DD283838A5 - Verfahren zur herstellung eines polypeptids - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches DNA-Sequenz enthaelt, die fuer das Pektinlyase * oder ein Derivat desselben kodieren, wobei ein mit einem DNA-Molekuel transformierter Wirt gezuechtet wird und das gewuenschte rekombinante DNA-Molekuel oder ein Derivat desselben isoliert wird. Das DNA-Molekuel kann auch durch in-Vitro-Synthese hergestellt werden. Durch die Entwicklung der neuen erfindungsgemaesz hergestellten Polypeptid-Expressionssysteme wird das Gebiet der Gentechnologie erweitert.{rekombinantes DNA-Molekuel; DNA-Sequenz; Gentechnologie; Pektinlyase I von Aspergillus niger; Konstruktion von Hybridvektoren}

Description

Hierzu 14 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnologie und schafft neue DNA-Moleküle, umfassend DNA-Sequenzen, die die Pektinlyase I (PLI/ von Aspergillus niger und/oder den Promotor, die Signalsequonz oder den Terminator davon kodieren. Die neuen DNA-Moleküle sind für die Überproduktion von PLI in Aspergillus und/oder die Konstruktion von Hybridvektoren, welche Fremdgene in Fadenpilzen zum Ausdruck kommen lassen, nützlich.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Obzwar auf gehtechnologischem Gebiet zahlreiche Polypeptid-Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Wirts bereits bekannt sind, besteht ein fortlaufender Bedarf für neue Systeme, welche gegenüber den bekannten Systemen Vorteile haben könnten.

In großem Maße werden der prokaryotische Wirt Escherichia coli und der eukaiyotische Hefe-Wirt, z. B Caccharomyces cerevisiae, für die eine große Anzahl von verschiedenen Expressionshybridvektofen, meistens Plasmide, entwickelt wurden, angewandt. Die Nachteile der E.coli-Wirte bestehen darin, daß sie das gebildete Poiypeptid nicht glykosylieren können und daß aufgrund des Fehlens von Ausscheidung das fremde Peptid innerhalb der Wirtszelle akkumuliert werden könnte und weiteres Wachstum verhindern könnte. Die Hefe-Wirte glykosylieren, jedoch scheiden sie nicht, wie E.coli, die Polypeptide in das Nährmedium aus, außer sehr kleinen. Hefen scheiden nur in den periplasmischen Raum aus. Höhere eukaryotische Wirte sind Säugetierkrebszellen, welche in der L=ige sind, zu glykosylieren und in das Nährmedium auszuscheiden, jedoch ist die Kultivierung hiervon sehr langsam und kostspielig, und es besteht die Gefahr, daß onkogene Nucleinsäuren zusammen mit dem gewünschten Peptid, wovon das letztere nicht befreit werden kann, isoliert werden.

Aufgrund des Bedarfs für andere Wirte wurden auch Fadenpilze, wie Neurospora crassa, Aspergillus nidulans und Aspergillus niger, untersucht. Solche Pilze werden bereits in hohem Maße für industrielle Zwecke verwendet, jedoch wurde ihre Anwendung in dor Gentechnologie vernachlässigt, hauptsächlich wegen des Fehlens eines geeigneten Transformationssystems. Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae enthalten Fadenpilze keine Plasmide, welche zur Einführung von Fremdgenen und phänotypif :her Selektion verwendet werden könnten. Es ist jedoch möglich, Fadenpilze mit Fremdplasmiden, die ein selektierbares Markergen enthalten, zu transformieren. Alle bisher für Fadenpilze beschriebenen Vektoren sind nicht selbstreplizierend wie diejenigen der Hefen, werden aber in das Pilzchromosom integriert. Dies tritt nur mit sehr niedriger Frequenz auf. Andererseits macht die integrative Transformation die Transformanten vorteilhafterweise mitotisch sehr stabil, selbst unter non-selektiven Bedingungen. Es wurde von einer stabilen Integration von mehr als einhundert Kopier» berichtet. Der erste beschriebene Vektor für Fadenpilze enthielt das qa-2-Gen von Neurospora crassa als seiaktiven Marker. Dieses Gen kodiert die Enzym-katabolische Dehydrokinase und kann zur funktioneilen Vervollständigung von Aromutanten von N.crassa verwendet werden (M.E. Case, M.Schweizer, S. R. Kushner und N.H. Giles [197S] Proc. Natl. Acad.Sei.USA 76, 5259-5263). Aromutanten sind nicht in der Lage, auf Minimalmedium ohne Zusatz einer aromatischen Aminosäure zu wachsen. Transformation von N.crassa durch den qa-2-Vektor trat durch Integration einer Einzelkop .e des Plasmids in dar Chromosom auf. 30% der stabilen Aro⁺-Integranten hielten das integrierte qa-2-Gen, das noch an di<> Liakterielle Plasmid-Sequenzen

getiuncbn war, zurück (M.E. Case [1982) in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (A. Holländer, D. DoMoss, S.Kaplan, J.Konisky, D.Savage und R.S. Wolfe, Editoren), Seiten 87-100, Plenum). Diese Beobachtung machte die Kot.ansformatlon von nicht-selektiven DNA-Sequenzen zusammen mit selektiven zu einer durchführbaren Aufgabe. In Aspergillus nidulans, der einen Sexualzyklus hat und daher klassischen genetischen Manipulationen unterworfen werden kann, wurden sowohl negative als auch positive Selektionssysteme identifiziert. Sowohl unter Verwendung von heterologer DNA von N.crassa als auch homologer DNA wurde eine funktioneile Vervollständigung von A. nidulans-pyrG-Mutanten durch Transformation mit Plasmiden, die Jas pyrG-Gon enthielten, erhalten (Ballance et al. BBRC112,284,1983; Tilburn et al. Gene 26, 205,1983). In anderen Systemen wurden Mutationen am trpC- oder argB-Locus funktionell durch Transfer iation mit don geeigneten Plasmiden vervollständigt (Yelton et al. PNAS 81,1470,1984; Yelton und Timberlake J.Cell. Uiochem.Suppl,9C 173, 1985; Johnstone et al. EMBO J. 4,1307,1983).

Ein dominantes, positives Selektionssystem wurde auch entwickelt, indem das amdS-Gen verwendet wurde, das aus A.nidulans isoliert wurde, welches den damit transformierten A. niger in die Lage versetzt, auf Acetamid als einziger Stickstoffquelle zu wachsen (Tilburn et al., Gene26,205,1983; Werners et al., Curr.Genet.9,361,1985; J. M. Kelly et al., EMBO J. 4,475,1985). Verglichen mit N.crassa oder A. nidulans ist A. niger bei weitem der wichtigere Organismus. Er wird in weitem Umfang bei der industriellen Produktion von Enzymen, z. B. zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie, verwendet. A. niger unterscheidet sich von A. nidulans,durch seine sekretorische Kapazität in der Weise, daß er eine Vielzahl von hydrolytischen Enzymen ausscheidet, z. B. Glucoamyiase, a-Amylase, Pectinase, Cellulase, ß-Glucanase, ß-Galactosidase, Naringinase, Pentosanase, Säuroprotease und Lignaso, wobei der Glucoamyiase- und Pectinase-Komplex die bei weitem wichtigsten sind. A. niger hr.t keinen bekannten Soxualzyklus. Mutationen können daher nicht über meiotische Rekombinationen eingeführt werden. Mittels klassischer Mutations- und Selektionsverfahren wurden jedoch ausgedehnte Starnmverbesserungen in der Sekretion von hydrolytischen Enzymen erreicht.

Von den Genen der A.niger-Enzyme wurden nur diejenigen dser Glucoamylase (Boel et al. EMBO J. 3,1581,1984) und Alkohol- und Aldehyd-Dehydrogenase (WO86/06097) zusammen mit ihrem Promotor und Signalsequenzen charakterisiert und bei Transformationsexperimenten mit A.nidulans bzw. A. niger verwendet.

Als Selektionsmarker für A. niger wurden die heterologen amds-Gone (Kelly und Hynes, EMBO 3,4,475,1985) und das argB-Gen (Buxton et al., Gene 37,207,1985; EP184438; WO86/06097), welche beide aus A. nidulans urhalten wurden, verwendet. A. niger ist der wichtigste Organismus für die industrielle Produktion von Pektin abbauenden Enzymen. Pektine sind Polygalacturonide mit hohom Molekulargewicht (20000 bis 40000D), die aus a-1,4-glykosidisch gebundener-D-Galacturonsäure-Polymeren bestehen und in der Natur als Bestandteile von Zellen höherer Pflanzen auftreten, wo sie an Cellulosemolekülen gebunden sind, die hauptsächlich in der primären Zellwand und den Mittellamellen gefunden werden. Unter den reichsten Quellen für Pektin sind Zitronen- und Orangenrinde, welche etwa 30% dieses Polysaccharide enthalten. Pektische Enzyme bauen das Kohlenhydrat-Polymersubstrat ab entweder durch Hydrolyse der a-1,4-glykosidischen bindung (Polygalucturonase) oder durch Transeiemination des cHi.ö-ungesättigt-Galacturonischen Restes aus dem Pektinmolekül (verschiedene Pektinlyasen). Der systematische Name der Pektinlyase ist Pektintranseliminase (EC4.2.2.10). In A. nigor werden did Protaine des pektischen Komplexes konstitutiv nicht exprimiert. Unter induzierenden Bedingungen und Verwendung von Pektin oder Bruchstücken davon drückt A. niger die oben erwähnten Enzyme einschließlich PLI aus, wenn andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose oder Saccharose, begrenzt sind. Bei Oberflächenkulturen neigen die pektischen Enzyme dazu, mit der äußeren Zellwand verbunden zu bleioon. Steigende K..tin- und Ca²⁺-Konzentration im Medium führt zu vollständiger Ausscheidung.

Pektinasen, wie PLI, werden von der Nahrungsmittelindustrie hauptsächlich für die Fruchtsaftklärung verwendet. Aus Aspergillus niger wurden zwei verschiedene Pektinlyasen, PLI und PLII, gereinigt und teilweise durch F.E. A. Van Houdenhoven (1) charakterisiert. PLI enthält vier Reste von Mannose, während PLII zwei Reste von jeweils Mannose und Glukose hat. Die Enzyme haben verschiedene Molekulargewichte (PLI: 37,5kD, PLII: 36kD). Vor der vorliegenden Erfindung wurden keino Gesamt- oder Teilaminosäure-Sequenzen veröffentlicht.

Die vorliegende Erfindung basiert auf einer teilweisen Strukturbestimmung von Pektinlyase I (PLI), welche die Synthese von DNA-Teilstücken erlaubte, die für relevante Teile des Proteins kodieren. Mit Hilfe der DNA-Teilstücke war es möglich, aus einer Genbank von A. niger DNA zu soreenen und zu isolieren, welche für PLI, gegebenenfalls zusammen mit Prä- und Post-Sequenzen davon, kodiert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung es, das Gebiet der G 3ntechnologie durch Entwicklung neuer Polypeplid-Expressionssysteme zu erweitern, die gegenüber den bekannten Systemen /orteile haben.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten DNA-Moleküien, die für ein Pektinlyase-Expressionssystem und Derivate davon kodieren, wie das Strukturgen von PLI und entsprechenden regulatorischen Sequenzen, z. B. Promotor-, Start- und Stopsequenzen, und Hybridvektoren, umfassend die entsprechenden DNAs einschließlich Hybridvektoren mit DNA, die für homologe oder heterologe Polypeptide kodieren, Wirte, insbesondere Fadenpilze, z. B. Aspergiüus-Wirte, transformiert durch diese Vektoren, Methoden zur Herstellung dieser rekombinanten DNA-Moieküle und ihrer Wirte und die Verwendung der rekombinanten DNA-Moleküle zur Herstellung von neuen Expressionssystemen zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe ist die Herstellung von Polypeptiden mittels dieser DNAs und ihrer Wirte.

Das Pektinlyase-Expressionssystem umfaßt DNA-Sequenzen, die für den Promotor, die Startsequenz, das Strukturgen und den Terminator eines Pektinlyasegens kodieren.

Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Konstruktion von Hybridexpressionsvektoren, umfassend DNA-Sequenzen, die für den Promotor von PLI kodieren, gegebenenfalls für die Startsequenz dieses Proteins und gegebenenfalls für

einen geeigneten Terminator des gleichen Gens zu finden. Diese Hybridexpressionsvektoren werden zum Einschluß der Gene, die für besondere Proteine und für die Transformation von Fadenpilzen, wie Aspergillus, Ponicillium und Cephalosporlum, kodieren, verwendet. Die Kotransformation von A. niger mit zwei verschiedenen Plasmlden kann durchgeführt werden, wobei eines der Plasmide aus dor Gruppe von Expressionsvektoren der Erfindung ausgewählt wird und das andere ein besonders konstruiertes Selektionsplasmid, das in Verbindung mit einem mutierten Stamm eines Fadenpilzas arbeitet, ist. Die vorliegende Erfindung hat auch die Aufgabe die Überproduktion von PLI in Asporgillus-Species zu schaffen. Erfindungsgemäß wird zur Herstellung eines rekombinanton DNA-Moleküls, welchos DNA-Sequenzen enthält, die für das Pektinlyase (PL)-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodieren, ein mit einem DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz enthält, die für das Pektinlyase-Expresslonssystem oder ein Derivat dessolben kodiert ein transformierter Wirt gezüchtet und das gewünschte rekombinante DNA-Molekül oder das Derivat desselben isoliert. Das rekombinierte DNA-Molekül kann erfindungsgemäß auch durch In-vitro-Synthese hergestellt werden.

Weitere erfindungswesentliche Details werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung eines kombinanten DNA-Moleküls, umfassend die DNA-Sequenz der Formel I (Fig.4) oder ein Derivat davon.

Der Ausdruck „Derivat", sofern im Zusammenhang mit der DNA-Sequenz dar Formel I verwendet, soll größere Derivate mit flankierenden Sequenzen, Fragmente dieser DNA-Sequenz, Mutanten, insbesondere natürlich auftretende Mutanten, und DMA-Sequenzen, welche degeneriert sind, umfassen.

Größere Derivate der DNA-Moleküle der Formel I sind solche, die aus dem A. niger-Genom ausgeschnitten werden können und die DNA-Sequenz der Formel I umfassen, wie sie in einer Genbank von A. niger gefunden werden kann, erhalten durch Fragmentieren der Nucleinsäuren, Behandlung der Fragmente mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z. B. Sau3A, Ligieren pn ein geeignetes Plasmid, z.B. pUN 121, Klonen, z.B. in E.coli, und Wiederausschneiden mit dem gleichen Restriktionsenzym. Ein solches Derivat ist z.B. dor Einschub des Plasmids pCG3B 11, dargestellt in Fig. 1.

Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I sind solche, die sich zwischen zwei Restriktionsstellen ausdehnen, ausgewählt aus denjenigen von Pst I, EcoRI, Hindill, Sau 3 Al, Kpnl, CIaI, Ncol, Accl, SaIII, Pvul, Sail, Spei, BgII, EcoRV, BgIII, Aval, Xhol, Nhel, BssHI, Xmnl, BamHI, BssHli und dergl., wie dies in den beigefügten Figuren gezeigt ist.

Bevorzugte Fragmente sind solche, welche die Promotor-Sequenz, die Start-Sequenz, das Strukturgen von PLI und/oder die Stop-Sequanz enthalten.

Die Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I können Linker enthalten, welche für eine erfolgreiche Verbindung zu anderen DNA-Molekülen sorgen.

Die PLI-Promotor-Sequenz ist in der DNA-Region zwischen den Nucleotid-Positionen -1 bis -688enthalten, wobei die Sequenz zwischen den Nucleotiden etwa -100 bis -146 wesentlich ist. Für die Promotor-Sequenz ist der TATAA-Abschnitt bei den Nucleotiden -120 bis -146 als RNA-Polymerase-Erkennungszone wichtig. An diese Fragmente können geeignete Bindeglieder angeknüpft werden.

Der Promotor von PLI von A. niger ist induzierbar, d.h. die Expression des daran geknüpften Strukturgens, z, B. des Strukturgens, das für PLI oder irgendein anderes Fremdgen kodiert, wird durch Zugabe von Pektin oder Pektinabbauprodukten zum Medium induziert.

Die Start-Sequenz dehnt sich zwischen den Nucleotiden 1 bis 57 aus. Die Start-Sequenz ist eine bevorzugte Sequenz und diese umfassende DNA-Moleküle, z.B. solche, welche diese Sequenz und gegebenenfalls geeignete Bindeglieder enthalten, sind bevorzugte DNA-Moleküle.

Das Strukturgen von PLI beginnt bei Nucleotid 58 und dehnt sich bis Nucleotid 1366 aus. Wie aus Formel I ersichtlich, enthält das Strukturgen mehrere Introns. Auch das Strukturgen kann geeignete Linker enthalten.

Der Terminator beginnt mit dem Stopcodon TAA bei Nucleotid 1367 und kann sich bis zu Nucleotid 1670 oder bis zu 2029 ausdehnen, besonders bis zu einem der Restriktionspunkte innerhalb dieser Sequenz. Das Terminatorfragment kann geeignete Linker enthalten.

Geeignete Linker für obige Fragmente haben eine DNA-Sequenz, welche in die Restriktionsstelle der DNA, an welche das Fragment gebunden werden soll, hineinpaßt oder welche eine Restriktionsstelle enthalten.

Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I sind auch solche, welche aus kleineren Fragmenten zusammengesetzt sind, z. B. solchen, die aus dem Promotor und der Start- oder Struktursequenz oder der Start- und der Struktursequen^, dem Strukturgen ohne die Introns, und dergl. bestehen.

Mutanten dor DNA-Sequenz der Formel I sind beispielsweise natürlich vorkommende Mutanten, wie die Mutante, deren Nucleotid T₈₀ durch A₈O ersetzt ist, wobei das Codon GTG, das für Valin kodiert, in GAG, dus für Glutaminsäure kodiert, geändert wird. Die letztere Aminosäure ist in dem PLI vorhanden, das aus einem Gemisch von pektinolytischen Enzymen (Ultrazym®, Novo Industries, Kopenhagen), erhalten aus einem A. niger-Stamm, isoliert wurde. Die Erfindung umfaßt auch natürliche oder synthetische Mutanten der Start-Sequenz mit einem ähnlichen oder identischen Hydrophobizitätsprofil, z.B. worin die Codons für die polaren Aminosäuren Lysin (K⁸⁺), Tyrosin (Y^s~) und Arginin (R⁶⁺) durch Codons für andere Aminosäuren mit ähnlichen Ladungen ausgetauscht wurden und die hydrophoben Aminosäuren Alanin (A), Leucin (L) und Threonin (T) durch Codons für andere hydrophobe Aminosäuren ausgetauscht sind. Beispielsweise kann das Codon für das positiv geladene Lysin durch ein Codon füi Arginin und umgekehrt ersetzt werden, das Codon für das negativ geladene Tyrosin durch ein Codon für Glutamat oder Aspartat und/oder das Codon für das nicht-polare, hydrophobe Alanin durch irgendeines der Codons für Threonin, Prolin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin und dergl. ersetzt sein. Andere Mutationen sind „stille Mutationen", worin eine oder einige andere Nucleotide, z. B. bis zu etwa 30, durch eine oder mehrere andere Nucleotide ersetzt sind, wobei die neuen Codons die gleiche(n) Aminosäure(n) kodieren.

DNA-Sequenzen der Formel I, welche degeneriert sind, sind, wie die stillen Mutationen, solche, welche innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes derart degeneriert sind, daß eine unbegrenzte Anzahl von Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt ist, ohne daß die Aminosäuresequenz, für die sie kodieren, geändert ist. Solche degenerierte DNA-Sequenzen können wegen ihrer verschiedenen Restriktionsstellen nützlich sein.

Rekombinante DNA-Moleküle, umfassend eine DNA-Sequenz der Formel I oder ein Derivat davon, sind besonders rekombinante Vektoren, alternativ auch Hybridvektoren genannt, die solche DNA-Sequenzen als Einschübe enthalten. Sie sind zum Klonen in Wirten, wie Bakterien, Pilzen oder tierischen Zellen, verwendbar. Solche Hybridvektoren stammen von irgendeinem Vektor, der

in der Gentechnologie verwendbar ist, wie von Phagen, Kosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNA, wie Derivaten von Phage λ, z.B. NM989, M 13mp8 Phagen-DNA (16), linearleiert durch BamHI-Abbau, bakteriellen Plasmiden, z.B. pBR322, pUN 121, pUC 18, oder Hefeplasmiden, z. B. Hefe 2 μ Plasmid, oder auch chromosomaler DNA, stammend z. B. von Aepergillur, z. B. A. niger, beispielsweise solchen, die von EP184438 zugänglich gemacht werden.

Ein Hybridvektor gemäß der Erfindung enthält zusätzlich zu der DNA-Sequenz der Formel I oder eines Derivats davon einen Replikationspunkt und gegebenenfalls, in Abhängigkeit von dem Typ des DNA-Derivats, einen Expressionskontrollsequenz, wie eine Beschleuniger-Sequenz, eine stromaufgelegene Aktivierungsstelle, einen Promotor und Start-Sequenzen und/oder Strukturgene, die verschieden sind von den entsprechenden Sequenzen, die von dem vorhandenen A. niger abgeleitet sind. Solche Enhancer-Sequenzen können abgeleitet werden von der extrachromosomalen, ribosomalen DNA von Physarum polycephalum (PCT/EP8500278) oder sind die stromaufgelegenen Aktivierungsstellen vom Säurephosphates PH05-Gon (EP-Anmeldung Nr.86111820.6) oder dem PHO5, trp, PHO5-GAPDH-Hybrid (EP-Anm. Nr. 86111820.6) oder ähnlichen Promotorn. Solche Expressions-Kontrollsoquenzen können an das PLI-Strukturgen gebunden sein.

Strukturgene, die mit dem vorhandenen Promotor, Start- und/oder Stopsequenzen verbunden sind, sind außer solchen, die PLI mit oder ohne Introns kodieren, auch homologe andere Pektinlyase-Gene und heterologe Strukturgene, die für eine großo Vielzahl von Polypeptiden kodieren, einschließlich glykosylierter Polypeptide, insbesondere von höheren eukaryotischen, insbesondere Säugetier-, wie tierischen und besonders menschlichen Ursprungs, wie Enzyme, welche verwendet werden können, beispielsweise zur Erzeugung von Nahrungsmitteln und zur Durchführung enzymatischer Rea'-.tionen in der Chemie, oder nicht-enzymatischer Polypeptide, welche zur Behandlung von menschlichen oder tierischen Krcnkheiten oder zur Vorbeugung davon nützlich und wertvoll sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunsteuernden, anti-viralen und Anti-Tumor-Eigenschaften, Antikörper, virale Antigene, Vakzinen bzw. Impfstoffe, Blutgerinnungsfaktoren, Nahrungsmittel und dergl.

Beispiele für solche heterologe Strukturgene sind beispielsweise solche, die kodieren für: Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermale oder insulinähnliche Wachstumsfaktoren, Mastzellen-, Nerven- oder Transformierungswachstumsfaktor, Wachstumshormone, wie Human- oder Rinder-Wachstumshormone, Interleukin, wie lnterleukin-1 oder -2, Humanmakrophagen-Migrationsinhibitorfaktor (MIF), Interferone, wie Human-a-lnterferon, z. B. Interferon-aA, aB, aD oder aF, ß-lnterferon, γ-lnterferon oder ein Hybrid-Inierferon, z.B. ein aA-aD- oder ein aB-aD-Hybrid-lnterferon, Hepatitisvirus-Antigene, wie Hepatitis B-Virus-Oberflächen- oder -Core-Antigen oder Hepatitis A-Virus-Antigen, Plasminogen-Aktivaturen, wie Gewebeplasminogen-Aktivator oder Urokinase, Tumor-Nekrose-Faktor, Somatostatin, Renin, ß-Endorphin, Immunoglobuline, wie die leichten oder/oder schweren Ketten von Immunoglobulin D, E oder G, Immunoglobuün-bindende Faktoren, wie Immunoglobulin E-Bindungsfaktor, Calcitonin, Humancalcitcnin-verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Eglin, wie Eglin C, Desulfatohirudin, wie Desulfatohirudin-Variant HV1, HV2 oder FA, oder Human-Superoxid-Dismutase. Bevorzugte Gene sind solche, die kodieren für: menschliches α-Interferon oder Hybridinterferon, menschlichen Plasminogen-Aktivator (t-PA), Hepatitis B-Virus-Oberflächen-Antigen (HBVsAg), Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I, Eglin C und Desulfatohirudin, z.B. Variant HV1. In den Hybridvektoren gemäß vorliegender Erfindung kann der vorliegende Promotor und/oder die Start- bzw. Signal-Sequenz opeiabel mit der Polypeptid kodierenden Region verbunden sein, um eine wirkungsvolle Expression des Polypeptids zu sichern.

Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können selektive Marker in Abhängigkeit von dem Wirt, der transformiert, selektiert und geklont werden soll, enthalten. Irgendein Markergen kann verwendet v/erden, welches die Selektion der Transformanten aufgrund der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind besonders solche, wie antibiotische Resistenz aufweisen, z. B. gegen Tetracyclin oder Ampicillin, oder, im Falle von auxotrophen Hefemutanten, Gene, welche die Wirtsläsionen ergänzen. Entsprechende Gene verleihen beispielsweise Resistenz gegenüber d6m antibiotischen Cycloheximid oder schaffen Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, z. B. dem ura 3-, leu 2-, his3- oder trp 1 -Gen. Es ist auch möglich, als Marker strukturelle Gene zu verwenden, welche mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, daß dor zu transformierende Wirt für das durch den Marker exprimierte Produkt auxotroph ist. Von besonderer Wichtigkeit sind Markergene, welche A. niger-Wirtsläsionen ergänzen, wie das argB-Gen, das für die Ornithincarbamoyl-Transferase kodiert, z.B. abgeleitet von A. niger oder A. nidulans (EP 184438) oder A. nidulans-DNA-Fragmente, die dem N.crassa pyr 4-Gen (26) homolog sind.

Bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung sind Hybridvektoren, worin das Strukturgen, insbesondere das fremde Strukturgen, mit dem Promotor und den Startsequenzen gemäß vorliegender Erfindung wirksam verbunden ist. Solche bevorzugten Hybridvektoren sind z.B. pCG3B 11, M13 mp8-PL (Sall-EcoRI) BssHII/BE5, pUBE5, pLHK3, pLHL5 und pLHLT7. Weitere brauchbare Hybridvektoren sind pPL35-5 (vergl. Beispiele und Figuren).

Die DNA der Formel I und deren Derivate einschließlich Fragmente können zum Screenon von DNA-Genbanken oder mRNA für ähnliche DNAs oder mRNAs verwendet werde-».

Die Züchtung der Wirte zur Herstellung eines rekombinanien DNA-Mo!eküls wird in einem üblichen Nährmedium durchgeführt, welches mit chemischen Verbindungen ergänzt oder von solchen befreit ist, welche eine negative oder positive Auswahl der Transformanten, d.h. solchen Wirten, die das gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, von den Nicht-Transformanten, d.h. solchen Wirten, denen das gewünschte DNA-Molekül fehlt, ermöglichen. Irgendwelche transformierbaren Wirte, die auf diesem Gebiet verwendbar sind, z. B. Bakterien, wie E. coli. Pilze, wie Saccharomyces cerevisiae, oder insbesondere Fadenpilze, wie Aspergillus, z. B. A. nidulans, A.oryzae, A.oarbonarius, A. awamori und insbesondere A. niger, können eingesetzt werden. Ein bevorzugter Wirt ist A. niger AnS, eine neue Mutante, der das pyrA-Gen fehlt, wie im folgenden beschrieben. Die Transformation der Wirte wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Die DNA-Sequenz, welche für das PL-Expressionssystem kodiert, wird aus Fadenpilzen erhalten, die ein solches System enthalten, insbesondere aus einer Genbank davon oder auch über die mRNA. Im folgenden ist die Herstellung des PLI-Expressionssystems detaillierter beschrieben.

Eine Genbank kann hergestellt werden, z. B. durch partiellen Abbau von genomischer DNAeines A. niger-Stamms,z. B. N 756, mit Sau3Al und Klonen von hochmolekularen DNA-Fragmenten in das E.coli-Plasmid pUN 121. Irgendein anderer A.niger-Stamm, der PLI produziert, kann als Quelle für die Genbank dienen und gleichermaßen können andere geeignete Vektoren als Rezipienten für die Fragmente verwendet werden.

Um die Gonbank für DNA-Sequenzen, die für PU kodieren, erfolgreich zu screonon, war eine Sequenzbestimmung dieser Enzyms oder von Teilchen davon notwendig. PLI wurde aus einer handelsüblich erhältlichen Mischung von pektinolytischen Enzymen von A. niger (Ultralzym®, Novo Industries) gereinigt und sequenzie-t. Der N-Terminus von reifem PLI ergab die Sequenz

V₁-G-V-Xv-G-T₆-P-E-G-F-A,

und ein Fragment von PLI, das durch Spalten der PLI mit Bromcyan erhalten wurde, ergab die N-tcrminale Sequenz V₁J₉-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-XHr-D-I-N-X₁₄T-E,

worin die Aminosäuren X damals nicht identifiziert worden waren.

Basierend auf jenen Aminosäure-Seque.izen wurde eine Anzahl von DNA-Teilstücke.i, d. h. Mischungen von DNA-Sequenzen, die für Teile der Aminosäure-Sequenzen kodieren und die entsprechenden degenerierten DNA-Sequenzen, chemisch synthetisiert und zum Scr6enen verwendet. Solche DNA-Teilstücke sind baispielswoise die Mischungen der Formeln

3' TGR₁ GGR₁ CTR₂ CCR₃ AAR₃ CG 5' (2014) (la)

3' TGR₁ GGR₁ CTR₂ CCR₂ AAR₃ CG 5' (2015) (Ib)

worin R₁ für A, C, G oder T steht, R₂ für C oder T steht und R₃ für A oder G steht, oder DNA-Gemisch 2060 der Formel 5' AAR, ATR₂ ATR₂ ATR₂ CAR₃ A3¹ (2060) (Ic)

worin R₁ für A oder T steht, R₂ für A, T oder C steht und R₃ für A oder G steht.

Da die Gesamt-DNA-Sequenz des PLI-Gens im Verlauf der vorstehenden Arbeit aufgeklärt wurde, kann irgendein Teil davon mit wenigstens etwa 14bp zum Screenen verwendet werden, was auch das Screenen für mRNA, welche für das PL-System kodiert, einschließt.

Für Screeningzwecke werden di DNA-Teilstücke nach bekannten Methoden unter Verwendung von V³²P-ATP- und T4-Kinase 5' radioaktiv markiert. Wirt-Mkrooi janismen, die die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung als Insert tragen, werden durch Hybridisierung mit dem markierten DNA-Teilstück auf Filterreplikas der Gi nbank identifiziert.

Zum Anfertigen einer Unterbank können Klone der Genbank, welche ein radioaktives Ansprechen auf das radioaktiv markierte DNA-Tbilstückzeigen, das für den N-terminalen Teil der PLI kodiert, isoliert, kultiviert und mit dem zweiten DNA-Teilstück hybrisiert werden, das für die N-terminalen Aminosäuren des CNBr-Fragments kodiert, wie oben beschrieben.

Klone, welche eine Hybridisationsreaktion auf eines oder beide DNA-Teilstücke zoigen, worden isoliert und vermehrt.

Beispielsweise ergab das Screenen mit DNA-Teilstücken 2014 und 2015 33 bzw. 39 positive Klone. Die 72 Klone wurden vermehrt und die erhaltenen Subgenbanken erneut mit DNA-Teilstücken 2060 gescreent, wodurch drei positive Klone identifiziert werden konnten. Ein Klon wurde selektiert und als E.coli Bj 5183/gCG3 B11 bezeichnet. Er enthält Plasmid pCG3B11, wovon eine Teilrestriktionskarte in Fig. 1 gezeigt ist. Das Sau 3 Al-Fragment von pCG 3 B11 umfaßt das Spel-Nhel-Fragment, das in Fig.4 und Formel I gezeigt wird.

Das Plasmid pCG3B 11 kann zum Aufbau anderer DNA-Moleküle gemäß der Erfindung durch Anwendung üblicher gentechnologischer Methoden verwendet werden

Beispielsweise führt die Restriktion von pCG3B 11 mit EcoRI und Klonen der beiden Fragmente in Plasmid pUN 121 zum Plasmid pPL 29-5 (Fig. 2), enthaltend den Promotor, die Start-Sequenz und den Teil des Struktur-PLI-Gens bis zur zentralen EcoRI-Restriktionsstelle in Stellung 649/650, und zu Plasmid pPL35-5 (Fig. 3), enthaltend einen Teil des PLI-Strukturgens, beginnend bei Position 650, und den Terminator. pPL 29-5 enthält weiterhin die flankierenden N-terminalen Sequenzen und pPL35-5 die flankierenden C-terminalen Sequenzen von pCG3B11.

Fragmente der Inserts der Plasmide pPL29-5 und pPL35-5 können für das Sequenzieren durch Restriktion mit geeigneten Fnzymen, wie Ahalll, Pstl, Aval, Hindill, EcoRI, Kpnl, CIaI, Ncol, Accl, Sail, Pvul, SaIII, Nhel, BgII, EcoRI und EcoRV, erhalten werden. Die Fragmente können subkloniert, z.B. in verschiedenen MI3-Phagen, vorzugsweise Ml3mp8 und MI3mpl8, und sequenziert werden, z. B. unter Verwendung des MI3-Kloning- und Sequencing Kit (M 13 Sequencing Kit N.4502, Amersham) unter den Bedingungen, die vom Hersteller (16) angegeben sind. Die ganze Sequenz des 2.7 kb Spel-Nhel-Fragments, enthaltend die Vi. !!ständige Sequenz vom PLI-Gen, ist in Fig. 4 dargestellt. Sie umfaßt 688 Nucleotide der Promotorregion, 1369 Nucleotide des strukturellen Teils des PLI-Gens und 661 Nucleotide der Terminatorregion. Der Sequenz von pPL 29-5, entsprechend der Aminosäure-Sequenz des N-Ternvnus von PLI, wie durch Aminosäure-Sequenzanalyse bestimmt (Beispiel 1), gehen 57 Nucleotide voraus, die für das Signalpeptid der Formel

M₁-K-Y-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-A-A-A₆₇

kodieren.

Die Aminosäure-Sequenz des N-Terminus des C-terminalen CNBr-Fragments von PLI (Beispiel 3) wird nicht kontinuierlich kodiert durch das geklonte DNA-Fragment von pPL35-5 (Nucleotid 1257-1379). Eine Computeruntersuchung auf Sequenzübereinstimmungen von Exon/Intron-Spleißverbindungen sowie auf Intron-interne Sequenzen (E. Boel et al. [18] und

S. M. Mount [19)) führt dazu, die Anwesenheit von vier Introns mit Längen von 65 bp, bzw. 62 bp bzw. 63 bp bzw. 57 bp (Fig.4) zu postulieren.

Eine Phage, der aus Phagen M 13mp8 und dem 0,8kb Sall-EcoRl-Fragment von Plasmid pPL29-5 erhalten wurde, enthaltend 130 Nucleotide des Promotors und des N-terminalen Teils des PLI-Gens, wird mit M 13mp8(Sill-EcoRI) bezeichr Λ und in weiteren Schritten zur Herstellung anderer DNA-Moleküle gemäß der Erfindung verwendet.

-6- 283

Solche anderen DNA-Mole <ülo gemäß dor Erfindung, die Fragmonto der DNA-Soquenz dor Formel I enthalten, können, wie in den Fig. 5 bis 9 beschrieben, aufgebaut wo'den, wobei gewünschtonfalls neue Rostriktionsstellon eingeführt werden können, 2. B. eine BssHII-Reptriktionsstollo innerhalb der Start-Sequenz des PLI-Gens. Solche DNA-Molokulo sind die Plasmide oder PhagenpUBE5, MBmpe-PUSall-EcoRilBssHII/BEBIFig.B), pLHK3(Fig.7),pLHL&, Miampie-PLISpelEcoRDBssHII/ACB pLHLT7 (Fig.9), wovon die letzterem drei Plasmide das Strukturgen enthalten, das für Dosul'atohirudin kodiort. Mutanten, die neue Restriktionsstellen enthalten, können beispielsweise in vitio durch gezielte Mutagenoso gemäß üblichen Methoden hergestellt werden (vergl. Review-Artikel von M. J. Zoller und M. Smith, Methods Enzymol. 100,468 (1983), D. Botstein und D.SI.ortle, Science 229,1 193 (1985) oder K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11,5103 (1983)).

Beispielsweise wird eine Mutante der vorliegenden DNA-Sequenzen vom M 13mp8PL(Sal-EcoRI)-Phagen abgeleitet, der den Promotor und das Ausscheidungssignalgen von PLI enthält. Die Einführung einer neuen BssHII-Restriktionsstelle in die Stait- bzw. Signal-Sequenzregion des MI3mp8PL(Sal-EcoRI)-Gons wird unter Verwendung eines chemisch synthetisierten Primer-Oligonucleotids durchgeführt, welches komplementär zu der DNA-Sequenz in Positionen 36-54 ist, die nahe dom C-terminalen TeM d<jr PLI-Signal-Sequenz gelegen ist, mit Ausnahme, daß bei Position 45 eine C/G-Transversion (mutagener Primer) eingeführt wird.

Der mutierte Phage, der die neue BssHil-Stelle trägt, wird als M 13mp8PL(sal-EcoRI)BssHII bezeichnet und kann zum Aufbau der Exprossionsvektoren für h< mologe oder heterologe Gene verwendet werden.

In einem entsprechenden Beispiel wird das Desulfetohirudin-Gen von pML310 (EP 168342) in den Phagen M 13mp l8-PL(Spol-EcoRI)bssHII/AC5 (Fig. 6 bis 9) reklonlert. Ein Hgal/BssHII-Llnker wird aufgebaut, um die Hgal-Restriktionsstelle des Desulfatohirudin-Gens von p.nL301 L mit der BssHII-Stelle von M ISmpie-PUSpel-EcoRDBssHII/ACS kompatibel zu machen. Die Linkor-DNA wird an die gespaltene Phogen-DNA gebunden. Die Phagen-DNA, die das Linkerfragment trägt, wird mit Hindlll aufgetrennt, was zwei Fragmente ergibt. Das 0,7 kb-Fragment, welches die Signal- bzw. Startstruktur von PLI und das Verbindungsfragment enthält, wird isoliert. Ein geeignetes Replikationsplasmid, das eine BamHI-Restriktionsstelle trägt, wie pBR322, wird mit BamHI gespalten. Das zu Monierende Gen wird mit geeigneten Restriktionsenzymen aus der genomischen DNA, Plasmid- oder Phagen-DNA herausgelöst und, falls notwendig, mit den erforderlichen ko npatiblen Restriktionsstellen versehen.

Eine andere Methode, um die Restriktionspunkte kompatibel zu machen, ist die in vitro-Mutagenese, wie sie beispielsweise beim Aufbau von pML301 L (Fig. 6) durchgeführt wird. Ein Verbindungsstück, enthaltend eine HgAI-Restriktionsstelle, wird hergestellt und an das 5'-terminale Ende des Desulfatohirudin-Gens geknüpft.

Für höhere Expressionsraten kann irgendeine eukaryotische Terminator-Sequenz mit dem Ende des Strukturgeris verknüpft werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Terminatorregion des PLI-Gens verwendet. Beispielsweise kann ein Expressionsvektor, der den Termin.,(orpunkt von PLI enthält, durch Modifikation des oben beschriebenen Verfahrens in der folgenden Weise erhalten werden. Der Promotor und die Ausscheidungs-Start-Sequenzen werden aus dom Plasmid M ISmpie-PLfSpel-EcoRll-BssHII/ACö erhalten. Die Terminatorregion wird aus pPL35-5 erhalten. M ISmpie-PLfSpel-EcoRD-BssHII/ACS wird mit BssHII gespalten, und ein BssHII-Hgal-Linker wird angefügt. In einer Modifikation wird Plasmid pPL35-5 mit Pstl gespalten, was zwei Fragmente ergibt, an die wiederum ein geeigneter Linker, der mit dem 3'-Ende des geklonten Gens kompatibel ist, angekoppelt wird. Die „sticky ends" der Pstl-Restriktionsstellen werden durch das Enzym T4-Polymerase aufgefüllt und es wird ein BamHI-Linker zugefügt, der beispielsweise von Biolabs, New England, bezogen werden kann. Das pPL35-5-Plasmid wird mit Nhel gespalten und das sich ergebende 0,7 kb-Fragment, das die Terminatorregion von PLI enthält, wird isoliert. Zur Verbreiterung bzw. Vermehrung kann irgendein Plasmid, das verträgliche Restr'ktionsstellen besitzt, verwendet werden, z. B. pUC 18. Im Fall« von pUC 18 wird das Plasmid mit Hindlll und Xbal gespalten. Vier DNA-Fragmente, das M13mp 1 e-PLfSpel-EcoRDBssHIKACö-Fragment, das den BssHII-Hga-l-Linker trägt, das 0,7kb-Fragment von pPL35-5, das den BamHI-Linker trägt, Hindlll/Xbal-gespaltenes pUC 18 und das Hgal-BamHI-Fragment des Desulfatohirudin-Gens, werden ligiert, um pLHL7 tu bilden (Fig.9).

Bakterien werden durch eine übliche Methode transformiert und die Transformanten werden aufgrund ihrer Resistenz, z. B. gegenüber Tetracyclin, identifiziert.

Insbesondere werden die beschriebenen Expresiionsvektoren in geeigneten E.coli-Wirtsstämmen, wie HB101, vermehrt, transformiert (10) und nach auf diesem Gebiet üblichen Methoden selektiert. Die vermehrto Plasmid-DNAwird aus den Bakterien durch übliche Methoden, insbesondere wie von Birnboim & DoIy beschrieben (17), isoliert. In ähnlicher Weise können andere Plasmide mit anderen homologen oder heterologen Genen aufgebaut werden. Die in vitro-Synthese ist besondere anwendbar zur Herstellung von kleineren Fragmenten des PL-Expressionssystems, z. B. der DNA-Sequenzen, welche für den Promotor oder besonders die Start-Sequenz von PLI oder Mutanten davon kodieren. DNA-Moloküle, gemäß der Erfindung hergestellt, die den PLI-Promotor und gegebenenfalls die PLI-Start-Sequenz, das PLI-Strukturgen, irgendein anderes heterologes Strukturgen und/oder den PLI-Ter.iinator enthalten, können auch verwendet werden, um Fadeiipilze, wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, z.B. A.niedulas, A.oryzae, A.carbonarius und insbesondere A.niger, zu transformieren.

Um die Selektion der transformierten von den nicht-transformierten Pilzen zu ermöglichen, tragen die DNA-Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder, alternativ, werden die Pilzo mit einem zweiton Vektor, der einen solchen Marker enthalt, kotransformiert. Wis in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmarker ein exprimierbares Strukturgen, dessen exprimiertos Polypeptid (ein Enzym) Resistenz gegen Verbindungen verleiht, die für den Transformanten toxisch sind, oder welches das Enzymsystem eines Mutanten, dem ein solches wesentliches Polypeptid fehlt, ergänzt. Solche Markergene sind beispielsweise die bekannten qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- oder argB-Gene.

Innerhalb des Bereichs der Erfindung wurde ein neues Markergen mit dem Namen pyrA aus der Genbank von A. niger isoliert, das mit dem μ·,··: 3 von A. nidulans und pyr4 von N. crassa verwandt ist und eine ähnliche Funktion hat, nämlich die Erzeugung des Enzyms Orotidin-B'-phosphat-decprboxylase. Dieses Enzym katalysiert die Decarboxylierung von Orotidin-5'-phosphat zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluororotsäure zum toxischen Fluoro-uridin. Ein E.coli-Klon, enthaltend das pyrA-Gen, wurde durch Hybridisierung mit dem 1,1 kb Hindlll-Fragment von pDJB 2 (26), enthaltend einen Teil des pyr4-Gens, identifiziert, jeduch kann DNA von irgendeinem anderen pyr-Gen, das Orotidin-5'-phosphat-decarboxy!ase kodiert, verwendet werden. Aus einem positiven Klon mit der Bezeichnung E.coli B75183/pCG ö9 D7 wurde das Plasmid pCG 59 D7, welches das

pyrA-Gen enthält, isoliert und zur Kotraneformation einer A. nlger pyrA~-Mutante verwendet. Einer solchen pyrA~*Mutante fehlt das Orotidin-ö'-phosphat-decarboxylase-Gen, und sie Ist daher nicht in der Lage, das entsprechende Enzym zu produzieren. Eine solche Mutanto wurde durch Behandlung von Konidiosporen von A. niger N 756 unter mutagener UV-Bestrahlung hergestellt und Kolonien, welche in Anwesenheit von Fluor-Orotsäure und Uridin überleben, werden ausgewählt. Kolonien, welche in Anwesenheit von Fluororotsäure und in Abwesenheit von Uridin überleben, werden entfernt. Die verbleibenden, Uridin benötigenden Mutanten gehören je nach ihrer Fähigkeit, transformiert zu werden, zu zwei ergänzenden Gruppen pyrA und py rB, die durch die Mutanten An 8 bzw. An 10 repräsentiert werden. Sie werden in Form ihrer Protoplasten unter transformierten Bedingungen mit dem pyrA enthaltenden Plasmid pCG59D7 behandelt. Es wurde gefunden, daß nur die Αηθ-Kolonien transformiert wurden und das pyrA-Gen enthielten, wie dies durch die hybrisierende Fähigkeit von deren abgebauter DNA mit DNA von pUN 121 gezeigt wurde.

Die Erfindung betrifft auch das Selektionsmarker-Plasmid pCG 59D7, einen Wirt, der dieses enthält und die pyrA-Mutante A. niger An 8 und Verfahren zu deren Herstellung.

Die Erfindung betrifft weiterhin Wirte, die mit den Hybridvektoren der Erfindung transformiert sind, und Methoden zu ihrer Herstellung. Solche Transformanten sind beispielsweise Bakterien, wie E.coil, oder Fadenpilze, wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, und insbesondere A. nidulans, Al. oryzae, A.carbonarius oder vorzugsweise A. nigor, z. B. A. niger An8. Dio Erfindung betrifft auch eine Methode zur Herstellung solcher Transformanten, umfassend die Behandlung eines Wirts unter transformierenden Bedingungen mit einem rekomblnan'.on DNA-Molekül, insbesondere einem Hybridvektor gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit einem Selektionsmarkergen und Selektieren der Transformanten. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der rekombinanten DNAs oder eines Derivats davon zur Herstellung von Hybridvektoren, welche nützliche Polypeptide, z. B. PLI, Desulfatohirudin und dergl., exprimieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Methode zur Herstellung vo ι Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hybridvektor der Erfindung in einem geeigneten Wirt exprimiert und das Polypeptid durch übliche Methoden isoliert wird. Diese Methode umfaßt dio Überproduktion von PLI in Aspergillus-Arten durch Züchtung eines Aspergillus-Wirts, der mit einem Expressionshybrid-Vektor für die Expression und Sekretion von PLI transformiert wurde, und Sammeln von PLI aus dem Nährmedium.

Ausführungsbeisplel

Die Erfindung soll anhand von Figuren in Beispielen näher erläutert werden.

Fig. 1: zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pCG3B 11, enthaltend ein Sau3AI-Fragment des A. niger-StammesN756; Fig.2: zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pP 129-5, enthaltend das N-terminale EcoRI-Fragment der DNA der Formel I; ng. 3: zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pP 136-5, enthaltend das C-terminale EcoRI-Fragment der DNA der Formel I; Fig. 4: zeigt die DNA der Formel (I) mit Angaben einiger Reotriktionsstellen und die Start- und Struktur-Aminosäure-Sequenzen

von PLI; Fig. 5: zeigt den Aufbau von pUBE5 aus M 13mp8-PL(Sall-EcoRI)-BassHII/BE5 und pUN 121. pUBE5 enthält einen Teil des

PLI-Promotors, die Start-Sequenz mit dem BssHII-Restriktionspunkt und einen Teil des PLI-Strukturgers; Fig.6: zeigt den Aufbau von pHL310L, enthaltend das Desulfatohirudin-Gen; Fig.7: zeigt den Aufbau von pLHK3, enthaltend einen Teil des PLI-Promotors, die Start-Sequenz mit der BassHII-

Restriktionsstelle, den Linker BssHII-Hgal und das Desulfatohirudin-Gen; Fig.8: zeigt den Aufbau von pLHL5, enthaltend cien PLI-Promotor, die Start-Sequenz mit der BssHII-Restriktionsnelle und das

Desulfatohirudin-Gen; und Fig.9: zeigt den Aufbau von pLHLT7, enthaltend den PLI-Promotor, die Start-Sequenz mit der BssHII-Restriktionsstelle, das Desulfatohirudin-Gen und den PLI-Terminator.

Die in den Anmeldeunterlagen angeführten Literaturstellen sind am Ende der Unterlagen in einem Literaturverzeichnis zusammengefaßt.

In den Beispielen, die zur Erläuterung der Erfindung dienen, sie jedoch in keiner Weise beschränken sollen, haben die Abkürzungen folgende Bedeutungen:

bp	Basenpaare
BSA	Rinderserumalbumin
cpm	Impulse pro Minute (radioaktiver Zerfall)
dATP	2'-Desoxyadenosin-triphosphat
dCTP	2'-Desoxycytidin-triphosphai
dGTP	2'-Desoxyguanosin-t.iphosphat
dTTP	2'-Desoxythymidin-triphosphat
dNTP	Mischung von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
CIAP	alkalische Phosphatase aus Kalbsdärmen
DNA	Desoxyribonucleinsäure
DTT	1,4-Dithiothreit
EDTA	Ethylendaimin-tetraessigsäure-dinatriumcalz
h	Stunden
IPfG	Isopropylß-D-thio-galactopyranosid
kb	Kilobasen
min	Minuten
PL	Pektinlyase I
PTH	Phenylthiohydantoin

RF-DNA Doppelstrang replikative Form von DNA

RNA	Ribonucleinsäure
rpm	Umdrehungen pro Minute
SDS	Natrkimdodecylsulfat
SS	einzolstranglg
RT	Raumtemperatur
Tris	Tris-(hydroxymethyl)-amlnomethan
tRNA	Transfer-RNA
U	Einheiten
Mg	Mikrogramm
vo I	Volumen
X-GAL	S-Brom^-chlor-S-indonyl-ß-galactosld.

Puffer, Medien, Reagentlen

ss-Denhardt: 0,02% Ficoll (Sigma), 0,02% Polyvinylpyrrolidon (Sigma), 0,02% BSA (Sigma), ΙΟΟμρ/ηηΙ denaturierte Lachsspermen-DNA (Sigma)

EcoRI-Puffer: 0,01 M Tris-HCI pH 7,5 0,1 M NaCI 0,01 Wi MgCI₂ · 1 mM 2-Mercaptoethanol HgalPuffer: 5OmM NaCI, 1OmM MgCI₂,1 mM DTT, ΙΟΟμρ/ml, BSA, 6mM Tris-HCI pH 7,4 IPTG: 10OmM Isopropyl-ß-D-thio-galactopyranosid (23,8 mg/ml in H₁O) -unmittelbar vor Verwendung herz'istellen LB-Medium: 1 % Bacto-trypton (Difco), 0,5% Bacto-Hefeextrakt (Difco), 17OmM NaCI, eingestellt auf pH 7,5 mit NaOH Verbindungspuffer: 2OmM Tris-HCI, 1OmM MgCI₂,1OmM Dithioerythrit, 0,6mM ATP, pH 7,0 TBE-Puffer: 11 enthält 10,8gTris, 5,5g Borsäure,4ml 0,5M EDTA (pH8,0)

TE-Puffer: 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA niedriger TE-Puffer: 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 0,1 mM EDTA

Topagar: pro Liter 10g Bacto-trypton, 8g NaCI, 8g Agar

2xTY-Medium: pro Liter 16g Bacto-trypton, 10g Hefeextrakt, 5g NaCI

X-GAL: 2%(5-Brom-4-chior-3-indonyl-ß-galactosid)in Dimethylformamid-unmittelbar vor Anwendung herzustellen SOC-Medium: 2% Bacto-trypton (Gibco), 0,5% Hefeextrakt (Gibco), 1OmM NaCI, 2,5mM KCi, 1OmM MgCI₂,5mM MgSO₄,2OmM GluKose

Kinase-Puffer: 5OmM Tris-HCI, 1OmM MoCI₂,5mM DDT (pH 7,5)

X-gal-Platten: 0,002% X-GaI, 0,07mM IPTG NET: 0.15M NaCI,0,015M Tris. HCI (pH /,5), 1 mM EDTA Minimalmedium für E.coli: 0,6% Na₂HPO₄,0,1 % NH₄CI, 0,05% NaCI, 1 mM MgSO₄,0,01 mM CaCI₂,1 mM Thiamin-HCI, 0,2% Glukose

Minimalmedium für A.niger: 1 Liter enthält 6g NaNO₃,0,52g KCI, 0,52g MgSO₄ χ 7H₂0,1,52g KH₂PO₄, Spuren an Zn, Fe, 10g

Glukose, eingestellt auf pH 6,5 mit NaOH . .,

Komplettmedium für A.niger: Mycophil-Agar (BBL)

PCT: 25% Polyethylenglykol 6000 (Merck, Darmstadt) in 10 mM Tris.HCI (pH 7,5), 50 mM CaCI₂ Sporulationsmedium: 10g/l Phytonpepton, lOg/l Glukose, 10g/l Agar

SSC: 0.15M NaCI, 0.015M Natriumeitrat.

Für die Platten werden alle Medien durch Zugabe von 1,5% Bacto-Agat (Difco) verfestigt.

Die folgenden Stämme werden verwendet

E.coli Stamm HB101: F", hsdS20 (r"_BTi-B), recA13, ara14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (str^R), xyl-5, mtl-1, supE44, λ" (Maniatis et

E.coli Stamm BJ5183: F", endA, sbcB", recBC", galK, met", str^B, thi-1, bioT, hsdR (ry, m_K ⁺), λ (Hanahan (101) E.coli Stamm JM101: supE, thi, A(lac-proAB), (F', traD36, proAB, lac19ZAM15) (Yanish-Perron et al (25]) Aspergillus niger Stamm N756: Der A.niger Stamm N756 wurde ausgewählt wegen der honen Produktion von pektinolytischen Komplexenzymen.

Die folgenden Vektoren werden verwendet M13mp-Phase

Die M13mp8,9,18,19-Vektoren (28) sind Derivate des Einzelstrang-DNA-Bakteriophagen M13 und werden benutzt, um die DNA-Sequenzierung zu erleichtern, indem das Klonen der DNA-Fragmente an einer anpassungsfähigen Polylinkerstelle und das Klonen des gleichen Restriktionsfragments in beiden möglichen Richtungen ermöglicht wird. Sequenzen, die in diese Vektoren geklont sind, können leicht als Vorlage für sequenzierende Reaktionen oder die Produktion von Einzelstrang-Teilstücken unter Verwendung eines S'andard-Oligodesoxyribonucleotid-Primers und des Klenow-Fragments von E.coli DNA-Polymerase I verwendet werden. Die Vektor DNA trägt den E.coli lac-Operon-Promotor und die genetische Information Her ersten 145 Aminosäuren der ß-Galactosidase. Die Polyverbindungssequenzen, die mehrere Restriktionsstellen enthalten, werden in die lacZ-Sequenz eingeschoben. Die Polylinkersequenz behält den lacZ-Ableserahmen und der Vektor ergibt eine adele Komplementation eines LacZa-Wirtsstamms und gibt blaue Plaques auf Platten, die IPTG und X-gal enthalten. Rekombinante Phagen, welche Inserts enthalten, die den Ableserahmen zerstören oder anderweitig mit der Expression des lacZa-Peptids interferieren, werden als färblose Plaques gefunden.

pUC18-Plasmid

Das pUC18-Plasmid (28) kann zum Klonen der DNA-Sequenzen in der lacZa-Region verwendet werden und liefert c'sn Nachweis für Transformanten, welche rekombinante Plasmide auf Basis ihres Lac-Phänotyps enthalten. Die Bakterien, welche die Plasmide aufgenommen haben, ohne daß sie eingefügt wurden, ergeben blaue Kolonien auf Indikatorplatten (Platten mit X-gal), während solche, welche rekombinante Plasmide aufgenommen haben, weiße Kolonien ergeben. Plasmid pUC18 snthält bestimmte Klonierungsstellen in der lacZa-Region, komplementär zu denen des M13mp18-Phagen. Das Plasmid trägt ein Gen für ampⁿ.

pML310-Pldsmld

pML310 ist in dar europäischen Patentanmeldung 0168342 beschrieben, pML310 wird durch amp", den trp-Promoter und ein Gen, das für Desulfatohirudin kodiert, einen Throm-bin-lnhibitor, der in der Natur in Blutegeln vorkommt, charakterisiert.

pUN121-Plasmid

Plasmid pUN121 (Nilsson et al. (9)] kann als Monierender Vektor verwendet werden, der oine positive Selektion von Transformanten erlaubt, die Plasmide mit DNA-Einschüben aufnehmen. Das Plasmid enthält das cl-Gen des Bakteriophagen lambda und das tet-Gen. Bakterien, die pUNi 21 aufgenommen haben, sind für Tetracyclin empfindlich, da das tet-Gon von dom rechten Promotor des Bakteriophagen lambda transkribierv wird, und dieser Promotor kann durch den cl-kodierten Repressor unterdrückt werden. Der Einschub der DNA-Fragmente in eine der Restriktionsstellen des cl-Gens inaktiviert das Repressorgen und liefert Tetracyclin-resistente Transformanten. Außerdem hat das Plasmid pl)N121 ein funktionellos amp-Gen, so daß eine Vermehrung der Plasmid DNA unter selektiven Bedingungen durchgeführt werden kann.

pBR322-Plasmld

Das Plasmid p8R322

trägt Gene für die Resistenz gegenüber den Antibiotika Ampicillin (amp^R) und Tetracyclin (tet^R). Das wovon einige entweder in dem amp- oder tet-Gen lokalisiert sind, so daß der Einschub von geklönter DNA zu antiobiotisch empfindlichen Bakterien führt.

pDJ32-Plasmld

Dieses Plasmid wurde von Ballance und Turner beschrieben (26).

Beispiel 1 Isolierung und Charakterisierung von Pektlnlyase I Beispiel 1.1 Amlnosaure-Sequenzbestlmmung das N-termlnalen Abschnitt· der Pektlnlyate I

Pektinlyase I wird gereinigt von Ultrazym^IR> (ein Gemisch von pektinolytischen Enzymen, erhalten von A. niger, Novo Industries, Kopenhagen) in Analogie zu der von F. E. A. van Houdenhoven (1) beschriebenen Methode. 2 mg Pektinlyase I werden gegen mehrere Litet destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Da^ Protein wird in 1,5ml 10OmM NaHCO₃, pH 10,0, gelöst und 3h bei Raumtemperatur gehalten. Diese Behandlung verursacht die Erhöhung der Anzahl der Stufen, die zuverlässig durch die automatische Edman-Abbaumethode (2) sequenziert werden können. Nach der alkalischen Behandlung wird das Protein gegen 11 destilliertes Wasser, 1 % Ameisensäure und anschließend destilliertes Wasser dialysiert. Der automatische Edman-Abbau wird in einem Beckman spinning-cupsequenator, Modell 890 C, durchgeführt. Das 'ntakte, reduzierte und carboxyrnethylierte Protein wird unter Verwendung eines Quadrol Einzelspaltungsprogramms (Modifikation des Beckman-Programms 072172 C) abgebaut. Der Abbau des Poptids wird unter Verwendung eines Dimethylbenzylamin-Einzel-Spaltungsprogramms (Beckman Programm 082773) oder nach dem Programm von Hunkapillei und Hood durchgeführt. Um das Auswaschen des Peptide zu verhindern, werden 2,5mg Dorsch-Parvalbumin als Träger verwendet (3). Phenylthiohydantoin-Derivate der Aminosäuren werden durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie gemäß der Methode von Frank und Strubert (4) identifiziert. Die folgende, N-terminale Aminosäure-Sequenz wild für die Pektinlyase I bestimmt:

V-G-V-X₄-G-T-P-E-G-F-A Aminosäure X₄ ist sehr wahrscheinlich Serin, jedoch wurde seine Anwesenheit nicht zweifelsfrei festgestellt.

Beispiel 1.2

Herstellung von Cyanbromid-Fragmenten von Pektinlyaso I

Die Reduktion und S-Carboxymethylierung von Pektinlyase I wird nach Crestfiald et al. (5) durchgeführt. 3g Harnstoff (ultrarein) werden in 5ml destilliertem Wasser gelöst und mit 0,5g eines Mischbett-Ionenaustauschers (Biorad Ag 501-X8) während 1 h gerührt. Nach Entfernen der ionenaustauscher-Kügelchen weren 10mg EDTA und 200mg Tris zu 4ml der Harnstofflösung gegeben und das pH wird mit HCI auf 8,5 eingestellt. Die Lösung wird auf ein Endvolumen von 5ml in einem Fläschchen mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Dann werden 5 bis 20mg Pektinlyase I, die gemäß F. E. A. van Houdenhoven (1) gereinigt wird, zugesetzt, und das Fläschchen wird unter einem Stickstoffmantel gehalten.

Schließlich werden 33μΙ P-Mercaptoethanol zugesetzt und die Reduktion 4h bei Raumtemperatur untor einem Stickstoff mantel fortgesetzt. 0,33ml einer frisch hergestellten Lösung (0,268g Jodessigsäure in 1ml 1 N NaOH) werden unter Stickstoff zudem Reaktionsgemisch gegeben und das Gemisch 15min im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten.

Die Reaktion wird durch Zugabe von ß-Mercaptoethanol gestoppt. Anschließend wird das carboxymethylierte Protein auf eine Sephadex G-25-Gelfilti ationssäu! 3 (100ml Bettvolumen) aufgebracht, welche mit einer Aluminiumfolie umwickelt ist, und mit U,5% Ameisensäure eluiert. Die Proteinfraktionen werden vereinigt und lyophilisiert.

Die carboxymethylierte Pektinlyase I (2-10 mg) wird in 70%iger Ameisensäure gelöst, und festes Bromryan wird in dem etwa 10Ofachen molaren Überschuß zu Methionin gegeben, wovon 1 Rest pro Pektinlyase I auftritt. Das Reaktionsgemisch wird kontinuierlich während 24hrs bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Reaktionsgefäß gerührt. Proben von 5μΙ werden in regelmäßigen Zeitabständen abgezogen und auf 15% SDS-PAGE analysiert, um das Ausmaß der Proteinspaltung zu kontrollieren. Nach 24 hrs wird Wasser zugesetzt und das Präparat teilweise durch Spülung mit Stickstoff eingedampft. Dieser Schritt wird zur Entfernung der Ameisensäure wiederholt.

Durch die SDS-PAGE-Analyse werden neben etwas restlicher Pektinlyase I zwei Bromcyan-Peptide, CBI und CBII, mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 16,5kD und 3OkD identifiziert. Die Reinigung dieser Fragmente wird durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung einer Sephacryl-S200-Säule (Länge 190cm, Durchmesser 1 cm), die in 2OmM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, äquilibriert ist, 10OmM NaCI, 4 M Harnstoff und 1%(Vol/Vol) ß-Mercaptoethanol durchgeführt. Das CBII-Fragment erscheint in zwei Peaks, wobei ein Peaksogar vordem restlichen, intakten Protein eluiert wird, welches daher ein Aggregat darstellen muß, und ein anderer Peak zwischen dem intakten Protein und dem kleinen CBI-Fragment.

Beispiel 1.3 AmlnosS uresequenz-Bestlmmung des N-tormlnnlen Abschnitt· von CBII der Pektlnlyase I

200 Mg des gereinigten, nicht-aggregierten CBII-Fragments von Beispiel 1.2 werden für den automatischen Edmun-Abbau (2) unter Verwendung eines Beckman eplnningcup sequenators eingesetzt. Die Umwandlung in die PTH-Aminosäuron wird nach Eindampfen der Fraktionen und Zugabe von 200μΙ 2 N HCI in Methanol zum Rückstand während 15min bei 65X durchgeführt.

Die Lösung wird dann erneut eingedampft und der Rückstand in 50μΙ THF/CH₃CN (1/1) aufgunommen. Die PTH-Aminosäuren werden durch HPLC unter Verwendung einer Zorbax CNⁿ-Säule (DuPont) nach R. Knecht et al. (6) identifiziert Die N-terminale Aminosäure-Sequenz von CBII ist die folgende:

V-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X₁₆-D-I-N-X₁₉-E X₁₆ und X₁₉ sind Aminosäurereste, die nicht identifiziert wurden.

Beispiel 2

Erstellung einer Genbank von Aspergillus nlger

Beispiel 2.1 Isolierung von hochmolekularer DNA aus Asperylllus nlger

Die Isolierung von hochmolekularer A. nigor-DNA wird nach Yelton et al. (7) durchgeführt. Konidiosporen eines A. niger Stamms N 756 werden in 200ml Minimalmedium, enthaltend 0,1 % Arginin, beimpft und in 500ml Kolben mit einem seitlichen Einstich bei 28⁰C auf einar rotierenden Schüttelmaschine während 2 bis 3 Tagen geschüttelt. Das Myzel wird durch Filtrieren ge erntet, mit kaltem, sterilem Wasser gewaschen, gefroren und in flü3sigem Stickstoff p'ilverisiert. Die Zellen werden rasch in 2( ml 5OmM EDTA, pH 8,5,0,2% SDS und 20μΙ Diethylpyrocarbonat suspendiert und durch kräftiges Schütteln während 1 min t ύ Raumtemperatur lysiert. Das Lysat wird 15min auf 68⁰C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt jnd 15min bei 120COg bei RT zentrifugiert. 16ml des Überstands werden in ein neues Rohr überführt und nach Zugabe von 1 ml 8M Kaliumacetat, pH 4,2,1 h auf Eis belassen. Der Niederschlag wird bei 25000g während 15min bei 4⁰C zentrifugiert. 12ml dieses Überstands werden gewonnen, und die Nucleinsäuren werden mit 12ml Isopropanol ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren wahrend 1,5min bei 12000g pelletiert und die Kügelchen werden erneut in 2ml TE suspendiert, enthaltend 10pg/ml RNAseA (Boehringer, Mannheim). Die DNA-Fragmente werden mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Ethanol wie von Maniatis et al.

(8) auf den Seiten 458-459 und 461-462 beschrieben gefällt.

Beispiel 2.2

Klonen von hochmolekularen DNA-Fragmenten aus Aspergillus nlger In pUN121 Die hochmolekulare DNA von Beispiel 2.1 (100μρ) wird durch Zentrifugieren gefällt und das Kügelchen wird erneut in 750μΙ Puffer, bestehend aus Tris-HCI 6mMol/l, NaCI 50mMol/l, MgCI₂ 6mMol/l, pH 7,5, suspendiert.

Partielle Verdauungen werden während 60min bei 37⁰C mit Sau3AI durchgeführt, wobei die Konzentrationen im Bereich von 0,25-0,01 U/pg liegen. Die Reaktionen werden durch Zugabe von EDTA zu den Endkonzentrationen von 2OmM beendet. Die teilweise abgebauten DNA-Fragmente werden auf einem 0,45% Agarosegel getrennt. Lambda DNA, die mit Hindill abgebaut ist, wird als Marker verwendet, um die Größe der teilweise abgebauten DNA-Fragmento zu bestimmen. Die Gelregion, welche die gewünschten Fragmente im Bereich von 15kb bis 20kb enthält, wird ausgeschnitten und in das Probengefäß eines ISCO elektrophonischen Konzentrator (ISCO GmbH) überführt, mit 0,1 TBE bedeckt und 90min bei 1 Watt elektroeluiert. Die DNA-Fragmente werden mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.

4pg der teilweise verdauten DNA-Fragmente werden erneut in Wasser suspendiert und 15h bei 15°Canl^g pUN121 Plasmid DNA [Nilsson et al. (9)], linearisiert mit Bell, in einem Gesamtvolumen von 106μΙ Ligationspuffer mit 6U T^DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) ligiert. 10 μI aliquote Anteile dieses Gemisches werden zu 210 μΙ kompetenten E.coii BJ5183-Zellen gegeben, welche zur Transformation, wie von Hanahan (10) beschrieben, hergestellt worden waren. Die Zellen werden 30 min auf Eis gehalten und 90see auf 42°C erwärmt, 2min auf Eis zurückgestellt, 800μΙ SOC-Mediurr orden zugesetzt und die Zellen werden 1 h bei 37⁰C inkubiert. Die Zellen werden auf 10-cm-Agarplatten ausgestrichen, die LB-Medium, ergänzt mit 8mg/l Tetracyclin (Sigma), enthalten. Die Platten werden 16hrs bei 37°C inkubiert. Etwa 6000 transformierte Kolonien werden erhalten, die durch ihre Tetracyclin-Resistenz charakterisiert sind. Die Effizienz beträgt etwa 12000 bis 20000 Tetracyclin-resistenter Kolonien pro μg pUN121 DNA.

Die Plasmid-Analyse von 11 willkürlich ausgewählten, rakombinanten Klonen zeigt einen mittleren DNA-Insert von 10kb. Um das Genom von A. niger (4,5 x 10⁷bp) in der Genbank fast 4fach darzustellen, werden 15360 Tetracyclin-resistente Kolonien aufgenommen und über Nacht in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten in LB-Medium, ergänzt mit 8mg/l Tetracyclin, gezüchtet. Nach der Inkubation wird Glycerin auf 50% Vol/Vol zugesetzt, und did Mikrotiterplatten werden bei -7O⁰C gelagert.

Beispiel 3

Screening der genomischen Karte von A.niger auf PLI verwandte Nucleinsäuren

Beispiel 3.1

Herstellung von Filterreplikas der Genbank

Zur Isolierung des Pektinlysse I-Gens aus der DNA-Bank, die gerrdß Beispiel 2.2 erhalten wurde, werden Filterreplikas von den 15360 ausgewählten, transformierten E.coii BJ5183-Zellen nacl. der von Gergen et al. (11) beschriebenen Methode gemacht. Die Zellen werden aus den Mikrotiterplatten auf Agarp'atton, die mit 8mg/l Tetracyclin ergänzt wurden, mittels der Stempeltechnik überführt und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Wie üblich geschnittene Whatman 541 Filterpapiere (114 χ 175mm/192 Klone) werden auf die Kolonien gegeben. Nach 2 h bei 37°C werden die Filter auf LB-Piatten, welche 250 mg/ml Chloramphenicol (Sigma, St. Louis, USA) enthalten, überführt und über Nacht bei 37⁰C bebrütet. Die Filter werden zweimal in 0,ö M NaOH, zweimal in 0,5M Tiis-HCI, pH 7,4, und zweimal in SSC gewaschen und luftgetrocknet. Die Filterreplikas können für mehrere Hybridisierungsversuche verwendet werden, wobei vorher jedesmal die oben erwähnten Waschstufen durchgeführt werden.

-11- 283 858

Beispiel 3.2

Synthese von Ollgonucleotld-Mischunyen

Die Oligonucleotide zum Screenen der DNA-Bank A. niger, erhalten gemäß Beispiel 2.2, werden gemäß der Aminosäure-Sequenz, bestimmt in den Beispielen 1.1 und 1.3, synthetisiert unter Verwendung der Phosphoramidit-Methode |M. H. Caruthers (12)) mit einem angewandten Biosystem (Modell SeOBl-Oligonuclootid-Synthosizer.

Synthese eines Ollgonucleotids, das für den N-tormlnalen Abschnitt der Pektinlyase I von Asperglllus nigor kodiert Das Oligonucleotid, dds für den N-terminalen Abschnitt des Poktinlyase I-Prnteins kodiort, wird in bezug auf seine Aminosäure-Zusammensetzung, wie in Beispiel 1 1 bestimmt, synth jtisiort. Aufgrund der genetischen Degeneration sind 256 Oligonucleotide erfordt rlich, um alle Möglichkeiten zu erfasson.

Zwei getrennte Mischungen von Oligonucleotiden werden chemisch synthetisiert, da es aus technischen Gründen erforderlich ist, die Anzahl der Nucleotide in dem Gemisch zu vermindern. Beide enthalten 128 verschiedene Oligonucleotide, wobei jedes ein komplementärer Strang derjenigen Stränge ist, die für die Aminosäure-Sequenz T₆-P-E-G-F-An kodieren. Im folgenden werden sie als Mischung 2014 und 2015 bezeichnet und bestehen aus Oligonucleotiden wie folgt:

Mischung 2014 3'TGR, GGR, CTR₂ CCR₃ AAR₃ CG5' Mischung 2015 3¹TGR₁ GGR, CTR₂ CCR₂ AAR₃ CGo' worin R₁ für A, C, G oder T stunt, R₂ für C oder T steht und H₁ für A oder G steht.

Beispiel 3.2.2

Synthese eines Ollgonucleotids, das den N-terminalen Abschnitt des C-terminalen Fragments des CNBr-zersetzten Pektinlyjse I-Protelns kodiert

Das Oligonucleotid, das für den N-terminalen Abschnitt des C-termii.älen Fragments des CNBr-zerseUten Pektinlyase I-Proteins kodiert, wird in bezug auf seine Aminosäure-Zusammensetzung synthetisiert, wie in Beispiel 1.3 angegeben. Ein Gemisch von 1OC Oligonucleotiden wird synthetisiert, das aus komplementären Strängen zu denjenigen St'ängen besteht, die für die Aminosäure- Sequenz N₁₃^-I-I-I-Qi₃₃ kodieren, und das aus Oligonucleotiden wie folgt zusammengesetzt ist;

Gemisch 2060 5'AAR₁ATR₂ ATR₂ ATR₂ CAR₃ A 3' worin R₁=C oder T, R₂ = A, T oder C und R₃ = A oder G.

Beispiel 3.2.3

³²P-Markierung der Oligonucleotid-Mischungsn

67pMol der jeweiligen Oligonucleotid-Mischungcn 2014, 2015 und 2060 der Beispiele 3.2.1 und 3.2.2 werden 5'-markiert unter Verwendung von 5OpMoI [V³²P]ATP (Amersham, Buckinghamshire, England, öOOOCi/mMol). Die Bebrütung wird bei 37°C mit 150 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (New England, Nuclear) in 500μ Kinasepuffer durchgeführt. Die Bindungsreaktion des radioaktiv markierten ATP an die Oligonucleotide wird ermittelt, indem man aliquote Anteile dar Reaktionsmischungen an 20% laufen läßt und anschließend autoradiographiert.

Beispiel 3.3

Screening der Genbank bei radioaktiv markierten Ol gonucleotid-Gemlschen 2014 und 2015 Das Screening der Genbank wurde durch die Hybridisierung mit den radioaktiv markierten Oligonucleotid-Mischungen 2014 und 2015 des Beispiels 3.2.1 durchgeführt. Partien von 20 FiLorreplikas der Genbank (Beispiel 3.1) werden in 6 x NET befeuchtet und in200ml6 x NET, 1 x ss-Denhardt, 0,1% SDS bei 49,3⁰C während 4 h vorhybridisiert. Dann werden 67 pMol der radioaktiv markierten Oligonucleotid-Mischung 2014 zugesetzt und die Hybridisierungen über Macht bei 43,3°C durchgeführt. Das glaiche Verfahren wird unter Verwendung der radioaktiv markierten Oligonucleotid-Mischung 2015 durchgeführt. Die Filter werdon zweimal während 5 min in 2 x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur, zweimal 1 h lang in 2 x SSC, 0,1 % SDS bei 49,3"C und einmal während 2h in 0,2 x SSC, 0,5% SDS bei 49,3⁰C gewaschen. Die Filter werden luftgetrocknet und 3 Tage unter Verwendung von KODAK X-omat S0282-Filmen autoradiographiert.

Mit der Oligon'icleotid-Mischung 2014 wer ·βη 33 Klone und mit der Oligonucleotid-Mischung 2015 werden 39 Klone gefunden, welche eine ziemlich starke Hybridisatiom :ntwort geben. Um eine Subbank zu erstellen, werden die 72 Klone in einer neuen Mikrotiter Platte gezüchtet und auf Whatman 541 Filter gemäß Beispiel 3.1 übertragen. Zwei Filierreplikas der Subbank werden mit beiden Teilstücken individuell hybridisiert, gewaschen und autoradiographiert. Mit der Oligonucleotid-Mischung 2014 hybridisisren nur die Klone, welche durch Hybriaisierung mit der Oligonucleotid-Mischung 2014 erhalten wurden. In gleicher Weise hybridisieren mit der Oligonucleotid-Mischung 2015 nur die Kloro, welche c'urch Hybridisierung mit der Oligonucleotid-Mischung 2015 erhalten wurden.

Beispiel 3.4

Screening der Subbank mit der Oligonucleotid-Mischung 2060

Die Filterreplikas der Subbank (72 Klone), die in Beispiel 3.3 erhalten wurde, werden in 6 x NET befeuchtet und 4 Ii in 1EmI 6 χ ΝΠΤ,1 χ ss-Denhardt, 0,1%SDS bei 32⁰C vorhybridisiert. 8pMol der Oligonucleotid-Mischung 2060,diewiein Beispiel 3.2.3 beschrieben radioaktiv markiert ist, werden zugesetzt, und die Hybridisierung wird über Nacht bei 32°C durchgeführt. Die Filter werden zweimal während 5min jeweils ίη2 χ SSC,0,l%SDSbeiReumtempera'.ur,zweimalfür1 hjeweilsin2 x SSC-0.1% SCS hei 32⁰C und einmal für 2 h in 0,2 χ SSC, 0,5% SDS bei 32⁰C gewaschen. Die Filter werden luftgetrocknet und währe.id 3 Tagen unter Verwendung von KODAK X-omat S028k-Filmen autoradiographiert. 3 positive Klune werden gefunden, welche alle tu der Gruppe gehören, die mit dem 2014-Abschnitt, wie in Beispiel 9 beschrieben, hybridisieren; ein Klon wird als E.coli BJ5183/ pCG3B11 (kurz 3B11) bezeichnet.

Beispiel 4

Isolierung des Plasmidt pCG3B11 und Restriktlonsanalyso desselben

Vom Klon 3B11, der gemäß Beispiel 3.4 erhalten wurde, werden große Plasmidpräparato (14) hergestellt.

Das entsprechende Plasmid, mit pCG3B11 bezeichnet, wird durch vollständigen Restriktionsverdauung mit Hindlll, EcoRI und Pstl (alle Boehringer, Mannheim) analysiert und der elektrophoretischon Trennung über 1 % Agarosegel (Fig. 1) unterworfen.

Beispiels

Subklonen der EcoRI-Fragmente von pCQ3B11, enthaltend die N-termlnalen und C-turmlnalen Fraktionen des Pektinlyase I-Gens

Beispiel 5.1

Isolierung der Sau3AI-Fragmente von pCQ3BII und Einbindung in die M13DNA 1 Mg des Plasmids pCG3B11 (Beispiel 4) wird bis zur Vollständigkeit mit 18 Einheiten Restriktions-Endonuklease Sau3AI (Boehringer,Mannheim) in ?0μΙ 10mMol/lTris-HCI, 75mMol/l NaCI, iOmMol/l MgCI₂,pH7,2, während 11 bei 37⁰C abgebaut. Die Reaktion wird durch Zugabo von EDTA auf eine Endkonzentration von 2OmM beendet. Die DNA-Fragmente werden mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 20μΙ TE-Putfer wieder gelöst. 100ng der Sau3AI-verdauten ONA werden an 20ng M.13mp8-Phagen-DNA (15), die durch BamHI-Verdauung (Boohringer, Mannheim) tinearisiert ist, ligiert Die Bindung wird 4h bei 15⁰C mit 1 Einheit T4DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) in einem Gesamtvolumen von 10μΙ Ligationspuffer durchgeführt. Empfindliche E.coli JM101-Zellen werden in 5OmM CaCI; in Übereinstimmung mit dem Ameisham handbook (16), S.25, hergestellt. 0,3ml aliquote Anteile der empfindlichen JM101-Zellen werden in 15ml sterile Kulturgefäße auf Eisen übertragen. 5 μΙ der gebundenen Phagen-DNA werden jedem Gefäß zugesetzt. Die Mischungen werden 40min auf Eis gehalten. Die Zellen werden 3min bei 42⁰C einem Hitzeschock unterworfen und die Gefäße in das Eisbad zurückgegeben. Für jedes Gefäß werden die folgenden Mischungen hergestellt: 40μΙ IPTG 10OmM, 40μΙ X-gal 2% in Dimethylformamid und 200μΙ E.coli JM101-Zellen aus einer frischen, in exponentiell Wachstumsphase befindlichen Kultur. 270μΙ dieses Gemisches werden jedem Gefäß, das die hitzegeschockten E.coli JM101 -Zellen enthält, zugesetzt. 3 ml verflüssigter Topagar (bei 42⁰C gehalten) werden jedem Gefäß zugesetzt, und der Inhalt der Gefäße wird auf Agarplatten gegossen. Die Platten werden umgekehrt bei 37⁰C über Nacht bebrütet.

Beispiel 5.2

Screening der rekomblnanten Phagen mit dem Oligonucleotid-Toilstück 20CO

E. coii JM101, transformiert mit der rekombinanten Phagen-DNA, zeigen weiße Plaques auf den X-gal enthaltenden Agarplatten von Beispiel 5.1.384 davon werden aufgenommen und individuell bei 37⁰C in 1,5ml 2 χ TY-Medium, beimpft mit 15μί exponentiell wachsenden R.coli JM101-Zellen, wachsengelassen. Nach 6h werden die 384 Kulturen 5min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert uno die Phagenüberstände bei 4⁰C aufbewahrt. Jeweils 100μΙ der 384 Überstände werden auf vier Gen-Screen-Membranen (New England Nuclear) unter Verwendung einer BioDot-Vorrichtung mit 96 Schlitzen (BioRad) übertragen. Die Membranen werden 5min in 0,5 M NaOH, 1,5M NaCI und 5min in 3M NaCI, 1M Tris-HCi, pH 5,6, eingeweicht, an der Luft getrocknet und 2 h im Vakuum bei 80⁰C gebacken. Schließlich werden die vier Membranen vorhybridisiert, mit der Oligonucleotid-Mischung 2060, die wie in Beispiel 8 beschrieben, radioaktiv markiert ist, hybridisiert, gewaschen und gemäß Beispiel 3.4 eutoradiographiert. Aus dem Bindungsversuch des Beispiels 5.1 wird ein positiver, rekombinanter Phage für die weitere Analyse, bezeichnet als mp8-3A, ausgewählt.

Beispiel 5.3

Sequenzanalyse des rekombinanten mp8-3A-Phagen

Der Überstand, enthaltend den Phagen mp8-3A, erhalten gemäß Beispiel 5.2, wird zur Herstellung einer einzelstrangigen und replikativen Form DNA (RF-DNA), wie im Amersham handbook (16) auf S. 18-27 beschrieben, verwendet. Die einzelstrangigen Templates (Vorlagen) werden unter Verwendung der Ketten-Terminator-Methode, beschrieben im Amersham handbook auf den Seiten 30-35, sequenziert. Es stellt sich heraus, daß der Phage das 574 bp Sau3AI-Fragment mit der vorhergesagten Nucleotid-Seauenz des Oligonucleotid-Teilstücks 2060 in Position 584 bis 599 enthält.

Beispiel 5.4

Identifizierung der N-terminalen und C-terminalen hcoRI-Fragmente des Pekllnlyose I-Gens Die sequenzierte EcoRI-Restriktionsstelle des Phagen mo8-3A (Beispiel 5.3) wird ver /venclet, um zwei EcoRI-Fragmente, einen mit einem Gehalt des C-terminalen Teiis des die Terminator-Region umfas senden PLi-Gans, und einen mit einem Gehalt des N-terminalon Teils des die Promotor-Region umfassenden Gens, zu identifizieren und zu subklonieren. Es werden die folgenden zwei Oligonucleotide, wie in Beispiel 3.2 beschrieben, synthetisiert.

Oligonucleotid 5052: 5'TGGATGATGATGTTGGAGACs'

ber/innt bei Position 597,5' zu dem zentralen EcoPI-Punkt in Position 649/650, und erstreckt sich bis Position 577 (Komplemeniärstrang).

Oligonucleotid 5066: 5'AGGTCCAGGACAACACCTAC3'

beginnt bei Position 1020,3' zur zentralen EcoRI-stelle und erstreckt sich bis Position 1039.

Die Oligonucleotid-Mischungen 5052 und E066 werden gemäß Beispiel 3.3 radioaktiv markiert.

1 pg der Plasmid-pCGSB11 (Beispiel 11 )-DNA wird mit EcoRI (Boehringer, Mannheim) vollständig abgebaut, und die Fragmente werden auf einem 1 % Agarose-Gel getrennt. Die DNA-Fragmente werden auf eine Gene Screen membrane (New England Nuclear), wie vom Lieferanten auf S. 383-386 beschrieben, aufgetragen und die Membranen mit radioaktiv markieren Teilstücken der Oligonucleotide 5052 und 5066, wie von Maniatis et al. (8), S.387-389 beschrieben, hybridisiert. Das Teilstück 5066 hybridisiert mit einem 3,5kb EcoRI-Fragment, welches den C-terminalen Abschnitt und die Terminator-Region des

PLI-Gens enthält. Das Teilstück 5052 hybridisiert mil einem 2,9kb EcoRI-Fragment, das den N-Terminus und die Promotor-Region des Gens enthält.

Beispiel 5.5 Aufbau von pPL29-5 und pPL35-5 durch Reklonen dor EcoRI-Fragmente von pCG3B111n pUN121

4,5Mg der gemäß Beispiel 4 erhaltenen Plasmid pCG3B11-DNA werden mit 50 Einheiten EcoRI (Boehringer, Mannheim) in 50μΙ 0,01 M Tris-HCI, pH 7,5,0,1 M NaCI, 0,01 M MgCI₂,1 mM Mercaptoethanol während 2h bei 37°C bebrütet. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1 % Agarose-Gel abgetrennt, die das 2,9kb-Fragment und das 3,5kb-Fragment enthaltenden Gelscheiben werden gemäß Beispiel 5 eluiert und die DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Niederschläge werden erneut in 40μΙ niedrigem TE-Puffer suspendiert, und 10μΙ dieser Lösung werden an 100ng pUN121 (9), linearisiert durch EcoRI-Abbau, gebunden. Die Ligierung wird 4h bei 15⁰C mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligate (Boohringer, Mannheim) in 35,5μΙ 2OmMoITris-HCI, 1 mMol EDTA, 5mMol Dithioorythrit, 6OmMoI KCI, 50% Glycerin,pH 7,6, durchgeführt.

17,5μΙ aliquoter Anteile dieser Mischung werden getrennt zu 200μΙ der empfindlichen E.coli HB101-Zellen gegeben, welche zur Transformation durch Behandlung mit Calciumchlorid, wie von Maniatis et al. (8), s. 250 beschrieben, hergestellt worden waren.

Die Mischungen werden 30min auf Eis gehalton und 2min auf 42⁰C erwärmt, dann mit 1 ml SOC-Medium verdünnt und 1 h bei 37⁰C bebrütet. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 2000g während 5min gesammelt. Jedes Zellkügelchen wird in 60OuI SOC-Medium resuspendiert und auf drei Agarplatten mit einem Gehalt des LB-Mediums, ergänzt mit 8mg/l Tetracyclin, ausgestrichen. Die Platten werden 16h bei 37⁰C bebrütet.

Die Plasmide von 6 rekombinanten tetⁿ-Klonen werden von jeder Transformation durch die Methode von Birnboim & DoIy (17) isoliert und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein Klon, der das 2,9 kb EcoRI-Fragment von pCG3B11 enthält, wird für die weitere Analyse ausgewählt und als pPL29-5 (Fig.3) bezeichnet. Ein anderer Klon, enthaltend das 3,5kB EcoRI-Fragment von pCG3B11, wird ausgewählt und als pPL35-5 (Fig.3) bezeichnet.

Beispiel 6

Sequenzanalyse des Pektinlyase I Gens

Die DNA von pPL29-5 (Beispiel 5.5) enthaltend den N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens und die DNA von pPL35-5 (Beispie! 5.5) enthaltend den C-terminalen Abschnitts des PLI-ens werden, wie von Hymphreys et al. (14) beschrieben, isoliert. Teile der Inserts der Plasmide pPL29-5 und pPL35 5 werden durch Restriktion mit geeigneten Enzymen erhalten. Die Fragmente werden in Mi3mp8 und M13mpi8 subkloniert und unter Verwendung des M13-Cloning and Sequencing Kit (M 15 Sequencing Kit N.4502, Amersham) unter den vom Lieferanten (16) angegebenen Bedingungen sequenziert.

Die gesamte Sequenz des 2,7 kb Spel-Nhel-Fragments, umfassend die vollständige Sequenz des PLI-Gens, ist in Fig.4 dargestellt. Sie umfaßt 688 Nucleotide dor Promotor-Region, 1369 Reste des Strukturteils des PLI-Gens und 660 Nucleotide der Terminator-Region.

Der Sequenz von PLI, entsprechend der Aminosäure-Sequenz des N-Terminus von PLI, wie durch Aminosäure-Sequenzanalyse (Beispiel 1) bestimmt, qehsn 57 Nucleotide voraus, die für die Startsequenz

M₁-K-Y-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-A-A-A₆₇

kodieren.

Eine computergesteuerte Untersuchung auf übereinstimmende Sequenzen von Exon/Intron-Spleißverbindungen sowie auf Intron-interne Sequenzen (E.Boel et al. [18] und S.M. Mount (19)) führt dazu, die Anwesenheit von vier Introns mit Längen von 65bp bzw. 62bp bzw. 63 bp bzw. 57bp (Fig.4, unterstrichen) zu postulieren.

Die Sequenz des PLI-Gens wird durci ""T.bination der Sequenzen des EcoRI-Spel-Fragments des Plasmids pPL29-5 und des EcoRI-Nhel-Fragments von pPL35-5 (bt. Je bestimmt durch Subklonen in M13) bestimmt.

Beispiel 7

Aufbau de· Expressionsvektoren

Beispiel 7.1

Einführung eines nouen Restriktionspunktes in die Start- bzw. Signal-Seqi'onz des PLI-Gens Die Einführung einer neuen BssHII-Stelle in die Start-Sequenzregion des PLI-Gens (sequenziert in Beispiel 57 durch in vitro-Mutagenese w^;rd gemäß Zoller und Smith (20) durchgeführt. Ein Oligonucleotid, bestehend aus 19 Resten, wird nach der in Beispiel 3.2 beschriebenen Methode synthetisiert, das komplementär zu der DNA-Sequenz (Pos.35-54), wr':he für den C-terminalen Abschnitt der PLI-Start-Sequenz kodiert, mit Ausnahme des Nucleotids 10 (45), was zu einer C/G-Transversion (mutagener Primer) führt, ist. Das ausgetauschte Nucleotid 45 des mutagenen Primers wird mit · bezeichnet.

Abschnitt der PLI- rr_Trrrrrr-rrrrrrrrT^<

Start-Sequenz ^b CCTCGCTGCt-CGCGCCGCTS

36 40 50 54

n-.utagener S'CCTCGCTGCGCCCCCCGCTB'

Primer 5156

Für die in vitro-Mutagenese werden 20OpMoI des Oligonucleotids 5156 mit 2OnMoI rATP 5'-phosphoryliert. Die Reaktion wird 1 h bei 37⁰C mit 10 Einheiten F4-Polynucleotid-Kinase (Boehringer, Mannheim) in 20μΙ Kinase-Puffer durchgeführt. Die Reaktion wird durch Erwärmen auf 65⁰C während 10min beendet.

Beispiel 7.2

in vltro-Mutagenose der Template-MISmpe-PUSal-EcoRO-DNA

Dao erste in vitro-Mutagenese-Experiment betrifft einzelstrangige DNA aus dem Phagen MiSmpe-PLfSall-EcoRI), erhalten in Beispiel 6, welche das 0,8kB Sall-EcoRI-Fragment des Plasmids pPL29-5, enthaltend 117 Nucleotide des Promotors und den N-terminalen Teil des PLI-Gens, enthält. 1 pMol einzelstrangige M13mp8-PI(Sall-EcoRI)-DNA wird mit 2OpMoI mutagenem Primer 5166 (Beispiel 7.1) und 1OpMoI Universal M13-sequenzierendom Primer (N.4511, Amersham) in 10,5μΙ 0,02M Tris-HCI, μΗ7,5,0,01 M MgCI₂,0,Ü5M NaCI, 0,001 M DDT verrr ischt. Die Mischung wird schnell auf 56⁰C erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. 1 μΙ 0,2 M Tris-HCI, pH7,5,0,1 M MgCI₃,0,01 M DDT, 4μΙ 2 mM dNTP, 1 μ110mM ATP werden dem Gemisch zugesetzt, 3 Einheiten T4-DNA-Ligaso (Boehringer, Mannheim) und 2 Finheiten DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment, Amersham) werden zugegeben und die Polymerisationsreaktion wird 15h bei 15°C durchgeführt. Es werden drei Verdünnungen des Polymerisationsgemisches (1:20,1:100 und 1:500) in niedrigem TE-Puffer durchgeführt. Von jeder Verdünnung worden 1 μΙ und 5μΙ zu 300μΙ kompetenter E. coli JM101-Zellen getrennt zugesetzt, welche zur Transformation nach der in Beispiel 5.1 beschriebenen Methode hergestellt worden waren. Die Zellen werdei, auf X-gnl-Platton gegossen und weiße Plaques bildende Kolonien werden erhalten. 100 der weißen Plaques werden aufgenommen und auf LB-Platten überführt. Die mit Phasen-DNA transformierten Bakterien werden über Nacht bei 37 ⁰C wachsengelassen und anschließend auf Whatman 541-Filter gemäß beispiel 3.1 überführt. Die Filter werden gewaschen (Beispiel 3.1), dann in 6 χ NET, 1 x ss-Denhaardt, 0,1 % SDS während 30min bei 67⁰C vorhybridisiert. Die Hybridisierung wird bei RT (Beispiel 3 4) während 30min mit 15pMol radioaktiv markiertem (Beispiel 3.3) Oligonucleotid 5156 pro Filter in 6 χ SSC durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Filter während 4 χ 40sec in 6 x SSC bei Raumtemperatur gowaschen und nach dem Lufttrocknen 1 h den Kodak-XAR-5-Filmen unter Vorwendung eines ilford-Screens ausgesetzt. Die Filter werden ein zweites Mal 5 min in 6 χ SSC bei 72°C (Tm des mutagonen Primers 5156 ist 70⁰C) gewaschen, getrocknet und über Nacht einem Kodak XAR-5-Film ausgesetzt.

Kolonien, welche nach der zweiten Wasch^tufe positive Signale zeigen, werden von der Original-LBPIatte aufgenommen, in 1 ml LB-Medium suspendiert und 20min auf 70°C erhitzt. Diese Bakteriophagen-Lösung wird 1 :Ό, 1:1000 und 1:100000 verdünnt und 10 μΙ jeder Verdünnung werden dazu verwendet, 300 μΙ exponentiell wachsender E. coli JM101 -Zellen durch Übertragung zu infizieren, und auf X-gal-Platten gegossen. 6 Plaques der 1:100000-Verdünnung werden individuell in 1,5ml 2 χ TY, enthaltend 15μΙ exponentiell wachsender E. coli MJ101 -Zellen, aufgenommen und auf X-gal-Platten gegossen und 6h bei 37⁰C wachsengelassen. Die Kulturen werden 5min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, die Überstände bei 4⁰C (Phagen-Vorrat) aufbewahrt und die Zellkügelchen werden dazu verwendet, RF-Präparate nach der Methode von Birnboim & DoIy (17) herzustellen. Nach der Restriktionsanalyse mit BssHII wird ein mutierter Phage, der einen neuen BssHII-Locus in dem PLI Sa>l-EcoRI-Fragment trägt, für weitere Vorsuche ausgewählt und als [MISmpiS-PUSall-EcoRDBssHII/BEB] bezeichnet.

Beispiel 7.3

In vitro-Mutagenese von Template-M13mp18-PL(Spel-EcoRI)

Das zweite in vitro-Mutageneseexperiment wird mit Einzelstrang-DNA aus dem Phagen MISmpie-PLfSpel-EcoRI), erhalten in Beispiel 6, durchgeführt. Dieser rekombinante Phage enthält das 1,4kb Spel-EcoRI-Fiagment des Plasmids pPL29-5 und somit 688 Nucleotide des Promotors plus dem N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens. Mutagenese dieses Templates wird genau wie in Beispiel 7.2 beschrieben durchgeführt. Ein Phage, der den neuen BssHII-Punkt in dem PLI Spel-EcoRI-Einschub 'ragt, wird für vier Versuche ausgewählt und als MISmpiS-PLfSpel-EcoRDBssHII/ACo bezeichnet.

Beispiel 7.4

Der Aufbau des Plasmids pUBE5

Zur einfacheren Handhabung wird das BamHI-EcoRI-Fragmeni des Phagen MISmpS-PLISall-EcoRDBssHII/BEö, erhalten gemäß Beispiel 7.2, einschließlich 130bp der Promotor-Region und des N-terminalen Abschnitts des PLI-Gens einschließlich der neu eingeführten BssHII-Stelle in der Start-Sequenzregion, in den Plasmid-Vektor pUN121 (9), wie in Fig.5 dargestellt und im folgenden beschrieben, subkloniert.

4 μg RF DNA des Phagen MISrnpS-PLISall-EcoRIlBssHII/BEö werden gemäß Beispiel 5.3 isoliert und vollstäiid'3 mit Restriktions-Endonuclease BamHI und EcoRI (Boeluinger, Mannheim) verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und der Gelabschnitt, enthaltend das 0,8 kb BamHI-EcoRI-Fragment, bestehend aus 117 bp des Promotors und dem N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens, wird elektroeluiort, wie in Beispiel 2.2 beschrieben. Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 10μΙ Wasser (50ng/pl) resuspendiert.

2 μg pUN121 werden vollständig mit Bell und EcoRI (Boehringer, Mannheim) verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und das 4,0kb-Fragment wird gemäß Beispiel 2.2 elektroeluiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Fällen mit Ethanol wird die DNA in 18μΙ Wasser CIOOng/μΙ) aufgelöst.

300ng des BamHI-EcoRI-Fragments, umfassend die BssHN-Stelle werden an 500 ng von Bcll/EcoRI ausgeschnictena pUN121-DNA angekoppelt. Die Kopplung wird 4h bei 15⁰C mit 400 Einheiten T4DNA-Ligase (Biolabs) in 20μΙ von 5OmM Tris-HCI (pH7,8), 1OmM MgCIj, 2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP durchgeführt. 10μΙ des Kopplungsgemisches werden dazu verwendet, um 100μΙ kompetente E. coli-HB101 -Zellen (8) zu transformieren. Die Zellen werden auf LB-Platten, enthaltend 8mg/l Tetracyclin (Sigma), ausgestrichen und über Nacht bei 37⁰C bebrütet.

Plasmid-Präparate werden aus 12tet^R-Kolonien gemäß der Methode von Birnboim & DoIy (17) hergestellt und ein Plasmid mit dem gewünschten Restriktionsmuster, dargestellt in Fig. 5, wird als pUBE 5 bezeichnet und für die weitere Analyse verwendet.

Beispiel 7.5

Einführung einer Hgal-Restrlktionsstelle vor dem Desulfatohlrudln-Gen von pML 310 und Isolierung düs 0,22 kB Hgal-BamHI-Gen-Fragments

Zur Einführung eines Hgal-Restrik'ionspunktes vor dem Desulfatohin din-Gen (Fig. 0) werden 8pg der Flasmid-pML310-DNA vollständig mit Restriktions-Endonuclease EcoRI verdaut. Die aufgetrennte DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Um 5' überzählige Enden zu entfernen, werden 4 pg pML310/EcoRI-DNA in 100μΙ 15OmM NaCI, 1 mM ZnSO₄, 3OmM Natriumacetat, pH 4,6, und 20U/mI Nuclease Si (Sigma) während 45min bei 37⁰C verdaut.

Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA (pMLSIO/EcoRI/S,) wird in ΙΟΟμΙ 5OmM Tris-HCI (pH 8,0) rosuspendiert und mit 2 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdärmen (CIAP, Orthophospho-säuremonoesterphosphorylase, ^P.C 3,1.3.1, Boehringer) 1 h bei 37⁰C bebrütet. Das Enzym wird 1,5h bei 65°C inaktiviert. Die NaCI-Konzentration wird auf 15OmM eingestellt. Die desphosphorylierte DNA (pMLSIO/EcoRI/S,/CIAP) wird durch Adsorption an DE52 (Whatman)-Ionenaustauschsäule in einem Puffer mit niedriger Salzkonzentration (15OmM NaCI, 1OmM Tris.HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA) gereinigt. Die Elution wird mit einer Pufferlösung hoher Salzkonzentration (1,5M NaCI, 1OmM Tris.HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA) durchgeführt. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und in H₂O bei einer Konzentration von 8,0 mg/ml resuspendiert.

Zur Einführung einer Hgal-Stelle wird ein Oligonucleotid dei Formel

1/-AGCGTCGACGCT-3'

nach der Phosphotriester-Methode (21) synthetisiert. Die Sequenz des Oligonurleotids ist selbst-komplementär, enthaltend die Erkennungsstelle -GACGC- für die Restriktions-Endonuclease Hgal. Anlagerung von zwei Einzelsträngen führt zu einem doppolstrangigen DNA-Verbindungsstück.

1,2Mg des synthetischen, einzelstrangigen Oligodesoxynucleotids werden in ΊΟμΙ 6OmM Tris-HCI, pH 7,5,1OmM MgCI₂, 5mM DTT, 30μΰί [γ-"Ρ1 ATP (3000 Ci.mMor¹, Amersham) und 6 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (Boehringer) während 30min bei 37⁰C phosphoryliert und danach einem 15minütigen „Chase" bei 37°Cin Anwesenheit vonO,5mM ATP unterworfen. Das Gemiscn wird weiter 10min bei 75°C bebrütet, um das Enzym zu inaktivieren, ü.e Mischung wird zwecks Anlagerung der Enden auf Raumtemperatur gekühlt.

0,6pg (17OpMoI) der "P-markierten Linker-DNA werden mit 2,4 \ig (1,75pMol Enden) von pMLSIO/EcoRI/Si/CIAP vermischt und in20ul6OmMTris.HCI,pH 7,5,1OmMMgCI₂,5mM DTT,3,5mM ATP,800 EinheitenT4DNA-Ligase(Biolabs)20hbei 15°Cligiert. Die Ligase wird 10min bei 85⁰C inaktiviert und der Überschuß de Linkermoleküle durch Fällen der DNA in Anwesenheit von 1OmM EDTA, pH 7,5, 30OmM Natriumacetat, pH 6,0, und 0,54 VoI Isopropanol entfernt. Nach 30min bei Raumtemperatur wird die DNA pelletiert in 45μΙ Ligierungsmischung (wie oben spezifiziert) resuspendiert und 6h bei 15⁰C ligiert, um zirkuläre DNA zu bilden.

Aliquote Anteile von 1μΙ und 3μΙα3Γ Ligierungsmischung werden zu lOOplCalcium-behandelten, transformationsfähigen E.coli HB 101-Zellen (hergestellt gemäß der Methode von D.Hanahan (10)] gegeben. Die Zellen werden 30 min auf Eis belassen, dann 3 min bei 42⁰C bebrütet, 2min auf Eisgekühlt und dann 1 h bei 37°Cin400pl SOC-Medium bebrütet. Die Zellen werden in 100μΙ SOC-Medium konzentriert, jeweils auf LB-Agarplatten, enthaltend 50pg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über nach bei 37°C wachsengelassen.

12 transformierte amp"-Kolonien werden isoliert und individuell in LB-Medien, enthaltend 100Mg/ml Ampicillin, wachsengelassen. Plasmid-DNA wird nach der Methode von D. S. Holmes et al. (22) hergestellt. Die Anwesenheit des synthetischen Oligonucleotid-Linkers wird durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines Einzelstrang-DNA-Fragments als Primer, das den kodierenden Strang von Hirudin hybridisiert, bestätigt. Ein Klon, der die Verbindungs-DNA in der korrekten Position vor dem Hirudin-Gen enthält, wird als pML 310L bezeichnet.

Zur Isolierung des 0,22kb Hgal-BamHI-Desulfatohirudin-Gen-Fragments werden 40pg des Plasmids pML310L vollständig mit Restriktions-Endonucleasen Pvul und BamHI (Boehringer) in 150μΙ 0,01 M Tris.HCI, ph 7,5,0,1 M NaCI, 0,01 M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol während 2 h bei 37°C verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1%Agarosegel getrennt und das Gelstück, dao das 0,84kb Pvul-BamHI-Fragment enthält, wird gemäß Beispiel 5 elsktroeluiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung wird die DNA in 20plHgal-Puffer resuspendiert und vollständig mit Restriktions-Endonuclease Hgal (Biolabs) abgebaut. Die Fragmente werden auf einem 2% Agarosegel abgetrennt, und das Gelstück, das das 0,2 kb-Hgal-BamHI-Fragment enthält, wird wie vorstehend eluiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung wird das Fragment in 55μΙ sterilem Wasser (0,1 pMol/μΙ) resuspendiert.

Beispiel 7.6

Fusion der PLI-Start-Sequonz und des Desulfatohirudin Strukturgens

Um einen Linker zu schaffen zur Ligierung der BssHII-Stelle der die Signal-Sequenz (Beispiel 7.2) kodierenden Region des PLI-Gens mit der Hgal-Stelle des Desulfatohirudin-Uens (Beispiel 7.G), werden zwei Oligonucleotide, wie in Beispiel 3.2 beschrieben, cynthetisiert.

PLI-Signal-Sequenz ι N-terminale Aminosäuren

• von Desulfatohirudin ι

ALA ALA LEU ALA ALA /VRG ALA ALA ALAI YAL YAL

I I

5' 3' I

GCC GCC CTC GCT Gcg cgc ßcc get get IGTT GTT Oligonucleotid 5172 CGG CGG GAG CGA CGC GCg egg cga cgalcaa caA Qligonucleotid 5173

3¹ I 5'

DssHII

(kleine Buchstaben: Linker).

30OpMoI jedes Oligonucleoticis werden getrennt mit 40OpMoI rATP unci 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (New England Nuclear) in 15μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂, 2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 5OMgAnI BSA behandelt. Beide mit Kinase behandelten Oligonucleotide werden in einem Verhältnis von 1:1 vermischt, auf 95°C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur zum Anlagern heruntergekühlt. Die doppelsträngigen Linkerfragmente werden bei -2O⁰C aufbewahrt.

Beispiel 7.7 Aufbau von pLHK3

Zum Aufbau eines Desulfatohirudin-Expressionsvoktors (Fig. 7), der den verkürzten Promotor von PLI enthält, werden 7 \ig pUBE 5-DNA (Beispiel 7.4) vollständig mit Restriktions-Endonuclease BssHII (Boehringer) verdaut mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefallt. Die DNA (1,9pMol) wird in 10μΙ sterilem Wasser resuspendiert. 30OpMoI des zusammengefügten Linkers 5172/5173 (Beispiel 7.6) werden 1,9pMol BssHII geschnittenes pUBE5 mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 60μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂, 2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50pg/ml BSA ligiert. Die Ligierungwird15hbei15°Cdurchgeführt. Die Ligase wird durch Erhitzen auf 85⁰C während 10 min inaktiviert. Der Puffer wird auf 0,01 M Tris-HCI, pH 8,0,0,1 IV NaCI, 0.005M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol eingestellt. 36 Einheiten von BamHI (Boehringer) werden zugesetzt und der Abbau wird 2 h bei 37 ⁰C durchgeführt. Dia Fragmente werden auf einem'1 % Agarosegel getrennt und das 3,4kB BamHI-[Bashll]Hgal-Linkeifragment durch Elektroelution des Gelstücks, nachfolgende Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung isoliert. Die DNA wird in 14μΙ sterilem Wasser auf eine Konzentration von 0,1 pMol/μΙ rosuspendiert. 0,2pMol des 0,22 kb Desulfatohirudin-Hgal-BamHI-Fragments werden an 0,1 pMol der abgebauten pUBE 5-DNA ligiert. Die Ligierung wird 15h bei 15⁰C mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 10μΙ 5OmM Tris-KCI (pH 7,8,1OmM MgCI₂, 2OmM Dithiothreit, 1,OmMATP, 50μΙ/ml BSA durchgeführt.

2μΙ des Ligierungsgemisches werden dazu verwendet, um 100 μΙ von empfänglichen E.coli HB101-Zellen (8) zu transformieren, welche dann auf LB-Platten, enthaltend 50mg/l Ampicillin (Sigma), ausgestrichen werden. Die DNA von 12amp^R-Kolonien wird nach der Methode von Birnboim & DoIy (17) hergestellt und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein Klon wird für die Sequenzanalyse nach der Didesoxy-Kettenterminator-Methode von Sanger et al. (23) ausgewählt. Ein Klon, der das gewünschte Restriktionsmuster und die korrekte Sequenz innerhalb der PLI-Startsequenz-Desulfathohirudin-Verbindung zeigt, wird isoliert und mit pLHK3 bezeichnet.

Beispiel 7.8

Der Aufbau von pLHL5

Zum Aufbau des Desulfohirudin-Expessions^ektors, der die vollständige Promotbr-Sequenz des PLI-Gens enthält, werden 10^g RF DNA des Phagen MISmpie-PLISpel-EcoRO-BssHII/AC 5 (Beispiel 3.3) vollständig mit Restriktions-Endonuclease BssHII (Boehringer) verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 10μΙ sterilem Wasser auf eine Konzentration von 1,OpMoI resuspendiert. 30OpMoI des doppelstrangigen Linkerfragmems 5172/5173 (siehe oben) werden an 1,9pMol der BssHII-ausgeschnittenen Phagen-DNA, wie in Beispiel 7.7 beschrieben, ligieit. Nach Inaktivierung der T4 DNA-Ligase wird der Puffer auf 0,01 M Tris-HCI, pH 7,6,0,05 M NaCI, 0,01 m MgCI₂,0,014 M DTT eingestellt, 36 Einheiten der Restriktions-Endonuclease Hindlll (Boehringer) werden zugesetzt und der Abbau wird 2 h bei 37°C durchgeführt. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel abgetrennt und das 1,4 kb Hindlll-(BssHII]Hga-l-Linkerfragment wird durch Elektroelution gemäß Beispiel 2.2 isoliert. Das Fragment wird in 15μΙ sterilem Wasser resuspendiert und führt zu einer Konzentration von 0,1ρΜοΙ/μΙ.

3 μ Plasmid pBR322 (24) werden vollständig mit Restriktions-Endonucleasen BamHI und Hindlll (Boehringer, Mannheim) in 20μΙ 0,0¹ M Tris.HCI, pH 7.5,0,1 m NaCI, 0,01 M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoßthanol verdaut, und die Fragmente auf einem 1 % Agarosegel getrennt. Dasgroße4,15kb Hindlll-BamHI-Fragment wird gemäß Beispiel 2.2 eluiert und in 8μΙ sterilem Wasser (0,1 pMol/μΙ) resuspendiert.

0,2 pMoldesO,2kb Hgal-BamHI-Fragments von Desulfohirudin und0,2pMol des 1,4kb PLIPromotor-Startsequenz-Hindlll[8ssHlllHgal-Linkerfragments werden an 0,1 pMol Hindlll/BamHI-ausgeschnittenem pBR322 15h bei 15°C ligiert. Die Kopplung wird mit 4CO Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 10μΙ 5OmM Tris-HCI [p'A 7,8), 1OmM MgCI₂, 2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50μg/ml BSA durchgeführt. 1 pldes Ligierungsgemisches wird dazu verwendet, um 100 μΙ empfindliche E.coli-HB101-Zellen (8) zu transformieren. 12amp^R-Kolonien werden isoliert und die DNA gemäß Beispiel 7.7 analysiert. Ein Klon wird für weitere Versuche ausgewählt und als pLHL5 (Fig. 8) bezeichnet.

Beispiel 7.9

Der Aufbau von pLHLT7

Um eine Terminator-Region für das PLI-Desulfatohirudin-Expressionssystem zti schaffen, wird das 0,7 kb Pstl-Nhol-Fragment des Plasmids pPL35-5 mit dem 3' Desulfatohirudin-Gen, wie in Fig.9 dargestellt, vereinigt.

10μς pPL35-5 werdon vollständig mit Pstl (Boehringer) abgebaut. Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefallt. Die Fragmente werden in 0,033 M Tris-Acetat (pH 7,9), 0,066M Kaliumacetat, 0,01 M Magnesiumacetat, 0,5mM DTT und 100ng/ml BSA resuspendiert. 10 Einheiten T4 DNA-Polymerase (Boehnnger) werden zugosetzt und die Reaktion wird 180s bei 37⁰C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegeben, jeweils 2OnMoI dATP, dCTP, dGTP, dTTP werden zugefügt, der Puffer auf die obigen Bedingungen eingestellt und die Reaktion 35min bei 37⁰C durchgeführt. Nach Phenol/ Chloroform-Extraktion undEthanol-Fällung wird die DNA in 10μΙ sterilem Wasser (1,9pMol = 11,4pMol stumpfe Enden) resuspendiert. 90OpMoI mit Kinaso behandelte, doppelsträngige (Beispiel 7.6) BamHI-Linkerfragmente (Biolabs) werden zugesetzt und die Kopplung 15hrs bei 15⁰C mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligaso (Biolabs) in 60μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCIi, 2OmM Dithiothreit, 1,OmMATP, 50pg/ml BSA durchgeführt. Nach Inaktivierung der Ligase durch lOminütigos Erhitzen auf 85⁰C wird der Puffer auf 0,01 M Tris-HCI (pH 8.0), 0,1 M NaCI, 5mM MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol eingestellt. 20 Einheiton Restriktions-Endonuclease Nhel (Biolabs) werden zugesetzt und der Abbau 2 h bei 37 ⁰C durchgeführt. Die Fragmente werden auf einem l,2% Agaro'segel abgetrennt, und das 0,7kb Nhel-[PstllBamHI-Fragment wird durch Elektroelution gemäß Beispiel 2.2 isoliert. Das Fragment wird in 15μΙ sterilem Wasser resuspendiort, um eine Konzentration von 0,1 pMol/μΙ zu ergeben. Eine Ligierung wird mit 0,2pMol 0,7 kbNhel-lPstl]-BamHI-Termifiatorfragment, 0,2pMol 1,4kbHindlll-(BssHII|Hgal-Promotorfragment (Beispiel 7.4), 0,2pMol 0,2kb Hgal-BamHI-Desulfatohirudin-Fragment (Beispiel 7,5) und 0,1 pMol pUC18-Vektor (25), linearisiert mit Hindi!! und Xbal, durchgeführt. Die Reaktion wird mit 400 Einholten T4 DNA-Ligase (Biolabs) während 15h bei 15⁰C in 10μΐ 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50pg/ml BSA durchgeführt.

2 μΙ der Ligation werden zum Transformieren von E. coli HB101 -Zellen verwendet. 12 amp^R-Transformatoren werden ge·näß Beispiel 7.6 analysiert, und das Plasmid, welches die korrekten Fusionssequenzen zeigt, wird als pLHLT7 bezeichnet.

Beispiel 8

Aufbau eines Cotransformationssystems fi'ir A. niger

Beispiel 8.1

Herstellung von pCG59D7, enthaltend das pyrA-Gen von Aspergillus niger

300 ng eines 1,1 kb Hindlll-Fragments von pDJB2 (26), das einen Abschnitt des N. crassa py r4-Gens trägt, werden radioaktiv durch Nicktranslation nach Maniatis et al. (8) markiert. Die Filterreplikas der Genbank (Beispiel 3.1) werden in 6 χ NET befeuchtet und in 6 χ NET, 1 χ ss-Denhardt, 0,1 % SDS während 4 h bei 50⁰C vorhybridisiert. Das der Nicktranslation unterworfene Hindlll-Fragment wird zugesetzt (300 ng/80 Filter), und die Hybridisierung wird 15 h bei 50⁰C durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Filter 1 χ 5min in 4 x SSC, 0,1 % SDS bei 50⁰C gewaschen. Nach dem Lufttrocknen werden die Filter 3 Tage Kodak X-Omat SO282-Filmen ausgesetzt. Eine stark hybridisierte Kolonie, mit Eschorichia coli BJ5183/pCG59D7 (kurz 59D7) bezeichnet, wird isoliert und ein großes Plasmidpräparat davon gemacht (14). Das Plasmid wird als pCG59D7 und zur Transformation in Beispiel 9.2 verwendet.

Beispiel 8.2

Mutation von A. niger Stamm N 756 und Isolierung der für Uridin auxotrophen Mutanten Die Selektion für Mutanten von A. niger Stamm N 756, denen speziell Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase-Aktivität fehlt, kann durch positive Selektion gegen die toxische analoge Fluororotsäure (27) in Anwesenheit von Uridin durchgeführt werden.

3 x 10^eIConidiosporen von A. niger Stamm N 756 werden auf 10ml Minimalmediumplatten, ergänzt mit 1 g/l Arginin und 50mg/l Uridin, ausgestrichen. Die Sporen werden der Kurzwellen-U\/-Bestrahlung (2600Ä) in einer Dosierung ausgesetzt, welche 0,5% überlebende Kolonien ergibt. Nach 2 Tagen Bebrütung bei 28°C, wenn das auswachsende Myzel schwach sichtbar ist, werden 10mg Fluororotsäure zu jeder Platte zugesetzt, und die Bebrütung wird weitere 2 bis 3 Tage fortgesetzt. Fluororotsäure-resistente Kolonien treten als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Untergrundwachstum von weißlichem, sensitivem Myzel auf. Von etwa 40000 Überlebenden der mutagenen Behandlung werden 8 Mutanten isoliert. 2 davon, weiche gegenüber Fluororotsäure ohne Uridin-Bedarf resistent sind, werden nicht weiter verfolgt. 6 davon zeigen eine Uridin-Auxotrophie. Es werden Heterokaryonten hergestellt, indem ein Gemisch von Konidiosporen der zwei Fluorsäure-resistenten Mutanten jeweils auf Komplettmedium über Nacht angezüchtet wird. Myzelblöcke werden in Minimalmedium überführt. Mutanten, die einander in ihrer Mutation komplementär sind, zeigen Auswachsen von prototrophem, heterokaryotischem Myzel an den Enden, Stämme mit einer Mutation in dem gleichen AIIeI nicht. Die 6 Uridin-erfordernden Mutanten von Stamm N /56 fallen, wie bei S.cerevisiae (27), in zwei Komplementgruppen. Jeweils einer-An 8 und An 10- wird zur Transformation verwendet.

Beispiel 8.3

Herstellung von Protoplasten und Transformation der Uridin-Mutanten An8 und An 10 von A. niger N 756 Konidiosporen der Mutanten An8 und An 10 werden getrennt auf schrägen Platten <i bis 5 Tage bei 28⁰C in Komplettmedium gezüchtet. 2 χ 10⁸ Konidiosporen von An 8 und An 10 werden dazu verwendet, um getrennt 200 mi Minimalmedium, ergänzt mit 1 g/l Arginin und Uridin (Beispiel 8.2), zu beimpfen. Nach 20stündigem vVachstum bei 28⁰C und 180rpm wird das Myzel durch Filtrieren durch Miracloth geerntet., zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen und in 20μΙ 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂, 0,5mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30⁰C, 50rpm) bebrütet, bis eine maximale Protoplasten-Freisetzung mikroskopisch festgestellt werden kann (90 bis 120 min). Die Protoplasten-Suspension wird durch einen Glaswollepfropfen in einem Trichter filtriert, um Myzelrückstände zu entfernen. Die Protoplasten werden durch vorsichtiges Zentrifugieren (10min, 2000rpm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200-500μΙ 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ resuspendiert, um eine Konzentration von 1 x 10⁶VmI zu ergeben.

Zur Transformation werden 200μΙ aliquote Anteile der Protoplasten-Suspensionen (An8 und An 10) getrennt zusammen mit Lösungen, bestehend aus 10pg/20pl pCG59D7 DNA, 50μΙ PCT, (1OmM Tris-HCI, pH 7,5, 5OmM CaCI₂, 25% PEG 6000), bebrütet. Die Inkubationsmischungen werden 20min auf Eis gehalten, weitere 2,0ml PCT werden zugesetzt und die Gemische weitere

5min bei Raumtemperatur bebrütet. 4 ml 0,8M KCI, 5OmM CaCIj werden zugesetzt und 1 ml aliquote Anteile dieser Endtransformationslösungen mit verflüssigtem Minimalagarmedium [MM + 1 g/l Arginin + lOg/IBacto-AgarlDifco)!, stabilisiert mit 0,0 M KCI, vermischt. Die Gemische werden sofort auf Agarplatten des gleichen Mediums gegossen und bei 28^CC bebrütet.

Nach 3tägigem Wachstum bei 28⁰C treten stabile Transformanten als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Untorgrundwachstum von vielen hundert kleinen, wahrscheinlich abortiven Transformanten auf.

Die Transformation mit pCG59D7 ist nur erfolgreich im Mutanten An 8, nicht in An 10. An8 wird daher angesehen, daß ihm die Ornithin-S'-phosphatdecarboxylase-Aktivität fehlt, die durch das gesamte Genprodukt des Selektionsplasmids pCG59D7 ergänzt ist. In An8 werden etwa 20-30 Transformanten pro \ig pCG59D7 erhalten.

10 Transformanten von An8 werden aufgenommen, auf Minimalmodium subkultiviert und die DNA v/ird isoliert und auf Anwesenheit von pCG59D7-Sequenzen analysiert. DNA der Transformanten wird nach Pulverisierung desgefrorsnen Myzels in flüssigem Stickstoff gemäß einer veröffentlichten Methode (7) isoliert. 1 Mg DNA jedes Transformanten wird vollständig mit Xhol abgebaut, durch Elektrophorese über 1 % Agarosegels fraktioniert und auf Nitrocellulose-Filter gemäß Maniatis (8), S 382-386, aufgetragen. Die Auftragungen werden mit \r. ^:'p]-markierter pUN121 DNA nach von Maniatis et al.(8), S.387-389, beschriebenen Standardverfahren hybridisiert. Die erhaltenen, verschiedenen Hybridisierungsmuster zeigen die chromosomalo Integration des transformierenden Plasmids pCG59D7 an verschiedenen Stellen in das Wirtsgenom an.

Beispiel 9 Expression des Desulfatohlrudin-Gens unter Steuerung des PLI-Promoters in A. nlner Beispiel 9.1 Cotransformation des Mutanten An 8 mit pCG59D7, pLHK3, pLHL5 oder pLHLT7

Protoplasten des Mutanten An8 werden gemäß Beispiel 8.2 hergestellt und mit 5pg Solektionsplasmid pCG59D7 und entweder 10Mg Plasmid pLHK3 (Beispiel 7.7), 10pg Plasmid pLHL5 (Beispiel 7.8) oder 10Mg Plasmid pLHLT7 (Beispiel 7.9) gemäß dein in Beispiel 8.2 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Die transformierten An-8-Zellen wurden auf Minimalmedium auf Uridin-Prototrophie, wie in Beispiel 8.2 beschrieben, ausgewählt. 50 Transformanten jedes Cotransformationsversuchs werden willkürlich genommen und auf Desulfato-hirudin-Expression analysiert. Die Desulfatohirudin-Aktivität wird in einer Thrombi i-lnhibierungsbostimmung nach den Herstellerinformationen für chromogenes Peptidsubstrat getestet (Boehringer, Mannheim, BRD).

Beispiel 9.2

Expression von Desiilfatohiruclin unter der Steuerung des PLI-Promoters In Transformanten der Mutanten An 8 Konidiosporen von gemäß Beispiel 8.3 erhaltenen Transformanten werden individuell vorgezüchtet in 50ml eines Vorkulturmediums (Pectin Slow Set L (Unipectin, S.A. Redon, Frankreich) 3g/l, NH₄CI 2g/l, KH₂PO₄ 0,5g/l, NaCI 0,5g/l, Mg₂SO₄ x 7H₂O 0,5g/l, Ca₂SO₄ χ 2H₂O 0,5g/l, pH 7,0]. Die Vorkultur wird 72 hrs bei 250rpm und 28⁰C bebrütet. 10% der Vorkultur werden dazu verwendet, um 50ml eines Hauptkulturmediums (Sojabohnenmehl 20g/l, Pectin Slow Set 5g/l)zu beimpfen. Die Kultur wird 72-96h (höchste Rate der Pektinlyase-Produktion) bei 250 rpm und 28⁰C (Dezeichnet als induzierende Bedingungen) gezüchtet. Transformanten des Mutanten An8 werden ebenfalls unter nichtinduzierenden Bedingungen in Phyton-pepton 10g/l, Glukose 10g/l anstelle des Hauptkulturmediums gezüchtet.

Bei verschiedenen Zeiten (alle 20h) werden Proben entnommen, die Zollen durch zentrifugieren pelletiert und durch Ultraschallzerkleinerung gebrochen. Überstehendes und Zellextrakte werden beide auf Desulfatohirudin-Aktivität gemäß Beispiel 9.1 getestet. Es wird keine Desulfatohirudin-Aktivität festgestellt anschließend an die Cotransformation mit Plasmid pLHK3. pLHL5 und pLHL7, enthaltend den gesamten PLI-Promoter, sind beide in der Lage, die Expression des Desulfatohirudins in A. niger Mutant An 8 voranzutreiben. Von den 50 Transformanten, die von den Cotransformations-Experimenten (Beispiel 9.1) genommen wurden, zeigen jeweils 10 Desulfatohirudin-Aktivität im Medium.

Die Expression des Desulfatohirudins in Mutante An8 unter Steuerung des gesamten PLI-Promotors und unter Zuhilfenahme des PLI-Startpeptids wird daher reguliert durch Induzieren von Substratpektin und führt zur Sekretion von Desulfatohirudin in das Medium.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen wurden unter dom üudapcster \'3rtrag bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Grisebachstr.8,3400 Göttingen, hinterlegt:

nummer Hinterlegungstag

11. Dezember 1986 11.Dezember1986

2. Februar 1987

Mikroorganismen	Hinterlegt
Escherichiacoli
BJ5i83/pCG3B11	DSM 3916
Aspergillus niger An8	DSM 3917
Escherichiacoli
BJ5183/pCG59D7	DSM 3968

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinanter Hybridvektor, weicher DNA-Sequenzen enthält, die für ein Pektinlyase-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodieren, in einem Wirt dor damit transformiert ist, exprimiert wird, und daß das Polypeptid isoliert wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Überproduktion homologer Polypeptid-Genprodukte in Aspergillus-Arten besteht in Züchtung eines Aspergillus-Wirtes, der mit einem Expressionshybridvektor für dio Expression und Sekretion der Polypeptid-Genprcdukte transformiert ist, und Gewinnung der Genprodukte aus dem Nährmedium.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das homologe Genprodukt Pektinlyase I ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktion heterologer Polypeptid-Gonprodukte in Aspergillus-Arten besteht in Züchtung eines Aspergillus-Wirtes, der mit einem Expressionshybridvektor für die Expression und Sekretion der Polypeptid-Genprodukte transformiert ist, und Gewinnung der Gen-produkte aus dem Nährmedium.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Polypeptid-Genprodukt Desdlfatohirudin ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der rekombinante Hybridvektor pLHL 5 ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der rekombinante Hybridvektor pLHLT7ist.