ES2891752T3

ES2891752T3 - Purificación de proteínas de triple hélice

Info

Publication number: ES2891752T3
Application number: ES14768321T
Authority: ES
Inventors: John Alan Maurice Ramshaw; Jerome Anthony Werkmeister; Yong Yi Peng
Original assignee: Evonik Operations GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2022-01-31
Anticipated expiration: 2034-03-21
Also published as: CN105143243B; TWI657094B; US10053501B2; EP2976352A1; AU2014234962A9; KR102351839B1; JP2016514708A; AU2014234962A1; AU2014234962B2; BR112015023447A2; EP2976352B1; JP6594293B2; CN105143243A; EP2976352A4; KR20150136604A; TW201514194A; AU2014234962C1; WO2014146175A1; US20160046692A1

Abstract

Un método para la purificación de una proteína de triple hélice expresada de forma recombinante que comprende un motivo de repetición (Gly-X-Y)n, en el que n está entre 5 y 600, y X e Y son independientemente cualquier imino o aminoácido natural o no natural, en el que la proteína está contenida en un extracto u homogenado de cultivo de células hospedantes no mamíferas, comprendiendo el método: (i) precipitar los materiales de la célula hospedante a partir de la proteína de triple hélice a un pH menor que 7 y a una temperatura que es menor que la temperatura de fusión Tm de la proteína de triple hélice; seguido de (ii) digerir materiales de células hospedantes presentes en el extracto u homogenado de cultivo de células hospedantes precipitado mediante la adición de una proteasa ácida, en el que la proteína de triple hélice es resistente a la digestión con proteasa ácida; y (iii) recoger la proteína de triple hélice purificada; en el que la proteína de triple hélice permanece en disolución durante al menos las etapas (i) y (ii).

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de proteínas de triple hélice

REFERENCIA CRUZADA A OTRAS SOLICITUDES

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Australiana No. 2013900990, titulada “Purificación de proteínas de triple hélice”, presentada el 21 de marzo de 2013.

LISTADO DE SECUENCIAS

Esta solicitud se presenta junto con un Listado de Secuencias en formato electrónico.

CAMPO DE LA DESCRIPCIÓN

La presente invención se refiere a un método para purificar proteínas de triple hélice o similares al colágeno producidas de forma recombinante a partir de una célula hospedante bacteriana, de levadura, o vegetal.

ANTECEDENTES

Los colágenos son las principales proteínas estructurales en la matriz extracelular de los animales, y se definen por una estructura característica de triple hélice que requiere una secuencia (Gly-Xaa-Yaa)n repetida. Los aminoácidos que se encuentran en las posiciones Xaa e Yaa son frecuentemente prolina, en los que Pro en la posición Yaa se modifica postraduccionalmente a hidroxiprolina (Hyp), que mejora la estabilidad de la triple hélice. En los seres humanos, está presente una familia de al menos 28 tipos de colágeno, cada uno con funciones biológicas y estructurales específicas de tipo. El motivo de triple hélice también está presente en otras proteínas, tales como los receptores depuradores de macrófagos, colectinas y C1q.

Los colágenos más abundantes son los colágenos intersticiales que forman fibrillas, en particular el colágeno de tipo I. Estos colágenos forman las principales estructuras tisulares en los animales mediante la formación de redes de haces de fibras que se estabilizan mediante reticulaciones específicas para dar estabilidad y resistencia a los tejidos. En contraste con los colágenos “principales” que forman fibrillas (tipos I, II y III), los colágenos “menores” se distribuyen generalmente de manera menos amplia, y se encuentran típicamente en ubicaciones de tejidos particulares en las que el colágeno menor puede ser un componente importante y crítico, por ejemplo, colágeno de tipo X en cartílago hipertrófico, o el colágeno de tipo IV en membranas basales.

Se ha demostrado que el colágeno es seguro y eficaz en una variedad de productos médicos en diversas aplicaciones clínicas (Ramshaw et al, J Materials Science, Materials in Science, (2009), 20(1) p. 3-8). Para aplicaciones médicas, el colágeno se usa generalmente en dos formatos distintos. En un primer formato, se usa tejido intacto después de la estabilización química, tal como las válvulas cardíacas porcinas fijadas con glutaraldehído, para uso en el reemplazo de la válvula aórtica. El otro es a través de la preparación de colágeno soluble purificado que ha sido reconstituido en diversos productos, tales como láminas secas estabilizadas o fibras extruidas útiles para vendajes de heridas, barreras de adhesión, o dispositivos para la reparación de meniscos, dando el procesamiento la forma deseada para el producto. Si es necesario, el dispositivo de colágeno puede estabilizarse, ya sea mediante fijación química, por ejemplo, glutaraldehído, o mediante un método físico, por ejemplo, reticulación deshidrotermal. El colágeno soluble purificado también se ha usado ampliamente como pasta de colágeno para el aumento de tejidos blandos, y también para el tratamiento de la incontinencia urinaria. Los productos reconstituidos se caracterizan por una alta pureza bioquímica asociada con baja inmunogenicidad, recambio controlado, a menudo durante períodos cortos de tiempo, porosidad controlada, y retención de interacciones célula-matriz que son importantes en las funciones biológicas en los tejidos.

Para purificar el colágeno de los tejidos de colágeno animal, las metodologías típicas incluyen una digestión inicial y solubilización del tejido mediante el uso de una etapa de digestión enzimática que elimina las regiones reticuladas dejando intacta la triple hélice. A continuación, el colágeno solubilizado se puede purificar para eliminar los posibles contaminantes inmunogénicos. El documento US6548077, por ejemplo, describe una preparación de colágeno a partir de tejidos que implica poner en contacto el colágeno con una primera enzima proteolítica, seguido de un agente reductor y una segunda enzima proteolítica.

Addad et al (Mar. Drugs (2011), 9(6), 967-983) describen la purificación del colágeno de medusas mediante la solubilización del extracto de tejido con ácido-pepsina. Sin embargo, para obtener un producto final estable y útil, se requirió una etapa de reticulación. El tratamiento con ácido, y ácido acético en particular, conduce al hinchamiento de los tejidos, y después de la digestión con pepsina, da un colágeno soluble. El producto de colágeno soluble resultante sería un material no fibroso débil que puede necesitar reconstituirse en un formato insoluble para muchas aplicaciones médicas.

Los métodos alternativos publicados incluyen moler el tejido animal natural que es rico en colágeno en partículas muy finas que se pueden lavar y limpiar de impurezas, ya sea antes o después de procesarlo en un material médico útil.

La mayoría de las cantidades comerciales de colágeno han derivado de animales tales como fuentes bovinas, pero con la preocupación de las enfermedades transmisibles, especialmente la encefalopatía espongiforme bovina (“enfermedad de las vacas locas”), se han dedicado esfuerzos de investigación para producir formas recombinantes de colágeno. Además, el colágeno de origen animal está limitado por cuanto los colágenos extraídos no pueden diseñarse ni modificarse para mejorar o cambiar propiedades biológicas específicas. Los colágenos están sujetos a extensas modificaciones postraduccionales tanto antes como después de la deposición en la matriz extracelular. En particular, los colágenos fibrilares están sujetos a reticulación intra- e intermolecular, que continúa durante la vida de la molécula en el espacio extracelular. De este modo, la cantidad de reticulación presente en los colágenos está influida, entre otros, por la edad y la fisiología del tejido del que se extrae el colágeno. Estas diferencias influyen tanto en la capacidad de extracción de colágenos de los tejidos como en las características biofísicas de estos colágenos. Como resultado, los colágenos aislados de tejidos exhiben una variabilidad significativa entre lotes y, como materiales a granel, a menudo son analíticamente intratables.

Por consiguiente, la atención se ha alejado del aislamiento del colágeno animal y se ha dirigido a la producción de colágenos recombinantes.

Además, el uso de tecnología de ADN recombinante es deseable por cuanto permite la producción potencial de colágenos sintéticos y fragmentos de colágeno que pueden incluir, por ejemplo, dominios biológicamente activos exógenos (es decir, para proporcionar una función proteica adicional) y otras características útiles (por ejemplo, biocompatibilidad y estabilidad mejoradas).

Se han explorado sistemas hospedantes tales como la levadura para producir de forma recombinante colágeno codificado en seres humanos. Sin embargo, los sistemas de levadura se complican por la necesidad de introducir genes para que la prolina-4 hidroxilasa forme los restos de Hyp necesarios para la estabilidad de los colágenos de mamíferos. Normalmente, los colágenos codificados en mamíferos recombinantes se expresan en Pichia, que requiere la adición de oxígeno para obtener la máxima hidroxilación, así como la adición de metanol para la inducción, creando la necesidad de una ingeniería mejorada y potencialmente ignífuga.

Se ha buscado otro material similar al colágeno que no requiera modificación postraduccional como sustituto al colágeno humano hidroxilado. Recientemente, la investigación sobre genomas bacterianos ha indicado que hay muchas proteínas bacterianas putativas que contienen Gly como cada tercer resto y un alto contenido de prolina, lo que sugiere que las estructuras de triple hélice similares al colágeno pueden estar presentes en ciertas proteínas derivadas de bacterias (Peng Y et al (2010) Biomaterials 31(10):2755-2761; Yoshizumi A et al (2009) Protein Sci 18:1241-1251). Además, se ha demostrado que varias de estas proteínas forman triples hélices que son estables a alrededor de 37°C, a pesar de la ausencia de Hyp. La composición de triple hélice se ha confirmado en varios casos. Los ejemplos incluyen proteínas de la superficie celular en ciertas células bacterianas y filamentos en esporas de Bacillus Anthracis. Se ha postulado que la expresión de tales construcciones similares al colágeno en profagos presentes en cepas patógenas de E coli parece ser responsable de la diseminación de genes relacionados con la virulencia a través de la infección (Bella J et al (2012) 7(6) PLoS 1 e37872).

Merle C. et al. FEBS Letters 515 (2002) 114 - 18: describen un método para la purificación de colágeno de tipo I humano recombinante expresado en hojas de tabaco mediante la precipitación de los materiales de la célula hospedante a partir de la proteína de triple hélice en condiciones ácidas y a una temperatura en la que la proteína de triple hélice permanece térmicamente estable. Sin embargo, no se describe allí una etapa de digestión de materiales de células hospedantes mediante la adición de una proteasa ácida, en la que la proteína de triple hélice es resistente a la digestión, y en la que la proteína de triple hélice permanece en disolución durante todo el procedimiento de purificación.

Sin embargo, el uso de tecnología recombinante todavía tiene sus deficiencias y obstáculos. El uso de células hospedantes para producir proteínas extrañas presenta desafíos adicionales, tales como la eliminación de proteínas contaminantes de la célula hospedante cuya presencia en la formulación final de las proteínas deseadas puede dar como resultado reacciones tóxicas o inmunológicas adversas. Si la proteína recombinante se produce de forma intracelular, la primera etapa de un procedimiento de purificación implica la lisis o ruptura de la célula, que libera el contenido de la célula en el homogenado, y además produce fragmentos subcelulares. Si la proteína recombinante se segrega fuera de la célula, la muerte natural de las células y la liberación de proteínas intracelulares de la célula hospedante en el sobrenadante también pueden dar lugar a contaminación tóxica e inmunogénica. Para eliminar estos contaminantes, normalmente se requieren muchas etapas de purificación diferentes. La cromatografía de afinidad se adopta comúnmente para lograr altos niveles de pureza. Este procesamiento posterior es generalmente intensivo en mano de obra y recursos y tiene un coste prohibitivo para la producción comercial a gran escala.

La producción a gran escala de proteínas recombinantes similares al colágeno está todavía en su infancia. Hay ciertos desafíos que deben abordarse con la producción a gran escala, incluyendo la escalabilidad del procedimiento, los costes de producción, la complejidad del método de extracción, el cumplimiento de los requisitos de GMP, el cumplimiento de los requisitos reglamentarios, la eliminación de proteínas contaminantes de la célula hospedante, la complejidad del método de purificación, y la idoneidad de la célula hospedante. Por ejemplo, las líneas celulares humanas solo dan como resultado rendimientos moderados que no son adecuados para una producción rentable a mayor escala.

Por consiguiente, existe la necesidad de métodos para la purificación de colágenos producidos de forma recombinante, en los que dichos métodos sean rentables y que den como resultado la producción de colágeno con altos rendimientos y pureza suficiente para diversas aplicaciones.

SUMARIO DE LA DESCRIPCIÓN

Los presentes inventores han desarrollado un método para purificar proteínas de triple hélice recombinantes expresadas por una célula hospedante no animal, tal como una célula bacteriana, de levadura, o vegetal. El método proporciona la purificación de proteína o proteínas de triple hélice solubles que permanecen solubles durante todo el método de purificación. Además, el método no da como resultado la desnaturalización, degradación, o hidrólisis de la o las proteínas de triple hélice.

El método de la presente descripción proporciona la purificación de proteínas de triple hélice recombinantes (de cualquier fuente) que da como resultado la producción de proteína de triple hélice solubilizada (por ejemplo, colágeno) que es estable y está libre de proteínas contaminantes (que pueden comprometer la estabilidad de las proteínas de triple hélice), y que se puede producir con un alto rendimiento ya que se minimizan las etapas del procedimiento. Ventajosamente, el método proporciona un enfoque rentable para la purificación de proteínas de triple hélice (por ejemplo, colágeno) que son estable en condiciones ácidas y que se producen con suficiente pureza para una variedad de aplicaciones diferentes.

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.

Por lo tanto, la presente descripción proporciona un método para la purificación de una proteína de triple hélice expresada de forma recombinante contenida en un extracto u homogenado de cultivo de células hospedantes no mamíferas, comprendiendo el método:

(i) precipitar los materiales de la célula hospedante de la proteína de triple hélice en condiciones ácidas y a una temperatura a la que la proteína de triple hélice permanece térmicamente estable; seguido de

(ii) digerir los materiales de la célula hospedante presentes en el extracto u homogenado del cultivo de la célula hospedante precipitado mediante la adición de una proteasa, en el que la proteína de triple hélice es resistente a la proteasa; y

(iii) recoger la proteína de triple hélice purificada; y

que comprende además opcionalmente una etapa de separación adicional, entre la etapa de precipitación y la etapa de digestión, de separar físicamente la proteína de triple hélice de los materiales insolubles de la célula hospedante; y

en el que la proteína de triple hélice permanece soluble durante al menos las etapas (i) y (ii).

En un ejemplo, la proteína de triple hélice permanece soluble a lo largo de las etapas (i) a (iii).

En un ejemplo, la etapa de digestión del material de la célula hospedante se lleva a cabo usando una proteasa ácida.

En un ejemplo, el método comprende además recolectar la célula hospedante. Preferiblemente, la célula hospedante es una célula hospedante bacteriana, de levadura, o vegetal. Los métodos para cultivar la célula hospedante de la presente descripción serán familiares para los expertos en la técnica, y se describen en otra parte aquí.

Las condiciones ácidas se refieren a un pH del extracto u homogenado del cultivo que está a un pH menor que 7, preferiblemente un pH menor que alrededor de 6.

Según el método de la descripción, la proteína de triple hélice permanece térmicamente estable. Los expertos en la técnica conocerán ciertos agentes o aditivos que pueden añadirse al extracto u homogenado del cultivo que ayudan a mantener la estabilidad térmica de la proteína de triple hélice. Por ejemplo, se puede añadir un agente anticongelante, tal como NaCl, u otros aditivos que proporcionen estabilidad, tales como, por ejemplo, alcohol polivinílico, óxido de polietileno, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, polietilenglicol (PEG) o derivados del mismo, metilcelulosa, agarosa, dextrinas, hidroxietilalmidones, N-óxido de trimetilamina (TMAO), etc. En un ejemplo, la estabilidad térmica de la proteína de triple hélice se mantiene si la etapa de precipitación se realiza a una temperatura menor que la temperatura de fusión de la proteína de triple hélice. En otro ejemplo, la estabilidad térmica de la proteína de triple hélice se mantiene en las condiciones de precipitación ácidas a una temperatura de al menos 10°C por debajo de la Tm de la proteína de triple hélice. Los métodos para determinar la estabilidad térmica de proteínas de triple hélice se describen, por ejemplo, en el documento US 8.280.710.

El método de la presente descripción incluye la etapa de separación intermedia opcional para separar la proteína de triple hélice de los materiales precipitados de la célula hospedante, tales como proteínas de la célula hospedante y/o ADN de la célula hospedante. Se puede emplear cualquier procedimiento o procedimientos de separación en esta etapa opcional para eliminar uno o ambos de estos materiales. Dichos procedimientos son preferiblemente técnicas brutas de separación o concentración tales como centrifugación, filtración, filtración de flujo cruzado, o sedimentación.

En otra realización, puede ser necesario un ajuste adicional del pH antes o al mismo tiempo que la etapa de digestión según el presente método. Dependiendo de la proteasa usada en la etapa de digestión, puede ser necesario ajustar el pH hacia arriba o hacia abajo con la condición de que la proteína de triple hélice permanezca en disolución. Por ejemplo, si se usa pepsina como proteasa, entonces puede ser necesario reducir el pH del extracto u homogenado del cultivo antes de la adición de pepsina. Dichos ajustes están dentro de los conocimientos del experto en la técnica.

Los expertos en la técnica apreciarán que la célula hospedante que se transforma o transfecta con una construcción recombinante que comprende una secuencia que codifica la proteína de triple hélice se cultiva en condiciones adecuadas para provocar la expresión de la proteína de triple hélice. En algunos ejemplos, la proteína de triple hélice se producirá intracelularmente, en cuyo caso será necesario extraer la proteína de triple hélice de la célula. Los métodos de extracción requerirán la ruptura de la célula hospedante. La extracción se puede lograr por medios mecánicos o químicos (por ejemplo, enzimáticos) conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de procedimientos de extracción mecánica pueden incluir uno o más de los siguientes: tratamiento con ultrasonidos, microfluidización, lisis en una prensa francesa o aparato similar, choque osmótico, y rotura por agitación/molienda vigorosa con perlas de vidrio, cerámica, o acero. Alternativamente, o junto con una extracción mecánica, también se puede emplear una extracción enzimática. Los ejemplos de agentes adecuados para la extracción enzimática incluyen lisozima, lisostafina, zimolasa, celulosa, mutanolisina, glicanasas, proteasas, manosa, etc.

En algunos ejemplos, la proteína de triple hélice es segregada por la célula hospedante (es decir, producida extracelularmente como es el caso en algunos sistemas de levadura). En esas circunstancias, la extracción no es necesaria; sin embargo, el extracto de cultivo celular puede concentrarse creando así un homogenado o filtrado por métodos conocidos en la técnica para obtener una disolución que comprende la proteína de triple hélice soluble recuperada. En otro ejemplo, el medio de cultivo celular se concentra con la proteína de triple hélice mediante filtración de flujo cruzado.

En consecuencia, el método de la presente descripción puede incluir una etapa adicional de producir un extracto u homogenado del cultivo de células hospedantes que contiene la proteína de triple hélice.

Los contaminantes celulares y los desechos del extracto u homogenado del cultivo celular que contiene proteína de triple hélice recombinante se eliminan mediante una etapa de precipitación ácida según el método de la presente descripción. Los inventores han descubierto que al ajustar el pH de la disolución a condiciones ácidas a una temperatura a la que la proteína de triple hélice permanece térmicamente estable, la proteína de triple hélice recombinante no se desnaturaliza y permanece en disolución mientras que gran parte del material contaminante (es decir, no soluble) precipita. De este modo, la invención aprovecha la estabilidad del pH de las proteínas de triple hélice en esta primera etapa de purificación.

Preferiblemente, la temperatura es constante durante todo el método. En un ejemplo, la temperatura se mantiene a temperatura ambiente (es decir, entre alrededor de 182C y 24°C).

En un ejemplo, la temperatura es al menos 10°C o más por debajo de la temperatura de fusión (Tm) de la proteína de triple hélice recombinante durante la etapa de precipitación ácida.

La acidificación de la disolución que contiene la proteína de triple hélice recombinante puede lograrse mediante cualquier ácido adecuado, incluyendo los ácidos fuertes o débiles. Puede usarse un solo ácido, o alternativamente pueden usarse combinaciones de diferentes ácidos. Los ejemplos de ácidos adecuados según el método incluyen ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, fórmico, o láctico, aunque también serían adecuados otros ácidos familiares para los expertos en la técnica. En consecuencia, dependiendo de la Tm de la proteína recombinante al pH de la disolución de acidificación, la temperatura a la que se produce la acidificación puede variar entre 4°C y 30°C.

En la siguiente tabla se proporcionan ejemplos de las temperaturas de fusión del dominio similar a colágeno (CL) de triple hélice para diversas especies bacterianas.

Tabla 1. Temperatura de fusión de dominios similares a colágeno (CL)

Especie Dominio Tm (pH neutro) °C Tm (pH ácido) °C

Clostridium perfringens CL 38,8 37,2

Solibacter usitatus CL 38,5 27,0

Metilobactería sp. 4-46 CL 35,0 28,3

Rhodopseudomonas palustris CL 37,0 32,0

Streptococcus pyogenes (Scl2) CL 35,9 25,7

Streptococcus pyogenes (Scl2) CL-CL 36,5

Durante la etapa de precipitación ácida, el pH ajustado del extracto u homogenado del cultivo celular que contiene la proteína de triple hélice recombinante dependerá de la célula hospedante y de la secuencia de la proteína de triple hélice. En un ejemplo, el extracto u homogenado de cultivo celular que comprende la proteína de triple hélice se ajusta a un pH menor que 7. En otro ejemplo, para las células hospedantes bacterianas, se prefiere un pH entre 2 y 4, y para las células hospedantes de levadura se prefiere un pH entre 4 y 6. En otro ejemplo de células hospedantes vegetales, se prefiere un pH entre 2 y 4,5.

En ciertos ejemplos, para la expresión de proteínas de triple hélice recombinantes de células vegetales, la etapa de precipitación ácida puede realizarse a dos valores de pH diferentes. Por ejemplo, cuando la proteína vegetal más abundante en el extracto es la ribulosa bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco), es mejor que se precipite a un pH de alrededor de 4,5. Sin embargo, este pH normalmente no es suficiente para eliminar todas las proteínas vegetales contaminantes, en cuyo caso puede ser necesario seguir con una precipitación adicional a pH 2,5.

Por consiguiente, la etapa de precipitación ácida puede requerir un ajuste del valor de pH que provoca la precipitación de proteínas contaminantes sucesivas presentes en el extracto. Preferiblemente, las proteínas precipitadas se eliminarán según los métodos descritos anteriormente entre los ajustes de pH posteriores.

Según el método de la presente descripción, la etapa de digestión sigue a la etapa de precipitación ácida. Los presentes inventores han descubierto que la etapa de digestión elimina los contaminantes de la célula hospedante generados en el procedimiento de extracción (en el que se produce el extracto u homogenado del cultivo) o que no se eliminaron durante la recuperación de la proteína de triple hélice en la etapa de precipitación. Normalmente, la etapa de digestión dará como resultado la eliminación de proteínas contaminantes de la célula hospedante que son propensas a la digestión enzimática, por ejemplo, proteínas de membrana. En otro ejemplo, la etapa de digestión se lleva a cabo utilizando una proteasa, preferiblemente una proteasa ácida. Los ejemplos adecuados de proteasas ácidas para uso según el método de la presente descripción incluyen pepsina, papaína, enzimas similares a la papaína tales como bromelina, ficina o actinidina, o proteasa ácida de Aspergillus saitoi.

Dependiendo de la proteasa empleada, puede ser necesario ajustar el pH a condiciones menos ácidas (por ejemplo, para proteasas tal como papaína). El experto en la técnica estará familiarizado con tales estrategias.

En algunos ejemplos, la digestión con proteasas se puede terminar ajustando el pH del extracto u homogenado del cultivo a pH neutro.

Se apreciará que el método da como resultado la purificación de una proteína de triple hélice proteolíticamente estable. La proteína de triple hélice también puede incluir secuencias de proteínas no helicoidales adicionales que son proteolíticamente estables y/o insertos de secuencia no triple helicoidal que, de forma natural o por diseño, son proteolíticamente estables a la enzima seleccionada para la eliminación de las proteínas hospedantes. De este modo, el método de la presente descripción también tiene la ventaja de purificar selectivamente proteínas proteolíticamente estables frente a proteínas proteolíticamente inestables, y de este modo purifica selectivamente proteínas de triple hélice frente a otras proteínas no de triple hélice.

La proteasa digiere muchas proteínas contaminantes en péptidos que pueden eliminarse por diafiltración o precipitación, ya que tienen un peso molecular mucho menor que la proteína de triple hélice recombinante soluble intacta. A continuación, se puede recoger la proteína de triple hélice recombinante purificada resultante. Ambos procedimientos tienen la ventaja añadida de concentrar la proteína de triple hélice recombinante. La precipitación de la proteína de triple hélice recombinante se puede lograr mediante la adición de sulfato de amonio, mediante el ajuste del pH y/o el ajuste de la temperatura, o mediante el uso de un polímero (por ejemplo, polietilenglicol).

En otro ejemplo, los ácidos nucleicos contaminantes de la célula hospedante también pueden eliminarse de la proteína de triple hélice recogida mediante métodos conocidos en la técnica.

Dependiendo del uso final de la proteína de triple hélice, se puede emplear una etapa de pulido de la proteína de triple hélice recogida para concentrar y/o purificar adicionalmente la proteína de triple hélice recombinante una vez que se han eliminado los contaminantes del hospedante. La cromatografía es una de esas técnicas que se usa habitualmente para pulir disoluciones de proteínas. Los ejemplos de procedimientos cromatográficos que pueden adoptarse incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de líquidos de alta resolución, electroforesis, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, y cromatografía de interacción hidrófoba. Si la proteína de triple hélice recombinante se ha precipitado mediante un polímero neutro, el precipitado será bajo en sal, y por lo tanto puede usarse directamente para cromatografía de intercambio iónico si es necesaria una purificación de pulido adicional.

Se apreciará que el método da como resultado la generación de proteína de triple hélice purificada. En un ejemplo, la proteína de triple hélice purificada se estabiliza. En otro ejemplo, la proteína de triple hélice se estabiliza con glutaraldehído; sin embargo, se pueden usar otros agentes estabilizantes conocidos en la técnica.

Las células hospedantes adecuadas para expresar la proteína de triple hélice recombinante incluyen células bacterianas, de levadura, o vegetales. Los métodos de producción recombinante de proteínas de triple hélice en estas células resultarán familiares para los expertos en la técnica.

La célula hospedante bacteriana puede seleccionarse de, pero sin limitarse a, Escherichia, Bacillus, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus. En un ejemplo, el hospedante bacteriano es Escherichia coli. Los hospedantes adecuados de E. coli incluyen la cepa de E. coli BL21 (ciencias biológicas), (Life Sciences), E. coliW3110 (ATCC 27.325), E. co li294 (ATCC 31.446), y E. coli X1776 (ATCC 31.537).

La célula hospedante de levadura puede seleccionarse de Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Schwanniomyces occidentis, Schizo saccharomyces pombe, Trichoderma reesei y Yarrowia lipolytica.

La célula hospedante vegetal puede seleccionarse de tabaco, maíz, trigo, cebada, así como plantas inferiores tales como microalgas, tal como Chlorella vulgaris.

La construcción de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de triple hélice recombinante purificada según el método de la presente descripción es aquella que comprende una secuencia que codifica un motivo repetitivo (Gly-X-Y)n como se define aquí. La proteína de triple hélice codificada por la construcción de expresión es preferiblemente termoestable a la temperatura corporal de los mamíferos (es decir, entre 35 y 40’C), 0 puede estabilizarse después de la purificación mediante modificación. El valor de n puede estar entre 5 y 600 o entre 1 y 350, y (Gly-X-Y) representa un dominio de formación de triple hélice derivado de bacterias o animales (mamíferos) 0 insectos, siendo X e Y independientemente cualquier imino- o aminoácido natural o no natural para cada unidad de repetición. En un ejemplo, ni X ni Y son hidroxiprolina. Sin embargo, en algunos ejemplos, el dominio de triple hélice podría incluir hidroxiprolina. Una secuencia de inserto o enlazadora puede ubicarse entre cada dominio de formación de triple hélice (también denominado aquí “dominio de formación similar a colágeno (CL)”) en construcciones que comprenden más de un dominio CL, o dentro de un dominio CL individual. El inserto se compone de aproximadamente 1 a 50 de cualquier imino- o aminoácido. Preferiblemente, el inserto no es lábil a enzimas/proteasas.

En un ejemplo, la proteína de triple hélice es colágeno.

La secuencia de triple hélice recombinante puede derivarse de cualquier proteína de triple hélice o que contenga una triple hélice, ya sea de bacterias, levaduras, plantas, insectos, o gusanos de seda, y puede estar hidroxilada o no hidroxilada.

Si la proteína de triple hélice está en forma hidroxilada, entonces se puede emplear una etapa adicional que requiera la modificación de los restos de prolina antes de emprender el presente método. Tales metodologías resultarán familiares para los expertos en la técnica.

Ejemplos de secuencias que codifican proteínas recombinantes de tipo triple hélice y que pueden usarse para diseñar construcciones apropiadas de la invención incluyen:

(i) secuencias de organismos bacterianos patógenos o no patógenos, en los que, por ejemplo, la secuencia de triple hélice puede incluir dominios CL derivados de uno o más de S. pyogenes, Methylobacterium sp.4-46, Solibacter usitatus, Streptococcus equi SclC, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Rhodopseudomonas palustris, Streptococcus pneumoniae A que exhiben la estabilidad térmica deseada en su estado nativo o después de la estabilización por reticulación química. Las secuencias también pueden incluir secuencias similares a colágeno de triple hélice identificadas en el documento US 6.953.839;

(ii) una o más secuencias de ADN aisladas de organismos seleccionados de, pero sin limitarse a, Corynebacterium difteria, Actinobacterias (por ejemplo, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium vanbaalenii, especies de Nocardioides, Rubrobacter xylanophilus, Salinispora arenicola, Salinispora tropica, y especies de Streptomyces), Alfaproteobacterias (por ejemplo, especies de Anaplasma, Methytobacterium radiotolerans, Nitrobacter winogradskyi, Paracoccus denitrificans, Rhizobium leguminosarum, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris, Sphingomonas wittichii, y especies de Wolbachia), Bacteriodotas (por ejemplo, Bacteroides thetaiotaomicron), Betaproteobacterias (por ejemplo, especies de Azoarcus, Burkholderia ambifaria, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia phymatum, Burkholderia vietnamiensis, Dechloromonas aromatica, Polaromonas naphthalenivorans, Ralstonia eutropha, Ralstonia metallidurans, Ralstonia pickettii, y Rhodoferax ferrireducens), Cianobacterias (por ejemplo, especies de Cyanothece, especies de Synechocystis, Trichodesmium erythraeum), Deinococcus (por ejemplo, Deinococcus radiodurans), Deltaproteobacterias (por ejemplo, Anaeromyxobacter dehalogenans), Epsilonproteobacterias (por ejemplo, Campylobacter curvus), Firmicutes (por ejemplo, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Clostridium botulinum, Clostridium phytofermentans, Enterococcus faecalis, Geobacillus kaustophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Lysinibacillus sphaericus, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agalactiae, y Streptococcus pneumoniae), y Gammaproteobacterias (por ejemplo, Citrobacter koseri, especies de Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Photorhabdus luminescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas entomophila, Pseudomonas putida, Psychrobacter cryohalolentis, Saccharophagus degradans, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Serratia proteamaculans, Shewanella amazonensis, Shewanella baltica, Shewanella frigidimarina, Shewanella halifaxensis, Shewanella loihica, Shewanella oneidensis, Shewanella pealeana, Shewanella putrefaciens, Shewanella sediminis, Shewanella woodyi, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, y Vibrio harveyi);

(iii) secuencias de ADN que codifican C1q, acetilcolina esterasa, receptor depurador de macrófagos, una proteína tensioactiva pulmonar, proteína de unión a manosa, proteína de hibernación, Mytilus byssus, ectodisplasina A, o gliomedina;

(iv) secuencias que codifican la proteína de seda de mosca de sierra derivada de un himenóptero, Nematini: en especies de Hemichroa, Pristiphora, Pachynemalus, Pikonema y Nematus (subfamilia Nematinae), Tomostethus, y especie de Tethida (subfamilia Blennocampinae); y

(v) secuencias que codifican colágeno de mamíferos, incluyendo uno o más de colágeno de tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, tipo V, tipo VI, tipo VII, tipo VIII, tipo IX, tipo X, tipo XI, tipo XII, tipo XIII, tipo XIV, tipo XV, tipo XVI, tipo XVII, tipo XVIII, tipo XIX, tipo XX, tipo XXI, tipo XXII, tipo XXIII, tipo X iV, tipo XXV, tipo XXVI, tipo XXVII, tipo XXVIII.

Las secuencias de inserto se pueden manipular en la construcción recombinante para mejorar la elasticidad de la proteína de triple hélice o para que sirvan de otro modo como dominio de unión natural o secuencia de escisión biológica. En el documento WO 2010/091251 se describen ejemplos de construcciones adecuadas para uso.

En un ejemplo, la proteína de triple hélice expresada y/o su dominio de triple hélice es un homotrímero en el que se ensamblan cadenas idénticas para formar una triple hélice.

En un ejemplo adicional, la proteína de triple hélice expresada y/o dominio de triple hélice de la misma es un heterotrímero que consiste en dos o tres cadenas distintas ensambladas para formar una triple hélice, por ejemplo, como se encuentra en el colágeno de tipo I de mamífero.

En un ejemplo adicional, la proteína de triple hélice expresada es una proteína quimérica que comprende al menos dos dominios de triple hélice que están enlazados mediante una secuencia enlazadora. Por ejemplo, la construcción quimérica que codifica la proteína puede comprender dos o más dominios formadores de triple hélice de secuencias de triple hélice de mamíferos y/o bacterias que pueden estar separados por un enlazador, o dominios formadores de triple hélice de diferentes colágenos bacterianos, que pueden estar separados por una secuencia enlazadora. Dichas quimeras, cuando se expresan, dan como resultado la producción de una cadena de proteína, que es capaz de formar una triple hélice, y que puede consistir, por ejemplo, en dos segmentos de cadena derivados de bacterias o un segmento de cadena derivado de bacterias y un segmento de cadena derivado de mamíferos, unidos en una sola secuencia que es capaz de formar la triple hélice.

Cada repetición de secuencia de dominio de triple hélice puede incluir repeticiones, fragmentos, variantes, o combinaciones de las secuencias mencionadas anteriormente.

Aunque no se limita a ello, el vector de expresión bacteriano puede ser un vector de choque frío, y la proteína de triple hélice recombinante puede expresarse en el microorganismo (por ejemplo E. coli) a temperaturas por debajo de 37°C, y en ciertos ejemplos, a temperaturas de alrededor de 15 a 23°C. En otro ejemplo, el vector de expresión es un vector pET (Novagen).

En otro ejemplo, se selecciona un vector de expresión de levadura. En la técnica se conocen ejemplos de vectores de expresión de levadura, y pueden seleccionarse, por ejemplo, de pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-SI, pPIC9, pPICZ, pA0815, pBLADE, pBLARG, YepFlag1, pAMH110 o pBLURA.

En otro ejemplo, el vector de expresión es un vector de expresión vegetal. Los ejemplos de vectores de expresión vegetales se conocen en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, el vector de expresión pBI121, pCAmbia2301, pEAQ-HT-DEST, o PVX.

La presente descripción también proporciona una proteína de triple hélice purificada mediante el método como se describe aquí.

La presente descripción también proporciona una proteína de triple hélice purificada obtenida mediante el método como se describe aquí.

En un ejemplo, la proteína de triple hélice es alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 95%, alrededor de 97%, o alrededor de 98% pura.

La proteína de triple hélice que se ha purificado según el método de la presente descripción puede convertirse, cuando sea necesario, en gelatina, que puede ser útil para diversas aplicaciones. Los expertos en la técnica conocerán métodos para convertir la proteína de triple hélice en gelatina, y típicamente implican desnaturalizar la proteína, por ejemplo, mediante un procedimiento de desnaturalización térmica o química. Por consiguiente, la presente descripción también abarca una proteína de triple hélice purificada según la presente descripción que se convierte en gelatina mediante desnaturalización térmica o química.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo del esquema de purificación según una realización de la presente descripción.

La Figura 2 muestra la solubilidad de las proteínas del hospedante después de la extracción ácida y el ajuste del pH y el equilibrio durante 16 h. (A) Bacteriano, E. coli, (B) Levadura, Saccharomyces cerevisiae, (C) Planta, Spinacia olerácea.

La Figura 3 muestra SDS PAGE que ilustra la purificación final de la proteína de triple hélice tras la precipitación ácida y después la digestión con proteasa; S = patrón de proteína; F = extracto de fermentación, y P = producto después de la precipitación a pH 2,0 y la digestión con pepsina, para la construcción de ADN inicial de S. pyogenes V-CL y V-CL-CL, que da productos después de la precipitación y proteólisis de CL y CL-CL.

La Figura 4 muestra esponja de colágeno de S. pyogenes y evaluación celular, que muestra (A) lámina estabilizada (superior) y esponja (inferior), (B) unión celular a las 3 h, y (C) viabilidad celular después de 16 h.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO 1: sitio de escisión de trombina/tripsina

SEQ ID NO: 2: secuencia de ADN de un fragmento de Scl2 de colágeno bacteriano procedente de S. pyogenes SEQ ID NO: 3: secuencia de proteína de un fragmento de Scl2 de colágeno bacteriano procedente S. pyogenes SEQ ID NO 4: secuencia de inserto

SEQ ID NO 5: cebador directo

SEQ ID NO 6: cebador inverso

SEQ ID NO 7: secuencia de ADN que codifica el dímero de colágeno bacteriano de los dominios CL de Scl2 de colágeno de S. pyogenes

SEQ ID NO: 8: secuencia de proteína que codifica el dímero de colágeno bacteriano de los dominios CL de Scl2 de colágeno de S. pyogenes

SEQ ID NO 9: secuencia de unión a heparina

SEQ ID NO 10: cebador directo

SEQ ID NO 11: cebador inverso

SEQ ID NO 12: cebador directo

SEQ ID NO 13: cebador inverso

SEQ ID NO 14: cebador directo

SEQ ID NO 15: cebador inverso

SEQ ID NO 16: secuencia de ADN que codifica Scl2 de colágeno bacteriano de Streptococcus pyogenes que incluye una secuencia funcional sustituida para la unión a heparina

SEQ ID NO 17: secuencia de proteína que codifica Scl2 de colágeno bacteriano de Streptococcus pyogenes que incluye una secuencia funcional sustituida para la unión a heparina

SEQ ID NO 18: secuencia de unión a integrina

SEQ ID NO 19: cebador directo

SEQ ID NO 20: cebador inverso

SEQ ID NO 21: cebador directo

SEQ ID NO 22: cebador inverso

SEQ ID NO 23: secuencia de ADN que codifica Scl2 de colágeno bacteriano de Streptococcus pyogenes que incluye una secuencia funcional sustituida para la unión a integrina

SEQ ID NO 24: secuencia de proteína que codifica Scl2 de colágeno bacteriano de Streptococcus pyogenes que incluye una secuencia funcional sustituida para la unión a integrina

SEQ ID NO 25: secuencia de ADN que codifica Scl2 de colágeno bacteriano de Streptococcus pyogenes que incluye secuencias funcionales sustituidas para la unión tanto a heparina como a integrina

SEQ ID NO 26: secuencia de proteína que codifica Scl2 de colágeno bacteriano de Streptococcus pyogenes que incluye secuencias funcionales sustituidas para la unión tanto a heparina como a integrina

SEQ ID NO 27: secuencia de ADN que codifica colágeno bacteriano de Solibacter usitatus usando un dominio V de Rhodopseudomonas palustris

SEQ ID NO 28: secuencia de proteína que codifica colágeno bacteriano de Solibacter usitatus usando un dominio V de Rhodopseudomonas palustris

SEQ ID NO 29: secuencia de ADN que codifica un colágeno de insecto de mosca sierra Nematus oligospilus, gen A SEQ ID NO 30: secuencia de ADN que codifica un colágeno de insecto de mosca sierra Nematus oligospilus, gen A SEQ ID NO 31: cebador

SEQ ID NO 32: cebador

SEQ ID NO 33: cebador

SEQ ID NO 34: cebador

SEQ ID NO 35: cebador

SEQ ID NO 36: cebador

SEQ ID NO 37: secuencia de ADN que codifica 3 repeticiones de un fragmento de colágeno de tipo III humano SEQ ID NO 38: secuencia de proteína que codifica 3 repeticiones de un fragmento de colágeno de tipo III humano SEQ ID NO 39: secuencia de ADN que codifica el fragmento CB3 de la cadena alfa I de tipo I humano

SEQ ID NO 40: secuencia de proteína que codifica el fragmento CB3 de la cadena alfa I de tipo I humano SEQ ID NO 41: secuencia de ADN que codifica una quimera obtenida a partir de segmentos de cadenas de colágeno humano tipo I y tipo III

SEQ ID NO 42: secuencia de ADN que codifica una quimera de diferentes cadenas de colágeno bacteriano en la que están presentes dos componentes diferentes similares a colágeno de Methylobacterium sp. y S. usitatus SEQ ID NO 44: secuencia de ADN que codifica una quimera de diferentes cadenas de colágeno bacteriano en la que están presentes dos componentes diferentes similares a colágeno de Methylobacterium sp. y S. usitatus Técnicas generales y definiciones

A menos que se defina específicamente de otra manera, se considerará que todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto normal en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, biología recombinante, tecnología de la seda, inmunología, química de proteínas, y bioquímica).

A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo celular, y las técnicas inmunológicas usadas en la presente invención son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican a lo largo de la bibliografía en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), O.M. Glover y B.D, Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente).

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a una sola etapa, composición de materia, grupo de etapas, o grupo de composiciones de materia debe considerarse que abarca uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de esas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupos de composiciones de materia. De este modo, como se usa aquí, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a “un” incluye tanto uno como dos o más; la referencia a “una” incluye tanto una como dos o más; la referencia a “el/la” incluye tanto uno como dos o más, y así sucesivamente.

Cada ejemplo de la presente descripción descrita aquí debe aplicarse mutatis mutandis a todos y cada uno de los demás ejemplos a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los expertos en la técnica apreciarán que la descripción aquí es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la descripción incluye todas esas variaciones y modificaciones. La descripción también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o se indican en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y todas y cada una de las combinaciones o cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.

El alcance de la presente descripción no debe limitarse a los ejemplos específicos descritos aquí, que están destinados únicamente a fines de ejemplificación. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la descripción, como se describe aquí.

El término “y/o”, por ejemplo “X y/o Y”, debe entenderse que significa “X e Y” o “X o Y”, y se debe considerar que proporciona un apoyo explícito para ambos significados o para cualquiera de los dos. Además, una lista de características que incluyen la frase “y/o” entre la penúltima y la última característica significa que una o más características enumeradas pueden estar presentes en cualquier combinación.

A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra “comprende”, o variaciones tales como “comprender” o “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas señalados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

La expresión “contenido dentro de un extracto u homogenado de cultivo de células hospedantes no mamíferas” se entiende que se refiere a un extracto u homogenado de cultivo celular que se preparó a partir de una célula hospedante según la presente descripción que ha sido transfectada o transformada con una construcción que codifica la secuencia de proteína de triple hélice.

El término “planta” incluye plantas enteras, estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces), órganos/estructuras florales, semillas (incluyendo embriones, endospermos, y cubierta de semillas), tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido de suelo, y similares), células, y progenie de las mismas.

Por “térmicamente estable” se entiende el grado en que la proteína de triple hélice (o la parte de triple hélice de una proteína) mantiene su estructura tridimensional a una temperatura determinada. Según el presente método, se permite un grado de tolerancia hasta el grado en el que se desestabiliza la estructura de triple hélice; sin embargo, es preferible que al menos el 70% de la proteína de triple hélice se mantenga en la forma tridimensional de triple hélice.

La expresión “proteína de triple hélice”, como se usa aquí, se entiende que se refiere a una proteína homotrimérica, quimérica o heterotrimérica como se describe aquí, que comprende al menos una región (denominada aquí como “dominio de triple hélice” o “dominio similar a colágeno”, dependiendo del contexto). La expresión “proteína de triple hélice” también incluye “proteínas similares a colágeno (CL)” como se hace referencia aquí. La expresión abarca variantes y fragmento o fragmentos de la proteína de triple hélice y equivalentes funcionales y derivados de la misma que preferiblemente retienen al menos una característica estructural o funcional o una proteína de triple hélice o similar a colágeno, es decir, secuencia (Gly X Y)n. Se entiende que la proteína de triple hélice de la presente descripción es proteolíticamente estable. La proteína de triple hélice también puede incluir una secuencia de proteína no de triple hélice adicional que es proteolíticamente estable, y/o insertos no de triple hélice que son naturalmente o por diseño proteolíticamente estables a la enzima proteasa seleccionada para la eliminación de proteínas del hospedante.

Como se usa aquí, la expresión “similar a colágeno (CL)” se refiere a un polipéptido que comprende tripletes Gly-X-Y, en los que X e Y pueden ser cualquier aminoácido. Una proteína de seda de la descripción también se incluye dentro de la expresión “similar a colágeno”, así como colágenos bacterianos de origen natural. Una proteína de seda similar a colágeno de la presente descripción no tiene hidroxiprolina. En un ejemplo, una proteína de seda similar a colágeno comprende al menos alrededor de 40, más preferiblemente al menos alrededor de 50, tripletes Gly-X-Y. Además, en otro ejemplo, los tripletes Gly-X-Y constituyen al menos alrededor de 40%, más preferiblemente al menos alrededor de 50%, de la secuencia de aminoácidos primaria de las proteínas. En otro ejemplo, un polipéptido de seda similar a colágeno tiene, o es capaz de formar en condiciones adecuadas, una estructura de triple hélice. Además, se entenderá que cualquier inserto o enlazador que esté incluido en la proteína de triple hélice recombinante es resistente a la proteasa.

La expresión “dominio de triple hélice” o “dominio similar a colágeno” se refiere a una proteína que comprende la fórmula peptídica general (Gly X Y)n, en la que Gly es glicina, X e Y representan el mismo o diferentes aminoácidos (cuyas identidades pueden variar de triplete Gly X Y a triplete Gly X Y), en la que n puede estar entre 5 y 600. El dominio de triple hélice consiste en tres cadenas caracterizadas por el motivo repetitivo (Gly X Y)n que se pliegan en una conformación de proteína de triple hélice.

Como se usa aquí, la expresión “dominio de formación de triple hélice” o “dominio de formación similar a colágeno” se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos, que comprende un motivo (Gly-X-Y)n, en el que X e Y son cualquier otro resto de aminoácido, que es capaz de plegarse o asociarse con otras dos cadenas para formar una triple hélice.

El término “homotrimérico” se refiere a una proteína de triple hélice y/o un dominio de triple hélice de la misma que contiene las tres cadenas de la triple hélice que son iguales.

El término “heterotrimérico” se refiere a una proteína de triple hélice y/o un dominio de triple hélice de la misma que contiene al menos dos cadenas diferentes que forman la triple hélice.

El término “cultivo”, como se usa aquí, se refiere a la propagación de una célula hospedante en un medio que conduce a su crecimiento, y a todos los subcultivos consiguientes.

La expresión “extracto de cultivo de células hospedantes”, como se usa aquí, se refiere a cultivos de células hospedantes en los que la proteína de triple hélice se segrega en el medio de cultivo. El extracto de cultivo de células hospedantes puede incluir, por ejemplo, un medio de cultivo celular concentrado en el que se cultivan las células hospedantes transformadas/transfectadas/transducidas con la proteína de triple hélice. Las células hospedantes intactas pueden eliminarse o separarse de la proteína de triple hélice segregada como se describe aquí.

La expresión “homogenado de cultivo de células hospedantes”, como se usa aquí, pretende referirse a cultivos de células hospedantes en los que la proteína de triple hélice se retiene dentro de la célula hospedante y se libera mediante un procedimiento de ruptura o extracción. De este modo, en el presente contexto, por homogenado se entiende que las células se han roto de modo que el homogenado del cultivo de células hospedantes comprende células hospedantes rotas y proteína de triple hélice que se ha liberado de las células rotas.

El término “construcción”, como se usa aquí, se refiere a un casete de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica un dominio de formación de triple hélice. La construcción puede incluir además un dominio V y una etiqueta de histidina. El término también se extiende a los vectores que pueden expresar el ADN presente en el casete de expresión. El ADN está funcionalmente asociado con otras secuencias capaces de afectar su expresión, por ejemplo, secuencias promotoras. En general, los vectores de expresión normalmente usados en tecnologías de ADN recombinante están en forma de “plásmidos”.

El término “fragmento”, como se usa aquí, se refiere a una porción de la secuencia genética nativa de aminoácidos o nucleótidos, y en particular los derivados funcionales de la proteína de triple hélice.

El término “variante”, como se usa aquí, se refiere a una secuencia con supresiones, inserciones o sustituciones de diferentes nucleótidos que dan como resultado un polinucleótido que codifica el mismo polipéptido o un polipéptido funcionalmente equivalente.

El término “purificado” pretende significar una proteína de triple hélice que se vuelve sustancialmente libre de otras proteínas (por ejemplo, proteínas de células hospedantes particulares) o agentes contaminantes, mediante el procedimiento de purificación de proteínas descrito aquí. La proteína puede quedar sustancialmente libre de otras proteínas o agentes contaminantes, por ejemplo, al menos alrededor de 70% o 75% u 80% u 85% o 90% o 95% o 96% o 97% o 98% o 99% libre de otras proteínas o agentes contaminantes.

Descripción detallada de la invención

El método de la presente descripción se puede usar para purificar cualquier proteína de triple hélice producida de forma recombinante a partir de cualquier fuente en células hospedantes no mamíferas.

Secuencias de triple hélice

Las secuencias de proteínas de triple hélice recombinantes útiles en el método de la presente descripción son útiles como biomaterial, un material para la fabricación, cosmético o aditivo alimentario. La secuencia que codifica la proteína de triple hélice está compuesta por uno o más dominios formadores de triple hélice o formadores similares a colágeno (CL) en los que cada dominio CL está opcionalmente separado por una región de inserto resistente a proteasas, no similar a colágeno. La región de inserto puede adaptarse para imitar roturas naturales en la estructura de triple hélice que se encuentran dentro de muchos colágenos humanos, o puede proporcionar una funcionalidad biológica deseada (por ejemplo, unión de células/tejidos (por ejemplo, heparina o integrina), sitio de escisión de proteasa, etc.). La región de inserto puede ocurrir entre dominios CL individuales o dentro de un dominio CL de la secuencia de triple hélice recombinante. Para asegurar el plegamiento adecuado de la región de triple hélice de la proteína recombinante, después de la traducción se inserta preferiblemente un dominio de plegamiento globular en el extremo N o C de la construcción recombinante. Este dominio de plegamiento globular puede eliminarse durante la etapa posterior de digestión con proteasa.

En un ejemplo, las secuencias de triple hélice que son adecuadas para uso en el método de la presente descripción pueden derivar de forma recombinante a partir de proteínas de triple hélice naturales que se encuentran en organismos bacterianos patógenos o no patógenos. Por ejemplo, se ha mostrado que una proteína bacteriana similar a colágeno de Streptococcus pyogenes (Scl1 o Scl2) forma una estructura estable de triple hélice sin necesidad de modificación postraduccional para formar hidroxiprolina. En otro ejemplo, las secuencias del genoma de cepas enterohemorrágicas de E. coli O157:H7 muestran múltiples marcos de lectura abiertos con secuencias similares a colágeno que están ausentes de la cepa común de laboratorio K-12 (Ghosh N et al. (2012) PLoS one e37872).

En Methylobacterium sp4-46, Solibacter usitatus, Streptococcus equi SclC, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Rhodopseudomonas palustris, Legionella pneumophila y Streptococcus pneumoniae A se pueden encontrar fuentes alternativas de proteínas bacterianas similares a colágeno de origen natural que se pueden producir recombinantemente. Por consiguiente, la presente descripción se extiende a las secuencias o fragmentos de las mismas obtenidas de tales fuentes.

En otro ejemplo, la proteína de triple hélice es una proteína recombinante que comprende una secuencia de inserto que separa cada dominio de triple hélice, en la que la secuencia de inserto es una secuencia peptídica no de colágeno, que es proteolíticamente estable, de alrededor de 1 a 50 iminoácidos o aminoácidos. Estas secuencias proporcionan alguna funcionalidad biológica que es útil para el biomaterial, cosmético, aditivo alimentario, u otro producto resultante (por ejemplo, para la fabricación).

La funcionalidad biológica deseada de la proteína de triple hélice puede derivar de secuencias que faciliten la unión de la proteína de triple hélice al tipo de célula dianizada o proporcionen un sitio de escisión natural para la degradación en el cuerpo. Las secuencias de unión pueden incluir la secuencia de unión a integrina de colágeno de tipo I (GERGFPGERGVE) y/o una de las secuencias de unión a heparina de la cola de colágeno de acetilcolina esterasa (GRPGKRGKQGQK). Las secuencias de escisión pueden incluir, pero no se limitan a, una o más secuencias dentro de la familia de dominios de metaloproteinasas de matriz (MMP), por ejemplo, MMP-I, MMP-2, MMP-6, MMP-13 y MMP-1B que escinden los colágenos de tipo I, II y III, y MMP-2 y MMP-9 que escinden los colágenos desnaturalizados. Las secuencias de inserto también pueden incluir secuencias parciales de las secuencias de unión o de escisión mencionadas anteriormente.

La presente descripción también contempla secuencias adicionales que se sabe que logran tal funcionalidad. Dichas secuencias pueden proporcionarse en unidades de repetición de tripéptidos de 4, 5, 6 u 8, siendo posible la escisión óptima, pero sin limitarse a 5 o 6 secuencias tripeptídicas.

El uso de técnicas recombinantes permite la introducción de secuencias de motivos de triple hélice estables específicas que imparten una mayor estabilidad, tales como cambios en los pares de carga, o secuencias que influyen en la temperatura de desnaturalización de las proteínas o pi, lo que a su vez influye en su uso en medicina.

Los dominios funcionales pueden insertarse dentro de un dominio de formación de triple hélice o entre dominios de formación de triple hélice sucesivos. Además, se puede añadir más de un dominio funcional, que podría incluir múltiples repeticiones dentro de un dominio de triple hélice, o en varias repeticiones de dominios de triple hélice en las que podrían incluirse las mismas funciones o diferentes. De manera similar, podrían incluirse múltiples repeticiones funcionales entre repeticiones de dominio de triple hélice, o podrían lograrse combinaciones más complejas usando insertos dentro y entre secuencias. Juntos, todos estos enfoques permiten el diseño y la manipulación de las proteínas de triple hélice expresadas para proporcionar funciones biológicas específicas que podrían proporcionar productos biomédicos mejorados.

En un ejemplo adicional, las proteínas quiméricas de triple hélice también están englobadas en la presente descripción. Por ejemplo, una quimera entre dos o más secuencias bacterianas diferentes, entre dos o más secuencias de animal o entre secuencias de animal y no de animal (por ejemplo, bacteriana) podría diseñarse fácilmente mediante la selección de secuencias específicas derivadas de diversos dominios afines juntos en un vector para dar como resultado la expresión de la proteína quimérica de triple hélice.

Otras proteínas de triple hélice que se contemplan en la presente descripción y que pueden expresarse de forma recombinante incluyen C1q, acetilcolina esterasa, receptor depurador de macrófagos, proteínas tensioactivas pulmonares, proteína de unión a manosa, proteínas de hibernación, mytilus byssus, ectodisplasina A, y gliomedina, o fragmentos de las mismas.

Células hospedantes

Las células hospedantes según la presente descripción son cualquier célula no animal conveniente, incluyendo las células de origen bacteriano, de levadura, y vegetal. Las células hospedantes de la presente invención pueden ser organismos naturales u organismos mutados capaces de expresar proteínas de triple hélice o similares a colágeno. En un ejemplo, el organismo hospedante es un organismo o su progenie que se ha transformado usando técnicas de ADN recombinante con una secuencia de ADN heteróloga que codifica la producción de una proteína de triple hélice.

Expresión de la secuencia de triple hélice

La construcción de expresión para la proteína de triple hélice recombinante puede introducirse en la célula hospedante mediante cualquier método conveniente conocido en la técnica.

Los métodos para expresar la proteína de triple hélice recombinante incluyen métodos de expresión estándar que son generalmente conocidos en la técnica, tales como los descritos en Molecular Cloning (Sambrook y Russell (2001)).

Los sistemas de expresión para la producción de proteínas de triple hélice se describen, por ejemplo, en el documento US 20120116053.

Los métodos de transformación, selección de transformantes positivos y de cultivo en Pichia pastoris se describen, por ejemplo, en las patentes US nos 4.837.148; 4.855.231; 4882.279; 4929.555; 5.122.465; 5.324.639; 5.593.859 y 6.472.171.

Los métodos para producir proteínas de triple hélice se conocen en la técnica, y se describen, por ejemplo, en los documentos US 20120282817, EP1809751 y WO 2012/117406.

Recuperación de la proteína de triple hélice expresada

Tras la expresión, las células cultivadas se pueden cosechas/recoger mediante técnicas conocidas en la técnica. En un ejemplo, las células se cosechan por centrifugación y se resuspenden en un medio adecuado para producir un caldo/disolución de fermentación (es decir, extracto de cultivo celular) u homogenado.

El método exacto de recuperación de la proteína de triple hélice recombinante expresada dependerá de la célula hospedante y de la construcción de expresión. En las células hospedantes microbianas, la proteína de triple hélice quedará atrapada dentro de la pared celular de las células hospedantes, incluso aunque haya sido transportada fuera del citoplasma. En este caso, las células hospedantes se rompen para recuperar la proteína de triple hélice. Alternativamente, las paredes celulares pueden eliminarse o debilitarse para liberar la proteína ubicada en el periplasma. La ruptura se puede lograr por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo tratamiento con ultrasonidos, microfluidización, lisis en una prensa francesa o aparato similar, ruptura mediante agitación/molienda vigorosa con perlas de vidrio, lisis de cepas de levadura mutantes osmóticamente frágiles, o tratamiento o tratamientos enzimáticos. Cuando la proteína de triple hélice se recupera mediante lisis o rotura de la célula hospedante recombinante, la lisis o rotura se lleva a cabo típicamente en un amortiguador de fuerza iónica suficiente para permitir que la proteína de triple hélice permanezca en forma soluble. Dichos métodos de rotura mecánica y enzimática producirán fragmentos subcelulares que pueden eliminarse mediante centrifugación o filtración para obtener un homogenado.

Si la proteína de triple hélice se produce extracelularmente, es decir, como proteína segregada soluble, las células aún deben eliminarse del sobrenadante celular. La clarificación generalmente se logra mediante centrifugación, pero también se puede lograr mediante sedimentación y/o filtración.

Purificación de proteínas de triple hélice

El caldo/disolución (por ejemplo, extracto de cultivo celular) u homogenado que contiene la proteína de triple hélice recombinante soluble se somete entonces, según el método de la presente descripción, a una etapa de precipitación ácida. Esto se logra mediante la adición de una disolución de ácido que ajusta el pH del caldo/disolución u homogenado. La disolución de ácido puede ser cualquier ácido débil o fuerte, o una mezcla de ambos. Son adecuados los ácidos clorhídrico, sulfúrico, acético, fórmico, y láctico. A diferencia de los tratamientos ácidos previos de material de tejido de mamíferos que contiene colágeno natural, que se utilizan para hinchar y solubilizar el colágeno, se ha descubierto que la etapa de acidificación empleada en el método de la presente descripción precipita las proteínas contaminantes de la célula hospedante mientras que aún se mantiene la proteína de triple hélice en disolución. Además, la etapa de acidificación no desnaturaliza la proteína de triple hélice. Por consiguiente, el método representa un procedimiento conveniente para separar eficazmente los contaminantes de la célula hospedante de la proteína soluble de triple hélice.

La disolución de ácido se puede añadir como una disolución concentrada. La acidificación se puede llevar a cabo a una temperatura de 4’C, pero también son posibles temperaturas tan altas como 30°C dependiendo de la construcción. La temperatura más apropiada dependerá de la temperatura del punto de fusión de la proteína de triple hélice que se ha formado a partir de la secuencia nucleotídica escogida. El uso de temperaturas por debajo de la temperatura del punto de fusión (Tm) de la proteína de triple hélice, preferiblemente al menos 10°C o más por debajo de Tm, asegurará que la triple hélice no se desnaturalizará. Por ejemplo, a pH 2,2, Streptococcus pyogenes tiene una construcción de 234 aminoácidos de longitud con el motivo Gly-Xaa-Yaa que tiene una Tm de 25,7°C; Methylobacterium, sp 4-46 con una construcción de 147 aminoácidos de longitud tiene una Tm de 28,3°C; Clostridium pertringens tiene una construcción de 189 aminoácidos de longitud y una Tm de 37,2°C.

El pH de las condiciones ácidas variará dependiendo de qué sistema hospedante se escoja y qué secuencias se usen para generar la proteína similar a colágeno. Si se usa una célula hospedante bacteriana tal como E. coli, se prefiere un pH de entre 2 y 3. Si se usa una célula hospedante de levadura, es preferible un pH de 4 a 6. Si se usa una célula hospedante vegetal, es preferible un pH de 2 a 5.

A la etapa de precipitación ácida le sigue entonces una etapa de digestión para eliminar las proteínas de la célula hospedante que son susceptibles de digestión con proteasas. La proteína de triple hélice permanece resistente a la proteasa. En un ejemplo, la etapa de digestión se lleva a cabo utilizando una proteasa ácida. Los ejemplos adecuados de proteasas ácidas para uso según el método de la presente descripción incluyen pepsina, papaína, enzimas similares a la papaína tales como bromelina, ficina o actinidina, o proteasa ácida de Aspergillus saitol. Dependiendo de la proteasa empleada, puede ser necesario ajustar las condiciones de pH (por ejemplo, para proteasas tal como papaína). El experto en la técnica estará familiarizado con tales estrategias. Si se utilizan proteasas tales como tripsina o quimotripsina, entonces puede ser necesario ajustar el pH a condiciones neutras o incluso básicas.

La proteasa digiere muchas proteínas contaminantes en péptidos que pueden eliminarse mediante diafiltración, ya que tienen un peso molecular mucho menor que la proteína de triple hélice recombinante soluble intacta. A continuación, la proteína de triple hélice recombinante resultante se puede recoger. La recolección mediante diafiltración tiene la ventaja adicional de concentrar la proteína de triple hélice recombinante. Además, bajo ciertas circunstancias, la recolección se puede facilitar precipitando la proteína de triple hélice, provocando así que se salga de la disolución. La recolección por precipitación de la proteína de triple hélice recombinante se puede lograr mediante la adición de un ajuste de la fuerza iónica (por ejemplo, con sulfato de amonio o cloruro de sodio), mediante el ajuste del pH, mediante el ajuste de la temperatura, o mediante la adición de un polímero (por ejemplo, polietilenglicol).

Dependiendo del método de extracción empleado en la etapa (i) de la presente invención, puede ser beneficioso incluir una etapa intermedia de separación/purificación entre la etapa de precipitación ácida y la etapa de digestión con proteasa, proporcionando dicha etapa de purificación la separación física de la proteína de triple hélice de los materiales precipitados de la célula hospedante. Los materiales de la célula hospedante pueden incluir proteínas y/o ADN. Por consiguiente, se puede emplear cualquier procedimiento de separación en bruto para eliminar uno o ambos de estos materiales. Tales procedimientos resultarán familiares para los expertos en la técnica. En un ejemplo, el procedimiento incluye centrifugación, (ultra)filtración, filtración de flujo cruzado, y sedimentación.

Pulido

Si la proteína de triple hélice se requiere para uso médico, es preferible que el producto acidificado y tratado con proteasa se purifique aún más mediante etapas de purificación por pulido para lograr niveles de pureza mayores que 90%. Cualquier purificación por pulido es adecuada según la presente descripción, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de filtración en gel, hidrófoba, de afinidad, o de intercambio iónico. Aunque también se pueden usar etapas de precipitación adicionales, generalmente no lograrán los altos niveles de pureza requeridos.

Estabilización

Si las proteínas de triple hélice purificadas se van a utilizar como materiales biomédicos, deben poder fabricarse en formatos adecuados. Las construcciones de triple hélice se pueden formar en esponjas y láminas. Para ayudar a lograr estos formatos, la proteína de triple hélice purificada puede estabilizarse, como es el caso de los colágenos animales, antes del uso en la aplicación médica para mejorar su estabilidad a largo plazo y resistencia mecánica si así se desea. Es posible una amplia variedad de estrategias de estabilización adecuadas. El glutaraldehído es un reactivo adecuado para la reticulación, y se usa ampliamente para mejorar la estabilidad in vivo de los materiales de colágeno. La irradiación es otra técnica de estabilización física.

Las proteínas de triple hélice purificadas según el método de la presente descripción se pueden usar en diversas aplicaciones y procedimientos que incluyen procedimientos restaurativos, regenerativos y cosméticos, procedimientos vasculares, procedimientos osteogénicos y condrogénicos, reconstrucción de cartílago, sustitutos de injertos óseos, hemostasia, tratamiento y manejo de heridas, refuerzo y soporte de tejidos, incontinencia, etc.

Ejemplos de productos biomédicos que se pueden producir a partir de la agregación de las proteínas recombinantes presentes y sus posibles aplicaciones incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: colágenos recombinantes solubles, tales como para uso en implantes dérmicos, portadores de fármacos, recubrimientos para dispositivos médicos, recubrimientos de implantes (ortopédicos y vasculares), materiales para la formación de formas, viscocirugía, selladores vasculares, cosméticos, materiales esponjosos, tal como para uso en cultivos celulares tridimensionales, ingeniería de tejidos y órganos, agentes hemostáticos, y terapia de heridas (piel artificial y apósitos para heridas); fibras, tales como para uso en suturas quirúrgicas y agentes hemostáticos; materiales similares a gel, tales como para uso en implantes de tejidos, protectores corneales, lentes de contacto, y matrices para cultivo celular; y materiales similares a membranas, tales como para uso en membranas anti-adherencia, sistemas de administración de fármacos, piel artificial, y similares.

EJEMPLOS

Los Ejemplos 1 - 11 a continuación describen diferentes construcciones de triple hélice que pueden purificarse según los métodos descritos aquí.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - ADN de un fragmento de Scl2 de colágeno bacteriano de S. pyogenes

La secuencia de ADN para el fragmento del alelo scl2.28 (Q8RLX7) que codifica las porciones globulares y similares a colágeno combinadas de la proteína Scl2.28, pero que carece del dominio de unión C-terminal, se obtuvo a partir de los datos proporcionados en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (National institutes of Hearth, Bethesda, MD 20894, USA) como registro GenBank: AY069936.1.). A esta secuencia se le introdujo una etiqueta His6 en el N-terminal de la secuencia, y se insertó una secuencia de escisión de trombina/tripsina LVPRGSP (SEQ ID NO: 1) entre el dominio globular N-terminal (V) y la siguiente secuencia del dominio similar a colágeno (CL) (Gly-Xaa-Yaa)n. Se incluyó una secuencia triplete GKY en el C terminal del dominio CL, seguido de un codón de parada, con sitios de clonación NdeI y BamHI. El ADN para este diseño se sintetizó comercialmente sin ninguna optimización de codones. SEQ ID NO: 2 es la construcción final.

Secuencia de ADN y proteica: (SEQ ID NO: 2 y 3)

fiTCTACAACGTGAAAGWiGCfiAÍCAAGSftC CAí'.CACCTCTCGCIGGtí'AAGCCC-STOAA'jCTGGWjCCXAACGCGAAACCGCCCCCGCTGGTCCACAG'IG

401 ------------- -------------- *................ * --------------►............— ■»•---•...... ------------------- *-------------- -------------- 4--------------4 500

CAGATGTICCACTTTCTCCCCTT6rTCCTC5TTCTCC»GACCBAC0ATTTC0KCCArTTCSACr:TCGl3TTTCCSCTTTGGCCGGGGCGACCfiGGTSTCCC

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Ejemplo 2: ADN para dímero de colágeno bacteriano de dominios CL de Scl2 de colágeno de S. pyogenes.

La secuencia de ADN para el fragmento del alelo scl2.28 de S. pyogenes que comprende las porciones globulares y similares a colágeno, pero que carece del dominio de unión C-terminal, fue como se describe en el Ejemplo 1. También se incluyó una secuencia de etiqueta His6 N-terminal adicional, una secuencia de escisión de trombina/tripsina LVPRGSp (SEQ ID NO: 1) entre el dominio globular N-terminal (V) y la siguiente secuencia de dominio similar a colágeno (CL) (Gly-Xaa-Yaa)n, se incluyó una secuencia triplete GKY en el C terminal del dominio CL, seguido de un codón de parada. Se añadió una segunda construcción que contenía un inserto, GAAGVM (SEQ ID NO: 4), en el gen Scl2 usando mutagénesis dirigida al sitio antes del inicio del dominio CL, usando los siguientes oligonucleótidos: 5’ ACGCGGTAGTCCCGGGGCAGCGGGTGTTATGGGGCCCAGAGG 3’ Directo e (SEQ ID NO: 5)

y

3’CCTCTGGGCCCCATAACACCCGCTGCCCCGGGACTACCGCGT 5’ Inverso (SEQ ID NO: 6)

Esta segunda construcción, que contiene el inserto GAAGVM, se digirió entonces con 5’ SmaI (Romo) y 3’ SspI (Romo). Este inserto digerido se subclonó entonces de nuevo en el gen Scl2 original en el sitio SmaI al final de la construcción original (Ejemplo 1). La construcción de secuencia final se muestra en SEQ ID NO: 7. Dado que el inserto se clonó como un fragmento romo, se escogieron colonias, se hicieron crecer en 1 xYT, y se llevaron a cabo midi preps para seleccionar clones que incluyen la secuencia adicional y con esta segunda secuencia en la orientación correcta. Secuencia de ADN y proteica: (SEQ ID NO: 7 y 8).

Ejemplo 3: ADN de Scl2 de colágeno bacteriano de S. pyogenes que incluye una secuencia funcional sustituida para la unión a heparina

El gen Scl2, como se da en el Ejemplo 1, se clonó en el vector lanzadera pSL1180 usando los sitios de restricción 5’ Nde\ y 3’ BamHI. Este clon se usó entonces para llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio para introducir un nuevo motivo de unión dentro de la secuencia. Se añadió una secuencia de unión a heparina (GRPGKRGKQGQK; SEQ ID NO: 9) al gen Scl2 en el par de bases 561 usando 3 reacciones secuenciales de PCR de mutagénesis dirigida al sitio, ya que el inserto de heparina tenía 12 aminoácidos y la secuencia alrededor del sitio de inserción era muy repetitiva. Para la primera reacción, se utilizaron los siguientes oligonucleótidos:

5’ TGAAGCTGGTGCTCAAGGCAGGCCGGGTCCAATGGGTCCTGCTG 3’ Directo (SEQ ID NO: 10)

y

3’ CAGCAGGACCCATTGGACCGGCCTGCCTTGAGCACCAGCTTCA 5’ Inverso (SEQ ID NO: 11)

Para la segunda reacción, se utilizaron los siguientes oligonucleótidos:

5’ CAAGGCAGGCCGGGTAAGCGGGGTCCTGCTGGTGAGCG 3’ Directo (SEQ ID NO: 12)

y

3’ CGCTCACCAGCAGGACCCGGCTTACCCGGCCTGCCTTG 5’ Inverso (SEQ ID NO: 13)

Para la tercera reacción, se utilizaron los siguientes oligonucleótidos:

5’ CCGGGTAAGCGGGGTAAACAGGGCCAGAAGGGTGAAAAAGGAGAACCTGG 3’ (SEQ ID NO: 14)

y

3’ CCAGGTTCTCCTTTTTCACCCTTCTGGCCCTGTTTACCCCGCTTACCCGG 5’ (SEQ ID NO: 15)

El producto de PCR se trató con la enzima DpnI, para asegurar que todo el ADN parental se digirió, y posteriormente se transformó en la cepa hospedante de E. co liXLI-BLUE. La construcción de secuencia final se describe en SEQ ID NO: 16. Se escogieron colonias, se hicieron crecer en medio selectivo de antibióticos, y se llevaron a cabo mini preps de Qiagen. Los clones que contenían el sitio de heparina introducido se identificaron y almacenaron a -20°C.

Secuencia de ADN y proteica: (SEQ NO: 16 y 17).

Ejemplo 4: ADN de Scl2 de colágeno bacteriano de S. pyogenes que incluye una secuencia funcional sustituida para la unión a integrina

El gen Scl2, como se da en el Ejemplo 1, se clonó en el vector lanzadera pSL1180 usando los sitios de restricción 5’ NdeI y 3’ BamHI. Este clon se usó entonces para llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio para introducir un nuevo motivo de unión dentro de la secuencia. Se añadió una secuencia de unión a integrina (GERGFPGERGVE; SEQ ID NO: 18) al gen Scl2 en el par de bases 705 mediante integración dirigida por PCR, utilizando dos etapas secuenciales. Los oligonucleótidos usados para la etapa 1 fueron:

5’ GGAAAAGATGGTGAACGTGGTTTCCCGGGTOCAGCTGGTAAGGACG 3’ Directo (SEQ ID NO: 19) y

3’ GGTGCTTACCAGCTGGACCCGGGAAACCACGTTCACCATTTTCC 5’ Inverso (SEQ ID NO: 20)

Los oligonucleótidos usados para la etapa 2 fueron:

5’ GAACGTGGTTTCCCGGGTGAGAGGGGCGTCGAGGGCCAAAACGGCCAAGAT 3’ Directo (SEQ ID NO: 21) y

3’ ATCTTGGCCGTTTTGGCCCTCGACGCCCCTCTCACCCGGGAAACCACGTTC 5’ Inverso (SEQ ID NO: 22) El producto de PCR se trató con la enzima DpnI, para asegurar que todo el ADN parental se digirió, y posteriormente se transformó en la cepa hospedante de E. co liXLI-BLUE. La construcción de secuencia final se describe en SEQ ID NO: 23. Se escogieron colonias, se hicieron crecer en medio selectivo de antibióticos, y se llevaron a cabo mini preps de Qiagen. Los clones que contenían el sitio de integrina introducido se identificaron y almacenaron a -20°C.

Secuencia de ADN y proteica: (SEQ ID NO: 23 y 24)

AT<X'AICA<;CATCRC.'CATCACGCTG.VrG?ACAAGfcAGAGAAAKCTAAAC'TTAGAACTGAATfAAÍTCAAG&GTTA<3CTCAGGGACTft5GG6GÍ ATT SAGA

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Ejemplo 5: ADN de Scl2 de colágeno bacteriano de S. pyogenes que incluye secuencias funcionales sustituidas para la unión tanto a heparina como a integrina

Se usó un gen Scl2 que contenía un sitio de unión a heparina introducido, como se describe en el Ejemplo 3. Un clon seleccionado que contenía el sitio de heparina introducido confirmado se sometió a una segunda ronda de mutagénesis dirigida al sitio para introducir un dominio de unión a integrina (GERGFPGERGVE; SEQ ID NO: 18) en el par de bases 705 del gen Scl2, usando oligonucleótidos como se describe en el Ejemplo 4. El producto de PCR se trató con la enzima DpnI, para asegurar que todo el ADN parental se digirió, y posteriormente se transformó en la cepa hospedante de E. coli XLI-BLUE. La construcción de secuencia final se describe en SEQ ID NO: 25. Se escogieron colonias, se hicieron crecer en medio selectivo de antibióticos, y se llevaron a cabo mini preps de Qiagen. Los clones que contenían el sitio de integrina introducido, así como el sitio de unión a heparina se identificaron y almacenaron a -20°C.

Secuencia de ADN y proteica: (SEQ ID NO: 25 y 26)

ATGCATCACCA'ÍCACCArCACGCTGA7GAACAAKAAPACÍMCCtAAAGttAGAACraAAITAAl";CAAGAüTTAGCTCAaGGACTAGGGGGTATTGAlXA TACGTMICaíTAGTGGTAQTGCGACTACTTGTTCTTCTCTTrCGATTTCAArmGACTTAWAAoTTCXCWTCGAGTCCCTGATCCCCCATAACTCT

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TCTACCAGAAGGTCCATTTCTGCCATTCCTGCCGQTTTTGCCAITTCIACCAGAAGGTCCATTrCT'GCCATTCCTGCCAGTTCTACCATTTCXGCCGGAG

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GGTCCATTTCTGCCATTTCTACCGGAGGGiCCATTCCTGCCATiCCTGCCAGTTGGTCCATTTSGCCCATTTATAATT

Ejemplo 6: ADN de colágeno bacteriano de Solibacter usitatus usando un dominio V de Rhodooseudomonas palustris

La secuencia de ADN para el colágeno que contiene repeticiones de triple hélice de Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076 se obtuvo a partir de los datos proporcionados en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (National institutes of Hearth, Bethesda, MD 20894, USA) como registro ABJ82342. La secuencia de Ad N para el dominio V de R. palustris se obtuvo a partir de los datos proporcionados en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (National institutes of Health, Bethesda, MD 20894, USA) como YP_001993064. Las secuencias de proteínas se tradujeron en secuencias de ADN nominales, y se diseñó un gen compuesto que mantuvo el marco de codificación correcto, con una señal de iniciación Met seguida del dominio CL de S. usitatus, después el dominio V de R. palustris, seguido finalmente de un etiqueta His6 C-terminal y un codón de terminación. Los sitios de restricción terminales fuera de la secuencia de codificación se añadieron como NdeI y EcoRI para 5’, y fueron SalI y HindIII para 3’. Esta construcción se sintetizó (GaneArt® Gene Synthesis, Regensburg, Alemania) con una secuencia de ADN que retuvo la secuencia de aminoácidos original mientras se optimizaba para la expresión en un sistema hospedante deseado, E. coli. La construcción de secuencia final se describe en SEQ ID NO: 27.

Secuencia de ADN y proteica: (SEQ ID NO: 27 y 28)

ae=at-eaccatcattaa

,001 --------- *--------- 1017

cq^agtcjgtagtaatt

Ejemplo 7: ADN para un colágeno de insecto procedente del gen A de mosca de sierra, Nematus oligospilus El ADN para una entidad similar a colágeno de triple hélice procedente de la glándula de seda de N. oligospilus se obtuvo a partir de una secuencia dada a conocer para una cadena de tipo A (A279), como se describió anteriormente (documento US 61/615745). Se sintetizó una construcción genética (GeneArt® Gene Synthesis, Regensburg, Alemania), que incluía sitios de restricción NdeI y EcoRI, y con sustituciones de bases conservativas introducidas que retuvieron la secuencia de aminoácidos original mientras se optimizaban para la expresión en un sistema hospedante deseado, E. coli.

La construcción de secuencia final se describe en SEQ No: 29.

Secuencia de ADN y proteica: (SEQ ID NO: 29 y 30)

SF21 (A279) - gen de colágeno tipo A de la mosca de sierra

: AGCTATTTTA 1 TTTGCAATTT ITCCAGAAGC ASH'CCGGTT CiCAACCCCGA GCAAAGGTAG

A V A L ?Pi F A E A V P V A T P S K G

CAAAAGCGC ! AAAGCGGTAA 1 GTGGTGATGG TTCTC-ATGGT GGTGCCGGTG GTGTTGGTGG TGGTCGTA3C

GGTGGTAGCG GTTGGGCAGG TCCGCAAGGT GCGCGTGGTG CAGATGGTAA AATTGGTCCG 3CTGGTCCGC AGGGTCCTTC TGGTCCGGCA GGTCCMCAG

G G 3 C - WA G P Q G P 3 G A O C- K I G P A G P O O P S G P A G P T

STCCGGTOí ! TCOTCGTGGT GATGCAGGTC GTCCGGGTGC AACCGGTGCT ACAGGtCCGO ATGGICCGAA AGGT3AATTT GGTCCTCACG GTCCGAGCGC-

G P V S P R G D A G R P G A T O A I G P D G P K G E F G P Q G P S

TCCACGTGGT GCACCASGTC CACAGGGTCC ' T ACCSGTCC-TG ATGGTCCrAA ASGCGOAGCA GGTCCGGCAG GCGCAGCTGG TCCTGOTGGT

IOTCCGGGTG CACAGGGTGA AACCGGTGAT CGTGSTGATC GCGSTCTSAA AGGTSAl'STl oGÍGCGOAGG GTGGTAMGG TATTCCGGCT CCGGCAGGAC

CTCGTGGTCA GACCGGTCCG AATGGTCTGC CTGGTGCAAA AGGCGAPJ.CC GGTCCGAAAG 5W3C1CAAEG TCCG3CTGGC CCTGCCGGTC CTAAAGGTGa

P R O O T G P M C I , P 0 A K S E T G P K G A O G P A G P A G P K C

AGATGGIGCC ACCGGTGAAA CAGGTCCTCG TGGCCCTCCA CG^ CCARCCG C-TGCAGCAGG TAAAGATATT ATCATTTGGA AAGGTCAGAA ASGTTGGCG7

£ £ G A T S E T G P A C - P A C P A S A A 3 K O i I l W K G C K G W P

«CCCGAGCG AACGTAAAAG CTAIOATCAI CATCACCATC ATTAATAACA ATTOOAGOÍC

Ejemplo 8: ADN para 3 repeticiones de un fragmento de colágeno de tipo III humano

El molde para las reacciones de PCR se basó en el clon de ADNc MGC:39848 (Image 5405119) (ATCC, Manassas, VA), que contiene el gen COL3A1 humano, con cambios de base limitados introducidos que no cambian la secuencia de aminoácidos pero disminuyen la posibilidad de formación de estructuras secundarias.

Los productos de la PCR se separaron por electroforesis, y las bandas cortadas se extrajeron utilizando un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen).

Los oligonucleótidos usados para la generación por PCR de tres fragmentos separados para la clonación fueron:

M G A P G A P G

EcoRI arriba ^{5 '-C C G G /A A IT C GGT GCC ATS GGT GCT CCA GGT GCT CCA GGT - 3 '} {SEQ ID NO:31)

KcoRT

a g p p g p p

XmaI abajo ^{5 '-TC CCC/CCG&G AGC ACC TGG TCG ACC TGG TGG AC--3 '} (SEQ ID NOl32)

Xroal

D A G G K G D A G

XmaI arriba ^{5 '-T C C C C/CCGGG GAT GCC GGT GGT AAG STT GAC GCT G G T -3 '} (SEO ID No:33)

X raal

5 p p g p p s

BamHI abajo ^{5 ' -CGCG/GATCC ACC TGG TGG ACC TGG TGG JUX A -3 '} (SEQ ID No:34)

BamHI

BamHI arriba

p p g p P g P SacII 5’-CTCCCCGCGG TTA AGG TGG CCC TGG TGG ACC TGG A-3’(SEQ ID NO: 36) SacII abajo Parada

Los fragmentos de PCR se sometieron a digestión con enzimas de restricción emparejadas (EcoRI y XmaI, XmaI y BamHI, BamHI y SacII), y los fragmentos se purificaron mediante extracción en geles de agarosa. La producción del segmento de ADN de tres repeticiones se logró junto con la ligación secuencial en el vector YepFlagl (Eastman Kodak/IBI, New Haven, CT). El ADN del vector se preparó usando enzimas apropiadas. Los fragmentos de PCR purificados se ligaron en construcciones de vectores secuenciales, cada una en una relación de 3 moles de inserto a 1 mol de vector. Se utilizaron mezclas de ligación para transformar E. co liutilizando procedimientos estándar. La cepa de Escherichia coli la XL1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) se usó de forma rutinaria para el mantenimiento, propagación y transformación de plásmidos. Si se desea, se puede aislar de este vector ADN separado. La construcción de secuencia final se muestra en SEQ ID NO: 37.

Secuencia de ADN y proteica (SEQ NO: 37 y 38)

Péptido FLAG EcoRI

GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG GAA TTC GGT GCC ATG GGT GCT CCA GGT GCT CCA GGT

D Y K D D D D K E S G A M G & P G A P G

GGT AAG GGT GAC GCT GGT GCT CCA GGT GAA ASA GGT CCA CCA GGT TTG GCT GGT GCT CCA

G K G D A G A P G E R G P P G L A G A P

GGT TTG AGA GGT GGT GCT GGT CCA CCA GGT CCA GAA GGT GGT AAG GGT GCT GCT GGT CCA

G L R G G A G P P G P E G G K G A A G P

CCA GGT CCA CCA GGT GCT CCC GGT GGT AAG GGT GAC GCT GGT GCT CCA GGT GAA AGA GGT

P G Í P G & F G G K G D A G A P G E R G

CCA CCA GGT TTG GCT GGT GCT CCA GGT TTG AGA GGT GGT GCT GGT CCA CCA GGT CCA GAA

F P G L A G A P G L R G G A G P P G P S

GGT GGT AAG GGT GCT GCT GGT CCA CCA GGT CCA CCA GGT GGA TCC GGT GGT AAG GGT GAC

G G K G A A G F F G P P G S S G G K G D

GCT GGT GCT CCA GGT GAA AGA GGT CCA CCA GGT TTG GCT GGT GCT CCA GGT TTG AGA GGT

A G A P G E R G P F G L A G A F G L R G

GGT GCT GGT CCA CCA GGT CCA GAA GGT GGT AAG GGT GCT GCT GGT CCA CCA GGT CCA CCA

G A G P P G P E G G K G A A G P P G P P

GGG CCA CCT TAA CCG CGG TAA G P P parada

Ejemplo 9: ADN para el fragmento CB3 de cadena alfa 1 de tipo I humano.

La secuencia de ADN para el fragmento CB3 de la cadena alfa 1 de colágeno de tipo I humano se obtuvo a partir de los datos proporcionados en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (National institutes of Health, Bethesda, MD 20894, USA) como número de registro GenBank: Z74615.1. La secuencia se modificó añadiendo una etiqueta His6 C-terminal y un codón de terminación, y se añadieron sitios de restricción 5’ NdeI y 3’ EcoRI e HindIII, lo que hace que la construcción sea adecuada para insertarla en el vector pCold IV. La estabilidad de la proteína de triple hélice producida a partir de este ADN significa que todas las manipulaciones deben realizarse a 4°C. La construcción se sintetizó (GeneArt® Gene Synthesis, Regensburg, Alemania) con sustituciones conservativas que retuvieron la secuencia de aminoácidos original mientras se optimizaba para la expresión en un sistema hospedante deseado, E. coli.

La construcción de secuencia final se describe en SEQ ID NO: 39.

Secuencia de ADN y proteica: (SEQ ID NO: 39 y 40)

1 H N G F F G P K G A A G & P G K A G S R G V P G

QhT ATG GGT Ti l CCG G&'f CCG AAA GGT GCA CCC GGI C-M CCG GGT AAA GCC GGT GAA CGT GGT C-TT CCC CGT

25 PPGA V GP A GK OG SA G AS GP P GP A G

101CCCCCTGGIGCAGVfGGTCCGGCAGGCAAAGATGGTGAASCCC-GTOCACAGGGTCCTCOAGGTCCCGCTGGT

49 FAGE R GR QC PA GS P GF Q GL C GP AG

20’CCTGCAGGCGAACGTGGT&AACAKGGTCCGGCTGGCTCTCCGSC-TTFTCAGGGTCTGCCTGGTCCTGCTGC-T

13 P P G E A G K P G S Q G V r - S D Í j G A P G P G G

201 CCG CCA GGT GAA GCA GGC AAA CCG GGT GAA CAA GGC GTT CCG GGT GAT CTG CGT GCA CCG GCT CCC TCA GGT

07 A R G E R G F P R R R G V C C - P P C P A G P R G

401 GCA CGT GGT GAA CGT GGC ITT CCT GGT GAA CCC GC-T GTG CAG 3C-T CCA CCA GGA CCA GCA GGC CCT CGT GCT

121 ANG A PG NB GA K GD A GA PG A PC S QG

GCAAATGGTGCTCCGC-GTAATGATGGTGCAAAAGGTGATGCAGGCGCACCGGGTGCACCTGGTAGCCAGGGT

145 A' PGL QGMKf i HHHH- I QA

GCACCAGGTCXGCAGGGTATGCACCAOCAYCACCATCAIToAATTCAAGCTT

Ejemplo 10: ADN para una quimera hecha de segmentos de cadenas de colágeno humano tipo I y tipo III

En la producción de ADN quimérico, se utilizaron ADNc alfa I de colágeno humano tipo I con número de acceso ATCC 95498 y ADNc alfa I de colágeno humano tipo III, con número de acceso ATCC 95502.

Inicialmente, 10 ng de ADNc que codifica los genes de colágeno I y III se transformaron en 50 ml de la cepa hospedante E. coli, utilizando el método de choque térmico a 42°C. Las colonias resistentes a ampicilina se recuperaron y se cultivaron durante la noche en 150 ml de medio YT.

Se llevaron a cabo digestiones de restricción de los clones parentales, y después se analizaron en electroforesis en gel de agarosa al 1%, y las bandas de colágeno se aislaron y se purificaron. Las preparaciones de inserto purificado y vector se ligaron usando el kit de T4 ADN ligasa (Invitrogen). A continuación, la mezcla de ligación se transformó en células Top10 y se sembró en placas sobre medio selectivo de ampicilina. Se utilizó PCR de colonias para detectar clones que contenían las quimeras manipuladas. Los productos de PCR que contenían clones potencialmente manipulados se analizaron en electroforesis en agarosa al 1%. El inserto del gen de colágeno I de 4,5 kb se subclonó a partir de su vector parental pUC19 utilizando los sitios de restricción XbaI (5’) y SspI (3’), y se clonó en el vector lanzadera bacteriano pBluescript II KS+ (Stratagene) usando sitios XbaI (5’) y SmaI (3’). Esta clonación permitió que el sitio de BamHI interno en el colágeno I, en los pares de bases 2929-2934, actuase como un único sitio en este vector. Se construyeron dos truncamientos de colágeno I (N y C) terminales. El truncamiento N terminal contenía un fragmento de colágeno de 2,7 kb clonado en pBluescript II KS+ en los sitios XbaI (5’) y BamHI (3’), mientras que el truncamiento C terminal, 1,8 kb de tamaño, se subclonó en el vector lanzadera pUC19 usando sitios de restricción BamHI (5’) e HindIII (3’). Para el truncamiento C terminal, se introdujo un sitio de restricción NaeI (mutación silenciosa) usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II (Invitrogen) en los pares de bases 3706-3711 del telopéptido C. Se añadió un sitio HincII (GTCAAC) directamente después del codón de parada de colágeno I para facilitar la clonación de las quimeras de longitud completa en un sistema de vector. Para el truncamiento N terminal, se usó PCR para introducir una secuencia kozak en dirección 5’ del resto de metionina iniciador. Se usó PCR de solapamiento de empalme para intercambiar regiones de la hélice a de colágeno I con las de la hélice a de colágeno III. Un solapamiento abarcó los pares de bases 3288-3711 de la hélice a de Coll I y se intercambió con el de los restos 3283-3708 de la hélice a de Coll III. El oligo de solapamiento de 5’ contenía un sitio BamHI introducido, y el oligo 3’ contenía un sitio NaeI introducido. El producto de PCR se clonó en el vector pTOPO usando el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen). El solapamiento se digirió de pTOPO con BamHI (5’) y NaeI (3’), y se intercambió con el clon C terminal de tipo salvaje (WT) de colágeno I que contiene el sitio NaeI introducido en pUC19. La eliminación del N-propéptido del colágeno I, restos 193-609, se realizó mediante mutagénesis por supresión en la construcción truncada N terminal. A continuación, el gen se clonó en el subfragmento C terminal de colágeno para crear el gen de longitud completa que carece del N-propéptido. La secuencia final está representada por SEQ NO: 41.

Secuencia de ADN: SEQ ID NO: 41

GCGGCCGB.CC ATGTTCAGCT TTGTGGACCT CCGGCTCCTG CTCCTCTTAG CGGCCACCGC CCTCCIGACG CACGGCCAGC TGTCIIATGG CTAXSATGAG

AAATCAACCÜ QIGGAAXTTC CGTGCCTGGC CCCATGCGTC CCTCTGGTCC ICGTGGTCTC CCT&3CCCCC CTGGTGCACC TGGTCCCCAA GGCTTCCAAG

GTCCCCCrGG TGAGCCXGGC GAGCCtGGAG CTICAGGTCC CATGGC-TOCC CGAGGTCCCC CAGGTCCCCC TGGAAAGAAT GGAGATOATG GGGAAGCTGG

AAAACCTGGT CGXCCTGGTG AGCKIGGGCC TCCIGGGCCT CAGGGT3CTC GAGGATTGCC CGGAACAGCT GGCCTCCCTG GAAXC-AAGGG ACACAGAGGT

TTCAGTGGTT TGGATGGTGC CAAGGGAGAT GCTGGTCCTG CTGGTCCTAA GGGTGAGCCT GGCB.3CCCIG GTGAAAATGG AGCTCCTGGT CAGATGGGCC

CTAGGGGCCT GCCTGGTGAG AGAGGTCGCC CTGGAGCCCC TGGCCCrGCT 3GTGC7CGTG GAAATGATGG TGCTACTGGT GCTGCCGGGC CCCCTGGTCC

CACCGGCCCC GCTGGTCCTC CTGGCTTCCC TG3TGCTGTT C-37GCIAAGG GTGAAGCTGG TCCCCAAGGG CCCCGAGGCT CTGAAGGTCC CCAGGCTGTG

CGTGGTGAGC CTGGCCCCCC TGGCCCTGCT GGIGCTGCTQ GCCCTGCTGG AAACCCTGGT GCTGATGGAC AGCCTGGTGC 7AAAGGTGCC AATGG7GCTC

CTGGTAITGC TGGTGCTCCT GGCTTCCCTG GTGCCCGAGG CCCCTCTGGA CCCCAGGGCC CCGSCGGCCC TCCTGGTCCC AAGGC-TAACA GCGGTGAACC

TGGXGC'ÍCCT GGCAGCAAAG GAGACACTGG TGC7AAGGGA C-AGCCT3GCC CTGT7GGTGT TCAAoGACCC CCtGGCCCTG CXGGAGAGGA AGGAAAGCGA

GGAGCTCGAG GTGAACCCGG ACCCAGTGC5C CTC-CCCGGAC CCCCTGGCGA 3CGTGGTGGA CCTGSTAGCC GTGGTTTCCC TGGCGCAGAT nGTSTTGCTS

GTCCCAAGGG ICCCGCTGGT GAACGTGGT? CTCCTGGOCC tC-CTGC-CCCC AAAGGATCTC CTGGIGAAGC TGGTCGTCCC GGTGAAGCTG GTCT3CCTG3

TGCCAAGGGT CIGACTGGAA SCCCTGGCAS CCGTGGTCC7 GATGGCAAAA CIGGCCCCCC TGGtCCCGCC GGTCAAGATG GICGCCCCGG ACCCCCAGGC

CCACCTGGTG CCCGTGGICA GGC7GGTGTG ATG5GATTCC CTGGACCTAA AGGTGCTGCT 3GAGAGCCCG GCAAGGCTGG AGAGCC-AGG7 GTTCCCGGBC

GCCCXGGGGC IGICGGICCT GCTGGCAAAG ATGSAGAGGC TC-GAGC7CAG GGACCCCGIG GCCCIGCCGÜ TCCCGCTGGO GAGAGAGGTG AACAAGGCCC

TGCIGGCXCC CCCGGAITCC AGGGTCTCCC XGGICCTCCT GoTCCTCCAG C-TGAA3CAGG CAAACCTGGt GAACAGGGTG TTCCT3GAGA CCTTGGCGCC

CCXGGCCCCT CXGGAGCAAG AGGCGAGAGA GGTrTCCCTCS GCC-AGCGTGG TSTGCAAGGT CCCCCIGGTC CTGCTGSTCC CCGAGC-GGCC AACGC-TGCTC

CCGBCAACGA TGGTGCTAAG GGTGATGGTG GTGCCCCTCG AGCTCCC3G7 AGCCA&OiGCG CCCCIüGCCI TCAGQGAATG CCTGGT5AAC GTGGTGCAGO

TGSXCTTCCA GGGCCTAAGG GTGACAGAGG TGAXGCTGGT CCCMASGTG CTGATGGCTC TCCXGGCAAA GAT6GCGICC GTGGTCTGAC TGGCCCCATX

«¡TCCTCCTG GCCCTGCTGG TGCCCCTGKX GACAAGGGTC AAACTGGTCC CAGCGSCCCT 3CT&G7CCCA (JT6BAGCXCG TGGTCCCCCC GGAGACCGTS

UTC-AGCCTGG TCCCCCCÜtíC CCTGCrGGCT TT5CTGGCCC rCCTGGTSCT GHCGGCCAAC C1SGIGCTBA AGGCGAACCT G3TGATGCTG GTGCTAAAGG

CGATGCTGGT CCCCCTGGCC CTGCCGSACC CG07GGACCC CCTCGCCCCA TTGCTAATGT TGGTGCTCCT GGAGCCAAAG GTGCTCGCGG CRGCSCTGSX

CCCCCTGGTG CXACTGGTTT CCCIGGTGCT GCTuGCC&AG TCGCTOCTCC T3GCCCCTCT SGAAAtGCCG UACCCCCTGG CCCTCCXGGI CCTGCTGGCA

AAGAACGCGG CAAAGGTCCC COl'GGTGAOA CT3GCCC7GC T3GACGTCXT CSTGAAGTTG GTCCCCCTGG TCCCCCTGGC CCTGCTGGCS AGAAAtjGA'XC

CCCTGfcTGCr GATGGTCCtG Cl'ÜGXGCTCC tGSXACXCCC C-SGCCTCAAS C-TATTRCTGG ACAGCCTCKT GTGGTCGGCC TGCCTC-GTCA, GAGAGGAliAG

ASASGCtTCC "TCCTCTICC XGGCCCCTCt GGIGAACC'CG BCftAACAAGO TCCCTCTGOA SCAAGTGGTG AACGTGGXCC CCCTGGXCCC ATGGGCCCCC

CTGGATTGGC XGGACCCCCT GGTGAATCXG GACGTGAGOtf «¿CÍCCSGGT 3CC3AAGGTT CCCCTGGACG AGACGGTTCT CCTGGCGCCA AGCC.7CACCG

TGSTGí.GACC GGCCCCGCTG GACCCCCTG3 TGCTCCTC-3T GCXCCTGGTÜ CCCCTUGTCC XGTCGGICCñ GCTGGAAAGA GTGGTC-ACAC- ACGAOAAAC-X

GGCCCtGCYtí oCCCTGCTGG TGCTCCCGGT GCTGCTC.STT CCCGAGGTGC XCTfflJICCTC AAGGCCCACG TGGIGACAAA G5TOBAACAG CTTCBACCTCS

AGCXGCXÜGC ATCAAA5GAC AtCñAGGAXX CCCXC-GTABT ÍCaSGTgCCC CAGGTXCTcC AWJCCCXGC'X üGTCACCAGG GIGCAAXCGG CAGTCCAGfiA

CCTGCABGCC CCAGAGGACC TGTTGGACGC AGtCGACCTC CTGGCAAAGA T3GAACCAGT 3GACAICCAG GTCCCATXGG ACCACCAGGC OCTCGAKCTA

ACAGAGGVGA AAGAGGATCT GAGGGCTCCC CACGCCACCC í.C-GGCAACCA 3«0::CCTG GCTCGC'fGTA CCTCCTGGTG CCCCTGGTCC TTGCTCTGCC

GQCTTCGACT TCAGCTTCCT GCCCCAGCCA CCTCAAGAGA AGGCTCACGA XGGTGGCCGC T'ACTACCGGG CTGATGATGC CM7GTCGTT CGTGACCGTG

ACCTCGAGGT GGACACCACC CTCAAGAGCC TGAGCCAGCA GATCGAGAAC STCCGSAGCC CACAGC-GCAG CCGCAAGAAC CCCGCCCGCA CCTGCCGTGA

CCTCAAGATS TGCCACTCTG ACTC-5AACAG VÜQAGAC-TAC TSGATTC-ACC CCAACCAAfiG CTC-CABCCTG GATGCCATCA AAÜTCTVCTtí CAACAT5CA5

ACXGGXGAOa CCTGCGTGT?. CCCCACTCAG CCCAGTGTGG CCCABAASAA CTGGTftCATC AGCAAGAACC CCAAGGACAA GAGGCAZGTC TGGTXCGCCK

ASAGCATGAC CGATGGATTC CAG'i ICGAGT ATBGCGGCCA GC-GCTCCGAC CCXGCC3ATG XGGCCAICCA GCTGACCITC CTGCGCCTGA TKCCACCGAG

OCCTCCCAGA ACAXCACCTA CCACTGCAAS AACAGCRTSR CCTACATGGA CCAGCAGACT GGCAACCTCA AGAAGGCCCI GCTCCTCCAC GCCTCCAACC-

3601 AGATCGAGAT CCGCGCCGAG GGCAACAGCC GCTTCACCTA CAGCGTCACT GtCGATGGCT ilCACGAGTCX* CACCCGACCC IGGCGCRAGA CAGIGATTGA

S0C1 ATACAAAACC ACCAAGACCT CCCGCcíGcC CAÍCAltGAT GIGCCCCCCT XGSACGTTG3 TGCCCCAGAC CACGAATTCO GCTTCGACGI TGC-CCCTGXC

40C1 TGCIICCTGT AAGTCGAC

Ejemplo 11: ADN para una quimera de diferentes cadenas de colágeno bacteriano en la que están presentes dos componentes diferentes similares a colágeno procedentes de Methylobacterium sp. y S. usitatus

La secuencia de ADN para los colágenos que contienen repeticiones de triple hélice de Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076 y Methylobacterium sp. se obtuvieron de los datos proporcionados en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (National institutes of Health, Bethesda, MD 20894, USA) como registro ABJ82342 para S. usitatus y registro ACA18713.1 para Methylobacterium.

Las secuencias de proteínas se tradujeron a una secuencia de ADN nominal, y se diseñó un gen compuesto que mantuvo el marco de codificación correcto, con una señal de iniciación Met seguida de los dominios V y CL de Methylobacterium, seguido del dominio CL de S. usitatus, seguido finalmente de un codón de terminación. Los sitios de restricción terminales fuera de la secuencia de codificación se añadieron como NdeI y EcoRI para 5’, y fueron Sail e HindIII para 3’. Después, esta construcción se optimizó para la expresión en el sistema hospedante, y se sintetizó (GeneArt® Gene Synthesis, Regensburg, Alemania) con una secuencia de ADN que retuvo la secuencia de aminoácidos original mientras se optimizaba para la expresión en un sistema hospedante deseado, E. coli.

La secuencia final se describe en SEQ ID NO: 42.

Secuencia de ADN: SEQ ID NO 42 y 43

Los Ejemplos 12 a 17 describen diferentes sistemas de células hospedantes de expresión para varias construcciones diferentes.

Ejemplo 12: Expresión de una construcción de ADN para una proteína de triple hélice.

Cualquiera de las construcciones de ADN mencionadas anteriormente de, por ejemplo, SEQ ID NOS: 2, 6, 14, 20, 21 se puede clonar en E. coli, y se puede hacer que exprese proteínas de triple hélice según el siguiente método.

La secuencia de ADN se subclonó en el sistema de vector de expresión de E. co lipColdIII usando los sitios únicos 5’ NdeI y 3’ BamHI. A continuación, la técnica de cribado de colonias por PCR se utilizó entonces para detectar clones positivos. Estos clones se cultivaron en volúmenes de cultivo de 100 ml, y se llevaron a cabo midi preps de Qiagen para expandir la cantidad de vector. Para la expresión, un clon positivo seleccionado se transformó en el hospedante de E. coli BL21-DE3. Las células se cultivaron en 2 x Medios YT (o también se podrían usar en algunas circunstancias medios definidos, tales como con SEQ ID NO 2) que contenían 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, y 5 g de NaCl por litro. El medio definido (DM) usado contenía, por litro: KH2PO4, 10,6 g; (NH4)2HPO4, 4 g; ácido cítrico, 1,7 g; glucosa, 25 g; MgSO4.7H2O, 1,23 g; ampicilina (50 mg/ml), 200 mg; hidrocloruro de tiamina, 4,4 mg; y disolución de sales en trazas 5 ml. La disolución de sales en trazas contenía por litro: CuSO4.5H2O, 2,0 g; Nal, 0,08 g; MnSO4.H2O, 3,0 g; Na2MoO4.2H2O, 0,2 g; ácido bórico, 0,02 g; CoCl2.6H2O, 0,5 g; ZnCl2, 7 g; FeSO4.7H2O, 22 g; CaSO4.2H2O, 05 g; y H2SO4, 1 ml. Según se requirió, se añadieron asépticamente glucosa, magnesio, sales en trazas, tiamina y ampicilina como disoluciones madre concentradas a los medio después de la esterilización.

Las células se hicieron crecer a 37°C durante 24 horas, y la densidad óptica del cultivo celular a A600 alcanzó alrededor de 3-6. Después, el cultivo se incubó a 25°C, y se añadió isopropil beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM para inducir la expresión de proteínas. Después de 10 horas de incubación a 25°C, la temperatura se redujo a 15°C durante otras 14 horas de incubación. Después de 24 h de incubación, las células se recolectaron por centrifugación.

Para la construcción de SEQ ID NO: 31 del fragmento CB3, después de la expresión, las células se mantuvieron durante 14 h a 4°C, con todo el procesamiento posterior también a 4°C, en lugar de 15°C.

Ejemplo 13: Expresión de una construcción de ADN para una proteína de triple hélice, un fragmento de colágeno bacteriano de S. usitatus, con un dominio V de R. palustris usando un vector pET en E. coli.

El ADN se tomó como se describe en el Ejemplo 6. El gen compuesto se clonó en el vector pET21 a usando los sitios 5’ EcoRI y 3’ Hindlll. La secuenciación del clon se llevó a cabo antes de transformarlo en la línea celular hospedante de E. coli competente BL21 DE3. Las células transformadas se sembraron en placas de YT más ampicilina, y se cultivaron durante la noche a 37°C. Se recogió una única colonia de esta placa y se cultivó durante la noche en medio YT más ampicilina a 37°C.

Los colágenos bacterianos recombinantes se produjeron en biorreactores de tanque agitado de 2 l conectados a un sistema de control Biostat B (Sartorius Stedim Alemania). El volumen inicial de medio en el fermentador fue 1,6 l, y se usó glucosa como fuente de carbono. Se añadió al biorreactor un volumen del cultivo de siembra secundario para alcanzar una densidad óptica inicial (medida a 600 nm) de 0,25. La formación de espuma se controló mediante la adición automática de polipropilenglicol 2025 al 10% (v/v); se añadieron 3 ml de la disolución antiespumante antes de la inoculación. El punto de ajuste de pH fue 7,0, controlado por la adición automática de disoluciones de H³PO⁴al 10% (v/v) o de NH³al 10% (v/v). El punto de ajuste de oxígeno disuelto fue 20% de saturación, y se utilizó un control en cascada de dos etapas para mantener el oxígeno disuelto por encima del punto de ajuste especificado. La velocidad del agitador osciló de 500 rpm a 1200 rpm, y el flujo de aire (suplementado con 5% de O²puro) osciló de 0,3 l/min a 1,5 l/min. Para procedimientos de alimentación por lotes de alta densidad celular, la disolución de alimentación estaba compuesta por 400 ml de disolución de glucosa 660 g/l, a los que se añadieron 40 ml de MgSO47H2O 1 M. El caudal de alimentación fue 15 ml/h, y la alimentación se inició 8,5 h después de la inoculación. Los tiempos y temperaturas de incubación para experimentos individuales variaron dependiendo de la construcción, del sistema de la célula hospedante, entre otros. El cultivo se enfrió (durante un período de 20 minutos) hasta la temperatura requerida 24 h después de la inoculación para activar el componente de choque frío del vector y la expresión proteica inducida por la adición de IPTG 1 mM (concentración final en el cultivo). A continuación, las células se recogieron mediante centrifugación.

Ejemplo 14: Expresión de una construcción de ADN para una proteína de triple hélice, un colágeno de seda de mosca de sierra, usando un vector pCold en E. coli.

La introducción de sitios de digestión con enzimas de restricción en el aislado de ADN de mosca de sierra de SEQ ID NO: 23 permitió el aislamiento del ADN de un gen de seda de mosca de sierra y su inserción en un vector de expresión. El gen de seda tipo A similar a colágeno de mosca de sierra se insertó en el vector pColdI a través de los sitios NdeI y EcoRI. Se utilizó la técnica de cribado de colonias por PCR para detectar clones positivos. Estos clones se cultivaron en volúmenes de cultivo de 100 ml, y se llevaron a cabo midi preps de Qiagen para expandir la cantidad de vector. Para la expresión, un clon positivo seleccionado se transformó en células competentes de E. coli BL21. Para la expresión del gen de la proteína de seda de mosca de sierra, se añadió una colonia de células a 100 ml de medio de cultivo iniciador, 2x YT-Amp, y se incubó a 37°C con agitación a 200 rpm durante la noche. A este cultivo se le añadieron entonces 100 ml de 2x YT-2% de glucosa-Amp reciente, y se indujo con IPTG 1 mM a 25°C durante 10 horas, después a 20°C durante otras 16 horas. La pasta celular se recogió mediante centrifugación (3000 x g durante 30 min). La proteína estaba asociada con el pelete celular.

Ejemplo 15: Expresión de una construcción de ADN para una proteína de triple hélice, una repetición de un fragmento de colágeno de tipo III, en Saccharomyces cerevisiae

Se realizaron transformaciones de levadura, usando el ADN/vector (YepFlag1) tal como en el Ejemplo 8, en el que una construcción de ADN que comprende una fusión en el marco de la prosecuencia de señal a del factor a/etiqueta FLAG/tres repeticiones de un fragmento de colágeno III, mediante electroporación en la cepa de levadura S. cerevisiae BJ5462 (a ura3-52 trp1 leu2_1 his3_200 pep4::HIS3 prb_1.6R) (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA). Los transformantes se cultivaron con aireación a 28°C durante 48 h en medio SDahI más Ura. Después de la selección, las porciones se diluyeron en medio YPHSM no selectivo (dextrosa al 1%, extracto de levadura al 1%, peptona al 8%, glicerol al 3%, CaCl2 20 mM), y el crecimiento continuó durante 96 h a 28°C con agitación vigorosa. Los peletes celulares se eliminaron mediante centrifugación a 12.000 x g durante 20 min. La presencia de FLAG ofrece una opción para la identificación de proteínas.

La expresión de construcciones de ADN para cadenas de colágeno humano tipo I y tipo III puede seguir la misma metodología.

Ejemplo 16: Expresión de una construcción de ADN para una proteína de triple hélice, un fragmento de colágeno bacteriano de S. usitatus, con un dominio V de R. palustris, utilizando Pichia pastoris

El gen del colágeno bacteriano se preparó como se describe en el Ejemplo 6. Opcionalmente, el gen podría optimizarse adicionalmente para la expresión en Pichia. La construcción genética se ensambló en E. coli.

La construcción del gen de colágeno se incorporó a un sistema de vector apropiado, pA0815 HIS4, para permitir la integración cromosómica de la construcción genética en la célula hospedante de levadura, P. pastoris. Opcionalmente, se podrían usar otros sistemas vectoriales tales como pA0815-SX HIS4, pPIC9 HIS4, pPICz ZeoR, pPICZa ZeoR, pBLADE-IX ADEI, pBLARG-IX ARG4, pBLARG-SX ARG4 o pBLURA UrA3. El sistema se caracteriza por una expresión metilotrófica en la que están presentes un promotor constitutivo fuerte (GAP) y un promotor inducible fuerte (preferiblemente AOXI - alcohol oxidasa). La adición de metanol, que puede utilizarse como única fuente de carbono, permite una inducción sencilla y completa. Este sistema utiliza la integración cromosómica del gen insertado, eliminando la necesidad de una selección continua (por ejemplo, antibiótico) durante la fermentación. El vector pA0815 que incluye el gen de colágeno se linealizó con BamHI. El plásmido linealizado se transformó en P. pastoris por electroporación. Son adecuadas diversas cepas de Pichia, incluyendo GSI15 his4. Los transformantes se seleccionaron como células His+ para la expresión de la construcción de colágeno. Las células seleccionadas se cultivaron en matraces de agitación en un medio de sal basal con glicerol, pH 5,0. Cuando se alcanzó una densidad celular húmeda apropiada, se añadió metanol, y la fermentación continuó durante otras 72 h.

Ejemplo 17: Expresión de una construcción de ADN para una proteína de triple hélice, un fragmento de colágeno bacteriano de S. usitatus , con un dominio V de R. palustris, usando expresión transitoria en Nicotinia sp.

Se usa un gen sintético que codifica el dominio CL de colágeno bacteriano de S. usitatus y el dominio V de R. palustris, como se describe en el Ejemplo 4, excepto que la secuencia se optimiza para la expresión en Nicotinia sp. y se introduce un sitio de restricción para 5’ AgeI y 3’ XhoI. El gen se amplifica por PCR y se clona en pENTR DTOPO.

Después se confirma la integridad de la secuencia. Las construcciones pENTR DTOPO se digieren mediante físpHI y se purifican para eliminar el gen de resistencia a la kanamicina, permitiendo así la selección adecuada con kanamicina después de la recombinación mediante LR clonasa del gen en el vector de destino binario pEAQ-HT-DEST GATEWAY (Sainsbury et al. (2009) Plant Biotechnol J 7(7):682-93). Los plásmidos binarios se transformaron y se mantuvieron en la cepa LBA4404 de A. tumefaciens. Las construcciones se cultivan en medio LB que contiene los antibióticos apropiados, hasta que se alcanza la fase estacionaria. Los cultivos se centrifugan, y los peletes se resuspenden en medio de infiltración que comprende MES 10 mM, MgCl2 10 mM, acetosiringona 20 mM, hasta una OD 600 de 0,5. Los cultivos se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 4 h antes de la infiltración con jeringa (Sainsbury et al. (2009) Plant Biotechnol J 7(7):682-93) en Nicotiana benthamiana que se hizo crecer hasta la etapa de cinco hojas. Las hojas se recogen 5 días después de la infiltración.

Los Ejemplos 18 - 32 describen las etapas de purificación de esta invención como se ilustra en el diagrama de flujo de la Figura 1.

Ejemplo 18: Extracción de proteína de triple hélice de una célula bacteriana, E. coli, usando tratamiento con ultrasonidos

Para la extracción, cada gramo de pasta celular, derivado por ejemplo de los ejemplos anteriores, 12 - 17, se resuspendió en 20 ml de amortiguador de ácido acético/HCl 50 mM pH 2, y las células se rompieron mediante tratamiento con ultrasonidos, usando un instrumento Misonix S4000, con una sonda Enhance Booster #1, a 30 A (escala del instrumento) durante 5 minutos. Opcionalmente, la mezcla de lisado celular se aclaró mediante centrifugación (12.000 x g durante 60 min), y se retuvo el sobrenadante transparente que contenía la proteína de triple hélice.

Ejemplo 19: Extracción de proteína de triple hélice de una célula bacteriana, E. coli, utilizando una prensa francesa.

La pasta celular congelada, derivada, por ejemplo, de los Ejemplos 12-17, se descongeló y se mezcló 1:10 p/p con ácido acético 50 mM pH 2. Esta mezcla se hizo pasar a través de un homogeneizador de prensa francesa Apv20003 veces a una presión de 700 bares, con un período de enfriamiento adicional de 1 h entre ciclos. Después del procesamiento, la pasta se clarificó opcionalmente mediante centrifugación a 12.000 x g durante 60 min, y se retuvo el sobrenadante transparente, que contenía proteína de triple hélice extraída.

Ejemplo 20: Extracción de proteína de triple hélice de una célula de levadura, S. cerevisiae

La pasta celular, obtenida de cualquiera de los sistemas de expresión de levadura, se resuspendió en amortiguador de ruptura (amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 7,4, e Dt A 0,5 mM, PMSF 2 mM, glicerol al 5%, Triton X-100 al 0,1%) en la relación de 1 g de pasta celular por 20 ml de amortiguador, y se añadió un volumen igual de perlas de vidrio (perlas de vidrio Sigma #G8772). Después, la mezcla se sometió a vórtice (1400 rpm) durante 30 segundos, se dejó reposar durante otros 30 segundos. Repita el vórtice 10 veces más. Todo el procedimiento de extracción se mantuvo a 5°C durante todo el procedimiento. Después, la mezcla se centrifugó durante 1 min a 10.000 x g para recoger el extracto soluble.

Ejemplo 21: Extracción de proteína de triple hélice de hojas vegetales, Nicotinia sp.

El material de las hojas, tal como el del Ejemplo 17, preferiblemente congelado a -20°C, se coloca en amortiguador de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, a 1:10 p/p de hoja a amortiguador, y se extrae en un mezclador Waring a máxima velocidad.

Ejemplo 22: Validación de una proteína soluble de triple hélice tras la expresión y secreción o extracción

La presencia de proteína de triple hélice soluble, después de la expresión tal como en los Ejemplos 12-17, y extracción tal como en los Ejemplos 18-21, o una proteína de triple hélice expresada como un producto soluble, tal como en el Ejemplo 16, se estableció mediante centrifugación del material celular seguido de SDS-PAGE. Si hay etiquetas presentes en la construcción usada para la expresión, tal como una etiqueta Hiss, o una etiqueta Flag, entonces se puede usar transferencia Western con un anticuerpo apropiado, tal como anti-poli-histidina monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano picante para la detección de proteína soluble.

Ejemplo 23: Selección de pH para la precipitación de extractos celulares

Las células hospedantes de expresión se extrajeron mecánicamente, tal como en los Ejemplos 18-19, y el extracto se incubó a un pH seleccionado, entre pH 2 y pH 8. Opcionalmente, se eliminó entonces el material de desecho celular. Las muestras del lisado celular extraído se ajustaron entonces a un pH de precipitación, con diversos pH seleccionados, a intervalos de 1 unidad de pH, o preferiblemente a intervalos de 0,5 unidades de pH, y las muestras se mantuvieron a 4°C durante 16 horas. A continuación, el precipitado se eliminó mediante centrifugación, y el contenido proteico del sobrenadante se estimó mediante absorción a 280 nm. La retención de solubilidad de la construcción de triple hélice se confirmó de nuevo como en el Ejemplo 22.

Ejemplo 24: Precipitación de proteínas de hospedante celular de expresión de E. coli, al tiempo que se retiene la proteína de triple hélice soluble.

La proteína extraída de E. coli, que contiene proteína similar a colágeno soluble de S. pyogenes, tal como en el Ejemplo 1, y aclarada después de la extracción por centrifugación, se ajustó a pH 2,2, se dejó a 4°C durante 16 h para permitir la precipitación. A continuación, la muestra se centrifugó durante 30 min y 15.000 x g, y se retuvo el sobrenadante, que contenía la proteína de triple hélice.

Ejemplo 25: Precipitación de proteínas de hospedante celular de expresión de S. cerevisiae al tiempo que se retiene la proteína de triple hélice soluble de un fragmento repetido de colágeno humano tipo III

El sobrenadante clarificado, que contiene proteínas de triple hélice solubles, se ajusta a pH 5,0 usando ácido acético o disolución de NaOH, y se deja a 4°C durante 16 h. El precipitado resultante se elimina por centrifugación, 10.000 x g durante 30 min, y se retiene el sobrenadante.

Ejemplo 26: Precipitación de proteínas de hospedante celular de expresión de Nicotinia sp. al tiempo que se retiene la proteína de triple hélice soluble de S. usitatus.

El sobrenadante clarificado, que contiene proteínas de triple hélice solubles, se ajusta a pH 4,5 con ácido acético o disolución de NaOH, y se deja a 4°C durante 16 h. El precipitado resultante se elimina por centrifugación, 10.000 x g durante 30 min. A continuación, el sobrenadante se ajusta a pH 2,5 con ácido acético y HCl, y se deja otras 20 h. La disolución se clarifica por centrifugación, 10.000 x g durante 30 min, y se retiene el sobrenadante.

Ejemplo 27: Digestión de contaminantes residuales de células hospedantes solubles posteriores a la precipitación

El sobrenadante obtenido después de la eliminación de las proteínas precipitadas con ácido, tal como en los experimentos anteriores, se ajustó según cualquiera de las siguientes condiciones.

• pH 2,5 y pepsina (0,01 mg/ml) durante 16 h a 4°C, y después se terminó opcionalmente ajustando el pH de la digestión a pH 7.

• pH 6,5 y Na EDTA (50 mM) y cisteína (50 mM), papaína (0,01 mg/ml) durante 16 h a 4°C pH 3,0 y proteasa ácida fúngica tipo XIII (0,01 mg/ml), 16 h a 4°C, y después se terminó opcionalmente ajustando el pH del digerido a pH 7. pH 8,0, y se añadieron tanto tripsina como quimotripsina a 0,01 mg/ml, 16 h a 4°C, y después se terminó ajustando opcionalmente el pH del digerido a pH 4.

Los siguientes ejemplos siguen las etapas de purificación de esta invención, y se refieren a la recolección, concentración y posiblemente pulido final y purificación de la proteína.

Ejemplo 28: Aislamiento de un producto de proteína de triple hélice mediante precipitación con sulfato de amonio

Las fracciones que contenían proteína de triple hélice recombinante después de la eliminación de impurezas por precipitación ácida seguida de tratamiento con proteasa, como se discutió en el ejemplo anterior, se combinaron, y el pH de la disolución se ajustó a un pH de 4,0 a 7,0, y la proteína de triple hélice se precipitó mediante la adición de sulfato de amonio sólido. Todas las etapas se realizaron a temperaturas menores que la temperatura de fusión de la triple hélice, preferiblemente a 4°C. La cantidad de sulfato de amonio sólido requerida para la precipitación fue seguida por centrifugación de muestras, examen visual para determinar la precipitación, y análisis por SDS-PAGE. Para colágenos pequeños no de animales, tales como de S. pyogenes, se requiere una saturación del 35% de sulfato de amonio.

Ejemplo 29: Aislamiento de un producto de proteína de triple hélice por precipitación con polímero

Las fracciones que contienen proteína de triple hélice recombinante después de la eliminación de impurezas por precipitación ácida seguida de tratamiento con proteasa, como se discutió en experimentos previos, se combinaron, y el pH de la disolución se ajustó a pH 7,0 ± 1,0, y la proteína de triple hélice se precipitó mediante la adición de polietilenglicol-4000, a partir de una disolución madre acuosa al 40%. Todas las etapas se realizaron a temperaturas menores que la temperatura de fusión de la triple hélice, preferiblemente a 4°C. La cantidad de polietilenglicol requerida para la precipitación fue seguida por centrifugación de muestras, examen visual para determinar la precipitación, y análisis por SDS-PAGE. Para colágenos pequeños no de animales, tales como de S. pyogenes, se requiere un 10% p/v de polietilenglicol-4000.

La pureza de las proteínas obtenidas se ilustra en la Figura 3.

Ejemplo 30: Aislamiento de un producto de proteína de triple hélice mediante ultrafiltración

Las fracciones que contienen proteína de triple hélice recombinante después de la eliminación de impurezas mediante precipitación ácida seguida de tratamiento con proteasa, como se discutió en ejemplos anteriores, se combinaron, y

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la purificación de una proteína de triple hélice expresada de forma recombinante que comprende un motivo de repetición (Gly-X-Y)n, en el que n está entre 5 y 600, y X e Y son independientemente cualquier imino o aminoácido natural o no natural, en el que la proteína está contenida en un extracto u homogenado de cultivo de células hospedantes no mamíferas, comprendiendo el método:

(i) precipitar los materiales de la célula hospedante a partir de la proteína de triple hélice a un pH menor que 7 y a una temperatura que es menor que la temperatura de fusión Tm de la proteína de triple hélice; seguido de (ii) digerir materiales de células hospedantes presentes en el extracto u homogenado de cultivo de células hospedantes precipitado mediante la adición de una proteasa ácida, en el que la proteína de triple hélice es resistente a la digestión con proteasa ácida; y

(iii) recoger la proteína de triple hélice purificada;

en el que la proteína de triple hélice permanece en disolución durante al menos las etapas (i) y (ii).

2. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína de triple hélice permanece en disolución a lo largo de las etapas (i) a (iii).

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que el pH es menor que 6.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula hospedante es una célula hospedante bacteriana, de levadura, o vegetal.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteasa es pepsina, papaína, enzimas similares a papaína, tales como bromelina, ficina, o actinidina, o proteasa de Aspergillus saitoi.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa de precipitación se realiza a una temperatura de al menos 10°C o más por debajo de la Tm de la proteína de triple hélice.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una etapa de separación intermedia, adicional entre la etapa de precipitación y la etapa de digestión, de separar físicamente la proteína de triple hélice de los materiales precipitados de la célula hospedante.

8. El método según la reivindicación 7, en el que la etapa de separación intermedia adicional se selecciona de una o más de centrifugación, filtración, filtración de flujo cruzado, o sedimentación.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteína de triple hélice expresada se produce intracelularmente dentro de la célula hospedante.

10. El método según la reivindicación 5, en el que:

(i) el pH está entre 2 y 4, y la célula hospedante es una célula hospedante bacteriana;

(ii) el pH está entre 4 y 6, y la célula hospedante es una célula hospedante de levadura; o

(iii) el pH está entre 2 y 4,5, y la célula hospedante es una célula hospedante vegetal.

11. El método según cualquier reivindicación anterior, en el que la precipitación de la proteína de triple hélice se logra mediante la adición de sulfato de amonio, mediante el ajuste del pH o el ajuste de la temperatura, y/o mediante el uso de un polímero.

12. El método según la reivindicación 10, en el que el polímero es polietilenglicol.

13. El método según cualquier reivindicación anterior, en el que la proteína de triple hélice recogida se estabiliza mediante la adición de un agente estabilizante.

14. Método según la reivindicación 13, en el que el agente estabilizante es glutaraldehído.

15. El método según cualquier reivindicación anterior, en el que la proteína de triple hélice es colágeno.

16. El método según cualquier reivindicación anterior, en el que la secuencia de proteína de triple hélice deriva de una levadura bacteriana, planta, insecto, o gusano de seda.