CN109608551A - 一种hlc-bmp融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种hlc-bmp融合蛋白及其制备方法 Download PDF

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余源
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Abstract

本发明公开了一种HLC‑BMP融合蛋白及其制备方法，该融合蛋白的基因序列由以下三部分依次组成：HLC基因序列、柔性接头和BMP基因序列。所述柔性接头的氨基酸编码序列包括(G)n或(GGGGS)n，其中n＝1～4。本发明的HLC‑BMP融合蛋白在国内外尚属首次，其优点为：(1)HLC‑BMP融合蛋白为直接产物，可避免BMP与载体复合过程中失活；(2)BMP的释放可通过设计融合蛋白编码序列进行控制，从而提高BMP利用率。

Description

一种HLC-BMP融合蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种HLC-BMP融合蛋白及其制备方法。
背景技术
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是广泛存在于人和动物骨基质中的一种骨生长因子，于1965年首次被Urist发现，具有非种属特异性，能够跨种属诱导成骨。目前，己克隆到15种BMP，其中除BMP1外其它均属于TGF-β超家族。在所有BMP中，以BMP2和BMP7的诱骨活性最强，是已知最有效的促骨形成因子。将BMP与人工材料复合，成为具有骨诱导活性的人工骨修复材料以替代自体骨移植，是目前植骨材料研究领域的热点。
类人胶原蛋白(human-like collagen，HLC)是根据胶原蛋白多肽链中“Gly-Pro-Hyp”、或“Gly-Pro-Xaa”和“Gly-Xaa-Yaa”(Xaa、Yaa代表Gly 和Pro以外的任何氨基酸)的重复序列，通过基因工程技术获得的具有胶原蛋白特性的蛋白质。Myllyharju J等使用酵母表达出类人I、II、III型胶原蛋白。 Tang等在大肠杆菌中表达出类人I型胶原蛋白(GAPGAPGSQGAPGLQ)16。
但目前类人胶原蛋白与BMP复合的方法仍主要是通过将胶原蛋白浸泡于 BMP溶液中使BMP与胶原蛋白结合，这种物理复合的方式导致BMP利用率不高。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种利用基因工程技术制备的 HLC-BMP融合蛋白，该融合蛋白为基因工程直接表达产物，解决现有的胶原蛋白与BMP物理浸泡复合方法导致的BMP利用率不高的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种HLC-BMP融合蛋白，该融合蛋白的基因序列由以下三部分依次组成：
HLC基因序列、柔性接头和BMP基因序列，该融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
本发明还具有如下技术特征：
所述柔性接头的氨基酸编码序列包括(G)n或(GGGGS)n，其中n＝1～4。
所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、分别合成HLC编码基因和碳端连接了柔性接头的BMP编码基因，并保存于克隆载体；
步骤二、通过核苷酸限制性内切酶切割、核酸琼脂糖凝胶电泳和目的片段切胶回收，将HLC-BMP融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体，经转化和重组子筛选鉴定，获得HLC-BMP融合蛋白表达载体；
步骤三、实现HLC-BMP融合蛋白在宿主细胞中的过表达；
步骤四、纯化过表达产物HLC-BMP融合蛋白，干燥保存。
所述步骤一中，HLC包括(Gly-Xaa-Yaa)n的60倍体、(Gly-Xaa-Yaa)n的72 倍体、(Gly-Xaa-Yaa)n的84倍体或(Gly-Xaa-Yaa)n的96倍体，其中Xaa、Yaa 为Gly以外的任何氨基酸；所述BMP包括BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、 BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、 BMP-13、BMP-14或BMP-15中的任意一种。
所述步骤二中，将HLC-BMP融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体包括：采用细菌表达时，将HLC-BMP编码基因插入线性化的原核表达载体的相应位点，经细菌转化和重组子筛选鉴定，获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的HLC-BMP表达载体；采用真核表达时，将HLC-BMP编码基因的克隆载体线性化，转化真核细胞和重组子筛选鉴定，获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的HLC-BMP表达载体。
所述步骤二中，用于保存HLC-BMP融合蛋白的克隆菌株为原核细胞或真核细胞。
所述步骤三中，实现HLC-BMP融合蛋白在宿主细胞中的过表达包括：采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确定HLC-BMP融合蛋白为可溶性表达还是包涵体表达，对可溶性表达收集上清，对包涵体表达收集沉淀后用盐酸胍或尿素溶解。
所述步骤四中，纯化表达产物HLC-BMP融合蛋白包括：确定HLC-BMP 融合蛋白等电点后采用阴/阳离子交换层析或反相色谱法进行纯化。
本发明还保护一种如上所述HLC-BMP融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、分别合成HLC编码基因和碳端连接了柔性接头的BMP编码基因，并保存于克隆载体；
步骤二、通过核苷酸限制性内切酶切割、核酸琼脂糖凝胶电泳和目的片段切胶回收，将HLC-BMP融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体，经转化和重组子筛选鉴定，获得HLC-BMP融合蛋白表达载体并保存；
步骤三、实现HLC-BMP融合蛋白在宿主细胞中的过表达；
步骤四、纯化表达产物HLC-BMP融合蛋白，干燥保存。
所述步骤一中，HLC包括(Gly-Xaa-Yaa)n的60倍体、(Gly-Xaa-Yaa)n的72 倍体、(Gly-Xaa-Yaa)n的84倍体或(Gly-Xaa-Yaa)n的96倍体，其中Xaa、Yaa 为Gly以外的任何氨基酸；所述BMP包括BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、 BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、 BMP-13、BMP-14或BMP-15中的任意一种。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的HLC-BMP融合蛋白为基因表达产物，无动物胶原蛋白带来的潜在风险。
(2)本发明的HLC-BMP融合蛋白为基因表达直接产物，有效避免BMP 与载体复合过程中失活。
附图说明
图1为实施例1：Nco I和Xho I双酶切检测HLCs编码基因在pET28a中的克隆。采用定向递归连接技术构建HLC克隆载体(a)60倍体；(b)72倍体； (c)84倍体；(d)96倍体；M：DNAMarker III；1：未酶切的pET28a-HLC；2-4：已酶切的pET28a-HLC。
图2为实施例1：PflMⅠ和XhoⅠ双酶切pUC57载BMP-2质粒。M：DNA Marker III；1-6：pUC57-BMP-2质粒。
图3为实施例1：NcoⅠ和Xho I双酶切pUC57-HLC-BMP-2质粒。M： DL5000；1：pUC57-HLC-BMP-2质粒。
图4为实施例2：Xho I和Not I双酶切检测HLC-BMP-2编码基因在pPIC9K 中的克隆。M：DNA Marker III；1-4：pPIC9K-HLC-BMP-2(HLC-BMP-2片段844bp)质粒。
图5为实施例2：所构建pPIC9K-HLC-BMP-2质粒的测序结果 (HLC-BMP-2片段844bp)。
图6为实施例2：挑选了8株酵母菌表达菌株，SDS-PAGE结果表明8株酵母菌均可表达HLC-BMP-2融合蛋白(分子量26kD)。M：蛋白分子量Marker； 1：未诱导菌株上清；2-9：诱导菌株上清。
图7为实施例2：已表达HLC-BMP-2融合蛋白(分子量26kD)的 Western-Blot检测结果(BMP-2抗体)。
图8为实施例3：Xho I和Not I双酶切检测HLC-BMP-2编码基因在pPIC9K 中的克隆。M：DNA Marker III；1-4：pPIC9K-HLC-BMP-2(HLC-BMP-2片段1619bp)质粒。
图9为实施例3：所构建pPIC9K-HLC-BMP-2质粒的测序结果 (HLC-BMP-2片段1619bp)。
图10为实施例3：Sal I单酶切线性化pPIC9K-HLC-BMP质粒后，核酸电泳检测线性化结果。M：DNA Ladder Mix；1：未线性化pPIC9K-HLC-BMP-2 质粒；2：线性化pPIC9K-HLC-BMP-2质粒。
图11为实施例3：线性化pPIC9K-HLC-BMP质粒电转入酵母，提取酵母基因组，检测电转效率，以提取基因组为模板，用BMP-2引物PCR，核酸电泳，筛选导入pPIC9K-HLC-BMP的酵母菌株。M：DNA Ladder Mix；1-23：导入pPIC9K-HLC-BMP酵母菌株的基因组PCR BMP-2基因。其中1、3、4、6-9、12、14、19号菌株基因组中有BMP-2基因。
图12为实施例3：挑选了6株酵母菌表达菌株，SDS-PAGE结果表明6 株酵母菌均可表达HLC-BMP-2融合蛋白(分子量51kD)。M：蛋白分子量 Marker；1-6：诱导菌株上清。
图13为实施例3：已表达HLC-BMP-2融合蛋白(分子量51kD)的 Western-Blot检测结果(BMP-2抗体)。M：预染蛋白分子量Marker；1-2：诱导HLC-BMP-2融合蛋白(分子量51kD)表达的菌株上清；3-4：未诱导表达的菌株上清。
图14为实施例3所获得的HLC-BMP-2融合蛋白多孔材料与类人胶原蛋白材料的形貌图片(a,b)HLC和(c,d)HLC-BMP-2大体形貌观察；(e)HLC 和(f)HLC-BMP-2的SEM形貌观察。
图15为实施例3所获得的HLC-BMP-2融合蛋白多孔材料与类人胶原蛋白材料植入SD大鼠颅骨标准直径缺损(8mm圆形缺损)8周后的显微CT扫描结果(a)未植入材料；(b)植入HLC；(c)植入HLC-BMP-2。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例提供一种HLC-BMP融合蛋白，其制备步骤为：
步骤一、分别合成HLC和碳端连接了柔性接头的BMP编码基因，并保存于克隆载体；
具体为：
1、人工合成HLC基因序列(150bp，大肠杆菌偏好)，如下：
ACCATGGGCCAGGGCGTGGGTGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCC CGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTAGCGCAGGTGCACCTGGCCCGCCTGG TGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTTCCGCAGTGCCGGGCGGGCTG CTCGAG
采用定向递归连接技术构建HLC克隆载体(a)60倍体；(b)72倍体；(c)84 倍体；(d)96倍体(酶切验证见图1)
2、人工合成BMP-2基因序列(384bp，大肠杆菌偏好)，如下：
ACCATGGGCCAGGGCGTGGGTCAGGCCAAACATAAGCAACGCAAA CGTCTGAAGAGCTCGTGCAAACGTCACCCGTTATATGTTGATTTCAGCGA CGTCGGTTGGAATGATTGGATTGTAGCACCTCCGGGCTACCATGCGTTTT ATTGCCACGGAGAATGTCCTTTCCCGCTGGCCGACCATCTTAACAGCACC AATCACGCAATTGTGCAGACCTTGGTTAACAGCGTTAATTCGAAGATTCC TAAAGCGTGCTGTGTCCCGACCGAACTGAGCGCCATTTCGATGTTATATT TGGATGAAAACGAGAAGGTAGTGCTTAAAAATTACCAGGACATGGTTGT CGAAGGTTGCGGCTGTCGCGTGCCGGGCGGGCTGCTCGAG
用BglⅠ和XhoⅠ双酶切pUC57载HLC质粒，获得pUC57-HLC线性载体。
步骤二、用PflMⅠ和XhoⅠ双酶切pUC57载BMP-2质粒，回收BMP-2 目的片段(酶切结果见图2)；用T4DNA连接酶连接获得pUC57-HLC-BMP-2 质粒；用NcoⅠ和Xho I双酶切pUC57-HLC-BMP-2质粒(酶切验证见图3)、 pET28a质粒，分别回收HLC-BMP-2目的片段及pET28a载体片段；用T4DNA 连接酶连接获得pET28a-HLC-BMP-2质粒。
步骤三、pET28a-HLC-BMP-2质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，从转化平板上挑取单克隆接种至10mL接种工作浓度含有100μg/mL卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃、200rpm培养5h左右至菌液明显浑浊，OD600约为0.4～ 0.6；加入10μL 100μg/mL的IPTG，37℃、200rmp诱导培养4h；收集菌液，离心收集上清及沉淀，上清样与沉淀样分别进行SDS-PAGE凝胶电泳检测、 Western-Blot检测。
步骤四、利用阴/阳离子交换层析、镍填料亲和层析制备高纯度 HLC-BMP-2；通过真空冷冻干燥制备HLC-BMP-2融合蛋白多孔材料。
实施例2：
本实施例提供一种HLC-BMP融合蛋白，其制备步骤为：
人工合成HLC基因序列(468bp，酵母菌偏好)，如下：
CTCGAGAAAAGACATCATCACCATCACCATGGTGCACCTGGCCCGC CTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTAGCGCAGGTGCACCTGG CCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTTCCGCAGGTGCA CCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTAGCGCAG GTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTTC CGCAGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTAGCGCAGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTC CTCCGGGTTCCGCAGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGC GGGTCCTCCGGGTAGCGCAGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTTCCGCAGAATTC
人工合成BMP-2基因序列(385bp，酵母菌偏好)，如下：
CCGGAATTCGGTGGTGGAGGTTCTCAAGCCAAGCACAAGCAAAGA AAGAGATTGAAGTCCTCTTGTAAGAGACACCCATTGTACGTTGACTTCTC TGACGTTGGTTGGAACGACTGGATTGTTGCTCCACCAGGTTACCACGCC TTCTACTGTCACGGTGAGTGTCCATTCCCATTGGCTGATCACTTGAACTC CACTAACCACGCCATTGTTCAAACTTTGGTCAACTCTGTTAACTCTAAGA TTCCAAAGGCTTGTTGTGTCCCAACTGAGTTGTCTGCTATCTCTATGTTGT ACTTGGACGAGAACGAGAAGGTTGTTTTGAAGAACTACCAAGACATGGT TGTTGAGGGTTGTGGTTGTAGATAAGCGGCCGCTAAACTAT
用Xho I和EcoR I双酶切载HLC质粒、pPIC9K质粒，回收HLC目的片段及pPIC9K载体片段，用T4DNA连接酶连接获得pPIC9K-HLC质粒，用EcoR I和Not I双酶切BMP-2质粒、pPIC9K-HLC质粒，回收BMP-2目的片段及 pPIC9K-HLC载体片段，用T4DNA连接酶连接获得pPIC9K-HLC-BMP-2质粒。 Xho I和Not I双酶切pPIC9K-HLC-BMP-2质粒，验证结果见图4。
接种DNA测序正确(见图5)的转化子于含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，进行质粒大量提取，取适量进行梯度稀释后琼脂糖凝胶电泳检测质粒浓度。用Sal I单酶切质粒，线性化载体。将上述溶液混匀后在37℃条件下反应2h后取1μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定酶切完全，回收pPIC9K-HLC-BMP-2线性化片段。
制备毕赤酵母GS115感受态；将线性化pPIC9K-HLC-BMP-2片段电转化入GS115感受态细胞，涂布平板，将平板在29℃生化培养箱中倒置培养2～ 5天，直到出现单菌落；将菌落依次点到含0.25mg/mL～4.0mg/mL 418抗性的 YPD平板上，进行低拷贝到高拷贝筛选。
G418抗性平板上随机挑取几个单菌落接15mLYPD培养基中29℃， 220rpm振荡培养过夜，菌液分装保存甘油种，剩少部分取适量转接 25mLBMGY培养基29℃，220rpm振荡培养至OD 600达到2～8，将菌液转移至50mL灭菌离心管中，室温4000rpm离心3min后倒掉上清液，用双蒸水重悬，离心倒掉上清后，用25mLBMMY培养基将菌体重新悬浮至OD 600等于1后转入250mL灭菌锥形瓶中，用六层灭菌纱布将瓶口封住，29℃， 250rpm诱导培养。每24h加250μL甲醇，诱导5天后停止培养，将发酵液离心，分别保存上清液和菌体，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测(见图6)、 Western-Blot检测(见图7)。
利用阴/阳离子交换层析、反相色谱法制备高纯度HLC-BMP-2；通过真空冷冻干燥制备HLC-BMP-2融合蛋白多孔材料。
实施例3：
本实施例提供一种HLC-BMP融合蛋白，其制备步骤为：
人工合成HLC基因序列(1251bp，酵母菌偏好)，如下：
CTCGAGAAAAGAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAAC CTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGG CTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCC AGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGG CTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCG CAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCC GGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGC CCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGATCCCCGGGTCCT CCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTG GTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGT CGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAAC CTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTG GATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGA AAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCA GGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGG AAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCA GAACGGTAAGCCAGGTACCCCAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCT GGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTC CTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCG GGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTG AACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCAC CCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTG GGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTA ATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGAATTC
人工合成BMP-2基因序列(385bp，酵母菌偏好)，如下：
CCGGAATTCGGTGGTGGAGGTTCTCAAGCCAAGCACAAGCAAAGA AAGAGATTGAAGTCCTCTTGTAAGAGACACCCATTGTACGTTGACTTCTC TGACGTTGGTTGGAACGACTGGATTGTTGCTCCACCAGGTTACCACGCC TTCTACTGTCACGGTGAGTGTCCATTCCCATTGGCTGATCACTTGAACTC CACTAACCACGCCATTGTTCAAACTTTGGTCAACTCTGTTAACTCTAAGA TTCCAAAGGCTTGTTGTGTCCCAACTGAGTTGTCTGCTATCTCTATGTTGT ACTTGGACGAGAACGAGAAGGTTGTTTTGAAGAACTACCAAGACATGGT TGTTGAGGGTTGTGGTTGTAGATAAGCGGCCGCTAAACTAT
用Xho I和EcoR I双酶切载HLC质粒、pPIC9K质粒，回收HLC目的片段及pPIC9K载体片段，用T4DNA连接酶连接获得pPIC9K-HLC质粒，用EcoR I和Not I双酶切BMP-2质粒、pPIC9K-HLC质粒，回收BMP-2目的片段及 pPIC9K-HLC载体片段，用T4DNA连接酶连接获得pPIC9K-HLC-BMP-2质粒 (酶切验证见图8)。
接种DNA测序正确(测序结果见图9)的转化子于含100μg/mL Amp的 LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，进行质粒大量提取，取适量进行梯度稀释后琼脂糖凝胶电泳检测质粒浓度。用Sal I单酶切质粒，线性化载体。将上述溶液混匀后在37℃条件下反应2h后取1μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定酶切完全(见图10)，回收pPIC9K-HLC-BMP-2线性化片段。
制备毕赤酵母GS115感受态；将线性化pPIC9K-HLC-BMP-2片段电转化入GS115感受态细胞，涂布平板，将平板在29℃生化培养箱中倒置培养2～5天，直到出现单菌落；将菌落依次点到含0.25mg/mL～4.0mg/mL 418抗性的 YPD平板上，进行低拷贝到高拷贝筛选。
G418抗性平板上随机挑取几个单菌落接15mLYPD培养基中29℃， 220rpm振荡培养过夜，菌液分装保存甘油种，取少量菌体提取基因组作为模板，以BMP-2为引物PCR验证目的基因是否在菌种中(见图11)，挑选菌种，取适量转接25mLBMGY培养基，29℃，220rpm振荡培养至OD 600达到 2～8，将菌液转移至50mL灭菌离心管中，室温4000rpm离心3min后倒掉上清液，用双蒸水重悬，离心倒掉上清后，用25mLBMMY培养基将菌体重新悬浮至OD 600等于1后转入250mL灭菌锥形瓶中，用六层灭菌纱布将瓶口封住，29℃，250rpm诱导培养，以同样条件培养未诱导菌株。诱导菌株每24h加250μL甲醇，诱导5天后停止培养，将发酵液离心，分别保存上清液和菌体，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测(见图12)、Western-Blot检测(见图13)。
利用阴/阳离子交换层析、反相色谱法制备高纯度HLC-BMP-2；通过真空冷冻干燥制备HLC-BMP-2融合蛋白多孔材料。
效果验证：
图14为实施例3所获得的HLC-BMP-2融合蛋白多孔材料与类人胶原蛋白材料的形貌图片(a,b)HLC和(c,d)HLC-BMP-2大体形貌观察；(e)HLC 和(f)HLC-BMP-2的SEM形貌观察。所制备材料是直径10mm，高5mm的圆柱体，由扫描电子显微镜可见HLC为多孔结构，HLC-BMP-2为纤维结构。
图15为实施例3所获得的HLC-BMP-2融合蛋白多孔材料与类人胶原蛋白材料植入SD大鼠颅骨标准直径缺损(8mm圆形缺损)8周后的显微CT扫描结果(a)未植入材料；(b)植入HLC；(c)植入HLC-BMP-2。由图可见植入HLC-BMP-2后，SD大鼠颅骨缺损修复的情况明显好于未植入材料组和植入HLC材料组。
核苷酸序列表电子文件
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<212>重组蛋白基因序列
<213> DNA
<220>
<400>
CTCGAGAAAAGAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGATCCCCGGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGTACCCCAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGAATTCGGTGGTGGAGGTTCTCAAGCCAAGCACAAGCAAAGAAAGAGATTGAAGTCCTCTTGTAAGAGACACCCATTGTACGTTGACTTCTCTGACGTTGGTTGGAACGACTGGATTGTTGCTCCACCAGGTTACCACGCCTTCTACTGTCACGGTGAGTGTCCATTCCCATTGGCTGATCACTTGAACTCCACTAACCACGCCATTGTTCAAACTTTGGTCAACTCTGTTAACTCTAAGATTCCAAAGGCTTGTTGTGTCCCAACTGAGTTGTCTGCTATCTCTATGTTGTACTTGGACGAGAACGAGAAGGTTGTTTTGAAGAACTACCAAGACATGGTTGTTGAGGGTTGTGGTTGTAGATAAGCGGCCGC

Claims (10)

1.一种HLC-BMP融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白的基因序列由以下三部分依次组成：HLC基因序列、柔性接头和BMP基因序列，该融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示。
2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述柔性接头的氨基酸编码序列包括(G)n或(GGGGS)n，其中n＝1～4。
3.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、分别合成HLC编码基因和碳端连接了柔性接头的BMP编码基因，并保存于克隆载体；
步骤二、通过核苷酸限制性内切酶切割、核酸琼脂糖凝胶电泳和目的片段切胶回收，将HLC-BMP融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体，经转化和重组子筛选鉴定，获得HLC-BMP融合蛋白表达载体；
步骤三、实现HLC-BMP融合蛋白在宿主细胞中的过表达；
步骤四、纯化过表达产物HLC-BMP融合蛋白，干燥保存。
4.如权利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤一中，HLC包括(Gly-Xaa-Yaa)n的60倍体、(Gly-Xaa-Yaa)n的72倍体、(Gly-Xaa-Yaa)n的84倍体或(Gly-Xaa-Yaa)n的96倍体，其中Xaa、Yaa为Gly以外的任何氨基酸；所述BMP包括BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14或BMP-15中的任意一种。
5.如权利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤二中，将HLC-BMP融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体包括：采用细菌表达时，将HLC-BMP编码基因插入线性化的原核表达载体的相应位点，经细菌转化和重组子筛选鉴定，获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的HLC-BMP表达载体；采用真核表达时，将HLC-BMP编码基因的克隆载体线性化，转化真核细胞和重组子筛选鉴定，获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的HLC-BMP表达载体。
6.如权利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤二中，用于保存HLC-BMP融合蛋白的克隆菌株为原核细胞或真核细胞。
7.如权利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤三中，实现HLC-BMP融合蛋白在宿主细胞中的过表达包括：采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确定HLC-BMP融合蛋白为可溶性表达还是包涵体表达，对可溶性表达收集上清，对包涵体表达收集沉淀后用盐酸胍或尿素溶解。
8.如权利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤四中，纯化表达产物HLC-BMP融合蛋白包括：确定HLC-BMP融合蛋白等电点后采用阴/阳离子交换层析或反相色谱法进行纯化。
9.权利要求1所述HLC-BMP融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、分别合成HLC编码基因和碳端连接了柔性接头的BMP编码基因，并保存于克隆载体；
步骤二、通过核苷酸限制性内切酶切割、核酸琼脂糖凝胶电泳和目的片段切胶回收，将HLC-BMP融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体，经转化和重组子筛选鉴定，获得HLC-BMP融合蛋白表达载体并保存；
步骤三、实现HLC-BMP融合蛋白在宿主细胞中的过表达；
步骤四、纯化表达产物HLC-BMP融合蛋白，干燥保存。
10.如权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述步骤一中，HLC包括(Gly-Xaa-Yaa)n的60倍体、(Gly-Xaa-Yaa)n的72倍体、(Gly-Xaa-Yaa)n的84倍体或(Gly-Xaa-Yaa)n的96倍体，其中Xaa、Yaa为Gly以外的任何氨基酸；所述BMP包括BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14或BMP-15中的任意一种。
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