CN110387366A - 一种aep环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用。本发明通过在在毕赤酵母中进行表达，通过基因串联的方法使AEP环化酶基因串联拷贝数最高达到了5拷贝，当基因拷贝数达到3时AEP环化酶表达量最高，达到0.89±0.03mg/mL。本发明采用一种新的方式验证AEP环化酶的环化能力，通过构建一种串联底物，选取能够较好的在SDS‑PAGE中观察到并且具备环化的可能性的蛋白为底物，并构建包含TEV蛋白酶的底物序列的串联底物，根据蛋白酶切割后底物大小的变化或者条带数量来鉴定是否环化，操作简单、方便，实用性强。

Description

一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用。
背景技术
天冬酰胺内切酶(AEPs)是一类可催化短肽形成环化肽的关键酶，在植物体内分布广泛，其催化形成的大环寡肽具有一个环状主链和一个典型的半胱氨酸结(六个保守的半胱氨酸残基形成三个二硫键)，该结构异常稳定，使得大环寡肽具有多种生物活性因而有作为药物设计框架的巨大应用潜力。然而，从植物组织提取天然AEP环化酶操作难度大，酶的得率低，2014年Nguyen GK研究发现来源于蝶豆的天冬酰胺内切酶butelase1可有效环化大环寡肽Kalata B1的前体，但butelase1并不能在大肠杆菌重组表达，在白花蛇舌草互补DNA文库中鉴定出三种表达的AEP同种型(OaAEP1-3)，并且对于OaAEP1的一个氨基酸进行突变(Glu371Val)得到第四种序列，命名为OaAEP1b，以下简称为AEP。研究发现AEP环化酶可在大肠杆菌重组表达，其表达量为1.8mg/L，其表达量仍不能满足工业生产的要求。
许多工业酶以及药学相关蛋白的成功表达使甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母成为最合适和最强大的蛋白质生产宿主系统之一。它也是膜蛋白和小生物活性和抗微生物肽表达的新兴宿主，它可能是化学合成的新选择。毕赤酵母具有以下优势：1、可以进行高密度发酵；2、可以进行真核生物的翻译后修饰；3、遗传背景清晰；4、含有调控严谨的强AOX1启动子和组成型强GAP启动子；5、可以进行胞外分泌。因此，发明人推测使用毕赤酵母对AEP环化酶进行表达是否会提高AEP环化酶的表达量。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用。
本发明是这样实现的，一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，包括以下步骤：
S1：构建pBDM-AEP载体；
S2：构建多拷贝pBDM-AEP质粒；
S3：将6*His标签构建至多拷贝pBDM-AEP质粒，构建含有His标签的AEP表达载体；
S4：pBDM-AEP-6*His摇瓶诱导表达。
进一步，步骤S2中所述多拷贝pBDM-AEP质粒为包含1-5之间任一整数个目的基因的表达框的质粒。
进一步，步骤S2中构建多拷贝pBDM-AEP质粒时，分别使用同尾酶Xba I和Spe I对载体进行酶切，完成连接。
进一步，在步骤S4后面增加AEP环化酶环化能力鉴定步骤。
进一步，所述AEP环化酶环化能力鉴定步骤包括：
步骤1：获取AEP环化酶的环化底物；
步骤2：AEP环化酶与环化底物反应；
步骤3：利用蛋白酶切割步骤2中的反应产物，并根据SDS-PAGE检测的目标条带结果判断AEP环化酶的环化能力。
进一步，步骤1中所述环化底物为包含SUMO蛋白酶底物序列的串联底物。
进一步，所述串联底物还包含TEV蛋白酶底物序列。
进一步，步骤S3中所述蛋白酶为TEV蛋白酶。
如权利要求1-8任一所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法在制备AEP环化酶中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本研究合成了进行密码子优化的白花蛇舌草(Oldenlandia affinis)中AEP(OaAEP1b)环化酶编码基因，并将其构建到表达载体上，在毕赤酵母中进行表达。通过基因串联的方法使AEP环化酶基因串联拷贝数最高达到了5拷贝，当基因拷贝数达到3时AEP环化酶表达量最高，达到0.89±0.03mg/mL。
传统检测环化能力用方法为基质辅助激光解吸附质谱技术，但是该技术对仪器设备与操作，检测样品制备(如需要用重水标记底物)具有较高的要求。而本研究采用一种新的方式验证AEP环化酶的环化能力，通过构建一种串联底物，选取能够较好的在SDS-PAGE中观察到并且具备环化的可能性的蛋白为底物，在其两端分别加上较长的Linker和AEP环化酶的识别序列，并在C端的较长的Linker和AEP环化酶的识别序列之间加入TEV蛋白酶的底物序列，在与AEP环化酶作用后通过TEV蛋白酶对反应后底物进行切割，根据切割后底物大小的变化或者条带数量来鉴定是否环化。实验证明可以环化，其环化效率最高可达到38.8％，也进一步说明AEP环化酶具有广谱性，可以环化非天然环化底物。
本发明的AEP环化酶在24h时可切割66.2％的底物蛋白，在进一步提高AEP环化酶的环化活性后将AEP环化酶对非天然环化抗菌肽进行环化，对于提高其稳定性和延长其半衰期具有极其重要的应用意义。AEP环化酶表达量的提高和环化活性的验证为其在肽工程中的应用奠定了良好的基础。
附图说明
图1是AEP环化酶表达载体的构建原理示意图；
图2是AEP环化酶多拷贝表达载体的构建原理示意图；
图3是AEP环化酶摇瓶发酵上清液分泌蛋白SDS-PAGE检测结果；
图4是带有His标签的AEP环化酶摇瓶发酵上清液分泌蛋白SDS-PAGE检测结果；
图5是AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株不同时间点蛋白质浓度变化曲线；
图6是毕赤酵母菌株AEP-6*His-3C摇瓶上清纯化的SDS-PAGE鉴定图；
图7是AEP环化酶纯化后的western blotting验证图；
图8是AEP环化酶糖基化位点示意图；
图9是Endo H处理后的AEP环化酶SDS-PAGE图；
图10是AEPs环化酶串联底物验证环化原理图；
图11是AEP环化酶与串联底物蛋白反应24h的SDS-PAGE图(左)以及与AEP环化酶反应后的串联底物与TEV蛋白酶反应的SDS-PAGE图(右)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1 AEP环化酶在毕赤酵母中的表达
S1：pBDM-AEP载体的构建
构建原理见图1。
首先，通过文献资料获取AEP的氨基酸序列，将序列交给武汉金开瑞生物工程有限公司用以基因合成。以武汉金开瑞生物工程有限公司提供的含有AEP序列的质粒为模板，以BDM-AEP-F：GTCAGCACGTGATGGTGATTATCTTCATTTACCG，见SEQ ID NO:1和BDM-AEP-R：GGCCATTAAGGAATAGAAGCGCATGCCTGAGAGG，见SEQ ID NO:2，为正反引物进行AEP片段PCR扩增，PCR总体系为100μL，其中10×pfu Buffer10μL，dNTPs(10mmol/L)4μL，正向引物和反向引物各4μL，质粒为模板：20-30ng，最后加入pfu DNA聚合酶4μL，最后加水补至100μL。将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于95℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于95℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度(57℃)，一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持40秒钟(扩增1356bp片段)，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持5min，使产物延伸完整，4℃保存。PCR扩增结束后进行电泳检测，正确条带大小应为1356bp，在确认得到目的条带后进行凝胶回收。
然后，用限制性内切酶Cpo I和Not I对pBDM表达载体在37℃反应4h进行双酶切，酶切总体系为50μL，其中DNA片段5μg，10x Buffer5μL，限制性内切酶Cpo I和Not I各2μL，最后加水至50μL。酶切结束后以未酶切的pBDM表达载体为对照用浓度为0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在确认酶切正确后使用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行凝胶回收。将凝胶回收得到的AEP片段用T4 DNA聚合酶处理，T4DNA聚合酶具有3’-5’的外切酶活性，而不具有5’-3’的外切酶活性，当在反应体系中加入dTTP核苷酸时，T4 DAN聚合酶会在单链DNA模板上从3’-5’逐步消化DNA模板上的核苷酸，在碰到尿嘧啶脱氧核糖核苷酸时就会停止消化。原因在于T4DNA聚合酶还具有5’-3’的聚合活性，当反应体系中含有dTTP时，T4DNA聚合酶就会把之前由于其外切酶活性而切掉的尿嘧啶脱氧核糖核苷酸给重新补上去，这样就会一直处于酶切和补充尿嘧啶脱氧核糖核苷酸的一个循环当中，这样T4 DNA聚合酶碰到尿嘧啶脱氧核糖核苷酸之后就不会再继续作用了，反应总体系为50μL，其中DNA片段2～3μg，T4 DNA聚合酶Buffer10μL，dTTP5μL，BSA5μL，T4 DNA聚合酶0.5μL，最后加水至50μL，处理后进行凝胶回收。处理后的AEP片段会形成与酶切后pBDM载体互补配对的粘性末端，因此在T4 DNA连接酶的作用下，AEP片段会插入到线性化的pBDM表达载体中，通过酶连转化后进行菌落PCR筛选并抽质粒测序进一步验证从而得到序列正确的重组质粒。
S2：pBDM-AEP多拷贝的构建及摇瓶诱导表达
1.pBDM-AEP多拷贝的构建原理见图2
在确认步骤S1中单拷贝的pBDM-AEP表达载体构建成功后，将构建好的单拷贝的pBDM-AEP表达载体用Xba I和BamH I进行双酶切。酶切总体系为50μL，其中DNA片段5μg，10xBuffer5μL，限制性内切酶Xba I和BamH I各2μL，最后加水至50μL。酶切结束后以未酶切的pBDM表达载体为对照，用浓度为0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。通过以未酶切载体作为对照进行琼脂糖凝胶检测确认是否酶切完全，在确认酶切完全后进行凝胶回收得到线性化表达框片段(AOX1+MF4I+AEP-TT)。
同时将一份同样的pBDM-AEP表达载体用SpeI和BamHI两个酶进行双酶切，酶切结束后以未酶切的pBDM表达载体为对照进行电泳检测，在确认酶切完全后进行凝胶回收得到线性化质粒。
由于Xba I和Spe I属于同尾酶，也就是说它们酶切后产生的粘性末端可以进行互补配对，因此用Xba I和BamH I进行双酶切得到的AOX1+MF4I+AEP-TT表达框片段可以插入到使用Spe I和BamH I切开的线性化质粒中。这样插入成功重组质粒就会含有目的基因的两个完整的表达框，命名为pBDM-AEP-2C。
将双酶切得到的表达框片段和双酶切后的线性化质粒进行酶连反应，T4 DNALigase是一种封闭DNA链上的切口酶，酶切后的DNA片段和质粒可以通过T4 DNA Ligase形成重组质粒，酶连总体系为50μL，其中DNA片段与载体的摩尔比为3：1，10x T4 DNA LigaseBuffer2μL，T4 DNA Ligase0.2μL，最后加水至50μL，将混合好的酶切体系用封口膜将管口封好于22℃条件下反应1h或者是16℃条件下反应过夜，时间到了之后取5μL的酶连产物进行大肠杆菌的转化。在超净工作台内取50μL的感受态于已经灭菌过的1,5mL的EP管内，再加入5μL的酶连产物，用移液枪将其轻轻混匀，在冰上静置10min，10min后将1.5mL的EP管于42℃水浴锅中热激35s，并加入500μL的LB液体培养基，37℃摇床培养1h，1h后用常温离心机4800rpm离心2min,去掉450μL的上清，然后将沉淀重悬后取50μL培养物涂布相应抗性LB平板，于37℃培养箱倒置培养过夜。以原始载体作为对照通过琼脂糖凝胶检测载体构建前后大小的变化来确定是否构建成功。在使用琼脂糖凝胶初步判断成功后用Xba I和BamH I双酶切进行进一步验证，酶切总体系为10μL，其中DNA片段1μg，10x Buffer1μL，限制性内切酶Xba I和BamH I各0.4μL，最后加水至10μL。因为二拷贝的表达框是单拷贝的两倍，如果构建后质粒大小变大且经过Xba I和BamH I双酶切验证正确，那么可以确认二拷贝质粒构建成功。同样的原理按照实验需要构建三拷贝质粒和四拷贝质粒，分别命名为pBDM-AEP-3C和pBDM-AEP-4C。
2.pBDM-AEP摇瓶诱导表达
将构建成功的重组质粒pBDM-AEP、pBDM-AEP-2C、pBDM-AEP-3C和pBDM-AEP-4C转化，在转化之前将构建成功的pBDM系列载体用Sal I酶反应成线性化载体，酶切总体系为50μL，其中DNA片段5μg，10x Buffer5μL，限制性内切酶Sal I2μL，最后加水至50μL，酶切反应在水浴锅中37℃条件下酶切4h并溶液回收。然后将回收后的产物转入毕赤酵母GS115感受态细胞，将2mmol/L的电转杯清洗干净并在烘箱中烘干，保证没有多余的水分，然后将电转杯置于紫外线下照射20min左右后，20min后放在冰上预冷。然后将100μL制备好的毕赤酵母GS115感受态细胞和1.5μg左右线性化的pBDM系列载体混合于1.5mL的EP管中，整个过程在超净工作台进行并将EP管置于冰上预冷静置5min。将EP管中的混合物转移到电转杯中，并盖上盖子，迅速将电转杯的外表面擦干，待擦干后将电转杯放于电转仪的电击槽中准备电击，电击电压为1.5kv，在电击结束后迅速在超净工作台中向电转杯加入300μL的YPD和300μL1 M的Sorbitol，并混合均匀，将混合物从电转杯吸出至1.5mL的EP管于30℃培养箱中孵育0.5h，之后再转入30℃摇床培养1.5h，在培养结束后取适量涂布于MD平板(值得注意的是在电击之前，YPD和Sorbitol就需要在1.5mL EP管中混合均匀)。将MD平板在30℃培养箱中倒置培养，直到观察到单菌落，一般需要两天时间。
待MD平板上长出的毕赤酵母菌长大后，随机挑取部分较大的菌，重新点到YPD平板上进行培养，并做好标记，然后通过毕赤酵母菌落PCR进行重组菌株筛选，在超净工作台内从转化平板上随机选取10个单菌落分别加入到PCR管中，PCR管中各含有10μL无菌水。根据PCR的反应体系逐步加样，PCR总体系为100μL，其中10×pfu Buffer10μL，dNTPs(10mmol/L)4μL，正向引物和反向引物各4μL，质粒为模板：20-30ng，最后加入pfu DNA聚合酶4μL，最后加水补至100μL，但不同的是不加模板，在混匀后按每管8μL的混合液进行分装。在含有单菌落的无菌水中取出2μL加入到已经分装好的PCR反应液中，注意一一对应，一切准备就绪后在PCR仪上设置合适的PCR反应条件进行反应。在PCR完成后将样品进行电泳检测，若跑胶结果显示PCR样品的条带清晰且大小为1356bp，则为实验需要的菌株。根据酵母菌落PCR结果，分别挑取不同拷贝数的重组菌株3-5个进行摇瓶诱导培养。
将重组质粒pBDM-AEP、pBDM-AEP-2C、pBDM-AEP-3C和pBDM-AEP-4C转化到毕赤酵母中得到的重组菌株重新命名为AEP-1C、AEP-2C、AEP-3C、AEP-4C。毕赤酵母菌株AEP-1C、AEP-2C、AEP-3C、AEP-4C先分别在50mL BMGY培养基中培养36h左右，酵母菌的OD值大约为15左右，再通过3000rpm离心5min收集菌体，转接到25mL BMMY培养基中进行终浓度为1％的甲醇诱导表达，并每隔24h加一次等量的甲醇和取样跑SDS-PAGE检测AEP分泌表达情况。
SDS-PAGE结果见图3，其中A:1/2/3/4：AEP环化酶1C/2C/3C/4C重组菌株第1天甲醇诱导表达情况；B:1/2/3/4：AEP环化酶AEP-1C/2C/3C/4C重组菌株在第2天诱导表达情况；C:1/2/3/4：AEP环化酶AEP-1C/2C/3C/4C重组菌株在第3天诱导表达情况；D:1/2/3/4：AEP环化酶AEP-1C/2C/3C/4C重组菌株在第4天诱导表达情况；E:1/2/3/4：AEP环化酶AEP-1C/2C/3C/4C重组菌株在第5天诱导表达情况。可以看出：在一定拷贝数的范围内，AEP环化酶的表达量会随着拷贝数的增加而增加。在AEP环化酶四拷贝，甲醇诱导第5天时其表达量最高，经过Bradford方法检测，其蛋白质浓度为0.68±0.01mg/mL。但由于AEP环化酶预测的大小为49.7kDa，而从SDS-PAGE图中却发现蛋白质条带的大小偏大，推测AEP在毕赤酵母分泌表达的过程中，可能存在翻译后修饰。
S3：pBDM-AEP-6*His多拷贝的构建
为了纯化得到在毕赤酵母中表达的AEP环化酶，于是在AEP基因序列的N端添加了一个6*His标签，从而可以使用Ni柱亲和层析纯化得到AEP环化酶。与前述构建多拷贝的方法相同，只有PCR引物不同，正向引物BDM-AEP-His-F：GTCAGCACGTGATGGTGATTATCTTCATTTACCG，见SEQ ID NO:3，反向引物BDM-AEP-His-R：GGCCATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGAATAGAAGCGCATGCCTGAGAGG，见SEQ ID NO:4。分别构建含有His标签的AEP表达载体，且构建到了5拷贝，分别命名为：pBDM-AEP-6*His、pBDM-AEP-6*His-2C、pBDM-AEP-6*His-3C、pBDM-AEP-6*His-4C和pBDM-AEP-6*His-5C。
S4：pBDM-AEP-6*His摇瓶诱导表达
将构建成功的重组质粒pBDM-AEP-6*His、pBDM-AEP-6*His-2C、BDM-AEP-6*His-3C、pBDM-AEP-6*His-4C和pBDM-AEP-6*His-5C转入毕赤酵母GS115感受态细胞：将2mmol/L的电转杯清洗干净并在烘箱中烘干，保证没有多余的水分，然后将电转杯置于紫外线下照射20min左右后，20min后放在冰上预冷。然后将100μL制备好的毕赤酵母GS115感受态细胞和1.5μg左右线性化的pBDM系列载体混合于1.5mL的EP管中，整个过程在超净工作台进行并将EP管置于冰上预冷静置5min。将EP管中的混合物转移到电转杯中，并盖上盖子，迅速将电转杯的外表面擦干，待擦干后将电转杯放于电转仪的电击槽中准备电击，电击电压为1.5kv，在电击结束后迅速在超净工作台中向电转杯加入300μL的YPD和300μL1 M的Sorbitol，并混合均匀，将混合物从电转杯吸出至1.5mL的EP管于30℃培养箱中孵育0.5h，之后再转入30℃摇床培养1.5h，在培养结束后取适量涂布于MD平板(值得注意的是在电击之前，YPD和Sorbitol就需要在1.5mL EP管中混合均匀)。将MD平板在30℃培养箱中倒置培养，直到观察到单菌落，一般需要两天时间。通过毕赤酵母菌落PCR进行重组菌株筛选，在超净工作台内从转化平板上随机选取10个单菌落分别加入到PCR管中，PCR管中各含有10μL无菌水。根据PCR的反应体系逐步加样，PCR总体系为100μL，其中10×pfu Buffer10μL，dNTPs(10mmol/L)4μL，正向引物和反向引物各4μL，质粒为模板：20-30ng，最后加入pfu DNA聚合酶4μL，最后加水补至100μL，但不同的是不加模板，在混匀后按每管8μL的混合液进行分装。在含有单菌落的无菌水中取出2μL加入到已经分装好的PCR反应液中，注意一一对应，一切准备就绪后在PCR仪上设置合适的PCR反应条件进行反应。在PCR完成后将样品进行电泳检测，若跑胶结果显示PCR样品的条带清晰且大小为1356bp，则为实验需要的菌株。根据菌落PCR结果在重组质粒pBDM-AEP-6*His、pBDM-AEP-6*His-2C、BDM-AEP-6*His-3C、pBDM-AEP-6*His-4C和pBDM-AEP-6*His-5C转化得到的重组菌株中各挑取3-5个毕赤酵母单菌落进行摇瓶培养。将重组质粒pBDM-AEP-6*His、pBDM-AEP-6*His-2C、BDM-AEP-6*His-3C、pBDM-AEP-6*His-4C和pBDM-AEP-6*His-5C转化到毕赤酵母GS115中得到的重组菌株重新命名为AEP-6*His-1C、AEP-6*His-2C、AEP-6*His-3C、AEP-6*His-4C、AEP-6*His-5C。毕赤酵母菌株AEP-6*His-1C、AEP-6*His-2C、AEP-6*His-3C、AEP-6*His-4C、AEP-6*His-5C先分别在50mLBMGY培养基中培养36h左右，其OD值增加到15左右时，再转接到25mL BMMY培养基进行甲醇诱导。诱导时在250mL锥形瓶中每隔24h加入终浓度为1％的甲醇来诱导AEP环化酶的分泌表达。定期取摇瓶发酵上清液分泌得蛋白进行SDS-PAGE检测。
检测结果见图4，其中A:1/2/3/4/5：AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株在第1天诱导表达情况；B:1/2/3/4/5：AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株在第2天诱导表达情况；C:1/2/3/4/5：AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株在第3天诱导表达情况；D:1/2/3/4/5：AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株在第4天诱导表达情况；E:1/2/3/4/5：AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株在第5天诱导表达情况。F:1/2/3/4/5：AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株在第6天诱导表达情况；G:1/2/3/4/5：AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株在第7天诱导表达情况；H:1/2/3/4/5：AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株在第8天诱导表达情况。
可以看出：在一定拷贝数范围内，随着AEP环化酶基因表达框串联数目的增多，AEP环化酶的分泌表达量也随之递增。根据图5中AEP环化酶AEP-6*His-1C/2C/3C/4C/5C重组菌株不同时间点蛋白质浓度变化曲线可知，AEP环化酶三拷贝的毕赤酵母表达菌株AEP-6*His-3C在甲醇诱导第7天后，蛋白质分泌表达量最高，为0.89±0.03mg/mL。但是，AEP环化酶分泌表达的条带与预测的大小相比偏大，故推测可能AEP在毕赤酵母表达中存在翻译后修饰，可能为糖基化修饰。
S5：AEP环化酶Ni柱亲和层析纯化
由摇瓶结果可知，AEP环化酶三拷贝菌株的蛋白质分泌表达量最高，因此将毕赤酵母菌株AEP-3C的摇瓶分泌上清进行Ni柱亲和层析，通过Elution Buffer纯化得到目的蛋白并检测目的蛋白AEP的纯化结果。
SDS-PAGE鉴定图如图6所示，结果表明，AEP环化酶预测的大小比表达的条带偏小，分析可能是翻译后修饰中的糖基化修饰而导致的蛋白分子量较大。
S6：AEP环化酶Western blot鉴定分析及糖基化检测
为了验证表达的蛋白质是否为AEP环化酶，选择用Western blotting来验证，Western blotting结果如图7所示，其中M：蛋白预染Marker；泳道1：毕赤酵母诱导表达的蛋白质经Ni柱纯化后得到的条带；泳道2：阴性对照；泳道3：阳性对照。阴性对照为不含有His标签的蛋白质，阳性对照为确认含有His标签的绿色荧光蛋白GFP，结果显示在毕赤酵母利用甲醇诱导8天后得到的蛋白质经Ni柱纯化后得到的为AEP环化酶。
由于表达的蛋白质分子量偏大，可能存在糖基化的翻译后修饰的特点，根据糖基化网站分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)AEP环化酶有3个N-糖基化位点，见图8框线处。糖苷内切酶H(Endo H)能够对N-糖蛋白中的高甘露糖和某些杂合型寡聚糖的核心壳二糖核心进行切割，因而可以用来确定蛋白质中是否存在N-糖基化。将纯化的AEP环化酶变性后用Endo H处理，于37℃条件下反应1h后进行SDS-PAGE检测，结果见图9，其中泳道1：未经过处理的AEP环化酶；泳道2：Endo H处理后的AEP环化酶；M：蛋白预染Marker。结果显示：AEP环化酶经过Endo H处理后其蛋白质大小会减小，但同时还是比预测的蛋白质大，因此，AEP环化酶中在存在有N-糖基化修饰的情况下，可能存在O-糖基化等其他翻译后修饰。
实施例2 AEP环化酶环化能力鉴定
步骤1：获取AEP环化酶的环化底物
由于SUMO蛋白质大小为11.0kDa，除了能够较好地在SDS-PAGE中观察到，还具备环化的可能性，因此将其作为AEP环化酶的环化底物。在SUMO蛋白酶底物的N端加上GGGGSGGGGS，在SUMO蛋白酶底物的C端依次加上较长的Linker1(GSGS)、TEV蛋白酶的底物序列(ENLYFQ/S)、较长的Linker2(DVGGGGSEGGGSGGPGSGGEGSAGGGSAGGGS)和6*His(HHHHHH)，最后在两端加上AEP环化酶的识别序列形成一个串联底物(GLP-SUMO蛋白酶底物-Linker1-TEV蛋白酶底物-Linker2-STRN/GLP-6*His)，AEP环化酶的识别序列见SEQ ID NO:5。通过重叠延伸PCR构建串联底物，正向引物为
SUMO-TEV-F：aactttaagaaggagatataccatgggcctgcaactgaaaggtttgccagtag，见SEQ ID NO:6；
反向引物为
SUMO-TEV-R：tcagtggtggtggtggtggtgctcgaggctcggcagcccgttgcgagtgctgggccattaaggaatagaagcgcatgcctgagagg，见SEQ ID NO:7。
为正反引物进行AEP片段PCR扩增，PCR总体系为100μL，其中10×pfu Buffer10μL，dNTPs(10mmol/L)4μL，正向引物和反向引物各4μL，质粒为模板：20-30ng，最后加入pfu DNA聚合酶4μL，最后加水补至100μ，PCR扩增结束后进行电泳检测，正确条带大小应为531bp，在确认得到目的条带后进行凝胶回收。
步骤2：AEP环化酶与环化底物反应
将构建成功的串联底物载体转入大肠杆菌表达菌株，在超净工作台内取50μL的感受态BL21(DE3)于已经灭菌过的1.5mL的EP管内，再加入5μL的酶连产物，用移液枪将其轻轻混匀，在冰上静置10min。10min后将1.5mL的EP管于42℃水浴锅中热激35s，并加入500μL的LB液体培养基，37℃摇床培养1h,1h后用常温离心机4800rpm离心2min,去掉450μL的上清，然后将沉淀重悬后取50μL培养物涂布相应抗性LB平板，于37℃培养箱倒置培养过夜。转化后进行串联底物蛋白纯化，待平板长出单菌落后，挑取单菌落到10mL的摇菌管中，摇菌管中加入2mL的LB液体培养基(含有50mg/mL的卡那霉素)，于37℃摇床培养过夜。第二天将10mL摇菌管中的菌液转接到1 L的锥形瓶中，其中1 L的锥形瓶中含有200mL的LB液体培养基(含有50mg/mL的卡那霉素)，转接后37℃摇床培养2～3h左右测其OD600，当OD600在0.6-0.8之间即可以开始诱导，向培养液中加入1 M IPTG使其终浓度为0.5mmol/L IPTG可诱导蛋白表达，之后将培养液于18℃摇床诱导24h，诱导结束后4℃、4800rpm离心10min收集菌体，将收集的菌体用Lysis Buffer重悬进行超声波破菌，超声波进行3秒停6秒，功率为35％破菌10分钟，在破菌结束后将破菌液进行低温高速离心得到破菌上清，将破菌上清进行Ni柱亲和层析，首先在蛋白纯化柱中加入1mL的Ni-NTA His Bind resin，然后用Wash Buffer等体积洗涤树脂两次，在一切准备好后将破菌上清加入到蛋白纯化柱中，每加入一次破菌上清就用等体积的Wash Buffer来洗涤树脂，在破菌上清全部加完后用Elution Buffer洗脱得到目的蛋白质。然后将在大肠杆菌中表达纯化的AEP环化酶激活：将AEP环化酶在激活缓冲液(1mmol/L EDTA、0.5mmol/L Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，用冰醋酸将pH调至4.5)中于37℃，pH4.5的条件下反应5h。将AEP环化酶和底物融合蛋白按照摩尔比1:5在反应Buffer(50mmol/L sodium acetate、50mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.5μM Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，pH5.0)中反应，于37℃水浴锅中做不同时间反应：4h、12h和24h。
步骤3：蛋白酶切割反应产物，SDS-PAGE检测环化能力
在反应结束后通过SDS-PAGE检测底物融合蛋白切割情况，总体系为50μL，于37℃水浴锅中反应24h，然后在反应后的50μL体系中取10μL作为下一步反应的底物，并在其中加入TEV蛋白酶以及对应的反应Buffer(500mM Tris-Hcl,pH8.0,5mM EDTA，1％Tween-20(v/v)，10mM DTT)，总体系依然是50μL，于4℃反应过夜。串联底物蛋白的大小是26.4kDa，如果AEP环化酶作用于串联底物形成环化状态，则再与TEV蛋白酶反应后即线性化，那么在SDS-PAGE上就会呈现一条带，其大小应为24.38kDa。如果AEP环化酶作用于串联底物未形成环化状态，则与TEV蛋白酶反应后，TEV蛋白酶就会将反应后的串联底物切割成两部分，那么在SDS-PAGE上就应该有两条带，一条带大小为20.31kDa，另一条大小为4.07kDa，且较大的一部分蛋白质大小与环化后由于TEV蛋白酶再次线性化形成的蛋白质大小相差约4.1kDa，原理见图10。
蛋白反应及SDS-PAGE结果见图11，左侧为AEP环化酶与串联底物蛋白反应24h的SDS-PAGE图，右侧为AEP环化酶反应后的串联底物与TEV蛋白酶反应的SDS-PAGE图；其中泳道1：来源于毕赤酵母中的AEP环化酶与串联底物蛋白反应24h；泳道2：串联底物蛋白；泳道3：串联底物蛋白与来源于毕赤酵母中的AEP环化酶反应后与TEV蛋白酶反应；泳道4：串联底物蛋白与TEV蛋白酶反应；M：蛋白预染Marker。由图可知：泳道1-2较小条带与24.38kDa一致，说明AEP环化酶作用于串联底物的C端，具有切割活性，根据软件定量计算显示在反应24h时来源于毕赤酵母的AEP环化酶可切割60.3％的底物蛋白；泳道3中间条带的大小与24.38kDa一致，泳道3-4最小的条带大小相同与20.31kDa一致，另一条大小为4.07kDa的条带由于太小而未能在SDS-PAGE上看到，由此可推断出AEP环化酶可以使底物环化，根据软件定量计算显示来源于毕赤酵母的AEP环化酶为38.8％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(BDM-AEP-F)
<400> 1
gtcagcacgt gatggtgatt atcttcattt accg 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(BDM-AEP-R)
<400> 2
ggccattaag gaatagaagc gcatgcctga gagg 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(BDM-AEP-His-F)
<400> 3
gtcagcacgt gatggtgatt atcttcattt accg 34
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(BDM-AEP-His-R)
<400> 4
ggccattagt ggtggtggtg gtggtgagga atagaagcgc atgcctgaga gg 52
<210> 5
<211> 169
<212> PRT
<213> AEP(AEP)
<400> 5
Gly Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ser
1 5 10 15
Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro
20 25 30
Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe
35 40 45
Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe
50 55 60
Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp
65 70 75 80
Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu
85 90 95
Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Asp Val Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Ser Ser Thr Arg Asn Gly Leu Pro
145 150 155 160
Ser Leu Glu His His His His His His
165
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(SUMO-TEV-F)
<400> 6
aactttaaga aggagatata ccatgggcct gcaactgaaa ggtttgccag tag 53
<210> 7
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(SUMO-TEV-R)
<400> 7
tcagtggtgg tggtggtggt gctcgaggct cggcagcccg ttgcgagtgc tgggccatta 60
aggaatagaa gcgcatgcct gagagg 86

Claims (9)

1.一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：构建pBDM-AEP载体；
S2：构建多拷贝pBDM-AEP质粒；
S3：将6*His标签构建至多拷贝pBDM-AEP质粒，构建含有His标签的AEP表达载体；
S4：pBDM-AEP-6*His摇瓶诱导表达。
2.根据权利要求1所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：步骤S2中所述多拷贝pBDM-AEP质粒为包含1-5之间任一整数个目的基因的表达框的质粒。
3.根据权利要求1所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：步骤S2中构建多拷贝pBDM-AEP质粒时，分别使用同尾酶Xba I和Spe I对载体进行酶切，完成连接。
4.根据权利要求1所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：在步骤S4后面增加AEP环化酶环化能力鉴定步骤。
5.根据权利要求4所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于，所述AEP环化酶环化能力鉴定步骤包括：
步骤1：获取AEP环化酶的环化底物；
步骤2：AEP环化酶与环化底物反应；
步骤3：利用蛋白酶切割步骤2中的反应产物，并根据SDS-PAGE检测的目标条带结果判断AEP环化酶的环化能力。
6.根据权利要求5所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：步骤1中所述环化底物为包含SUMO蛋白酶底物序列的串联底物。
7.根据权利要求6所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：所述串联底物还包含TEV蛋白酶底物序列。
8.根据权利要求7所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：步骤S3中所述蛋白酶为TEV蛋白酶。
9.如权利要求1-8任一所述的一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法在制备AEP环化酶中的应用。
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