DD240029A1 - METHOD FOR PRODUCING A BLV-CODED HUEL PROTEIN - Google Patents
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Abstract
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, auf der Basis des manipulierten Hefestammes ein Herstellungsverfahren fuer BLV-kodierte Huellproteine oder fuer dessen Derivate zu entwickeln. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Hefe mit einem rekombinanten Plasmid, das mindestens aus einem Replikationsursprung, einer Expressionskontrolleinheit und einer fuer ein Huellprotein kodierenden BLV-Nukleosidsequenz besteht, transformiert, diesen Wirt isoliert und unter Bildung einer grossen Population zuechtet und das BLV-kodierte Huellprotein oder dessen Derivate aus der Kultur gewinnt. Anwendungsgebiet ist insbesondere die Veterinaermedizin, vor allem die Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen durch das Rinderleukaemievirus.The invention is based on the object of developing a production process for BLV-encoded envelope proteins or derivatives thereof on the basis of the manipulated yeast strain. The process according to the invention is characterized in that yeast is transformed with a recombinant plasmid which consists of at least one origin of replication, an expression control unit and a BLV nucleoside sequence coding for a envelope protein, this host is isolated and cultivated to form a large population and the BLV encoded envelope protein or its derivatives from the culture wins. Field of application is in particular the veterinary medicine, above all the diagnosis, prophylaxis and therapy of diseases by the bovine leukemia virus.
Description
Hierzu 2 Seiten ZeichnungenFor this 2 pages drawings
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines BLV-kodierten Hüllproteins oder von dessen Derivaten in einem transformierten Wirt.The invention relates to a method for producing a BLV-encoded envelope protein or its derivatives in a transformed host.
Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Gentechnik, die mikrobiologische Industrie und die Veterinärmedizin, insbesondere die Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen durch das Rinderleukämievirus.Field of application of the invention are the genetic engineering, the microbiological industry and the veterinary medicine, in particular the diagnosis, prophylaxis and therapy of diseases by the bovine leukemia virus.
Die enzootische Rinderleukose ist die ökonomisch bedeutendste Tumorerkrankung der Rinder. Sie wird durch das Bovine Leukämie-Virus horizontal übertragen. Der Erreger ist ein umhülltes RNA-Tumorvirus, das in Zellkultur (fötale Lammnierenzellen) propagiert werden kannEnzootic bovine leukosis is the economically most important tumor disease of cattle. It is transmitted horizontally by the Bovine Leukemia Virus. The pathogen is an enveloped RNA tumor virus that can be propagated in cell culture (fetal lamb kidney cells)
In allen europäischen Ländern wurden umfangreiche diagnostische Maßnahmen eingeleitet, um auf dem Boden einer sicheren und In all European countries, extensive diagnostic measures have been initiated to get on the ground of a safe and secure
einfachen serologischen Diagnostik unter Einsatz des viralen Hauptoberflächenproteins der Virushülle als Antigen Sanierungsprogramme der verseuchten Tierbestände durch Merzung oder Separierung der infizierten Tiere durchzuführen. Eine Vakzine steht international nicht zur Verfügung. Der Preis für eine Virusvakzine auf Zellkulturbasis ist so hoch, daß dieser Weg ökonomisch nicht in Frage kommt. Hinzu kommt, daß eine BLV-Vakzine wegen der Gefährlichkeit des Virus sicher inaktiviert werdensimple serological diagnosis using the viral main surface protein of the virus envelope as an antigen to carry out remediation programs of contaminated livestock by merzung or separation of the infected animals. A vaccine is not available internationally. The price for a virus-based vaccine based on cell culture is so high that this route is economically out of the question. In addition, a BLV vaccine is safely inactivated because of the danger of the virus
Das Oberflächenantigen wird vom env-Gen des viralen Genoms kodiert und entsteht durch proteolytische Spaltung und Glykosylierung einer Vorstufe des Hüllantigens.The surface antigen is encoded by the env gene of the viral genome and is produced by proteolytic cleavage and glycosylation of a precursor of the envelope antigen.
Es sind Verfahren zur immunologischen Diagnostik von Viruserkrankungen landwirtschaftlicher Nutztiere bekannt, die auf der Verwendung von Viruspräparaten, die aus infizierten bzw. virusinfizierten Zellkulturen gewonnen werden, beruhen. Mangel der bekannten Verfahren ist ihr hoher Arbeitsaufwand, wodurch die Notwendigkeit des Erhaltens billiger Präparate von Virus-Oberflächenantigen entstand, die frei von Verunreinigungen durch andere tierische Eiweiße sind.Methods are known for the immunological diagnosis of viral diseases of farm animals based on the use of virus preparations obtained from infected or virus-infected cell cultures. Lack of the known methods is their high workload, thereby creating the need to obtain cheap preparations of virus surface antigen, which are free from contamination by other animal proteins.
Die Verwendung von gentechnischen Methoden erlaubt die Lösung des Problems der Diagnostik von tierischen Viruserkrankungen auf prinzipiell neuen Wegen. Mit diesem Ziel ist die Isolierung von Genom-Fragmenten des Rinder-Leukämievirus, die das Oberflächenantigen kodieren, ihre Einführung in Mikroorganismen-Zellen als Bestandteile speziell konstruierter Plasmide, die die Replikation und Expression des für das BLV-Oberflächenantigen kodierenden Gens gewährleisten und, in dessen Ergebnis, die Biosynthese des Hüllproteins in der Mikroorganismen-Zelle möglich.The use of genetic engineering methods allows the solution of the problem of the diagnosis of animal viral diseases in fundamentally new ways. With this aim, the isolation of bovine leukemia virus genome fragments encoding the surface antigen is their introduction into microorganism cells as constituents of specially designed plasmids which ensure the replication and expression of the gene coding for the BLV surface antigen and in which Result, the biosynthesis of the envelope protein in the microorganism cell possible.
Rekombinante DNA, die die Synthese von BLV-Oberflächenantigen (gp51) in der Bakterienzelle bewirkt, wurde bereits vorgeschlagen. Mangel dieses Verfahrens ist der relativ geringe Ertrag an Expressionsprodukt, was mit der Toxizität des Expressionsproduktes für E. coli-Zellen verbunden sein mag - hervorgerufen durch hohe Hydrophobizität des gebildeten Eiweißes.Recombinant DNA, which causes the synthesis of BLV surface antigen (gp51) in the bacterial cell, has already been proposed. Lack of this method is the relatively low yield of expression product, which may be related to the toxicity of the expression product for E. coli cells - caused by high hydrophobicity of the protein formed.
Der Vorzug der Verwendung von Hefen der Gattung Saccharomyces für die Schaffung von Produzenten-Stämmen von Oberflächenantigenen tierischer Viren besteht darin, daß diese Mikroorganismen im Unterschied zu E. coli weniger der toxischen Wirkung von hydrophoben Expressionsprodukten unterworfen sind, aber auch zur Realisierung einer Reihe von Prozessen der posttranslationalen Modifikationen synthetisierter Fremdeiweiße befähigt sind, einschließlich Processing und Glykosilierung. Diese Modifikationen sind möglicherweise auch für die Entfaltung der vollen Antigen-Eigenschaften des BLV-Hüllproteins notwendig. Es sind Konstruktionsverfahren für rekombinante Plasmide bekannt, die die Synthese von Oberflächenantigen des Hepatitis B-Virus des Menschen in Hefezellen mit hohem Ertrag gewährleisten ( ) sowie des Tollwut-C-Virus-Antigens ( ).The advantage of using yeasts of the genus Saccharomyces for creating producer strains of surface antigens of animal viruses is that, unlike E. coli, these microorganisms are less subject to the toxic effects of hydrophobic expression products, but also to a variety of processes post-translational modifications of synthesized foreign proteins, including processing and glycosylation. These modifications may also be necessary for the unfolding of the full antigenic properties of the BLV envelope protein. Recombinant plasmid construction methods are known which assure the synthesis of human hepatitis B human surface antigen surface antigen in high yield yeast cells () as well as the rabies C virus antigen ().
Die erhaltenen Derivate der erwähnten Proteine verfügen über hohe Antigen-Aktivität und können auch für Schutzimpfungen zur Erlangung von Immunität gegen durch diese Viren hervorgerufene Erkrankungen ausgenutzt werden. Auf diese Art kann das Präparat eines BLV-Hüllprotein-Derivates, das aus dem Produzenten-Stamm isoliert wurde, auch für den Erhalt ungefährlicher Anti-BLV-Vakzine benutzt werden. Es sind bereits E. coli-Stämme vorgeschlagen worden, die ein BLV-Hüllprotein-Derivat produzieren). Angaben in bezug auf Hefe-Stämme, die ein BLV-Hüllprotein-Derivat produzieren, sind gegenwärtig in der internationalen Fachliteratur nicht zu finden.The resulting derivatives of the mentioned proteins have high antigenic activity and can also be exploited for vaccinations to obtain immunity to diseases caused by these viruses. In this way, the preparation of a BLV coat protein derivative isolated from the producer strain can also be used to obtain harmless anti-BLV vaccines. E. coli strains producing a BLV coat protein derivative have already been proposed). Information regarding yeast strains producing a BLV coat protein derivative is currently not found in international literature.
Die Erfindung hat das Ziel, einen Hefestamm so zu manipulieren, daß er eine rekombinante Plasmid-DNA enthält, welche für ein BLV-Hüllprotein kodiert und bei der Kultivierung die Synthese des BLV-Hüllproteins mit hoher Ausbeute gewährleistet.The invention aims to manipulate a strain of yeast to contain a recombinant plasmid DNA encoding a BLV envelope protein which, in culture, assures high yield synthesis of the BLV envelope protein.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, auf der Basis des manipulierten Hefestammes ein Herstellungsverfahren für BLV-kodierte Hüllproteine oder für Jessen Derivate zu entwickeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daßThe invention is based on the object of developing a preparation process for BLV-encoded envelope proteins or for Jessen derivatives on the basis of the manipulated yeast strain. The inventive method is characterized in that
a) Hefe mit einem rekombinanten Plasmid, das mindestens aus einem Replikationsursprung, einer Expressionskontrolleinheit und einer für ein Hüllprotein kodierenden BLV-Nucleotidsequenz besteht, transformiert wird,a) yeast is transformed with a recombinant plasmid consisting of at least one origin of replication, an expression control unit and an envelope protein encoding BLV nucleotide sequence,
b) dieser Wirt isoliert und unter Bildung einer großen Population kultiviert wird undb) this host is isolated and cultured to form a large population; and
c) das BLV-kodierte Hüllprotein oder dessen Derivate aus der Kultur gewonnen werden.c) the BLV-encoded envelope protein or its derivatives are obtained from the culture.
Als Hefe wird gemäß der Erfindung Saccharomyces cerevisiae benutzt, vorzugsweise ein pho 5-deletierter und weitere Hefemarker wie Leucin-, Histidin-Auxotrophie tragender Stamm, z. B. AH 216.As a yeast Saccharomyces cerevisiae is used according to the invention, preferably a pho 5-deleted and other yeast markers such as leucine, histidine auxotrophy carrying strain, z. Eg AH 216.
Die für das BLV-Protein kodierenden Sequenzen stammen aus natürlichen oder synthetischen Nucleotidsequenzen. Eine bevorzugt eingesetzte Sequenz ist eine Nucleotidsequenz aus dem BLV-Rekombinantenklon HU-1 (ZIMET-Nr. 11085). Ebensogut einsetzbar sind Plasmid-BLV-Rekombinanten-Klone, die Restriktionsfragmente des Lambda-BLV-Rekombinantenklons von HU-1 enthalten. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung befindet sich die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nucleotidsequenz vollständig auf einem Hindlll-Pvull-2,6 kB-Restriktionsfragment, wobei der N-Terminus 0,7 kB vom Hindll!-Ort, der C-Terminus des gp51-Hüllproteins 1,6 kB vom Hind HI-Ort und der C-Terminus des gp30-Hüllproteins 2,25 kB vom Hind Ill-Ort entfernt liegen. Dieses Fragment wird mit dem durch Hindill- und Smal-geöffneten plac-Expressionsvektor pUC19 durch T4-Ligase-Behandlung verbunden, wobei das Rekombinantenplasmid penV26 (ZIMET-Nr. 11062) entsteht.The BLV protein coding sequences are from natural or synthetic nucleotide sequences. A preferred sequence is a nucleotide sequence from the BLV recombinant clone HU-1 (ZIMET # 11085). Just as useful are plasmid BLV recombinant clones containing restriction fragments of the lambda BLV recombinant clone of HU-1. In a specific embodiment of the invention, the nucleotide sequence encoding a BLV coat protein is located entirely on a HindIII-Pvull 2.6 kb restriction fragment, wherein the N-terminus is 0.7 kb from the HindIII site, the C terminus of the HindIII site gp51 envelope protein 1.6 kb from the Hind HI site and the C-terminus of the gp30 envelope 2.25 kb from the Hind III site. This fragment is joined to the HindIII and SmaI-opened plac expression vector pUC19 by T4 ligase treatment to yield the recombinant plasmid penV26 (ZIMET # 11062).
In weiterer Fortführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein BgI Il-Sma 1-0,63 kB-Restriktionsfragment von penV26-verwendet, wobei der Bglll-Restriktionsort 265 Nucleotide vom N-Terminus des Hüllproteins entfernt liegt und der Smal-Ort sich 12 Nucleotide vor dem C-Terminus des gp51-BLV-Hüllproteins befindet. Dieses Fragment, das einen Teil der Sequenz des gp51-Gens kodiert, wird durch Behandlung des Fragments mit dem Klenow-Fragment, der Polymerase I, Verbindung desselben mit synthetischen EcoRI-Linkern, Spaltung des Fragments mitXmal, Einbau des erhaltenen EcoRI-Xmal-Fragmentes in die EcoRI-Xmal gespaltene DNA des Vektorplasmides pAT1125. und nachfolgende Behandlung T4-Ligase verbunden.In a further continuation of the method of the invention, a Bgl II-Sma 1-0.63 kb restriction fragment of penV26 is used with the Bgl II restriction site located 265 nucleotides from the N-terminus of the envelope protein and the SmaI site 12 nucleotides in front of the nucleotide C-terminus of the gp51 BLV envelope protein is located. This fragment, which encodes a part of the sequence of the gp51 gene, is prepared by treating the fragment with the Klenow fragment, the polymerase I, compound thereof with synthetic EcoRI linkers, cleaving the fragment with Xmal, incorporation of the EcoRI-Xmal fragment obtained into the EcoRI-Xmal digested DNA of the vector plasmid pAT1125. and subsequent T4 ligase treatment.
Mit der erhaltenen rekombinanten DNA, die die Plasmid-DNA mit einem Teil gp51-Sequenz in richtiger Orientierung und den als Xmal-Hind Ill-Fragment vorliegenden Transkriptionsterminator des Hefe-pho-5-Genes enthält, werden E. coli-Stämme transformiert.E. coli strains are transformed with the obtained recombinant DNA containing the plasmid DNA with a part gp51 sequence in the correct orientation and the transcription terminator of the yeast pho-5 gene present as Xmal-Hind III fragment.
Anschließend erfolgt die Selektion des Klones, der das Plasmid pSG83 enthält (vgl. Schema Abb. 1).This is followed by the selection of the clone containing the plasmid pSG83 (see scheme Fig. 1).
Aus dem Plasmid pSG83 wird das 1070 Bp große EcoRI-Hind Ill-Fragment gewonnen. Dieses Fragment wird in die rekombinante DNA des Vektors YEp13, auch bekannt als CV13 (Broach), dessen DNA durch BamHI-Hindlll-Behandluna aeöffnet wurde.From the plasmid pSG83 the 1070 bp EcoRI-Hind III fragment is recovered. This fragment is inserted into the recombinant DNA of vector YEp13, also known as CV13 (Broach), whose DNA has been opened by BamHI-HindIII treatment.
gemeinsam mit einem BamHI-EcoRI-Fragment, das aus dem Plasmid pAP54 isoliert wurde und für den Promotorbereich des Hefe-pho-5-Genes mit der Signalsequenz kodiert, eingebaut und mit Ligase verbunden (vgl. Schema Abb. 2).together with a BamHI-EcoRI fragment, which was isolated from the plasmid pAP54 and codes for the promoter region of the yeast pho-5 gene with the signal sequence, incorporated and ligase-linked (see Scheme Fig. 2).
Mit dieser Rekombinante wird der E. coli-Stamm ΗΒ10Ί transformiert. Nach Selektion erhält man den Klon E. coli HB101/YEpSG 94, der das gp51-Genfragment in Verbindung mit dem Hefe-pho-5-lnitiations- und Terminationssignalen der Transkription enthält.With this recombinant E. coli strain ΗΒ10Ί is transformed. Upon selection, one obtains the clone E. coli HB101 / YEpSG94, which contains the gp51 gene fragment in conjunction with the yeast pho-5 initiation and termination signals of transcription.
Die Auswahl des Klones erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse. Der Stamm wurde in der Allunionssammlung für Mikroorganismen des Institutes für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der AdW der UdSSR unter der Nr. hintergelegt.The selection of the clone is carried out with the help of the restriction analysis. The strain was deposited in the All-Union Collection of Microorganisms of the Institute of Biochemistry and Physiology of AdW microorganisms of the USSR under the number.
Als letzter Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae AH216 mit der rekombinanten Plasmid DNA YEpSG 94 transformiert. Nach Selektion erhält man den Stamm Saccharomyces cerevisiae AH216 (YEpSG94), der bei Kultivierung das BLV-Hüllprotein expremiert. Er wurde in der Allunionssammlung für Mikroorganismen des Instituts für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der AdW der UdSSR unter der Nr. hinterlegt.As a last step of the method according to the invention, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae AH216 is transformed with the recombinant plasmid DNA YEpSG 94. After selection, the strain Saccharomyces cerevisiae AH216 (YEpSG94) is obtained, which expresses the BLV envelope protein on cultivation. He was deposited in the All-Union Collection of Microorganisms of the Institute of Biochemistry and Physiology of AdW microorganisms of the USSR under the number.
Der Promotor des Hefe-pho-5-Genes, der im Stamm Saccharomyces cerevisiae YEpSG 94 enthalten ist, ist regulierbar. Durch Verwendung bestimmter Kultivierungsbedingungen, vorzugsweise durch phosphatfreie Medien oder Medien mit organischenThe promoter of the yeast pho-5 gene contained in strain Saccharomyces cerevisiae YEpSG 94 is regulatable. By using certain cultivation conditions, preferably by phosphate-free media or media with organic
Polyphosphaten, wird eine hohe Ausbeute an BLV-Hüllproteinen erreicht. ^Polyphosphates, a high yield of BLV envelope proteins is achieved. ^
Das rekombinante Plasmid YEpSG 94, dessen Restriktionskarte auf Abb. 3 dargestellt ist, enthält das Replikon des Plasmides pBR322, das Replikon der Hefe-2 μ-DNA, den Promotor und den Terminator des pho-5-Gens der Hefe sowie eine verkürzte Variante des Gens gp51.The recombinant plasmid YEpSG 94, whose restriction map is shown in Fig. 3, contains the replicon of the plasmid pBR322, the replicon of yeast 2 μ DNA, the promoter and the terminator of the pho-5 gene of yeast and a shortened variant of the Gp51 gene.
Es besteht aus folgenden Elementen:It consists of the following elements:
- das 10,3 kB große BamHI-Hind Ill-Fragment von Plasmid-DNA des Vektors YEp 13;the 10.3 kb BamHI-Hind III fragment of plasmid DNA of vector YEp 13;
- ein 600 bp großes BamHI-EcoRI-Fragment, das den pho-5-Promotor enthält;a 600 bp BamHI-EcoRI fragment containing the pho-5 promoter;
- ein EcoRI-Xmal-Fragment, das das verkürzte gp51-Gen enthält, vor welchem als die synthetische Sequenz AATTCG, deren erste Nucleotide einen Teil des EcoRI-Spaltortes darstellen, eingefügt wurde;an EcoRI-Xmal fragment containing the truncated gp51 gene, before which is inserted as the synthetic sequence AATTCG, the first nucleotides of which form part of the EcoRI cleavage site;
- nach dem 6. Nucleotid der o. g. synthetischen Sequenz folgt im Plasmid YEpSG 94 die Sequenz von gp51, die in Abb. 4 dargestellt wird;after the 6th nucleotide of o. g. synthetic sequence in the plasmid YEpSG 94 follows the sequence of gp51, which is shown in Fig. 4;
- ein Xma I-Hind Ill-Fragment, das die modifizierte Sequenz des 3'-Endes des pho-5-Gens enthält, wurde als Transkriptionsterminator benutzt. Die Nucleotidsequenz dieses Fragments rechts vom Xma 1-Ort wird weiter unten angeführt (S. 12).An Xma I-Hind III fragment containing the modified sequence of the 3 'end of the pho-5 gene was used as the transcription terminator. The nucleotide sequence of this fragment to the right of the Xma 1 site is given below (page 12).
Die Aminosäuresequenz dieses Fragmentes, die sich im selben Leserahmen befindet wie die Sequenz des Genes gp51, entstand durch die Verschiebung des Leserahmens der pho-5-Ausgangssequenz im Prozeß der Klonierung.The amino acid sequence of this fragment, which is in the same reading frame as the sequence of the gene gp51, was created by shifting the reading frame of the pho-5 starting sequence in the process of cloning.
Das Molekulargewicht des Plasmides YEpSG 94 beträgt 8 MD, die Größe 11,9 kB. Die Kopiezahl der erhaltenen Plasmide beträgt etwa 10 bis 20 pro Zelle sowohl in E. coli als auch in Hefen bei Anzucht unter selektiven Bedingungen. Die Plasmid-DNA von YEpSG 94 enthält einen unikalen Restriktionsspaltort für Hind III, 2 Restriktionsspaltorte für die Enzyme Xma I, SaIGI und BamHI. Das wurde auf dem Wege der Restriktionsanalyse bestimmt (Abb. 3).The molecular weight of the plasmid YEpSG 94 is 8 MD, the size 11.9 kB. The copy number of plasmids obtained is about 10 to 20 per cell in both E. coli and yeasts grown under selective conditions. The plasmid DNA of YEpSG 94 contains a unique restriction site for Hind III, 2 restriction sites for the enzymes Xma I, SaIGI and BamHI. This was determined by restriction analysis (Figure 3).
Die Restriktionsspaltorte für Xma I, SaIGI und BamHI haben in Uhrzeigerrichtung folgende Abstände vom unikalen Hindlll-Spaltort:The restriction sites for Xma I, SaIGI and BamHI have the following distances from the unique HindIII site in the clockwise direction:
Xma I: 380 bzw. 6 000 bpXma I: 380 or 6,000 bp
SaIGI: 1 900 bzw. 8 700 bpSaIGI: 1,900 or 8,700 bp
BamHI: 866 bzw. 1 616 bpBamHI: 866 and 1616 bp, respectively
Das Plasmid YEpSG 94 enthält die Gene:The plasmid YEpSG 94 contains the genes:
- BLV-Hüllprotein-modifiziertes Gen gp51, das die Synthese eines Derivates dieses Proteins durch die das Plasmid enthaltende Hefezellen gewährleistet:- BLV coat protein-modified gene gp51, which ensures the synthesis of a derivative of this protein by the yeast cell containing the plasmid:
Dieses Gen, das zwischen dem EcoRI- und dem Xma I-Spaltort eingefühgt wurde, hat folgende Nucleotidsequenz (Abb. 4). Die Nucleotidsequenz kodiert den C-terminalen Teil des Hüllproteins gp51 von der 122. bis zur 430. Aminosäure. Vorgelagert ist eine Nucleotidsequenz, die für die 18 N-terminalen Aminosäuren des Hefe-pho-r-Proteins kodiert.This gene, inserted between the EcoRI and Xma I cleavage sites, has the following nucleotide sequence (Figure 4). The nucleotide sequence encodes the C-terminal part of the envelope protein gp51 from the 122nd to the 430th amino acids. Upstream is a nucleotide sequence encoding the 18 N-terminal amino acids of the yeast pho-r protein.
- bla-Gen, das die Synthese der ß-Lactamase und die Resistenz der das Plasmid enthaltenden E. coli-Stämme gegenüber Ampicillin bewirkt:bla gene which effects the synthesis of β-lactamase and the resistance of the plasmid-containing E. coli strains to ampicillin:
_tet-Qen. |n dessen BamHI- und Hindlll-Spaltorte ein Fragment des klonierten gp51-Abschnittes mit pho-5-Promotor und -Terminator eingebaut wurde:_tet-Qen. | n whose BamHI and HindIII cleavage sites a fragment of the cloned gp51 section with pho-5 promoter and terminator was incorporated:
- Leu 2-Gen, das die Leucin-Prototrophie der das Plasmid tragenden Transformanten des Hefe-Rezipientenstammes bewirkt.- Leu 2 gene, which causes the leucine prototrophy of the plasmid-carrying transformants of the yeast recipient strain.
Das Plasmid YEpSG 94 wird in E. coli-Zellen durch das Vorhandensein des pBR322-Replicons repliziert. In Hefe-Zeflen gewährleistet das 2 μπη-DNA-Replicon die Replikation des angegebenen Plasmides. Die Synthese des BLV-Hüllproteins in Hefezellen geschieht unter Kontrolle des pho5-Promotors und pho5-Terminators. Die rekombinante Plasmid-DNA YEpSG94 wird in E. coli-Zellen bei Zugabe von Chloramphenicol amplifiziert. Den Produzentenstamm des BLV-Hüllproteins erhält man durch Transformation von Zellen eines pho5-deletierten und weitere Hefemarker wie Leucin-Histidin-Auxotrophie tragenden Hefestammes, z. B. AH216 mit der vorliegenden rekombinanten Plasmid-DNA. Das Synthese-Niveau des BLV-Hüllproteins im konstruierten Stamm liegt bei 100 μg/l bei einem Titer der Kultur von 1 x 108/ml.The plasmid YEpSG 94 is replicated in E. coli cells by the presence of the pBR322 replicon. In yeast cells, the 2 μπη DNA replicon ensures replication of the indicated plasmid. The synthesis of the BLV envelope protein in yeast cells is under the control of the pho5 promoter and pho5 terminator. The recombinant plasmid DNA YEpSG94 is amplified in E. coli cells with the addition of chloramphenicol. The producer strain of the BLV envelope protein is obtained by transformation of cells of a pho5-deleted yeast strain and other yeast markers such as leucine-histidine auxotrophy carrying yeast strain, eg. AH216 with the present recombinant plasmid DNA. The synthesis level of the BLV envelope protein in the engineered strain is 100 μg / L with a culture titer of 1 x 10 8 / ml.
Der Nachweis des erfindungsgemäß hergestellten BLV-Hüllproteins erfolgt durch eine spezifische Reaktion mit einem Festphasen-RIA unter Verwendung von Cyanurchlorid-aktiviertem Papier als Träger, von Kaninchenantiseren, die spezifische Antikörper gegen BLV-Hüllproteine enthalten, und von I25-Jod-markiertem Staphylococcus aureus Protein A. Die Auswertung und Einschätzung der Expressionshöhe erfolgt autoradiographisch und durch Vergleich mit einem BLV-gp51-Standard und nichtexprimierenden Kontrollysaten bzw. -ex-trakten. Der Nachweis des BLV-Hüllproteins ist auch durch eine Elektrophorese der Syntheseprodukte anschließenden Transfer auf Nitrocellulosefilter und nachfolgende spezifische Reaktion mit dem Antiserum möglich. Alle E. coli-Stämme, die rekombinante Plasmid-DNA YEpSG 94 enthalten, sind durch folgende allgemeine Merkmale gekennzeichnet:The detection of the BLV envelope protein produced according to the invention is carried out by a specific reaction with a solid phase RIA using cyanuric chloride-activated paper as carrier, rabbit antisera containing specific antibodies against BLV envelope proteins, and I25- iodine-labeled Staphylococcus aureus protein A. The evaluation and assessment of the level of expression is autoradiographic and by comparison with a BLV gp51 standard and non-expressing Kontrollysaten or -ex-tracts. Detection of the BLV envelope protein is also possible by electrophoresis of the synthesis products subsequent transfer to nitrocellulose filters and subsequent specific reaction with the antiserum. All E. coli strains containing recombinant plasmid DNA YEpSG 94 are characterized by the following general features:
Gestreckte, stäbchenförmige, gramnegative, nichtsporulierende Zellen.Elongated, rod-shaped, Gram-negative, non-sporulating cells.
Die Zellen wachsen gut in gewöhnlich verwendeten Nährmedien. Auf 1,5%igem Nähragar „Difco" sind die Kolonien glatt, grau, glänzend, rund mit ebenem Rand. Bei Anzucht in flüssigen YT- und LB-Medien bildet sich eine gleichmäßig intensive Trübung.The cells grow well in commonly used nutrient media. On 1.5% nutrient agar "Difco", the colonies are smooth, gray, shiny, round with a flat margin, and when grown in liquid YT and LB media, a uniformly intense turbidity forms.
Optimale Kultivierungstemperatur: 37°C, pH-Optimum 6,8 bis 7,5. Als Kohlenstoffquelle werden viele Kohlehydrate benutzt, organische Säuren, Alkohole.Optimal cultivation temperature: 37 ° C, pH-optimum 6.8 to 7.5. As carbon source many carbohydrates are used, organic acids, alcohols.
Als Stickstoffquelle dienen mineralische Salze (in Ammonium- oder Nitratform), organische Verbindungen (in der Art von Repton, Trypton, Aminosäuren).As a source of nitrogen, mineral salts (in ammonium or nitrate form), organic compounds (in the manner of Repton, tryptone, amino acids).
Es wird Resistenz gegenüber Ampicillin (50 mg/1) ausgeprägt. Alle Hefestämme, die das Plasmid YEpSG 94 tragen, sind durch folgende allgemeine Merkmale gekennzeichnet:It is resistant to ampicillin (50 mg / 1) pronounced. All yeast strains carrying the plasmid YEpSG 94 are characterized by the following general features:
runde bis ovale, nur unter Hungerbedingungen sporulierende Zellen mit Sprossungen (Tochterzellen).Round to oval, only under starvation conditions sporulating cells with budding (daughter cells).
Die Zellen wachsen gut in gewöhnlich verwendeten Nährmedien. Auf 2 bis 2,5%igem Nähragar Difco sind die Kolonien glatt und weiß, mit ebenem Rand. Bei Anzucht in flüssigen YEPD- und YNB-Medien bildet sich eine gleichmäßig intensive Trübung.The cells grow well in commonly used nutrient media. On 2 to 2.5% nutrient agar Difco, the colonies are smooth and white, with flat margin. When grown in liquid YEPD and YNB media, a uniformly intense turbidity forms.
Optimale Kultivierungstemperatur: 28 bis 30°C, pH-Optimum: 6,6. Als Kohlenstoffquelle wird vorzugsweise Glucose verwendet, in einigen Fällen Alkohole. Als Stickstoffquelle dienen (NH4J2SO4 organische Verbindungen (in der Art von Pepton, Aminosäuren).Optimal cultivation temperature: 28 to 30 ° C, pH optimum: 6,6. The carbon source used is preferably glucose, in some cases alcohols. As nitrogen source serve (NH 4 J 2 SO 4 organic compounds (in the way of Pepton, amino acids).
Das erfindungsgemäße Verfahren der Herstellung von Plasmid-DNA erlaubt die Schaffung eines Hefestammes, der die Synthese eines Derivates des BLV-Hüllproteins gewährleistet, das man einerseits als potentielles Präparat für die Schutzimpfung von Tieren, andererseits für die Herstellung diagnostischer Präparate zur Feststellung von BLV-Antikörpem bei infizierten Tieren verwendenThe process according to the invention for the production of plasmid DNA allows the creation of a yeast strain which ensures the synthesis of a derivative of the BLV envelope protein, on the one hand as a potential preparation for the vaccination of animals, on the other hand for the preparation of diagnostic preparations for the detection of BLV antibodies use in infected animals
Der Vorzug des vorliegenden Verfahrens im Vergleich zu bekannten Verfahren der Herstellung von Antigenen aus Viruspräparaten, die aus infizierten Zellkulturen isoliert wurden, besteht in folgendem:The advantage of the present method over known methods of preparing antigens from virus preparations isolated from infected cell cultures is as follows:
1. Sparsamkeit, da der vorliegende Stamm auf einfachen und billigen Nährmedien wächst1. Economy, as the present strain grows on simple and cheap nutrient media
2. Ungefährlichkeit des Präparates bei Verwendung als Vakzine, da es keine Bestandteile infektiöser BLV-DNA enthält2. Non-hazardousness of the preparation when used as a vaccine, as it contains no components of infectious BLV DNA
3. Hohe Spezifität des Präparates als Diagnosemittel, da es als Bestandteil keine anderen tierischen Proteine enthält, deren Vorhandensein bei der beabsichtigten Verwendung des Präparates in der Diagnostik eine hohe Reinigung erforderlich machen würde.3. High specificity of the product as a diagnostic agent, as it does not contain any other animal proteins as a component, whose presence in the intended use of the drug in the diagnosis would require a high level of purification.
Die Erfindung soll anschließend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail by exemplary embodiments.
Konstruktion des rekombinanten Plasmides pSG83, welches ein DNS-Fragment mit einem Teil des Genes des BLV-Hüllproteines enthält.Construction of the recombinant plasmid pSG83, which contains a DNA fragment with a part of the gene of the BLV envelope protein.
Das Konstruktionsschema ist auf der Abbildung 1 dargestellt. 5 μg des Plasmides penv26, das ein die Gene der Proteine gp51 und gp30 umfassendes Fragment des BLV-Genomes enthält, werden mit der Restriktionsendonuclease BgI Il in einem Puffer mit hoher lonenstärke, bestehend aus 100 mM NaCI; 50 mM Tris-HCI pH 7,5; 10 mM MgCI2; 1 mM DTT und 1 μg RNase A in einem Volumen von 20 μΙ bei 370C gespalten. Die Vollständigkeit der Spaltung wird in einem Agarosegel elektrophoretisch untersucht. Die erhaltenen Fragmente werden mit 2 Einheiten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I im gleichen Puffer unter Zusatz von 4 Desoxyribonucleosidtriphosphaten behandelt, deren Endkonzentration dabei 50 bis 100 μΜ beträgt. Die Reaktion wird 20 min bei einer Temperatur von 2O0C geführt. Die Inaktivierung des Enzymes erfolgt 10 min bei 700C.The design scheme is shown in Figure 1. 5 μg of the plasmid penv26, which contains a fragment of the BLV genome comprising the genes of the proteins gp51 and gp30, are incubated with the restriction endonuclease Bgl II in a buffer of high ionic strength, consisting of 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 10 mM MgCl 2 ; 1 mM DTT and 1 μg RNase A in a volume of 20 μΙ at 37 0 C cleaved. The completeness of the cleavage is examined electrophoretically in an agarose gel. The resulting fragments are treated with 2 units Klenow fragment of DNA polymerase I in the same buffer with the addition of 4 deoxyribonucleoside triphosphates, the final concentration is 50 to 100 μΜ. The reaction is carried out 20 at a temperature of 2O 0 C min. The inactivation of the enzyme is carried out at 70 ° C. for 10 minutes.
Die auf diese Art und Weise gewonnenen glattendigen Fragmente werden zur Ligation mit Eco-Rl-Linkern (CCGAATTCGG) benutzt. Dafür wird zu Beginn die Phosphorylierung von 5OpM Linker in einem Puffer vorgenommen, der sich aus folgenden Komponenten zusammensetzt: 66 mM Tris-HCL pH 7,6; 10 mM MgCI2; 1 mM DTT; 1 mM Spermidin; 20 pM ( 32P)ATP (spezif. Aktivität: 1 000 Ci/mM); 2 Einheiten Polynucleotidkinase und 100 μg/ml BSA. Die Reaktion wird in einem Volumen von 15 μΙ 30 min bei 37°C geführt. Anschließend werden ATP zu einer Endkonzentration von 1 mM sowie 2 Einheiten Polynucleotirikinase dem Ansatz zugesetzt, der weitere 30 min bei 37 0C inkubiert wird. Die Kontrolle der Markierung des Linkers erfolgt durch die Behandlung eines auf einem DE 81-Filter absorbierten Teiles des Reaktionsgemisches mittels 0,5 M Na2HPO4.The blunt-ended fragments obtained in this manner are used for ligation with Eco RI linkers (CCGAATTCGG). For this purpose, the phosphorylation of 5OpM linker is initially carried out in a buffer, which consists of the following components: 66 mM Tris-HCl pH 7.6; 10 mM MgCl 2 ; 1mM DTT; 1 mM spermidine; 20 pM ( 32 P) ATP (specific activity: 1000 Ci / mM); 2 units polynucleotide kinase and 100 μg / ml BSA. The reaction is carried out in a volume of 15 μΙ 30 min at 37 ° C. Subsequently, ATP are added to the final concentration of 1 mM and 2 units of polynucleotiricinase in the batch, which is incubated at 37 0 C for a further 30 min. The control of the labeling of the linker is carried out by treating a portion of the reaction mixture absorbed on a DE 81 filter by means of 0.5 M Na 2 HPO 4 .
Der markierte Linker (20 pMol) wird zu dem das die aufgefüllten BgI Il-Enden der Fragmente des Plasmides penV26 enthaltenden Reaktionsgemisch gegeben. Außerdem werden 20-40 Einheiten T4-Ligase hinzugefügt. Der Ansatz wird 16 Stunden bei 15°C inkubiert.The labeled linker (20 pmol) is added to the reaction mixture containing the filled-in Bgl II ends of the fragments of plasmid penV26. In addition, 20-40 units of T4 ligase are added. The batch is incubated for 16 hours at 15 ° C.
Danach wird das Ligationsgemisch 10 min bei 7O0C inkubiert und das Reaktionsgemisch 3mal mit Puffern hoher lonenstärke verdünnt. Es werden 20-30 Einheiten Restriktase EcoRI dazugegeben, wonach 3 Stunden bei 37 °C inkubiert wird. Die Vollständigkeit der Ligierung und der Abspaltung der Linker werden mit Hilfe der Elektrophorese eines Teils des Reaktionsgemisches in einem 13%igen PAAG kontrolliert. Das 1,25 kB lange, das verkürzte gp51-Gen umfassende Fragment des Plasmids penV26 wird durch Elution aus einem 5%igen PAAG gewonnen. Die entsprechende Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, homogenisiert und in 1 ml Puffer aufgenommen, der sich aus folgenden Komponenten zusammensetzt: 150 mM NaCI; 50 mM Tris-HCI pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0. Die Elution erfolgt 16 Stunden bei 370C. Danach wird die Gelsuspension 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert und der Überstand durch Glaswolle filtriert. Der verbleibende Gelrest wird nochmals mit einem Volumen Puffer gewaschen, danach erfolgen wiederum Zentrifugation und Filtration. Beide Eluate werden vereint.Thereafter, the ligation mixture is incubated for 10 min at 7O 0 C and the reaction mixture is diluted 3 times with buffers of high ionic strength. 20-30 units of restriction enzyme EcoRI are added, followed by incubation at 37 ° C. for 3 hours. The completeness of the ligation and cleavage of the linkers are monitored by electrophoresis of a portion of the reaction mixture in a 13% PAAG. The 1.25 kb fragment containing the truncated gp51 gene of the plasmid penV26 is recovered by elution from a 5% PAAG. The appropriate band is cut out of the gel, homogenized and taken up in 1 ml of buffer, which is composed of the following components: 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 8.0; 10 mM EDTA pH 8.0. Elution is carried out for 16 hours at 37 0 C. Thereafter, the gel suspension is centrifuged for 10 min at 10000 U / min and the supernatant was filtered through glass wool. The remaining gel residue is again washed with a volume of buffer, followed by centrifugation and filtration. Both eluates are combined.
Um die DNS aus der so erhaltenen Lösung auszufällen, werden t-RNS zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml und 1/20 des Ausgangsvolumens einer 2%igen „Cetaflon" Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wird 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen und danach 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, der Niederschlag in 100 μ-Ι 3M-Natriumacetat pH 5,6 gelöst und 3 Teile Alkohol dazugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei -20"0C gekühlt und danach 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert. Der gewonnene Niederschlag wird in 100 μΙ 0,3 M-Natriumacetat gelöst und wie oben beschrieben gefällt. Der erhaltene Niederschlag wird mit 70%igem Alkohol gewaschen, getrocknet und in 10 μΙ H2O gelöst. 7 μΙ des Fragments werden mit der Restriktase Xma I in einem Puffer, der 50 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI pH 7,6, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT enthält, unter Verwendung von 5 Einheiten des Enzyms in einem Volumen von 25 μΙ bei 370C gespalten. Die so gewonnenen Fragmente werden durch Ligierung in den Vektor pAT 1125 eingebracht, der den Transkriptionsterminator des pho-5-Gens enthält. Der Vektor pAT 1125 wurde durch Klonierung eines 300 bp großen modifizierten Fragments (Bajna et al, Nucl. Acids Research 1984, Bd 12, 7721—7739) in den Restriktionsorten EcoRI und HindMl des Plasmids pBR322 gewonnen. Das Fragment enthält den 3'-terminalen Bereich des Gens pho-5. Die Nucleotidsequenz des 3'-terminal vom EcoRI-Ort gelegenen Teils dieses Fragments ist folgende:To precipitate the DNA from the solution thus obtained, t-RNAs are added to a final concentration of 10 μg / ml and 1/20 of the initial volume of a 2% "Cetaflon" solution, the mixture is allowed to stand at room temperature for 30 minutes and then 10 minutes centrifuged at 10,000 rev / min. the supernatant is discarded, dissolved the precipitate in 100 μ-Ι 3M sodium acetate pH 5.6 and 3 parts of added alcohol. the reaction mixture is cooled for one hour at -20 "0 C and then 10 min at Centrifuged at 10,000 rpm. The recovered precipitate is dissolved in 100 .mu.l 0.3 M sodium acetate and precipitated as described above. The precipitate obtained is washed with ethyl alcohol 70%, and dried at 10 μΙ H 2 O dissolved. 7 μΙ of the fragment are digested with the restriction Xma I in a buffer containing 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT using 5 units of the enzyme in a volume of 25 μΙ at 37 0 C cleaved. The fragments thus obtained are introduced by ligation into the vector pAT 1125, which contains the transcription terminator of the pho-5 gene. The vector pAT 1125 was obtained by cloning a 300 bp modified fragment (Bajna et al, Nucl. Acids Research 1984, Vol 12, 7721-7739) in the restriction sites EcoRI and HindMl of the plasmid pBR322. The fragment contains the 3'-terminal region of the pho-5 gene. The nucleotide sequence of the 3 'terminal of the Eco RI site of this fragment is as follows:
GAATTXma ICCCGGGGATCGATCCTGGTACGTTCCTCAAGGTGCTCGTGTCTACACCGAAAAATTCCAATGTTCT.GAATTXma ICCCGGGGATCGATCCTGGTACGTTCCTCAAGGTGCTCGTGTCTACACCGAAAAATTCCAATGTTCT.
Nach der Spaltung von 5 μg Vektor-DNS pAT 1125 mit den Restriktasen EcoRI und Xmal unter Standardbedingungen wird das große 4,8 kb umfassende Fragment wie oben beschrieben aus einem PAAG eluiert. Das Vektorfragment wird in 20 μΙ H2O gelöst und zur Klonierung verwendet. Das Ligationsgemisch enthält 0,1 Mg Vektor; 0,5 μg Fragment, 50 mM Tris HCI pH 7,5; 10 mM MgCI2; 1 mM DTT; 5 Einheiten T4-DNS-Ligase, 1 mM ATP, 10 Mg/ml BSA. Die Ligierung wird in einem Volumen von 40 μΙ über Nacht bei 4°C vorgenommen. Um die Effektivität der Insertion des Fragmentes in den Vektor zu überprüfen, wird als Kontrolle die Ligierung von 0,1 μg Vektor unter gleichen Bedingungen, aber ohne Fragment, vorgenommen. Mit dem Ligationsgemisch werden durch CaCI2 behandelte (Cohen et al, PNAS 1972, Band 69, S. 2110-2114) kompetente Zellen des E. coli-Stammes HB 101 transformiert.After cleavage of 5 μg of vector DNA pAT 1125 with the restriction enzymes EcoRI and Xmal under standard conditions, the large 4.8 kb fragment is eluted from a PAAG as described above. The vector fragment is dissolved in 20 μΙ H 2 O and used for cloning. The ligation mixture contains 0.1 mg of vector; 0.5 μg fragment, 50 mM Tris HCl pH 7.5; 10 mM MgCl 2 ; 1mM DTT; 5 units T4 DNA ligase, 1 mM ATP, 10 μg / ml BSA. The ligation is done in a volume of 40 μΙ overnight at 4 ° C. In order to check the effectiveness of the insertion of the fragment into the vector, the control of the ligation of 0.1 ug vector under the same conditions, but without a fragment made. The ligation mixture is used to transform competent cells of the E. coli strain HB101 (Cohen et al, PNAS 1972, Volume 69, pages 2110-2114) treated by CaCl 2 .
5 ml Übernachtkultur des Rezipientenstammes HB 101 werden in YT bei 37 0C angezogen. Mit 0,1 ml Übernachtkultur werden 100 ml YT-Kultur angeimpft. Die Hauptkultur wird bis zu einer Extinktion von ungefähr 0,5 bis 0,6 bei 550 nm angezogen und 10 min bei 5000 rpm bei O0C zentrifugiert. Das Sediment wird im Eisbad in 50 ml sterilem, auf 0°C abgekühlter 0,1 M CaCI2 aufgenommen und 20 min auf Eis stehen gelassen. Danach werden die Zellen - wie oben beschrieben - durch Zentrifugation geerntet und in 5 ml 0,1 ml CaCI2 resuspendiert. Zu 200 μΙ Suspension kompetenter Zellen werden 75 μΙ Ligationsgemisch mit etwa 0,5 bis 1,0 μg DNA auf 8 x 107 Zellen gegeben. Nach 30minütiger Inkubation im Eisbad erfolgt ein 2minütiger Hitzeschock bei 420C. Anschließend werden 2 ml YT-Medium zugegeben und 1 h bei 370C inkubiert. Nachfolgend kann auf YT-Platten mit 50 Mg/ml Ampicillin in entsprechenden Verdünnungen plattiert werden.5 ml of overnight culture of the recipient strain HB 101 are grown in YT at 37 ° C. With 0.1 ml of overnight culture, 100 ml of YT culture are inoculated. The main culture is grown to an absorbance of about 0.5 to 0.6 at 550 nm and centrifuged for 10 min at 5000 rpm at 0 ° C. The sediment is taken up in an ice bath in 50 ml of sterile, 0.1 M CaCl 2 cooled to 0 ° C. and allowed to stand on ice for 20 min. Thereafter, the cells are harvested by centrifugation as described above and resuspended in 5 ml of 0.1 ml CaCl 2 . To 200 μΙ suspension of competent cells 75 μΙ ligation mixture with about 0.5 to 1.0 micrograms of DNA are placed on 8 x 10 7 cells. After incubation for 30 minutes in an ice bath 2minütiger a heat shock at 42 0 C. Subsequently, 2 ml YT-medium are added and incubated for 1 h at 37 0 C. Subsequently, plating on YT plates with 50 μg / ml ampicillin in appropriate dilutions.
Die Transformanten werden auf 50 μΙ/ml Ampicillin enthaltendem Vollmedium selektiert.The transformants are selected on 50 μΙ / ml ampicillin-containing complete medium.
12 zufällig ausgewählte Transformantenkolonien werden in 50 Mg/ml Ampicillin enthaltenden 5 ml YT-Medium angezogen und die Plasmid-DNS nach Birnboim und DoIy präpariert (Birnboim, DoIy, Nucl. Acids Res. 1979, Bd. 7, 1513-1523).Twelve randomly selected transformant colonies are grown in 5 ml YT medium containing 50 μg / ml ampicillin and the plasmid DNA is prepared according to Birnboim and Doyy (Birnboim, Doyl, Nucl. Acids Res. 1979, Vol. 7, 1513-1523).
Von Transformanteneinzelkolonien ausgehend werden 2,5-ml-Kulturen in YT mit 50 Mg/ml Ampicillin unter kräftigem Schütteln bei 37°C im Verlaufe von 8 bis 12 h angezogen. Die Zellen werden durch 15sekündige Zentrifugation bei 10000 rpm sedimentiert, sorgsam in 100 ul Lösung I (25 mM Tris HCI pH 8,0; 10 mM EDTA; 50 mM Glucose) suspendiert und Lysozym zur Endkonzentration von 2 mg/ml zugegeben. Nach 5minütiger Inkubation im Eisbad erfolgt die Zugabe von 200 μΙ Lösung Il (0,2 N NaOH; 1 % SDS) und weitere öminütige Inkubation im Eisbad. Anschließend werden 150 μΙ 3 M Natriumacetat pH 4,8 bis 5,2 zugegeben und weitere 15 min im Eisbad inkubiert. Nach 15minütiger Zentrifugation bei 10 000 rpm wird aus dem Überstand durch Zugabe von 1 ml 96%igem Ethanol und 10minütiger Inkubation bei -7O0C — gefolgt von lOminütiger Zentrifugation bei 10 000 rpm — die DNA ausgefällt. Das Sediment wird in 0,1 ml 0,3 M Natrium-Acetat gelöst und mit 300 μΙ Ethanol bei -700C erneut die DNA ausgefällt.Starting from single transformant colonies, 2.5 ml cultures are grown in YT with 50 μg / ml ampicillin with vigorous shaking at 37 ° C for 8 to 12 hours. The cells are sedimented by centrifugation at 10,000 rpm for 15 seconds, carefully suspended in 100 μl of solution I (25 mM Tris HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 50 mM glucose) and lysozyme added to the final concentration of 2 mg / ml. After incubation for 5 minutes in an ice bath, the addition of 200 μl of solution II (0.2 N NaOH, 1% SDS) and further incubation in an ice bath for a period of 0.5 minutes are carried out. Then 150 .mu.M 3 M sodium acetate pH 4.8 to 5.2 are added and incubated for 15 minutes in an ice bath. The DNA was precipitated - After 15 minutes centrifugation at 10,000 rpm is from the supernatant by adding 1 ml of 96% ethanol and 10 minutes of incubation at -7O 0 C - followed by lOminütiger centrifugation at 10,000 rpm. The sediment is dissolved in 0.1 ml of 0.3 M sodium acetate and again precipitated with 300 .mu.Ι ethanol at -70 0 C, the DNA.
Das nach lOminütiger Zentrifugation erhaltene Sediment wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μΙ Wasser gelöst. Aliquote dieser Lösung werden vor und nach Spaltung mit Restriktionsenzymen in Agarose- bzw. Acrylamidgelen analysiert.The sediment obtained after 10 minutes of centrifugation is washed with 70% ethanol, dried and dissolved in 20 .mu.l of water. Aliquots of this solution are analyzed before and after cleavage with restriction enzymes in agarose or acrylamide gels.
Die Spaltung von 0,5 bis 1 μg Plasmid-DNA erfolgt in 10 bis 20 μΙ Reaktionsvolumen mit 0,5 bis 1 Einheit Enzym in 2 h bei 370C.The cleavage of 0.5 to 1 μg of plasmid DNA is carried out in 10 to 20 μΙ reaction volume with 0.5 to 1 unit of enzyme in 2 h at 37 0 C.
Die Plasmid-DNS der rekombinänten Klone, die ein Insert von etwa 700 bp enthalten, wird durch BamHl- und Pstl-Spaltungen analysiert. Die Klone, die das Fragment des Genes gp51 in richtiger Orientierung im Verhältnis zum Transkriptionsterminator des pho-5-Gens enthalten, zeigen im Vektor pAT1125 2 Fragmente. Bei der BamHI-Spaltung entstehen Banden von 4,19 kb und 1,22 kb sowie bei der Pstl-Spaltung 3,6 und 1,8 kb im Agarosgel. Einer der erhaltenen Rekombinatenklone wurde pSG83 genannt und im weiteren verwendet.The plasmid DNA of the recombinant clones containing an insert of approximately 700 bp is analyzed by BamHI and PstI digestions. The clones containing the fragment of the gene gp51 in the correct orientation relative to the transcription terminator of the pho-5 gene show 2 fragments in the vector pAT1125. In the BamHI cleavage, bands of 4.19 kb and 1.22 kb are formed, as well as 3.6 and 1.8 kb in the agarose gel in the PstI cleavage. One of the recombinant clones obtained was named pSG83 and used further.
Für die Konstruktion des rekombinaten Plasmides, das die Synthese eines BLV-Hüllproteinderivates in Hefezellen codiert, werden in den Shuttle-Vektor YEp13 ein Fragment des Plasmides pSG83 mit einem Teil des gp51-Gens und dem pho5-Terminator sowie ein Fragment des Plasmides pAP54 mit der Sequenz des pho 5-Promoters und die Signalpeptides'eingebaut.For the construction of the recombinant plasmid, which encodes the synthesis of a BLV envelope protein derivative in yeast cells, a fragment of the plasmid pSG83 with a part of the gp51 gene and the pho5 terminator and a fragment of the plasmid pAP54 with the Sequence of the pho 5 promoter and the signal peptides.
Das Promoter-Fragment ist ein 600 bp großes BamHI-Rsal-Fragment des pho5-Gens (Bajwa et al., 1984, NAR13, 7221-7338), an dessen Rsal-site die Sequenz CTAGAATT anligiert wurde, so daß deren letzte 5 Nucleotide einen EcoRI-Spaltort ergeben (K. G.The promoter fragment is a 600 bp BamHI-Rsal fragment of the pho5 gene (Bajwa et al., 1984, NAR13, 7221-7338), to the Rsal site of which the sequence CTAGAATT has been ligated so that its last 5 nucleotides give an EcoRI site (KG
Skryabin et al., unveröffentlichte Angaben). Das Konstruktionsschema des Plasmides YEpSG 94 ist auf Abb. 2 dargestellt.Skryabin et al., Unpublished data). The construction scheme of the plasmid YEpSG 94 is shown in Fig. 2.
10 μg DNA des Plasmides pSG83 werden unter Standardbedingungen mit EcoRI und Hindill gespalten, ein 1 070 bp großes DNA-Fragment wird aus Polyacrylamid — wie unter Beispiel 1 beschrieben — isoliert.10 ug DNA of the plasmid pSG83 are cleaved under standard conditions with EcoRI and HindIII, a 1,070 bp DNA fragment is from polyacrylamide - as described in Example 1 - isolated.
Aus dem Plasmid pAP54wird auf analoge Art ein 600 bp großes BamHI-EcoRI-Fragment isoliert.From the plasmid pAP54, a 600 bp BamHI-EcoRI fragment is isolated in a similar manner.
10 μg DNA des Plasmides YEP13 werden mit BamHl und Hindill unter Standardbedingungen gespalten, in 1%iger Agarose aufgetrennt und ein 10,3 kb großes Fragment unter allgemein üblichen Bedingungen isoliert.10 μg DNA of the plasmid YEP13 are cleaved with BamHI and HindIII under standard conditions, separated in 1% agarose and a 10.3 kb fragment isolated under generally customary conditions.
Die Ligation des BamHI-Hindlll-Vektorfragmentes mit den 2 klonierten Fragmenten BamHI-EcoRI sowie EcoRI-Hindlll wird, wie unter Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von 0,1 μg Vektor und jeweils 0,5 μg Fragment durchgeführt. Mit dem Ligationsgemisch werden komponente E.-coli-Zellen des Stammes HB101 transformiert. Es werden Transformanten des Phänotypes Leu+Amp+ selektiert. DNA aus 12 zufällig ausgewählten Klonen wird nach der Alkali-Lyse-Methode (siehe oben) isoliert.Ligation of the BamHI-HindIII vector fragment with the 2 cloned fragments BamHI-EcoRI and EcoRI-HindIII is performed as described in Example 1 using 0.1 μg vector and 0.5 μg fragment each. The ligation mixture is used to transform component E. coli cells of strain HB101. Transformants of the phenotype Leu + Amp + are selected. DNA from 12 randomly selected clones is isolated by the alkali lysis method (see above).
Nach den Ergebnissen der Restriktionsanalyse wird die Plasmid-DNA ausgewählt, die Inserte von 1,7-kb-Größe enthält, die durch 745 pb-Fragmente bei Hydrolyse mit BamHl und 1 070 bp-Fragmente bei gleichzeitiger Spaltung mit EcoRI und Hindlll sowie 5080 bp und 6 820 bp bei Spaltung mit SaIGI charakterisiert sind.According to the results of the restriction analysis, the plasmid DNA containing inserts of 1.7 kb size, which is characterized by 745 pb fragments upon hydrolysis with BamHI and 1070 bp fragments with simultaneous cleavage with EcoRI and HindIII and 5080 bp and 6,820 bp are characterized by cleavage with SaIGI.
Wie aus den Angaben der Restriktionsanalyse folgt, enthält die isolierte Plasmid-DNA das gp51-Fragment im Anschluß an den pho5-Transkriptionspromoter und vor dem pho5-Transkriptionsterminator.As follows from the restriction analysis, the isolated plasmid DNA contains the gp51 fragment following the pho5 transcriptional promoter and before the pho5 transcription terminator.
Einer der erhaltenen Klone erhielt die Bezeichnung YEpSG94 und wurde für die weiteren Untersuchungen verwendet.One of the resulting clones was named YEpSG94 and was used for further studies.
Die Restriktionskarte von YEpSG 94 zeigt Abb. 3.The restriction map of YEpSG 94 is shown in Fig. 3.
Erhalt des E.-coli-Stammes HB101, der das rekombinante Plasmid YEpSG94 enthält 1 μ Plasmid-DNA YEpSG94 wurde für die Transformation kompetenter E.-coli-Zellen des Stammes HB101 nach der Methode von Cohen et al. verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben.Obtaining the E. coli strain HB101 containing the recombinant plasmid YEpSG94 1 μ plasmid DNA YEpSG94 was prepared for the transformation of competent E. coli cells of the strain HB101 by the method of Cohen et al. used as described in Example 1.
Die Transformanten werden auf Petrischalen mit YT-Agar (enthaltend 50 μg/ml Ampicillin) ausplattiert. Ein 1 μg Plasmid-DNA ergibt 10e—107 Transformanten.The transformants are plated on Petri dishes with YT agar (containing 50 μg / ml ampicillin). A 1 μg plasmid DNA gives 10 e -10 7 transformants.
Zur Analyse von Einzelklonen werden jeweils 5 ml Kultur in YT mit Ampicillin im Verlaufe von 8 bis 12 Stunden angezogen und die Plasmid-DNA nach der Metode von Birnboim und DoIy wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert.For the analysis of single clones, in each case 5 ml of culture in YT are grown with ampicillin in the course of 8 to 12 hours and the plasmid DNA is isolated according to the method of Birnboim and DoIy as described in Example 1.
Die Plasmid-DNA wird durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI/Hindlll und SaIGI und Analyse der Spaltprodukte in 1°/oigen Agarosegelen untersucht.The plasmid DNA is analyzed by cleavage with the restriction enzymes BamHI, EcoRI / HindIII and SaIGI and analysis of the cleavage products in 1% agarose gels.
Man erhält einen Stamm, der in der Allunionskollektion der Mikroorganismen am Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der AdW der UdSSR unter Nr. deponiert ist.A strain is obtained which is deposited in the all-union collection of microorganisms at the Institute for Biochemistry and Physiology of AdW microorganisms in the USSR.
produziert.produced.
YEpSG94 wird für die Transformation von kompetenten Zellen des Stammes AG216 (a leu 2,3-112, his 3—11, pho 3, 5); nach der Methode von Ito et al. (J. Bac, 1983,153, 163-168) verwendet. Eine Hefekolonie wird von Vollmedium in 50 ml YEPD-Flüssigmedium überführt und bei 300C im Verlaufe einer Nacht inkubiert. Die Kultur wird zentrifugiert und das Pellet einmal mit folgendem Puffer gewaschen: 0,01 M Tris-HCI pH 7,4; 0,1 mM EDTA. Die gewaschenen Zellen werden in 50 ml desselben Puffers resuspendiert, der 0,1 M LiCI enthält und 1 h bei 3O0C inkubiert. Nach Zentrifugation werden die Zellen in 500 μΙ LiCI-Puffer suspendiert. Es werden 20Mg Plasmid-DNA YEpSG 94 zugegeben (in 40 μΙ) und das Gemisch 30 min bei 300C inkubiert. Danach wird 1 ml 50%iges PEG4000 (in Wasser gelöst) zugegeben. Nach sorgsamem Durchmischen der Suspension erfolgt eine 30minütige Inkubation bei 300C und danach ein 5minütiger Hitzeschock bei 420C. Die Zellen werden zentrifugiert und 3mal mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in 500 μΙ Wasser gelöst und jeweils 100 μΙ auf Petrischalen mit Selektivagar (0,67% YNB, 2% Glucose, 20 Mg/ml Histidin, 2% Agar) plattiert.YEpSG94 is used for the transformation of competent cells of the strain AG216 (a leu 2.3-112, his 3-11, pho 3, 5); according to the method of Ito et al. (J. Bac, 1983, 153, 163-168). A yeast colony is transferred from complete medium in 50 ml of YEPD liquid medium and incubated at 30 0 C in the course of one night. The culture is centrifuged and the pellet washed once with the following buffer: 0.01 M Tris-HCl pH 7.4; 0.1mM EDTA. The washed cells are resuspended in 50 ml of the same buffer containing 0.1 M LiCl containing and incubated for 1 h at 3O 0 C. After centrifugation, the cells are suspended in 500 μL LiCl buffer. It will be 20mg plasmid DNA YEpSG 94 added (in 40 μΙ) and the mixture incubated for 30 min at 30 0 C. Thereafter, 1 ml of 50% PEG4000 (dissolved in water) is added. After thorough mixing of the suspension, a 30 minute incubation at 30 0 C and then a 5 minute heat shock at 42 0 C. The cells are centrifuged and washed 3 times with water. The washed cells are dissolved in 500 .mu.l water and plated in 100 .mu.l dishes on selective agaric petri plates (0.67% YNB, 2% glucose, 20 mg / ml histidine, 2% agar).
Transformantenkolonien sind 2 bis 4 Tage nach Ausplattieren erkennbar.Transformant colonies are evident 2 to 4 days after plating.
Die mitotische Stabilität des Hybridplasmids wird als Verhältnis plasmidhaltiger zu plasmidfreien Zellen in individuellen Transformantenkolonien, die auf Mimimalagarohne Leucin gewachsen sind, geschätzt. Einzelne Transformantenkolonien werden auf Selektivagar ausgestrichen, nach Wachstum der Zellen bei 300C im Verlaufe von 12 bis 20 h wird auf Vollmedium (YEPD) kloniert. Die auf Vollmedium gewachsenen Einzelklone werden danach wiederholt auf Minimalmedium übertragen zur Bestimmung des Prozentsatzes an Klonen, die ihre Leucin-Prototrophie bewahrt haben.The mitotic stability of the hybrid plasmid is estimated as the ratio of plasmid-containing to plasmid-free cells in individual transformant colonies grown on mimimal agar without leucine. Individual transformant colonies are streaked on selective agar, after growth of the cells at 30 0 C in the course of 12 to 20 h is cloned on complete medium (YEPD). The single-cell grown monolayers are then repeatedly transferred to minimal medium to determine the percentage of clones that have retained their leucine prototrophy.
Die auf diese Art und Weise bestimmte mitotische Stabilität des Plasrnids YEpSG94 im Stamm AH216 beträgt 75 bis 85% (Durchschnitt aus 10 Bestimmungen).The determined mitotic stability of the plasmid YEpSG94 in strain AH216 is 75 to 85% (average of 10 determinations).
Plasmid-DNA aus dem Transformantenstamm AH 216 wird auf folgende Art und Weise isoliert:Plasmid DNA from the transformant strain AH 216 is isolated in the following manner:
Zellen, die in 200 ml Minimalmedium ohne Leucin angezogen wurden, werden zentrifugiert und sorgsam mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden 10 min bei Raumtemperatur in folgendem Puffer inkubiert:Cells grown in 200 ml minimal medium without leucine are centrifuged and washed thoroughly with water. The washed cells are incubated for 10 min at room temperature in the following buffer:
0,64 M Mercapto-Ethanol, 0,1 M Tris, 0,1 M EDTA pH 8,0. Danach werden die Zellen zentrifugiert, mehrmals mit folgendem Puffer gewaschen: 0,126 M Na2HPO4; 0,56 M (NH4)2SO4; 0,062 M Citrat und in eben demselben Puffer resuspendiert. Es folgt eine Istündige Inkubation in Anwesenheit von 10 mg Zymolyase/5 · 109 Zellen bei 300C. Die Protoplasten werden durch Zentrifugation geerntet, 2mal in 1 M Sorbitol gewaschen und im Volumen von 5 ml Sorbitol nach der Methode von Bimboim/Doly die Plasmid-DNA aus ihnen isoliert. Es macht sich eine 2malige Deproteinisierung mit Phenol (Tris-gesättigt, pH 8) erforderlich.0.64M Mercapto-ethanol, 0.1M Tris, 0.1M EDTA pH 8.0. Thereafter, the cells are centrifuged, washed several times with the following buffer: 0.126 M Na 2 HPO 4 ; 0.56 M (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.062 M citrate and resuspended in the same buffer. The following is a Istündige incubation in the presence of 10 mg Zymolyase / 5 x 10 9 cells at 30 0 C. The protoplasts are harvested by centrifugation, washed 2 times in 1 M sorbitol and in volume of 5 ml sorbitol by the method of Birnboim / Doly the Plasmid DNA isolated from them. A two-fold deproteinization with phenol (Tris-saturated, pH 8) is required.
Mit der erhaltenen Plasmid-DNA wird E. coli HB101 transformiert. Aus den auf YT mit Ampicillin gewachsenen Transformanten wird die Plasmid-DNA isoliert, mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI/Hindll BamHI und SaIGI gespalten und durch Auftrennen der Spaltprodukte in 1%igem Agarosegel die strukturelle Stabilität deraus den Hefen isolierten Plasmide bewiesen.With the obtained plasmid DNA E. coli HB101 is transformed. From plasmid DNA grown on YT with ampicillin, the plasmid DNA is isolated, cleaved with the restriction enzymes EcoRI / HindIII BamHI and SaIGI, and the structural stability of the plasmids isolated from the yeasts is demonstrated by separating the cleavage products in 1% agarose gel.
Der erhaltene Produzentenstamm eines BLV-Hüllprotein-Derivates ist in der Allunionskollektion der Mikroorganismen beim Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der AdW der UdSSR unter der Nr. deponiert.The obtained producer strain of a BLV coat protein derivative is deposited in the all-union collection of microorganisms at the Institute for Biochemistry and Physiology of AdW microorganisms of the USSR under the number.
Für die Testung der Expression des gp51-Derivates im.Transformantenstamm AH216 wurden gleichzeitig unter gleichen Bedingungen ein Transformantenklon und der plasmidfreie Rezipientenstamm angezogen. 1 ml Übernachtkulturin Selektivmedium mit 1,5 g/l K-P wurde in 100 ml Vollmedium ohne Phosphat überimpft. Die phophatfreien Medien wurden nach der Methode von Rubin/ hergestellt. 50 g Hefeextrat Difco und 100 g Baktopepton werden in 1 I Wasser gelöst und Magnesiumsulfat zur Endkonzentration von 0,34 M zugegeben. Zur erhaltenen Lösung wird unter Mischen Ammoniak zur selben Endkonzentration zugegeben. Nach 2stündigem Mischen bei Raumtemperatur wird die Lösung filtriert und mit HCI auf pH 6 gebracht. Es wird 3 M Natriumacetat (pH 6) zur Endkonzentration von 0,03 M zugegeben und die Lösung autoklaviert. Die erhaltene Lösung wird auf \% verdünnt und Glucose zur Endkonzentration von 2% zugegeben. Das so erhaltene Medium wird für die Kultivierung der Hefen unter Bedingungen der Derepression des pho5-Promotors benutzt.To test the expression of the gp51 derivative im.Transformantenstamm AH216 were simultaneously attracted a transformant clone and the plasmid-free recipient strain under the same conditions. 1 ml of overnight culture in selective medium with 1.5 g / l KP was inoculated in 100 ml of complete medium without phosphate. The phosphate-free media were prepared by the method of Rubin /. Dissolve 50 g of yeast excipient Difco and 100 g of bactopeptone in 1 L of water and add magnesium sulfate to the final concentration of 0.34 M. To the resulting solution, ammonia is added to the same final concentration with mixing. After 2 hours of mixing at room temperature, the solution is filtered and brought to pH 6 with HCl. Add 3 M sodium acetate (pH 6) to the final concentration of 0.03 M and autoclave the solution. The resulting solution is diluted to ~ % and glucose added to the final concentration of 2%. The medium thus obtained is used for culturing the yeast under conditions of derepression of the pho5 promoter.
Parallel werden 100 ml Transformantenkultur in phosphathaltigem Minimalmedium (0,67% YNB, 2 Glucose, 20 μg/ml Histidin) angezogen. Nach 28stündiger Inkubation bei 28°C werden aus den 3 Parallelkulturen mittels Zentrifugation Pellets gewonnen, die mit Wasser gewaschen werden und für die Herstellung der Proteinlysate verwendet werden. Dafür wird zum Zellsediment das zweifache Volumen an folgendem Puffer: 0,14 M Ci, 30 mM aP, pH 7,2,1 mM PMSF und danach ein Volumenteil an Glasperlen mit 0,45 bis 0,5 mm Durchmesser zugegeben und intensiv auf dem Mixer 5 min geschüttelt mit periodischem Abkühlen im Eisbad. Zur Entfernung zellulärer Bestandteile und der Glasperlen werden die Lysate zentrifugiert, der Überstand durch wiederholte Zentrifugation in der Eppendorfzentrifuge gereinigt. Die Konzentration an Gesamteiweiß in den Lysaten wird nach der Methode von Bradford (Ann. Bioch. 1976, 72, 248 bis 254) bestimmt.In parallel, 100 ml of transformant culture in phosphate-containing minimal medium (0.67% YNB, 2 glucose, 20 ug / ml histidine) are attracted. After incubation at 28 ° C. for 28 hours, pellets are obtained from the 3 parallel cultures by centrifugation, which are washed with water and used for the preparation of the protein lysates. For the cell sediment, twice the volume of the following buffer: 0.14 M Ci, 30 mM aP, pH 7.2, 1 mM PMSF and then a volume of glass beads with 0.45 to 0.5 mm diameter added and intensively on the Mixer shaken for 5 min with periodic cooling in an ice bath. To remove cellular components and the glass beads, the lysates are centrifuged, the supernatant purified by repeated centrifugation in the Eppendorf centrifuge. The concentration of total protein in the lysates is determined by the method of Bradford (Ann Bioch 1976, 72, 248-254).
Das Protein, das ein Derivat von gp51 darstellt, wird in den Lysaten nach der Methode des Festphasen-RIA determiniert. Als Träger dient Cyanurchlorid-aktiviertes (CCA)-Papier (Hunger et al., Manuskript in Vorb.), das sich gegenüber herkömmlichen Trägern durch eine höhere Bindungskapazität (etwa 0,2 mg/cm2) und die kovalente Bindung zwischen Träger und Testsubstanz auszeichnet. Auf CCA-Papier werden 5 bis 10 μ§ Protein der gewonnenen Extrakte im Volumen von 1 bis 2 μΙ aufgetragen. Als Standard werden 10 ng Standardantigen gp51 verwendet. Nach dem Auftragen der Proben verbleibt der Träger etwa 30 min bei Raumtemperatur, um die kovalente Bindung zwischen Probe und Träger herzustellen. Anschließend werden alle unspezifischen Proteinbindungsstellen mit einer 1%igen Gelatinelösung in Verdünnungspuffer für mindestens 30 min bzw. über Nacht beblockt (bei Raumtemperatur). Als Verdünnungspuffer dient PBS/Tween80 mit folgender Zusammensetzung: 8 g NaCI; 0,2 g KCI; 0,12 g KH2PO4; 2,29 g Na2HPO4X 12 H2O pH 7,2 bis 7,4 in 1 I, Tween80 wird zur Endkonzentration von 0,1 % zugesetzt. Anschließend wird das Papier 2 h bei 370C in einemThe protein, which is a derivative of gp51, is determined in the lysates by the solid-phase RIA method. The carrier used is cyanuric chloride activated (CCA) paper (Hunger et al., Manuscript in Vorb.) Which, compared to conventional carriers, has a higher binding capacity (about 0.2 mg / cm 2 ) and the covalent bond between carrier and test substance distinguished. On CCA paper 5 to 10 μ§ protein of the extracts obtained in a volume of 1 to 2 μΙ are applied. The default is 10 ng standard antigen gp51. After application of the samples, the support remains at room temperature for about 30 minutes to produce the covalent bond between sample and support. Subsequently, all nonspecific protein binding sites are blocked with a 1% gelatin solution in dilution buffer for at least 30 min or overnight (at room temperature). The dilution buffer used is PBS / Tween80 having the following composition: 8 g NaCl; 0.2 g of KCl; 0.12 g KH 2 PO 4 ; 2.29 g of Na 2 HPO 4 X 12 H 2 O pH 7.2 to 7.4 in 1 l, Tween80 is added to the final concentration of 0.1%. Subsequently, the paper for 2 h at 37 0 C in a
Antiserum vom Kaninchen, das durch Immunisierung mit Gesamt-BLV hergestellt wurde, in einer Verdünnung von 1:250 in Verdünnungspuffer unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach Waschen in Verdünnungspuffer mit mehrfachem Wechsel der Waschlösung im Volumen von 100 bis 200 ml erfolgt ein 2. Block in 1%iger Gelatinelösung (30 min bei Raumtemperatur). Danach wird das Papier 2 h bei 37°C im Volumen von 50 I mit 125J-markiertem Staphylococcus aureus-Protein A (3 χ 107 cpm/Mg; 106 cpm/10 ml) unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in Verdünnungspuffer wird das Papier bei Raumtemperatur getrocknefund 24 h mit 2 Verstärkerfolien bei -70°C einer Autoradiographie unterworfen. Die Menge an Expressionsprodukt wird durch Vergleich der Intensität der Hybridisationssignale auf dem Autoradiogramm mit dem verdünnten Standardantigen gp51 (Abb. 5) ermittelt. Die Nachweisgrenze dieses Testes beträgt etwa 2 ng BLV-gp51/1 μΙ Probe. Wie aus Abb. 4 folgt, entspricht die Konzentration des gp51-Derivates im Lysat des Stammes AH 216/YEpSG94, der unter Bedingungen der Derepression des pho5-Promotors angezogen wurde, 10 ng/5 μg Gesamtprotein, d. h. 0,2% des Gesamtproteins.Rabbit antiserum prepared by immunization with total BLV was incubated at 1: 250 dilution in dilution buffer with gentle shaking. After washing in dilution buffer with multiple changes of the wash solution in the volume of 100 to 200 ml, a second block in 1% gelatin solution (30 min at room temperature). Thereafter, the paper is incubated for 2 h at 37 ° C. in the volume of 50 l with 125 I-labeled Staphylococcus aureus protein A (3 × 10 7 cpm / Mg; 10 6 cpm / 10 ml) with gentle shaking. After several washes in dilution buffer, the paper is dried at room temperature and subjected to autoradiography for 24 hours with 2 intensifying screens at -70 ° C. The amount of expression product is determined by comparing the intensity of the hybridization signals on the autoradiogram with the diluted standard antigen gp51 (Figure 5). The detection limit of this test is about 2 ng BLV-gp51 / 1 μΙ sample. As shown in Fig. 4, the concentration of the gp51 derivative in the lysate of the strain AH 216 / YEpSG94 grown under conditions of derepression of the pho5 promoter corresponds to 10 ng / 5 μg total protein, ie 0.2% of the total protein.
50 bis 100 Mg Gesamtprotein aus den Lysaten der drei Stämme, die, wie in Beispiel 5 beschrieben, angezogen wurden, werden mittels der Methode der Disc-Elektrophorese in 13%igem PAAG getrennt (Methode Laemmli et al.). Das Laufverhalten der Proteine im Gel wird mit Hilfe von Markern kontrolliert. Die eine Hälfte des Gels wird angefärbt, die andere Hälfte wird für ein Westernblot auf Nitrocellulose verwendet. Nach dem Blot wird der Filter mit AntiBLV-Antikörpern und J125Protein A — wie unter Beispiel 5 beschrieben - behandelt und einer Autoradiographie unterworfen. Das im Ergebnis der Durchführung der beschriebenen Prozeduren erhaltene Autoradiogramm ist auf Abb. 6 dargestellt. Wie aus Abb. 5 ersichtlich ist, existiert die auf dem Wege der Hybridisierung mit AK und 125Jod-Protein A detektierte Proteinzone nur im Extrakt des Stammes AH216/YEpSG94, der unter Derepressionsbedingungen angezogen wurde. Das durch Vergleich des Laufverhaltens dieser Zone mit den Kontrollmarkern bestimmte Molekulargewicht des Expressionsproduktes beträgt 25 kD, das entspricht einer Proteingröße von 230 AA. Die aus der Nucleotidsequenz des in YEpSG94 befindlichen DNA-Fragmentes abgeleitete Größe des gp51-Derivates beträgt 209 AA.50-100 μg total protein from the lysates of the three strains grown as described in Example 5 are separated by means of the disc electrophoresis method in 13% PAAG (Laemmli et al. Method). The running behavior of the proteins in the gel is controlled by markers. One half of the gel is stained, the other half is used for a western blot on nitrocellulose. After blotting, the filter is treated with anti-BLV antibodies and J 125 protein A as described in Example 5 and subjected to autoradiography. The autoradiogram obtained as a result of performing the described procedures is shown in FIG. As can be seen from Fig. 5, the protein zone detected by way of hybridization with AK and 125 iodine protein A exists only in the extract of the strain AH216 / YEpSG94, which was grown under conditions of derepression. The molecular weight of the expression product determined by comparing the running behavior of this zone with the control markers is 25 kD, which corresponds to a protein size of 230 AA. The size of the gp51 derivative derived from the nucleotide sequence of the YEpSG94 DNA fragment is 209 AA.
Bgt II ' 'Bgt II ''
AAG ATC TAC TGG CCC CCC CCA CAA Lys-IIe-Tyr-Trp-Pro-Pro-Pro-Gln-AAG ATC TAC TGG CCC CCC CCA CAA Lys-IIe-Tyr-Trp-Pro-Pro-Pro-Gln-
GGG CGG CGC CGG TTT GGA GCC AGG Gly-Ars-Ars-Ars-Phe-Gly-Ala-Ars-I6GGG CGG CGC CGG TTT GGA GCC AGG Gly-Ars-Ars-Ars-Phe-Gly-Ala-Ars-I6
GCC ATG GTC ACA TAT GAT TGC GAG Ala-MET-Val-Thr-Tyr-Asp-Cys-Glu-GCC ATG GTC ACA TAT GAT TGC GAG Ala-MET-Val-Thr-Tyr-Asp-Cys-Glu
CCC CGA TGC CCT TAT GTG GGG GCA Pro-Ars-Cys-Pro-Tyr-Val-Gly-Ala-32CCC CGA TGC CCT TAT GTG GGG GCA Pro-Ars-Cys-Pro-Tyr-Val-Gly-Ala-32
GAT CGC TTC GAC TGC CCC CAC TGG Asp-Ars-Phe-Asp-Cys-Pro-His-Trp-GAT CGC TTC GAC TGC CCC CAC TGG Asp-Ars-Phe-Asp-Cys-Pro-His-Trp-
GAC AAT ^CC TCC CAG GCC GAT CAA Asp-Asn-Ala-Ser-Gln-Ala-Asp-Gln-48GAC AAT ^ CC TCC CAG GCC GAT CAA Asp-Asn-Ala-Ser-Gln-Ala-Asp-Gln-48
GGA TCC TTT TAT GTC AAT CAT CAG GIy-Ser-Phe-Tyr-Val-Asn-His-Gln-GGA TCC TTT TAT GTC AAT CAT CAG Gly-Ser-Phe-Tyr-Val-Asn-His-Gln
ATT TTA TTC CTG CAT CTT AAA CAA Ile-Leu-Phe-Leu-His-Leu-Lys-Gln-64ATT TTA TTC CTG CAT CTT AAA CAA Ile-Leu-Phe-Leu-His-Leu-Lys-Gln-64
TGT CAT GGA ATT TTC ACT CTA ACC Cys-His-Gly-Ile-Phe-Thr-Leu-Thr-TGT CAT GGA ATT TTC ACT CTA ACC Cys His Gly Ile Phe Thr Leu Thr
TGG GAG ATA TGG GGA TAT GAT CCC Trp-Glu-Ile-Trp-Gly-Tyr-Asp-Pro-80TGG GAG ATA TGG GGA TAT GAT CCC Trp-Glu-Ile-Trp-Gly-Tyr-Asp-Pro-80
CTG ATC ACC TTT TCT TTA CAT AAG Leu-Ile-Thr-Phe-Ser-Leu-His-Lys-CTG ATC ACC TTT TCT TTA CAT AAG Leu Ile-Thr-Phe-Ser-Leu-His-Lys-
ATC CCT GAT CCC CCT CAA CCC GAC Ile-Pro-Asp-Pro-Pro-Gln-Pro-Asp-96ATC CCT GAT CCC CCT CAA CCC GAC Ile-Pro-Asp-Pro-Pro-Gln-Pro-Asp-96
TTT CCC CAG TTG AAC AGT GAC TGG Phe-Pro-Gln-Leu-Asn-Ser-Asp-Trp-TTT CCC CAG TTG AAC AGT GAC TGG Phe-Pro-Gln-Leu-Asn-Ser-Asp-Trp-
GTT CGC TCT GTC AGA TCA TGG GCC Val-Pro-Ser-Val-Ars-Ser-Trp-Ala-112GTT CGC TCT GTC AGA TCA TGG GCC Val-Pro-Ser-Val-Ars-Ser-Trp-Ala-112
CTG CTT TTA AAC CAA ACA GCA CGG Leu-Leu-Leu-Asn-Gln-Thr-Ala-Ars-CTG CTT TTA AAC CAA ACA GCA CGG Leu-Leu-Leu-Asn-Gln-Thr-Ala-Ars
GCC TTC CCA GAC TGT GCT ATA TGT Ala-Phe-Pro-Asp-Cys-Ala-Ile-Cys-IGCC TTC CCA GAC TGT GCT ATA TGT Ala-Phe-Pro-Asp-Cys-Ala-Ile-Cys-I
TGG GAA CCT TCC CCT CCC TGG GCT Trp-Glu-Pro-Ser-Pro-Pro-Trp-Ala-TGG GAA CCT TCC CCT CCC TGG GCT Trp-Glu-Pro-Ser-Pro-Pro-Trp-Ala
CCC GAA ATA TTA GTA TAT AAC AAA Pro-Glu-Ile-Leu-Val-Tyr-Asn-Lys-IMCCC GAA ATA TTA GTA ACT AAC AAA Pro-Glu-Ile-Leu-Val-Tyr-Asn-Lys-IM
ACC ATC TCC AGC TCT GGA CCC GGCACC ATC TCC AGC TCT GGA CCC GGC
Thr-IIe-Ser-Ser-Ser-Gly-Pro-Gly-Thr-Ile-Ser-Ser-Ser-Gly-Pro-Gly
CTC GCC CTC CCG GAC GCC CAA ATC Leu-Ala-Leu-Pro-Asp-Ala-Gln-Ile-160CTC GCC CTC CCG GAC GCC CAA ATC Leu-Ala-Leu-Pro-Asp-Ala-Gln-Ile-160
TTC TGG GTC AAC ACG TCC TCG TTT Phe-Trp-Val-Asn-Thr-Ser-Ser-Phe-TTC TGG GTC AAC ACG TCC TCG TTT Phe-Trp-Val-Asn-Thr-Ser-Ser-Phe-
AAC ACC ACC CAA GGA TGG CAC CAC Asn-Thr-Tb.r-Gln-Gly-Trp-His-His-.176 'AAC ACC ACC CAA GGA TGG CAC CAC Asn-Thr-Tb.r-Gln-Gly-Trp-His-His-.176 '
CCT TCC CAG AGG TTG TTG TTC AAT Pro-Ser-Gln-Ars-Leu-Leu-Phe-Asn-CCT TCC CAG AGG TTG TTG TTC AAT Pro-Ser-Gln-Ars-Leu-Leu-Phe-Asn
GTT TCT CAA.. GGC AAC GCC TTG TTA Val-Ser-Gln-Gly-Asn-Ala-Leu-Leu-192GTT TCT CAA .. GGC AAC GCC TTG TTA Val-Ser-Gln-Gly-Asn-Ala-Leu-Leu-192
TTA GCT CCT ATG TCC CTG GTT AAT Leu-Pro-Pro-IIe-Ser-Leu-Val-Asn-TTA GCT CCT ATG TCC CTG GTT AAT Leu-Pro-Pro-IIe-Ser-Leu-Val-Asn
CTC TCT ACG GCT TCC TCC GCC CCT Leu-Ser-Thr-Ala-Ser-Ser-Ala-Pro-208CTC TCT ACG GCT TCC TCC GCC CCT Leu-Ser-Thr-Ala-Ser-Ser-Ala-Pro-208
CCI ACC Pro-Thr-CCI ACC Pro-Thr
Abb. 4 (Portsetzung)Fig. 4 (Port setting)
Ausschnitt aus der env-Sequenz des BLV-Rekombinantenklons HU-1 (BgIII bis Smal), die für einen Abschnitt des gp51 kodiert, der die Aminosäuren 122 bis 430 einschließt.Section from the env sequence of BLV recombinant clone HU-1 (BglII to SmaI), which encodes a portion of gp51 that includes amino acids 122 to 430.
a b ca b c
a) gp51 Standard (jeweils Doppeibestimmung) 20 ng, 10 ng, 2,5 ng, 5 nga) gp51 standard (each double determination) 20 ng, 10 ng, 2.5 ng, 5 ng
b) AH216 plasmidfrei, 24 μg, 12 μg, 3 μς, 6μg Gesamtprotein unter Induktionsbedingungen (ohne anorganische's Phosphat)b) AH216 plasmid-free, 24 μg, 12 μg, 3 μς, 6μg total protein under induction conditions (without inorganic phosphate)
c) AH216/YEpSG94/24μg, 12 μg, 3 μg, 6 μg Gesamtprotein unter Induktionsbedingungenc) AH216 / YEpSG94 / 24μg, 12 μg, 3 μg, 6 μg total protein under induction conditions
d) wie c1 unter Repressionsbedingungen (mit anorganischem Phosphat)d) as c 1 under repression conditions (with inorganic phosphate)
a ä ba ä b
a) gp51 Standard 30 ng a') gp51 Standard 7 nga) gp51 standard 30 ng a ') gp51 standard 7 ng
b) AH216 plasmidfrei 50 μg Gesamtprotein unter Induktionsbedingungen (ohne anorganisches Phosphat)b) AH216 plasmid-free 50 μg total protein under induction conditions (without inorganic phosphate)
c) AH216 /YEpSG94/ 50 μg Gesamtprotein unter Induktionsbedingungenc) AH216 / YEpSG94 / 50 μg total protein under induction conditions
d) AH216 /YEpSG94/ 50 μg Gesamtprotein unter Repressionsbedingungen (mit anorganischem Phosphat)d) AH216 / YEpSG94 / 50 μg total protein under repression conditions (with inorganic phosphate)
Claims (15)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD85279294A DD240029A1 (en) | 1985-08-02 | 1985-08-02 | METHOD FOR PRODUCING A BLV-CODED HUEL PROTEIN |
| SU854025079A SU1337408A1 (en) | 1985-08-02 | 1985-12-02 | Recombination plasmide deoxyribonucleic acid y ep sg 94 coding synthesis of cattle leucosis virus shell protein derivative,method of its construction and saccharomyces cerevisial yeast strain producer of derivative of cattle leukosis virus shell protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD85279294A DD240029A1 (en) | 1985-08-02 | 1985-08-02 | METHOD FOR PRODUCING A BLV-CODED HUEL PROTEIN |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD240029A1 true DD240029A1 (en) | 1986-10-15 |
Family
ID=5570199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD85279294A DD240029A1 (en) | 1985-08-02 | 1985-08-02 | METHOD FOR PRODUCING A BLV-CODED HUEL PROTEIN |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD240029A1 (en) |
| SU (1) | SU1337408A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988006182A1 (en) * | 1987-02-10 | 1988-08-25 | Toa Nenryo Kogyo Kabushiki Kaisha | Bovine leukemia virus vaccine prepared by using recombinant vaccinia virus |
-
1985
- 1985-08-02 DD DD85279294A patent/DD240029A1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-12-02 SU SU854025079A patent/SU1337408A1/en active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988006182A1 (en) * | 1987-02-10 | 1988-08-25 | Toa Nenryo Kogyo Kabushiki Kaisha | Bovine leukemia virus vaccine prepared by using recombinant vaccinia virus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SU1337408A1 (en) | 1987-09-15 |
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