CN107090458A

CN107090458A - 酵母重组胶原蛋白

Info

Publication number: CN107090458A
Application number: CN201710512319.6A
Authority: CN
Inventors: 梁亮; 张永正
Original assignee: Jiangsu Yuezhi Biology Medicine Co ltd
Current assignee: Jiangsu Yuezhi Biology Medicine Co ltd
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2017-08-25

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酵母重组胶原蛋白的生产方法，包括重组毕赤酵母工程菌构建及其无需甲醇诱导的组成型分泌表达重组胶原蛋白的方法。本发明首先在基因水平上利用毕赤酵母惯用密码子优化胶原基因序列并人工全基因合成，然后整合进酵母染色体中，构建成组成型分泌表达的重组毕赤酵母工程菌。发酵过程操作简便，产量高，且产物分离纯化简单；无需甲醇诱导，生产设备与厂房建设防火、防爆指标较低，生产环境环保无污染；无毒害物质使用，产品更安全。其携带的特异性亲和纯化标记，易于得到更高纯度的产品，可用于生物医用原料。

Description

酵母重组胶原蛋白

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种酵母重组胶原蛋白的生产方法。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的一类蛋白质家族，是支持和保护机体的结缔组织的重要组成成分，并使结缔组织保持一定的机械强度。胶原蛋白约占动物机体总蛋白的30％左右，主要存在于皮肤、骨骼、肌腱、软组织等中，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复起着重要作用。胶原蛋白作为天然的生物高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性和吸收性、促进细胞形成及促上皮细胞形成等功能，可广泛应用在医学、美容、化妆品、保健品等领域中，它能保持血管壁弹性、防止栓塞、提高软骨及韧带的机械性能等，其在皮肤损伤修复、整形美容、增强机体免疫力等方面的作用亦已获得共识，同时胶原蛋白含有大量的极性基团和甘氨酸等天然保湿因子，且有着促进组织新陈代谢的作用，故胶原蛋白能起到滋润皮肤延缓衰老、美白、防皱、祛斑等的功效。

目前，用于异源蛋白表达的巴斯德毕赤酵母真核表达系统既具有大肠杆菌原核表达系统产量高、生产周期短、培养简单、易获取高密度发酵等优点，又具有无致热源、产物可胞外分泌、纯化简单、可进行翻译后加工修饰、且外源基因遗传稳定性高等优势；毕赤酵母自身分泌很少量的蛋白，易于异源蛋白的分离纯化，且其分泌的蛋白存在翻译后加工修饰，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，更适合于真核生物基因的表达；其表达水平稳定、发酵工艺成熟等优点，使其成为目前异源蛋白表达应用最广泛的真核表达系统之一。该系统具有较高的生物安全性，已获得包括美国FDA在内的广泛认可，使其更适于医用和食品用蛋白的异源表达。

已建立的诱导型表达系统的高密度发酵方法，在重组蛋白表达中表现出了一定的优势，范代娣、杨树林等曾利用该系统构建了甲醇诱导型表达系统，并获得了重组胶原蛋白的高表达。但其在生产中操作繁杂，需要碳源的转换，延迟了生产周期；在规模化生产中，因需要使用大量甲醇，对环境造成污染；大量甲醇的储存与运输，存在一定的火灾和爆炸隐患；甲醇的易燃、易爆特性对储存设备、生产设备的防爆性能提出高要求，对厂房建设的防火、防爆性能也提出高要求，较高的防火、防爆要求，也加大了资金投入，增加了成本；甲醇的有毒易挥发特性，还严重影响了生产人员的身体健康；甲醇作为有毒物质，使得发酵产品难以在医药和食品上应用。

毕赤酵母组成型表达系统利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子引导外源基因的表达，不需要甲醇诱导，却可获得与诱导型表达系统相似、甚至更高的产量。该系统拥有诱导型表达系统的所有优点，其能和表达载体一起整合到酵母基因组中，随基因组一起复制和遗传，避免了外源基因的丢失现象。由于该组成型表达系统在发酵表达时可以利用甘油或葡萄糖等无毒性、难挥发物质作为唯一碳源，不需要甲醇诱导，避免了在生产过程中大量甲醇利用所造成的污染与危险，并且表达量高，发酵工艺简单，更适合规模化生产。该系统的主要优点在于：异源蛋白表达产量高；毕赤酵母自身分泌蛋白量较少，有利于后续的提取分离；不需要甲醇作为诱导剂，在发酵过程中，不需要从一种碳源到另一种碳源的转换，既缩短了培养时间，又降低了培养过程中杂菌的污染概率；发酵周期短，生产工艺简单，更适于连续高密度发酵；因生产过程中不再需要甲醇，亦无需甲醇的储存与运输，生产环境更安全，同时生产设备和厂区建设的防火、防爆指标降低，安防资金投入减少，降低了成本。

目前的现有技术中尚未有采用密码子优化后的Ⅲ型胶原基因在毕赤酵母中以组成型方式表达该蛋白的报道。本发明首次根据毕赤酵母所偏爱的密码子，人工合成了胶原基因序列，并利用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，构建出一个全新的、组成型的和分泌型的毕赤酵母高效表达载体，在将外源基因导入毕赤酵母细胞后，通过营养缺陷型标记筛选、抗性筛选、表达量检测等方法，获得了能够高效表达重组人源胶原蛋白的毕赤酵母工程菌株。经特定条件的发酵培养、亲和层析纯化等操作，得到无毒、高纯度的产品，可用于生物医用原料、整形美容、食品等领域。

发明内容

本发明所解决的技术问题包括提供一种优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列，以解决现有技术中因密码子利用效率导致的胶原蛋白在毕赤酵母中表达量偏低的问题。在不改变天然胶原氨基酸序列的前提下，根据毕赤酵母偏爱的密码子优化胶原基因序列，亦即将天然胶原基因中的酵母不常用密码子替换成其惯用密码子，以此提高重组酵母中胶原蛋白的翻译效率。同时在全基因合成该序列时，在其前端引入Kex2蛋白酶酶切位点编码序列。通过该操作将信号肽与胶原蛋白分开，提高了信号肽的切割效率，确保胶原蛋白N端无外源氨基酸残留，保证了胶原蛋白N端的天然状态。

本发明所解决的技术问题包括提供一种含有优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列的重组毕赤酵母工程菌的制备方法。

本发明所解决的技术问题包括提供一种安全、高效的制备酵母重组胶原蛋白的方法。本发明利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子构建组成型表达系统表达重组胶原蛋白，既具有诱导型表达系统的优点，也避免了大量甲醇的使用、储存与运输造成的污染与危险，安全性高；发酵周期短，发酵过程简单，更适合规模化生产，可进行连续高密度发酵生产；生产设备和厂区建设的防火、防爆指标较低，安防资金投入少，降低生产成本；未使用有毒害物质，产品绿色、安全；提供了一种快速、简便、高效的胶原蛋白纯化方法，其利用带有特异性亲和的纯化标记，易于获取高纯度产品。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列，基因序列如SEQ ID NO.1所示；优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列是将天然胶原基因中的密码子替换成宿主惯用密码子而设计，并未改变天然胶原的氨基酸序列，然后通过全基因合成该序列，并在该序列前端引入Kex2蛋白酶酶切位点编码序列；所述宿主为酵母。

本发明所述的优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列，其中，所述Kex2蛋白酶酶切位点编码序列如SEQ ID NO.2所示；将人源Ⅲ型胶原片段与Kex2蛋白酶酶切位点直接相连接，用于获取具有天然N端的胶原蛋白肽段。

本发明所述的优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列的重组毕赤酵母工程菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)获得优化的胶原基因；

(2)双酶切胶原基因和组成型载体pGHKα连接构建成重组组成型表达质粒pGHKα-col3-col3-6his；

(3)将重组组成型表达质粒pGHKα-col3-col3-6his用限制性内切酶SalⅠ线性化，并电转化入毕赤酵母感受态细胞中，以组氨酸缺陷型标记和G418抗性标记筛选高拷贝阳性重组子，得到重组毕赤酵母工程菌。

获得本发明所述的优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列对应的酵母重组胶原蛋白的生产方法，其中，

(1)挑取本发明的重组毕赤酵母工程菌接种于YPD液体培养基，30℃、220rpm过夜培养，而后转接于BMDY发酵培养基中，并使OD₆₀₀＝1.0～2.0，于28℃220rpm下振荡培养；发酵结束后，离心收集上清，在非变性条件下，用Ni-NTA His Bands树脂吸附重组胶原，用洗涤液洗去杂质，最后再洗脱重组胶原，收集洗脱液；洗脱液经超滤系统脱盐、浓缩，所制得的浓缩液经真空冷冻干燥制得酵母重组胶原蛋白；

(2)转入发酵培养基后，无需甲醇诱导，重组胶原蛋白随工程菌自身生命活动主动分泌表达于发酵液中。

根据本发明的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白在医用敷料中的应用。

采用本发明的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的胶原蛋白凝胶，其中，所述胶原蛋白凝胶以纯化水为溶剂，其组分还包括酵母重组胶原蛋白、凝胶剂、保湿剂和医用防腐剂；所述凝胶剂为卡波姆；所述保湿剂为甘油和三乙醇胺；所述医用防腐剂为尼泊金甲酯；各组分的质量分数为：

酵母重组胶原蛋白0.1％；

甘油5％；

尼泊金甲酯0.2％；

卡波姆0.4％；

三乙醇胺10％；

其余为纯化水。

采用本发明的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的胶原蛋白贴敷料，其中，所述胶原蛋白贴敷料由酵母重组胶原蛋白、保湿剂、医用防腐剂和无纺布基材组成；所述保湿剂为甘油；所述医用防腐剂为尼泊金甲酯；其中，酵母重组胶原蛋白、保湿剂、医用防腐剂的质量分数为：

酵母重组胶原蛋白0.1％；

甘油5％；

尼泊金甲酯0.2％；

其余为纯化水。

采用本发明的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的胶原蛋白液体敷料，其中，所述胶原蛋白液体敷料由以下质量配比的原料制备而成：

酵母重组胶原蛋白0.05％～0.5％；

多元醇5％～40％；

透明质酸钠0.01％～0.05％；其余为0.01M～0.1M磷酸盐缓冲液；所得的制备液灭菌后，无菌灌装。

采用本发明的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的胶原蛋白喷雾敷料，其中，所述胶原蛋白喷雾敷料由以下质量配比的原料制备而成：

酵母重组胶原蛋白0.05％～0.5％；

多元醇5％～40％；

透明质酸钠0.01％～0.05％；其余为0.01M～0.1M磷酸盐缓冲液；所得的制备液灭菌后，无菌灌装入无菌压力喷瓶中。

采用本发明的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的用于微整形的皮肤黏膜保护剂，其中，所述皮肤黏膜保护剂由以下质量配比的原料组成：

酵母重组胶原蛋白0.1％～1％；透明质酸钠0.1％～1％；多元醇0～40％；其余为纯化水；

所制得的制备液灭菌后，无菌灌装。

具体而言，本发明提供的酵母重组胶原蛋白的制备方法由下述步骤组成：

1.重组表达质粒的获取

(1)本发明首先提供一种优化了的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列。其中，所涉及的人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为中国专利201310033299.6所公开的方法获得的胶原蛋白的氨基酸序列。本发明在不改变胶原蛋白原始氨基酸序列的前提下优化其对应的基因序列，其优化处理是根据毕赤酵母偏爱性密码子进行，将胶原蛋白基因序列中毕赤酵母不常用的密码子agg、cgt、ggg、ggc、gca等优化为其偏爱密码子aga、ggt、gct等，利用DNASTAR软件分析后得到的，经过这一处理，使胶原蛋白更利于表达。其基因序列(见SEQ IDNO.1)如下：

(2)将(1)中的基因序列通过全基因合成获取，其中，将优化后的基因序列通过全基因合成，并在其前端引入Kex2酶切位点编码序列，其基因序列(SEQ ID NO.2)为：AAAAGA。经过这一处理，使分泌出的胶原蛋白N端无额外氨基酸残基残留，更接近于其天然结构。

(3)本发明利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子构建成可组成型表达的载体质粒，首先利用组成型的启动子pGAP替换掉诱导型的启动子pAOX1构建成组成型载体pGHKα，然后再将优化的胶原基因序列导入该载体中，构建成重组表达质粒pGHKα-col3-col3-6his，经过这一处理，可使生产过程中无需甲醇诱导，操作更简单，产品更安全。

2.基因重组毕赤酵母工程菌的构建

将制备得到的重组质粒pGHKα-col3-col3-6his用限制性内切酶SalⅠ线性化处理，并将其电转化入毕赤酵母SND1168(Invitrogen)感受态细胞中。以营养缺陷型标记和G418抗性标记筛选高拷贝阳性重组子，得到重组毕赤酵母工程菌。(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.14057，保藏日期：2017年4月21日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris)

3.酵母重组胶原蛋白的制备及应用

用YPD培养基于30℃220rpm过夜培养重组毕赤酵母工程菌；取适量过夜培养物接入BMDY培养基，使OD₆₀₀＝1.0～2.0；于28℃220rpm下振荡培养4d。发酵结束后，离心收集上清，在非变形条件下，用Ni-NTA His Bands树脂(Merck)吸附重组胶原，用洗涤液洗去杂质，最后再洗脱重组胶原，收集洗脱液。洗脱液经超滤系统(PALL)脱盐、浓缩。浓缩液经真空冷冻干燥制得重组胶原蛋白。

作为医用敷料的功能性原料，酵母重组胶原蛋白在医用敷料中的应用简述如下：

胶原蛋白凝胶产品以纯化水为溶剂，其组分由本发明的生产方法获得的酵母重组胶原蛋白、凝胶剂、保湿剂、少量医用防腐剂构成。其配方(质量分数，％)为：酵母重组胶原蛋白0.1％，甘油5％，尼泊金甲酯0.2％，卡波姆0.4％，三乙醇胺10％。

胶原蛋白贴敷料产品由胶原蛋白溶液、少量医用防腐剂和无纺布基材组成。胶原蛋白溶液以纯化水作为溶剂，由本发明的生产方法获得的酵母重组胶原蛋白和甘油配制而成，加入少量医用防腐剂，配制成最终的灌装液。灌装液中各组分比例(质量分数，％)为：酵母重组胶原蛋白0.1％，甘油5％，尼泊金甲酯0.2％。每片胶原蛋白贴敷料中的灌装液量为25mL。

胶原蛋白液体敷料产品以0.01M～0.1M磷酸盐缓冲液为溶剂，溶解本发明的生产方法获得的酵母重组胶原蛋白、多元醇、透明质酸钠而制成，其溶质质量配比为：酵母重组胶原蛋白0.05％～0.5％，多元醇5％～40％，透明质酸钠0.01％～0.05％。所得制备液灭菌后，无菌灌装。

胶原蛋白喷雾敷料产品以0.01M～0.1M磷酸盐缓冲液为溶剂，溶解本发明的生产方法获得的酵母重组胶原蛋白、多元醇、透明质酸钠而制成，其溶质质量配比为：酵母重组胶原蛋白0.05％～0.5％，多元醇5％～40％，透明质酸钠0.01％～0.05％。所得制备液除菌后，灌装入压力喷瓶中，辐照灭菌。

用于微整形的皮肤黏膜保护剂产品(医用敷料)以纯化水为溶剂，其原料由本发明的生产方法获得的酵母重组胶原蛋白、多元醇、透明质酸钠组成，质量配比为：酵母重组胶原蛋白0.1％～1％，透明质酸钠0.1％～1％，多元醇0～40％。所得制备液灭菌后，无菌灌装。

本发明与现有技术相比，具有以下优势及有益成果：

(1)本发明通过在胶原蛋白前端引入Kex2蛋白酶酶切位点，将信号肽与胶原蛋白分开，提高了信号肽的切割效率，确保胶原蛋白N端无外源氨基酸残留，保证了胶原蛋白N端的天然结构。

(2)本发明根据毕赤酵母密码子的偏好性，对胶原基因序列进行密码子优化，消除了胶原蛋白表达中因密码子利用限制造成的低翻译效率，使其更适于在毕赤酵母中表达。

(3)本发明所使用的表达载体为组成型分泌表达载体，可在菌体自身生命活动过程中持续分泌表达胶原蛋白，生产工艺简单，可进行连续高密度发酵。

(4)本发明的工程菌在生产过程中无需使用有毒挥发性的甲醇，亦无需甲醇的储存与运输，降低了安全隐患；

(5)本发明的重组胶原蛋白生产过程无有毒甲醇添加，且携带特异性亲和纯化标记，便于纯化，产物纯度高、绿色安全，可用于生物医用原料、微创、整形美容等产品。

下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此而限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤、条件等所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

附图说明

图1为载体构建技术路线图；

图2为重组毕赤酵母工程菌表达重组胶原蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1-重组菌初始接种浓度OD₆₀₀＝2.0；2-重组菌初始接种浓度OD₆₀₀＝10；3-对照菌初始接种浓度OD₆₀₀＝2.0；

图3为重组胶原蛋白Western Blot检测图，其中，1-重组菌初始接种浓度OD₆₀₀＝2.0；2-重组菌初始接种浓度OD₆₀₀＝10；3-对照菌初始接种浓度OD₆₀₀＝2.0。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 重组组成型表达质粒的获得(如图1所示)

(1)优化基因的合成

根据中国专利201310033299.6所公开的方法获得的胶原蛋白的氨基酸序列以及Genbank登录的Ⅲ型胶原肽段的基因序列，参考毕赤酵母偏好性密码子，在不改变原始氨基酸序列的前提下，利用DNASTAR软件优化基因序列，然后通过全基因合成获得优化的基因全序列，并在其前端引入Kex2酶切位点编码序列，同时在优化基因的3′端添加TAA位点和EcolRⅠ酶切位点，由化学法合成，获得含目的基因序列的质粒pPIC9k-col3-col3-6his。

(2)重组表达质粒的构建

在本发明的相关实验中，用限制性内切酶BamHⅠ、EcolRⅠ双酶切质粒pPIC9k-col3-col3-6his，并通过切胶回收获得目标片段col3-col3-6his；同样双酶切组成型载体质粒pGHKα，并通过切胶回收大片段；然后将回收的col3-col3-6his基因片段和载体pGHKα大片段在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜；将连接产物转化进入感受态大肠杆菌DH5α，在含有Kan和Amp的LB抗性平板筛选阳性克隆，成功获得重组组成型表达质粒，命名为pGHKα-col3-col3-6his。

实施例2 重组毕赤酵母工程菌的获得

(1)重组组成型表达质粒pGHKα-col3-col3-6his的线性化

提取重组质粒pGHKα-col3-col3-6his，用限制性内切酶SalⅠ于37℃进行酶切消化，然后以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测是否完全切开，待完全切开后，用胶回收试剂盒对酶切液进行处理，回收线性化质粒，并脱盐处理。

(2)毕赤酵母SMD1168感受态细胞的制备

①挑取酵母SMD1168单菌落，接种至含有5mL的YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养过夜；

②取50μL的过夜培养物接种至含有50mL新鲜YPD液体培养基的500mL三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养过夜，至OD₆₀₀值达到1.1～1.3；

③将培养物于4℃，1500×g离心5min，用50mL冰预冷的无菌双蒸水重悬菌体；

④按步骤③离心，用25mL冰预冷的无菌双蒸水重悬菌体；

⑤按步骤③离心，用20mL冰预冷的1M的山梨醇溶液重悬菌体；

⑥按步骤③离心，用0.3mL冰预冷的1M的山梨醇溶液重悬菌体，其终体积约为0.5mL；

⑦分装成每80μL一份，于-70℃保存备用。

(3)毕赤酵母的电转化

①用无水乙醇冲洗电转杯三遍，于灭过菌的超净台中晾干残余乙醇；

②将电转杯密封，转至冰中预冷10min；

③将毕赤酵母感受态细胞于冰预中解冻，加入约10μg的线性化pGHKα-col3-col3-6his质粒，轻轻混匀，转至0.2cm冰预冷的电转杯中，继续于冰上预冷5min；

④电击，电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击时间为5～10mSec；

⑤电击结束，迅速加入1mL冰预冷的1M的山梨醇溶液，轻轻吹打混匀，并转至1.5mL离心管中；

⑥将菌悬液涂布于MD平板上，每100μL～200μL涂布一块平板，室温静置10min，于30℃倒置培养2-5天，直至有单菌落出现。

(4)多拷贝插入重组子的筛选

①在生长有转化子的MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His⁺转化子，并转移到50mL离心管中；

②加入20mL无菌双蒸水稀释，混匀后测定其OD₆₀₀值(1OD₆₀₀＝5×10⁷cells/mL)；

③取10⁵个细胞涂布于含有0.5mg/mLG418的YPD平板上，倒置，30℃培养3～4d；

④在无菌96孔板中每孔加入200μL YPD液体培养基；

⑤用无菌牙签往步骤④分别接入在含有0.5mg/mL G418的YPD平板上获得的转化子，混匀，于30℃培养48h；

⑥48h后，取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第一块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h；

⑦24h后，再取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第二块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h；

⑧24h后，分别从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有1.0mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上，于30℃继续培养96h～120h。毕赤酵母SMD1168转化子若能在含越高浓度G418的培养基上生长，说明该转化子含有越多拷贝的目的基因，即有多个pGHKα-col3-col3-6his阅读框整合进了酵母染色体上，亦即有高表达目的蛋白的潜能。

实施例3 酵母重组胶原蛋白生产

⑴用YPD培养基于30℃220rpm过夜培养重组毕赤酵母工程菌；

⑵取适量过夜培养物接入BMDY培养基，使OD₆₀₀＝1.0～2.0，于28℃220rpm下振荡培养4d。

⑶发酵培养结束后，4℃下5000×g离心20min，收集上清。取少量上清液进行SDS-PAGE分析检测，结果如图2所示，根据His标记，进行Western Blot分析确认为主蛋白条带为目的蛋白，结果如图3所示；

⑷上清中加入5～7倍体积的纯水，再经超滤浓缩至初始体积的20％；

(5)取1mL浓缩液中加入100μL 1×Ni-NTA结合缓冲液，4℃充分混合；

⑹加入20μL 50％Ni-NTA His·Bands树脂悬液轻柔混匀，结合30min；

⑺1500×g离心10秒沉淀树脂，弃上清；

⑻用100μL 1×Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗树脂，1500×g离心10秒，小心吸去上清。再重复一次；

⑼用20μL 1×Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，1500×g离心10秒，小心将上清转移至干净小管中。再重复3次；

⑽收集上清，加入5倍体积的纯水，再经超滤浓缩至初始体积的10％～20％；

⑾取10mL浓缩液倒入50mL小烧杯中，放入-20℃冰箱中冷冻过夜，然后转入预冷至-45℃的冷冻干燥机中，开启真空泵，维持48h；

(12)冻干结束后，小心打开放气阀，直至内外气压平衡。取出烧杯，得到白色海绵状重组胶原蛋白。

实施例4 胶原蛋白凝胶敷料制备例

①称取50.0g甘油，加入4.0g卡波姆，搅拌1h；

②称取酵母重组胶原蛋白1.0g，用适量纯化水溶解，加入尼泊金甲酯2.0g，搅拌充分溶解；

③将②全部转入①中，补足纯化水至总质量为990.0g，搅拌1h；

④加入10.0g的三乙醇胺1h，即得胶原蛋白凝胶敷料产品。

实施例5 胶原蛋白贴敷料制备例

①称取50.0g甘油，溶于适量纯化水中，加入酵母重组胶原蛋白1.0g和尼泊金甲酯2.0g，充分搅拌溶解；

②加入纯化水至1000g，搅拌1h；

③定量灌装到含无纺布基材的医用铝箔袋中，封口，即得胶原蛋白贴敷料产品。

实施例6 胶原蛋白液体敷料制备例

①分别称取1,3-丁二醇100g，1,2-己二醇5g，1,2-戊二醇20g，甘油80g，混合搅拌20min，加入透明质酸钠0.5g，搅拌1h；

②称取NaH₂PO₄·2H₂O 10.687g，Na₂HPO₄·12H₂O 11.282g，溶于适量纯化水中，加入①中；

③加入酵母重组胶原蛋白1.0g，补足纯化水至1000g，搅拌1h；

④过滤除菌后灌装，即得胶原蛋白液体敷料产品。

实施例7 胶原蛋白喷雾敷料制备例

③加入酵母重组胶原蛋白1.0g，补足纯化水至1000g，搅拌1h；

④过滤除菌后灌装入压力喷瓶中，辐照灭菌，即得胶原蛋白喷雾敷料产品。

实施例8 胶原蛋白基皮肤黏膜保护剂敷料制备例

①称取甘油80.0g，1,3-丁二醇100g混合搅拌20min，加入透明质酸钠1.0g，搅拌1h；

②称取酵母重组胶原蛋白5.0g，溶解于适量纯化水中，然后转入到①中，补足纯化水至1000g，搅拌1h；

③辐照灭菌后，无菌灌装，即得胶原蛋白基皮肤黏膜保护剂敷料，应用于微整形后的皮肤黏膜保护等。

上文中已经通过优选实施例对本发明作了详尽的描述，在本发明基础上，可以对之做若干变动和修饰，对本领域技术人员来讲是显而易见的。因此，凡根据本发明精神和实质所作的各种变动和润饰，都被视为涵盖在本发明的保护范围内。本领域技术人员还应当理解，本发明还包括本说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何单独和组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏悦智生物医药有限公司

<120> 酵母重组胶原蛋白

<130> UC33

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 酵母重组胶原蛋白基因序列

<400> 1

gccggtaata ctggtgctcc aggatcacca ggtgtttctg gtcctaaagg tgacgctggt 60

caaccaggtg aaaagggtag tccaggtgct caaggtccac caggtgctcc tggaccatta 120

ggtattgctg gaattactgg tgctagaggt ttggcaggtc caccaggaat gccaggacct 180

agaggatcac caggtcctca aggtgttaag ggtgaatcag gtaaaccagg tgctaatggt 240

ttgtctggtg agagaggtcc tccaggtcct caaggtttgc ctggtttagc tggtactgct 300

ggtgaaccag gtcgtgatgg taatcctggt tctgatggtt tacctggtag agatggatct 360

ccaggtggta aaggagatag aggtgaaaat ggttctcctg gagcaccagg agctccagga 420

catcctggac ctccaggacc agttggacca gctggtaaat ctggagatag aggtgaaagt 480

ggtcctgctg gtccagctgg tgcaccaggt cctgctggtt ctagaggtgc tccaggacca 540

caaggtccta ggggagataa aggtgaaact ggtgaacgtg gtgctgctgg tattaagggt 600

catagaggtt tccctggtaa cccaggagct cctggttctc caggtccagc tggacaacaa 660

ggtgctattg gatctccagg tcctgctgag tttactgctg gaaacactgg agctccaggt 720

tctccaggag tttctggacc aaaaggtgac gctggtcaac caggtgaaaa aggttctcca 780

ggtgctcagg gtccacctgg tgcacctggt ccattaggta ttgctggaat cactggtgct 840

agaggtcttg ctggtccacc aggtatgcca ggtcctagag gttctcctgg tcctcagggt 900

gttaagggtg agtctggaaa gccaggtgct aatggtcttt ctggagaaag aggtcctcca 960

ggtccacaag gattgcctgg tttggctggt actgctggtg agccaggtag agatggtaat 1020

ccaggttcag atggtttacc aggtagagat ggttctccag gaggtaaagg tgacagaggt 1080

gaaaatggtt ctcctggtgc tcctggtgct ccaggtcatc caggtccacc tggtccagtt 1140

ggtccagctg gtaaatctgg tgacagaggt gaatctggac ctgctggacc agctggagct 1200

ccaggtcctg caggttctag aggtgcacca ggacctcaag gtcctagagg agataaagga 1260

gaaactggtg aaagaggtgc tgctggtatc aaaggacata gaggattccc aggaaatcca 1320

ggtgctccag gtagtccagg tccagcaggt caacaaggtg ctattggttc accaggtcca 1380

gctgatcatc atcatcatca ccatactggt ttggctagat tt 1422

<210> 2

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Kex2酶切位点

<400> 2

aaaaga 6

Claims

1.一种优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列，其特征在于：基因序列如SEQ IDNO.1所示；优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列是将天然胶原基因中的密码子替换成宿主惯用密码子而设计，并未改变天然胶原的氨基酸序列，然后通过全基因合成该序列，并在该序列前端引入Kex2蛋白酶酶切位点编码序列；所述宿主为酵母。

2.根据权利要求1所述的优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列，其特征在于：所述Kex2蛋白酶酶切位点编码序列如SEQ ID NO.2所示；将人源Ⅲ型胶原片段与Kex2蛋白酶酶切位点直接相连接，用于获取具有天然N端的胶原蛋白肽段。

3.含有权利要求1所述的优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列的重组毕赤酵母工程菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)获得优化的胶原基因；

4.获得权利要求1所述的优化的人源Ⅲ型胶原蛋白片段的基因序列对应的酵母重组胶原蛋白的生产方法，其特征在于：

(1)挑取权利要求3所述的重组毕赤酵母工程菌接种于YPD液体培养基，30℃、220rpm过夜培养，而后转接于BMDY发酵培养基中，并使OD₆₀₀＝1.0～2.0，于28℃220rpm下振荡培养；发酵结束后，离心收集上清，在非变性条件下，用Ni-NTA His Bands树脂吸附重组胶原，用洗涤液洗去杂质，最后再洗脱重组胶原，收集洗脱液；洗脱液经超滤系统脱盐、浓缩，所制得的浓缩液经真空冷冻干燥制得酵母重组胶原蛋白；

(2)转入发酵培养基后，无需甲醇诱导，重组胶原蛋白随重组酵母工程菌自身生命活动主动分泌表达于发酵液中。

5.根据权利要求4的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白在医用敷料中的应用。

6.采用权利要求4的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的胶原蛋白凝胶，其特征在于：所述胶原蛋白凝胶以纯化水为溶剂，其组分还包括酵母重组胶原蛋白、凝胶剂、保湿剂和医用防腐剂；所述凝胶剂为卡波姆；所述保湿剂为甘油和三乙醇胺；所述医用防腐剂为尼泊金甲酯；各组分的质量分数为：

酵母重组胶原蛋白0.1％；

甘油5％；

尼泊金甲酯0.2％；

卡波姆0.4％；

三乙醇胺10％；

其余为纯化水。

7.采用权利要求4的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的胶原蛋白贴敷料，其特征在于：所述胶原蛋白贴敷料由酵母重组胶原蛋白、保湿剂、医用防腐剂和无纺布基材组成；所述保湿剂为甘油；所述医用防腐剂为尼泊金甲酯；其中，酵母重组胶原蛋白、保湿剂、医用防腐剂的质量分数为：

酵母重组胶原蛋白0.1％；

甘油5％；

尼泊金甲酯0.2％；

其余为纯化水。

8.采用权利要求4的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的胶原蛋白液体敷料，其特征在于：所述胶原蛋白液体敷料由以下质量配比的原料制备而成：

酵母重组胶原蛋白0.05％～0.5％；

多元醇5％～40％；

9.采用权利要求4的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的胶原蛋白喷雾敷料，其特征在于：所述胶原蛋白喷雾敷料由以下质量配比的原料制备而成：

酵母重组胶原蛋白0.05％～0.5％；

多元醇5％～40％；

透明质酸钠0.01％～0.05％；其余为0.01M～0.1M磷酸盐缓冲液；所得的制备液灭菌后，无菌灌装入无菌压力喷瓶。

10.采用权利要求4的生产方法制得的酵母重组胶原蛋白而制备的用于微整形的皮肤黏膜保护剂，其特征在于：所述皮肤黏膜保护剂由以下质量配比的原料组成：

所制得的制备液灭菌后，无菌灌装。