CN116655808A - 梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用，属于合成生物学、基因工程技术领域。本发明通过设计胶原蛋白单体并使其重复串联，在串联单体之间添加特异性酶切位点，利用毕赤酵母表达系统中Kex2蛋白酶的代谢途径，将串联重复序列切割为长度不等的序列，于胞外分泌表达梯度分子量重组胶原蛋白的组合物。本发明的方法在酵母分泌表达途径中即可获得梯度分子量大小的重组胶原蛋白的组合物，各组分氨基酸序列、分子量分布比例明确，且都富含RGD活性位点和其它活性序列，使其既有较好的透皮吸收性也有较好的生物学活性，适用性更为广泛。

Description

梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用，属于合成生物学、基因工程技术领域。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递、细胞增生、分化、运动、细胞免疫等关系密切，基于其低抗原性、良好的生物相容性、促细胞生长等优良的生物学性质，广泛应用于生物医药、美容护肤等领域。目前，胶原蛋白的制备主要有动物提取和基因重组两种方式，重组胶原蛋白因具有低安全隐患、可规模化生产等优势逐渐取代动物源提取的天然胶原蛋白。近年来，毕赤酵母表达外源基因系统常用来表达重组胶原蛋白。
现有的研究中，利用基因工程重组技术在微生物细胞分泌途径中表达重组胶原蛋白，均致力于获得单一分子量的重组胶原蛋白。现有的关于梯度分子量胶原蛋白的研究很少，大多为混合胶原蛋白肽段。公开号为CN109627325A中使用动物来源酶解工艺获得胶原蛋白，在超滤过程中分段截留以得到不同分子量的梯度胶原多肽，除此以外，还有通过分布酶解等方法获得不同大小的胶原蛋白，通过这些方法获得的胶原蛋白其种类、氨基酸序列、分子量分布比例不明确，且批次间难以实现重复，可加工性较差。将不同分子量大小的胶原蛋白进行复配，选择不同种类或大小的重组胶原蛋白按比例混合后也可开发出具有梯度分子量的胶原蛋白产品，但需要多种重组胶原蛋白产品，每一种都需要单独进行产品的研发及生产，此方法成本较高且需考虑每种胶原蛋白间的兼容性。
因此，亟需一种方法或胶原蛋白，使得表达的重组胶原蛋白具有不同分子量大小且呈梯度分布，能兼具小分子胶原蛋白的良好透皮吸收性和大分子胶原蛋白的较高生物学活性的研究。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术中存在的一些技术问题，提供一种梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明一方面提供了一种含有重组胶原蛋白单体的蛋白融合体，所述蛋白融合体的结构用通式表示为L1-X-L2，其中X为重组胶原蛋白单体；L1为氨基酸EA，位于所述重组胶原蛋白单体的氨基端；L2为氨基酸KR，位于所述重组胶原蛋白单体的羧基端。
进一步的，所述重组胶原蛋白单体包括SEQ ID NO：1所示的序列，或与SEQ ID NO：1具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的序列。
本发明还提供了一种重组胶原蛋白，所述重组胶原蛋白包含所述含有重组胶原蛋白单体的蛋白融合体。
进一步的，所述重组胶原蛋白包括串联重复的所述蛋白融合体，所述蛋白融合体之间构成Kex2蛋白酶识别切割位点KREA或HRGKREA。
进一步的，所述串联重复次数为大于或等于1的正整数，优选的，所述串联重复次数1-9次；更优选的，所述串联重复次数为9次，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
本发明还提供了一种编码所述重组胶原蛋白的核酸。
进一步的，所述核酸包括SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列、或其简并序列。
本发明还提供了一种包含所述核酸的重组载体，所述载体包括pPIC9K。
本发明还提供了一种包含所述核酸、或包含所述的重组载体、或表达所述重组胶原蛋白的重组工程菌。
进一步的，所述重组工程菌的宿主菌优选毕赤酵母。
根据本发明的实施例，所述重组工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC NO.26121；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2022年11月11日；分类命名为：巴斯德毕赤酵母Komagataellaphaffii。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包含本发明所述的重组胶原蛋白、或所述核酸、或所述重组载体、或所述的宿主细胞或重组工程菌。
本发明还提供一种制品，所述制品包含本发明所述的重组胶原蛋白、或所述核酸、或所述重组载体、或所述的宿主细胞或重组工程菌、或所述的组合物；优选地，所述制品选自药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。
本发明还提供所述重组胶原蛋白、或所述核酸、或所述重组载体、或所述的宿主细胞或重组工程菌、或所述的组合物、或所述的制品在制备药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品中的用途。
本发明还提供一种梯度分子量重组胶原蛋白的制备方法，所述方法包括：
(1)设计并获取所述重组胶原蛋白氨基酸序列和编码DNA序列；
进一步的，所述重组胶原蛋白包含所述含有重组胶原蛋白单体的蛋白融合体；
所述蛋白融合体的结构用通式表示为L1-X-L2，其中X为重组胶原蛋白单体；L1为氨基酸EA，位于所述重组胶原蛋白单体的氨基酸；L2为氨基酸KR，位于所述重组胶原蛋白单体的羧基端。
进一步的，所述重组胶原蛋白单体包括SEQ ID NO：1所示的序列，或与SEQ ID NO：1具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的序列。
进一步的，所述重组胶原蛋白包括串联重复的所述蛋白融合体，所述蛋白融合体之间构成Kex2蛋白酶识别切割位点KREA或HRGKREA。
所述串联重复次数为大于或等于1的正整数，优选的，所述串联重复次数1-9次；更优选的，所述串联重复次数为9次，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
(2)重组表达载体构建：
将步骤(1)中所述的DNA序列克隆于表达载体上，得到重组表达载体。
进一步的，所述表达载体包括pPIC9K。
(3)重组工程菌株构建及高表达筛选：
将获得的重组表达载体转入毕赤酵母感受态细胞中，筛选高拷贝、高表达梯度分子量重组胶原蛋白的重组工程菌。
进一步的，所述重组工程菌所述的重组工程菌的宿主菌优选毕赤酵母，。
进一步的，所述重组工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC NO.26121；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2022年11月11日。分类命名为：巴斯德毕赤酵母Komagataella phaffii。
(4)诱导表达与梯度小分子胶原蛋白的获得：
重组工程菌经诱导表达后，获得梯度分子量重组胶原蛋白。
进一步的，所述梯度分子量重组胶原蛋白包括多个不同分子量胶原蛋白，所述不同分子量胶原蛋白的大小呈梯度分布。
进一步的，所述多个不同分子量胶原蛋白包括所述的重组胶原蛋白单体，所述多个不同分子量胶原蛋白均与重组胶原蛋白单体呈梯度倍数关系。
根据本发明的实施例，所述梯度分子量重组胶原蛋白分子量大小为5-45KDa。
本发明的有益效果：
目前动物来源获得的梯度胶原蛋白其种类、氨基酸序列、分子量分布比例均不明确，且批次间难以实现重复，可加工性较差；而复配不同分子量大小的重组胶原蛋白获得的梯度分子量胶原蛋白产品，其需对多种胶原蛋白进行开发生产，成本较高。本发明解决了现有的梯度分子量大小的胶原蛋白制备中存在的问题。本发明的方法在酵母分泌表达途径中即可获得梯度分子量大小的重组胶原蛋白的组合物，其分子量涵盖了5KDa～45KDa的范围，各组分氨基酸序列、分子量分布比例明确，且都富含RGD活性位点和其它活性序列，使其既有较好的透皮吸收性也有较好的生物学活性，适用性更为广泛。且通过一步离子交换即可获得纯度较高的产品，生产工艺简单。本发明对重组胶原蛋白进行细胞黏附活性检测，结果表明3A5D29的细胞黏附活性不亚于天然人胶原蛋白和大分子重组Ⅲ型胶原蛋白。
附图说明
图1为3A5D29在诱导36h后的胞外表达上清SDS-PAGE检测结果。左图南京金斯瑞Bis-tris12％预制胶，右图为上海万生昊天Tricine预制胶，左图中梯度分子量蛋白的表观分子量从上至下依次为59.9、52.8、45.9、40.0、33.3、26.9、21.6、16.7、7.8KDa；右图中最下方条带为7.8KDa。
图2为诱导表达得到的梯度小分子胶原蛋白序列比对结果。
图3为诱导表达得到的梯度小分子胶原蛋白细胞黏附活性检测结果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。
值得说明的是，本发明中主要选取天然Ⅲ型胶原蛋白为例进行梯度分子量重组胶原蛋白的表达，但理论而言，其它任何一个型别的胶原蛋白及氨基酸序列使用类似的方法、策略也可以实现类似的效果；本发明中使用毕赤酵母也可换作其它的酵母属生物达到类似的效果；本发明中选取的用来切割重复串联胶原蛋白序列的酶是Kex2蛋白酶，相应设计的位点是Kex2蛋白酶识别与切割的位点，理论而言，其它的酶切位点或其它的酶也可以实现类似的梯度表达的效果；如上均属本发明的保护范围，实施例仅用于说明使得本领域人员更好的理解，但不限制本发明的保护范围。
实施例1：
(1)氨基酸序列设计
选择人Ⅲ型胶原蛋白全长(包含N前肽、成熟肽链、C前肽)序列(参照Uniprot数据库中ID为P02461的蛋白质序列，https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02461)第1036-1087位氨基酸序列，为重组胶原蛋白单体，序列如SEQ ID NO：1所示：
GKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRG
在如SEQ ID NO：1所示单体的氨基端添加两个氨基酸残基EA，羧基端添加两个氨基酸残基KR，获得含有重组胶原蛋白单体的蛋白融合体，并以此序列为基础重复串联重复，优选的，本实施例中串联重复9次，得到的胶原蛋白命名为3A5D29，共504个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：2所示：
EAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKREAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKREAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKREAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGK REAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKREAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKREAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKREAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKREAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKR
序列中的“HRGKREA”组合成为Kex2蛋白酶识别切割位点，3A5D29进入毕赤酵母蛋白分泌途径中时，Kex2蛋白酶对双碱基氨基酸KR羧基端肽键进行切割，而本发明中“HRGKREA”这样的特殊的酶切位点设计与其它研究成果中Kex2蛋白酶酶切位点序列有效识别、彻底切割的效果有所不同，它与Kex2蛋白酶结合效率并不会达到完全切割，而是同时产生1个单体、和2～9个单体的串联重复序列的混合物，使得最终分泌表达的产物由n个重组胶原蛋白单体序列的重复序列组成(n为大于等于1的正整数，优选的，n＝1～9)，其最终分泌表达的产物单体序列如SEQ ID NO：3所示：
(GKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGKR)n(n为大于等于1的正整数，优选的，n＝1～9)
(2)重组表达载体的构建
经过优化设计后，编码3A5D29的DNA序列，如SEQ ID NO：4所示：
GAAGCTGGGAAATCGGGAGACAGGGGCGAGAGCGGACCAGCCGGGCCAGCTGGTGCTCCTGGGCCTGCCGGAAGTCGAGGTGCTCCTGGTCCACAAGGCCCGAGAGGTGACAAAGGCGAGACTGGTGAACGGGGTGCGGCGGGCATCAAAGGCCACAGGGGTAAGCGCGAAGCTGGAAAGTCCGGAGATCGCGGCGAGAGTGGACCGGCTGGTCCTGCTGGGGCGCCCGGACCTGCTGGAAGTCGGGGTGCGCCTGGACCACAAGGTCCCCGAGGTGACAAAGGGGAGACGGGCGAGCGAGGTGCCGCGGGGATAAAAGGACATAGAGGAAAGCGCGAAGCCGGCAAAAGCGGCGATAGAGGAGAATCCGGTCCTGCTGGCCCGGCAGGTGCTCCTGGGCCGGCAGGATCACGGGGGGCTCCCGGTCCGCAAGGTCCTCGTGGTGACAAAGGCGAGACAGGGGAAAGGGGTGCGGCAGGGATTAAGGGTCACAGAGGCAAGCGTGAAGCCGGGAAGTCAGGAGATCGAGGGGAGAGCGGGCCAGCTGGTCCCGCGGGAGCACCAGGGCCTGCCGGCTCCAGGGGTGCACCAGGACCCCAGGGTCCTCGCGGCGACAAAGGAGAAACAGGGGAACGTGGCGCGGCGGGGATCAAAGGACATAGGGGTAAGCGTGAAGCAGGGAAGTCTGGTGATCGGGGTGAGTCGGGACCAGCTGGACCCGCCGGAGCACCCGGCCCCGCCGGATCTCGAGGAGCACCGGGTCCTCAAGGGCCGCGTGGTGACAAAGGCGAGACTGGGGAACGCGGAGCTGCGGGCATCAAAGGGCATCGGGGTAAGCGAGAGGCGGGAAAATCGGGTGATAGGGGGGAGTCTGGTCCTGCAGGGCCAGCAGGAGCCCCCGGACCAGCGGGGTCACGGGGCGCACCTGGTCCTCAAGGTCCTAGAGGAGACAAAGGAGAGACCGGCGAGCGGGGGGCTGCCGGAATTAAGGGTCACCGGGGCAAGCGAGAGGCCGGAAAGAGTGGCGATCGTGGCGAATCCGGCCCAGCAGGTCCTGCTGGCGCTCCTGGCCCGGCAGGTTCTCGCGGTGCTCCTGGACCGCAGGGTCCAAGAGGGGATAAGGGGGAAACGGGTGAGCGGGGTGCAGCCGGGATAAAGGGGCATAGGGGGAAACGCGAAGCAGGTAAAAGCGGAGATAGAGGAGAGAGTGGCCCCGCTGGTCCTGCGGGGGCACCCGGGCCGGCCGGTTCTCGTGGTGCCCCCGGCCCTCAAGGTCCTAGAGGCGATAAGGGCGAAACCGGTGAGCGCGGCGCTGCGGGTATTAAGGGTCACAGGGGTAAACGTGAAGCCGGCAAGTCGGGTGACCGTGGAGAGTCTGGCCCAGCCGGACCTGCTGGAGCGCCCGGCCCAGCTGGATCACGTGGTGCTCCTGGTCCGCAGGGTCCACGAGGAGACAAGGGGGAAACGGGGGAACGCGGCGCAGCGGGGATAAAAGGGCATAGAGGTAAAAGG
设计好的DNA序列委托南京金斯瑞科技有限公司合成，并直接构建于表达载体pPIC9K(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)之上，克隆位置为α-factor secretion signal/cleavage site 1203(查找序列为AAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGA)与Not I酶切位点之间。扩增表达质粒，以质粒小提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)抽提质粒，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。将提取的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，验证正确，得到构建的重组表达载体质粒。
(3)重组工程菌株构建及高表达筛选
将上述得到的重组表达载体质粒10μg用限制性内切酶SacI(购自大连Takara公司)37℃酶切消化，使其线性化，再使用PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)回收线性化质粒。取线性化的质粒10μL电转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，取200μL转化产物涂布到MD平板上，于30℃培养箱中倒置培养2-3天，直至有阳性转化子出现。
向MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到无菌离心管中。用无菌双蒸水稀释菌悬液，以105个细胞涂布于含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，于30℃培养箱中倒置培养3～4天后至单菌落出现。
从YPD平板上挑取单菌落至装有200μL YPD培养基的96孔板中，混匀后于30℃培养箱中静置培养48h；混匀孔中菌液，取10μL转接至一块新的96孔板中，于30℃培养24h后再重复一次此操作，使得孔板中菌体密度保持相对一致，取第三块96孔板中的菌液在新的96孔板中以灭菌水或培养基将其稀释一定倍数使得最终点板细胞数为103～104，按Invitrogen操作手册(ppic9k-APichia Vector for Multicopy Integration and SecretedExpression)用多通道移液器吸取1～2μL菌液分别点板于含1、2、4mg/mL G418的YPD平板，置于30℃培养箱中培养2～5天。毕赤酵母转化子若能在含高浓度G418的平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个重组片段进入了酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选可得到的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种。
构建的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种样本送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：CGMCC NO.26121；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2022年11月11日。分类命名为：巴斯德毕赤酵母Komagataella phaffii。
(4)诱导表达与重组胶原蛋白的鉴定
取表达3A5D29重组胶原蛋白的毕赤酵母工程菌种置于装有15mL BMGY培养基的100mL三角瓶中，于30℃、220rpm培养至OD600为2～6左右(16-18h)。室温下1500～3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为2左右，放置于30℃、220rpm的摇床上继续生长36h以上，每24h向培养基中添加100％甲醇至甲醇终浓度为1.0％。收取菌液样品置于1.5mL EP管中，4℃下以12000g离心5min，收集表达上清，分别加入5×上样缓冲液(250mM Tris-HCl、pH6.8，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)和2×上样缓冲液(购自上海万生昊天生物技术有限公司)于金属浴100℃煮样10min，进行SDS-PAGE检测。电泳结果如图1所示。
如图1所示：两张图为同一样品在不同PAGE胶中的电泳结果，其分离范围有差异，其中左图为南京金斯瑞Bis-tris12％预制胶，右图为上海万生昊天Tricine预制胶。图中可见，3A5D29在诱导36h后可高效的分泌于胞外表达上清中，且出现由1～9个重组胶原蛋白单体组成的梯度分子量大小的目的条带，无明显降解条带，使用Image Lab软件(Bio-Rad GelDocTM XR+成像仪)测算，表观分子量从上到下依次为：59.9、52.8、45.9、40.0、33.3、26.9、21.6、16.7、7.8KDa，分子量大小基本上均与重组胶原蛋白单体的分子量呈梯度倍数关系，表明其成功表达了多个蛋白，包括1～9段重组胶原蛋白单体序列，符合预期，其中各组分的含量从上到下呈递增趋势；泳道中80KDa大小的位置出现一条非目的条带，其为毕赤酵母宿主菌自身分泌的内源性蛋白。
因胶原蛋白在凝胶电泳中存在一定的迁移延迟，所以其在胶图中表现出的分子量会比理论分子量高10％-40％，表观分子量7.8KDa、16.7KDa、21.6KDa、26.9KDa、33.3KDa、40.0KDa、45.9KDa、52.8KDa、59.9KDa相对应的理论分子量从小到大依次为5KDa、10KDa、15KDa、20KDa、25KDa、30KDa、35KDa、40KDa、45KDa。
将SDS-PAGE凝胶上的目的条带切割下来，送至苏州普泰生物技术有限公司进行Nano-LC-ESI-MS/MS蛋白质谱检测，将检测到的肽段进行序列比对(Uniprot数据库)，数据比对结果及鉴定肽段与天然序列比对覆盖图，如图2所示，图2可见，胶图上的目的条带酶解后检测到的肽段均属于Ⅲ型胶原α1链上的序列。
实施例2：高密度发酵与纯化
将实施例1中筛选到的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种接于种子培养基YPG中，30℃、220rpm过夜培养制备菌种液。设置发酵温度30℃。将菌种液按10％接种量加到含有3L发酵培养基BSM的5L发酵罐(保兴生物)中，pH设置为4.0。调节搅拌转速为300r/min-700r/min，空气通量为2VVM，罐压为0-0.05MPa，DO≥30％，培养至碳源耗尽，DO快速回升，开始流加补料培养基，至菌OD600＝150，湿重200g/L，停止流加补料培养基。等甘油耗尽DO≥70％后开始流加诱导培养基，进入甲醇诱导阶段，调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30％。每4h取样，测定OD600，湿重和UV蛋白含量。诱导48h后，结束发酵，放罐收集发酵液7000rpm离心20min，收集发酵液上清。
以缓冲液A(20mM KH2PO4，pH 4.0)平衡阳离子交换介质(层析填料为苏州纳微产UniGel-80sp装载于利穗科技产XK50/30层析柱，使用GE AKTA Pure蛋白质分离层析纯化系统)至A215吸光值和电导率值都保持不变后，开始上样，上样体积0.5L/次，上样结束后，再以缓冲液A平衡阳离子层析介质，直至A215吸光值和电导降至最低且不再变化后，最后以缓冲液B(20mM KH2PO4、1M NaCl，pH 4.0)进行洗脱，当A215吸光值开始上升时，打开收集口，收集洗脱液，直至A215下降至最低，停止收集。洗脱液进行SDS-PAGE检测，确认目的蛋白后，洗脱液进行透析(透析液为超纯水)，随后浓缩、冷冻干燥，最后收集冻干胶原蛋白海绵。
实施例3：细胞黏附活性检测
正常培养NIH/3T3细胞(购自中国科学院细胞库，货号GNM6，培养、传代方法参照细胞说明书执行)。取实施例2中得到的梯度分子量重组胶原蛋白的冻干样品，对照天然人胶原蛋白(Sigma，货号C7774)和本公司(江苏创健医疗科技股份有限公司)生产的大分子重组Ⅲ型胶原蛋白(公开号为CN103102407B，发明名称为：基因重组人胶原蛋白，授权公告日为2014年4月30日)，以UV蛋白定量经验公式：C(mg/mL)＝0.144*(A215-A225)测定蛋白浓度，再以PBS(pH 7.4)稀释至0.5mg/mL。向96孔细胞培养板中加入100μL各蛋白溶液和空白PBS溶液对照，室温静置60min；再向每孔中加入105个培养状态良好的NIH/3T3细胞，37℃、5％CO2孵育60min。以PBS清洗4次孔中细胞。使用LDH检测试剂盒(Roche，04744926001)检测OD492nm的吸光度值(具体操作参照说明书执行)，分析数据并进行显著性差异分析(SPSS22软件，Ducan法，P<0.05)。
OD492nm的吸光度相应的表征可以说明胶原蛋白样品的细胞粘附活性，黏附活性越高，说明蛋白粘附的细胞越多，胶原蛋白越能在短时间内帮助细胞贴壁或粘附于细胞外基质之上，更利于构建更佳的细胞外环境。该实施例的结果如图3所示，本发明得到的梯度分子量重组胶原蛋白的细胞粘附活性优于天然人胶原蛋白和大分子重组Ⅲ型胶原蛋白，表明其具有良好的生物学活性。

Claims (20)

1.一种含有重组胶原蛋白单体的蛋白融合体，其特征在于，所述蛋白融合体的结构用通式表示为L1-X-L2，其中X为重组胶原蛋白单体；L1为氨基酸EA，位于所述重组胶原蛋白单体的氨基端；L2为氨基酸KR，位于所述重组胶原蛋白单体的羧基端。
2.根据权利要求1所述的蛋白融合体，其特征在于，所述重组胶原蛋白单体包括SEQ IDNO：1所示的序列，或与SEQ ID NO：1具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的序列。
3.一种重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白包含权利要求1或2所述含有重组胶原蛋白单体的蛋白融合体。
4.根据权利要求3所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白包括串联重复的所述蛋白融合体，所述蛋白融合体之间构成Kex2蛋白酶识别切割位点KREA或HRGKREA。
5.根据权利要求4所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述串联重复次数为大于或等于1的正整数。
6.根据权利要求5所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述串联重复次数1-9次。
7.根据权利要求6所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述串联重复次数为9次，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
8.核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求4-7任一项所述重组胶原蛋白。
9.根据权利要求8所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列、或其简并序列。
10.重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求8或9所述核酸。
11.重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包含权利要求8或9所述的核酸、或包含权利要求10所述的重组载体、或表达权利要求4-7任一项所述重组胶原蛋白。
12.根据权利要求11所述的重组工程菌，其特征在于，所述工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC NO.26121；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2022年11月11日；分类命名为：Komagataellaphaffii。
13.组合物，其特征在于，所述组合物包含权利4-7任一所述的重组胶原蛋白、或权利要求8或9所述核酸、或权利要求10所述重组载体、或权利要求11或12所述重组工程菌。
14.制品，其特征在于，所述制品包含权利4-7任一所述的重组胶原蛋白、或权利要求8或9所述核酸、或权利要求10所述重组载体、或权利要求11或12所述的重组工程菌、或权利要求13所述的组合物；优选地，所述制品选自药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。
15.权利4-7任一所述的重组胶原蛋白、或权利要求8或9所述核酸、或权利要求10所述重组载体、或权利要求11或12所述的重组工程菌、或权利要求13所述的组合物、或权利要求14所述的制品在制备药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品中的用途。
16.一种梯度分子量重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)设计并获取权利要求4-7任一所述的重组胶原蛋白氨基酸序列和编码DNA序列；
(2)重组表达载体构建：将步骤(1)中所述的DNA序列克隆于表达载体上，得到重组表达载体；
(3)重组工程菌株构建及高表达筛选：将获得的重组表达载体转入毕赤酵母感受态细胞中，筛选高拷贝、高表达梯度分子量重组胶原蛋白的重组工程菌；
(4)诱导表达与梯度小分子胶原蛋白的获得：重组工程菌经诱导表达后，获得梯度分子量重组胶原蛋白。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的表达载体包括pPIC9K。
18.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的重组工程菌的宿主菌优选毕赤酵母，所述重组工程菌保藏编号为：CGMCC NO.26121。
19.根据权利要求16-18任一项所述的方法制备得到的梯度分子量重组胶原蛋白，其特征在于，所述梯度分子量重组胶原蛋白包括多个不同分子量胶原蛋白，所述不同分子量胶原蛋白的大小呈梯度分布。
20.根据权利要求19所述的梯度分子量重组胶原蛋白，其特征在于，所述多个不同分子量胶原蛋白包括权利要求1或2所述的重组胶原蛋白单体，所述多个不同分子量胶原蛋白均与重组胶原蛋白单体呈梯度倍数关系。
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