DD240029A1

DD240029A1 - Verfahren zur herstellung eines blv-kodierten huellproteins

Info

Publication number: DD240029A1
Application number: DD85279294A
Authority: DD
Inventors: Sabine Brantl
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-08-02
Filing date: 1985-08-02
Publication date: 1986-10-15
Also published as: SU1337408A1

Abstract

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, auf der Basis des manipulierten Hefestammes ein Herstellungsverfahren fuer BLV-kodierte Huellproteine oder fuer dessen Derivate zu entwickeln. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Hefe mit einem rekombinanten Plasmid, das mindestens aus einem Replikationsursprung, einer Expressionskontrolleinheit und einer fuer ein Huellprotein kodierenden BLV-Nukleosidsequenz besteht, transformiert, diesen Wirt isoliert und unter Bildung einer grossen Population zuechtet und das BLV-kodierte Huellprotein oder dessen Derivate aus der Kultur gewinnt. Anwendungsgebiet ist insbesondere die Veterinaermedizin, vor allem die Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen durch das Rinderleukaemievirus.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines BLV-kodierten Hüllproteins oder von dessen Derivaten in einem transformierten Wirt.

Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Gentechnik, die mikrobiologische Industrie und die Veterinärmedizin, insbesondere die Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen durch das Rinderleukämievirus.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die enzootische Rinderleukose ist die ökonomisch bedeutendste Tumorerkrankung der Rinder. Sie wird durch das Bovine Leukämie-Virus horizontal übertragen. Der Erreger ist ein umhülltes RNA-Tumorvirus, das in Zellkultur (fötale Lammnierenzellen) propagiert werden kann

In allen europäischen Ländern wurden umfangreiche diagnostische Maßnahmen eingeleitet, um auf dem Boden einer sicheren und

einfachen serologischen Diagnostik unter Einsatz des viralen Hauptoberflächenproteins der Virushülle als Antigen Sanierungsprogramme der verseuchten Tierbestände durch Merzung oder Separierung der infizierten Tiere durchzuführen. Eine Vakzine steht international nicht zur Verfügung. Der Preis für eine Virusvakzine auf Zellkulturbasis ist so hoch, daß dieser Weg ökonomisch nicht in Frage kommt. Hinzu kommt, daß eine BLV-Vakzine wegen der Gefährlichkeit des Virus sicher inaktiviert werden

Das Oberflächenantigen wird vom env-Gen des viralen Genoms kodiert und entsteht durch proteolytische Spaltung und Glykosylierung einer Vorstufe des Hüllantigens.

Es sind Verfahren zur immunologischen Diagnostik von Viruserkrankungen landwirtschaftlicher Nutztiere bekannt, die auf der Verwendung von Viruspräparaten, die aus infizierten bzw. virusinfizierten Zellkulturen gewonnen werden, beruhen. Mangel der bekannten Verfahren ist ihr hoher Arbeitsaufwand, wodurch die Notwendigkeit des Erhaltens billiger Präparate von Virus-Oberflächenantigen entstand, die frei von Verunreinigungen durch andere tierische Eiweiße sind.

Die Verwendung von gentechnischen Methoden erlaubt die Lösung des Problems der Diagnostik von tierischen Viruserkrankungen auf prinzipiell neuen Wegen. Mit diesem Ziel ist die Isolierung von Genom-Fragmenten des Rinder-Leukämievirus, die das Oberflächenantigen kodieren, ihre Einführung in Mikroorganismen-Zellen als Bestandteile speziell konstruierter Plasmide, die die Replikation und Expression des für das BLV-Oberflächenantigen kodierenden Gens gewährleisten und, in dessen Ergebnis, die Biosynthese des Hüllproteins in der Mikroorganismen-Zelle möglich.

Rekombinante DNA, die die Synthese von BLV-Oberflächenantigen (gp51) in der Bakterienzelle bewirkt, wurde bereits vorgeschlagen. Mangel dieses Verfahrens ist der relativ geringe Ertrag an Expressionsprodukt, was mit der Toxizität des Expressionsproduktes für E. coli-Zellen verbunden sein mag - hervorgerufen durch hohe Hydrophobizität des gebildeten Eiweißes.

Der Vorzug der Verwendung von Hefen der Gattung Saccharomyces für die Schaffung von Produzenten-Stämmen von Oberflächenantigenen tierischer Viren besteht darin, daß diese Mikroorganismen im Unterschied zu E. coli weniger der toxischen Wirkung von hydrophoben Expressionsprodukten unterworfen sind, aber auch zur Realisierung einer Reihe von Prozessen der posttranslationalen Modifikationen synthetisierter Fremdeiweiße befähigt sind, einschließlich Processing und Glykosilierung. Diese Modifikationen sind möglicherweise auch für die Entfaltung der vollen Antigen-Eigenschaften des BLV-Hüllproteins notwendig. Es sind Konstruktionsverfahren für rekombinante Plasmide bekannt, die die Synthese von Oberflächenantigen des Hepatitis B-Virus des Menschen in Hefezellen mit hohem Ertrag gewährleisten ( ) sowie des Tollwut-C-Virus-Antigens ( ).

Die erhaltenen Derivate der erwähnten Proteine verfügen über hohe Antigen-Aktivität und können auch für Schutzimpfungen zur Erlangung von Immunität gegen durch diese Viren hervorgerufene Erkrankungen ausgenutzt werden. Auf diese Art kann das Präparat eines BLV-Hüllprotein-Derivates, das aus dem Produzenten-Stamm isoliert wurde, auch für den Erhalt ungefährlicher Anti-BLV-Vakzine benutzt werden. Es sind bereits E. coli-Stämme vorgeschlagen worden, die ein BLV-Hüllprotein-Derivat produzieren). Angaben in bezug auf Hefe-Stämme, die ein BLV-Hüllprotein-Derivat produzieren, sind gegenwärtig in der internationalen Fachliteratur nicht zu finden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, einen Hefestamm so zu manipulieren, daß er eine rekombinante Plasmid-DNA enthält, welche für ein BLV-Hüllprotein kodiert und bei der Kultivierung die Synthese des BLV-Hüllproteins mit hoher Ausbeute gewährleistet.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, auf der Basis des manipulierten Hefestammes ein Herstellungsverfahren für BLV-kodierte Hüllproteine oder für Jessen Derivate zu entwickeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß

a) Hefe mit einem rekombinanten Plasmid, das mindestens aus einem Replikationsursprung, einer Expressionskontrolleinheit und einer für ein Hüllprotein kodierenden BLV-Nucleotidsequenz besteht, transformiert wird,

b) dieser Wirt isoliert und unter Bildung einer großen Population kultiviert wird und

c) das BLV-kodierte Hüllprotein oder dessen Derivate aus der Kultur gewonnen werden.

Als Hefe wird gemäß der Erfindung Saccharomyces cerevisiae benutzt, vorzugsweise ein pho 5-deletierter und weitere Hefemarker wie Leucin-, Histidin-Auxotrophie tragender Stamm, z. B. AH 216.

Die für das BLV-Protein kodierenden Sequenzen stammen aus natürlichen oder synthetischen Nucleotidsequenzen. Eine bevorzugt eingesetzte Sequenz ist eine Nucleotidsequenz aus dem BLV-Rekombinantenklon HU-1 (ZIMET-Nr. 11085). Ebensogut einsetzbar sind Plasmid-BLV-Rekombinanten-Klone, die Restriktionsfragmente des Lambda-BLV-Rekombinantenklons von HU-1 enthalten. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung befindet sich die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nucleotidsequenz vollständig auf einem Hindlll-Pvull-2,6 kB-Restriktionsfragment, wobei der N-Terminus 0,7 kB vom Hindll!-Ort, der C-Terminus des gp51-Hüllproteins 1,6 kB vom Hind HI-Ort und der C-Terminus des gp30-Hüllproteins 2,25 kB vom Hind Ill-Ort entfernt liegen. Dieses Fragment wird mit dem durch Hindill- und Smal-geöffneten plac-Expressionsvektor pUC19 durch T4-Ligase-Behandlung verbunden, wobei das Rekombinantenplasmid penV26 (ZIMET-Nr. 11062) entsteht.

In weiterer Fortführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein BgI Il-Sma 1-0,63 kB-Restriktionsfragment von penV26-verwendet, wobei der Bglll-Restriktionsort 265 Nucleotide vom N-Terminus des Hüllproteins entfernt liegt und der Smal-Ort sich 12 Nucleotide vor dem C-Terminus des gp51-BLV-Hüllproteins befindet. Dieses Fragment, das einen Teil der Sequenz des gp51-Gens kodiert, wird durch Behandlung des Fragments mit dem Klenow-Fragment, der Polymerase I, Verbindung desselben mit synthetischen EcoRI-Linkern, Spaltung des Fragments mitXmal, Einbau des erhaltenen EcoRI-Xmal-Fragmentes in die EcoRI-Xmal gespaltene DNA des Vektorplasmides pAT1125. und nachfolgende Behandlung T4-Ligase verbunden.

Mit der erhaltenen rekombinanten DNA, die die Plasmid-DNA mit einem Teil gp51-Sequenz in richtiger Orientierung und den als Xmal-Hind Ill-Fragment vorliegenden Transkriptionsterminator des Hefe-pho-5-Genes enthält, werden E. coli-Stämme transformiert.

Anschließend erfolgt die Selektion des Klones, der das Plasmid pSG83 enthält (vgl. Schema Abb. 1).

Aus dem Plasmid pSG83 wird das 1070 Bp große EcoRI-Hind Ill-Fragment gewonnen. Dieses Fragment wird in die rekombinante DNA des Vektors YEp13, auch bekannt als CV13 (Broach), dessen DNA durch BamHI-Hindlll-Behandluna aeöffnet wurde.

gemeinsam mit einem BamHI-EcoRI-Fragment, das aus dem Plasmid pAP54 isoliert wurde und für den Promotorbereich des Hefe-pho-5-Genes mit der Signalsequenz kodiert, eingebaut und mit Ligase verbunden (vgl. Schema Abb. 2).

Mit dieser Rekombinante wird der E. coli-Stamm ΗΒ10Ί transformiert. Nach Selektion erhält man den Klon E. coli HB101/YEpSG 94, der das gp51-Genfragment in Verbindung mit dem Hefe-pho-5-lnitiations- und Terminationssignalen der Transkription enthält.

Die Auswahl des Klones erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse. Der Stamm wurde in der Allunionssammlung für Mikroorganismen des Institutes für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der AdW der UdSSR unter der Nr. hintergelegt.

Als letzter Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae AH216 mit der rekombinanten Plasmid DNA YEpSG 94 transformiert. Nach Selektion erhält man den Stamm Saccharomyces cerevisiae AH216 (YEpSG94), der bei Kultivierung das BLV-Hüllprotein expremiert. Er wurde in der Allunionssammlung für Mikroorganismen des Instituts für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der AdW der UdSSR unter der Nr. hinterlegt.

Der Promotor des Hefe-pho-5-Genes, der im Stamm Saccharomyces cerevisiae YEpSG 94 enthalten ist, ist regulierbar. Durch Verwendung bestimmter Kultivierungsbedingungen, vorzugsweise durch phosphatfreie Medien oder Medien mit organischen

Polyphosphaten, wird eine hohe Ausbeute an BLV-Hüllproteinen erreicht. ^

Das rekombinante Plasmid YEpSG 94, dessen Restriktionskarte auf Abb. 3 dargestellt ist, enthält das Replikon des Plasmides pBR322, das Replikon der Hefe-2 μ-DNA, den Promotor und den Terminator des pho-5-Gens der Hefe sowie eine verkürzte Variante des Gens gp51.

Es besteht aus folgenden Elementen:

- das 10,3 kB große BamHI-Hind Ill-Fragment von Plasmid-DNA des Vektors YEp 13;

- ein 600 bp großes BamHI-EcoRI-Fragment, das den pho-5-Promotor enthält;

- ein EcoRI-Xmal-Fragment, das das verkürzte gp51-Gen enthält, vor welchem als die synthetische Sequenz AATTCG, deren erste Nucleotide einen Teil des EcoRI-Spaltortes darstellen, eingefügt wurde;

- nach dem 6. Nucleotid der o. g. synthetischen Sequenz folgt im Plasmid YEpSG 94 die Sequenz von gp51, die in Abb. 4 dargestellt wird;

- ein Xma I-Hind Ill-Fragment, das die modifizierte Sequenz des 3'-Endes des pho-5-Gens enthält, wurde als Transkriptionsterminator benutzt. Die Nucleotidsequenz dieses Fragments rechts vom Xma 1-Ort wird weiter unten angeführt (S. 12).

Die Aminosäuresequenz dieses Fragmentes, die sich im selben Leserahmen befindet wie die Sequenz des Genes gp51, entstand durch die Verschiebung des Leserahmens der pho-5-Ausgangssequenz im Prozeß der Klonierung.

Das Molekulargewicht des Plasmides YEpSG 94 beträgt 8 MD, die Größe 11,9 kB. Die Kopiezahl der erhaltenen Plasmide beträgt etwa 10 bis 20 pro Zelle sowohl in E. coli als auch in Hefen bei Anzucht unter selektiven Bedingungen. Die Plasmid-DNA von YEpSG 94 enthält einen unikalen Restriktionsspaltort für Hind III, 2 Restriktionsspaltorte für die Enzyme Xma I, SaIGI und BamHI. Das wurde auf dem Wege der Restriktionsanalyse bestimmt (Abb. 3).

Die Restriktionsspaltorte für Xma I, SaIGI und BamHI haben in Uhrzeigerrichtung folgende Abstände vom unikalen Hindlll-Spaltort:

Xma I: 380 bzw. 6 000 bp

SaIGI: 1 900 bzw. 8 700 bp

BamHI: 866 bzw. 1 616 bp

Das Plasmid YEpSG 94 enthält die Gene:

- BLV-Hüllprotein-modifiziertes Gen gp51, das die Synthese eines Derivates dieses Proteins durch die das Plasmid enthaltende Hefezellen gewährleistet:

Dieses Gen, das zwischen dem EcoRI- und dem Xma I-Spaltort eingefühgt wurde, hat folgende Nucleotidsequenz (Abb. 4). Die Nucleotidsequenz kodiert den C-terminalen Teil des Hüllproteins gp51 von der 122. bis zur 430. Aminosäure. Vorgelagert ist eine Nucleotidsequenz, die für die 18 N-terminalen Aminosäuren des Hefe-pho-r-Proteins kodiert.

- bla-Gen, das die Synthese der ß-Lactamase und die Resistenz der das Plasmid enthaltenden E. coli-Stämme gegenüber Ampicillin bewirkt:

_tet-Qen. |_n dessen BamHI- und Hindlll-Spaltorte ein Fragment des klonierten gp51-Abschnittes mit pho-5-Promotor und -Terminator eingebaut wurde:

- Leu 2-Gen, das die Leucin-Prototrophie der das Plasmid tragenden Transformanten des Hefe-Rezipientenstammes bewirkt.

Das Plasmid YEpSG 94 wird in E. coli-Zellen durch das Vorhandensein des pBR322-Replicons repliziert. In Hefe-Zeflen gewährleistet das 2 μπη-DNA-Replicon die Replikation des angegebenen Plasmides. Die Synthese des BLV-Hüllproteins in Hefezellen geschieht unter Kontrolle des pho5-Promotors und pho5-Terminators. Die rekombinante Plasmid-DNA YEpSG94 wird in E. coli-Zellen bei Zugabe von Chloramphenicol amplifiziert. Den Produzentenstamm des BLV-Hüllproteins erhält man durch Transformation von Zellen eines pho5-deletierten und weitere Hefemarker wie Leucin-Histidin-Auxotrophie tragenden Hefestammes, z. B. AH216 mit der vorliegenden rekombinanten Plasmid-DNA. Das Synthese-Niveau des BLV-Hüllproteins im konstruierten Stamm liegt bei 100 μg/l bei einem Titer der Kultur von 1 x 10⁸/ml.

Der Nachweis des erfindungsgemäß hergestellten BLV-Hüllproteins erfolgt durch eine spezifische Reaktion mit einem Festphasen-RIA unter Verwendung von Cyanurchlorid-aktiviertem Papier als Träger, von Kaninchenantiseren, die spezifische Antikörper gegen BLV-Hüllproteine enthalten, und von ^I25-Jod-markiertem Staphylococcus aureus Protein A. Die Auswertung und Einschätzung der Expressionshöhe erfolgt autoradiographisch und durch Vergleich mit einem BLV-gp51-Standard und nichtexprimierenden Kontrollysaten bzw. -ex-trakten. Der Nachweis des BLV-Hüllproteins ist auch durch eine Elektrophorese der Syntheseprodukte anschließenden Transfer auf Nitrocellulosefilter und nachfolgende spezifische Reaktion mit dem Antiserum möglich. Alle E. coli-Stämme, die rekombinante Plasmid-DNA YEpSG 94 enthalten, sind durch folgende allgemeine Merkmale gekennzeichnet:

Morphologische Merkmale:

Gestreckte, stäbchenförmige, gramnegative, nichtsporulierende Zellen.

Kulturmerkmale:

Die Zellen wachsen gut in gewöhnlich verwendeten Nährmedien. Auf 1,5%igem Nähragar „Difco" sind die Kolonien glatt, grau, glänzend, rund mit ebenem Rand. Bei Anzucht in flüssigen YT- und LB-Medien bildet sich eine gleichmäßig intensive Trübung.

Physiko-biochemische Merkmale:

Optimale Kultivierungstemperatur: 37°C, pH-Optimum 6,8 bis 7,5. Als Kohlenstoffquelle werden viele Kohlehydrate benutzt, organische Säuren, Alkohole.

Als Stickstoffquelle dienen mineralische Salze (in Ammonium- oder Nitratform), organische Verbindungen (in der Art von Repton, Trypton, Aminosäuren).

Resistenz gegenüber Antibiotika:

Es wird Resistenz gegenüber Ampicillin (50 mg/1) ausgeprägt. Alle Hefestämme, die das Plasmid YEpSG 94 tragen, sind durch folgende allgemeine Merkmale gekennzeichnet:

Morphologische Merkmale:

runde bis ovale, nur unter Hungerbedingungen sporulierende Zellen mit Sprossungen (Tochterzellen).

Kulturmerkmale:

Die Zellen wachsen gut in gewöhnlich verwendeten Nährmedien. Auf 2 bis 2,5%igem Nähragar Difco sind die Kolonien glatt und weiß, mit ebenem Rand. Bei Anzucht in flüssigen YEPD- und YNB-Medien bildet sich eine gleichmäßig intensive Trübung.

Physiko-biochemische Merkmale:

Optimale Kultivierungstemperatur: 28 bis 30°C, pH-Optimum: 6,6. Als Kohlenstoffquelle wird vorzugsweise Glucose verwendet, in einigen Fällen Alkohole. Als Stickstoffquelle dienen (NH₄J₂SO₄ organische Verbindungen (in der Art von Pepton, Aminosäuren).

Das erfindungsgemäße Verfahren der Herstellung von Plasmid-DNA erlaubt die Schaffung eines Hefestammes, der die Synthese eines Derivates des BLV-Hüllproteins gewährleistet, das man einerseits als potentielles Präparat für die Schutzimpfung von Tieren, andererseits für die Herstellung diagnostischer Präparate zur Feststellung von BLV-Antikörpem bei infizierten Tieren verwenden

Der Vorzug des vorliegenden Verfahrens im Vergleich zu bekannten Verfahren der Herstellung von Antigenen aus Viruspräparaten, die aus infizierten Zellkulturen isoliert wurden, besteht in folgendem:

1. Sparsamkeit, da der vorliegende Stamm auf einfachen und billigen Nährmedien wächst

2. Ungefährlichkeit des Präparates bei Verwendung als Vakzine, da es keine Bestandteile infektiöser BLV-DNA enthält

3. Hohe Spezifität des Präparates als Diagnosemittel, da es als Bestandteil keine anderen tierischen Proteine enthält, deren Vorhandensein bei der beabsichtigten Verwendung des Präparates in der Diagnostik eine hohe Reinigung erforderlich machen würde.

Die Erfindung soll anschließend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Konstruktion des rekombinanten Plasmides pSG83, welches ein DNS-Fragment mit einem Teil des Genes des BLV-Hüllproteines enthält.

Das Konstruktionsschema ist auf der Abbildung 1 dargestellt. 5 μg des Plasmides penv26, das ein die Gene der Proteine gp51 und gp30 umfassendes Fragment des BLV-Genomes enthält, werden mit der Restriktionsendonuclease BgI Il in einem Puffer mit hoher lonenstärke, bestehend aus 100 mM NaCI; 50 mM Tris-HCI pH 7,5; 10 mM MgCI₂; 1 mM DTT und 1 μg RNase A in einem Volumen von 20 μΙ bei 37⁰C gespalten. Die Vollständigkeit der Spaltung wird in einem Agarosegel elektrophoretisch untersucht. Die erhaltenen Fragmente werden mit 2 Einheiten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I im gleichen Puffer unter Zusatz von 4 Desoxyribonucleosidtriphosphaten behandelt, deren Endkonzentration dabei 50 bis 100 μΜ beträgt. Die Reaktion wird 20 min bei einer Temperatur von 2O⁰C geführt. Die Inaktivierung des Enzymes erfolgt 10 min bei 70⁰C.

Die auf diese Art und Weise gewonnenen glattendigen Fragmente werden zur Ligation mit Eco-Rl-Linkern (CCGAATTCGG) benutzt. Dafür wird zu Beginn die Phosphorylierung von 5OpM Linker in einem Puffer vorgenommen, der sich aus folgenden Komponenten zusammensetzt: 66 mM Tris-HCL pH 7,6; 10 mM MgCI₂; 1 mM DTT; 1 mM Spermidin; 20 pM ( ³²P)ATP (spezif. Aktivität: 1 000 Ci/mM); 2 Einheiten Polynucleotidkinase und 100 μg/ml BSA. Die Reaktion wird in einem Volumen von 15 μΙ 30 min bei 37°C geführt. Anschließend werden ATP zu einer Endkonzentration von 1 mM sowie 2 Einheiten Polynucleotirikinase dem Ansatz zugesetzt, der weitere 30 min bei 37 ⁰C inkubiert wird. Die Kontrolle der Markierung des Linkers erfolgt durch die Behandlung eines auf einem DE 81-Filter absorbierten Teiles des Reaktionsgemisches mittels 0,5 M Na₂HPO₄.

Der markierte Linker (20 pMol) wird zu dem das die aufgefüllten BgI Il-Enden der Fragmente des Plasmides penV26 enthaltenden Reaktionsgemisch gegeben. Außerdem werden 20-40 Einheiten T4-Ligase hinzugefügt. Der Ansatz wird 16 Stunden bei 15°C inkubiert.

Danach wird das Ligationsgemisch 10 min bei 7O⁰C inkubiert und das Reaktionsgemisch 3mal mit Puffern hoher lonenstärke verdünnt. Es werden 20-30 Einheiten Restriktase EcoRI dazugegeben, wonach 3 Stunden bei 37 °C inkubiert wird. Die Vollständigkeit der Ligierung und der Abspaltung der Linker werden mit Hilfe der Elektrophorese eines Teils des Reaktionsgemisches in einem 13%igen PAAG kontrolliert. Das 1,25 kB lange, das verkürzte gp51-Gen umfassende Fragment des Plasmids penV26 wird durch Elution aus einem 5%igen PAAG gewonnen. Die entsprechende Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, homogenisiert und in 1 ml Puffer aufgenommen, der sich aus folgenden Komponenten zusammensetzt: 150 mM NaCI; 50 mM Tris-HCI pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0. Die Elution erfolgt 16 Stunden bei 37⁰C. Danach wird die Gelsuspension 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert und der Überstand durch Glaswolle filtriert. Der verbleibende Gelrest wird nochmals mit einem Volumen Puffer gewaschen, danach erfolgen wiederum Zentrifugation und Filtration. Beide Eluate werden vereint.

Um die DNS aus der so erhaltenen Lösung auszufällen, werden t-RNS zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml und 1/20 des Ausgangsvolumens einer 2%igen „Cetaflon" Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wird 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen und danach 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, der Niederschlag in 100 μ-Ι 3M-Natriumacetat pH 5,6 gelöst und 3 Teile Alkohol dazugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei -20"⁰C gekühlt und danach 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert. Der gewonnene Niederschlag wird in 100 μΙ 0,3 M-Natriumacetat gelöst und wie oben beschrieben gefällt. Der erhaltene Niederschlag wird mit 70%igem Alkohol gewaschen, getrocknet und in 10 μΙ H₂O gelöst. 7 μΙ des Fragments werden mit der Restriktase Xma I in einem Puffer, der 50 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI pH 7,6, 10 mM MgCI₂, 1 mM DTT enthält, unter Verwendung von 5 Einheiten des Enzyms in einem Volumen von 25 μΙ bei 37⁰C gespalten. Die so gewonnenen Fragmente werden durch Ligierung in den Vektor pAT 1125 eingebracht, der den Transkriptionsterminator des pho-5-Gens enthält. Der Vektor pAT 1125 wurde durch Klonierung eines 300 bp großen modifizierten Fragments (Bajna et al, Nucl. Acids Research 1984, Bd 12, 7721—7739) in den Restriktionsorten EcoRI und HindMl des Plasmids pBR322 gewonnen. Das Fragment enthält den 3'-terminalen Bereich des Gens pho-5. Die Nucleotidsequenz des 3'-terminal vom EcoRI-Ort gelegenen Teils dieses Fragments ist folgende:

GAATTXma ICCCGGGGATCGATCCTGGTACGTTCCTCAAGGTGCTCGTGTCTACACCGAAAAATTCCAATGTTCT.

Nach der Spaltung von 5 μg Vektor-DNS pAT 1125 mit den Restriktasen EcoRI und Xmal unter Standardbedingungen wird das große 4,8 kb umfassende Fragment wie oben beschrieben aus einem PAAG eluiert. Das Vektorfragment wird in 20 μΙ H₂O gelöst und zur Klonierung verwendet. Das Ligationsgemisch enthält 0,1 Mg Vektor; 0,5 μg Fragment, 50 mM Tris HCI pH 7,5; 10 mM MgCI₂; 1 mM DTT; 5 Einheiten T4-DNS-Ligase, 1 mM ATP, 10 Mg/ml BSA. Die Ligierung wird in einem Volumen von 40 μΙ über Nacht bei 4°C vorgenommen. Um die Effektivität der Insertion des Fragmentes in den Vektor zu überprüfen, wird als Kontrolle die Ligierung von 0,1 μg Vektor unter gleichen Bedingungen, aber ohne Fragment, vorgenommen. Mit dem Ligationsgemisch werden durch CaCI₂ behandelte (Cohen et al, PNAS 1972, Band 69, S. 2110-2114) kompetente Zellen des E. coli-Stammes HB 101 transformiert.

Methode der E. coli-Transformation

5 ml Übernachtkultur des Rezipientenstammes HB 101 werden in YT bei 37 ⁰C angezogen. Mit 0,1 ml Übernachtkultur werden 100 ml YT-Kultur angeimpft. Die Hauptkultur wird bis zu einer Extinktion von ungefähr 0,5 bis 0,6 bei 550 nm angezogen und 10 min bei 5000 rpm bei O⁰C zentrifugiert. Das Sediment wird im Eisbad in 50 ml sterilem, auf 0°C abgekühlter 0,1 M CaCI₂ aufgenommen und 20 min auf Eis stehen gelassen. Danach werden die Zellen - wie oben beschrieben - durch Zentrifugation geerntet und in 5 ml 0,1 ml CaCI₂ resuspendiert. Zu 200 μΙ Suspension kompetenter Zellen werden 75 μΙ Ligationsgemisch mit etwa 0,5 bis 1,0 μg DNA auf 8 x 10⁷ Zellen gegeben. Nach 30minütiger Inkubation im Eisbad erfolgt ein 2minütiger Hitzeschock bei 42⁰C. Anschließend werden 2 ml YT-Medium zugegeben und 1 h bei 37⁰C inkubiert. Nachfolgend kann auf YT-Platten mit 50 Mg/ml Ampicillin in entsprechenden Verdünnungen plattiert werden.

Die Transformanten werden auf 50 μΙ/ml Ampicillin enthaltendem Vollmedium selektiert.

12 zufällig ausgewählte Transformantenkolonien werden in 50 Mg/ml Ampicillin enthaltenden 5 ml YT-Medium angezogen und die Plasmid-DNS nach Birnboim und DoIy präpariert (Birnboim, DoIy, Nucl. Acids Res. 1979, Bd. 7, 1513-1523).

Plasmid-Minipräparation aus Transformantenkolonien

Von Transformanteneinzelkolonien ausgehend werden 2,5-ml-Kulturen in YT mit 50 Mg/ml Ampicillin unter kräftigem Schütteln bei 37°C im Verlaufe von 8 bis 12 h angezogen. Die Zellen werden durch 15sekündige Zentrifugation bei 10000 rpm sedimentiert, sorgsam in 100 ul Lösung I (25 mM Tris HCI pH 8,0; 10 mM EDTA; 50 mM Glucose) suspendiert und Lysozym zur Endkonzentration von 2 mg/ml zugegeben. Nach 5minütiger Inkubation im Eisbad erfolgt die Zugabe von 200 μΙ Lösung Il (0,2 N NaOH; 1 % SDS) und weitere öminütige Inkubation im Eisbad. Anschließend werden 150 μΙ 3 M Natriumacetat pH 4,8 bis 5,2 zugegeben und weitere 15 min im Eisbad inkubiert. Nach 15minütiger Zentrifugation bei 10 000 rpm wird aus dem Überstand durch Zugabe von 1 ml 96%igem Ethanol und 10minütiger Inkubation bei -7O⁰C — gefolgt von lOminütiger Zentrifugation bei 10 000 rpm — die DNA ausgefällt. Das Sediment wird in 0,1 ml 0,3 M Natrium-Acetat gelöst und mit 300 μΙ Ethanol bei -70⁰C erneut die DNA ausgefällt.

Das nach lOminütiger Zentrifugation erhaltene Sediment wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μΙ Wasser gelöst. Aliquote dieser Lösung werden vor und nach Spaltung mit Restriktionsenzymen in Agarose- bzw. Acrylamidgelen analysiert.

Die Spaltung von 0,5 bis 1 μg Plasmid-DNA erfolgt in 10 bis 20 μΙ Reaktionsvolumen mit 0,5 bis 1 Einheit Enzym in 2 h bei 37⁰C.

Die Plasmid-DNS der rekombinänten Klone, die ein Insert von etwa 700 bp enthalten, wird durch BamHl- und Pstl-Spaltungen analysiert. Die Klone, die das Fragment des Genes gp51 in richtiger Orientierung im Verhältnis zum Transkriptionsterminator des pho-5-Gens enthalten, zeigen im Vektor pAT1125 2 Fragmente. Bei der BamHI-Spaltung entstehen Banden von 4,19 kb und 1,22 kb sowie bei der Pstl-Spaltung 3,6 und 1,8 kb im Agarosgel. Einer der erhaltenen Rekombinatenklone wurde pSG83 genannt und im weiteren verwendet.

Beispiel 2 Konstruktion des rekombinänten Plasmides YEpSG94

Für die Konstruktion des rekombinaten Plasmides, das die Synthese eines BLV-Hüllproteinderivates in Hefezellen codiert, werden in den Shuttle-Vektor YEp13 ein Fragment des Plasmides pSG83 mit einem Teil des gp51-Gens und dem pho5-Terminator sowie ein Fragment des Plasmides pAP54 mit der Sequenz des pho 5-Promoters und die Signalpeptides'eingebaut.

Das Promoter-Fragment ist ein 600 bp großes BamHI-Rsal-Fragment des pho5-Gens (Bajwa et al., 1984, NAR13, 7221-7338), an dessen Rsal-site die Sequenz CTAGAATT anligiert wurde, so daß deren letzte 5 Nucleotide einen EcoRI-Spaltort ergeben (K. G.

Skryabin et al., unveröffentlichte Angaben). Das Konstruktionsschema des Plasmides YEpSG 94 ist auf Abb. 2 dargestellt.

10 μg DNA des Plasmides pSG83 werden unter Standardbedingungen mit EcoRI und Hindill gespalten, ein 1 070 bp großes DNA-Fragment wird aus Polyacrylamid — wie unter Beispiel 1 beschrieben — isoliert.

Aus dem Plasmid pAP54wird auf analoge Art ein 600 bp großes BamHI-EcoRI-Fragment isoliert.

10 μg DNA des Plasmides YEP13 werden mit BamHl und Hindill unter Standardbedingungen gespalten, in 1%iger Agarose aufgetrennt und ein 10,3 kb großes Fragment unter allgemein üblichen Bedingungen isoliert.

Die Ligation des BamHI-Hindlll-Vektorfragmentes mit den 2 klonierten Fragmenten BamHI-EcoRI sowie EcoRI-Hindlll wird, wie unter Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von 0,1 μg Vektor und jeweils 0,5 μg Fragment durchgeführt. Mit dem Ligationsgemisch werden komponente E.-coli-Zellen des Stammes HB101 transformiert. Es werden Transformanten des Phänotypes Leu⁺Amp⁺ selektiert. DNA aus 12 zufällig ausgewählten Klonen wird nach der Alkali-Lyse-Methode (siehe oben) isoliert.

Nach den Ergebnissen der Restriktionsanalyse wird die Plasmid-DNA ausgewählt, die Inserte von 1,7-kb-Größe enthält, die durch 745 pb-Fragmente bei Hydrolyse mit BamHl und 1 070 bp-Fragmente bei gleichzeitiger Spaltung mit EcoRI und Hindlll sowie 5080 bp und 6 820 bp bei Spaltung mit SaIGI charakterisiert sind.

Wie aus den Angaben der Restriktionsanalyse folgt, enthält die isolierte Plasmid-DNA das gp51-Fragment im Anschluß an den pho5-Transkriptionspromoter und vor dem pho5-Transkriptionsterminator.

Einer der erhaltenen Klone erhielt die Bezeichnung YEpSG94 und wurde für die weiteren Untersuchungen verwendet.

Die Restriktionskarte von YEpSG 94 zeigt Abb. 3.

Beispiel 3

Erhalt des E.-coli-Stammes HB101, der das rekombinante Plasmid YEpSG94 enthält 1 μ Plasmid-DNA YEpSG94 wurde für die Transformation kompetenter E.-coli-Zellen des Stammes HB101 nach der Methode von Cohen et al. verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Die Transformanten werden auf Petrischalen mit YT-Agar (enthaltend 50 μg/ml Ampicillin) ausplattiert. Ein 1 μg Plasmid-DNA ergibt 10^e—10⁷ Transformanten.

Zur Analyse von Einzelklonen werden jeweils 5 ml Kultur in YT mit Ampicillin im Verlaufe von 8 bis 12 Stunden angezogen und die Plasmid-DNA nach der Metode von Birnboim und DoIy wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert.

Die Plasmid-DNA wird durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI/Hindlll und SaIGI und Analyse der Spaltprodukte in 1°/oigen Agarosegelen untersucht.

Man erhält einen Stamm, der in der Allunionskollektion der Mikroorganismen am Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der AdW der UdSSR unter Nr. deponiert ist.

Beispiel 4 Gewinnung des Hefestammes AG216, der das rekombinante Plasmid YEpSG94 enthält und das BLV-Hüllprotein-Derivat

produziert.

YEpSG94 wird für die Transformation von kompetenten Zellen des Stammes AG216 (a leu 2,3-112, his 3—11, pho 3, 5); nach der Methode von Ito et al. (J. Bac, 1983,153, 163-168) verwendet. Eine Hefekolonie wird von Vollmedium in 50 ml YEPD-Flüssigmedium überführt und bei 30⁰C im Verlaufe einer Nacht inkubiert. Die Kultur wird zentrifugiert und das Pellet einmal mit folgendem Puffer gewaschen: 0,01 M Tris-HCI pH 7,4; 0,1 mM EDTA. Die gewaschenen Zellen werden in 50 ml desselben Puffers resuspendiert, der 0,1 M LiCI enthält und 1 h bei 3O⁰C inkubiert. Nach Zentrifugation werden die Zellen in 500 μΙ LiCI-Puffer suspendiert. Es werden 20Mg Plasmid-DNA YEpSG 94 zugegeben (in 40 μΙ) und das Gemisch 30 min bei 30⁰C inkubiert. Danach wird 1 ml 50%iges PEG4000 (in Wasser gelöst) zugegeben. Nach sorgsamem Durchmischen der Suspension erfolgt eine 30minütige Inkubation bei 30⁰C und danach ein 5minütiger Hitzeschock bei 42⁰C. Die Zellen werden zentrifugiert und 3mal mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in 500 μΙ Wasser gelöst und jeweils 100 μΙ auf Petrischalen mit Selektivagar (0,67% YNB, 2% Glucose, 20 Mg/ml Histidin, 2% Agar) plattiert.

Transformantenkolonien sind 2 bis 4 Tage nach Ausplattieren erkennbar.

Die mitotische Stabilität des Hybridplasmids wird als Verhältnis plasmidhaltiger zu plasmidfreien Zellen in individuellen Transformantenkolonien, die auf Mimimalagarohne Leucin gewachsen sind, geschätzt. Einzelne Transformantenkolonien werden auf Selektivagar ausgestrichen, nach Wachstum der Zellen bei 30⁰C im Verlaufe von 12 bis 20 h wird auf Vollmedium (YEPD) kloniert. Die auf Vollmedium gewachsenen Einzelklone werden danach wiederholt auf Minimalmedium übertragen zur Bestimmung des Prozentsatzes an Klonen, die ihre Leucin-Prototrophie bewahrt haben.

Die auf diese Art und Weise bestimmte mitotische Stabilität des Plasrnids YEpSG94 im Stamm AH216 beträgt 75 bis 85% (Durchschnitt aus 10 Bestimmungen).

Plasmid-DNA aus dem Transformantenstamm AH 216 wird auf folgende Art und Weise isoliert:

Zellen, die in 200 ml Minimalmedium ohne Leucin angezogen wurden, werden zentrifugiert und sorgsam mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden 10 min bei Raumtemperatur in folgendem Puffer inkubiert:

0,64 M Mercapto-Ethanol, 0,1 M Tris, 0,1 M EDTA pH 8,0. Danach werden die Zellen zentrifugiert, mehrmals mit folgendem Puffer gewaschen: 0,126 M Na₂HPO₄; 0,56 M (NH₄)₂SO₄; 0,062 M Citrat und in eben demselben Puffer resuspendiert. Es folgt eine Istündige Inkubation in Anwesenheit von 10 mg Zymolyase/5 · 10⁹ Zellen bei 30⁰C. Die Protoplasten werden durch Zentrifugation geerntet, 2mal in 1 M Sorbitol gewaschen und im Volumen von 5 ml Sorbitol nach der Methode von Bimboim/Doly die Plasmid-DNA aus ihnen isoliert. Es macht sich eine 2malige Deproteinisierung mit Phenol (Tris-gesättigt, pH 8) erforderlich.

Mit der erhaltenen Plasmid-DNA wird E. coli HB101 transformiert. Aus den auf YT mit Ampicillin gewachsenen Transformanten wird die Plasmid-DNA isoliert, mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI/Hindll BamHI und SaIGI gespalten und durch Auftrennen der Spaltprodukte in 1%igem Agarosegel die strukturelle Stabilität deraus den Hefen isolierten Plasmide bewiesen.

Der erhaltene Produzentenstamm eines BLV-Hüllprotein-Derivates ist in der Allunionskollektion der Mikroorganismen beim Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der AdW der UdSSR unter der Nr. deponiert.

Beispiel 5 Testung der Expression des BLV-Hüllproteinderivates im Lysat des Produzentenstammes

Für die Testung der Expression des gp51-Derivates im.Transformantenstamm AH216 wurden gleichzeitig unter gleichen Bedingungen ein Transformantenklon und der plasmidfreie Rezipientenstamm angezogen. 1 ml Übernachtkulturin Selektivmedium mit 1,5 g/l K-P wurde in 100 ml Vollmedium ohne Phosphat überimpft. Die phophatfreien Medien wurden nach der Methode von Rubin/ hergestellt. 50 g Hefeextrat Difco und 100 g Baktopepton werden in 1 I Wasser gelöst und Magnesiumsulfat zur Endkonzentration von 0,34 M zugegeben. Zur erhaltenen Lösung wird unter Mischen Ammoniak zur selben Endkonzentration zugegeben. Nach 2stündigem Mischen bei Raumtemperatur wird die Lösung filtriert und mit HCI auf pH 6 gebracht. Es wird 3 M Natriumacetat (pH 6) zur Endkonzentration von 0,03 M zugegeben und die Lösung autoklaviert. Die erhaltene Lösung wird auf \% verdünnt und Glucose zur Endkonzentration von 2% zugegeben. Das so erhaltene Medium wird für die Kultivierung der Hefen unter Bedingungen der Derepression des pho5-Promotors benutzt.

Parallel werden 100 ml Transformantenkultur in phosphathaltigem Minimalmedium (0,67% YNB, 2 Glucose, 20 μg/ml Histidin) angezogen. Nach 28stündiger Inkubation bei 28°C werden aus den 3 Parallelkulturen mittels Zentrifugation Pellets gewonnen, die mit Wasser gewaschen werden und für die Herstellung der Proteinlysate verwendet werden. Dafür wird zum Zellsediment das zweifache Volumen an folgendem Puffer: 0,14 M Ci, 30 mM aP, pH 7,2,1 mM PMSF und danach ein Volumenteil an Glasperlen mit 0,45 bis 0,5 mm Durchmesser zugegeben und intensiv auf dem Mixer 5 min geschüttelt mit periodischem Abkühlen im Eisbad. Zur Entfernung zellulärer Bestandteile und der Glasperlen werden die Lysate zentrifugiert, der Überstand durch wiederholte Zentrifugation in der Eppendorfzentrifuge gereinigt. Die Konzentration an Gesamteiweiß in den Lysaten wird nach der Methode von Bradford (Ann. Bioch. 1976, 72, 248 bis 254) bestimmt.

Das Protein, das ein Derivat von gp51 darstellt, wird in den Lysaten nach der Methode des Festphasen-RIA determiniert. Als Träger dient Cyanurchlorid-aktiviertes (CCA)-Papier (Hunger et al., Manuskript in Vorb.), das sich gegenüber herkömmlichen Trägern durch eine höhere Bindungskapazität (etwa 0,2 mg/cm²) und die kovalente Bindung zwischen Träger und Testsubstanz auszeichnet. Auf CCA-Papier werden 5 bis 10 μ§ Protein der gewonnenen Extrakte im Volumen von 1 bis 2 μΙ aufgetragen. Als Standard werden 10 ng Standardantigen gp51 verwendet. Nach dem Auftragen der Proben verbleibt der Träger etwa 30 min bei Raumtemperatur, um die kovalente Bindung zwischen Probe und Träger herzustellen. Anschließend werden alle unspezifischen Proteinbindungsstellen mit einer 1%igen Gelatinelösung in Verdünnungspuffer für mindestens 30 min bzw. über Nacht beblockt (bei Raumtemperatur). Als Verdünnungspuffer dient PBS/Tween80 mit folgender Zusammensetzung: 8 g NaCI; 0,2 g KCI; 0,12 g KH₂PO₄; 2,29 g Na₂HPO₄X 12 H₂O pH 7,2 bis 7,4 in 1 I, Tween80 wird zur Endkonzentration von 0,1 % zugesetzt. Anschließend wird das Papier 2 h bei 37⁰C in einem

Antiserum vom Kaninchen, das durch Immunisierung mit Gesamt-BLV hergestellt wurde, in einer Verdünnung von 1:250 in Verdünnungspuffer unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach Waschen in Verdünnungspuffer mit mehrfachem Wechsel der Waschlösung im Volumen von 100 bis 200 ml erfolgt ein 2. Block in 1%iger Gelatinelösung (30 min bei Raumtemperatur). Danach wird das Papier 2 h bei 37°C im Volumen von 50 I mit ¹²⁵J-markiertem Staphylococcus aureus-Protein A (3 χ 10⁷ cpm/Mg; 10⁶ cpm/10 ml) unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in Verdünnungspuffer wird das Papier bei Raumtemperatur getrocknefund 24 h mit 2 Verstärkerfolien bei -70°C einer Autoradiographie unterworfen. Die Menge an Expressionsprodukt wird durch Vergleich der Intensität der Hybridisationssignale auf dem Autoradiogramm mit dem verdünnten Standardantigen gp51 (Abb. 5) ermittelt. Die Nachweisgrenze dieses Testes beträgt etwa 2 ng BLV-gp51/1 μΙ Probe. Wie aus Abb. 4 folgt, entspricht die Konzentration des gp51-Derivates im Lysat des Stammes AH 216/YEpSG94, der unter Bedingungen der Derepression des pho5-Promotors angezogen wurde, 10 ng/5 μg Gesamtprotein, d. h. 0,2% des Gesamtproteins.

Beispiel 6 Bestimmung des Molekulargewichtes des Expressionsproduktes

50 bis 100 Mg Gesamtprotein aus den Lysaten der drei Stämme, die, wie in Beispiel 5 beschrieben, angezogen wurden, werden mittels der Methode der Disc-Elektrophorese in 13%igem PAAG getrennt (Methode Laemmli et al.). Das Laufverhalten der Proteine im Gel wird mit Hilfe von Markern kontrolliert. Die eine Hälfte des Gels wird angefärbt, die andere Hälfte wird für ein Westernblot auf Nitrocellulose verwendet. Nach dem Blot wird der Filter mit AntiBLV-Antikörpern und J¹²⁵Protein A — wie unter Beispiel 5 beschrieben - behandelt und einer Autoradiographie unterworfen. Das im Ergebnis der Durchführung der beschriebenen Prozeduren erhaltene Autoradiogramm ist auf Abb. 6 dargestellt. Wie aus Abb. 5 ersichtlich ist, existiert die auf dem Wege der Hybridisierung mit AK und ¹²⁵Jod-Protein A detektierte Proteinzone nur im Extrakt des Stammes AH216/YEpSG94, der unter Derepressionsbedingungen angezogen wurde. Das durch Vergleich des Laufverhaltens dieser Zone mit den Kontrollmarkern bestimmte Molekulargewicht des Expressionsproduktes beträgt 25 kD, das entspricht einer Proteingröße von 230 AA. Die aus der Nucleotidsequenz des in YEpSG94 befindlichen DNA-Fragmentes abgeleitete Größe des gp51-Derivates beträgt 209 AA.

Bgt II ' '

AAG ATC TAC TGG CCC CCC CCA CAA Lys-IIe-Tyr-Trp-Pro-Pro-Pro-Gln-

GGG CGG CGC CGG TTT GGA GCC AGG Gly-Ars-Ars-Ars-Phe-Gly-Ala-Ars-I6

GCC ATG GTC ACA TAT GAT TGC GAG Ala-MET-Val-Thr-Tyr-Asp-Cys-Glu-

CCC CGA TGC CCT TAT GTG GGG GCA Pro-Ars-Cys-Pro-Tyr-Val-Gly-Ala-32

GAT CGC TTC GAC TGC CCC CAC TGG Asp-Ars-Phe-Asp-Cys-Pro-His-Trp-

GAC AAT ^CC TCC CAG GCC GAT CAA Asp-Asn-Ala-Ser-Gln-Ala-Asp-Gln-48

GGA TCC TTT TAT GTC AAT CAT CAG GIy-Ser-Phe-Tyr-Val-Asn-His-Gln-

ATT TTA TTC CTG CAT CTT AAA CAA Ile-Leu-Phe-Leu-His-Leu-Lys-Gln-64

TGT CAT GGA ATT TTC ACT CTA ACC Cys-His-Gly-Ile-Phe-Thr-Leu-Thr-

TGG GAG ATA TGG GGA TAT GAT CCC Trp-Glu-Ile-Trp-Gly-Tyr-Asp-Pro-80

CTG ATC ACC TTT TCT TTA CAT AAG Leu-Ile-Thr-Phe-Ser-Leu-His-Lys-

ATC CCT GAT CCC CCT CAA CCC GAC Ile-Pro-Asp-Pro-Pro-Gln-Pro-Asp-96

TTT CCC CAG TTG AAC AGT GAC TGG Phe-Pro-Gln-Leu-Asn-Ser-Asp-Trp-

GTT CGC TCT GTC AGA TCA TGG GCC Val-Pro-Ser-Val-Ars-Ser-Trp-Ala-112

CTG CTT TTA AAC CAA ACA GCA CGG Leu-Leu-Leu-Asn-Gln-Thr-Ala-Ars-

GCC TTC CCA GAC TGT GCT ATA TGT Ala-Phe-Pro-Asp-Cys-Ala-Ile-Cys-I

TGG GAA CCT TCC CCT CCC TGG GCT Trp-Glu-Pro-Ser-Pro-Pro-Trp-Ala-

CCC GAA ATA TTA GTA TAT AAC AAA Pro-Glu-Ile-Leu-Val-Tyr-Asn-Lys-IM

ACC ATC TCC AGC TCT GGA CCC GGC

Thr-IIe-Ser-Ser-Ser-Gly-Pro-Gly-

CTC GCC CTC CCG GAC GCC CAA ATC Leu-Ala-Leu-Pro-Asp-Ala-Gln-Ile-160

TTC TGG GTC AAC ACG TCC TCG TTT Phe-Trp-Val-Asn-Thr-Ser-Ser-Phe-

AAC ACC ACC CAA GGA TGG CAC CAC Asn-Thr-Tb.r-Gln-Gly-Trp-His-His-.176 '

CCT TCC CAG AGG TTG TTG TTC AAT Pro-Ser-Gln-Ars-Leu-Leu-Phe-Asn-

GTT TCT CAA.. GGC AAC GCC TTG TTA Val-Ser-Gln-Gly-Asn-Ala-Leu-Leu-192

TTA GCT CCT ATG TCC CTG GTT AAT Leu-Pro-Pro-IIe-Ser-Leu-Val-Asn-

CTC TCT ACG GCT TCC TCC GCC CCT Leu-Ser-Thr-Ala-Ser-Ser-Ala-Pro-208

CCI ACC Pro-Thr-

Abb. 4 (Portsetzung)

Ausschnitt aus der env-Sequenz des BLV-Rekombinantenklons HU-1 (BgIII bis Smal), die für einen Abschnitt des gp51 kodiert, der die Aminosäuren 122 bis 430 einschließt.

a b c

a) gp51 Standard (jeweils Doppeibestimmung) 20 ng, 10 ng, 2,5 ng, 5 ng

b) AH216 plasmidfrei, 24 μg, 12 μg, 3 μς, 6μg Gesamtprotein unter Induktionsbedingungen (ohne anorganische's Phosphat)

c) AH216/YEpSG94/24μg, 12 μg, 3 μg, 6 μg Gesamtprotein unter Induktionsbedingungen

d) wie c¹ unter Repressionsbedingungen (mit anorganischem Phosphat)

a ä b

a) gp51 Standard 30 ng a') gp51 Standard 7 ng

b) AH216 plasmidfrei 50 μg Gesamtprotein unter Induktionsbedingungen (ohne anorganisches Phosphat)

c) AH216 /YEpSG94/ 50 μg Gesamtprotein unter Induktionsbedingungen

d) AH216 /YEpSG94/ 50 μg Gesamtprotein unter Repressionsbedingungen (mit anorganischem Phosphat)

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung eines BLV-kodierten Hüllproteins oder dessen Derivate in einem transformierten Wirt, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Hefe mit einem rekombinanten Plasmid, das mindestens aus einem Replikationsursprung, einer Expressionskontrolleinheit und einer für ein Hüllprotein kodierenden BLV-Nukleotidsequenz besteht, transformiert,

b) diesen Wirt isoliert und unter Bildung einer großen Population des Wirts züchtet und

c) das BLV-kodierte Hüllprotein oder dessen Derivate aus der Kultur gewinnt.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirt die Hefe Saccharomyces cerevisiae benutzt wird
3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirt ein pho 5-deletierter, weitere Hefemarker wie Leucin-, Histidinauxotrophie tragender Hefestamm, z. B. AH 216, benutzt wird
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das BLV-Hüllprotein kodierende BLV-Nukleotidsequenz aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Nukleotidsequenzen stammt.
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nukleotidsequenz eine BLV-Nukleotidsequenz aus dem Lambda-BLV-Rekombinantenklon HU-1 (ZIMET-Nr. 11085) ist.
6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nukleotidsequenz eine BLV-Nukleotidsequenz aus Plasmid-BLV-Rekombinanten-Klonen, die Restriktionsfragmente des Lambda-BLV-Rekombinantenklons HU-1 (ZIMET-Nr. 11085), enthalten, ist.
7. Verfahren nach Punkt 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nukleotidsequenz sich vollständig auf einem Hind IH-Pvu M-2,6 kb-Restriktionsfragment befindet, wobei der N-Terminus 0,7 kb vom Hind Ill-Ort, der C-Terminus des gp51-Hüllproteins 1,6 kb vom Hind Ill-Ort und der C-Terminus des gp30-Hüllproteins 2,25 kb vom Hind Ill-Ort entfernt liegt.
8. Verfahren nach den Punkten 1, 5, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Hind Ill-Pvu M-2,6 kb-BLV-Restriktionsfragment mit dem durch Hindill- und Smal-geöffneten pLac-Expressionsvektor pUC19 durch T4-Ligase-Behandlung verbunden wird, wobei das Rekombinantenplasmid penV26 (ZIMET-Nr. 11062) entsteht.
9. Verfahren nach den Punkten 1, 5, 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein BgI Il-Sma 1-0,63 kb-Restriktionsfragment von penV26 verwendet wird, wobei der BgI Il-Restriktionsort 265 Nucleotide vom N-Terminus des Hüllproteins entfernt liegt und der Smal-Ort sich 12 Nucleotide vordem C-Terminus des gp51-BLV-Hüllproteins befindet.
10. Verfahren nach den Punkten 1, 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß das BGI Il-Sma I-Restriktionsfragment von penV26, das einen Teil der Sequenz des gp51 -Gens kodiert, durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment, mit Polymerase I, Verbindung desselben mit synthetischen EcoRI-Linkem, Spaltung des Fragments mit Xma I, Einbau des erhaltenen EcoRI-Xma I-Fragments in die EcoRI-Xma gespaltene DNA des den als Xma I-Hindlll-Fragment vorliegenden pho5rTranskriptionsterminator enthaltenden Vektorplasmids pAT1125 und nachfolgende Behandlung mit T4-Ligase verbunden wird.
11. Verfahren nach den Punkten 1, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß nach Transformation von E.coli-Stämmen mit der

- rekombinanten DNA, die die Plasmid-DNA mit einem Teil der gp51-Sequenz in richtiger Orientierung und in Leserahmen mit der Nucleotidsequenz des im weiteren verwendeten Promotorfragments des Hefe-pho-5-Gens enthält, die Selektion des Klons pSG 8/3 erfolgt.
12. Verfahren nach den Punkten 1 und 9-11, dadurch gekennzeichnet, daß die gp51-Sequenz, enthalten in einem 1070 bp großen EcoRI-Hind HI-Fragment aus dem Plasmid pSG 8/3, in die rekombinante DNA des Vektors YEp33, dessen DNA durch BamHI-Hind Il geöffnet wurde, gemeinsam mit einem BamHI-EcoRJ-Fragment, das aus dem Plasmid pAP54 isoliert wurde und für den Promotorbereich des Hefe-pho-5-Gens mit der Signalsequenz kodiert, inseriert und anschließend mit Ligase verbunden wird.
13. Verfahren nach den Punkten 1 und 9-12, dadurch gekennzeichnet, daß nach Transformation des E.coli-Stammes HB101 mit der rekombinanten DNA ein Klon selektiert wird, der das gp51 -Genfragment in Verbindung mit dem Hefe-pho-5-lnitiations- und Terminationssignalen der Tränskription enthält, wodurch die rekombinante Plasmid-DNA YEpSG 9/4 im E.coli-Stamm HB101 entsteht.
14. Verfahren nach den Punkten 1 und 9-13, dadurch gekennzeichnet, daß der Hefestamm saccharomyces cerevisiae AH 216 mit der rekombinanten Plasmid-DNA YEpSG 9/4 transformiert wird, wodurch der Stamm saccharomyces cerevisiae AH 216/YEpSG 9/4 entsteht.
15. Verfahren nach den Punkten 1 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Hefestamm saccaromyces cerevisiae AG 216/YEpSG94 in Medien ohne Phosphatzusatz bzw. unter Zusatz von organischen Polyphosphaten kultiviert und das BLV-Hüllprotein oder dessen Derivate aus der Kultur isoliert und in einem Festphasen-RIA, der als spezifische Komponente ein Antiserum gegen gp51 enthält, nachgewiesen wird.