KR101002058B1 - 인간상피세포 성장인자와 콜라겐 결합 도메인을 함유하는 융합단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간상피세포 성장인자와 콜라겐 결합 도메인을 함유하는 융합단백질에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Vibrio mimicus 메탈로프로테아제 유래의 콜라겐 결합 단백질과 인간상피세포 성장인자를 함유하는 융합단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합단백질은 인체 내 투여시, 외래 콜라겐 결합 단백질에 대한 항체형성 등의 부작용이 적으며, 융합되지 않은 인간상피세포 성장인자보다 높은 인간상피세포 성장인자 활성을 나타낸다.
상피세포성장인자, 콜라겐 결합 도메인, 콜라겐 결합 단백질, 비브리오 미미쿠스

Description

인간상피세포 성장인자와 콜라겐 결합 도메인을 함유하는 융합단백질{Fusion Protein Containing Human Epidermal Growth Factor and Collagen-binding Domain}
본 발명은 인간상피세포 성장인자와 콜라겐 결합 도메인을 함유하는 융합단백질에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Vibrio mimicus 메탈로프로테아제 유래의 콜라겐 결합 단백질과 인간상피세포 성장인자를 함유하는 융합단백질에 관한 것이다.
인간의 상피세포 성장인자(hEGF)는 6kDa의 단일사슬 폴리펩티드로서 53개의 아미노산으로 이루어져 있으며 신체 내의 다양한 기관에서 생산, 분비되며, 세포의 부착, 분열촉진, 그리고 손상된 상피 조직의 치유에 필요한 세포들의 재배열 등을 촉진하는 역할을 담당한다. 이러한 상피세포 성장인자는 낮은 생산량, 세포 특이성, 짧은 지속기간이라는 단점이 있기 때문에 치료의 목적으로 상피세포성장인자만을 사용하기에 많은 무리가 있다. 따라서 상피세포의 대량 생산과정에서 생산미생물에 해가되는 물질을 제거하여 생산성을 증가시키는 방법, 대장균이 아닌 다른 미생물을 이용한 생산 방법, 성장인자에 다른 단백질을 함께 부착하여 발현 시키는 방법 등의 다양한 연구가 이러한 단점을 보완하기 위한 연구가 진행되고 있다.
한편, 콜라겐은 세포외 기질 중 단백질 부분의 주요 구성성분이고, 고등동물에서 가장 풍부한 단백질이다. 콜라겐 분해성 세균 중 많은 수가 콜라겐을 함유하는 조직의 파괴를 포함되는 발병과정과 관련이 있다. 포유동물의 콜라게나아제를 포함하는 포유동물의 기질 메탈로프로테아제(MMPs)는 정상 조직에서 콜라겐의 항상성을 유지하는데 관련되어 있다. MMP들은 보편적으로 프로 펩티드 도메인, 촉매 도메인 및 헤모펙신 C 도메인을 포함하는 전체 구조를 가지고 있으며, 상기 C-말단의 헤모펙신 C-도메인은 콜라겐-결합 도메인(CBD)으로 알려져 있다. 포유동물의 콜라게나아제와 대조적으로, 세균의 콜라게나아제의 기능적 도메인은 잘 알려져 있지 않다.
지금까지 Vibrio alginolyticus(VAC), Vibiro anguillarum(EmpA), Vibiro cholerae(Hap 및 VCC), Vibrio fluvialis(VFP), Vibrio parahaemolyticus(VPPRT 및 VppC), Vibrio proteolyticus(Nprv) 및 Vibrio vulnificus(VVP) 등의 비브리오에서 메탈로프로테아제가 분리되었다. Vibrio mimicus는 31kDa VMP단백질과 61kDa의 VMC 단백질인 두개의 메탈로프로테아제를 생산한다 (Lee, JH et al., Biochim. Biophys. Acta 1384:1, 1998, Chowdhury, MAR et al., Infect. Immun., 58:4159, 1990). 본 발명자들은 상기 VMC 단백질(VMC61)이 특이적 콜라겐분해 활성을 가지고 Vibiro cholerae의 VCC 단백질, Vibrio alginolyticus의 VAC 단백질 및 Vibrio parahaemolyticus의 VPPRT 단백질과 유사한 아미노산 서열을 가진다는 것을 밝힌바 있으며 (Lee, J.H. et al., FEMS Microbiol. Lett., 223:293, 2003), Vibrio mimicus의 VMP 단백질의 생물학적 활성은 Vibiro cholerae의 Hap와 유사하다.
본 발명자들은 VMC61의 C 말단으로부터 100개의 아미노산이 제거되면 콜라겐분해 활성이 감소되는데 반하여, 말단의 67개 아미노산이 제거된 단백질의 경우에는 온전한 VMC61과 거의 비슷한 콜라겐분해 활성을 가진다는 것을 밝히고(Lee, J.H. et al., FEMS Microbiol. Lett., 223:293, 2003), VMC61의 C 말단의 33개 아미노산이 콜라겐과 결합하는데 관여하여 VMC61의 CBD(Collagen binding domain)이라는 것을 보고한 바 있다(Lee, JH et al., FEBS Lett., 579:2507, 2005).
한편, 상처부위의 세포에는 신호전달물질의 농도가 일정 수준 이상이 되어야 하며 그리고 세포가 증식할 수 있는 기반의 조성이 필요하다. 외래 EGF를 신호전달이 필요한 부위로 유도하고, 적정농도로 유지하기 위한 여러가지 시도 중, 상피조직콜라겐에 부착하는 콜라겐 부착 단백질, fibronectin-collagen-binding 단백질들의 결합 도메인을 EGF와 결합시켜 발현시키는 시도가 있어왔다.
Chlostridum histolyticum의 메탈로프로테아제 내에 존재하는 CBD(collagen binding domain)와 EGF 유전자를 연결시켜 대장균에서 발현시킨 융합단백질에서 EGF의 활성을 나타내었다는 보고가 있으나(Nishi N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:7018, 1998), C. histolyticum의 상기 콜라겐 부착 부위는 200개 이상의 아미노산으로 구성되어 있어 53개로 이루어진 상피세포성장인자와 같은 짧은 단백질들과 융합시키면 인체에 적용 시켰을 때 콜라겐 부착 단백질에 대한 항체 형성 및 구조변화에 따른 활성저하 등의 부작용을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 짧은 아미노산 서열을 갖는 콜라겐 부착 도메인을 이용 하여, EGF와 융합시키면, 인체 내에 항체 형성등의 부작용이 없으면서, EGF 활성이 높은 융합단백질을 수득할 수 있을 것에 착안하여, 본 발명자들이 밝힌 V. mimicus metalloprotease 내의 콜라겐 부착 부위와 사람의 상피세포 성장인자를 융합시킨 재조합단백질의 대량발현 시스템을 구축하고, 상기 융합단백질이 우수한 상피세포의 성장촉진 활성 및 콜라겐 부착 활성을 가지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 융합단백질을 함유하는 상피세포의 손상, 위장관의 궤양 및 망막의 손상으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 치유용 의약조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 메탈로프로테아제 유전자 유래 콜라겐 결합 도메인 유전자 단편과 인간 상피세포성장인자 유전자가 결합되어 있는 제1항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 함유하는 상피세포의 손상, 위장관의 궤양 및 망막의 손상으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 치료용 의약조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 융합단백질은 인체 내 투여시, 외래 콜라겐 결합 단백질에 대한 항체형성 등의 부작용이 적으며, 융합되지 않은 인간상피세포 성장인자보다 높은 인간상피세포 성장인자 활성을 나타낸다.
일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 콜라겐 결합단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질에 관한 것이다.
본 발명의 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질에서 인간 상피세포성장인자는 세포의 부착, 분열촉진, 그리고 손상된 상피 조직의 치유에 필요한 세포들의 재배열 등을 촉진하는 역할을 담당하여, 상피세포의 치유, 궤양, 망막의 치유 등에 사용되며, 콜라겐 결합 단백질은 인간 상피세포성장인자를 수용체가 위치하는 상피세포로 유도하고 농도를 유지하는 역할을 한다.
본 발명에 있어서, 상기 콜라겐 결합 도메인은 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 메탈로프로테아제 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 콜라겐 부착 단백질은 33개의 아미노산으로 이루어진 Vibrio mimicus 메탈로프로테아제의 C-말단 부위에 존재하는 콜라겐 결합 도메인이며, 특히 본 발명의 콜라겐 부착 단백질은 기존의 연구에서 사용된 23.9 kDa의 Clostridium histolyticum에서 유래한 부착 단백질이나, 40kDa의 사람의 fibronectin-collagen-binding 단백질보다도 크기가 매우 작아, 생체 내에 투여되었을때, 항체 형성에 의한 부작용이 적고, 함께 결합된 상피세포성장인자 단백질의 구조에 미치는 영향이 적어, 성장인자 활성에 영향을 미치지 않는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질의 상피세포성장인자의 활성을 확인하기 위하여, 상피세포에 상피세포성장인자와 본 발명의 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질을 처리한 후, 웨스턴블러팅에 의하여, 상피세포성장인자와 본 발명의 융합단백질의 인산화정도는 유사한 것으로 나타나, 성장인자의 활성이 콜라겐 결합 단백질과의 결합에 의하여 저하되지 않는다는 것을 확인하였다 (도 3).
또한, 본 발명의 또다른 실시예에서는 본 발명의 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질의 콜라겐 결합능을 확인한 결과, 본 발명의 융합단백질이 콜라겐과 성공적으로 결합한다는 것을 확인하였다 (도 5).
다른 관점에서, 본 발명은 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 메탈로프로테 아제 유전자 유래 콜라겐 결합 도메인 유전자 단편과 인간 상피세포성장인자 유전자가 결합되어 있는 제1항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 포함하며, 바람직하게는 박테리아이다. 바람직한 박테리아로는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli BL21 등을 포함한다.
또 다른 관점에서,본 발명은 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 융합단백질을 함유하는 상피세포의 손상, 위장관의 궤양 및 망막의 손상으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 치유용 의약조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합단백질을 함유하는 의약조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스 트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 폴리감마글루탐산에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 의약조성물은 투여대상의 나이, 성별, 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서도 백신의 투여량이 증감될 수 있다.
본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다.
본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:hEGF-CBD 플라스미드의 제작
hEGF-CBD 플라스미드를 제작하기 위하여, hEFG 유전자 및 CBD 유전자를 PCR을 이용하여 증폭하고, 오버랩핑 PCR을 통하여, hEGF-CBD 단편을 수득하였다.
hEGF 단편은 성숙 hEGF의 cDNA를 주형으로 하여, 제한효소 BamHI 절단부위를 가지는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 CBD 단편의 5'말단과 상보적인 서열을 가지는 서열번호 4의 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
서열번호 3:5'-GGCCGGATCCAATAGTGACTCTGAATGTCCC-3
서열번호 4:5'-AGACAGTACCAAGCGCAGTTCCCACCAC-3'
CBD 단편은 pETMETA61 플라스미드를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다.
상기 pETMETA61 플라스미드는 다음 방법으로 제작하였다, 먼저, PCR 반응의 주형으로 Vibrio mimicus의 메탈로프로테아제(vmc) 유전자(AF004832)를 포함하는 pVMC193를 사용하여, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머로 PCR을 수행하였다.
PCR 반응은 94℃에서 10분간 첫 번째 변성을 수행한 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1.5분의 사이클을 15회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 10분간 신장시켰다. 정제한 PCR 산물은 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 절단 한 후, 절단된 단편은 pET22b(+)벡터(Novagen, USA)에 삽입하여, pETMETA61 플라스미드를 제작하였다.
서열번호 5: 5'-GGCCCATATGGCAGAACAAGCCCAACGC-3' (F1)
서열번호 6: 5'-GGCCGGATCCCCTGTAAAGATCGGCGTGG-3'(R1)
상기 pETMETA61 플라스미드를 주형으로 하여, EcoRI 절단부위를 가지는 서열 번호 7의 역방향 프라이머 및 hEGF의 3' 말단과 상보적인 서열을 가지는 서열번호 8의 정방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 7: 5'-GGCCGAATTCCTATGTATCAAGCCAGACTGCAA-3
서열번호 8: 5'-TGGGAACTGCGGTTGGTACTGTCTCGACCA-3
EGF 단편과 CBD 단편은 서열번호 3 및 서열번호 7의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, 258bp의 hEGF-CBD 단편을 수득하고 이를 BamHI과 EcoRI으로 처리한 후, pET22b(+)벡터(Novagen, USA)에 삽입하여 pET-hEGF-CBD를 제작하였다.
실시예 2: hEGF-CBD 융합단백질의 생산
실시예 1에서 제작된 pET-hEGF-CBD를 E.coli BL21(DE3)에 형질전환시킨 후, 10㎍/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 37℃, OD 값이 0.4이 될때까지 배양한 후, IPTG를 최종농도 1mM이 되도록 첨가하여, hEGF-CBD의 과발현을 유도한 후, 37℃에서 4시간 동안 추가로 배양하였다.
hEGF-CBD 융합단백질은 E.coli BL21(DE3) 균주내에서 불용성 형태로 과발현되므로, 하기의 방법으로 정제하였다.
상기 배양된 배양액을 원심분리하여 균체를 수득한 후, 상기 균체를 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)에 현탁시킨 후, 초음파로 균체를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 균체 현탁액을 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여, 펠렛을 얻은 후, 상기 펠 렛을 6M 요소를 함유하는 20mM Tris-HCl 버퍼 (pH 8.0)에 녹여 변성시킨 후, 20mM Tris-HCl 버퍼 (pH 8.0)에서 투석하여 재접힘(refolding)시켰다. 투석된 샘플을 His-binding 칼럼(Novagen, USA)에 적용하여 hEGF-CBD 융합단백질을 정제하였으며, 브래드포드 어세이로 정량하였다.
상기 융합단백질의 정제단계별 샘플의 SDS-PAGE 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 9 kDa의 hEGF-CBD 융합단백질이 E.coli BL21(DE3) 균주내에서 과발현되는 것을 알 수 있으며(레인 1), 정제 단계를 거치면서 순수한 hEGF-CBD 융합단백질을 수득한 것을 확인할 수 있다 (레인 5).
실시예 3: hEGF-CBD 융합단백질의 성장인자활성 분석
hEGF-CBD 융합단백질의 성장인자로서의 활성을 hEGF와 비교하여 분석하였다.
인간 표피형태 암세포주 A-431(ATCC CRL-1555)을 37℃ 5% CO2 환경에서 10% FBS를 함유하는 MEM 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 6 웰 플레이트에 5x103 cell/well농도로 파종하여, 하룻밤 배양 한 후, 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교환한 후, 0~100ng/well 농도로 hEGF(Sigma, USA) 및 hEGF-CBD 융합단백질을 각각 처리하였다. 2일 동안 배양한 후, 세포를 PBS 로 세척하고, 신선한 RPMI(-) 배지로 교환하고, 추가로 2일을 배양한 후, MTT 어세이로 세포성장을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, hEGF-CBD 융합단백질 또는 hEGF를 처리한 샘플은 무처리 대조군과 비교하여 높은 세포수를 나타내었으며, 처리농도에 따라 세포수도 증가하였다. hEGF-CBD 융합단백질은 hEGF와 유사하거나 더 높은 성장활성을 나타내었다.
실시예 4: EGF 수용체의 인산화 확인
hEGF 또는 hEGF-CBD 융합단백질가 처리된 세포에서의 EGF 수용체의 인산화 정도를 분석하여 신호분자(hEGF 또는 hEGF-CBD 융합단백질)와 수용체 사이의 상호작용 수준 웨스턴블럿팅으로 확인하였다(Sahasrabuddhe A et al., Cell stress & Chaperones 11:135, 2006).
먼저, 배양된 A-431세포를 5x105 개를 PBS로 세척하고, 100ng의 hEGF 또는 hEGF-CBD 융합단백질로 5분간 처리한 후, 원심분리로 세포를 수득한 뒤, 전기영동용 샘플버퍼에 현탁시켰다. 상기 샘플을 10분간 끓인다음 8% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼한 다음, antiphosphotyrosine 항체(BioSource, 벨기에)를 이용하여, 웨스턴블럿팅을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, hEGF-CBD 융합단백질을 처리한 세포와 hEGF를 처리한 세포에서 EGF 수용체의 인산화정도는 비슷한 것으로 나타났다.
실시예 5: 콜라겐 결합능 확인
(1)GST-CBD 융합단백질의 구축 및 GST-CBD 융합단백질의 콜라겐-결합능 확인
본 실시예에서는 CBD와 GST(glutathione S-transferase)가 결합된 융합 단백질을 발현하는 플라스미드를 구축하고, 이에 의해 발현된 GST 융합 단백질을 사용하여 콜라겐 결합 어세이를 수행하였다.
GST-CBD의 발현을 위한 플라스미드를 제작하기 위하여 실시예 1에서 제작한 pETMETA61 플라스미드를 주형으로 하고, BamHI 절단부위를 갖는 서열번호 9의 프라이머 및 XhoI 절단부위를 갖는 서열번호 10의 프라이머를 사용하여, PCR을 수행하여, CBD 단편을 증폭하였다.
서열번호 9:5'-CCGCGTGGATCCTTGGTACTGTCTCGACCA-3'
서열번호 10:5'-CGGCCGCTCGAGTGTATCAAGCCAGACTGC-3'
상기 PCR 산물을 정제한 후 BamHI과 XhoI으로 절단하고, 절단된 DNA 단편을 pGEX-4T-1 벡터(Amersham, USA)에 삽입하여 GST-CBD 융합단백질을 코딩하는 pVMCBD 플라스미드(GSTCBD-C)을 제작하였다. 상기 융합단백질은 E.coli BL21(DE3)에 형질전환하여 발현시켰다. 발현된 GST-CBD 융합단백질은 글루타치온-세파로오즈 칼럼으로 정제하였으며, 분자량은 31kDa이었다.
상기에서 분리된 GSTCBD 융합단백질을 사용하여 콜라겐 결합 어세이를 수행하였다.
콜라겐 결합 어세이는 하기의 방법으로 수행하였다.
소의 아킬레스건으로부터 분리한 약 10mg의 불용성 타입I 콜라겐(Sigma, USA)을 5mM CaCl2가 포함된 50mM Tris-HCl(pH8.0)에서 pre-swelling시킨 후, 10,000xg에서 10분간 원심분리하였다. 상기 pre-swelling된 콜라겐 펠렛을 0.1mg의 GSTCBD 융합단백질과 혼합하여 6시간동안 상온에서 반응시킨 후, 0.22㎛ 포어사이즈의 Durapore membrane device(Millipore, USA)를 이용하여 여과시킨 여과액을 12% SDS-gel에서 전기영동을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 콜라겐을 첨가한 샘플에서는 GSTCBD 융합단백질이 관찰되지 않아, 융합단백질이 콜라겐과 결합하였다는 것을 알 수 있다.
(2) hEGF-CBD 융합단백질의 콜라겐 결합능 확인
hEGF-CBD 융합단백질을 사용하여 상기 (1)의 방법과 동일하게 콜라겐 결합어세이를 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 콜라겐과 반응시키지 않은 hEGF-CBD 융합단백질은 SDS-PAGE에서 밴드가 확인되었으며,콜라겐과 반응시킨 융합단백질은 밴드가 나타나지 않았다.
콜라겐과 반응시킨 hEGF-CBD 융합단백질을 0.1% SDS로 1시간 처리하여 콜라겐과의 결합된 콜라겐을 분리시킨 후, SDS-PAGE를 수행한 결과, 도 5의 레인 3에 나타난 바와 같이 hEGF-CBD 융합단백질과 콜라겐이 분리되어 관찰되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통 상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다
도 1은 E.coli BL21(DE3) 균주내에서 과발현된 본 발명의 융합단백질의 정제과정을 SDS-PAGE로 나타낸 것으로 레인 1은 crude extract 이고, 레인 2는 발현유도 후의 균체전체이며, 레인 3은 가용성 단백질이고, 레인 4는 불용성 봉입체이고, 레인 5는 정제된 hEGF-CBD이다.
도 2는 본 발명의 융합단백질인 hEGF-CBD의 처리농도에 따른 A-431의 성장을 MMT 어세이로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 융합단백질과 인간상피세포성장인자(hEGF)의 인산화정도를 확인한 웨스턴블럿팅 결과를 나타낸 것으로, 레인 C는 음성 대조군이고, 레인 1은 hEGF 100ng 처리군이며, 레인 2는 hEGF-CBD 100ng 처리군이다.
도 4는 GSTCBD 융합단백질의 콜라겐 결합능을 나타낸 것으로, 레인 1은 콜라겐을 첨가하지 않고 반응시킨 GST-CBD이고, 레인 2는 콜라겐을 첨가하여 반응시킨 GST-CBD 이다.
도 5는 본 발명의 융합단백질의 콜라겐 결합능을 나타낸 것으로, 레인 1은 콜라겐을 첨가하지 않고 반응시킨 hEGF-CBD이고, 레인 2는 콜라겐을 첨가하여 반응시킨 hEGF-CBD이며, 레인 3은 콜라겐과 반응시킨 후, 0.1% SDS를 첨가하여 반응시킨 hEGF-CBD이다.
<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Fusion Protein Containing Human Epidermal Growth Factor and Collagen-binding Domain <130> P08-B158 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein hEGF-CBD <400> 1 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Cys Asn Cys 20 25 30 Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp 35 40 45 Trp Glu Leu Arg Leu Val Leu Ser Arg Pro Gly Gln Phe Ala Gln Trp 50 55 60 Ala Gln Thr Val Lys Asn Leu Gly Glu Gln Tyr Asn Ala Glu Phe Ala 65 70 75 80 Val Trp Leu Asp Thr 85 <210> 2 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion proteion hEGF-CBD <400> 2 aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctccatga tggtgtgtgc 60 atgtatattg aagcattgga caagtattgc aactgtgttg ttggctacat cggggagcga 120 tgtcagtacc gagacctgaa gtggtgggaa ctgcgcttgg tactgtctcg accagggcaa 180 tttgcacaat gggcgcaaac agtgaaaaac ttaggtgaac aatacaacgc cgagtttgca 240 gtctggcttg ataca 255 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggccggatcc aatagtgact ctgaatgtcc c 31 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agacagtacc aagcgcagtt cccaccac 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggcccatatg gcagaacaag cccaacgc 28 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggccggatcc cctgtaaaga tcggcgtgg 29 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggccgaattc ctatgtatca agccagactg caa 33 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tgggaactgc ggttggtact gtctcgacca 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccgcgtggat ccttggtact gtctcgacca 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cggccgctcg agtgtatcaa gccagactgc 30

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 결합 단백질은 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 메탈로프로테아제 유래인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  3. 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 메탈로프로테아제 유전자 유래 콜라겐 결합 도메인 유전자 단편과 인간 상피세포성장인자 유전자가 결합되어 있는 제1항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.
  6. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  7. 제6항의 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 결합 단백질과 인간 상피세포성장인자를 함유하는 융합단백질의 제조방법.
  8. 제1항의 융합단백질을 함유하는 상피세포의 손상, 위장관의 궤양 및 망막의 손상으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 치료용 의약조성물.
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