CN112359035A - 一种蛋白酶k多拷贝菌种构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，属于生物技术领域。一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝菌种，具体步骤主要如下：S1、多拷贝载体构建；S2、多拷贝菌种的筛选；S3、多拷贝菌种大规模发酵；本发明利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝串联表达盒；这种构建方法的优势在于重组质粒的拷贝数是可控的，不需要依赖于对高浓度抗性药物的筛选，也不需要进行大规模的筛选，基因剂量效应被认为是毕赤酵母表达外源蛋白的最重要的因素，多拷贝菌株的表达量比单拷贝高出很多倍，从而提高了蛋白酶K的产量，价格更低廉，使之可以被运用到各个领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法。
背景技术
蛋白酶K属于丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球菌产生的一类主要蛋白酶；因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶K；蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键；在pH4.0到pH12.0均有活性，最适pH在7.5-8.0之间，最适温度在50-55℃之间。在0.2-1％SDS或者10mM尿素存在下，蛋白酶K显示出更高的活力，而在常用浓度的EDTA，Triton X-100，盐酸胍存在下均对蛋白酶K活力影响不大。
随着人类对疾病的认识逐步深入到基因层面，以及基因检测技术的进步，通过对各种DNA和/或RNA样本的病原性突变的检测来实现对疾病的检测和诊断；蛋白酶K主要在DNA、RNA提取过程中抑制核酸酶和原位杂交中起着重要的作用；另外，蛋白酶K可替代DEPC处理RNA抽提用的离心管和枪头,实现灭活RNase A的目的,也用于处理RNase-Free的水，为脉冲电场凝胶电泳、RT-PCR等准备无DNase、RNase的样品，提取组织中非蛋白成份时降解含有蛋白质的杂质用途(例如DNA疫苗和肝素的制备)，在生物加工过程中，如肉类嫩化，对生活和工业水中病毒污染进行消毒，作为洗涤剂中加酶洗衣粉的添加剂，和生物检测中都有很广泛的应用。
目前工业化的蛋白酶K生产菌株产酶水平低，商品酶价格较高，妨碍了蛋白酶K的应用推广，加上传统的诱变选育高产菌株的方法工作量大且效率低，具有盲目性，不利于实验的快速开展；如何制备量高和价低的蛋白酶K就成了关键，优化蛋白酶K基因的密码子和序列提高蛋白酶K活性是常用的手段，但往往工作量大且提高活性的程度有限，往往并没有很大的提升。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中优化蛋白酶K基因的密码子和序列提高蛋白酶K活性是常用的手段，但往往工作量大且提高活性的程度有限，往往并没有很大的提升问题，而提出的一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝菌种。
优选的，具体步骤主要如下：
S1、多拷贝载体构建；
S2、多拷贝菌种的筛选；
S3、多拷贝菌种大规模发酵。
优选的，步骤S1中对多拷贝载体构建具体如下：
第一步、选择载体pHBM905BDM，并将其通过CpoⅠ和NotⅠ酶切；
第二步、利用Overlapping PCR方法合成蛋白酶K片段，然后进行纯化；
第三步、使用T4 DNA聚合酶处理纯化后的目的片段，与经CpoⅠ和NotⅠ酶切后载体pHBM905BDM连接，转化大肠杆菌XL-Gold，在含Amp的LB平板上挑取转化子；
第四步、利用菌落PCR法对重组转化子进行鉴定，鉴定正确的转化子送去测序，抽取正确的单拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒；
第五步、在已构建好的单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体基础上，首先利用限制性内切酶EcoRI和BamHI对单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体进行双酶切，胶回收纯化得到6.3-6.8kb的片段作为多拷贝载体1；
第六步、然后用两对限制性内切酶SpeI-EcoRI和XbaI-BamHI分别对单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体进行双酶切，胶回收纯化大小为2.5kb的小片段，得到片段1和2；
第七步、将片段1、片段2和载体1混合均匀，转化大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞，37℃培养16h，挑取单菌落接种液体LB，提取质粒，构建两拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒；
第八步、以上述同样的方法步骤构建三拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒，四拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒和五拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒。
优选的，所述第二步的纯化方法为：待纯化PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在蓝光仪下切割目的条带，最大限度地去除多余部分的琼脂糖。
优选的，多拷贝菌种的筛选步骤具体如下：
步骤一、将上述已构建好的1-5拷贝pHBM905BDM-PK分别用SalI线性化后并回收纯化；
步骤二、纯化完成后，通过电击法转化Pichia pastoris GS115感受态细胞；
步骤三、2-3天后挑取MD平板上的酵母菌转化子进行含1％干酪素的BMMY平板筛选，将含有单拷贝pHBM905BDM-PK的酵母重组子菌株命名为MPKS1，同样，将含有二到五拷贝pHBM905BDM-PK的酵母重组子菌株分别命名MPKS2、MPKS3、MPKS4、MPKS5；
步骤四、接种菌株PK1-PK5进行摇瓶诱导表达。
优选的，多拷贝菌种大规模发酵方法具体如下：
A1、种子培养基的制备：挑取单菌落到BMGY培养基中，28℃，220rpm培养24h。
A2、将菌株PK1-PK5在毕赤酵母中的发酵罐诱导表达，分菌体生长阶段和诱导阶段两步完成。
优选的，菌体生长阶段：发酵参数为：温度28℃，用28％氨水调节至pH5.8，通风量为0.5vvm，搅拌速度300-700rpm，溶氧量20％-30％；从接种开始16-20h后，发酵罐中的甘油被消耗尽，此时开始流加50％甘油；当菌体密度OD600＝300时停加甘油，准备进入第二阶段。
优选的，诱导阶段：发酵参数为：温度25℃，pH5.5，通风量为0.5vvm，搅拌速度500-750rpm，溶氧量20-30％。当停加甘油后，流加甲醇和山梨醇。在初始的2-3h，是菌体对甲醇的适应期，甲醇会在发酵罐中积累，DO值不稳定。最终DO会达到稳定状态并保持稳定状态。当菌体完全适应利用甲醇2-4h，并以甲醇为限制性碳源，DO值会达到稳定状态。在适应期后，继续保持低速流加甲醇至少2h，之后将流加速度提高1倍并保持至发酵结束，整个甲醇流加过程大约持续诱导90h左右。当酶活开始下降，发酵结束，离心去除菌体，上清液即为含蛋白酶K的粗酶液。
优选的，，在发酵每个阶段取样进行分析，一天至少两次；每个时间点取样10mL，样品被用来分析细胞生长情况。
优选的，在分析细胞生长情况时，用Bradford法测定蛋白质浓度，紫外分光光度计法测蛋白酶K的活性。
与现有技术相比，本发明提供了一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，具备以下有益效果：
1、该蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝串联表达盒；这种构建方法的优势在于重组质粒的拷贝数是可控的，不需要依赖于对高浓度抗性药物的筛选，也不需要进行大规模的筛选，基因剂量效应被认为是毕赤酵母表达外源蛋白的最重要的因素，多拷贝菌株的表达量比单拷贝高出很多倍，从而提高了蛋白酶K的产量，价格更低廉，使之可以被运用到各个领域。
附图说明
图1为本发明提出的一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法的琼脂糖凝胶电泳图检测结果图之一；
图2为本发明提出的一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法的琼脂糖凝胶电泳图检测结果图之二；
图3为本发明提出的一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法的MPKS1-MPKS5水解圈结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明在体外通过基因编辑的方法构建蛋白酶K多拷贝菌种，经过大规模发酵生产，最终产量可以达到8g/L，可达到目前国内产量最高水平；
下面将采用的如下引物序列、针对的目的基因序列、载体结构生物材料信息，作为本发明实施的具体方法。
一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝菌种。
具体步骤主要如下：
S1、多拷贝载体构建；
S2、多拷贝菌种的筛选；
S3、多拷贝菌种大规模发酵。
步骤S1中对多拷贝载体构建具体如下：
第一步、选择载体pHBM905BDM，并将其通过CpoⅠ和NotⅠ酶切；
第二步、利用OverlappingPCR方法合成蛋白酶K片段，然后进行纯化；
第三步、使用T4 DNA聚合酶处理纯化后的目的片段，与经CpoⅠ和NotⅠ酶切后载体pHBM905BDM连接，转化大肠杆菌XL-Gold，在含Amp的LB平板上挑取转化子；
第四步、利用菌落PCR法对重组转化子进行鉴定，鉴定正确的转化子送去测序，抽取正确的单拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒；
第五步、在已构建好的单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体基础上，首先利用限制性内切酶EcoRI和BamHI对单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体进行双酶切，胶回收纯化得到6.3-6.8kb的片段作为多拷贝载体1；
第六步、然后用两对限制性内切酶SpeI-EcoRI和XbaI-BamHI分别对单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体进行双酶切，胶回收纯化大小为2.5kb的小片段，得到片段1和2；
第七步、将片段1、片段2和载体1按一定比例混合均匀，转化大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞，37℃培养16h，挑取单菌落接种液体LB(含ampr)，提取质粒，构建两拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒；
第八步、以上述同样的方法步骤构建三拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒，四拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒和五拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒。
第二步的纯化方法为：待纯化PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在蓝光仪下切割目的条带，最大限度地去除多余部分的琼脂糖。
多拷贝菌种的筛选步骤具体如下：
步骤一、将上述已构建好的1-5拷贝pHBM905BDM-PK分别用Sal I线性化后并回收纯化；
步骤二、纯化完成后，通过电击法转化Pichia pastoris GS115感受态细胞；
步骤三、2-3天后挑取MD平板上的酵母菌转化子进行含1％干酪素的BMMY平板筛选，将含有单拷贝pHBM905BDM-PK的酵母重组子菌株命名为MPKS1，同样，将含有二到五拷贝pHBM905BDM-PK的酵母重组子菌株分别命名MPKS2、MPKS3、MPKS4、MPKS5；
步骤四、接种菌株PK1-PK5进行摇瓶诱导表达。
多拷贝菌种大规模发酵方法具体如下：
A1、种子培养基的制备：挑取单菌落到BMGY培养基中，28℃，220rpm培养24h。
A2、将菌株PK1-PK5在毕赤酵母中的发酵罐诱导表达，分菌体生长阶段和诱导阶段两步完成。
菌体生长阶段：发酵参数为：温度28℃，用28％氨水调节至pH5.8，通风量为0.5vvm，搅拌速度300-700rpm，溶氧量20％-30％；从接种开始16-20h后，发酵罐中的甘油被消耗尽，此时开始流加50％甘油(W/V)；当菌体密度OD600＝300时停加甘油，准备进入第二阶段。
诱导阶段：发酵参数为：温度25℃，pH5.5，通风量为0.5vvm，搅拌速度500-750rpm，溶氧量20-30％。当停加甘油后，流加甲醇和山梨醇。在初始的2-3h，是菌体对甲醇的适应期，甲醇会在发酵罐中积累，DO值不稳定。最终DO会达到稳定状态并保持稳定状态。当菌体完全适应利用甲醇2-4h，并以甲醇为限制性碳源，DO值会达到稳定状态。在适应期后，继续保持低速流加甲醇至少2h，之后将流加速度提高1倍并保持至发酵结束，整个甲醇流加过程大约持续诱导90h左右。当酶活开始下降，发酵结束，离心去除菌体，上清液即为含蛋白酶K的粗酶液。
在发酵每个阶段取样进行分析，一天至少两次；每个时间点取样10mL，样品被用来分析细胞生长情况(OD600，细胞湿重)。
在分析细胞生长情况时，用Bradford法测定蛋白质浓度，紫外分光光度计法测蛋白酶K的活性。
本发明利用整合表达盒式结构的拷贝数是提高单个细胞中蛋白酶K表达量的方式；通过人工体外构建多拷贝质粒筛选高拷贝毕赤酵母菌株；利用限制性内切酶的方法，将表达盒式结构首尾相连，进而组装成含有多个表达盒式结构的质粒；核心在于，在外源蛋白基因表达盒式结构的两侧分别引入同尾酶酶切位点；其中每对同尾酶都有相同的粘性末端，通过不断的切割和连接，构建出一系列含有不同拷贝数的表达载体，但拷贝数都是偶数倍；然后利用一种BioBrick改进方法，以构建任意拷贝数的表达载体；片段A和B来源于同一个质粒，片段A由该质粒用EcoRⅠ和SpeⅠ酶切获得，片段B由该质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切获得，利用SpeⅠ和XbaⅠ是同尾酶具有相同的粘性末端，将两者连接，得到含有片段A和片段B的多拷贝质粒。
本发明是利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝串联表达盒；这种构建方法的优势在于重组质粒的拷贝数是可控的，不需要依赖于对高浓度抗性药物的筛选，也不需要进行大规模的筛选，基因剂量效应被认为是毕赤酵母表达外源蛋白的最重要的因素，多拷贝菌株的表达量比单拷贝高出很多倍，从而提高了蛋白酶K的产量，价格更低廉，使之可以被运用到各个领域。
实验结果和结论
与单拷贝pHBM905BDM-PK质粒进行大小比对，再用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳图检测，参照图1，切下的两个片段分别约为5.2kb和6.3kb，与预期理论大小相符合，两拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒构建成功。
泳道M：λEcoT14 DNA Marker；泳道1：pHBM905BDM-PK2拷贝重组质粒；
泳道2：用EcoRI和BamHI双酶切的pHBM905BDM-PK 2拷贝重组质粒。
同样方法成功构建蛋白酶K的二到五拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒的凝胶电泳图，参照图2，
泳道M：λEcoT14 DNA Marker；泳道1：质粒pHBM905BDM；
泳道2：pHBM905BDM-PK的二到五拷贝重组质粒。
多拷贝菌种在含1％干酪素的BMMY平板上的筛选，GS115菌株为负对照，MPKS-9K菌株为正对照，MPKS-9K是以PPIC9K为载体连接有蛋白酶K基因。参照图3，MPKS1-MPKS5水解圈逐步增大，证明了蛋白酶K的表达量也越来越高。
对多拷贝菌株在大规模发酵后，参照表1，从菌株MPKS1-MPKS5的表达量和酶活性可以得出，菌株MPKS5的蛋白表达量远远大于其他多拷贝菌株的蛋白表达量，随着拷贝数的增加，PEPAS4的蛋白表达量和酶活性有逐步提高，说明蛋白总量与拷贝数呈正相关性，蛋白酶K的产量达到8g/l。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝菌种。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，具体步骤主要如下：
S1、多拷贝载体构建；
S2、多拷贝菌种的筛选；
S3、多拷贝菌种大规模发酵。
3.根据权利要求2所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，步骤S1中对多拷贝载体构建具体如下：
第一步、选择载体pHBM905BDM，并将其通过CpoⅠ和NotⅠ酶切；
第二步、利用Overlapping PCR方法合成蛋白酶K片段，然后进行纯化；
第三步、使用T4 DNA聚合酶处理纯化后的目的片段，与经CpoⅠ和NotⅠ酶切后载体pHBM905BDM连接，转化大肠杆菌XL-Gold，在含Amp的LB平板上挑取转化子；
第四步、利用菌落PCR法对重组转化子进行鉴定，鉴定正确的转化子送去测序，抽取正确的单拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒；
第五步、在已构建好的单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体基础上，首先利用限制性内切酶EcoR I和BamH I对单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体进行双酶切，胶回收纯化得到6.3-6.8kb的片段作为多拷贝载体1；
第六步、然后用两对限制性内切酶SpeI-EcoRI和XbaI-BamHI分别对单拷贝pHBM905BDM-PK表达载体进行双酶切，胶回收纯化大小为2.5kb的小片段，得到片段1和2；
第七步、将片段1、片段2和载体1混合均匀，转化大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞，37℃培养16h，挑取单菌落接种液体LB，提取质粒，构建两拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒；
第八步、以上述同样的方法步骤构建三拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒，四拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒和五拷贝pHBM905BDM-PK重组质粒。
4.根据权利要求3所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，所述第二步的纯化方法为：待纯化PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在蓝光仪下切割目的条带，最大限度地去除多余部分的琼脂糖。
5.根据权利要求3所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，多拷贝菌种的筛选步骤具体如下：
步骤一、将上述已构建好的1-5拷贝pHBM905BDM-PK分别用Sal I线性化后并回收纯化；
步骤二、纯化完成后，通过电击法转化Pichia pastoris GS115感受态细胞；
步骤三、2-3天后挑取MD平板上的酵母菌转化子进行含1％干酪素的BMMY平板筛选，将含有单拷贝pHBM905BDM-PK的酵母重组子菌株命名为MPKS1，同样，将含有二到五拷贝pHBM905BDM-PK的酵母重组子菌株分别命名MPKS2、MPKS3、MPKS4、MPKS5；
步骤四、接种菌株PK1-PK5进行摇瓶诱导表达。
6.根据权利要求5所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，多拷贝菌种大规模发酵方法具体如下：
A1、种子培养基的制备：挑取单菌落到BMGY培养基中，28℃，220rpm培养24h；
A2、将菌株PK1-PK5在毕赤酵母中的发酵罐诱导表达，分菌体生长阶段和诱导阶段两步完成。
7.根据权利要求6所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，菌体生长阶段：发酵参数为：温度28℃，用28％氨水调节至pH5.8，通风量为0.5vvm，搅拌速度300-700rpm，溶氧量20％-30％；从接种开始16-20h后，发酵罐中的甘油被消耗尽，此时开始流加50％甘油；当菌体密度OD600＝300时停加甘油，准备进入第二阶段。
8.根据权利要求6所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，诱导阶段：发酵参数为：温度25℃，pH 5.5，通风量为0.5vvm，搅拌速度500-750rpm，溶氧量20-30％。当停加甘油后，流加甲醇和山梨醇。在初始的2-3h，是菌体对甲醇的适应期，甲醇会在发酵罐中积累，DO值不稳定。最终DO会达到稳定状态并保持稳定状态。当菌体完全适应利用甲醇2-4h，并以甲醇为限制性碳源，DO值会达到稳定状态。在适应期后，继续保持低速流加甲醇至少2h，之后将流加速度提高1倍并保持至发酵结束，整个甲醇流加过程大约持续诱导90h左右。当酶活开始下降，发酵结束，离心去除菌体，上清液即为含蛋白酶K的粗酶液。
9.根据权利要求6-8任一项所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，在发酵每个阶段取样进行分析，一天至少两次；每个时间点取样10mL，样品被用来分析细胞生长情况。
10.根据权利要求9所述的蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，其特征在于，在分析细胞生长情况时，用Bradford法测定蛋白质浓度，紫外分光光度计法测蛋白酶K的活性。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210212 |