Das
Mini-Mu-MudIIZK1 wurde ausgehend von Mini-Mu-MudIIZZ1, das von Daignan-Fornier und
Bolotin-Fukuhara beschrieben wurde (Gene 62 (1988) 45), konstruiert.
Es wurde erhalten, indem der Replikationsursprung des Mini-Transposons
MudIIZZ1 durch einen in Kluyveromyces funktionellen Replikationsursprung
ersetzt wurd: den Replikationsursprung des Plasmids pKD1 (
EP 0 231 435 ).
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A.1.1. Konstruktion einer
Kassette, die den Replikationsursprung des Plasmids pKD1 trägt (Fragment
S11)
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Um
die späteren
Manipulationen zu erleichtern, wurde das Fragment S11 (trägt den Replikationsursprung
des Plasmids pKD1) in die Form einer Kassette NotI gebracht. Dazu
wurde ein Derivat des Plasmids pUC18 konstruiert, in dem die externen
Stellen der Mehrfachklonierungsstelle (Stellen HindIII und EcoRI)
in NotI-Stellen geändert
waren. Dies erfolgte durch Verdau mit dem entsprechenden Enzym,
Wirkung des Klenow-Enzyms und Ligation mit einem synthetischen Oligonucleotid,
das einer NotI-Stelle entspricht [Oligo d(AGCGGCCGCT); Biolabs].
Das erhaltene Plasmid wird pGM67 genannt. Das durch Verdau durch
das Enzym Sau3A des Plasmids KEp6 erhaltene Fragment S11 mit 960
bp (Chen et al., Nucl. Acids Res. 114 (1986) 4471) wurde dann an
die kompatible BamHI-Stelle des Plasmids pGM67 insertiert. Das so
erhaltene Plasmid, das pGM68 genannt wird, enthält das Fragment S11 in Form
einer NotI-Kassette.
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A.1.2. Unterdrückung des
Replikationsursprungs 2μ des
Transposons MudIIZZ1
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Das
Plasmid pGM15, das das mini-Mu-MudIIZZI trägt (Daignan-Fornier und Bolotin-Fukuhara,
vorher zitiert) hat 2μ-Regionen
durch Verdau mit dem Enzym SalI deletiert. Die so erhaltene eindeutige
SalI-Stelle wurde dann durch Ligation eines synthetischen Oligonucleotids,
das einer NotI-Stelle entspricht, nach Einwirkung des Klenow-Enzyms
in einer NotI-Stelle transformiert. Das resultierende Plasmid wird
pGM59 genannt.
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A.1.3. Insertion des Fragments
S11
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Die
NotI-Kassette, die den Replikationsursprung des Plasmids pKD1 trägt (Fragment
S11), die vom modifizierten Plasmid pUC18 stammt, wurde dann in
die einmal vorkommende NotI-Stelle des Plasmids pGM59 eingeführt.
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Das
erhaltene Plasmid, das pGM83 genannt wird, trägt ein mini Mu, MudIIZK1, genannt,
das an die Hefe Kluyveromyces lactis angepasst ist, sowie eine funktionelle
Kopie des Gens LEU2 von S. cerevisiae, die fähig ist, eine Mutation leu2
bei K. lactis zu komplementieren (Kämper et al., Curr. Genet. 19
(1991) 109). Die Restriktionskarte von mini-mu-MudIIZK1 ist in 3 dargestellt.
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A.2. Einführung von
Mini Mu MudIIZK1 in den E. coli-Stamm
der Mu-Helfer-JM109::(Mucts) trägt:
Erhalt des Stamms JM109::(Mucts)::(MudIIZK1).
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Der
Stamm JM109::(Mucts) wurde durch das Plasmid pGM83, das mini mu
MudIIZK1 enthält,
in Gegenwart von Calciumchlorid transformiert. Nach der Transformation
wurde die Transposition durch thermischen Schock nach der Technik
induziert, die von Castilho et al. (J. Bacteriol. 158 (1984) 488)
beschrieben wurde. Das nach Induktion erhaltene Phagenlysat wurde
dann verwendet, um den Stamm JM109::(Mucts) zu infizieren. Der Stamm
JM109::(Mucts) ist recA, die durch den Phagen eingekapselte lineare
DNA kann sich nicht wieder schließen, um ein replikatives Plasmid
zu ergeben. Die Integranten [Stamm JM109::(Mucts)::(MudIIZK1)] wurden
somit als Klone selektioniert, die gegen Chloramphenicol resistent
sind (CmR), für Ampicillin empfindlich sind
(AmpS).
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A.3. Herstellung der genomischen
Bank von K. lactis in E. coli DH1
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Die
DNA mit hohem Molekulargewicht wurde ausgehend von dem Stamm K.
lactis 2359/152 hergestellt und partiell durch das Enzym Sau3A verdaut.
Die Fragmente mit einer Größe von 4
bis 8 kb wurden auf Agarosegel LMP ("Low Melting Point", SEAKEM) gewonnen und in das Plasmid
pBR322, das durch BamHI linearisiert worden war und durch Kälberdarmphosphatase
(Biolabs) dephosphoryliert worden war, kloniert. 35 Pools mit 1000
Kolonien in E. coli DH1 wurden so verwirklicht. Die 1000 Kolonien
jedes Pools sind Ampicillin-resistent und Tetracyclinempfindlich,
was zeigt, dass sie alle ein genomisches DNA-Fragment von K. lactis in
pBR322 insertiert haben.
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A.4. Herstellung der Fusionsbank
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A.4.1. Einführung der
genomischen Bank von K. lactis in den Stamm JM109::(Mucts)::(MudIIZK1)
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Die
Plasmid-DNA jedes in DH1 verwirklichten Pools wird extrahiert (Maniatis).
Diese DNA wird dann verwendet, um den Stamm JM109::(Mucts)::(MudIIZK1)
in Gegenwart von Calciumchlorid zu transformieren. Um repräsentativ
zu sein, waren 1000 Kolonien in jedem Pool der genomischen Bank
enthalten, mehr als 3000 Klone pro Pool wurden in dem Stamm JM109::(Mucts)::(MudIIZK1),
der die Transduktion zulässt,
gewonnen.
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A.4.2. Transposition des
Mini Mu MudIIZK1
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Die
Fusionsbank wird durch ausgiebige Transposition des Mini Mu MudIIZK1
auf den Plasmiden, die die genomische DNA-Bank von K. lactis bilden,
verwirklicht. Die mini-Muduktionen
wurden nach dem Protokoll durchgeführt, das von Castilho et al.
(J. Bacteriol. 158 (1984) 488) beschrieben wurde und die Transduktanten wurden
auf LBA-Selektionsmedium (Medium LB (Gibco BRL), supplementiert
mit 50 mg/l Ampicillin und 30 mg/l Chloramphenicol) durchgeführt, wobei
der Marker AmpR durch das Plasmid beigesteuert
wird und der Marker CmR durch das mini-mu
beigesteuert wird. Für
jeden Pool werden die Transpositionen in Reihe durchgeführt, und
pro Pool werden 10.000 und 20.000 Transduktanten gewonnen. Die DNA
der Transduktanten wird dann durch eine 100 ml-Präparation
extrahiert, durch Präzipitation
mit Polyethylenglykol gereinigt (Maniatis et al., 1989) und in 100 μl Wasser
resuspendiert. Diese DNA wurde dann verwendet, um K. lactis zu transformieren
und Klone, die Promotoren tragen, zu selektionieren.
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B/ Isolierung des Promotors
K1TAL1 von K. lactis
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Die
oben hergestellte Fusions-DNA wurde verwendet, um einen Empfängerstamm
von K. lactis durch Elektroporation zu transformieren. Dieser Empfängerstamm,
SD6 genannt, trägt
die Mutationen leu2 (entspricht dem Selektionsmarker des mini mu
MudIIZK1) und lac4–8.
Diese letzte Mutation verhindert, dass der Stamm auf einem Medium
sprießt,
das Lactose als einzige Kohlenstoffquelle hat, sie kann aber durch Überexpression
des lacZ-Gens von E. coli, das für β-Galactosidase
codiert, komplementiert werden (Chen et al., J. Basic Microbiol.
28 (1988) 211). Aufgrund dieser Tatsache muss die Expression eines
Proteins, das an β-Galactosidase
fusioniert ist, das Wachstum des Stamms SD6 nach Transformation
auf Lactose zulassen. Dieses positive Screening wurde verwendet,
um Klone, die starke Promotoren tragen, schnell zu selektionieren.
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B.1. Konstruktion des
Empfänger-Stamms
K. lactis SD6
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Der
Stamm SD6 (Chen et al., Mol. Gen. Genet. 233 (1992) 97) wurde durch
Kreuzung des Stamms K. lactis CXJ1-7A (a, lac4–8, ura3A, adel-1, K1, K2,
pKD1) (Chen et Fukuhara, Gene 69 (1988) 181) mit dem Stamm AWJ-137
(leu2, trp1, homothallisch) (Kämper
et al., Curr. Genet. 19 (1991) 109) und Selektion der Sporen, die
den Genotyp ADE+, uraA, leu2, lac4–8 haben,
erhalten. Da die erhaltenen Sporen nicht fähig waren, nach Transformation
durch Protoplasten zu regenerieren, wurde eine Rückkreuzung mit dem Stamm CXJ1-7A durchgeführt. Nach
Sporulation in Masse wurden die Sporen des gewählten Genotyps auf Transformation
in Lithiumchlorid mit dem Plasmid KEp6 nach der Technik getestet,
die von der von Ito et al. beschriebenen (J. Bacteriol. 153 (1983)
163) abgeleitet war, getestet (die Konzentration an LiCl war 20
mM, 10 mal weniger als die, die von Ito für S. cerevisiae verwendet wurde).
Der Stamm CXJ1-7A diente als Transformationsvergleich.
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Die
Stamm SD6, der unter diesen Kriterien selektioniert worden war,
transformiert korrekt: 1 bis 3 × 104 Transformanten pro μg DNA; und die Transformanten
haben eine zufrieden stellende Stabilität: 30 bis 40 % der Kolonien
behält
den Phänotyp
[Ura+] nach sechs Generationen in nicht-selektivem
Medium bei.
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B.2. Isolierung des Promotors
K1TAL1
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Der
Stamm SD6 wurde durch Elektroporation gemäß Becker und Guarante (in Methods
in Enzymology, Band 194 (1991) 182) transformiert (Apparat Jouan;
2500 V/cm; 80–100
ng DNA/Transformation), und zwar mit DNA aus 11 Pools aus Transduktanten,
erhalten in A.4.2. (entspricht einer Bank mit 11.000 Klonen in E. coli).
Nach 5-stündiger
Regeneration in YPD-Medium (10 g/l Hefeextrakt; 10 g/l Pepton; 20
g/l Glucose) wurden die Zellen auf Lactose-Minimalmedium ausgebreitet. Die Transformanten,
die fähig
waren, auf Lactose zu wachsen, wurden erneut ausgestrichen und für jeden
Klon wurde das Plasmid extrahiert, in E. coli amplifiziert und nach
schneller Bestätigung
der Restriktionskarte des Vektors und des Mini-Mus zur Retransformation
der Hefe SD6 eingesetzt.
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Unter
den nach Retransformation erhaltenen Klonen von K. lactis wurde
einer, der Klon 12C4, durch Restriktion (siehe 4)
und durch Sequenzanalyse der Verknüpfung zwischen dem Protein
K. lactis und β-Galactosidase
untersucht. Dazu wurde die Sequenz der Verknüpfung ausgehend vom LacZ-Ende
von mini mu (Doppelstrangsequenz) durch Sequenzierung bestimmt,
und zwar mit Hilfe des folgenden Oligonucleotids, das sich bei – 59 Nucleotiden
der Verknüpfung
befindet:
5'-CTGTTTCATTTGAAGCGCG-3' (SEQ ID NO: 2)
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Die
Analyse der Proteinsequenz, die von der so erhaltenen Nucleotidsequenz
abgeleitet wurde, im Vergleich zu den Sequenzen von Banken von Proteinen
anderer Hefen oder Eukaryoten (Genbank, MIPS, EMBL usw.) zeigt,
dass die Sequenz, die vom Klon 12C4 getragen wird, dem Promotor
des Gens der Transaldolase TAL1 von K. lactis entspricht. Das BamHI-HindIII-Fragment mit 2,5
kb, das die Region stromaufwärts der
Fusion enthält,
wurde dann in den Bluescript KS+-Vektor (Stratagene) subkloniert,
eine Restriktionskarte wurde angefertigt (5) und die
Sequenz wurde durch sequenzielle Deletionen auf etwa 1,3 kb bestimmt (SEQ
ID NO: 1). Der Erhalt von Sequenzelementen erlaubt es dem Fachmann,
spezifische Sonden herzustellen und die Promotorregion der Erfindung
durch Hybridisierung nach klassischen Techniken der Molekularbiologie
erneut zu klonieren.
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II – Transformation
von Kluyveromyces
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Es
können
verschiedene Techniken, die die Einführung von DNA in die Hefe ermöglichen,
verwendet werden.
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Vorteilhafterweise
wurden die verschiedenen Stämme
von Kluyveromyces, die verwendet wurden, transformiert, indem die
ganzen Zellen in Gegenwart von Lithiumacetat und Polyethylenglykol
nach der von Ito et al. beschriebenen Technik (J. Bacteriol. 153
(1983) 163–168)
behandelt wurden. Die von Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990)-7)
beschriebene Transformationstechnik, die Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid
verwendet, wurde ebenfalls eingesetzt. Es ist auch möglich, die
Hefen durch Elektroporation, beispielsweise nach der Methode, die
von Karube et al. (FEBS Letters 182 (1985) 90) beschrieben wurde,
zu transformieren.
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Ein
alternatives Protokoll wurde noch detailliert in der Anmeldung
EP 0 361 991 beschrieben.
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III – Verwendung des Promotors
der 1 zur Expression von heterologen
Genen
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Die
Transkriptionspromotoraktivität
der Region von K. lactis, die in SEQ ID NO: 1 beschrieben ist, wurde
selbst bei der Isolierung gezeigt, und zwar durch ihr Vermögen, die
Komplementierung der Mutation lac4–8 des Stamms SD6 zu induzieren.
Dieses Vermögen
resultiert in der Tat in der Expression des lacZ-Gens von E. coli
und zeigt dadurch die Fähigkeit
zur Expression von heterologen Genen.
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IV – Konstruktion eines beweglichen
KLTAL1-Promotors
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Ein
beweglicher Promotor wurde durch PCR hergestellt, in dem in das
BamHI-HindIII-Fragment mit 2,5 kb eine Restriktionsstelle HindIII
in Position +1 bezüglich
des ATG-Codons des KLTAL1-Gens und Restriktionsstellen MluI und
SalI 1197 bp stromaufwärts
insertiert wurden (SEQ ID NO: 3). Das PCR-Produkt wird in den Vektor
pCRII (Kit TA CloningTM System, Invitrogen)
kloniert, wodurch der Vektor pYG176 erhalten wird. Diese Konstruktion
ermöglicht
es, den Promotor K1TAL1 durch MluI-HindIII-Verdau zu erhalten und
erleichtert die Klonierung in den Stellen, die dem Expressionsvektor
pYG1018 entsprechen, der das humane Prepro-Albumin-Gen unter der
Kontrolle des LAC4-Promotors enthält. Das Plasmid pYG1018 ist
identisch mit dem Vektor pYG1023, der im Patent EPA 0 402 212 beschrieben
ist, außer
dass es das Fragment BssHII-MluI enthält, das das Gen KlPGK trägt.
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5 μg der Vektoren
pYG176 und pYG1018 werden durch 60 Einheiten HindIII und MluI verdaut.
Nach Wanderung auf 0,8 % Agarosegel werden die Banden mit etwa 9
kb (entspricht dem Vektorteil) und 2 kb (entspricht dem Albuminfragment)
für pY1018
elektroeluiert. Eine Ligation an drei Partner (entsprechend den
Empfehlungen bezüglich
Puffer und Temperatur, die vom Lieferanten, New England Biolabs,
gegeben wurden) wird danach durchgeführt. Die Herstellung von Plasmiden
der Transformanten, die nach Transformation von E. coli nach der
von Chung und Miller beschriebenen Technik erhalten wurden [Nucleic
Acids Res., 16 (1988) 3580], folgt dem alkalischen Lyseverfahren
in SDS von Birnboim und Doly [Nucleic Acids Res., 6 (1979) 1513],
modifiziert durch Ish-Horowicz und Burke [Nucleic Acids Res., 2
(1981) 2989]. Nach enzymatischem Verdau wird das Plasmid, das das
gute Restriktionsprofil besitzt, pYG182 genannt (1).
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Eine
Transformation des Stamms CBS293.91 von K. lactis nach dem Protokoll,
das von Durrens et al. [Curr. Genetics, 18 (1990) 7] beschrieben
wurde, durch 10 μg
pYG182 wird durchgeführt.
Die Transformanten werden auf YPD-Medium (2 % Glucose, 1 % Hefeextrakt,
2 Bactopepton, 1,5 % Bacto-Agar), supplementiert mit dem Antibiotikum
Geneticin (200 μg/ml),
selektiert.
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Die
Albuminproduktion durch mehrere Transformanten des Stamms, der pYG182
enthält,
wird nach dem Verfahren getestet, das in den Patentanmeldungen EPA
0 361 991 und EPA 0 521 767 beschrieben ist. Die durch die verschiedenen
Transformanten sezernierte Albuminmenge ist ähnlich, und sie kann mit etwa
50 mg/l bestimmt werden.
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