JP6594293B2 - 三重らせんタンパク質の精製 - Google Patents
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Description
本明細書で引用したすべての出版物、特許、特許出願、及びその他の参考資料は、出版物、特許、特許出願、又はその他の参考資料のそれぞれが参照により組み入れられると個別具体的に提示されたかのように、参照によりそれらの全体が組み入れられる。
配列表
本出願は、電子式の配列表と共に申請される。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
開示の分野
本発明は、細菌、酵母菌、又は植物の宿主細胞から組換え生産された三重らせん又はコラーゲン様のタンパク質を精製するための方法に関する。
さらに、例えば外因性の生物学的活性ドメイン(すなわち追加のタンパク質機能を提供する)、及びその他の有用な特徴(例えば生物適合性(biocompatability)及び安定性を改善する)を含み得る合成コラーゲン及びコラーゲン断片の製造を可能にし得るという点で、組換えDNA技術の使用が望ましい。
(i)酸性条件下で、かつ三重らせんタンパク質が熱的に安定な状態を保つ温度で、三重らせんタンパク質から宿主細胞物質を沈殿させ、その後に
(ii)沈殿させた宿主細胞培養抽出物又はホモジネート中に存在する宿主細胞物質を、プロテアーゼを添加することにより消化し、ここにおいて、前記三重らせんタンパク質が前記プロテアーゼに対して耐性である、そして、
(iii)精製した三重らせんタンパク質を収集する
工程を含み、さらに所望により、前記沈殿させる工程と前記消化する工程との間に、不溶性宿主細胞物質から前記三重らせんタンパク質を物理的に分離する追加の分離工程を含み、並びに
前記三重らせんタンパク質は、少なくとも工程(i)から(ii)の全体にわたり可溶性の状態を保つ。
1つの例では、宿主細胞物質の消化工程は、酸性プロテアーゼを用いて実施される。
本開示の方法によれば、三重らせんタンパク質は、有利なことに熱的に安定な状態を保つ。当業者であれば、三重らせんタンパク質の熱安定性を維持するのに役立つ、培養抽出物又はホモジネートに添加され得る所定の薬剤又は添加剤を認識しているものと予想される。例えば、NaCl等の不凍剤が添加される場合もあるし、又は安定性を提供するその他の添加剤、例えばポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール(PEG)又はその誘導体、メチルセルロース、アガロース、デキストリン、ヒドロキシエチルスターチ、トリメチルアミンN−酸化物(TMAO)等が添加される場合もある。1つの例では、三重らせんタンパク質の融解温度未満の温度で沈殿工程が実施される場合には、三重らせんタンパク質の熱安定性は維持される。さらなる例では、三重らせんタンパク質の熱安定性は、三重らせんタンパク質のTmよりも少なくとも10℃低い温度、酸性の沈殿条件下で維持される。三重らせんタンパク質の熱安定性を測定する方法は、例えば米国特許第8,280,710号に記載されている。
細胞培養抽出物又はホモジネートを含有する、組換え三重らせんタンパク質に由来する細胞汚染物質及び死細胞片は、本開示の方法に従い、酸性の沈殿工程により除去される。本発明者らは、三重らせんタンパク質が熱的に安定な状態を保つ温度で、溶液のpHを酸性条件に調整することにより、多くの汚染性(すなわち不溶性)物質が沈殿する一方、組換え三重らせんタンパク質は変性せずに、溶液状態に留まることを見出した。したがって、本発明は、この第1の精製工程において、三重らせんタンパク質のpH安定性に利点を有する。
1つの例では、酸性の沈殿工程期間中、温度は組換え三重らせんタンパク質の融解温度(Tm)よりも少なくとも10℃以上低い。
本方法はタンパク質分解作用に対して安定な三重らせんタンパク質の精製を実現するものと認識される。三重らせんタンパク質は、タンパク質分解作用に対して安定な追加の非らせんタンパク質配列、及び/又は宿主タンパク質を除去するために選択された酵素のタンパク質分解作用に対して、自然に又は設計により安定な非三重らせん配列インサートも含み得る。したがって、本開示の方法は、タンパク質分解作用に対して不安定なタンパク質よりも、タンパク質分解作用に対して安定なタンパク質が選択的に精製され、その他の非三重らせんタンパク質よりも三重らせんタンパク質が選択的に精製されるという長所も有する。
三重らせんタンパク質の最終用途に応じて、宿主汚染物質が除去されると、組換え三重らせんタンパク質をさらに濃縮及び/又は精製するために、収集された三重らせんタンパク質についてポリッシング工程が採用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質溶液をポリッシングするのに一般的に用いられる1つのかかる技法である。採用され得るクロマトグラフィープロセスの例として、イオン交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーが挙げられる。中性ポリマーにより組換え三重らせんタンパク質が沈殿した場合には、沈殿物の塩含有量は低く、したがって、さらなるポリッシング精製が必要な場合には、イオン交換クロマトグラフィー用として直接利用可能である。
本開示の方法により精製された組換え三重らせんタンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物は、本明細書で規定するような反復モチーフ(Gly−X−Y)nをコードする配列を含むものである。発現構築物によりコードされる三重らせんタンパク質は、好ましくは哺乳動物の体温(すなわち35から40℃の間)において熱安定的であり、又は精製後、修飾により安定化させることができる。nの値は5から600の間、又は1から350の間であってもよく、また(Gly−X−Y)は、細菌又は動物(哺乳動物)又は昆虫由来の三重らせん形成ドメインを表し、X及びYは、反復ユニットごとに独立して、任意の天然又は非天然のイミノ酸又はアミノ酸である。1つの例では、XもYもヒドロキシプロリンではない。しかしいくつかの例では、三重らせんドメインはヒドロキシプロリンを含み得る。インサート又はリンカーの配列は、2つ以上のCLドメインを含む構築物内の各三重らせん形成ドメイン(本明細書では「コラーゲン様(CL)形成ドメイン」とも呼ぶ)の間に、又は個々のCLドメイン内に位置し得る。インサートは、約1から50個の任意のイミノ酸又はアミノ酸から構成される。好ましくは、インサートは酵素/プロテアーゼの作用を受けにくい。
組換え三重らせん配列は、細菌、酵母菌、植物、昆虫、若しくはカイコに由来するかを問わず、任意の三重らせんタンパク質、又は三重らせん含有タンパク質に由来し得、またヒドロキシル化されても、またヒドロキシル化されなくてもよい。
(i)病原性又は非病原性の細菌性微生物に由来する配列、但し、例えば三重らせん配列がS.ピオゲネス(S. pyogenes)、メチロバクテリウム種4−46、ソリバクター・ユシタトス(Solibacter usitatus)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)SclC、炭疽菌、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Closridium perfringens)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)Aのうちの1つ又は複数に由来するCLドメインであって、その天然の状態又は化学的架橋による安定化後において所望の熱安定性を示すCLドメインを含み得る場合。配列には、米国特許第6,953,839号において同定された三重らせんコラーゲン様配列も含まれる可能性がある;
(ii)コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、アクチノバクテリア(例えばマイコバクテリウム・ギルバム(Mycobacterium gilvum)、結核菌、マイコバクテリウム・バンバアレニイ(Mycobacterium vanbaalenii)、ノカルディオイデス(Nocardioides)種、ルブロバクター・キシラノフィラス(Rubrobacter xylanophilus)、サリニスポラ・アレニコーラ(Salinispora arenicola)、サリニスポラ・トロピカ(Salinispora tropica)、及びストレプトミセス種)、アルファプロテオバクテリア(例えばアナプラスマ種、メチロバクテリウム・ラデイオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)、ニトロバクター・ウィノグラドスキイ(Nitrobacter winogradskyi)、パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)、リゾビウム・レグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス・ウィッティチイ(Sphingomonas wittichii)、及びボルバキア種(Wolbachia species))、バクテロイデス門(例えばバクテロイデス・シータイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron))、ベータプロテオバクテリア(例えばアゾアルカス(Azoarcus)種、ブルクホルデリア・アンビファリア(Burkholderia ambifaria)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、バークホルデリア・フィマタム(Burkholderia phymatum)、バークホルデリア・ベトナミエンシス(Burkholderia vietnamiensis)、デクロロモナス・アロマチカ(Dechloromonas aromatica)、ポーラロモナス・ナフタレニボランス(Polaromonas naphthalenivorans)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、ラルストニア・メタリデュランス(Ralstonia metallidurans)、ラルストニア・ピッケティ(Ralstonia pickettii)、及び ロドフェラックス・フェリレデューセンス(Rhodoferax ferrireducens))、シアノバクテリア(例えばシアノセイス種、シネコシスティス種、トリコデスミウム・エリスラエウム(Trichodesmium erythraeum))、デイノコッカス属(例えばデイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans))、デルタプロテオバクテリア(例えばアナエロミクソバクター・デハロゲナンス(Anaeromyxobacter dehalogenans))、イプシロンプロテオバクテリア(例えばキャンピロバクター・カーブス(Campylobacter curvus))、ファーミキューテス門(例えばバチルス・クラウジイ(Bacillus clausii)、バチルス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、枯草菌、ボツリヌス菌、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス(Clostridium phytofermentans)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、ゲオバシルス・カウストフィルス(Geobacillus kaustophilus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラスラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、リシニバチルス・スフェリカス(Lysinibacillus sphaericus)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、ストレプトコッカス・アガラクティアエ(Streptococcus agalactiae)、及びストレプトコッカス・ニューモニエ)、及びガンマプロテオバクテリア(Gammaproteobacteria)(例えばシトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、エンテロバクター(Enterobacter)種、大腸菌、肺炎桿菌、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)、緑膿菌、シュードモナス・エントモフィラ(Pseudomonas entomophila)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、サイクロバクター・クリオハロレティス(Psychrobacter cryohalolentis)、サッカロファガス・デグラダンス(Saccharophagus degradans)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、シュワネラ・アマゾネンシス(Shewanella amazonensis)、シュワネラ・バルティカ(Shewanella baltica)、シュワネラ・フリギディマリナ(Shewanella frigidimarina)、シュワネラ・ハリファクセンシス(Shewanella halifaxensis)、シュワネラ・ロイヒカ(Shewanella loihica)、シェワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)、シュワネラ・ペアレアナ(Shewanella pealeana)、シェワネラ・プトレファシエンス(Shewanella putrefaciens)、シュワネラ・セディミニス(Shewanella sediminis)、シュワネラ・ウーディイ(Shewanella woodyi)、シゲラ・ボイデイ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾネイ(Shigella sonnei)、及びビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi))より選択される、但しこれらに限定されない微生物から単離された1つ又は複数のDNA配列;
(iii)C1q、アセチルコリンエステラーゼ、マクロファージスカベンジャー受容体、肺サーファクタントタンパク質、マンノース結合タンパク質、冬眠タンパク質、マイティラス・バイサス(Mytilus byssus)、エクトジスプラシンA、又はグリオメジン(gliomedin)をコードするDNA配列;
(iv)ヘミクロア属(Hemichroa)、プリスチフォラ属(Pristiphora)、パキネマルス属(Pachynemalus)、ピコネマ属(Pikonema)、及びネマトス(Nematus)種(Nematinae亜科)、トモステタス(Tomostethus)及びテチダ(Tethida)種(マルハバチ亜科)において膜翅類、ネマチニ(Nematini)に由来するハバチ絹タンパク質をコードする配列;並びに
(v)I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、XVIII型、XIX型、XX型、XXI型、XXII型、XXIII型、XIV型、XXV型、XXVI型、XXVII型、XXVIII型コラーゲンのうちの1つ又は複数を含む、哺乳動物コラーゲンをコードする配列。
さらなる例では、発現する三重らせんタンパク質及び/又はその三重らせんドメインは、2つ又は3つの異なる鎖からなるヘテロ三量体であり、これらは会合して、例えば哺乳動物のI型コラーゲンに見出されるものと同じ三重らせんを形成する。
一方、これに限定するものではないが、細菌発現ベクターはコールドショックベクターであり得、また組換え三重らせんタンパク質は、微生物(例えば大腸菌)内で、37℃未満の温度、及び特定の例では、約15から23℃の温度において発現可能である。さらなる例では、発現ベクターはpETベクターである(Novagen)。
本開示は、本明細書に記載するような方法により取得された、精製された三重らせんタンパク質も提供する。
本開示の方法により精製された三重らせんタンパク質は、必要な場合には、様々な用途に役立ち得るゼラチンに変換可能である。三重らせんタンパク質をゼラチンに変換する方法は当業者にとって公知であり、例えば熱的又は化学的変性プロセスによるタンパク質の変性と一般的に関係する。したがって、本開示は、熱的又は化学的変性によりゼラチンに変換され、本開示に基づき精製される三重らせんタンパク質も含む。
配列番号1:トロンビン/トリプシン切断部位
配列番号2:S.ピオゲネス由来の細菌コラーゲンScl2断片のDNA配列
配列番号3:S.ピオゲネス由来の細菌コラーゲンScl2断片のタンパク質配列
配列番号4:インサート配列
配列番号5:フォワードプライマー
配列番号6:リバースプライマー
配列番号7:S.ピオゲネス由来のコラーゲンScl2から得られるCLドメインの細菌コラーゲン二量体をコードするDNA配列
配列番号8:S.ピオゲネス由来のコラーゲンScl2から得られるCLドメインの細菌コラーゲン二量体をコードするタンパク質配列
配列番号9:ヘパリン結合配列
配列番号10:フォワードプライマー
配列番号11:リバースプライマー
配列番号12:フォワードプライマー
配列番号13:リバースプライマー
配列番号14:フォワードプライマー
配列番号15:リバースプライマー
配列番号16:ヘパリン結合に関する置換後の機能的配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の細菌コラーゲンScl2をコードするDNA配列
配列番号17:ヘパリン結合に関する置換後の機能的配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の細菌コラーゲンScl2をコードするタンパク質配列
配列番号18:インテグリン結合配列
配列番号19:フォワードプライマー
配列番号20:リバースプライマー
配列番号21:フォワードプライマー
配列番号22:リバースプライマー
配列番号23:インテグリン結合に関する置換後の機能的配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の細菌コラーゲンScl2をコードするDNA配列
配列番号24:インテグリン結合に関する置換後の機能的配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の細菌コラーゲンScl2をコードするタンパク質配列
配列番号25:ヘパリン結合及びインテグリン結合の両方に関する置換後の機能的配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の細菌コラーゲンScl2をコードするDNA配列
配列番号26:ヘパリン結合及びインテグリン結合の両方に関する置換後の機能的配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の細菌コラーゲンScl2をコードするタンパク質配列
配列番号27:ロドシュードモナス・パルストリス由来のV−ドメインを用いた、ソリバクター・ユシタトス由来の細菌コラーゲンをコードするDNA配列
配列番号28:ロドシュードモナス・パルストリス由来のV−ドメインを用いた、ソリバクター・ユシタトス由来の細菌コラーゲンをコードするタンパク質配列
配列番号29:ハバチのネマトス・オリゴスピルス(Nematus oligospilus)、遺伝子Aに由来する昆虫コラーゲンをコードするDNA配列
配列番号30:ハバチのネマトス・オリゴスピルス、遺伝子Aに由来する昆虫コラーゲンをコードするDNA配列
配列番号31:プライマー
配列番号32:プライマー
配列番号33:プライマー
配列番号34:プライマー
配列番号35:プライマー
配列番号36:プライマー
配列番号37:ヒトIII型コラーゲン断片について、その3回反復部分をコードするDNA配列
配列番号38:ヒトIII型コラーゲン断片について、その3回反復部分をコードするタンパク質配列
配列番号39:ヒトI型のαI鎖CB3断片をコードするDNA配列
配列番号40:ヒトI型のαI鎖CB3断片をコードするタンパク質配列
配列番号41:ヒトコラーゲンI型及びIII型鎖に由来するセグメントから作成されたキメラをコードするDNA配列
配列番号42:異なる細菌コラーゲン鎖からなるキメラをコードするDNA配列であり、この場合、2つの異なるコラーゲン様成分は、メチロバクテリウム種及びS.ユシタトスに由来して存在する
配列番号44:異なる細菌コラーゲン鎖からなるキメラをコードするDNA配列であり、この場合、2つの異なるコラーゲン様成分は、メチロバクテリウム種及びS.ユシタトスに由来して存在する
一般技法及び定義
別途特別に規定されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、組換え生物学、絹技術、免疫学、タンパク質化学、及び生化学における)により一般的に理解される意味と同じ意味を有すると解されるものとする。
当業者は、本明細書の開示は、具体的に記載されたもの以外の変更及び修正を受け入れる余地があることを認識している。開示には、すべてのかかる変更形態及び修正形態が含まれるものと理解される。開示には、本明細書で参照又は提示されるすべての工程、特性、組成物、及び化合物も、個別に又は全体として、並びに前記工程若しくは特徴のあらゆるすべての組み合わせ、又はそれらのうちの任意の2つ以上も含まれる。
用語「ヘテロ三量体」とは、三重らせんを形成する鎖のうち少なくとも2本が異なる、そのような鎖を含有する三重らせんタンパク質及び/又はその三重らせんドメインを意味する。
本明細書で用いる場合、用語「宿主細胞培養抽出物」とは、三重らせんタンパク質が培養培地内に分泌されるような宿主細胞培養物を意味するように意図されている。宿主細胞培養抽出物は、例えば三重らせんタンパク質で形質転換/トランスフェクト/形質導入された宿主細胞が増殖する濃縮された細胞培養培地を含み得る。未処理の宿主細胞は、本明細書に記載するように、分泌された三重らせんタンパク質から除去又は分離され得る。
本明細書で用いる場合、用語「変異体」とは、配列に欠損、挿入、又は置換があり、異なるヌクレオチドに該当するが、結果的には同一又は機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをもたらすような配列を意味する。
発明の詳細な説明
本開示の方法は、非哺乳動物の宿主細胞内の任意の起源から、任意の組換え生産した三重らせんタンパク質を精製するのに利用可能である。
本開示の方法で有用な組換え三重らせんタンパク質配列は、バイオマテリアル、製造材料、化粧品又は食品添加物として有用である。三重らせんタンパク質をコードする配列は、1つ又は複数の三重らせん形成ドメイン又はコラーゲン様(CL)形成ドメインから構成され、各CLドメインは、任意選択で非コラーゲン様のプロテアーゼ耐性インサート領域により分離される。インサート領域は、多くのヒトコラーゲン内に見出される、三重らせん構造内に自然に生じた中断部を模倣するように、又は所望の生物学的機能(例えば細胞/組織結合部位(例えばヘパリン又はインテグリン)、プロテアーゼ切断部位等)を提供し得るように構成され得る。インサート領域は、個々のCLドメインの間、又は組換え三重らせん配列のCLドメイン内に生ずる可能性がある。組換えタンパク質の三重らせん領域が適切に折り畳まれるよう保証するために、翻訳後に球形の折り畳みドメインが組換え構築物のN−又はC末端に好ましくは挿入される。この球形の折り畳みドメインは、後続するプロテアーゼ消化工程期間中に除去され得る。
本開示に基づく宿主細胞は、細菌、酵母菌、及び植物を起源とする細胞を含む、任意の好都合な非動物細胞である。本発明の宿主細胞は、三重らせん又はコラーゲン様のタンパク質を発現する能力を有する天然の微生物又は突然変異した微生物であり得る。1つの例では、宿主微生物は、組換えDNA技法を用いて形質転換した微生物又はその子孫であり、三重らせんタンパク質が生産するようにコード化する非相同的DNA配列を有する。
組換え三重らせんタンパク質に関する発現構築物は、任意の当技術分野で公知の好都合な方法により、宿主細胞に導入され得る。
ピキア・パストリスにおける形質転換、陽性形質転換体の選別及び培養方法は、例えば米国特許第4,837,148号、同第4,855,231号、同第4882,279号、同第4929,555号、同第5,122,465号、同第5,324,639号、同第5,593,859号、及び同第6,472,171号に開示されている。
発現された三重らせんタンパク質の回収
発現後、培養された細胞は、当技術分野において公知の技法により採集/収集可能である。1つの例では、細胞は遠心分離により採集され、そして適する媒体中で再懸濁されて、発酵培養液/溶液(すなわち細胞培養抽出物)又はホモジネートが得られる。
可溶性の組換え三重らせんタンパク質を含有する培養液/溶液(例えば細胞培養抽出物)又はホモジネートは、次に本開示の方法によって、酸による沈殿工程で処理される。これは、培養液/溶液又はホモジネートのpHを調整する酸性溶液の添加により達成される。酸性溶液は、任意の弱酸又は強酸、又は両方の混合物であり得る。塩酸、硫酸、酢酸、ギ酸、及び乳酸はすべて適する。これまでの天然コラーゲン含有哺乳動物組織材料の酸性処理法は、コラーゲンを膨潤化及び可溶化するのに用いられるが、これとは異なり、本開示の方法で採用される酸性化工程は、三重らせんタンパク質をなおも溶液状態に保ちつつ、汚染性の宿主細胞タンパク質を沈殿させることが判明した。酸性化工程はさらに、三重らせんタンパク質を変性させない。したがって当該方法は、可溶性の三重らせんタンパク質から宿主細胞の汚染物質を効果的に分離するための好都合な方法を代表する。
三重らせんタンパク質が医学的用途で必要とされる場合には、酸性化及びプロテアーゼ処理された生成物は、90%を上回る純度レベルを達成するために、ポリッシング精製工程によりさらに精製されるのが好ましい。あらゆるポリッシング精製が本開示に基づき適しており、これには例えばゲル濾過、疎水性、アフィニティー、又はイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。追加の沈殿工程も利用可能であるが、このような工程は一般的に必要とされる高純度レベルを達成しないと予想される。
精製した三重らせんタンパク質がバイオメディカル材料として用いられる場合には、適する形態への加工が可能でなければならない。三重らせん構築物は、スポンジ及びシートに形成され得る。このような形態の達成に役立つように、精製した三重らせんタンパク質は所望の場合、その長期安定性及び機械強度を改善するために、医学的用途で使用する前に、動物コラーゲンの場合と同様に安定化可能である。いろいろな種類の適する安定化策が可能である。グルタルアルデヒドは架橋に適する試薬であり、またコラーゲン材料のin vivo安定性を改善するのに幅広く用いられる。照射は、別の物理的安定化技法である。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
[態様1]
非哺乳動物の宿主細胞培養抽出物又はホモジネートに含まれる、組換え発現された三重らせんタンパク質を精製するための方法であって、
(i)酸性条件下で、かつ三重らせんタンパク質が熱的に安定な状態を保つ温度で、三重らせんタンパク質から宿主細胞物質を沈殿させ、その後に
(ii)沈殿させた宿主細胞培養抽出物又はホモジネート中に存在する宿主細胞物質を、プロテアーゼを添加することにより消化し、ここにおいて、前記三重らせんタンパク質が前記プロテアーゼに対して耐性である、そして、
(iii)精製した三重らせんタンパク質を収集する
工程を含み、前記三重らせんタンパク質が、少なくとも工程(i)から(ii)の全体にわたり可溶性の状態を保つ、方法。
[態様2]
前記三重らせんタンパク質が、工程(i)から(iii)の全体にわたり可溶性の状態を保つ、態様1に記載の方法。
[態様3]
前記消化が、酸性プロテアーゼを用いて実施される、態様1又は2に記載の方法。
[態様4]
前記宿主細胞が、細菌、酵母菌、又は植物の宿主細胞である、態様1〜3のいずれか一項に記載の方法。
[態様5]
酸性条件は、7未満のpHを意味する、態様1〜4のいずれか一項に記載の方法。
[態様6]
前記沈殿させる工程が、前記三重らせんタンパク質の融解温度より低い温度で実施される、態様1〜5のいずれか一項に記載の方法。
[態様7]
前記沈殿させる工程と前記消化する工程との間に、沈殿させた宿主細胞物質から前記三重らせんタンパク質を物理的に分離する追加の分離工程をさらに含む、態様1〜6のいずれか一項に記載の方法。
[態様8]
中間の前記分離工程が、遠心分離、濾過、クロスフロー濾過、又は沈降のうちの1つ又は複数より選択される、態様7に記載の方法。
[態様9]
前記発現された三重らせんタンパク質が、前記宿主細胞中で細胞内生産される、態様1〜8のいずれか一項に記載の方法。
[態様10]
前記発現された三重らせんタンパク質が、前記宿主細胞から分泌される、態様1〜8のいずれか一項に記載の方法。
[態様11]
前記三重らせんタンパク質を含有する宿主細胞培養抽出物又はホモジネートを生産する追加の工程を含む、態様1〜10のいずれか一項に記載の方法。
[態様12]
前記組換え三重らせんタンパク質の融解温度(Tm)で実施される、態様1〜11のいずれか一項に記載の方法。
[態様13]
前記温度が、前記組換え三重らせんタンパク質のTmよりも少なくとも10℃以上低い、態様12に記載の方法。
[態様14]
前記pHが、2から4の間であり、及び前記宿主細胞が、細菌宿主細胞である、態様5に記載の方法。
[態様15]
前記pHが、4から6の間であり、及び前記宿主細胞が、酵母菌宿主細胞である、態様5に記載の方法。
[態様16]
前記pHが、2から4.5の間であり、及び前記宿主細胞が、植物宿主細胞である、態様5に記載の方法。
[態様17]
前記三重らせんタンパク質が、タンパク質分解作用に対して安定である、態様3〜16のいずれか一項に記載の方法。
[態様18]
タンパク質分解作用に対して不安定なタンパク質よりも、タンパク質分解作用に対して安定なタンパク質が選択的に精製される、態様3〜17のいずれか一項に記載の方法。
[態様19]
収集された前記三重らせんタンパク質から、宿主細胞の核酸が除去される、態様1〜18のいずれか一項に記載の方法。
[態様20]
前記三重らせんタンパク質の沈殿が、硫酸アンモニウムの添加により、pH調整又は温度調整により、及び/又はポリマー(例えばポリエチレングリコール)の使用により達成される、態様1〜19のいずれか一項に記載の方法。
[態様21]
収集された前記三重らせんタンパク質が、安定化剤により安定化される、態様1〜20のいずれか一項に記載の方法。
[態様22]
前記三重らせんタンパク質が、(Gly−X−Y)n反復モチーフを含み、式中nは、5から600の間である、態様1〜21のいずれか一項に記載の方法。
[態様23]
前記三重らせんタンパク質が、コラーゲンである、態様1〜22のいずれか一項に記載の方法。
[態様24]
前記三重らせんタンパク質の配列が、細菌、酵母菌、植物、昆虫、又はカイコに由来する、態様1〜23のいずれか一項に記載の方法。
[態様25]
態様1〜24のいずれか一項に記載の方法により精製された、三重らせんタンパク質。
[態様26]
態様1〜24のいずれか一項に記載の方法により取得された、精製された三重らせんタンパク質。
[態様27]
熱的又は化学的変性によりゼラチンに変換される、態様25又は26に記載の三重らせんタンパク質。
実施例
Scl2.28タンパク質の球形部分とコラーゲン様の部分とが組み合わされた、但しC末端アタッチメントドメインが欠失した部分をコードするscl2.28対立遺伝子(Q8RLX7)の断片に関するDNA配列を、国立生物工学情報センターデータベース(国立衛生研究所、Bethesda、MD 20894、米国)で、記録GenBank:AY069936.1として提供されるデータから得た。この配列に対し、同配列のN末端においてHis6タグを導入し、そしてトロンビン/トリプシン切断配列LVPRGSP(配列番号1)をN末端球形ドメイン(V)配列と後続する(Gly−Xaa−Yaa)nコラーゲン様ドメイン(CL)配列との間に挿入した。NdeI及びBamHIクローニング部位を用いて、トリプレット配列GKYをCLドメインのC末端に含め、これに終止コドンを後続させた。このデザイン用のDNAは、コドンの最適化を一切行わずに商業的に合成した。配列番号2は最終構築物である。
DNA及びタンパク質配列:(配列番号2及び3)
球形部分とコラーゲン様部分を含むが、C末端アタッチメントドメインが欠失したS.ピオゲネスに由来するscl2.28対立遺伝子の断片に関するDNA配列は、実施例1に記載した通りである。この配列には、追加のN末端His6タグ配列、N末端球形ドメイン(V)と後続する(Gly−Xaa−Yaa)nコラーゲン様ドメイン(CL)配列との間にトロンビン/トリプシン切断配列LVPRGSP(配列番号1)も含まれたが、CLドメインのC末端にトリプレット配列GKYが含まれ、終止コドンがこれに続いた。部位特異的突然変異誘発法を用いて、インサートGAAGVM(配列番号4)を含有する第2の構築物を、CLドメイン開始前にScl2遺伝子に付加したが、その際、下記のオリゴヌクレオチドを用いた:
DNA及びタンパク質配列:(配列番号7及び8)
実施例1に提示するScl2遺伝子を、制限部位5’NdeI及び3’BamHIを用いてシャトルベクターpSL1180にクローニングした。このクローンを、次に部位特異的突然変異誘発法を実施して、配列内の新規結合モチーフを導入するために用いた。ヘパリンインサートは12個のアミノ酸であり、また挿入部位周辺の配列は非常に反復性であったので、ヘパリン結合配列(GRPGKRGKQGQK;配列番号9)を、3回の連続した部位特異的突然変異誘発式PCR反応を用いて、第561番目塩基対においてScl2遺伝子に付加した。最初の反応では、下記のオリゴヌクレオチドを用いた:
DNA及びタンパク質配列:(配列番号16及び17)
実施例1に提示するScl2遺伝子を、制限部位5’NdeI及び3’BamHIを用いてシャトルベクターpSL1180にクローニングした。このクローンを、次に部位特異的突然変異誘発を実施して配列内に新たな結合モチーフを導入するために用いた。インテグリン結合配列(GERGFPGERGVE;配列番号18)をPCR特異的組み込みにより、2回の連続したステップを用いて、第705番目の塩基対においてScl2遺伝子に付加した。ステップ1で用いたオリゴヌクレオチドは次の通りであった。
DNA及びタンパク質配列:(配列番号23及び24)
実施例3に記載する、導入されたヘパリン結合部位を含有するScl2遺伝子を用いた。Scl2遺伝子の第705番目の塩基対において、インテグリン結合ドメイン(GERGFPGERGVE;配列番号18)を導入するために、ヘパリン部位が導入されたことが確認され、その部位を含む選択されたクローンについて、実施例4に記載のオリゴヌクレオチドを用いて、第2ラウンドの部位特異的突然変異誘発を実施した。PCR産物を酵素DpnIで処理してすべての親DNAの消化を徹底し、その後、大腸菌宿主株XLI−BLUEに形質転換した。最終的な配列構築物を配列番号25に記載する。コロニーを抗生物質選択培地内で選別、増殖させ、そしてQiagenミニプレップを実施した。導入されたインテグリン部位並びにヘパリン結合部位を含むクローンを同定し、−20℃で保管した。
DNA及びタンパク質配列:(配列番号25及び26)
カンディダトス・ソリバクター・ユシタトスEllin6076に由来する、三重らせん反復部分含有コラーゲンに関するDNA配列を、国立生物工学情報センターデータベース(国立衛生研究所、Bethesda、MD20894、米国)で、記録ABJ82342として提供されるデータから得た。R.パルストリス由来のV−ドメインに関するDNA配列を、国立生物工学情報センターデータベース(国立衛生研究所、Bethesda、MD20894、米国)でYP_001993084として提供されるデータから得た。タンパク質配列を名目DNA配列に翻訳し、そして正しいコーディングフレームワークを維持する複合遺伝子を、Met開始シグナルの後にS.ユシタトス由来のCLドメインが続き、次にR.パルストリス由来のV−ドメインが連なり、最後にC末端His6−タグ及び終止コドンが続くように設計した。コーディング配列の外側の末端制限部位を、5’の場合NdeI及びEcoRIとして、また3’の場合SalI及びHindIIIを付加した。この構築物は所望の宿主株、すなわち大腸菌における発現を最適化しつつ、元のアミノ酸配列を保持するDNA配列を用いて合成された(GeneArt(登録商標)Gene Synthesis、Regensburg、ドイツ)。最終的な配列構築物を配列番号27に記載する。
DNA及びタンパク質配列:(配列番号27及び28)
N.オリゴスピルスの絹糸腺から得られる三重らせんコラーゲン様物体に関するDNAを、これまでに記載されているように(米国特許第61/615745号)、タイプA鎖(A279)について報告済みの配列から得た。遺伝子構築物を合成したが(GeneArt(登録商標)Gene Synthesis、Regensburg、ドイツ)、同構築物にはNdeI及びEcoRI制限部位が含まれ、また所望の宿主系、すなわち大腸菌における発現を最適化しつつ、元のアミノ酸配列を保持した保存的な塩基置換が導入されている。
最終的な配列構築物を配列番号29に記載する。
DNA及びタンパク質配列:(配列番号29及び30)
SF21(A279)−ハバチコラーゲン、タイプA遺伝子
PCR反応用のテンプレートは、cDNAクローンMGC:39848(画像5405119)(ATCC、Manassa、VA)に基づき、同テンプレートはヒトCOL3A1遺伝子を含有し、アミノ酸配列は変化させないが、二次構造を形成する可能性が低下している限定的な塩基変化が導入されている。
クローニング用の3つの分離した断片をPCR生産するために用いたオリゴヌクレオチドは下記の通りであった。
DNA及びタンパク質配列:(配列番号37及び38)
ヒトI型コラーゲンα1鎖のCB3断片に関するDNA配列を、国立生物工学情報センターデータベース(国立衛生研究所、Bethesda、MD20894、米国)で記録番号GenBank:Z74615.1として提供されるデータから得た。当該配列をC末端His6−タグ及び終止コドンを付加して修飾し、そして5’NdeI及び3’EcoRI及びHindIII制限部位を付加させて、構築物をpCold IVベクターへの挿入に適するようにした。このDNAから生産された三重らせんタンパク質の安定性は、すべての操作が4℃で実施されなければならないことを意味する。所望の宿主系、すなわち大腸菌における発現を最適化しつつ、元のアミノ酸配列を保持した保存的な置換を有する遺伝子構築物を合成した(GeneArt(登録商標)Gene Synthesis、Regensburg、ドイツ)。
最終的な配列構築物を配列番号39に記載する。
DNA及びタンパク質配列:(配列番号39及び40)
ATCC受け入れ番号が95498のヒトコラーゲンI型、αIc−DNA、及びATCC受け入れ番号が95502のヒトコラーゲンIII型、αIc−DNAをキメラDNAの生産で用いた。
DNA配列:配列番号41
カンディダトス・ソリバクター・ユシタトスEllin6076及びメチロバクテリウム種に由来する三重らせん反復部分含有コラーゲンに関するDNA配列を、ソリバクター・ユシタトスについて記録ABJ82342及びメチロバクテリウムについて記録ACA18713.1として、国立生物工学情報センターデータベース(国立衛生研究所、Bethesda、MD 20894、米国)に提供されるデータから取得した。
最終的な配列を配列番号42に記載する。
DNA配列:配列番号42及び43
例えば配列番号2、6、14、20、21の上記DNA構造物のどれでも大腸菌にクローニングすることができ、また下記の方法に基づき三重らせんタンパク質を発現させることができる。
DNAを実施例6に記載するように得た。複合遺伝子を、5’EcoRI及び3’HindIII部位を用いて、pET21aベクターにクローニングした。形質転換受容性のある大腸菌宿主細胞系統BL21 DE3に形質転換する前に、クローンの配列決定を実施した。形質転換した細胞をYT+アンピシリンプレート上に播種し、そして37℃、一晩増殖させた。単一コロニーをこのプレートから拾い出し、そしてYT+アンピシリン培地内にて、37℃、一晩増殖させた。
制限酵素消化部位を配列番号23のハバチDNA単離物内に導入することにより、ハバチ絹遺伝子及びそのインサートに関するDNAを発現ベクター内に単離可能となった。ハバチのコラーゲン様絹タイプA遺伝子をNdeI及びEcoRI部位を介してpColdIベクターに挿入した。PCRコロニースクリーニング技法を、陽性クローンを検出するために用いた。このクローンを培養容積100ml内で増殖させ、そしてQiagenミディプレップを実施してベクター量を増やした。発現用として、選択した陽性クローンを形質転換受容性のある大腸菌BL21細胞に形質転換した。ハバチ絹タンパク質遺伝子の発現では、細胞の1コロニーを、初発の培養培地2×YT−Amp、100mlに添加し、そして200rpmで振盪させながら、37℃、一晩インキュベートした。次に、この培養物に新鮮な2×YT−2%グルコース−Amp100mlを添加し、そして1mMのIPTGにより25℃で10時間、次に20℃で別途16時間誘導した。細胞ペーストを、遠心分離(3000×g、30分間)により採集した。タンパク質は細胞ペレットと関連付けられた。
実施例8に記載するようなDNA/ベクター(YepFlag1)を用いて、エレクトロポレーションにより、酵母菌をS.セレビシエ酵母菌株BJ5462(α ura3−52 trp1 leu2_1 his3_200 pep4::HIS3 prb_1.6R)(Yeast Genetic Stock Center、Berkeley、CA)に形質転換したが、この場合、DNA構築物は、コラーゲンIII断片のα−因子シグナルα−pro配列/FLAGタグ/3回反復からなるインフレーム融合(in frame fusion)を含んだ。形質転換体をSDahl+Ura培地上、28℃で48時間、通気しながら増殖させた。選別後、各部分を非選択的YPHSM培地(1%デキストロース、1%酵母菌抽出物、8%ペプトン、3%グリセロール、20mM CaCl2)で稀釈し、そして激しく振盪させながら28℃で96時間、増殖を継続した。細胞ペレットを12,000×gで20分間、遠心分離して除去した。FLAGの存在は、タンパク質を同定するための選択肢を提供する。
細菌コラーゲン遺伝子を、実施例6の記載に従い調製した。任意選択で、当該遺伝子はピキア属発現用としてさらに最適化可能であった。遺伝子構築物を大腸菌内で組み立てた。
実施例4に記載するように、S.ユシタトスから得られた細菌コラーゲンCLドメイン及びR.パルストリス由来のV−ドメインをコードする合成遺伝子を用いるが、但し配列がニコチニア種内での発現に最適化され、また制限部位5’AgeI及び3’XhoIが導入される点を除く。遺伝子をPCR増幅し、そしてpENTR DTOPOにクローニングする。配列の完全性を次に確認する。pENTR DTOPO構築物をBspHI消化し、そして精製してカナマイシン耐性遺伝子を除去すれば、バイナリーpEAQ−HT−DEST GATEWAYデスティネーションベクター内へのLR clonase遺伝子組換え後に、カナマイシンによる適切な選別が可能となる(Sainsburyら、(2009年)Plant Biotechnol J、第7巻(7):682〜93頁)。バイナリープラスミドを、A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)株LBA4404内に形質転換し、維持した。構築物を、静止期に到達するまで適切な抗生物質を含有するLB培地内で増殖させる。培養物を遠心分離し、そしてペレットを、10mMのMES、10mMのMgCl2、20mMのアセトシリンゴンを含むインフィルトレーション培地にOD600が0.5となるまで再懸濁する。培養物をシリンジインフィルトレーション前に、暗所で4時間、室温でインキュベートして(Sainsburyら(2009年)Plant Biotechnol J、第7巻(7):682〜93頁)、5葉期のニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)まで成長させる。葉をインフィルトレーション後5日目に採集する。
抽出では、例えば上記実施例12〜17に由来する細胞ペースト各1グラムを、50mMの酢酸/HClバッファー、pH2、20mlに再懸濁し、そしてエンハンスブースター1号プローブを備えるMisonix S4000装置を用いて、30A(装置のスケール)で5分間、超音波処理することにより細胞をバーストさせた。任意選択で、細胞ライセート混合物を、遠心分離(12,000×gで60分間)により清透化し、そして三重らせんタンパク質を含有する透明な上清を保持した。
例えば、実施例12〜17に由来する凍結した細胞ペーストを解凍し、そして50mMの酢酸、pH2と1:10w/wに混合した。この混合物を、Apv2000フレンチプレスホモジナイザーに700barの圧力で3回、各回間で1時間の冷却期間を追加しながら通過させた。処理後、ペーストを遠心分離により、12,000×gで60分間任意選択で清透化し、そして抽出した三重らせんタンパク質を含有する透明な上清を保持した。
酵母菌発現系の任意の1つから得られた細胞ペーストを、破砕バッファー(50mMのリン酸ナトリウムバッファー、pH7.4、0.5mMのEDTA、2mMのPMSF、5%のグリセロール、0.1%のトリトンX−100)中に、バッファー20ml当たり細胞ペースト1gの比で再懸濁し、そして同容積のガラスビーズ(Sigma社製ガラスビーズ番号G8772)を添加した。次に混合物を30秒間ボルッテックス処理し(1400rpm)、さらに30秒静置した。ボルテックス処理をさらに10回繰り返す。全抽出プロセスを、全期間にわたり5℃に保った。混合物を、次に10,000×gで1分間、遠心分離して可溶性抽出物を収集する。
好ましくは−20℃で凍結した、実施例17等に由来する葉材料を20mMの酢酸ナトリウムバッファー、pH4.5に、1:10w/wの葉:バッファーの比で投入し、そしてWaring Blender内にてフルスピードで抽出した。
実施例12〜17等における発現、及び実施例18〜21等における抽出後の可溶性三重らせんタンパク質、又は実施例16の場合のように、可溶性生成物として発現された三重らせんタンパク質の存在を、細胞物質の遠心分離とその後のSDS−PAGEにより立証した。発現に用いた構築物上に何らかのタグ、例えばHis6−タグ又はFlagタグ等が存在する場合には、次にウェスタンブロッティングが適切な抗体、例えば可溶性タンパク質検出用の、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したモノクロナール抗ポリヒスチジン等と共に利用可能である。
実施例18〜19に記載するように、発現宿主細胞を機械的に抽出し、抽出物をpH2からpH8の間の選択したpHでインキュベートした。次に、任意選択で死細胞片を除去した。抽出した細胞ライセートのサンプルを、次に1pH単位の間隔、又は好ましくは0.5pH単位の間隔で様々なpHを選択しながら沈殿pHに調整し、そしてサンプルを4℃で16時間保持した。次に、沈殿物を遠心分離により除去し、そして上清のタンパク質含有量を280nmにおける吸収により見積もった。三重らせん構築物の溶解性の保持について、実施例22に記載するように再度確認した。
実施例1に記載するように、S.ピオゲネス由来の可溶性コラーゲン様タンパク質を含有する大腸菌から得られたタンパク質を抽出し、その後遠心分離により清透化した同タンパク質をpH2.2に調整し、4℃で16時間放置して沈殿させた。次に、サンプルを15,000×gで30分間遠心分離し、そして三重らせんタンパク質を含有する上清を保持した。
可溶性三重らせんタンパク質を含有する清透化後の上清を、酢酸又はNaOH溶液を用いてpH5.0に調整し、そして4℃で16時間放置する。得られた沈殿物を10,000×gで30分間遠心分離して除去し、そして上清を保持する。
可溶性三重らせんタンパク質を含有する清透化後の上清を、酢酸又はNaOH溶液を用いてpH4.5に調整し、そして4℃で16時間放置する。得られた沈殿物を、10,000×gで30分間遠心分離して除去する。次に、上清を酢酸及びHClでpH2.5に調整し、そしてさらに20時間放置する。10,000×gで30分間遠心分離して溶液を清透化し、そして上清を保持する。
上記実験で記載するような、酸による沈殿タンパク質の除去後に得られた上清を、下記の条件のうちの任意の1つに基づき調整した。
・pH2.5及びペプシン(0.01mg/ml)で、4℃にて16時間処理し、次に任意選択で、消化物のpHをpH7に調整して終了した。
・pH6.5及びNa EDTA(50mM)及びシステイン(50mM)、パパイン(0.01mg/ml)で、4℃にて16時間処理し、pH3.0及び真菌酸性プロテアーゼXIII型(0.01mg/ml)で、4℃にて16時間処理し、次に任意選択で、消化物のpHをpH7に調整して終了した。pH8.0のトリプシン及びキモトリプシンの両方を、0.01mg/ml、4℃、16時間処理したものに添加し、次に任意選択で消化物のpHをpH4に調整して終了した。
これまでの実施例で議論したように、酸による沈殿とその後のプロテアーゼ処理により不純物を除去した後の組換え三重らせんタンパク質を含有する分画をプールし、溶液のpHをpH4.0〜7.0に調整し、そして固体の硫酸アンモニウムを添加して、三重らせんタンパク質を沈殿させた。すべての工程は三重らせんの融解温度未満の温度で、好ましくは4℃で実施した。沈殿に必要とされる固体の硫酸アンモニウムの量を添加後、サンプルの遠心分離、沈殿物の目視検査、及びSDS−PAGEによる分析が続いた。S.ピオゲネス等に由来する小型の非動物コラーゲンの場合、35%の飽和硫酸アンモニウムが必要である。
これまでの実験で議論したように、酸による沈殿とその後のプロテアーゼ処理により不純物を除去した後の組換え三重らせんタンパク質を含有する分画をプールし、溶液のpHをpH7.0±1.0に調整し、そしてポリエチレングリコール−4000を添加して、三重らせんタンパク質を40%のストック水溶液から沈殿させた。すべての工程は三重らせんの融解温度未満の温度で、好ましくは4℃で実施した。沈殿に必要とされるポリエチレングリコールの量を添加後、サンプルの遠心分離、沈殿物の目視検査、及びSDS−PAGEによる分析が続いた。S.ピオゲネス等に由来する小型の非動物コラーゲンの場合、10%w/vのポリエチレングリコール−4000が必要である。
これまでの実施例で議論したように、酸による沈殿とその後のプロテアーゼ処理により不純物を除去した後の組換え三重らせんタンパク質を含有する分画をプールし、次に濃縮し、そして10kDaクロスフロー濾過メンブレン装置(Pall Life Sciences)を用いて、20mMのリン酸ナトリウムバッファー、pH8.0に置換した。すべての工程は三重らせんの融解温度未満の温度で、好ましくは4℃で実施した。
これまでの実施例で議論したように、酸による沈殿とその後のプロテアーゼ処理により不純物を除去した後の組換え三重らせんタンパク質を含有する分画をプールし、そして溶液のpHをトリスでpH8.0±0.5に調整した。S.ピロゲネスに由来する三重らせんタンパク質では、次にプールしたサンプルを、荷電基として−CH2−N+(CH3)3を有する、50mMのトリス/HClバッファー、pH8.0内で事前平衡化したモノ−Qカラム(GE Healthcare)に吸着させた。ローディング後、カラムを5カラムボリュームの平衡化バッファーで洗浄し、次に同一のバッファー内で、NaClを0〜1Mにリニアグラジエントすることにより溶離した。タンパク質を214nmにおける吸収により検出し、そしてSDS−PAGEにより確認した。
精製したコラーゲンタンパク質をバイオメディカル材料として用いる場合には、ほぼ間違いなく、当業者にとって公知の方法を用いて、さらに「ポリッシング」する必要がある。また動物コラーゲンの場合と同様に、医学的用途で使用する前にタンパク質を安定化する必要もあり得る。
Claims (17)
- 非哺乳動物の宿主細胞培養抽出物又はホモジネートに含まれる、組換え発現されたヒドロキシル化されていない三重らせんタンパク質を精製するための方法であって、
(i)酸性条件下で、かつ三重らせんタンパク質が熱的に安定な状態を保つ温度で、三重らせんタンパク質から宿主細胞物質を沈殿させ、その後に
(ii)沈殿させた宿主細胞培養抽出物又はホモジネート中に存在する宿主細胞物質を、プロテアーゼを添加することにより消化し、ここにおいて、前記三重らせんタンパク質が前記消化に対して耐性である、そして、
(iii)精製した三重らせんタンパク質を収集する
工程を含み、
ここにおいて、前記三重らせんタンパク質が、コラーゲン又はコラーゲン様タンパク質であり;そして、
ここにおいて、前記三重らせんタンパク質が、少なくとも工程(i)から(ii)の全体にわたり可溶性の状態を保つ、
方法。 - 前記三重らせんタンパク質が、工程(i)から(iii)の全体にわたり可溶性の状態を保つ、請求項1に記載の方法。
- 前記三重らせんタンパク質が、少なくとも80%、90%、95%、97%又は98%の純度である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記消化が、酸性プロテアーゼを用いて実施される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、細菌、酵母菌、又は植物の宿主細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 酸性条件は、7未満のpHを意味する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記沈殿させる工程が、前記組換え三重らせんタンパク質の融解温度(TM)よりも少なくとも10℃低い温度で実施される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記沈殿させる工程と前記消化する工程との間に、沈殿させた宿主細胞物質から前記三重らせんタンパク質を物理的に分離する追加の中間の分離工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 中間の前記分離工程が、遠心分離、濾過、クロスフロー濾過、又は沈降のうちの1つ又は複数より選択される、請求項8に記載の方法。
- (i) 前記pHが2から4の間であり、及び前記宿主細胞が細菌宿主細胞である;
(ii)前記pHが4から6の間であり、及び前記宿主細胞が酵母菌宿主細胞である;あるいは、
(iii)前記pHが2から4.5の間であり、及び前記宿主細胞が植物宿主細胞である、
請求項6に記載の方法。 - タンパク質分解作用に対して不安定なタンパク質よりも、タンパク質分解作用に対して安定なタンパク質が選択的に精製される、請求項4〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 精製した三重らせんタンパク質を収集する工程が、透析濾過又は沈殿によって前記三重らせんタンパク質を濃縮する、というさらなる工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記三重らせんタンパク質の沈殿が、硫酸アンモニウムの添加により、pH調整又は温度調整により、及び/又はポリマー(例えばポリエチレングリコール)の使用により達成される、請求項12に記載の方法。
- 収集された前記三重らせんタンパク質が、安定化剤により安定化される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記三重らせんタンパク質が、(Gly−X−Y)n反復モチーフを含み、式中nは、5から600の間であり、そして、X及びYは独立して、任意の天然又は非天然のイミノ酸又はアミノ酸である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記三重らせんタンパク質が、ヒトコラーゲンである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記三重らせんタンパク質の配列が、細菌、酵母菌、植物又は昆虫に由来のコラーゲン様タンパク質である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
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