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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie.
Sie betrifft insbesondere eine neue DNA-Sequenz, die Transkriptionspromotor-Aktivität zeigt,
Expressionsvektoren, die diese Sequenz enthalten, und ihre Verwendung
für die
Herstellung von rekombinanten Proteinen und beispielsweise von heterologen Proteinen.
Die Erfindung betrifft auch die rekombinanten Zellen, die diese
DNA-Sequenz enthalten.
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Die
Fortschritte, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie erreicht
wurden, haben es ermöglicht,
Mikroorganismen zu modifizieren, um sie heterologe Proteine produzieren
zu lassen. Es wurden insbesondere zahlreiche genetische Studien
an dem Bakterium E. coli durchgeführt. Allerdings ist die industrielle
Anwendung dieser neuen Produktionsarten noch beschränkt, insbesondere
durch die Probleme der Wirksamkeit der Expression von Genen in diesen
rekombinierten Mikroorganismen. Mit dem Ziel, die Leistungsfähigkeit
dieser Produktionssysteme zu steigern, wurden auch Forschungen durchgeführt, um
starke Promotoren zu isolieren, die den Erhalt von erhöhten Expressionsleveln
von heterologen Proteinen ermöglichen.
Bei E.co1i kann man insbesondere die Promotoren der Tryptophan-
und Lactose-Operone nennen.
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Kürzlich wurden
an der Hefe S.cerevisiae Untersuchungen bezüglich der Promotoren durchgeführt, die
von Genen stammen, die bei der Glycolyse beteiligt sind. Man kann
insbesondere die Arbeiten über
den Promotor des Gens der 3-Phosphoglyceratkinase PGK [Dobson et
al., Nucleic Acid Res. 10, 1982, 2625; Hitzeman et al., Nucleic
Acid Research 1982, 7791], den des Gens der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase GAPDH
[Holland et al., J. Biol. Chem. 254, 1979, 9839; Musti et al., Gene
25, 1983, 133], den des Gens der Alkoholdehydrogenase 1 ADH1 [Bennentzen
et al., J. Biol. Chem. 257, 1982, 3018; Denis et al., J. Biol. Chem. 25,
1983, 1165], den des Gens der Enolase 1 ENO1 [Uemura et al., Gene
45, 1986, 65], den des Gens GAL1/GAL10 [Johnston und Davis, Mol.
Cell. Biol. 4 (1984) 1440] oder den des Gens CYC1 [Guarente and Ptashne,
PNAS 78 (1981) 2199].
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Vor
kurzem wurden genetische Werkzeuge entwickelt, um sich der Hefe
Kluyveromyces als Wirtszelle für
die Produktion von rekombinanten Proteinen zu bedienen. Der Beweis
eines Plasmids des Typs 2-μm
aus K. drosophilarum (Plasmid pKD1 –
EP 0 241 435 ) hat es erlaubt, ein
Wirt/Vektor-System zu entwickeln, das für die Produktion von rekombinanten
Proteinen (
EP 0 361 991 )
sehr wirksam ist. Jedoch wurden die in diesem System eingesetzten
Promotoren bis heute nicht optimiert. Es handelt sich insbesondere
um heterologe Promotoren, d.h. die aus anderen Mikroorganismen stammen,
insbesondere aus S. cerevisiae. Diese Situation kann verschiedene
Nachteile verursachen und insbesondere die Aktivität des Promotors
infolge des Fehlens bestimmter Elemente des Transkriptionsapparats
(z.B. Transaktivatoren) begrenzen, eine bestimmte Toxizität für die Wirtszelle
infolge des Fehlens von Regulation zeigen oder die Stabilität des Vektors
beeinflussen.
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Unter
diesen Bedingungen bildet das Fehlen von starken homologen Promotoren
bei Kluyveromyces einen Faktor, der bei der industriellen Verwertung
dieses Expressionssystems limitierend ist.
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Die
Anmelderin hat nun eine Region des Genoms von Kluyveromyces lactis,
die Transkriptionspromotor-Aktivität zeigt,
identifiziert, kloniert und sequenziert (SEQ ID NO: 1). Genauer
ausgedrückt,
diese Region entspricht dem Promotor des Gens des Ribosomenproteins
rp28 von K. lactis (Klrp28). Diese Region oder Derivate oder Fragmente
derselben können
in leistungsstarker Art für
die Produktion von rekombinanten Proteinen bei den Hefen der Gattung
Kluyveromyces verwendet werden. Es ist selbstverständlich,
dass diese Sequenz auch in anderen Wirtsorganismen verwendet werden
kann.
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Im übrigen beruht
ein Vorteil der erhaltenen Promotorregion im Fehlen einer Unterdrückung durch
Glucose, was eine Verwendung in klassischen und industriellen Kulturmedien
zulässt.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung liegt demnach in einer DNA-Sequenz,
die die Sequenz SEQ ID NO: 1 ganz oder einen Teil davon oder ihren
komplementären
Strang oder ein Derivat der genannten umfasst und Transkriptionspromotor-Aktivität besitzt.
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Im
Sinn der vorliegenden Erfindung versteht man unter Derivat jede
Sequenz, die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 1 durch Modifikation(en)
der genetischen und/oder chemischen Natur erhalten wird, die eine
Promotoraktivität
konserviert. Unter Modifikation der genetischen und/oder chemischen
Natur versteht man jede Mutation, Deletion, Substitution, Addition
und/oder Modifikation eines Nucleotids oder mehrerer Nucleotide.
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Derartige
Modifikationen können
mit unterschiedlichen Zielen und insbesondere dem, bewegliche Promotoren
herzustellen, oder dem, Promotoren herzustellen, die an die Expression
in einem bestimmten Vektor- oder Wirts-Typ angepasst sind, dem, die Größe zu verringern,
die Aktivität
des Transkriptionspromotors zu erhöhen, induzierbare Promotoren
zu erzeugen, das Regulationsniveau zu verbessern oder auch die Natur
der Regulation zu verändern,
durchgeführt
werden. Derartige Modifikationen können z.B. durch in vitro-Mutagenese,
durch Einführung
zusätzlicher
Kontrollelemente oder synthetischer Sequenzen oder durch Deletionen
oder Substitutionen der ursprünglichen
Kontrollelemente durchgeführt
werden.
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Wenn
ein Derivat, wie es oben definiert wurde, verwirklicht wird, kann
seine Transkriptionspromotor-Aktivität in verschiedener
Art bewiesen werden, insbesondere, indem ein Reportergen, dessen
Expression detektierbar ist, unter die Kontrolle der untersuchten
Sequenz gestellt wird. Jede andere Technik, die dem Fachmann bekannt
ist, kann selbstverständlich
zu diesem Zweck eingesetzt werden.
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Die
Sequenz SEQ ID NO: 1 wurde ausgehend von einer Fusionsbank zwischen
den Fragmenten des Genoms von K. lactis 2359/152 und dem Gen lacZ
von E. coli nach dem in den Beispielen beschriebenen Protokoll erhalten.
Es ist einzusehen, dass der Fachmann diese Region durch Hybridisierung
mittels einer Sonde, die die Sequenz SEQ ID NO: 1 ganz oder teilweise
oder ihren komplementären
Strang ganz oder teilweise umfasst, isolieren kann. Die Derivate
gemäß der Erfindung
können dann
ausgehend von dieser Sequenz hergestellt werden, wie es in den Beispielen
angegeben ist.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine rekombinante DNA,
die eine DNA-Sequenz umfasst, wie sie oben definiert ist.
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Diese
rekombinante DNA kann z.B. die Promotorsequenz SEQ ID NO: 1 oder
ein Derivat davon, in das eine Restriktionsstelle insertiert ist,
die die Verwendung dieser Sequenz als "beweglichen" Promotor erleichtert, enthalten.
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Vorzugsweise
enthält
diese rekombinante DNA außerdem
ein Strukturgen oder mehrere Strukturgene. Es handelt sich insbesondere
um Gene, die für
Proteine von pharmazeutischem oder agroalimentärem Interesse codieren. Als
Beispiel kann man die Enzyme (wie insbesondere Superoxiddismutase,
Catalase, Amylasen, Lipasen, Amidasen, Chymosin usw.), Blutderivate
(wie z.B. Serumalbumin, α-
oder β-Globin,
Faktor VIII, Faktor IX, von Willebrand-Faktor, Fibronectin, α-1-Antitrypsin
usw.), Insulin und seine Varianten, Lymphokine (Interleukine, Interferone,
Kolonien stimulierende Faktoren [G-CSF, GM-CSF, M-CSF...], TNF,
TRF usw.), Wachstumsfaktoren (wie z.B. Wachstumshormon, Erythropoietin,
FGF, EGF, PDGF, TGF usw.), Apolipoproteine, antigene Polypeptide
zur Herstellung von Vakzinen (Hepatit, Cytomegalovirus, Eppstein-Barr,
Herpes usw.) oder auch Fusionen von Polypeptiden wie insbesondere
Fusionen, die einen aktiven Teil fusioniert mit einem stabilisierenden
Teil umfassen (z.B. Fusionen zwischen Albumin oder Albuminfragmenten und
dem Rezeptorvirus oder einem Teil eines Rezeptorvirus (CD4 usw.))
nennen.
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Noch
bevorzugter enthält
die rekombinante DNA auch Signale, die die Sekretion des Expressionsproduktes
des Strukturgens oder der Strukturgene zulässt. Diese Signale können natürlichen
Sekretionssignalen des betrachteten Proteins entsprechen, können aber
auch anderen Ursprungs sein. Es können insbesondere Sekretionssignale
verwendet werden, die von Hefegenen stammen, wie die der Gene des
Killertoxins [Stark und Boyd, EMBO J. 5 (1986) 1995] oder von α-Pheromon
[Kurjan und Herskowitz, Cell 30 (1982) 933; Brake et al., Yeast
4 (1988) 5436].
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In
einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung ist die rekombinante DNA Teil eines Expressionsplasmids,
das zur autonomen oder integrierenden Replikation fähig ist.
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Die
Vektoren zur autonomen Replikation können insbesondere erhalten
werden, indem Sequenzen zur autonomen Replikationen bei dem gewählten Wirt
ausgenutzt werden. Bei der Hefe handelt es sich insbesondere um
Replikationsursprünge,
die von Plasmiden (pKD1, 2μ usw.)
stammen oder auch um chromosomale Sequenzen (sequences chromosomiques;
ARS).
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Die
integrierenden Vektoren können
insbesondere erhalten werden, indem Sequenzen, die mit bestimmten
Regionen des Genoms des Wirts homolog sind, verwendet werden, welche
die Integration des Vektors durch homologe Rekombination ermöglichen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft rekombinante Zellen,
die eine DNA-Sequenz, wie sie vorstehend definiert wurde, enthalten.
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Vorteilhafter
Weise werden die Zellen unter den Hefen und noch bevorzugter unter
den Hefen der Gattung Kluyveromyces ausgewählt. Es ist selbstverständlich,
dass die Erfindung alle rekombinanten Zellen abdeckt, in denen die
Promotorregionen der Erfindung aktiv sind, ob es sich um eukaryotische
oder prokaryotische Zellen handelt.
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Unter
den Eukaryotenzellen kann man die Pflanzenzellen, Tierzellen, die
Hefen oder die Pilze nennen. Wenn es sich um Hefen handelt, kann
man insbesondere die Hefen der Gattung Saccharomyces, Pichia, Schwanniomyces
oder Hansenula nennen. Wenn es sich um Tierzellen handelt, kann
man die Zellen COS, CHO, CI27 usw. nennen. Unter den Pilzen, die
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, kann man insbesondere
Aspergillus spp. oder Trichoderma spp. nennen. Als Prokaryotenwirte
kann man die Bakterien wie Escherichia coli oder die, die zu den
Gattungen Corynebacterium, Bacillus oder Streptomyces gehören, nennen.
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Die
Aktivität
des Promotors der Transkription der erfindungsgemäßen Sequenzen
in diesen verschiedenen Wirten kann z.B. verifiziert werden, indem
z.B. in die betrachtete Wirtszelle eine rekombinante DNA, die unter
der Kontrolle der untersuchten Promotorsequenz ein Reportergen trägt, dessen
Expression in dem betrachteten Wirt bewiesen werden kann, eingeführt wird.
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Die
rekombinanten Zellen der Erfindung können durch jedes Verfahren
erhalten werden, das es erlaubt, eine Fremd-DNA in eine Zelle einzuführen. Es
handelt sich insbesondere um Transformation, Elektroporation, Konjugation,
Fusion von Protoplasten oder jede andere Technik, die dem Fachmann
bekannt ist. Für die
Transformation wurden verschiedene Protokolle im Stand der Technik
beschrieben. Sie kann insbesondere durch Behandlung der ganzen Zellen
in Gegenwart von Lithiumacetat und Polyethylenglykol nach der Technik, die
von Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983) 163–168) beschrieben wurde oder
in Gegenwart von Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid nach der Technik
von Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7) verwirklicht werden.
In der Patentanmeldung
EP 0361
991 wurde auch ein alternatives Protokoll beschrieben.
Handelt es sich um eine Elektroporation, so kann sie gemäß Becker
und Guarentte (in: Methods in Enzymology, Band 194 (1991) 182) durchgeführt werden.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer
Sequenz, wie sie vorstehend definiert wurde, zur Expression von
rekombinanten Genen. Die DNA-Sequenzen
der Erfindung können
tatsächlich
eine Produktion von rekombinanten Proteinen auf erhöhtem Niveau
ermöglichen.
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Vorteilhafter
Weise können
die Sequenzen der Erfindung zur Expression von Genen, die für Proteine von
pharmazeutischem oder agroalimentärem Interesse codieren, verwendet
werden. Als Beispiel kann man die vorstehend aufgezählten Proteine
nennen.
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Die
vorliegende Erfindung erlaubt auch die Durchführung eines Herstellungsverfahrens
für rekombinante
Proteine, nach dem man eine rekombinante Zelle, wie sie vorstehend
definiert wurde, kultiviert und das produzierte Protein gewinnt.
Als Beispiel für
ein Protein kann man die vorstehend aufgezählten Proteine nennen.
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Vorzugsweise
ist das erfindungsgemäße Verfahren
auf die Produktion von humanem Serumalbumin oder eine seiner molekularen
Varianten anwendbar. Unter molekularer Variante des Albumins versteht
man die natürlichen
Varianten, die aus dem Polymorphismus des Albumins resultieren,
die verkürzten
Formen oder jedes Hybridprotein auf Albuminbasis.
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Andere
Vorzüge
der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der folgenden Beispiele
klar, die nur als erläuternd
und nicht als beschränkend
anzusehen sind.
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LEGENDE DER
FIGUREN
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SEQ
ID NO: 1: Nucleotidsequenz des Fragments mit 0,9 kb, das dem Promotor
Klrp28 von K. lactis entspricht.
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1: Herstellung des Transposons Mini Mu
MudIIZK1.
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2:
Restriktionskarte des Transposons Mini Mu MudIIZK.
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3:
Restriktionskarte des Klons 12C10.
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4:
Restriktionskarte des BamHI-HindIII-Fragments mit 1,75 kb, das den Promotor
Klrp28 trägt.
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ALLGEMEINE
KLONIERUNGSTECHNIKEN
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Die
klassischerweise verwendeten Methoden der Molekularbiologie, wie
z.B. die präparativen
Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA
im Cäsiumchloridgradienten,
Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, die Reinigung von
DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Extraktion von Proteinen
in Phenol oder Phenol-Chloroform, die Präzipitation von DNA in Salzmedium
durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia
coli usw. sind dem Fachmann gut bekannt und sind in der Literatur
reichlich beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (Herausg.), "Current Protocols
in Molecular Biology",
John Wiley & Sons,
New York, 1987].
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Die
Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Biolabs) oder
Pharmacia geliefert und wurden nach den Empfehlungen der Lieferanten
verwendet.
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Die
Plasmide des Typs pBR322 und pUC stammen aus dem Handel (Bethesda
Research Laboratories).
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Für die Ligationen
wurden die DNA-Fragmente durch Elektrophorese auf Agarose- oder
Acrylamid-Gelen getrennt, in Phenol oder durch ein Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert,
mit Ethanol präzipitiert, dann
in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Boehringer) nach den
Empfehlungen des Lieferanten inkubiert.
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Die
Auffüllung
der vorstehenden 5'-Enden
wurde durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli
(Boehringer) nach den Beschreibungen des Lieferanten durchgeführt. Die
Zerstörung
der vorstehenden 3'-Enden
wurde in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), der
nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet wurde, durchgeführt. Die
Zerstörung
der vorstehenden 5'-Enden
erfolgte durch eine Behandlung mit der Nuclease S1.
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Die
gerichtete in vitro-Mutagenese durch synthetische Oligodesoxynucleotide
wurde nach den Verfahren durchgeführt, das von Taylor et al.
[Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelt wurde.
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Die
enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die PCR [Polymerase-catalyzed
Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis
K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] genannte
Technik wird unter Verwendung eines "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) nach den Angaben
des Herstellers durchgeführt.
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Die
Analyse der Nucleotidsequenzen wird durch die von Sanger et al.
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelte Methode
durchgeführt.
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Die
Transformationen von K. lactis werden durch jede Technik, die dem
Fachmann bekannt ist, durchgeführt
und für
die im Text ein Beispiel gegeben wird.
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Wenn
nichts Gegenteiliges angegeben ist, waren die verwendeten Bakterienstämme E. coli
DH1 (Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983) 557) oder E. coli JM109::(Mucts)
(Daignan-Fornier und Bolotin-Fukuhara, Gene 62 (1988) 45).
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Die
verwendeten Hefestämme
gehören
zu den Knospenhefen und insbesondere zu Hefen der Gattung Kluyveromyces.
Der Stamm K. lactis 2359/152 und K. lactis SD6 wurden bevorzugt
verwendet.
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Die
Hefestämme,
die durch die Plasmide transformiert wurden, wurden in Erlenmeyerkolben
oder Pilotfermentatoren mit 2 l (SETRIC, Frankreich) bei 28°C in reichem
Medium (YPD : 1 % Hefeextrakt, 2 % Bactopepton, 2 % Glucose oder
YPL :1 % Hefeextrakt, 2 % Bactopepton, 2 % Lactose) unter konstanter
Bewegung kultiviert.
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BEISPIELE
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I – Isolierung des Promotors
Klrp28 von K. lactis
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Die
Sequenz SEQ ID NO: 1 wurde ausgehend von einer Fusionsbank zwischen
den Fragmenten des Genoms von K. lactis 2359/152 und dem lacZ-Gen
von E. coli isoliert. Dieses Beispiel beschreibt in [A] die Herstellung
der Fusionsbank und in [B] die Selektion und Charakterisierung eines
Klons dieser Bank, die den Promotor des Gens des Ribosomenproteins
rp28 von K. lactis trägt.
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A/ Herstellung der Fusionsbank
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A.1. Herstellung des Transposons
Mini Mu MudIIZK1 (1 und 2)
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Mini
Mu MudIIZK1 wurde ausgehend von Mini Mu MudIIZZ1, (beschrieben von
Daignan-Fornier und Bolotin-Fukuhara (Gene 62 (1988) 45), konstruiert.
Es wurde erhalten, indem der Replikationsursprung des Mini-Transposons
MudIIZZ1 durch einen Replikationsursprung, der in Kluyveromyces
funktionell ist, ersetzt wurde: durch den Replikationsursprung des
Plasmids pKD1 (
EP 0 231 435 ).
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A.1.1. Konstruktion einer
Kassette, die den Replikationsursprung des Plasmids pKD1 trägt (Fragment
S11)
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Um
die späteren
Manipulationen zu erleichtern, wurde das Fragment S11 (trägt den Replikationsursprung
des Plasmids pKD1) in die Form einer NotI-Kassette gebracht. Dazu
wurde ein Derivat des Plasmids pUC18 hergestellt, in dem die externen
Stellen der Mehrstellenklonierung (Stellen HindIII und EcoRI) in
NotI-Stellen geändert
wurden. Dies erfolgte durch Verdau mit den entsprechenden Enzymen,
der Wirkung des Klenow-Enzyms und Ligation mit einem synthetischen
Oligonucleotid, das einer NotI-Stelle entspricht [Oligo-d (AGCGGCCGCT);
Biolabs]. Das erhaltene Fragment wurde pGM67 genannt. Das Fragment
S11 mit 960 bp, das durch Verdau mit dem Enzym Sau3A des Plasmids
Kep6 erhalten worden war (Chen et al., Nucl. Acids Res. 114 (1986)
4471), wurde dann an die mit BamHI kompatible Stelle des Plasmids
pGM67 insertiert. Das so erhaltene Plasmid, das pGM68 genannt wird,
enthielt in Form einer NotI-Kassette das Fragment S11.
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A.1.2. Suppression des
Replikationsursprungs 2μ des
Transposons MudIIZZ1
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Das
Plasmid pGM15, das mini Mu MudIIZZ1 (Daignan-Fornier und Bolotin-Fukuhara, vorher
zitiert) trägt,
wurde durch Verdau mit Hilfe des Enzyms SalI bezüglich der Regionen 2μ deletiert.
Die so erhaltene einmal vorkommende Stelle SalI wurde dann durch
Ligation eines synthetischen Oligonucleotids, das einer NotI-Stelle
entspricht, nach Wirkung des Klenow-Enzyms in die NotI-Stelle transformiert.
Das resultierende Plasmid wird pGM59 genannt.
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A.1.3. Insertion des Fragments
S11
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Die
NotI-Kassette, die den Replikationsursprung des Plasmids pKD1 (Fragment
S11), stammend vom modifizierten Plasmid pUC18, trägt, wurde
dann in die einmal vorkommende NotI-Stelle des Plasmids pGM59 eingeführt.
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Das
erhaltene Plasmid, das pGM83 genannt wird, trägt ein mini-Mu, MudIIZK1 genannt,
das an die Hefe Kluyveromyces lactis angepasst ist, sowie eine funktionelle
Kopie des Gens LEU2 von S. cerevisiae, die fähig ist, eine Mutation leu2
bei K. lactis zu komplementieren (Kämper et al., Curr. Genet. 19
(1991) 109). Die Restriktionskarte des minu-mu MudIIZK1 ist in 2 dargestellt.
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A.2. Einführung des
Mini Mu MudIIZK1 in den Stamm E. coli, der den Mu-Helfer JM109::(Mucts)
enthält:
Erhalt des Stamms JM109::Mucts)::MudIIZK1).
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Der
Stamm JM109::(Mucts) wurde durch das Plasmid pGM83, das mini mu
MudIIZK1 enthält,
in Gegenwart von Calciumchlorid transformiert. Nach der Transformation
wurde die Transposition durch thermischen Schock nach der Technik,
die von Castilho et al. (J. Bacteriol. 158 (1984) 488) beschrieben
wurde, induziert. Das nach Induktion erhaltene Phagenlysat wird
dann verwendet, um den Stamm JM109::(Mucts) zu überinfizieren. Im Stamm JM109::(Mucts),
der recA ist, kann die lineare DNA, die durch den Phagen eingekapselt
wird, sich nicht wieder schließen,
um ein replikatives Plasmid zu ergeben. Die Integranten [Stamm JM109::(Mucts)::(MudIIZK1)]
Werden dann als Klone selektiert, die Chloramphenicolresistent (CmR), Ampicillin-sensibel (Amps)
sind.
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A.3. Herstellung der genomischen
Bank von K. lactis in E. coli DH1
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Die
DNA mit hohem Molekulargewicht wurde ausgehend vom Stamm K. lactis
2359/152 hergestellt und mit dem Enzym Sau3A partiell verdaut. Die
Fragmente mit einer Größe von 4
bis 8 kb wurden auf Agarosegel LMP ("Low Melting Point", SEAKEM) gewonnen und in das Plasmid
pBR322 kloniert, welches durch BamHI linearisiert worden war und
durch Wirkung der Kälberdarmphosphatase
(Biolabs) dephosphoryliert worden war. 35 Pools mit 1000 Kolonien
in E. coli DH1 wurden auf diese Weise verwirklicht. Die 1000 Kolonien jedes
Pools sind Ampicillin-resistent und Tetracyclin-sensibel, was zeigt,
dass sie alle ein genomisches DNA-Fragment von K. lactis in pBR322
insertiert haben.
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A.4. Herstellung der Fusionsbank
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A.4.1. Einführung der
genomischen Bank von K. lactis in den Stamm JM109::(Mucts)::(MudIIZK1)
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Die
Plasmid-DNA jedes Pools, der in DH1 verwirklicht worden war, wurde
extrahiert (Maniatis). Diese DNA wurde dann verwendet, um den Stamm
JM109::(Mucts)::(MudIIZK1) in Gegenwart von Calciumchlorid zu transformieren.
Um repräsentativ
zu sein, wurden 1000 Kolonien, die in jedem Pool der Genombank enthalten waren,
plus 3000 Klone pro Pool in dem Stamm JM109::(Mucts)::(MudIIZK1),
der die Transduktion zulässt,
gewonnen.
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A.4.2. Transposition des
Mini Mu MudIIZK1
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Die
Fusionsbank wurde durch extensive Transposition des Mini Mu MudIIZK1
auf den Plasmiden, die die genomische DNA-Bank von K. lactis bilden,
verwirktlicht. Die mini-Muductionen
wurden nach dem Protokoll durchgeführt, das von Castilho et al.
(J. Bacteriol. 158 (1984)488) beschrieben wurde, und die Transduktanten wurden
auf selektivem Medium LBAC (Medium LB (Gibco BRL), supplementiert
mit 50 mg/l Ampicillin und 30 mg/l Chloramphenicol) selektiert,
wobei der Marker AmpR durch das Plasmid
beigetragen wird und der Marker CmR durch
das mini-mu beitragen wird. Für
jeden Pool wurden die Transpositionen in Serie durchgeführt und pro
Pool wurden zwischen 10000 und 20000 Transductanten gewonnen. Die
DNA der Transduktanten wurde dann aus einer Präparation mit 100 ml extrahiert,
durch Präzipitation
mit Polyethylenglykol (Maniatis et al., 1989) gereinigt und in 100 μl Wasser
resuspendiert. Diese DNA wurde dann zum Transformieren von K. lactis und
Selektieren der Klone, die Promotoren tragen, verwendet.
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B/ Isolierung des Promotors
Klrp28 von K. lactis
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Die
oben hergestellte Fusions-DNA wurde zum Transformieren eines Empfängerstamms
von K. lactis durch Elektroporation verwendet. Dieser Empfängerstamm,
SD6 genannt, trägt
die Mutationen leu2 (entspricht dem Selektionsmarker von mini-mu
MudIIZK1) und lact4–8.
Diese letzte Mutation verhindert, dass der Stamm auf einem Medium,
das Lactose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, sprießt, allerdings kann er durch Überexpression
des lacZ-Gens von E. coli, das für β-Galactosidase
codiert (Chen et al., J. Basic. Microbiol. 28 (1988) 211) komplementiert
werden. Dadurch muss die Expression eines Proteins, das an β-Galactosidase
fusioniert ist, das Wachstums des Stamms SD6 auf Galactose nach
Transformation zulassen. Diese positive Durchmusterung wurde verwendet,
um Klone, die starke Promotoren tragen, schnell zu selektieren.
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B.1. Konstruktion des
Empfängerstamms
K. lactis SD6
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Der
Stamm SD6 (Chen et al., Mol. Gen. Genet. 233 (1992) 97) wurden durch
Kreuzung des Stamms K.lactis CXJ1-7A (a, lac4-8, ura3A, ade1-1,
K1, K2, pKD1) (Chen und Fukuhara, Gene 69 (1988) 181) mit dem Stamm
AWJ-137 (leu2, trp1, homothallique) (Kämper et al., Curr. Genet. 19
(1991) 109), und Selektion der Sporen, die den Genotyp ADE+, uraA, leu2, lac4-8 haben, erhalten. Da
die erhaltenen Sporen nicht fähig
waren, nach Transformation durch Protoplasten zu regenerieren, wurde
eine Rückkreuzung
mit dem Stamm CXJ1-7A durchgeführt.
Nach Sporolierung in Masse wurden die Sporen des gewählten Genotyps
durch Transformation in Lithiumchlorid mit dem Plasmid Kep6 nach
der Technik, die von der abgeleitet ist, die von Ito et al. (J.
Bacteriol. 153 (1983) 163) beschrieben wurde, getestet (die Konzentration
an LiCl ist 20 mM, 10-mal weniger als die, die von Ito für S. cerevisiae
verwendet wurde). Der Stamm CXJ1-7A hat als Transformationsvergleich
gedient.
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Der
Stamm SD6, der nach diesen Kriterien selektiert wurde, transformiert
sich korrekt: 1 bis 3 × 104 Transformanten pro μg DNA; und die Transformanten
haben eine zufriedenstellende Stabilität: 30 bis 40 % der Kolonien
behalten den Phänotyp
[Ura+] nach sechs Generationen in nicht-selektivem
Medium bei.
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B.2. Isolierung des Promotors
Klrp28
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Der
Stamm SD6 wurde durch Elektroporation gemäß Becker und Guarante (in Methods
in Enzymology, Band 194 (1991) 182) (Jouan-Gerät; 250 V/cm; 80–100 ng
DNA/Transformation) mit der DNA aus 11 Pools an Transduktanten,
erhalten in A.4.2. (entsprechend einer Bank mit 11000 Klonen in
E. coli) transformiert. Nach 5 Stunden Regeneration in YPD-Medium
(10 g/l Hefeextrakt; 10 g/l Pepton; 20 g/l Glucose) wurden die Zellen
auf Minimallactosemedium verteilt. Die Transformanten, die fähig waren,
auf Lactose zu sprießen,
wurden erneut ausgestrichen und für jeden Klon wurde das Plasmid extrahiert,
in E. coli amplifiziert und nach schneller Bestätigung der Restriktionskarte
des Vektors und des mini-mu zum Retransformieren der Hefe SD6 verwendet.
Unter den Klonen von K. lactis, die nach Retransformation erhalten
wurden, wurde einer von ihnen, der Klon 12C10, durch Restriktion
(siehe 3) und durch Analyse der Sequenz der Verknüpfung zwischen dem
Protein von K. lactis und der β-Galactosidase
untersucht. Dazu wurde die Sequenz der Verknüpfung ausgehend vom lacZ-Ende
von mini-mu8 (Doppelstrangsequenz) durch Sequenzierung mit Hilfe
des folgenden Oligonucleotids bestimmt, das sich ab –59 Nucleotiden
der Verbindung erstreckt:
5'-CTGTTTCATTTGAAGCGCG-3' (SEQ ID NO: 2)
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Die
Analyse der Proteinsequenz, die von der so erhaltenen Nucleotidsequenz
abgeleitet wurde, zeigt durch Vergleich mit den Sequenzen von Proteinbanken
anderer Hefen oder Eukaryoten (Genbank, MIPS, EMBL usw.), dass die
Sequenz, die durch den Klon 12C10 getragen wird, im Promotor des
Gens des Ribosomenproteins rp28 von K. lactis entspricht. Das Fragment
BamHI-HindIII mit 1,75 kb, das die Region stromaufwärts der
Fusion enthält,
wurde dann in den Vektor Bluescript KS+ (Stratagene) subkloniert,
eine Restriktionskarte wurde angelegt (4) und die
Sequenz wurde durch sequenzielle Deletionen mit 0,9 kb bestimmt
(SEQ ID NO: 1). Der Erhalt von Sequenzelementen erlaubt es dem Fachmann,
spezifische Sonden herzustellen und die Promotorregion der Erfindung
durch Hybridisierung nach den klassischen Techniken der Molekularbiologie zu
reklonieren.
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II – Transformation
von Kluyveromyces
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Es
können
verschiedene Techniken verwendet werden, die die Einführung von
DNA in die Hefe erlauben.
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Vorteilhafter
Weise wurden die verschiedenen verwendeten Stämme von Kluyveromyces transformiert,
indem die ganzen Zellen in Gegenwart von Lithiumacetat und Polyethylenglykol
nach der Technik behandelt wurden, die von Ito et al. (J. Bacteriol.
153 (1983) 163–168)
beschrieben wurde. Die von Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990)
7) beschriebene Transformationstechnik, die Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid
verwendet, kann ebenfalls eingesetzt werden. Es ist auch möglich, die
Hefen durch Elektroporation zu transformieren, z.B. durch das Verfahren,
das von Karube et al. (FEBS Letters 182 (1985) 90) beschrieben wurde.
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In
der Anmeldung
EP 0 361 991 wurde
noch ein alternatives Protokoll beschrieben.
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III – Verwendung des Promotors
der 1 zur Expression von heterologenen
Genen
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Die
Aktivität
des Transkriptionspromotors der Region von K. lactis, die auf der
SEQ ID NO: 1 beschrieben ist, wurde während seiner Isolierung durch
seine Fähigkeit,
die Vervollständigkeit
der Mutation lac4-8 des Stamms SD6 zu induzieren, bewiesen. Diese
Fähigkeit
führt zur
Expression des Gens lacZ von E. coli und beweist dadurch die Fähigkeit
zur Expression von heterologenen Genen.
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IV – Konstruktion des beweglichen
Promotors Klrp28
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Ein
beweglicher Promotor wird durch PCR durch Insertion im Fragment
BamHI-HindIII mit 1,75 kb einer HindIII-Restriktionsstelle in Position +1 bezüglich des
ATG-Codons des Gens
Klrp28 und der Restriktionsstellen MluI und SalI mit 533 bp stromaufwärts (SEQ
ID NO: 3). Das PCR-Produkt wird in den Vektor pCRII (Invitrogen)
kloniert, um das Plasmid pYG177 zu erzeugen, das es möglich macht,
den Promotor durch einfachen MluI-HindIII-Verdau wieder herauszubringen,
was die Klonierung in einen Expressionsvektor erleichtert.
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Dann
wird ein Expressionsvektor des humanen Serumalbumins, ausgehend
vom Plasmid pYG1018, wie folgt hergestellt: Das Plasmid pYG1018
enthält
das Präpro-Albumingen unter
der Kontrolle des Promotors LAC4. Es stammt vom Vektor pYG1023,
der in der Patentanmeldung
EP
0 402 212 beschrieben wurde, durch Deletion des Fragments
BssHII-MluI, das das Gen KIPGK trägt. 5 μg der Vektoren pYG177 und pYG1018
werden durch 16 Einheiten HindIII und MluI verdaut. Nach Wanderung
auf 0,8 % Agarosegel werden die Bande, die dem Promotor rp28 entspricht
(etwa 0,5 kb), die Bande, die dem Vektorteil entspricht (etwa 9
kb) und die Bande, die der cDNA des Albumin entspricht (ungefähr 2 kb)
elektroeluiert. Eine Ligation mit drei Partnern (entsprechend den
Empfehlungen bezüglich
Puffer und Temperatur, die vom Lieferanten New England Biolabs definiert
sind) wird dann mit 1 μl
DNA-Promotor, 1 μl
Vektor-DNA und 2 μl
Albumin-DNA durchgeführt.
Nach Transformation bei E. coli (Chung et al., NAR 16 (1988) 3580)
wird die Plasmid-DNA der Transformanten nach der Technik der alkalischen
Lyse in SDS von Birboim und Doly (NAR 6 (1979) 1513), modifiziert
durch Ish-Horowicz
und Burke (NAR 9 (1981) 2989), hergestellt. Nach enzymatischem Verdau
wird das Plasmid, das das gute Restriktionsprofil besitzt, isoliert.
Dieses Plasmid wird pYG183 genannt.
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Der
Stamm K. lactis CBS 293.91 wurde durch pYG183 unter den Bedingungen,
die in Beispiel II beschrieben sind, transformiert. Die Albuminproduktion
durch mehrere Transformanten wurde nach der Technik getestet, die
in
EP 0 361 991 beschrieben
ist. Die Menge an Albumin, die durch die Transformanten sezerniert wird,
ist ähnlich
(50 bis 100 mg/l). SEQUENZPROTOKOLL
