TW201514194A - 三螺旋蛋白質之純化 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於純化自細菌、酵母或植物宿主細胞重組產生之三螺旋或膠原蛋白狀蛋白質的方法及藉由該方法來純化之蛋白質。

Description

三螺旋蛋白質之純化 【其他申請案之交叉參考】
本文所引用之所有公開案、專利、專利申請案及其他參考均以全文引用之方式併入，如同表明各個別公開案、專利、專利申請案或其他參考特定且單獨地以引用之方式併入一般。
本申請案主張2013年3月21日申請、標題為「Purification of triple helical proteins」之澳大利亞專利申請案第2013900990號的優先權。此申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案與電子形式之序列表一起提交。序列表之全部內容以引用之方式併入本文中。
本發明係關於一種用於純化自細菌、酵母或植物宿主細胞重組產生之三螺旋或膠原蛋白狀蛋白質的方法。
膠原蛋白為動物之細胞外基質中的主要結構蛋白，且定義為需要(Gly-Xaa-Yaa)n重複序列之特徵性三螺旋結構。在Xaa及Yaa位置中發現之胺基酸常為脯胺酸，其中Yaa位置中之Pro經轉譯後修飾為羥脯胺酸(Hyp)，該羥脯胺酸提昇三螺旋穩定性。在人類中，存在至少28種膠原蛋白類型之家族，各自具有類型特異性生物學及結構功能。三螺旋基元亦存在於其他蛋白質中，諸如巨噬細胞清道夫受體、膠原凝集素及Clq。
最豐富之膠原蛋白為間質、原纖維形成膠原蛋白，尤其為I型膠原蛋白。此等膠原蛋白經由形成藉由特異性交聯穩定之纖維束網狀物來在動物中形成主要組織結構，以使組織具有穩定性及強度。與『大』原纖維形成膠原蛋白(I型、II型及III型)相反，『小』膠原蛋白('minor' collagen)分佈一般較不廣泛，且典型地發現於其中小膠原蛋白可為重要及關鍵成分之特定組織位置中；例如肥厚性軟骨中之X型膠原蛋白或基底膜中之IV型膠原蛋白。
已顯示膠原蛋白在各種臨床應用中之多種醫學產品中安全且有效(Ramshaw等人，J Materials Science,Materials in Science,(2009),20(1)第3-8頁)。對醫學應用而言，膠原蛋白一般以兩種明顯相異之形式使用。在一種形式中，在化學穩定化之後使用完整組織，諸如在主動脈瓣膜替換中使用戊二醛固著之豬心瓣膜。另一種形式為經由製備經純化之可溶性膠原蛋白(諸如適用於傷口塗劑之無水穩定化薄片或擠壓纖維、用於半月板修復之黏附障壁或裝置)，該等可溶性膠原蛋白復原為各種產品且加工得到產品之所需形狀或形式。必要時，膠原蛋白裝置可藉由化學固著(例如戊二醛)或藉由物理方法(例如乾熱交聯)而穩定化。經純化之可溶性膠原蛋白亦廣泛用作用於軟組織加強以及亦用於治療尿失禁的膠原蛋白漿。復原產品之特徵在於較高生物化學純度，該較高生物化學純度與組織中之生物學功能中至關重要的低免疫原性、受控轉換(常經較短時間段)、受控孔隙度及細胞-基質相互作用之滯留相關。
為純化來自動物膠原組織之膠原蛋白，典型方法包括經由使用酵素消化步驟(其移除交聯區而保留三螺旋完整)來使組織初始消化及溶解。溶解之膠原蛋白可隨後經純化以移除潛在免疫原性污染物。舉例而言，US6548077描述來自組織之膠原蛋白的製備，其涉及使膠原蛋白與第一蛋白水解酵素接觸，繼而與還原劑及第二蛋白水解酵素接觸。
Addad等人(Mar.Drugs(2011),9(6),967-983)描述使用組織萃取物之酸性胃蛋白酶溶解作用來純化來自水母之膠原蛋白。然而，為獲得穩定及適用之最終產物，需要交聯步驟。用酸且特定言之用乙酸處理導致組織膨脹，且在胃蛋白酶消化之後得到可溶性膠原蛋白。所得可溶性膠原蛋白產物將為可能需要復原為不溶形式以用於許多醫學應用的弱非纖維材料。
已公開之替代性方法包括將富含膠原蛋白之天然動物組織研磨為極精細粒子，該等粒子可在加工為適用之醫學材料之前或之後經洗滌為無雜質。
大部分商業量之膠原蛋白來源於動物(諸如牛來源)，但擔心可具有可傳染之疾病，尤其牛海綿狀腦病(『狂牛症』)，已在產生重組形式之膠原蛋白上花費研究努力。此外，來源於動物之膠原蛋白受到限制，因為所萃取之膠原蛋白無法經設計及修飾以增強或改變特定生物學特性。膠原蛋白在沈積於細胞外基質中之前及之後經受大量轉譯後修飾。特定言之，原纖膠原蛋白在細胞外空間中經受持續分子壽命之分子內及分子間交聯。因此，存在於膠原蛋白中之交聯量除了其他以外還受到收集膠原蛋白之組織的壽命及生理學影響。此等差異影響來自組織之膠原蛋白的可萃取性及此等膠原蛋白之生物物理學特徵。因此，自組織分離之膠原蛋白展現顯著批次間變化，且作為塊狀材料在分析上常常難以處理。
相應地，關注已從動物膠原蛋白之分離轉移至重組型膠原蛋白之產生。
此外，需要使用重組DNA技術，因為該技術可能允許產生合成膠原蛋白及膠原蛋白片段，該等膠原蛋白及膠原蛋白片段可包括例如外源性生物活性結構域(亦即提供額外蛋白質功能)及其他適用之特徵(例如改良之生物相容性及穩定性)。
已探索宿主系統(諸如酵母)以重組產生人類編碼之膠原蛋白。然而，酵母系統為複雜的，因其需要引入脯胺酸-4羥化酶之基因以形成哺乳動物膠原蛋白之穩定性所需要之Hyp殘基。典型地，重組型哺乳動物編碼之膠 原蛋白表現在畢赤酵母(Pichia)中，需要添加氧氣以得到最大羥基化，以及添加甲醇以用於誘導，產生對增強的潛在防火工程的需要。
已尋找到不需要轉譯後修飾之其他膠原蛋白狀物質來作為羥基化之人類膠原蛋白的替代。最近，對細菌基因組之研究已表明，存在許多每三個殘基含有一個Gly且脯胺酸含量較高的假定之細菌蛋白質，表明膠原蛋白狀三螺旋結構可存在於某些來源於細菌之蛋白質中(Peng Y等人(2010)Biomaterials 31(10)：2755-2761；Yoshizumi A等人(2009)Protein Sci 18：1241-1251)。此外，已顯示若干此等蛋白質形成即使不存在Hyp亦在約37℃下穩定的三螺旋。已在多種情況下確認三螺旋組成物。實例包括某些細菌細胞上之細胞表面蛋白質及炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)孢子上之長絲。已假定該等膠原蛋白狀構築體在存在於病原性大腸桿菌(E coli)菌株中之原噬菌體中的表現似乎為造成毒性相關之基因經由感染傳播的原因(BellaJ等人(2012)7(6)PLoS 1 e37872)。
然而，使用重組技術仍具有其缺點及障礙。使用宿主細胞來產生外來蛋白質增加挑戰，諸如移除存在於所需蛋白質之最終調配物中之污染性宿主細胞蛋白質可導致有害毒性或免疫反應。若重組型蛋白質係在細胞內製得，則純化製程之第一步驟涉及裂解或破壞細胞，其將細胞之內容物釋放至均質物中且另外產生亞細胞片段。若重組型蛋白質係自細胞分泌的，則細胞之自然死亡及將細胞內宿主細胞蛋白質釋放至上澄液中亦可產生毒性及免疫原性污染。為移除此等污染物，典型地需要許多不同之純化步驟。通常採用親和性層析法來達成高純度水準。此後續加工一般為勞動及資源密集型的，且對大規模商業生產而言成本過高。
重組型膠原蛋白狀蛋白質之大規模生產仍處於其發展初期。存在大規模生產必須處理之某些挑戰，包括製程之可擴充性、生產成本、萃取方法之複雜性、對GMP需求之順應性、對調控需求之順應性、污染性宿主細胞 蛋白質之移除、純化方法之複雜性、宿主細胞之適合性。舉例而言，人類細胞系僅促使中度產出率，對有成本效益的更大規模之生產而言為不適合的。
相應地，需要用於純化重組產生之膠原蛋白的方法，其中該等方法具有成本效益且促使以高產量及用於各種應用之足夠純度來生產膠原蛋白。
本發明者已開發出一種用於純化由非動物宿主細胞(諸如細菌、酵母或植物細胞)表現之重組型三螺旋蛋白質的方法。該方法提供在整個純化方法中保持可溶性之可溶性三螺旋蛋白質的純化。此外，該方法不導致三螺旋蛋白質之變性、降解或水解。
本發明之方法提供重組型三螺旋蛋白質(來自任何來源)之純化，該純化導致所產生的溶解之三螺旋蛋白質(例如膠原蛋白)為穩定且不含污染性蛋白質(其可損害三螺旋蛋白質之穩定性)的，並且因製程步驟最少化而可以高產量來進行生產。有利的是，該方法提供一種用於純化三螺旋蛋白質(例如膠原蛋白)的有成本效益之方法，該等三螺旋蛋白質在酸性條件下穩定且以用於多種不同應用之足夠純度來進行生產。
本發明因此提供一種用於純化在非哺乳動物宿主細胞培養萃取物或均質物內含有之重組表現三螺旋蛋白質的方法，該方法包含：(i)在酸性條件下及在該三螺旋蛋白質保持熱穩定之溫度下自該三螺旋蛋白質沈澱宿主細胞物質；繼而；(ii)藉由添加蛋白酶來消化存在於該經沈澱之宿主細胞培養萃取物或均質物中的宿主細胞物質，其中該三螺旋蛋白質對該蛋白酶具有耐受性；及(iii)收集該經純化之三螺旋蛋白質；且視情況在該沈澱步驟與該消化步驟之間進一步包含額外分離步驟，該 分離步驟以物理方式自不溶性宿主細胞物質分離該三螺旋蛋白質；且其中該三螺旋蛋白質在至少步驟(i)及(ii)中均保持可溶性。
在一個實例中，該三螺旋蛋白質在步驟(i)至(iii)中均保持可溶性。
在一個實例中，宿主細胞物質之該消化步驟使用酸性蛋白酶來進行。
在一個實例中，該方法進一步包含收集宿主細胞。較佳地，該宿主細胞為細菌、酵母或植物宿主細胞。用於培養本發明之宿主細胞的方法對熟習此項技術者而言將為熟悉的，且描述於本文中其他地方。
在一個實例中，該酸性條件係指培養萃取物或均質物之pH值在小於7之pH值下，較佳地在小於約6之pH值下。
根據本發明之方法，三螺旋蛋白質宜保持熱穩定。熟習此項技術者將瞭解可向培養萃取物或均質物中添加以輔助維持三螺旋蛋白質之熱穩定性的某些藥劑或添加劑。舉例而言，可添加抗冷凍劑(諸如NaCl)或提供穩定性之其他添加劑，諸如聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯啶酮、聚丙烯醯胺、聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)或其衍生物、甲基纖維素、瓊脂糖、糊精、羥乙基澱粉、N-氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide；TMAO)等。在一個實例中，若在小於三螺旋蛋白質之熔化溫度的溫度下進行該沈澱步驟，則該三螺旋蛋白質之熱穩定性得以維持。在另一個實例中，在酸性沈澱條件下在比三螺旋蛋白質之Tm低至少10℃之溫度下維持該三螺旋蛋白質之熱穩定性。測定三螺旋蛋白質之熱穩定性的方法描述於例如US 8,280,710中。
本發明之方法包括視情況選用之中間分離步驟，該分離步驟用於自所沈澱之宿主細胞物質(諸如宿主細胞蛋白質及/或宿主細胞DNA)分離三螺旋蛋白質。可在此視情況選用之步驟中採用任何分離製程來移除此等物質中之一者或兩者。該等製程較佳為粗物質分離或濃縮技術，諸如離心、過濾、交叉流過濾或沈降。
在另一個具體實例中，在根據本發明之方法的消化步驟之前或與其同時可必需另一個pH值調節。視用於消化步驟之蛋白酶而定，可能需要向上或向下調節pH值，其限制條件為三螺旋蛋白質保持在溶液中。舉例而言，若使用胃蛋白酶作為蛋白酶，則可能必需在添加胃蛋白酶之前降低培養萃取物或均質物之pH值。該等調節足以處於熟習此項技術者之技能內。
熟習此項技術者應瞭解，將由包含編碼三螺旋蛋白質之序列的重組型構築體轉化或轉染的宿主細胞在適合於使得該三螺旋蛋白質表現之條件下培養。在一些實例中，將在細胞內產生三螺旋蛋白質，在此情況下，必需自細胞萃取三螺旋蛋白質。萃取方法將需要使宿主細胞破裂。萃取可藉由熟習此項技術者已知之機械或化學(例如酵素)手段來達成。機械萃取製程之實例可包括以下各者中之一或多者：音波處理、微流體化、在法式壓碎器(French Press)或相似設備中裂解、滲透猝震、及藉由與玻璃、陶瓷或鋼珠一起劇烈攪拌/研磨來破壞。作為替代方案，或與機械萃取結合，亦可採用酵素萃取。適合於酵素萃取之藥劑的實例包括溶菌酶、溶葡球菌酶、消解酶、纖維素、變溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露糖等。
在一些實例中，三螺旋蛋白質係自宿主細胞分泌的(亦即如在一些酵母系統中之情況下在細胞外產生)。在彼等情況下，不必需萃取，然而，細胞培養萃取物可經濃縮，由此藉由此項技術中已知之方法產生均質物或濾液，以獲得包含所回收之可溶性三螺旋蛋白質的溶液。在另一實例中，細胞培養基與三螺旋蛋白質一起藉由交叉流過濾來濃縮。
相應的，本發明之方法可包括一種產生含有三螺旋蛋白質之宿主細胞培養萃取物或均質物的額外步驟。
根據本發明之方法，藉由酸性沈澱步驟來自含有細胞培養萃取物或均質物之重組型三螺旋蛋白質中移除細胞污染物及碎片。本發明者已發現，藉由在三螺旋蛋白質保持熱穩定之溫度下將溶液之pH值調節為酸性條 件，在許多污染性(亦即非可溶性)物質沈澱的同時，重組型三螺旋蛋白質不變性且保持在溶液中。因此，本發明具有在此第一純化步驟中三螺旋蛋白質之pH值穩定性的優勢。
較佳地，溫度在整個方法中為恆定的，在一個實例中，溫度維持在室溫下(亦即在約18℃與24℃之間)。
在一個實例中，在酸性沈澱步驟期間，溫度比重組型三螺旋蛋白質之熔化溫度(melting temperature；Tm)低至少10℃或更多。
含有重組型三螺旋蛋白質之溶液的酸化可藉由任何適合之酸(包括強酸或弱酸)來達成。可使用單一酸，或者可使用不同酸之組合。根據該方法適合之酸的實例包括鹽酸、硫酸、乙酸、甲酸或乳酸，但熟習此項技術者熟悉之其他酸亦將為適合的。相應地，視重組型蛋白質在酸化溶液之pH值下的Tm而定，酸化發生之溫度可在4℃與30℃之間變化。
在下表中提供各種細菌物種之三螺旋膠原蛋白狀(collagen-like；CL)結構域的熔化溫度之實例。
在酸性沈澱步驟期間，含有重組型三螺旋蛋白質之細胞培養萃取物或均質物的經調節之pH值將視宿主細胞及三螺旋蛋白質序列而定。在一個實例中，包含三螺旋蛋白質之細胞培養萃取物或均質物之pH值調節至小於7。在另一個實例中，對細菌宿主細胞，介於2與4之間的pH值較佳，而對酵母宿主細胞，介於4與6之間的pH值較佳。在對植物宿主細胞之另一 個實例中，介於2與4.5之間的pH值較佳。
在某些實例中，對重組型三螺旋蛋白質之植物細胞表現而言，酸性沈澱步驟可在兩種不同之pH值下進行。舉例而言，在其中萃取物中最豐富之植物蛋白質為核酮糖雙磷酸羧化酶加氧酶(ribulosebisphosphate carboxylase oxygenase；Rubisco)的情況下，其最佳在約4.5之pH值下沈澱。然而，此pH值典型地不足以移除所有污染性植物蛋白質，在此情況下，可必需繼而進行pH值2.5下之另一個沈澱。
相應地，酸性沈澱步驟可需要調節pH值以使存在於萃取物中之連續污染性蛋白質沈澱。較佳地，所沈澱之蛋白質將根據上述方法在後續pH值調節之間移除。
根據本發明之方法，在酸性沈澱步驟之後為消化步驟。本發明者已發現，消化步驟移除在萃取製程(其中產生培養萃取物或均質物)中生成之宿主細胞污染物或在於沈澱步驟回收三螺旋蛋白質期間未移除之宿主細胞污染物。典型地，消化步驟將導致移除易於酵素消化之污染性宿主細胞蛋白質，例如膜蛋白質。在另一個實例中，使用蛋白酶，較佳酸性蛋白酶來進行消化步驟。適用於根據本發明之方法的酸性蛋白酶之實例包括胃蛋白酶、番木瓜蛋白酶、番木瓜蛋白酶狀酵素(諸如鳳梨蛋白酶、無花果蛋白酶或奇異果蛋白酶)、或佐氏麯黴(Aspergiliussaitoi)酸性蛋白酶。
非酸性蛋白酶亦可用於本發明之消化步驟，諸如胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。視所採用之蛋白酶而定，可必需將pH值調節至酸性較弱條件(例如對諸如番木瓜蛋白酶之蛋白酶)。熟習此項技術者將熟悉該等策略。
在一些實例中，蛋白酶消化可藉由將培養萃取物或均質物之pH值調節至中性pH值來終止。
應瞭解該方法產生對蛋白水解穩定之三螺旋蛋白質的純化。三螺旋蛋白質亦可包括對經選擇以用於移除宿主蛋白質之酵素為蛋白水解穩定的額 外非螺旋蛋白質序列及/或天然或藉由設計以對該酵素為蛋白水解穩定的非三螺旋序列插入。因此，本發明之方法亦具有相較於對蛋白水解不穩定之蛋白質，選擇性純化對蛋白水解穩定之蛋白質的優勢，且因此選擇性純化三螺旋蛋白質超過其他非三螺旋蛋白質。
蛋白酶將許多污染性蛋白質消化為因分子量比完整可溶性重組型三螺旋蛋白質小得多而均可藉由滲濾沈澱來移除之肽。隨後可收集所得經純化之重組型三螺旋蛋白質。此等製程均具有濃縮重組型三螺旋蛋白質之附加優勢。重組型三螺旋蛋白質之沈澱可藉由添加硫酸銨、藉由調節pH值及/或調節溫度、或藉由使用聚合物(例如聚乙二醇)來達成。
在另一個實例中，亦可藉由此項技術中已知之方法來自所收集之三螺旋蛋白質中移除污染性宿主細胞核酸。
視三螺旋蛋白質之最重用途而定，可採用所收集之三螺旋蛋白質的精製步驟以在已移除宿主污染物之後立即進一步濃縮及/或純化該重組型三螺旋蛋白質。層析為常用以精製蛋白質溶液之一種該類技術。可採用之層析製程之實例包括離子交換層析、高效液相層析、電泳、凝膠過濾層析、親和性層析及疏水性相互作用層析。若已藉由中性聚合物沈澱重組型三螺旋蛋白質，則沈澱之鹽將較低，且因此若必需進一步精製純化，則可直接用於離子交換層析。
應瞭解該方法促使經純化之三螺旋蛋白質的生成。在一個實例中，經純化之三螺旋蛋白質為穩定化的。在另一個實例中，三螺旋蛋白質藉由戊二醛而穩定化；然而，可使用此項技術中已知之其他穩定劑。
用於表現重組型三螺旋蛋白質的適合之宿主細胞包括細菌、酵母或植物細胞。在此等細胞中重組產生三螺旋蛋白質之方法對熟習此項技術者而言將為熟悉的。
細菌宿主細胞可選自(但不限於)艾氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌 屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀桿菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)及副球菌屬(Paracoccus)。在一個實例中，細菌宿主為大腸桿菌(Escherchia coli)。適合之大腸桿菌(E.coli)宿主包括大腸桿菌BL21菌株(Life Sciences)\大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)\大腸桿菌294(ATCC 31,446)及大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)。
酵母宿主細胞可選自畢赤酵母(Pichiapastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維斯酵母(Kluyveromyceslactis)、西方施氏酵母(Schwanniomyces occidentis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、瑞氏木黴菌(Trichoderma reesei)及耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
植物宿主細胞可選自煙草、玉米、小麥、大麥，以及諸如微藻之較低等植物，諸如普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
包含編碼根據本發明之方法純化之重組型三螺旋蛋白質的核酸序列的表現構築體為包含編碼如本文所定義之重複基元(Gly-X-Y)的序列的一個表現構築體。藉由該表現構築體編碼之三螺旋蛋白質較佳為在哺乳動物體溫下(亦即在35℃與40℃之間)熱穩定的或可在藉由修飾純化後變得穩定的。n值可在5至600之間或在1至350之間，且(Gly-X-Y)表示細菌或動物(哺乳動物)或昆蟲來源之三螺旋形成結構域。其中對各重複單位，X及Y獨立地為任何自然天然或非天然亞胺基或胺基酸。在一個實例中，X或Y均不為羥脯胺酸。然而，在一些實例中，三螺旋結構域可包括羥脯胺酸。插入或連接序列可定位於包含一個以上膠原蛋白狀(CL)結構域之構築體中的各三螺旋形成結構域(在本文中亦稱為「膠原蛋白狀(CL)形成 結構域」)之間或定位於個別CL結構域內。插入序列由約1至50個任何亞胺基或胺基酸構成。較佳地，插入序列不為酵素/蛋白酶不穩定的。
在一個實例中，三螺旋蛋白質為膠原蛋白。
重組型三螺旋序列可來源於任何三螺旋蛋白質或含有三螺旋之蛋白質，不論其來自細菌、酵母、植物、昆蟲或蠶，且可為羥基化或非羥基化的。
若三螺旋蛋白質呈羥基化形式，則在進行本發明之方法之前可採用需要修飾脯胺酸殘基的額外步驟。該等方法對熟習此項技術者而言將為熟悉的。
編碼重組型三螺旋狀蛋白質且可用於設計本發明之適當構築體的實例序列包括：(i)來自病原性或非病原性細菌生物體之序列，其中舉例而言，三螺旋序列可包括來源於以下各者中之一或多者的CL結構域：化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、甲基桿菌4-46、Solibacter usitatus、equiScIC鏈球菌(Streptococcus equiScIC)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、產氣莢膜芽胞梭菌、沼澤紅假單胞菌、肺炎鏈球菌A(Streptococcus pneumonia A)，其在天然狀態中或在藉由化學交聯穩定化之後均展現所需熱穩定性。序列亦可包括在US 6,953,839中識別之三螺旋膠原蛋白狀序列；(ii)自選自(但不限於)以下各者之生物體分離的一或多個DNA序列：白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)、放線菌綱(Actinobacteria)(例如淡黃分枝桿菌(Mycobacterium gilvum)、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、范巴倫分支桿菌(Mycobacterium vanbaalenii)、類諾卡氏菌(Nocardioides)種、紅色桿菌(Rubrobacter xylanophilus)、棲沙鹽水孢菌(Salinisporaarenicola)、熱帶鹽水孢菌(Salinisporatropica)及鏈黴菌種)、α變形菌綱(Alphaproteobacteria)(例如邊蟲(Anaplasma)種、耐輻射性甲基 桿菌(Methylobacteriumradiotolerans)、維氏硝化桿菌(Nitrobacterwinogradskyi)、脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、球形紅細菌(Rhodobactersphaeroides)、沼澤紅假單胞菌、威氏鞘胺醇單胞菌(Sphingomonaswittichii)及沃爾巴克氏細菌(Wolbachia)種)、擬桿菌門(例如多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron))、β變形菌綱(Betaproteobacteria)(例如固氮弧菌(Azoarcus)種、須芒草伯克氏菌(Burkholderia ambifaria)、新洋蔥伯克氏菌(Burkholderia cenocepacia)、結瘤伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)、芳族脫氯單胞菌(Dechloromonas aromatica)、萘降解極地單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、真氧產鹼慢生根瘤菌(Ralstonia eutropha)、耐重金屬慢生根瘤菌(Ralstonia metallidurans)、皮氏慢生根瘤菌(Ralstonia pickettii)及鐵還原紅育菌(Rhodoferaxferrireducens))、藍藻菌屬(例如藍桿藻(Cyanothece)種、集胞藻(Synechocystis)種、紅海束毛藻(Trichodesmiumerytgraeum))、奇異球菌屬(Deinococcus)(例如抗輻射奇異球菌(Deinococcusradiodurans))、δ變形菌綱(Deltaproteobacteria)(例如Anaeromyxobacterdehalogenans)、ε變形菌綱(例如曲狀桿菌(Campylobacter curvus))、厚壁菌門(例如克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、肉毒芽孢梭菌(Clostridium botulinum)、植物醱酵梭菌(Clostridium phytofermentans)、糞腸球菌(糞腸球菌)、嗜熱地芽桿菌(Geobacilluskaustophilus)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、球形賴胺酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)及肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae))、及γ變形菌綱(例如克氏檸檬酸桿菌(Citrobacterkoseri)、 腸桿菌種、大腸桿菌、克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜肺性退伍軍人桿菌(Legionella pneumophila)、發光桿菌(Photorhabdusluminescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜蟲假單胞菌(Pseudomonas entomophila)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、嗜冷桿菌(Psychrobactercryohalolentis)、降解噬糖菌(Saccharophagusdegradans)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)、變形斑沙雷氏菌(Serratiaproteamaculans)、亞馬遜希瓦氏菌(Shewanella amazonensis)、波羅的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)、冷海希瓦氏(Shewanella frigidimarina)、哈里法克斯希瓦氏菌(Shewanella halifaxensis)、光伏希瓦氏菌(Shewanella loihica)、奧奈達希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、匹里那希瓦氏菌(Shewanella pealeana)、腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、沈積希瓦氏菌(Shewanella sediminis)、武氏希瓦氏菌(Shewanella woodyi)、鮑氏志賀桿菌(Shigella boydii)、痢疾志賀桿菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志賀桿菌(Shigella flexneri)、宋內志賀桿菌(Shigella sonnei)及哈維氏弧菌(Vibrio harveyi))；(iii)為以下各者編碼之DNA序列：Clq、乙醯膽鹼酯酶、巨噬細胞清道夫受體、肺界面活性蛋白質、甘露糖結合蛋白、休眠蛋白質、足絲貽貝(Mytilus byssus)、外異蛋白A或神經膠質蛋白；(iv)編碼來源於以下各者中絲葉蜂族膜翅目之鋸蜂絲蛋白的序列：在葉蜂(Hemichroa)、紅紋葉蜂(Pristiphora)、Pachynemalus、綠頭鋸蜂(Pikonema)及香葉蜂(Nematus)種(絲葉蜂(Nematinae)亞科)、桂花葉蜂(Tomostethus)及黑頭葉蜂(Tethida)種(蛞蝓葉蜂(Blennocampinae)亞科)中；及(v)編碼包括以下各者中之一或多者的哺乳動物膠原蛋白的序列：I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、XVIII型、XIX型、 XX型、XXI型、XXII型、XXIII型、XIV型、XXV型、XXVI型、XXVII型、XXVIII型膠原蛋白。
插入序列可在重組型構築體中經改造以改良三螺旋蛋白質之彈性，或以其它方式充當天然結合域或生物學分裂序列。適合於使用之構築體的實例揭示於WO 2010/091251中。
在一個實例中，所表現之三螺旋蛋白質及/或其三螺旋結構域為其中相同鏈經組合以形成三螺旋的同源三聚體。
在另一個實例中，所表現之三螺旋蛋白質及/或其三螺旋結構域為由兩個或三個經組合以形成三螺旋的相異鏈組成，例如在哺乳動物I型膠原蛋白中所見。
在另一個實例中，所表現之三螺旋蛋白質為包含至少兩個藉助於連接序列連接之三螺旋結構域的嵌合蛋白質。舉例而言，編碼蛋白質之嵌合構築體可包含兩個或兩個以上的哺乳動物之三螺旋形成結構域及/或可藉由連接子分隔之細菌三螺旋序列或可藉由連接序列分隔的不同細菌膠原蛋白之三螺旋形成結構域。該等嵌合體在表現時導致產生蛋白質鏈，該蛋白質鏈能夠形成三螺旋且可由以能夠形成三螺旋之單一序列接合在一起的兩個來源於細菌之鏈片段或一個來源於細菌之鏈片段與來源於哺乳動物之鏈片段組成。
各三螺旋結構域序列重複可包括之前提及之序列的重複序列、片段、變異體或組合。
雖然不限於此，但細菌表現載體可為冷休克載體，且重組型三螺旋蛋白質可在37℃以下之溫度下(且在某些實例中在約15℃至23℃之溫度下)在微生物(例如大腸桿菌)中表現。在另一個實例中，表現載體為pET載體(Novagen)。
在另一個實例中，選擇酵母表現載體。酵母表現載體之實例為此項技 術中已知的，且可選自例如pHIL-D2、pPIC3.5、pHIL-SI、pPIC9、pPICZ、pA0815、pBLADE、pBLARG、YepFlag1、pAMH110或pBLURA。
在另一個實例中，表現載體為植物表現載體。植物表現載體之實例為此項技術中已知的，且可包括例如pBH21、pCAmbia2301、pEAQ-HT-DEST或PVX表現載體。
本發明亦提供藉由如本文所描述方法來純化的三螺旋蛋白質。
本發明亦提供藉由如本文所描述之方法來獲得的經純化之三螺旋蛋白質。
在一個實例中，三螺旋蛋白質為約80%、約85%、約90%、約95%、約97%或約98%純的。
已根據本發明之方法經純化的三螺旋蛋白質在需要時可轉變為可適用於各種應用的明膠。將三螺旋蛋白質轉變為明膠之方法對熟習此項技術者而言將為已知的，且典型地涉及例如藉由熱或化學變性製程來使蛋白質變性。相應地，本發明亦涵蓋藉由熱或化學變性而轉變為明膠的本發明之經純化三螺旋蛋白質。
序列表之關鍵
SEQ ID NO 1：凝血酶/胰蛋白酶分裂位點
SEQ ID NO：2：來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2片段的DNA序列
SEQ ID NO：3：來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2片段的蛋白質序列
SEQ ID NO 4：插入序列
SEQ ID NO 5：正向引子
SEQ ID NO 6：反向引子
SEQ ID NO 7：編碼來自化膿性鏈球菌之膠原蛋白Scl2的CL結構域之細菌膠原蛋白二聚體的DNA序列
SEQ ID NO：8：編碼來自化膿性鏈球菌之膠原蛋白Scl2的CL結構域之細菌膠原蛋白二聚體的蛋白質序列
SEQ ID NO 9：肝素結合序列
SEQ ID NO 10：正向引子
SEQ ID NO 11：反向引子
SEQ ID NO 12：正向引子
SEQ ID NO 13：反向引子
SEQ ID NO 14：正向引子
SEQ ID NO 15：反向引子
SEQ ID NO 16：編碼包括用於肝素結合之經取代功能性序列的來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2的DNA序列
SEQ ID NO 17：編碼包括用於肝素結合之經取代功能性序列的來自化膿 性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2的蛋白質序列
SEQ ID NO 18：整合素結合序列
SEQ ID NO 19：正向引子
SEQ ID NO 20：反向引子
SEQ ID NO 21：正向引子
SEQ ID NO 22：反向引子
SEQ ID NO 23：編碼包括用於整合素結合之經取代功能性序列的來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2的DNA序列
SEQ ID NO 24：編碼包括用於整合素結合之經取代功能性序列的來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2的蛋白質序列
SEQ ID NO 25：編碼包括用於肝素及整合素結合兩者之經取代功能性序列的來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2的DNA序列
SEQ ID NO 26：編碼包括用於肝素及整合素結合兩者之經取代功能性序列的來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2的蛋白質序列
SEQ ID NO 27：使用來自沼澤紅假單胞菌之V結構域來編碼來自Solibacter usitatus之細菌膠原蛋白的DNA序列
SEQ ID NO 28：編碼來自Solibacterusitatus之細菌膠原蛋白(使用來自沼澤紅假單胞菌之V結構域)的蛋白質序列
SEQ ID NO 29：編碼來自鋸蜂少孢絲角葉蜂(Nematusoligospilus)基因A之昆蟲膠原蛋白的DNA序列
SEQ ID NO 30：編碼來自鋸蜂少孢絲角葉蜂基因A之昆蟲膠原蛋白的DNA序列
SEQ ID NO 31：引子
SEQ ID NO 32：引子
SEQ ID NO 33：引子
SEQ ID NO 34：引子
SEQ ID NO 35：引子
SEQ ID NO 36：引子
SEQ ID NO 37：編碼人類III型膠原蛋白之3個重複片段的DNA序列
SEQ ID NO 38：編碼人類III型膠原蛋白之3個重複片段的蛋白質序列
SEQ ID NO 39：編碼人類I型α I鏈CB3片段之DNA序列
SEQ ID NO 40：編碼人類I型α I鏈CB3片段之蛋白質序列
SEQ ID NO 41：編碼由人類膠原蛋白I型及III型鏈之片段製得之嵌合體的DNA序列
SEQ ID NO 42：編碼其中存在來自甲基桿菌及S.usitatus之兩種不同膠原蛋白狀成分的不同細菌膠原蛋白鏈之嵌合體的DNA序列
SEQ ID NO 44：編碼其中存在來自甲基桿菌及S.usitatus之兩種不同膠原蛋白狀成分的不同細菌膠原蛋白鏈之嵌合體的DNA序列
圖1顯示根據本發明之一個具體實例之純化流程的流程圖。
圖2顯示宿主蛋白質在酸性萃取及調節pH值及平衡16小時之後的可溶性。(A)細菌，大腸桿菌，(B)酵母，啤酒酵母菌，(C)植物，菠菜(Spinaciaoleracea)。
圖3顯示SDS PAGE，該SDS PAGE展示在酸性沈澱及隨後蛋白酶消化之後的三螺旋蛋白質最終純化；S=蛋白質標準；F=醱酵萃取物及P=在pH值2.0沈澱及胃蛋白酶消化之後的產物，對化膿性鏈球菌之初始DNA構築體V-CL及V-CL-CL得到沈澱及蛋白水解CL及CL-CL之後的產物。
圖4顯示化膿性鏈球菌膠原蛋白海綿及細胞評估，其顯示(A)穩定化 薄片(上部)及海綿(下部)，(B)在3小時時之細胞附接，及(C)在16小時之後的細胞存活性。
一般技術及定義
除非另外具體定義，否則本文所用之所有技術及科學術語將視為具有與一般熟習此項技術者通常理解(例如在細胞培養、分子遺傳、重組型生物學、真絲技術、免疫學、蛋白質化學及生物化學中)之含義相同的含義。
除非另外指明，否則在本發明中所利用之重組型蛋白質、細胞培養及免疫技術為熟習此項技術者所熟知之標準程序。該等技術描述及解釋於諸如以下之來源的文獻通篇中：J.Perbal，分子選殖實用引導(A Practical Guide to Molecular Cloning),John Wiley and Sons(1984)、J.Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual),Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown(編者)，基礎分子生物學：實用方法(Essential Molecular Biology：A Practical Approach)，卷1及2,IRL Press (1991)、D.M.Glover及B.D.Hames(編者)，DNA選殖：實用方法(DNA Cloning：A Practical Approach)，卷1-4,IRL Press(1995及1996)、及F.M.Ausubel等人(編者)，分子生物學目前方案(Current Protocols in Molecular Biology),Greene Pub.Associates及Wiley-Interscience(1988，包括直至目前之所有更新)、Ed Harlow及David Lane(編者)抗體：實驗室手冊(Antibodies：A Laboratory Manual),Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)、及J.E.Coligan等人(編者)免疫學目前方案(Current Protocols in Immunology),John Wiley & Sons(包括直至目前之所有更新)。
在本說明書通篇中，除非另外具體陳述或上下文另外需要，否則提及單一步驟、物質之組成物、步驟之群或物質組成物之群將視為涵蓋彼等步驟、物質組成物、步驟之群或物質組成物之群中的一者及多者(亦即一或多者)。因此，如本文所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一種/一個(a/an)」及「該(the)」包括複數態樣。舉例而言，提及「一種/一個(a)」包括單個以及兩個或超過兩個；提及「一種/一個(an)」包括單個以及兩個或兩個以上；提及「該」包括單個以及兩個或兩個以上等。
除非另外具體陳述，否則本文所描述的本發明之各實例可在細節上作必要的修改之後應用於其他實例中之各者及每一者。
熟習此項技術者將瞭解，本文中之本發明除具體描述之彼等外允許進行變型及修改。應理解本發明包括所有該等變型及修改。本發明亦包括在本說明書中單獨或共同地提及或指示之所有步驟、特徵、組成物及化合物，及該等步驟或特徵之任何及所有組合或任何兩者或兩者以上。
本發明不限於本文所描述之特定實例的範疇，該等特定實例僅欲出於範例之目的。如本文所描述，功能等效之產物、組成物及方法明確處於本發明之範疇內。
術語「及/或」(例如「X及/或Y」)應理解為意謂「X及Y」或「X或 Y」，且應視為提供對兩種含義或任一含義的明確支持。此外，在倒數第二及最後特徵之間包括片語「及/或」的列表或特徵意謂所列特徵中之任何一或多者可以任何組合形式存在。
在本說明書通篇中，詞語「包含」或變型(comprise/comprises/comprising)應理解為暗示包涵所陳述之要素、整數或步驟、或要素、整數或步驟之群，但不排除任何其他元素、整數或步驟、或元件、整數或步驟之群。
術語「在非哺乳動物宿主細胞培養萃取物或均質物內含有」理解為提及自本發明之宿主細胞製備的細胞培養萃取物或均質物已由編碼三螺旋蛋白質序列之構築體轉染或轉化。
術語「植物」包括整個植物、無性結構(例如葉片、莖、根)、開花器官/結構、種子(包括胚芽、內胚乳及種衣)、植物組織(例如脈管組織、地面組織及其類似組織)、細胞及其後代。
「熱穩定」意謂三螺旋蛋白質(或蛋白質之三螺旋部分)在所給定之溫度下維持其三維結構的程度。根據本發明之方法允許三螺旋結構以所容許之程度不穩定，然而，較佳至少70%之三螺旋蛋白質維持三維三螺旋形式。
如本文所用之術語「三螺旋蛋白質」理解為提及如本文所描述包含至少一個區(在本文中視上下文而定稱為「三螺旋結構域」或「膠原蛋白狀結構域」)的同源三聚、嵌合或異源三聚蛋白質。術語「三螺旋蛋白質」亦包括如本文所提及之「膠原蛋白狀(CL)蛋白質」。該術語涵蓋三螺旋蛋白質之變異體及片段及其功能等效物及衍生物，其較佳均保留至少一個結構或功能性特徵或三螺旋或膠原蛋白狀蛋白質(亦即Gly X Y)n序列。本發明之三螺旋蛋白質理解為對蛋白水解穩定的。三螺旋蛋白質亦可包括對經選擇用於移除宿主蛋白質之蛋白酶酵素為蛋白水解穩定的額外非三螺旋蛋白質序列及/或天然或藉由設計以對該酵素為蛋白水解穩定的非三螺旋插入序列。
如本文所用，術語「膠原蛋白狀(CL)」係指多肽包含Gly-X-Y三聯體，其中X及Y可為任何胺基酸。本發明之絲蛋白以及天然產生之細菌膠原蛋白亦包括在術語「膠原蛋白狀」內。本發明之膠原蛋白狀絲蛋白不具有任何羥脯胺酸。在一個實例中，膠原蛋白狀絲蛋白包含至少約40個，更佳至少約50個Gly-X-Y三聯體。此外，在另一個實例中，Gly-X-Y三聯體構成蛋白質之主要胺基酸序列的至少約40%，更佳至少約50%。在另一個實例中，膠原蛋白狀絲多肽具有或在適合之條件下能夠形成三螺旋結構。此外，應理解包括在重組型三螺旋蛋白質中之任何插入序列或連接子均對蛋白酶具有耐受性。
術語「三螺旋結構域」或「膠原蛋白狀結構域」係指包含肽通式(Gly X Y)n之蛋白質，其中Gly為甘胺酸，X及Y表示相同或不同之胺基酸(其具體情況可在不同Gly X Y三聯體之範圍內變化)，其中n可在5與600之間。三螺旋結構域由三個鏈組成，該等鏈之特徵在於摺疊為三螺旋蛋白質構形之重複(Gly X Y)n基元。
如本文所用，術語「三螺旋形成結構域」或「膠原蛋白狀形成結構域」係指編碼包含(Gly-X-Y)n基元之胺基酸序列的核苷酸序列，其中X及Y為任何其他胺基酸殘基，該(Gly-X-Y)n基元能夠摺疊或與其他兩個鏈締合以形成三螺旋。
術語「同源三聚」係指三螺旋蛋白質及/或其三螺旋結構域所含有的三螺旋之所有三個鏈均相同。
術語「異源三聚」係指三螺旋蛋白質及/或其三螺旋結構域含有至少兩個不同的形成三螺旋之鏈。
如本文所用之術語「培養」係指在介質中繁殖宿主細胞以使之生長及所有繼代培養物。
如本文所用之術語「宿主細胞培養萃取物」意欲指其中三螺旋蛋白質 分泌至培養基中的宿主細胞培養物。宿主細胞培養萃取物可包括例如其中生長有用三螺旋蛋白質轉化/轉染/轉導之宿主細胞的濃縮細胞培養基。如本文所描述，可自所分泌性之三螺旋蛋白質中移除或分離完整宿主細胞。
如本文所用之術語「宿主細胞培養均質物」意欲指其中三螺旋蛋白質保留在宿主細胞內且藉由破裂或萃取製程而釋放的宿主細胞培養物。因此，在本發明之上下文中，均質物意謂細胞已經破壞，以使得宿主細胞培養均質物包含破裂宿主細胞及已自該破裂細胞釋放之三螺旋蛋白質。
如本文所用之術語「構築體」係指含有用於編碼三螺旋形成結構域之DNA序列的表現卡匣。構築體可進一步包括V結構域及組胺酸標記。該術語亦延伸至可表現存在於表現卡匣中之DNA的載體。DNA在功能上與能夠影響其表現之其他序列(例如啟動子序列)相關。一般而言，通常用於重組型DNA技術中之表現載體呈「質體」形式。
如本文所用之術語「片段」係指天然胺基酸或核苷酸遺傳序列，且特定言之三螺旋蛋白質之功能衍生物的一部分。
如本文所用之術語「變異體」係指缺失、插入或取代有不同核苷酸以產生編碼相同或功能上等效多肽之多核苷酸的序列。
術語「純化」意欲意謂藉由本文所描述之蛋白質純化製程而使三螺旋蛋白質變得實質上不含其他蛋白質(例如特定宿主細胞蛋白質)或污染劑。蛋白質可能變得實質上不含其他蛋白質或污染劑(例如至少約70%或75%或80%或85%或90%或95%或96%或97%或98%或99%不含其他蛋白質或污染劑)。
本發明之實施方式
本發明之方法可用於純化來自非哺乳動物宿主細胞中之任何來源的任何重組產生之三螺旋蛋白質。
三螺旋序列
適用於本發明之方法的重組型三螺旋蛋白質序列適用作生物材料，用於製造之材料、化妝品或食物添加劑。編碼三螺旋蛋白質之序列由一或多個三螺旋形成或膠原蛋白狀(CL)形成結構域構成，其中各CL結構域視情況由非膠原蛋白狀耐蛋白酶性插入區分隔。插入區可經調適以用於模擬在許多人類膠原蛋白內發現的三螺旋結構中之天然間斷，或可提供所需生物學功能(例如細胞/組織結合(例如肝素或整合素)、蛋白酶分裂位點等)。插入區可出現在重組型三螺旋序列之個別CL結構域之間或一個CL結構域內。為確保重組型蛋白質之三螺旋區的恰當摺疊，在轉譯之後，球狀摺疊結構域較佳插入在重組型構築體之N末端或C末端處。此球狀摺疊結構域可在後續蛋白酶消化步驟期間移除。
在一個實例中，適用於本發明之方法的三螺旋序列可重組地來源於在病原性或非病原性細菌生物體中發現之天然三螺旋蛋白質。舉例而言，已顯示來自化膿性鏈球菌(Scl1或Scl2)之細菌膠原蛋白狀蛋白質在不該等經轉譯後修飾以形成羥脯胺酸的情況下形成穩定三螺旋結構。在另一個實例中，腸出血性大腸桿菌O157：H7菌株之基因組序列顯示多個具有不存在於常見實驗室菌株K-12中之膠原蛋白狀序列的開放讀碼框架(Ghosh N等人(2012)PLoS one e37872)。
可重組產生的天然產生之細菌膠原蛋白狀蛋白質的替代性來源可在甲基桿菌4-46、Solibacterusitatus、equiScIC鏈球菌、炭疽芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、產氣莢膜芽胞梭菌、沼澤紅假單胞菌、嗜肺性退伍軍人桿菌及肺炎鏈球菌A中找到。相應地，本發明延伸至自該等來源獲得之序列或其片段。
在另一個實例中，三螺旋蛋白質為包含分隔各三螺旋結構域之插入序列的重組型蛋白質，其中該插入序列為對蛋白水解穩定的約1至50個亞胺基酸或胺基酸之非膠原蛋白肽序列。此等序列提供適用於所得生物材料、化妝品、食物添加劑或其他產品(例如用於生產)的一些生物學功能。
三螺旋蛋白質之所需生物學功能可來源於促進三螺旋蛋白質與靶向細胞型之結合或以其他方式在身體中提供用於降解之天然分裂位點的序列。結合序列可包括來自I型膠原蛋白之整合素結合序列(GERGFPGERGVE)及/或來自乙醯膽鹼酯酶之膠原蛋白尾部的肝素結合序列之一(GRPGKRGKQGQK)。分裂序列可包括(但不限於)基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase；MMP)結構域之家族內的一或多個序列，例如分裂I型、II型及III型膠原蛋白之MMP-I、MMP-2、MMP-8、MMP-13及MMP-18、以及分裂變性之膠原蛋白的MMP-2及MMP-9。插入序列亦可包括上述結合或分裂序列之部分序列。
本發明亦涵蓋已知達成該等功能之其他序列。該等序列可以4、5、6或8個三肽重複單元之形式提供，其中最佳分裂為(但不限於)可能之5或6個三肽序列。
使用重組技術允許引入賦予更大穩定性(諸如電荷對中之變化)的特定穩定三螺旋基元序列，或影響蛋白質變性溫度或π(其隨後影響其可用於藥物之程度)的序列。
功能性結構域可插入在一個三螺旋形成結構域內或在連續三螺旋形成結構域之間。另外，可添加一個以上功能性結構域，其可包括一個三螺旋結構域內之多個重複序列或跨越若干重複三螺旋結構域(可包括相同或不同功能)之重複序列。類似地，多個功能性重複序列可包括在三螺旋結構域重複之間，或為可使用序列內及序列之間的插入序列而達成的更複雜之組合。總之，所有此等方法允許設計及操控所表現之三螺旋蛋白質以提供可提供增強型生物醫學產品的特定生物學功能。
在另一個實例中，在本發明中亦涵蓋嵌合三螺旋蛋白質。舉例而言，在兩個或兩個以上不同細菌序列之間、在兩個或兩個以上動物之間或在動物與非動物(例如細菌)序列之間的嵌合體可容易地藉由選擇來源於同在 載體中之各種同源結構域的特定序列來改造，以促使嵌合三螺旋蛋白質之表現。
由本發明所涵蓋且可重組表現之其他三螺旋蛋白質包括Clq、乙醯膽鹼酯酶、巨噬細胞清道夫受體、肺界面活性蛋白質、甘露糖結合蛋白、休眠蛋白質、足絲貽貝、外異蛋白A及神經膠質蛋白、或其片段。
宿主細胞
本發明之宿主細胞為任何便利之非動物細胞，包括細菌、酵母及植物來源之細胞。本發明之宿主細胞可為能夠表現三螺旋或膠原蛋白狀蛋白質的天然產生之生物體或突變生物體。在一個實例中，宿主生物體為已使用重組型DNA技術用異源DNA序列(該序列編碼產生三螺旋蛋白質)轉化的生物體或其後代。
三螺旋序列之表現
用於重組型三螺旋蛋白質之表現構築體可藉由此項技術已知之任何便利方法引入宿主細胞中。
表現重組型三螺旋蛋白質之方法包括此項技術中一般已知的標準表現方法，諸如描述於分子選殖(Molecular Cloning)(Sambrook及Russell(2001))中之彼等方法。
用於產生三螺旋蛋白質之表現系統描述於例如US 20120116053中。
畢赤酵母之轉化、陽性轉化體選擇及培養方法揭示於例如美國專利第4,837,148號；第4,855,231號；第4882,279號；第4929,555號；第5,122,465號；第5,324,639號；第5,593,859號及第6,472,171號中。
產生三螺旋蛋白質之方法為此項技術中已知的且描述於例如US 20120282817、EP1809751及WO 2012/117406中。
用於產生三螺旋蛋白質之表現系統描述於例如US 20120116053中。
所表現之三螺旋蛋白質的回收
可藉由此項技術中已知之技術來採集/收集表現後培養之細胞。在一個實例中，藉由離心來採集細胞且再懸浮於適合之介質中以獲得醱酵液/溶液(亦即細胞培養萃取物)或均質物。
回收所表現之重組型三螺旋蛋白質的準確方法將視宿主細胞及表現構築體而定。在微生物宿主細胞中，三螺旋蛋白質將在宿主細胞之細胞壁內捕獲，即使其已輸送至細胞質外亦如此。在此情況下，破壞宿主細胞以回收三螺旋蛋白質。或者，可移除或削弱細胞壁以釋放定位於胞外質中之蛋白質。破壞可藉由此項技術中已知之任何手段來實現，包括音波處理微流體化、在法式壓碎器或相似設備中裂解、藉由與玻璃珠一起劇烈攪拌/研磨來破壞、使滲透易碎性突變酵母菌株裂解或酵素處理。在其中藉由裂解或破壞重組型宿主細胞來回收三螺旋蛋白質的情況下，裂解或破壞典型地在具有足夠離子強度之緩衝劑中進行以允許三螺旋蛋白質保持可溶形式。該等機械及酵素破壞方法將產生亞細胞片段，該等片段可藉由離心或藉由過濾來移除以獲得均質物。
若三螺旋蛋白質在細胞外(亦即以可溶性分泌蛋白質形式)產生，則仍需要自細胞上澄液移除細胞。澄清一般藉由離心來實現，但亦可藉由沈降及/或過濾來實現。
三螺旋蛋白質之純化
含有可溶性重組型三螺旋蛋白質之培養液/溶液(例如細胞培養萃取物)或均質物隨後根據本發明之方法經受酸性沈澱步驟。此藉由添加調整培養液(both)/溶液或均質物之pH值的酸性溶液來達成。酸性溶液可為任何弱酸或強酸或兩者之混合物。鹽酸、硫酸、乙酸、甲酸及乳酸均為適合的。不同於用於使膠原蛋白膨脹及溶解的含天然膠原蛋白之哺乳動物組織材料之預先酸性處理，已發現在本發明之方法中採用的酸化步驟使污染性宿主細胞蛋白質沈澱出來但仍將三螺旋蛋白質保持在溶液中。此外，酸化步驟不 使三螺旋蛋白質變性。相應地，該方法表示用於自可溶性三螺旋蛋白質有效分離宿主細胞污染物的便利製程。
酸性溶液可以濃溶液形式添加。酸化可在4℃之溫度下進行，但視構築體而定，高達30℃之溫度亦為可能的。最適當之溫度將視已由所選擇之核苷酸序列形成之三螺旋蛋白質的熔點溫度而定。使用比三螺旋蛋白質之熔點溫度(Tm)低的溫度(較佳比Tm低至少10℃或更多)將確保三螺旋不變性。舉例而言，在pH值2.2處，構築體長度為234個Gly-Xaa-Yaa基元之化膿性鏈球菌的Tm為25.7℃，構築體長度為147個胺基酸之甲基桿菌4-46的Tm為28.3℃，構築體長度為189個胺基酸之產氣莢膜芽胞梭菌的Tm為37.2℃。
酸性條件之pH值將視所選擇之宿主系統的情況及用於產生膠原蛋白狀蛋白質之序列的情況而變化。若使用細菌宿主細胞(諸如大腸桿菌)，則pH值較佳介於2與3之間。若使用酵母宿主細胞，則pH值較佳為4至6。若使用植物宿主細胞，則pH值較佳為2至5。
酸性沈澱步驟之後為移除易受蛋白酶消化影響之宿主細胞蛋白質的消化步驟。三螺旋蛋白質保持對蛋白酶之耐受性。在一個實例中，消化步驟使用酸性蛋白酶來進行。適用於根據本發明之方法的酸性蛋白酶之實例包括胃蛋白酶、番木瓜蛋白酶、番木瓜蛋白酶狀酵素(諸如鳳梨蛋白酶、無花果蛋白酶或奇異果蛋白酶)、或佐氏麯黴酸性蛋白酶。視所採用之蛋白酶而定，可必需將調節pH值(例如對諸如番木瓜蛋白酶之蛋白酶)。熟習此項技術者將熟悉該等策略。若使用諸如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶之蛋白酶，則可必需將pH值調節至中性或甚至鹼性條件。
蛋白酶將許多污染性蛋白質消化為因分子量比完整可溶性重組型三螺旋蛋白質小得多而均可藉由透濾作用來移除之肽。隨後可收集所得重組型三螺旋蛋白質。藉助於透濾作用來收集具有濃縮重組型三螺旋蛋白質之附 加優勢。另外，在某些情況下，可藉由使三螺旋蛋白質沈澱，因而使該三螺旋蛋白質移出溶液來促進收集。藉由使重組型三螺旋蛋白質沈澱而收集可藉由添加調節離子強度(使用例如硫酸銨或氯化鈉)、藉由調節pH值、藉由調節溫度、或藉由添加聚合物(例如聚乙二醇)來達成。
視在本發明之步驟(i)中所採用之萃取方法而定，在酸性沈澱步驟與蛋白酶消化步驟之間包括中間物分離/純化步驟可為有益的，該純化步驟提供三螺旋蛋白質自所沈澱之宿主細胞物質的物理分離。宿主細胞物質可包括蛋白質及/或DNA。相應地，可採用任何粗物質分離製程以移除此等物質中之一者或兩者。該等製程對熟習此項技術者而言將為熟悉的。在一個實例中，該製程包括離心、(超)過濾、交叉流過濾及沈降。
精製
若需要將三螺旋蛋白質用於醫學用途，則較佳藉由精製純化來進一步純化經酸化及蛋白酶處理之產物，以達成大於90%之純度。根據本發明，任何精製純化均為適合的，包括例如凝膠過濾、疏水性、親和性或離子交換層析。儘管亦可使用其他沈澱步驟，但其一般不達成所需高純度。
穩定化
若使用經純化之三螺旋蛋白質作為生物醫學材料，則其必須能夠製成適當形式。三螺旋構築體可形成為海綿及薄片。為幫助達成此等形式，經純化之三螺旋蛋白質可在用於醫學應用中之前穩定化(如動物膠原蛋白之情況)，以在需要時改良其長期穩定性及機械強度。多種多樣適合之穩定化策略為可能的。戊二醛為用於交聯之適合試劑，且廣泛用於改良膠原蛋白物質之活體內穩定性。輻射為另一種物理穩定化技術。
根據本發明之方法而純化的三螺旋蛋白質可用於各種應用及程序，包括恢復、再生及美容程序、血管程序、成骨形成及軟骨形成程序、軟骨重構、移植骨替代物、止血、傷口處理及管理、組織強化及支撐、失禁等。
可自本發明之重組型蛋白質聚集產生的生物醫學產品之非限制性實例及其可能應用包括(但不限於)以下各者：可溶性重組型膠原蛋白，諸如用於真皮植入物、藥物載劑、醫學裝置塗層、植入物塗層(骨及血管)、形狀形成物質、黏性手術(viscosurgery)、血管封閉劑、化妝品；海綿狀物質，諸如用於三維細胞培養物、組織及器官改造、止血劑及傷口療法(人工皮膚及傷口塗劑)；纖維，諸如用於手術縫合及止血劑；凝膠狀物質，諸如用於組織植入物、角膜保護膜、隱形眼鏡及用於細胞培養之基質；及膜狀物質，諸如用於抗黏附膜、藥物輸送系統、人工皮膚及其類似物。
熟習此項技術者應瞭解，可在不背離本發明之廣泛一般範疇的情況下進行上述具體實例之大量變型及/或修改。因此，本發明之具體實例在所有方面中視為說明性而非限制性的。
實施例
以下實施例1-11描述可根據本文所描述之方法而純化的不同三螺旋構築體。
實施例
實施例1-來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2片段的DNA
自國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)資料庫(美國國家衛生研究院(National institutes of Health),Bethesda,MD 20894,USA)中提供之資料獲得用於編碼Scl2.28蛋白質之組合球狀及膠原蛋白狀部分但缺少C末端附接結構域的scl2.28對偶基因之片段(Q8RLX7)的DNA序列，作為記錄GenBank：AY069936.1。向此序列中在序列之N末端處引入His6標記，且在N末端球狀結構域(V)與以下(Gly-Xaa-Yaa)n膠原蛋白狀結構域(CL)序列之間插入凝血酶/胰蛋白酶分裂序列LVPRGSP(SEQ ID NO：1)。在CL結構域之C末端處包括三聯體序列GKY，繼而包括終止密碼子以及NdeI及BamHI選殖位點。商業上在不進行任何密碼子最佳化的情況 下合成用於此設計之DNA。SEQ ID NO：2為最終構築體。
DNA及蛋白質序列：(SEQ ID NO：2及3)
實施例2：來自化膿性鏈球菌之膠原蛋白Scl2的CL結構域之細菌膠原蛋白二聚體的DNA
用於來自包含球狀及膠原蛋白狀部分但缺少C末端附接結構域之化膿性鏈球菌的scl2.28對偶基因之片段的DNA序列如實施例1中所描述。其亦包括額外之N末端His6標記序列、在N末端球狀結構域(V)與以下 (Gly-Xaa-Yaa)n膠原蛋白狀結構域(CL)序列之間的凝血酶/胰蛋白酶分裂序列LVPRGSP(SEQ ID NO：1)，在CL結構域之C末端處包括三聯體序列GKY，繼而包括終止密碼子。使用定點突變誘發(Site Directed Mutagenesis)在CL結構域開端處使用以下寡核苷酸來在Scl2基因中添加含有插入序列GAAGVM(SEQ ID NO：4)之第二構築體：5' ACGCGGTAGTCCCGGGGCAGCGGGTGTTATGGGGCCCAGAGG 3'正向(SEQ ID NO：5)及3' CCTCTGGGCCCCATAACACCCGCTGCCCCGGGACTACCGCGT 5'反向(SEQ ID NO：6)
隨後用5'SmaI(平端)及3'SspI(平端)消化含有GAAGVM插入序列之此第二構築體。此經消化之插入序列隨後次選殖回原Scl2基因在原(實施例1)構築體末端之SmaI位點處。最終序列構築體以SEQ ID NO：7顯示。因為插入序列以平端片段形式選殖，所以選擇菌落，在1×YT中生長，且進行中量製備以選擇包括額外之序列及此第二序列正確定向的無性繁殖系。
DNA及蛋白質序列：(SEQ ID NO：7及8)
實施例3：包括用於肝素結合之經取代功能性序列的來自化膿性鏈球菌 之細菌膠原蛋白Scl2的DNA
如實施例1中所給出，使用限制位點5'NdeI及3'BamHI來將Scl2基因選殖入梭形載體pSL1180中。此無性繁殖系隨後用於進行定點突變誘發以在序列內引入新結合基元。使用3個依序定點突變誘發之PCR反應來在Scl2基因之鹼基對561處添加肝素結合序列(GRPGKRGKQGQK；SEQ ID NO：9)，因為肝素插入序列為12個胺基酸且圍繞插入位點之序列重複極多。對第一反應，使用以下寡核苷酸：5' TGAAGCTGGTGCTCAAGGCAGGCCGGGTCCAATGGGTCCTGCTG 3'正向(SEQ ID NO：10)及3' CAGCAGGACCCATTGGACCGGCCTGCCTTGAGCACCAGCTTCA 5'反向(SEQ ID NO：11)
對第二反應，使用以下寡核苷酸：5' CAAGGCAGGCCGGGTAAGCGGGGTCCTGCTGGTGAGCG 3'正向(SEQ ID NO：12)及3' CGCTCACCAGCAGGACCCCGCTTACCCGGCCTGCCTTG 5'反向(SEQ ID NO：13)
對第三反應，使用以下寡核苷酸：5' CCGGGTAAGCGGGGTAAACAGGGCCAGAAGGGTGAAAAAGGAGAACCTGG 3'(SEQ ID NO：14)及3' CCAGGTTCTCCTTTTTCACCCTTCTGGCCCTGTTTACCCCGCTTACCCGG 5'(SEQ ID NO：15)
用酵素DpnI處理PCR產物以確保所有親本DNA經消化，且隨後轉化 至大腸桿菌宿主菌株XLI-BLUE中。最終序列構築體以SEQ ID No 16描述。選擇菌落，在抗生素選擇性介質中生長，且進行Qiagen小量製備。識別含有所引入之肝素位點的無性繁殖系且儲存在-20℃下。
DNA及蛋白質序列：(SEQ No：16及17)
實施例4：包括用於整合素結合之經取代功能性序列的來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2的DNA
如實施例1中所給出，使用限制位點5'NdeI及3'BamHI來將Scl2基因 選殖入梭形載體pSL1180中。此無性繁殖系隨後用於進行定點突變誘發以在序列內引入新結合基元。藉助於PCR導引之整合使用兩個依序步驟來在Scl2基因之鹼基對705處添加整合素結合序列(GERGFPGERGVE；SEQ ID NO：18)。用於步驟1之寡核苷酸為：5' GGAAAAGATGGTGAACGTGGTTTCCCGGGTCCAGGTGGTAAGGACC 3'正向(SEQ ID NO：19)及3' CGTCCTTACCAGCTGGACCCGGGAAACCACGTTCACCATCTTTTCC5'反向(SEQ ID NO：20)
用於步驟2之寡核苷酸為：5' GAACGTGGTTTCCCGGGTGAGAGGGGCGTCGAGGGCCAAAACGGCCAAGAT 3'正向(SEQ ID NO：21)及3' ATCTTGGCCGTTTTGGCCCTCGACGCCCCTCTCACCCGGGAAACCACGTTC 5'反向(SEQ ID NO：22)
用酵素DpnI處理PCR產物以確保所有親本DNA經消化，且隨後轉化至大腸桿菌宿主菌株XLI-BLUE中。最終序列構築體以SEQ ID No 23描述。選擇菌落，在抗生素選擇性介質中生長，且進行Qiagen小量製備。識別含有所引入之整合素位點的無性繁殖系且儲存在-20℃下。
DNA及蛋白質序列：(SEQ ID NO：23及24)
實施例5：包括用於肝素及整合素結合兩者之經取代功能性序列的來自化膿性鏈球菌之細菌膠原蛋白Scl2的DNA
使用如實施例3中所描述的含有引入之肝素結合位點的Scl2基因。使用如實施例4中所描述之寡核苷酸使經選擇的含有確定引入之肝素位點的無性繁殖系經受第二輪定點突變誘發，以在Scl2基因之鹼基對705處引入整合素結合域(GERGFPGERGVE；SEQ ID NO：18)。用酵素DpnI處理PCR產物以確保所有親本DNA經消化，且隨後轉化至大腸桿菌宿主菌株 XLI-BLUE中。最終序列構築體以SEQ ID No 25描述。選擇菌落，在抗生素選擇性介質中生長，且進行Qiagen小量製備。識別含有所引入之整合素位點以及肝素結合位點的無性繁殖系且儲存在-20℃下。
DNA及蛋白質序列：(SEQ ID NO：25及26)
實施例6：使用來自沼澤紅假單胞菌之V結構域的來自Solibacter usitatus之細菌膠原蛋白的DNA
自國家生物技術資訊中心資料庫(美國國家衛生研究院，Bethesda,MD 20894,USA)中提供之資料獲得用於來自候選種Candidatus Soiibacterusitatus Ellin6076之含三螺旋重複序列之膠原蛋白的DNA序列，作為記錄ABJ82342。自在國家生物技術資訊中心資料庫(美國國家衛生研究院，Bethesda,MD 20894，美國)中提供之資料獲得用於來自沼澤紅假單胞菌V結構域的DNA序列，作為YP_001993084。將蛋白質序列轉譯成標稱DNA序列，且複合基因經設計以維持正確編碼構架，其中為Met啟動信號，繼而為來自S.usitatus之CL結構域，隨後為來自沼澤紅假單胞菌之V結構域，繼而最後為C末端His6標記及終端密碼子。為5'以NdeI及EcoRI形式添加編碼序列外之末端限制位點，而為3'以SalI及HindIII形式添加。用在使所需宿主系統大腸桿菌之表現達到最佳的同時保留原胺基酸序列的DNA序列來合成此構築體(GeneArt® Gene Synthesis,Regensburg,Germany)。最終序列構築體以SEQ ID NO：27描述。
DNA及蛋白質序列：(SEQ ID No：27及28)
實施例7：來自鋸蜂(少孢絲角葉蜂)基因A之昆蟲膠原蛋白的DNA
如先前所述(US 61/615745)，自所報告之A型鏈序列(A279)獲得來自少孢絲角葉蜂絲腺之三螺旋膠原蛋白狀實體的DNA。合成基因構築體(GeneArt® Gene Synthesis,Regensburg,Germany)，該基因構築體包括NdeI及EcoRI限制位點，且具有在使所需宿主系統大腸桿菌之表現達到最佳的同時保留原胺基酸序列的引入之保守鹼基取代。
最終序列構築體以SEQ No：29描述。
DNA及蛋白質序列：(SEQ ID No：29及30)
SF21(A279)-鋸蜂膠原蛋白A型基因
實施例8：用於人類III型膠原蛋白之3個重複片段的DNA
PCR反應之模板係基於cDNA Clone MGC：39848(影像5405119)(ATCC,Manassas,VA)，其含有人類COL3A1基因且引入有不改變胺基酸序列但減少第二結構形成之可能性的有限鹼基變化。
藉由電泳來分離PCR產物，且使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen)來萃取所切除之條帶。
用於PCR生成三個用於選殖之分離片段的寡核苷酸為：
(SEQ ID No：31)
(SEQ ID No：32)
(SEQ ID No：33)
(SEQ ID No：34)
(SEQ ID No：35)
(SEQ ID No：36)
使PCR片段經受成對限制酶消化(EcoRI及XmaI、XmaI及BamHI、BamHI 及SaclI)，且藉由自瓊脂糖凝膠萃取來純化片段。
與在載體YepFIagl(Eastman Kodak/IBI,New Haven,CT)中依序接合結合來達成三個重複DNA片段之產生。使用適當酵素製備載體DNA。經純化之PCR片段接合至依序載體構築體中，各載體構築體之比為3莫耳插入序列與1莫耳載體。接合混合物用於使用標準程序來轉化大腸桿菌。大腸桿菌菌株XL1 Blue(Stratagene,La Jolla,CA)常規用於質體之維持、繁殖及轉化。若需要則可自此載體分離各別DNA。最終序列構築體以SEQ ID NO：37顯示。
DNA及蛋白質序列：(SEQ No：37及38)
FLAG肽EcoRI
實施例9：用於人類I型α 1鏈CB3片段之DNA
自國家生物技術資訊中心資料庫(美國國家衛生研究院，Bethesda,MD 20894,USA)中提供之資料獲得用於人類I型膠原蛋白α 1鏈之CB3片段的DNA序列，作為記錄#GenBank：Z74615.1。藉由添加C末端His6標記及終端密碼子來修飾序列，且添加有5'NdeI及3'EcoRI及HindIII限制位點，使構築體適合於插入在pCold IV載體中。自此DNA產生之三螺旋蛋白質的穩定性意謂所有操作必須在4℃下進行。合成構築體(GeneArt® Gene Synthesis,Regensburg,Germany)，該構築體具有在使所需宿主系統大腸桿菌之表現達到最佳的同時保留原胺基酸序列的保守取代。
最終序列構築體以SEQ ID NO：39描述。
DNA及蛋白質序列：(SEQ ID NO：39及40)
實施例10：用於由來自人類膠原蛋白I型及III型鏈之片段製得之嵌合體的DNA
在產生嵌合DNA中使用具有ATCC寄存編號95498之人類膠原蛋白I型α I c-DNA及具有ATCC寄存編號95502之人類膠原蛋白III型α I c-DNA。
最初，使用熱休克方法在42℃下將編碼膠原蛋白I及III基因之10ng c-DNA轉化至50μl大腸桿菌宿主菌株中。回收對安比西林(ampicillin)具有耐受性之菌落且在150ml YT介質中生長隔夜。
進行親本無性繁殖系之限制消化，且隨後在1%瓊脂糖凝膠電泳上分 析，且分離及純化膠原蛋白條帶。使用T4 DNA接合酶套組(Invitrogen)來接合載體與經純化之插入製劑。隨後將連接反應混合物轉化至Top10細胞中且接種在安比西林選擇性介質上。使用菌落PCR來偵測含有經改造之嵌合體的無性繁殖系。在1%瓊脂糖電泳上分析含有經潛在改造之無性繁殖系的PCR產物。4.5kb膠原蛋白I基因插入序列使用限制位點XbaI(5')及SspI(3')次選殖自其親本載體pUC19，且使用位點XbaI(5')及SmaI(3')選殖入細菌梭形載體pBluescript II KS+(Stratagene)中。此選殖允許膠原蛋白I中鹼基對2929-2934處之內部BamHI位點充當此載體中之獨特位點。構造膠原蛋白I(N及C)末端之兩個截斷。N末端截斷含有選殖入pBluescript IIKS+中位點XbaI(5')及BamHI(3')處的2.7kb膠原蛋白片段，而大小為1.8kb之C末端截斷使用限制位點BamHI(5')及HindIII(3')次選殖入梭形載體pUC19中。在C末端截斷中，使用QuickChange II定點突變誘發套組(Invitrogen)在C尾肽之鹼基對3706-3711處引入NaeI限制位點(靜默突變)。A在膠原蛋白I終止密碼子之後直接添加HincII位點(GTCAAC)以易於將全長嵌合體選殖入載體系統中。在N末端截斷中，使用PCR來上啟動甲硫胺酸殘基上游引入克紮克序列(克紮克序列)。剪接重疊PCR用於使膠原蛋白I α螺旋區與膠原蛋白III α螺旋區互換。跨越Coll I α螺旋之鹼基對3288-3711的重疊與Coll III α螺旋之殘基3283-3708的重疊互換。5'重疊寡核苷酸含有所引入之BamHI位點，而3'寡核苷酸含有所引入之NaeI位點。PCR產物使用零平端TOPO PCR選殖套組(英維羅根)選殖入pTOPO載體中。重疊自具有BamHI(5')及NaeI(3')之pTOPO消化，且與在pUC19中含有所引入之Nael位點的膠原蛋白I野生型(wild type；WT)C末端無性繁殖系互換。使用N末端截斷之構築體上的缺失突變誘發來進行N-原肽自膠原蛋白I殘基193-609之移除。隨後將基因選殖入膠原蛋白之C末端次片段中以產生缺少N-原肽之全長基因。最終序列由SEQ No：41表示。
DNA序列：SEQ ID NO：41
實施例11：用於不同細菌膠原蛋白鏈(其中存在之兩個不同膠原蛋白狀成分來自甲基桿菌及S.usitatus)之嵌合體的DNA
自國家生物技術資訊中心資料庫(美國國家衛生研究院，Bethesda,MD 20894,USA)中提供之資料獲得來自候選種Candidatus Soiibacterusitatus Ellin6076及甲基桿菌之含三螺旋重複序列之膠原蛋白的DNA序列，S.usitatus作為記錄ABJ82342而甲基桿菌作為記錄ACA18713.1。
將蛋白質序列轉譯成標稱DNA序列，且複合基因經設計以維持正確編碼構架，其中為Met啟動信號，繼而為來自甲基桿菌之V及CL結構域，繼 而為來自S.usitatus之CL結構域，繼而最後為終端密碼子。為5'以NdeI及EcoRI形式添加編碼序列外之末端限制位點，而為3'以SalI及HindIII形式添加。此構築體隨後就宿主系統中之表現而進行最佳化，且與在使所需宿主系統大腸桿菌之表現達到最佳的同時保留原胺基酸序列的DNA序列一起合成(GeneArt® Gene Synthesis,Regensburg,Germany)。
最終序列以SEQ ID NO：42描述。
DNA序列：SEQ ID NO 42及43
實施例12-17描述若干不同構築體之不同表現宿主細胞系統。
實施例12：三螺旋蛋白質之DNA構築體的表現
前述例如SEQ ID NO：2、6、14、20、21之DNA構造中的任一者可選殖入大腸桿菌中且根據以下方法製得為表現三螺旋蛋白質。
使用獨特位點5'NdeI及3'BamHI來將DNA序列次選殖入大腸桿菌表現載體系統pColdIII中。隨後使用PCR菌落篩檢技術來偵測陽性無性繁殖系。此等無性繁殖系在100ml培養體積中生長，且進行Qiagen中量製備以擴展載體數量。對表現而言，將所選擇之陽性無性繁殖系轉化入大腸桿菌宿主BL21-DE3中。在每公升含有16g胰化蛋白、10g酵母萃取物及5g NaCl之2×YT介質中生長細胞(亦可在一些情況下使用限定介質，諸如與SEQ ID No 2一起)。所用之限定介質(Defined medium；DM)每公升含有：KH2PO4，10.6g；(NH4)2HPO4，4g；檸檬酸，1.7g；葡萄糖，25g；MgSO4.7H2O，1.23g；安比西林(50μg/ml)，200mg；鹽酸硫胺，4.4mg；及痕量鹽溶液5mL。痕量鹽溶液每公升含有：CuSO4.5H2O，2.0g；NaI，0.08g；MnSO4.H2O，3.0g；Na2MoO4.2H2O，0.2g；硼酸，0.02g；CoCl2.6H2O，0.5g；ZnCl2，7g；FeSO4.7H2O，22g；CaSO4.2H2O，05g及H2SO4，1mL。視需要，葡萄糖、鎂、痕量鹽、 硫胺及安比西林在滅菌之後以濃儲備溶液之形式無菌地添加至介質中。
在37℃下生長細胞24小時，且A600處之細胞培養光學密度達到約3-6。培養物隨後在25℃下培育，且添加1mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以誘導蛋白質表現。在25℃下培育10小時之後，將溫度降低至15℃再培育14小時。在培育24小時之後，藉由離心採集細胞。
對CB3片段之SEQ ID NO：31構築體，在表現之後，將細胞在4℃下保持14小時，且亦在4℃(而非15℃)下進行所有後續加工。
實施例13：三螺旋蛋白質(來自S.usitatus之細菌膠原蛋白片段與來自沼澤紅假單胞菌之V結構域，使用大腸桿菌中之pET載體)之DNA構築體的表現
DNA視為如實施例6中所描述。複合基因使用5'EcoRI及3'HindIII位點選殖入pET21a載體中。在轉化入有效大腸桿菌宿主細胞系BL21 DE3之前進行無性繁殖系之定序。轉化之細胞接種在YT加安比西林培養板上且在37℃下生長隔夜。自此培養板選取單一菌落，且在YT加安比西林介質中於37℃下生長隔夜。
在連接至Biostat B(Sartorius Stedim Germany)控制系統之2L攪拌槽生物反應器中產生重組型細菌膠原蛋白。醱酵槽中之介質的初始體積為1.6L，且使用葡萄糖作為碳來源。向生物反應器中添加一定體積之第二接種培養物以獲得初始光學密度0.25(在600nm處量測)。藉助於自動添加10%(v/v)聚丙二醇2025來控制發泡；在接種之前添加3mL消泡劑溶液。pH值設定點為7.0，藉由自動添加10%(v/v)H3PO4或10%(v/v)NH3溶液來控制。溶解氧設定點為飽和之20%，且使用兩步級聯控制來將溶解氧維持在指定設定點以上。攪拌器速度介於500rpm至1200rpm之範圍內，而氣流(補充有5%純O2)介於0.3L/min至1.5L/min之範圍內。對高細胞密度饋入之物料製程而言，饋入溶液由其中添加有40mL 1M MgSO47H2O的400mL 660g/L葡萄 糖溶液組成。饋入流動速率為15毫升/小時，且在接種8.5小時之後開始饋入。個別實驗之培育時間及溫度視構築體、宿主細胞系統以及其他情況而變化。在接種24小時之後，將培養物冷卻(經20分鐘時間段)至必需溫度以活化載體之冷休克成分及藉由添加1mM IPTG(培養物中之最終濃度)來誘導之蛋白質表現。隨後藉由離心採集細胞。
實施例14：三螺旋蛋白質(鋸蜂絲膠原蛋白，使用大腸桿菌中之pCold載體)之DNA構築體的表現
在SEQ ID NO：23之鋸蜂DNA分離物中引入限制酶消化位點允許分離鋸蜂絲基因之DNA及將其插入表現載體中。鋸蜂膠原蛋白狀絲A型基因藉助於NdeI及EcoRI位點插入在pColdI載體中。使用PCR菌落篩檢技術來偵測陽性無性繁殖系。此等無性繁殖系在100ml培養體積中生長，且進行Qiagen中量製備以擴展載體數量。對表現而言，將所選擇之陽性無性繁殖系轉化至有效大腸桿菌BL21細胞中。對鋸蜂絲蛋白質基因之表現而言，想100ml啟動培養基(2×YT-Amp)中添加一個細胞菌落，且在37℃下在200rpm震盪的情況下培育隔夜。此培養隨後添加有100ml新製2×YT-2%葡萄糖-Amp，且用1mM IPTG在25℃下誘導10小時，隨後在20℃再持續16小時。藉由離心(3000×g持續30分鐘)採集細胞漿。蛋白質與細胞小球締合。
實施例15：三螺旋蛋白質(來自啤酒酵母中III型膠原蛋白之重複片段)之DNA構築體的表現
使用諸如實施例8中之DNA/載體(YepFlag1)藉由在啤酒酵母菌株BJ5462(α ura3-52 trp1 leu2_1 his3_200 pep4：：HIS3 prb_1.6R)(酵母遺傳儲備中心(Yeast Genetic Stock Center),Berkeley,CA)中電穿孔來進行酵母轉化，其中構築體包含α因子信號α前導序列/FLAG標記/三個重複膠原蛋白III片段之框架內融合體。將轉化體在充氣的情況下於28℃下在SDahl加Ura 介質上生長48小時。在選擇之後，將部分在非選擇性YPHSM介質(1%右旋糖、1%酵母萃取物、8%蛋白腖、3%甘油、20mM CaCl2)中稀釋且在28℃下在劇烈震盪下繼續生長96小時。藉由在12,000×g下離心20分鐘來移除細胞小球。FLAG之存在提供用於蛋白質識別之選項。
人類膠原蛋白I型及III型鏈之DNA構築體的表現可按照相同方法。
實施例16：三螺旋蛋白質(來自S.usitatus之細菌膠原蛋白片段與來自沼澤紅假單胞菌之V結構域，使用畢赤酵母)之DNA構築體的表現
如實施例6中所描述製備細菌膠原蛋白基因。視情況，基因可進一步就畢赤酵母表現而最佳化。基因構築體在大腸桿菌中組合。
在適當載體系統pA0815 HIS4中結合膠原蛋白基因構築體，以允許使基因構築體染色體整合至酵母宿主細胞巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)中。視情況可使用其他載體系統，諸如pA0815-SX HIS4、pPIC9 HIS4、pPICZZeoR、pPICZaZeoR、pBLADE-IX ADEI、pBLARG-IX ARG4、pBLARG-SX ARG4或pBLURA URA3。系統之特徵在於其中存在強構成性啟動子(GAP)及強誘導性啟動子(較佳AOXI-醇氧化酶)的甲基營養型表現。添加可用作單獨碳來源之甲醇允許簡單完全誘導。此系統使用插入基因之染色體整合，消除在醱酵期間連續選擇(例如抗生素)之需要。將包括膠原蛋白基因之載體pA0815與BamHI一起線性化。線性化質體藉由電穿孔轉化至巴斯德畢赤酵母中。各種畢赤酵母菌株(包括GSI15 his4)為適合的。轉化體選擇為用於表現膠原蛋白構築體之His+細胞。在震盪燒瓶中在pH值為5.0的具有甘油之基底鹽介質中生長所選擇之細胞。當獲得適當濕式細胞密度時，添加甲醇且再繼續醱酵72小時。
實施例17：三螺旋蛋白質(來自S.usitatus之細菌膠原蛋白片段與來自沼澤紅假單胞菌之V結構域，使用煙草短暫表現)之DNA構築體的表現
使用如實施例4中所描述的編碼來自S.usitatus之細菌膠原蛋白CL結構 域及來自沼澤紅假單胞菌之V結構域的合成基因，除了序列經最佳化以用於在煙草中表現及引入用於5'AgeI及3'XhoI的限制位點之外。基因為擴增及選殖入pENTR DTOPO中之PCR。隨後確認序列之完整性。pENTR DTOPO構築體經BspHI消化且經純化以移除耐康黴素性基因，因此允許在基因經LR clonase再結合入二元pEAQ-HT-DEST GATEWAY目標載體中之後進行康黴素之適當選擇(Sainsbury等人(2009)Plant Biotechnol J 7(7)：682-93)。二元質體轉化至且維持在農桿菌(A.tumefaciens)菌株LBA4404中。構築體在含有適當抗生素之LB介質中生長，直至達到生長停滯期。離心培養物，且將小球再懸浮於中包含10mM MES、10mM MgCl2、20mM乙醯丁香酮之滲浸介質中直至OD 600為0.5。在黑暗中於室溫下培育培養物4小時，隨後用注射器滲浸至生長至五葉階段之本生煙草(Nicotianabenthamiana)中(Sainsbury等人(2009)Plant Biotechnol J 7(7)：682-93)。在滲浸之後5天後採集葉片。
實施例18-32描述如圖1之流程圖中所示的本發明之純化步驟。
實施例18：使用音波處理來自細菌細胞(大腸桿菌)萃取三螺旋蛋白質
對萃取而言，將來源於例如上文之實施例12-17的各1公克細胞漿再懸浮於中20ml 50mM乙酸/HCl緩衝劑(pH值2)中，且藉由音波處理(使用Misonix S4000儀器用增強型輔助#1探針)在30A(儀器標度)持續5分鐘來使細胞爆裂。視情況，藉由離心(12,000×g持續60分鐘)來使細胞溶胞混合物澄清，且保留含有三螺旋蛋白質之透明上澄液。
實施例19：使用法式壓碎器來自細菌細胞(大腸桿菌)萃取三螺旋蛋白質
將來源於例如實施例12-17之冷凍細胞漿解凍且以1：10 w/w與50mM乙酸混合(pH值2)。使此混合物在700巴壓力下穿過Apv2000法國壓碎勻 漿器3次，在輪次之間另外冷卻1小時時間段。在加工之後，視情況藉由在12,000×g下離心60分鐘來澄清，且保留含有經萃取之三螺旋蛋白質的透明上澄液。
實施例20：自酵母細胞(釀酒酵母)萃取三螺旋蛋白質
將自酵母表現系統中之任一者獲得的細胞漿以每20ml斷裂緩衝劑1g細胞漿之比再懸浮於該緩衝劑(50mM磷酸鈉緩衝劑(pH值7.4)、0.5mM EDTA、2mM PMSF、5%甘油、0.1% Triton X-100)中，且添加相等體積之玻璃珠(Sigma Glass beads #G8772)。隨後將混合物渦旋(1400rpm)混合物30秒，再靜置30秒。再重複渦旋10×次。整個萃取製程均保持在5℃下。隨後在10,000×g下離心混合物1分鐘以收集可溶性萃取物。
實施例21：自植物葉片(煙草)萃取三螺旋蛋白質
將諸如來自實施例17(較佳已在-20℃下冷凍)之葉片材料以葉片與緩衝劑1：10 w/w之比放入20mM乙酸鈉緩衝劑(pH值4.5)中，且全速在瓦林摻合器(Waring Blender)中萃取。
實施例22：在表現及分泌或萃取之後驗證可溶性三螺旋蛋白質
藉由離心細胞物質繼而進行SDS-PAGE來確立在諸如實施例12-17中之表現及諸如實施例18-21中之萃取後之可溶性三螺旋蛋白質或如在實施例16中表現為可溶性產物之三螺旋蛋白質的存在。若在用於表現之構築體上存在任何標記(諸如His6標記或Flag標記)，則西方墨點法可與適當抗體(諸如與辣根過氧化酶結合之單株抗聚組胺酸)一起使用以偵測可溶性蛋白質。
實施例23：選擇用於沈澱細胞萃取物之pH值
如在實施例18-19中以機械方式萃取表現宿主細胞，且在所選擇之pH值下(介於pH值2與pH值8之間)培育萃取物。隨後視情況移除細胞碎片物質。隨後將經萃取之細胞溶胞物的樣本調節至沈澱pH值(其中以1pH值單位間隔或較佳地以0.5pH值單位間隔選擇各種pH值)，且將樣本在4℃ 下保持16小時。隨後藉由離心移除沈澱，且藉由在280處之吸收估計上澄液之蛋白質含量。如在實施例22中再次確認三螺旋構築體可溶性之保持。
實施例24：在保留可溶性三螺旋蛋白質的同時沈澱來自大腸桿菌之表現細胞宿主蛋白質
如在實施例1中的含有來自化膿性鏈球菌之可溶性膠原蛋白狀蛋白質的來自大腸桿菌之經萃取蛋白質在藉由離心萃取之後澄清，調節至pH值為2.2，在4℃下放置16小時以允許沈澱。隨後離心樣本30分鐘及15,000×g，且保留含有三螺旋蛋白質之上澄液。
實施例25：在保留來自人類III型膠原蛋白重複片段之可溶性三螺旋蛋白質的同時沈澱來自釀酒酵母之表現細胞宿主蛋白質
使用乙酸或NaOH溶液將含有可溶性三螺旋蛋白質之澄清上澄液調節至pH值為5.0，且在4℃下放置16小時。藉由離心(10,000×g持續30分鐘)移除所得沈澱，且保留上澄液。
實施例26：在保留來自S.usitatus之可溶性三螺旋蛋白質的同時沈澱來自煙草之表現細胞宿主蛋白質
使用乙酸或NaOH溶液將含有可溶性三螺旋蛋白質之澄清上澄液調節至pH值為4.5，且在4℃下放置16小時。藉由離心(10,000×g持續30分鐘)移除所得沈澱。隨後用乙酸及HCl調節上澄液至pH值為2.5，且再放置20小時。藉由離心(10,000×g持續30分鐘)來澄清溶液，且保留上澄液。
實施例27：消化沈澱後殘餘之可溶性宿主細胞污染物
根據以下條件中之任一者調節諸如上述實驗中的在移除酸性沈澱之蛋白質之後所獲得之上澄液。
．pH值2.5，且用胃蛋白酶(0.01mg/ml)在4℃下持續16小時，且隨後視情況藉由將消化物之pH值調節至pH值7來終止。
．pH值6.5及Na EDTA(50mM)及半胱胺酸(50mM)，且用番木瓜蛋白酶(0.01mg/ml)在4℃及pH值3.0下持續16小時，且用真菌酸性蛋白酶XIII型(0.01mg/ml)在4℃下持續16小時，且隨後視情況藉由將消化物之pH值調節至pH值7來終止。pH值8.0，且添加胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶(0.01mg/ml)在4℃持續16小時，且隨後視情況藉由將消化物之pH值調節至pH值4來終止。
以下實施例按照本發明之純化步驟且係關於蛋白質之收集、濃縮及可能之最終精製及純化。
實施例28：藉由硫酸銨沈澱來分離三螺旋蛋白質產物
將在如先前實施例中所論述藉由酸性沈澱移除雜質繼而進行蛋白酶處理之後的含有重組型三螺旋蛋白質之部分合併，且將溶液之pH值調節至pH值4.0至7.0，且經由添加固體硫酸銨來沈澱三螺旋蛋白質。所有步驟均在小於三螺旋之熔化溫度的溫度下，較佳在4℃下進行。在沈澱必需之固體硫酸銨量之後離心樣本，視覺檢查沈澱，且藉由SDS-PAGE分析。對較小非動物膠原蛋白(諸如來自化膿性鏈球菌)，需要35%飽和硫酸銨。
實施例29：藉由聚合物沈澱來分離三螺旋蛋白質產物
將在如先前實驗中所論述藉由酸性沈澱移除雜質繼而進行蛋白酶處理之後的含有重組型三螺旋蛋白質之部分合併，且將溶液之pH值調節至pH值7.0±1.0，且經由添加來自40%水性儲備溶液之聚乙二醇-4000來沈澱三螺旋蛋白質。所有步驟均在小於三螺旋之熔化溫度的溫度下，較佳在4℃下進行。在沈澱必需之聚乙二醇量之後離心樣本，視覺檢查沈澱，且藉由SDS-PAGE分析。對較小非動物膠原蛋白(諸如來自化膿性鏈球菌)，需要10% w/v聚乙二醇-4000。
所獲得之蛋白質的純度展示在圖3中。
實施例30：藉由超過濾來分離三螺旋蛋白質產物
將在如先前實施例中所論述藉由酸性沈澱移除雜質繼而進行蛋白酶處理之後的含有重組型三螺旋蛋白質之部分合併，且隨後濃縮且使用10kDa交叉流過濾膜設備(Pall Life Sciences)交換至20mM磷酸鈉緩衝劑(pH值8.0)中。所有步驟均在小於三螺旋之熔化溫度的溫度下，較佳在4℃下進行。
實施例31：藉由吸收來分離三螺旋蛋白質產物
將在如先前實施例中所論述藉由酸性沈澱移除雜質繼而進行蛋白酶處理之後的含有重組型三螺旋蛋白質之部分合併，且用Tris將溶液之pH值調節至pH值8.0±0.5。對來自化膿性鏈球菌之三螺旋蛋白質而言，隨後將經合併之樣本吸附在於50mM Tris/HCl緩衝劑(pH值8.0)中預平衡之Mono-Q管柱(GE醫療)上，該管柱具有作為帶電基團之-CH2-N+(CH3)3。在加料之後，用5管柱體積之平衡緩衝劑洗滌管柱，且隨後藉由相同緩衝劑中0至1M之線性NaCl梯度溶離。藉由214nm處之吸收來偵測蛋白質，且藉由SDS-PAGE確認。
以下實施例展示經純化之三螺旋蛋白質可如何用於臨床應用中。
實施例32：製造-製備用於活體內應用之細菌膠原蛋白狀樣本
若經純化之膠原蛋白待用作生物醫學材料，則其最可能需要使用熟習此項技術者已知之方法進一步「精製」。蛋白質亦可能需要在用於醫學應用中之前穩定化，如動物膠原蛋白之情況。
在此實施例中，藉由冷凍乾燥化膿性鏈球菌膠原蛋白(其由戊二醛蒸氣在封閉式容器中於20℃下穩定化18小時)來製備海綿。此方法得到在>37℃下穩定蛋白質海綿。收縮溫度之增加視穩定化之程度而定，但可獲得至多約25C之額外穩定性。藉由差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry；DSC)使用PBS中之樣本檢測穩定化樣本之熱穩定性。
為評估細胞附接，用MEM中之120μg/ml青黴素及200μg/ml鏈黴素 處理經PBS洗滌之穩定化CL樣本2小時，且隨後與每樣本1×104 L929細胞一起接種於96孔培養板中補充有1%NEAA及10%FCS之MEM中。在用PBS沖洗樣本兩次之後3小時及16小時時評估附接。在於37℃下16小時之後用Live/Dead®存活性/細胞毒性套組(分子探針)分析來測試細胞存活性。
此等資料顯示膠原蛋白海綿材料為較小纖維與更大聚集體之混合物。在3小時時可見L929細胞與較小纖維及聚集體兩者之良好附接。在16小時之後，L929細胞在Live/DeadTM分析中顯示極佳存活性。此時佈撒程度極受限制，符合『空白石板』觀測。GA穩定化之基質具有少量自體螢光(圖4)。
<110> 全民科學與工業研究機構
<120> 三螺旋蛋白質之純化
<130> 515030
<160> 43
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶/胰蛋白酶分裂位點
<400> 1
<210> 2
<211> 978
<212> DNA
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 2
<210> 3
<211> 325
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 3
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 插入序列
<400> 4
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 5
<210> 6
<21> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 6
<210> 7
<211> 1686
<212> DNA
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 7
<210> 8
<211> 561
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 8
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肝素結合序列
<400> 9
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 10
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 11
<210> 12
<21> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 12
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 13
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 14
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 15
<210> 16
<211> 981
<212> DNA
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 16
<210> 17
<211> 325
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 17
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 整合素結合序列
<400> 18
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 19
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 20
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 21
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 22
<210> 23
<211> 978
<212> DNA
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 23
<210> 24
<211> 325
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 24
<210> 25
<211> 978
<212> DNA
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 25
<210> 26
<211> 325
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 26
<210> 27
<211> 1017
<212> DNA
<213> 候選種Candidatus solibacter usitatus
<400> 27
<210> 28
<211> 338
<212> PRT
<213> 候選種Candidatus solibacter usitatus
<400> 28
<210> 29
<211> 860
<212> DNA
<213> 少孢絲角葉蜂(N.oligospilus)
<400> 29
<210> 30
<211> 278
<212> PRT
<213> 少孢絲角葉蜂(N.oligospilus)
<400> 30
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 31
<210> 32
<21> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 32
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 33
<210> 34
<211> 31
<2 1 2> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 34
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 35
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 36
<210> 37
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類III型膠原蛋白之重複片段
<400> 37
<210> 38
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類III型膠原蛋白之重複片段
<400> 38
<210> 39
<211> 484
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α 1鏈CB3片段
<400> 39
<210> 40
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α 1鏈CB3片段
<400> 40
<210> 41
<211> 4018
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類膠原蛋白I型及III型之片段
<400> 41
<210> 42
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 甲基桿菌(Methylobacterium sp.)與S usitatus之嵌合體
<400> 42
<210> 43
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甲基桿菌(methylbacterium sp.)與S usitatus之嵌合體
<400> 43

Claims (27)

  1. 一種用於純化在非哺乳動物宿主細胞培養萃取物或均質物內含有之重組表現三螺旋蛋白質的方法，該方法包含：(i)在酸性條件下及在該三螺旋蛋白質保持熱穩定之溫度下自該三螺旋蛋白質沈澱宿主細胞物質；繼而(ii)藉由添加蛋白酶來消化存在於該經沈澱之宿主細胞培養萃取物或均質物中的宿主細胞物質，其中該三螺旋蛋白質對該蛋白酶具有耐受性；及(iii)收集該經純化之三螺旋蛋白質；其中該三螺旋蛋白質在至少步驟(i)及(ii)中均保持可溶性。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該三螺旋蛋白質在步驟(i)至(iii)中均保持可溶性。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該消化使用酸性蛋白酶來進行。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中該宿主細胞為細菌、酵母或植物宿主細胞。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法，其中酸性條件係指pH值小於7。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中該沈澱步驟在低於該三螺旋蛋白質之熔化溫度的溫度下進行。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其在該沈澱步驟與該消化步驟之間進一步包含額外之分離步驟，該分離步驟以物理方式自經沈澱之宿主細胞物質分離該三螺旋蛋白質。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該中間分離步驟係選自離心、過濾、交叉流過濾或沈降中之一或多者。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之方法，其中該表現之三螺旋蛋白質在宿主細胞內以細胞內方式產生。
  10. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之方法，其中該表現之三螺旋蛋白質係自該宿主細胞分泌的。
  11. 如前述申請專利範圍任一項之方法，其包含產生含有該三螺旋蛋白質之宿主細胞培養萃取物或均質物的額外步驟。
  12. 如前述申請專利範圍任一項之方法，其中該方法在該重組型三螺旋蛋白質之熔化溫度(Tm)的溫度下進行。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該溫度比該重組型三螺旋蛋白質之Tm低至少10℃或更多。
  14. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該pH值在2與4之間且該宿主細胞為細菌宿主細胞。
  15. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該pH值在4與6之間且該宿主細胞為酵母宿主細胞。
  16. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該pH值在2與4.5之間且該宿主細胞為植物宿主細胞。
  17. 如申請專利範圍第3項至第16項中任一項之方法，其中該三螺旋蛋白質對蛋白水解為穩定的。
  18. 如申請專利範圍第3項至第17項中任一項之方法，其中該方法相較於對蛋白水解不穩定之蛋白質，選擇性地純化對蛋白水解穩定之蛋白質。
  19. 如前述申請專利範圍任一項之方法，其中自該收集之三螺旋蛋白質移除宿主細胞核酸。
  20. 如前述申請專利範圍任一項之方法，其中該三螺旋蛋白質之沈澱藉由添加硫酸銨、藉由調節pH值或調節溫度、及/或藉由使用聚合物(例如聚乙二醇)來達成。
  21. 如前述申請專利範圍任一項之方法，其中該收集之三螺旋蛋白質藉由穩定劑而穩定化。
  22. 如前述申請專利範圍任一項之方法，其中該三螺旋蛋白質包含重複(Gly-X-Y)n基元(motif)，其中n在5與600之間。
  23. 如前述申請專利範圍任一項之方法，其中該三螺旋蛋白質為膠原蛋白。
  24. 如前述申請專利範圍任一項之方法，其中該三螺旋蛋白質序列來源於細菌性酵母、植物、昆蟲或蠶。
  25. 一種三螺旋蛋白質，其藉由如申請專利範圍第1項至第24項中任一項之方法來純化。
  26. 一種經純化之三螺旋蛋白質，其藉由如申請專利範圍第1項至第24項中任一項之方法來獲得。
  27. 如申請專利範圍第25項或第26項之三螺旋蛋白質，其藉由熱或化學變性而轉變為明膠。
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