CN116082493A - 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 - Google Patents
高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116082493A CN116082493A CN202210954027.9A CN202210954027A CN116082493A CN 116082493 A CN116082493 A CN 116082493A CN 202210954027 A CN202210954027 A CN 202210954027A CN 116082493 A CN116082493 A CN 116082493A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- collagen
- sequence
- stability
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 115
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 114
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 112
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 claims description 8
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 claims description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 claims description 4
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 15
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 206010058679 Skin oedema Diseases 0.000 description 4
- 206010070835 Skin sensitisation Diseases 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 231100000370 skin sensitisation Toxicity 0.000 description 4
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 3
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 3
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N Dinitrochlorobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C([N+]([O-])=O)=C1 VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005615 Interstitial Cystitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920001903 high density polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004700 high-density polyethylene Substances 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001991 scapula Anatomy 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- RKQOSDAEEGPRER-UHFFFAOYSA-L zinc diethyldithiocarbamate Chemical compound [Zn+2].CCN(CC)C([S-])=S.CCN(CC)C([S-])=S RKQOSDAEEGPRER-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/24—Collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/10—General cosmetic use
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Birds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用,在原始胶原蛋白序列的基础上进行包括选自避免不稳定GXY三联体、去除潜在的MMP酶切位点、消除化学不稳定因素、增加序列中RGD含量中一种或多种的突变。该方法可以扩展到毕赤酵母以外的表达系统。由该方法获得的重组胶原蛋白与原始序列有类似的理化性质和生物学功能,作为生物材料使用时由于更高的稳定性,批间一致性高,便于质量控制,有利于产品稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白技术领域,尤其涉及高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用。
背景技术
胶原蛋白是动物机体中含量最丰富的一类蛋白质,是重要的细胞外基质成分,在细胞迁移、细胞代谢、细胞信号通路应答、血小板凝聚、细胞、组织、器官的正常生理功能的维护、调节及损伤修复等方面有重要作用。胶原蛋白有良好的生物相容性、生物活性和可降解性,现已广泛应用于化工、医药、食品、化妆品等众多领域。
动物组织中提取胶原蛋白的技术已较为成熟、且该类胶原蛋白已有悠久的应用历史。但传统胶原生产过程中使用的酸碱等原料对环境不友好,提取的胶原肽性质不均、批间差异大且有病毒感染的安全隐患,鉴于此类原因基因工程技术生产的重组胶原蛋白日益受到重视。重组胶原的研究及应用已有超过30年的历史,现有的文献及专利主要集中在不同宿主中人源胶原蛋白单链的表达、截短的胶原蛋白基因单链的表达,另有少量关注胶原蛋白与相关表达后修饰酶的共表达获得三螺旋结构的胶原蛋白。
现有技术涉及的重组胶原蛋白的表达多使用人源胶原蛋白序列(CN201010527766.7,CN201510535383.7,CN201911093124.8),表达产物多为无规卷曲,较少有规则的二级结构,更少有三、四级结构等高级结构,另外由于水溶性蛋白易于加工、使用,故氨基酸序列的选择多倾向于高水溶性。这就导致此类线状重组胶原蛋白在宿主内易被蛋白酶降解,在纯化、加工过程中,高水溶性蛋白由于疏水区域含量很少,无法折叠成稳定的高级结构,不稳定的侧链、残基、肽键易于发生脱酰胺、氧化、水解,最终可能导致产生与过程相关的杂质和降解产物,增加免疫原性。
获得高稳定性的重组胶原蛋白是本领域的迫切需求。
发明内容
为克服上述问题,本发明旨在通过对现有氨基酸序列的突变或对氨基酸序列的选择获得稳定性提高的重组胶原蛋白序列,简化纯化工艺,提高蛋白收率以及储存稳定性。
具体地,本发明第一方面提供了一种稳定性提高的胶原蛋白变体构建方法,在原始胶原蛋白序列的基础上进行包括选自避免不稳定GXY三联体、去除潜在的MMP酶切位点、消除化学不稳定因素、增加序列中RGD含量中一种或多种的突变。
在某些实施方式中,所述原始胶原蛋白包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:1具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述GXY三联体中G为甘氨酸,X和Y 可为任意氨基酸,胶原蛋白由GXY基序构成。
在某些实施方式中,所述避免不稳定GXY三联体包括在初始胶原蛋白序列中进行选自GPL→GPS、GIA→GPA、GDR→GER、GAA→GPA的突变。
在某些实施方式中,所述去除潜在的MMP酶切位点包括去除潜在的MMP2和/或MMP9酶切位点;优选地,进行GLA→GPA和/或GIK→GEK的突变。
在某些实施方式中,所述化学不稳定因素包括易于脱酰胺、易于水解、或易于氧化的位点;优选地,进行选自如下突变:1)NG→QG;2)F→P;3)MPGPR→PPGPR;4)在保留原有RGD序列情况下,将其他R突变为K;5)在保留原有RGD序列情况下,将其他D突变成E。
本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述方法获得的稳定性提高的胶原蛋白变体。
在某些实施方式中,所述胶原蛋白变体的序列包含选自与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述胶原蛋白变体的序列包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
本发明第三方面提供了高稳定性重组胶原蛋白,所述重组胶原蛋白包含选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或包含选自与SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的氨基酸序列。
本发明第四方面提供了分离的多核苷酸,所述多核苷酸编码本发明第二方面所述的稳定性提高的胶原蛋白变体或本发明第三方面所述的高稳定性重组胶原蛋白。
在某些实施方式中,所述多核苷酸包含选自与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的核酸序列。
在某些实施方式中,所述多核苷酸包含选自与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10所示的核酸序列。
本发明第五方面提供了载体,所述载体包含本发明第四方面所述的分离的多核苷酸。
在某些实施方式中,所述载体为真核载体。
在某些实施方式中,所述载体为原核载体。
本发明第五方面提供了宿主细胞,所述细胞包含本发明第四方面所述的分离的多核苷酸或本发明第五方面所述的载体。
在某些实施方式中,所述宿主细胞为真核细胞。优选地,所述宿主细胞为毕赤酵母。更优选地,所述毕赤酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.24687、CGMCC No.24688、CGMCC No.24689、CGMCC No.24690。
在某些实施方式中,所述宿主细胞为原核细胞。优选地,所述原核细胞为基因工程菌。
本发明第六方面提供了组合物,所述组合物包括本发明第二方面所述的稳定性提高的胶原蛋白变体或本发明第三方面所述的高稳定性重组胶原蛋白。
本发明第七方面提供了制品,所述制品包括本发明第二方面所述的稳定性提高的胶原蛋白变体、本发明第三方面所述的高稳定性重组胶原蛋白、本发明第六方面提供的组合物。
本发明第八方面提供了本发明第二方面所述的稳定性提高的胶原蛋白变体、本发明第三方面所述的高稳定性重组胶原蛋白、本发明第六方面提供的组合物或本发明第七方面所述的制品在制备医疗器材、生物材料、组织工程产品或化妆品中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供了一种高稳定性胶原蛋白变体的构建方法,包括避免不稳定GXY三联体、去除潜在的MMP酶切位点、消除化学不稳定因素、增加序列中RGD含量。该方法可以扩展到毕赤酵母以外的表达系统。
(2)本发明涉及的重组蛋白稳定性提高,在发酵阶段主条带占85%以上,纯化过程中不易发生降解,大大提高了全长蛋白的收率;
(3)本发明涉及的重组蛋白经纯化后获得的样品在稳定性实验中的表现优于原始蛋白,水溶液在4℃存放1个月未见明显降解条带,冻干海绵可在室温长期保存,减小了储存难度,延长了存储时间;
(4)本发明涉及的重组蛋白与原始序列有类似的理化性质和生物学功能,作为生物材料使用时由于更高的稳定性,批间一致性高,便于质量控制,有利于产品稳定性。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著:
图1显示重组胶原蛋白质谱检测结果。
图2显示重组胶原蛋白摇瓶表达上清(诱导48h)的SDS-PAGE。
图3显示各重组胶原5L罐发酵上清的SDS-PAGE图。
图4显示重组胶原蛋白海绵的SDS-PAGE。
图5显示重组胶原蛋白海绵的M4反相色谱结果。
图6显示重组胶原液体在不同温度下的稳定性。
图7显示重组胶原液体在不同pH下的稳定性。
图8显示细胞粘附活性检测。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另作定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明提供了一种高稳定性胶原蛋白变体的制备方法、由该方法获得的胶原蛋白变体的性能鉴定及其应用。包括如下方法步骤:
(1)设计胶原蛋白变体序列:
以CN201310033299.6(该专利氨基酸序列选自3型胶原)中的胶原序列为基础设计了一系列变体,其中:M2更改不稳定的GXY三联体(Bachinger, H.P. and J.M. Davis,Sequence specific thermalstability of the collagen triple helix. Int J BiolMacromol,1991.13(3):p.152-6.),去除潜在的MMP酶切位点,易于脱酰胺的位点NG突变为QG,光氧化敏感性F突变为P,与原始序列同源性为95%;M4以M2为基础,保留原有RGD序列,将其他R突变成K,与原始序列同源性为91.7%;M5以M2为基础,保留原有RGD,其他D突变成E,点突变使总序列含8个RGD基序,MPGPR→PPGPR,与原始序列同源性为92%;选取原序列中不含上述不稳定GXY三联体、潜在MMP酶切位点、化学不稳定因素的稳定序列拼接形成单体,进行5次重复形成M6。
(2)构建重组表达载体:
合成含M2、M4、M5、M6的DNA序列,将外源DNA连接入表达载体pPIC9K中,分别构建表达M2、M4、M5、M6的重组表达载体。
(3)构建重组工程菌株、诱导表达和菌株筛选;
以PmeⅠ线性化重组表达载体,电转入毕赤酵母感受态细胞,涂布至MD平板初筛后,再经过含有不同浓度G418的YPD平板筛选,挑取菌落接入BMGY培养基中,再以BMMY培养基诱导表达;挑取多株菌种,选择表达量高的一株工程菌株进行后续实验。
(4)蛋白质表达鉴定;
以SDS-PAGE电泳对表达的蛋白质进行初步鉴定,表明:M2、M4、M5、M6能够高效分泌表达于胞外,目的条带占90%以上,降解片段较少,大小符合胶原蛋白的表观迁移特征。液相分析结果与SDS-PAGE一致,目的条带含量达90%以上。
(5)高密度发酵、培养和蛋白质纯化;
采用发酵罐进行高密度发酵实验,SDS-PAGE验证主条带均占85%以上;经一步阳离子交换纯化后获得的目的条带占比达95%。
(6)体外细胞实验验证重组胶原蛋白细胞粘附活性;
使用体外培养的NIH/3T3细胞进行M2、M4、M5、M6与原序列的细胞粘附,实验表明:M2、M4、M5、M6与原序列的粘附活性无明显差别,与商品化的人胶原蛋白基本一致。
(7)重组胶原稳定性验证;
以原序列蛋白为对照,重组蛋白M2、M4、M5、M6冻干海绵进行不同温度(-20℃、4℃、25℃、40℃、60℃)、不同pH(4、7、9)条件下的稳定性检测,以SDS-PAGE和液相手段监测目的条带含量变化,M2、M4、M5、M6的稳定性显著高于原序列。
(8)重组胶原蛋白安全性实验;
委托中检华通威国际检验(苏州)有限公司按照GB/T16886.5-2017的方法要求,使用体外培养哺乳动物L-929细胞,测试重组胶原蛋白M4的潜在细胞毒性作用。按照GB/T16886.10-2017的方法要求,使用新西兰兔观察重组胶原蛋白M4的潜在皮内反应试验。按照GB/T16886.10-2017的方法要求,使用豚鼠最大剂量试验法观察重组胶原蛋白M4的潜在皮肤致敏作用。结果显示无细胞毒性、皮内反应和皮肤致敏作用。
(9)重组胶原蛋白膀胱修复剂的制备与检测
以下结合具体实施例对本发明的高稳定性重组胶原蛋白、其生产方法、性能验证进行阐述。
实施例1:胶原蛋白变体氨基酸序列的设计
原序列为CN201310033299.6中序列,该序列以3型胶原(https://www.uniprot.org/uniprot/P02461)序列中第908-1136AA为单体进行串联,C端融合6His标签,其序列如SEQ ID NO:1:
AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFTAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPADHHHHHHTGLARF
M2将稳定性得分为0.0的三联体更改为得分为2.0或1.0的三联体,具体更改序列:GPLGIA(38-43,270-275)→GPSGPA,GDR(125-127,155-157,357-359,387-389)→GER,GAA(194-196,426-428)→GPA。删除D462、连接序列EFT(230-232)、6His后序列TGLARF(469-474)。突变GLA(潜在的MMP2、MMP9识别位点,49-51,94-96,277-279,322-324)→GPA,GIK(潜在的MMP2识别位点,196-198,424-426)→GEK。去除化学不稳定因素,NG(易于脱酰胺的位点,78-79,129-130,306-307,357-358)→QG,F(光诱导氧化敏感,203,431)→P。其序列如SEQ ID NO:2:
AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPSGPAGITGARGPAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGAQGLSGERGPPGPQGLPGPAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGERGEQGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGERGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGPAGEKGHRGPPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPSGPAGITGARGPAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGAQGLSGERGPPGPQGLPGPAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGERGEQGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGERGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGPAGEKGHRGPPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAHHHHHH
M4以M2为基础,保留原有RGD序列,将其他R突变成K(毕赤酵母多种内源蛋白酶识别碱性氨基酸,在其C端裂解,酶切位点最为常见的碱性氨基酸为精氨酸)。其序列如SEQ IDNO:3:
AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPSGPAGITGAKGPAGPPGMPGPKGSPGPQGVKGESGKPGAQGLSGEKGPPGPQGLPGPAGTAGEPGKDGNPGSDGLPGKDGSPGGKGEKGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGEKGESGPAGPAGAPGPAGSKGAPGPQGPRGDKGETGEKGPAGEKGHRGPPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPSGPAGITGAKGPAGPPGMPGPKGSPGPQGVKGESGKPGAQGLSGEKGPPGPQGLPGPAGTAGEPGKDGNPGSDGLPGKDGSPGGKGEKGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGEKGESGPAGPAGAPGPAGSKGAPGPQGPRGDKGETGEKGPAGEKGHRGPPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPA
M5以M2为基础,保留原有RGD序列,其他D突变成E(谷氨酰胺处易发生水解),点突变使总序列含8个RGD基序,MPGPR→PPGPR(M位于Kex2识别位点-5位上,-4位为阻碍酶切的P,M易发生氧化,故突变),其序列如SEQ ID NO:4:
AGNTGAPGSPGVSGPKGEAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPSGPAGITGARGDAGPPGpPGPRGSPGPQGVKGESGKPGAQGLSGERGDPGPQGLPGPAGTAGEPGREGNPGSEGLPGREGSPGGKGERGDQGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGERGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGPAGEKGHRGPPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGEAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPSGPAGITGARGDAGPPGpPGPRGSPGPQGVKGESGKPGAQGLSGERGDPGPQGLPGPAGTAGEPGREGNPGSEGLPGREGSPGGKGERGDQGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGERGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGPAGEKGHRGPPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAHHHHHH
选取原序列中不含MMP酶切位点,不含不稳定三联体的序列(2-37aa、62-85aa、134-154aa、176-190aa)拼接形成单体,其序列如SEQ ID NO:5:GNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGAPGPQGPRGDKGET
M6为SEQ ID NO.5重复5次,序列如SEQ ID NO: 6:
GPPGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGAPGPQGPRGDKGETGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGAPGPQGPRGDKGETGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGAPGPQGPRGDKGETGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGAPGPQGPRGDKGETGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGAPGPQGPRGDKGETGG
编码M2、M4、M5、M6的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-10所示。
实施例2: DNA序列的合成与重组表达载体的构建
委托南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成:合成表达M2、M4、M5、M6的DNA片段,将合成后的基因片段克隆至pPIC9K空载体(购自赛默飞世尔科技公司)中,使目的片段准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内,获得表达M2、M4、M5、M6的重组质粒。
实施例3:重组工程菌株的构建、菌种筛选
将上述重组表达质粒10μg用PmeⅠ(购自大连TaKaRa公司,具体操作按试剂盒说明书进行)37℃酶切消化过夜,使其线性化,再使用PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)回收线性化质粒,控制体积在10μL左右。
将线性化质粒电转化入宿主菌种毕赤酵母SMD1168(购自赛默飞世尔科技公司)感受态细胞,将电转后的菌液涂布于MD平板上,每100μL~200μL涂布一块平板,室温静置10min,于30℃倒置培养2-5天,直至单菌落(阳性转化子)出现。
向MD平板表面加入2mL无菌双蒸水,然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子,并转移到50mL离心管中。以无菌双蒸水稀释菌悬液,105个细胞涂布于含有0.5mg/mLG418的YPD平板上,倒置,30℃培养3~4d后至单菌落出现。从YPD平板上挑取菌落至无菌96孔板中(200μLYPD/孔),混匀,于30℃培养48h;混匀孔中菌液,各取10μL接入至一块新的无菌96孔板,于30℃培养24h后再重复一次此操作;24h后,从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有1.0mg/mL和4mg/mLG418的YPD平板上,于30℃继续培养96h~120h。毕赤酵母转化子若能在含高浓度G418的平板上生长,说明该转化子含有多拷贝的目的基因,即有多个重组片段进入了酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选可得到的高拷贝、可高效表达的重组酵母工程菌种。
构建的4种工程菌样本均送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏编号分别是: No.24687、No.24688、No.24689、No.24690。地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏日期:2022年4月18日。分类命名:巴斯德毕赤酵母
Komagataella
phaffii。
实施例4:诱导表达与重组胶原蛋白的鉴定
分别取表达M2、M4、M5、M6的毕赤酵母工程菌种,同时取专利CN201310033299.6中的工程菌株置于装有10mLBMGY培养基的100mL三角瓶中,于28-30℃、220rpm培养至OD600为2~6(16-18h)。室温下1500~3000g离心5min,收集菌体,用BMMY培养基重悬菌体,使OD600为2左右,放置于28-30℃、220rpm的摇床上继续生长3天,每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为1.0%。加甲醇诱导16h以上,就可收取菌液样品,取样量为1mL,置于1.5mL EP管中,4℃下以12000g离心5min,收集表达上清,待检测样品于-80℃保存备用。
收取的表达上清,加入5×上样缓冲液(250mMTris-HCl、pH6.8,10%SDS,0.5%溴酚蓝,50%甘油,5%β-巯基乙醇),置于100℃金属浴加热10min,进行SDS-PAGE检测。结果如图2所示,各胶原变体均能高效分泌于培养基上清,目的条带均占80%以上。
将M4、M5、M6在SDS-PAGE上的预期条带切割下来,用胰蛋白酶将其酶解,Nano-HPLC-MS/MS质谱检测重组胶原的胰蛋白酶解后肽段(交由苏州普泰生物技术有限公司完成),并将检测到肽段与理论序列进行比对。如图1所示:M4、M5、M6被酶解后检测到的肽段均属于对应胶原蛋白变体的理论序列,说明各胶原蛋白变体成功表达。
实施例5:高密度发酵与纯化试验
(1)对基因工程菌进行高密度发酵试验,重组M2、M4、M5、M6胶原蛋白规模化表达生产,获取含有重组胶原蛋白的发酵液。
种子培养基YPG(酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、甘油10g/L);发酵培养基(NH4H2PO4190.4g/L、KH2PO4 10.06g/L、CaSO4•2H2O1.18g/L、K2SO418.2g/L、MgSO4•7H2O14.9g/L、甘油40g/L);补料培养基(50%W/V甘油,每升加12mLPTM1微量元素);诱导培养基(100%甲醇,每升加入12mLPTM1微量元素);PTM1:用0.22μm的滤膜过滤除菌,4℃保存。发酵培养基高温灭菌后待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节PH至5.0。
工程菌株分批培养条件和诱导表达条件为:采用分批补料培养方法,培养温度30℃。工程菌接入含200ml种子培养基YPG的1L摇瓶,220rpm、30℃,培养18-20h,至OD600=2~10。使用5L发酵罐(保兴生物),装液量2L发酵培养基,2%甘油分开灭菌,接种前调节转速300rpm,通气量4L/min,温度30℃,用浓氨水配制好的碱液调pH,设置pH为4.5。然后先接入0.9mLPTM1,再将制备好的200ml种子液接入罐内(火焰圈接种),然后点击溶氧电极校百,校百后开始发酵。待生长溶氧第一次掉至30%,采用溶氧串级转速功能,保持30%;等待甘油耗完,溶氧反弹、溶氧大于70%(OD600值约20),取消溶氧串级转速,调高搅拌650rpm,甘油采用30%联动补料,补料80ml。停止补甘油,溶氧反弹至70%以上后,设置pH4、温度29℃,以甲醇、甘油混合碳源(甲醇:50%甘油=7:3)进行诱导培养。手动补加5ml,待溶氧反弹至70%以上后,设定补料速度为8ml/h,一小时后提高到为10ml/h,一小时后再次提高设定到20ml/h。待溶氧值低于30%,停止补料,等待溶氧反弹,溶氧回升至30%后联动补料。诱导40~60h,UV测量蛋白浓度增长幅度不明显或下降即可放罐。UV蛋白定量公式:C(mg/mL)=0.144*(A215-A225),A215<1.5。
收集发酵上清进行SDS-PAGE电泳检测,如图3所示,在高密度发酵条件下,各变体胶原蛋白在诱导24h以内均几乎只有目的条带,M4、M5在48h有轻微降解,光密度分析主条带占比均超过85%。
(2)纯化
缓冲液A:20mMKH2PO4,pH4.0;
缓冲液B:20mMKH2PO4、1MNaCl,pH4.0。
收集发酵液,2000g、30min、4℃离心分离菌体和发酵上清。以缓冲液A平衡阳离子交换介质(层析填料为苏州纳微产UniGel-80sp,装载于利穗科技产XK50/30层析柱,使用GEAKTAPure蛋白质分离层析纯化系统)至A215吸光值和电导率值都保持不变后,设置100us/cm的流速上样,上样体积0.5L/次,检测紫外A215吸光值,当其上升时,开始接样。待上样结束后,关闭接样,再以缓冲液A平衡阳离子层析介质,当A215吸光值下降时,打开接样,直至紫外和电导降至最低且不再变化,停止接样。收集洗脱液,分别检测确定好组份后,进行透析(透析液为超纯水),随后浓缩、冷冻干燥,收集冻干胶原蛋白海绵。取纯化后冻干海绵溶于超纯水,进行SDS-PAGE电泳,如图4所示。使用Image Lab软件(Bio-Rad Gel DocXR+成像仪)测算:M2、M4、M5、M6纯度分别达到97.1%、96.7%、90.6%、97.6% 。M4经反向色谱法测定纯度达99.78%,结果如图5所示。
实施例6:重组胶原蛋白稳定性试验
重组蛋白M2、M4、M5、M6冻干海绵加UP水配置成1mg/ml的溶液,0.22μm滤膜过滤后分装于无菌离心管,分别置于60℃、40℃、25℃、4℃、-20℃,第3天、7天、15天取样进行SDS-PAGE检测,结果如图6所示,-20℃、4℃条件下放置的各重组胶原蛋白与初始无明显区别,M4在60℃、40℃、25℃液体条件下的稳定性显著高于原序列及其他变体。
重组蛋白M2、M4、M5、M6冻干海绵加UP水配置成1mg/ml的溶液,调节pH为酸性(pH4-5)、中性(pH7-7.5)、碱性(pH9-10),0.22μm滤膜过滤后分装于无菌离心管,置于4℃,第1天、5天、10天、30天取样,进行SDS-PAGE检测,仅显示第10天取样检测结果,第5天时中性和碱性条件下的原序列重组胶原蛋白已无主条带(结果未显示),图7显示第10天的原序列结果和第5天一致,已全部降解,其他变体主条带占比仍超过60%,各变体在中性条件下的稳定性显著高于原序列蛋白。
实施例7:重组胶原蛋白细胞黏附活性实验
正常培养NIH/3T3细胞(购自中国科学院细胞库,货号GNM6,培养、传代方法参照细胞说明书执行)。取重组M2、M4、M5、M6胶原蛋白冻干海绵、对照人胶原蛋白(Sigma,货号C7774)及牛血清白蛋白(BSA,购自生工生物(上海)股份有限公司)溶解(超纯水或1MHCl溶液),以UV蛋白定量经验公式:C(mg/mL)=0.144*(A215-A225)测定蛋白浓度,再以PBS(pH7.4)稀释至0.5mg/mL。向96孔细胞培养板中加入100μL各种蛋白溶液和空白PBS溶液对照,室温静置60min;再向每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞,37℃、5%CO2孵育60min。以PBS清洗4次孔中细胞。使用LDH检测试剂盒(Roche,04744926001)检测570nm的吸光度值(具体操作参照说明书执行)。
吸光度表征胶原蛋白样品的细胞粘附活性:吸光度越高,说明蛋白粘附的细胞越多,黏附活性越高,胶原蛋白越能在短时间内帮助细胞贴壁或粘附于细胞外基质之上,更利于构建合适的细胞外环境。如图8所示,M2、M4、M5、M6与原序列胶原粘附活性接近,无显著差异,均显著高于对照组。
实施例8:重组胶原蛋白安全性实验
委托中检华通威国际检验(苏州)有限公司按照GB/T16886.5-2017的方法要求,使用体外培养哺乳动物L-929细胞,测试重组胶原蛋白M4的潜在细胞毒性作用。将试验样品与对照样品分别放在含有10%胎牛血清的MEM培养基中,于37℃培养箱浸提24小时。在浸提结束后将培养24小时的96孔板(104个/孔)内细胞培养基去除,换成相应浸提液,并在细胞培养箱(37℃,5%CO2,>90%湿度)中培养24小时。培养结束后镜下观察细胞形态和细胞裂解情况,并采用MTT法测定供试品的细胞毒性值。结果显示,空白对照组和阴性对照组(高密度聚乙烯)中细胞在整个试验过程中形态完好正常,没有显示细胞毒性反应。阳性对照组(ZDEC)中显示严重的细胞毒性反应。测试样品100%浓度浸提液在孵育细胞24小时后细胞形态基本完好,细胞活力值为83.6%。重组胶原蛋白M4在MTT法细胞毒性试验条件中没有潜在的细胞毒性影响。
委托中检华通威国际检验(苏州)有限公司按照GB/T16886.10-2017的方法要求,使用新西兰兔观察重组胶原蛋白M4的潜在皮内反应试验。使用0.9%氯化钠注射液和芝麻油浸提样品。在试验前18h,彻底除去动物背部脊柱两侧足够面积的被毛,以备注射浸提液。在试验当天,在每只兔脊柱一侧皮内注射10个位点,五个点注射0.2mL极性浸提液,五个点注射0.2mL非极性浸提液;在脊柱另一侧分别注射极性和非极性对照溶液,操作步骤同试验样品浸提液。根据“皮内反应评分系统”,观察并记录(24±2)h,(48±2)h和(72±2)h各注射点部位状况。结果显示,试验过程中动物未出现异常症状或死亡。试验组一侧皮肤反应未超过阴性对照组一侧皮肤反应,供试品与对照组动物皮肤完好,未出现红斑和水肿等反应。重组胶原蛋白M4在新西兰兔体内没有潜在皮内反应。
委托中检华通威国际检验(苏州)有限公司按照GB/T16886.10-2017的方法要求,使用豚鼠最大剂量试验法观察重组胶原蛋白M4的潜在皮肤致敏作用。使用0.9%氯化钠注射液和芝麻油浸提样品。将配制好的浸提液与弗氏完全佐剂混合成稳定性乳化剂,在每只动物去毛的肩胛骨内侧部位皮内注射乳化剂进行皮内诱导和局部诱导。局部诱导后14天,在诱导阶段未试验部位进行激发试验。激发后24小时和48小时,分别观察供试品组和对照组动物激发部位皮肤反应情况,按Magnusson和Kligman分级标准对每一激发部位的皮肤红斑和水肿反应进行评分。结果显示,阴性对照组(0.9%氯化钠注射液与芝麻油)中动物在试验过程中,皮肤完好,未出现皮肤红斑和水肿反应。阳性对照组(DNCB)动物出现明显皮肤红斑和水肿反应。重组胶原蛋白M4浸提液组动物皮肤完好,未出现皮肤红斑和水肿反应。重组胶原蛋白M4在致敏试验中没有皮肤致敏作用。
实施例9:重组胶原蛋白膀胱修复剂的制备与检测
重组胶原蛋白膀胱修复剂配方:
规格:50ml:0.5g,浓度1%。配方:重组胶原蛋白:10(g),氯化钠:9(g),磷酸氢二钠:1(g),注射用水:1000ml(分装20瓶)。
制备过程:量取处方量体积注射用水于配液罐中,称取处方量氯化钠、磷酸氢二钠加至水中,搅拌15分钟使完全溶解后,加入处方量胶原蛋白,搅拌15分钟使其完全溶解。溶液过0.45μm滤膜,滤液过0.22μm滤膜。将滤液分装(50ml/瓶)、熔封。
功效检测:通过构建小鼠间质性膀胱炎模型,来评估重组胶原蛋白修复剂对膀胱炎的治疗效果,研究表明组胶原蛋白修复剂可以明显改善膀胱出血情况,而且经过修复剂治疗后膀胱粘膜上皮能够保持完整,无明显的水肿和脱落损伤,此外膀胱粘膜下胶原纤维排列紧密,胶原蛋含量有明显提升。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (13)
1.稳定性提高的胶原蛋白变体构建方法,其特征在于,在原始胶原蛋白序列的基础上进行包括选自避免不稳定GXY三联体、去除潜在的MMP酶切位点、消除化学不稳定因素、增加序列中RGD含量中一种或多种的突变。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述原始胶原蛋白包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:1具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述GXY三联体中G为甘氨酸,X和Y 可为任意氨基酸;优选地,所述避免不稳定GXY三联体包括在初始胶原蛋白序列中进行选自GPL→GPS、GIA→GPA、GDR→GER、GAA→GPA的突变。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述去除潜在的MMP酶切位点包括去除潜在的MMP2和/或MMP9酶切位点;优选地,进行GLA→GPA和/或GIK→GEK的突变。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述化学不稳定因素包括易于脱酰胺、易于水解、或易于氧化的位点;优选地,进行选自如下突变:1)NG→QG;2)F→P;3)MPGPR→PPGPR;4)在保留原有RGD序列情况下,将其他R突变为K;5)在保留原有RGD序列情况下,将其他D突变成E。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法获得的稳定性提高的胶原蛋白变体;优选地,所述胶原蛋白变体的序列包含选自与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的氨基酸序列;更优选地,所述胶原蛋白变体的序列包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
7.高稳定性重组胶原蛋白,其特征在于,所述重组胶原蛋白包含选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,或包含选自与SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的氨基酸序列。
8.分离的多核苷酸,所述多核苷酸编码权利要求6所述的稳定性提高的胶原蛋白变体或权利要求7所述的高稳定性重组胶原蛋白;优选地,所述多核苷酸包含选自与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的核酸序列;更优选地,所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核酸序列。
9.载体,所述载体包含权利要求8所述的分离的多核苷酸;优选地,所述载体为真核载体或原核载体。
10. 宿主细胞,所述细胞包含权利要求8所述的分离的多核苷酸或权利要求9所述的载体;优选地,所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞;更优选地,所述宿主细胞为毕赤酵母;更优选地,所述毕赤酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.24687、CGMCC No.24688、CGMCC No.24689、CGMCC No.24690。
11.组合物,所述组合物包括权利要求6所述的稳定性提高的胶原蛋白变体或权利要求7所述的高稳定性重组胶原蛋白。
12.制品,所述制品包括权利要求6所述的稳定性提高的胶原蛋白变体或权利要求7所述的高稳定性重组胶原蛋白或权利要求11所述的组合物。
13.根据权利要求6所述的稳定性提高的胶原蛋白变体、权利要求7所述的高稳定性重组胶原蛋白、权利要求11所述的组合物或权利要求12所述的制品在制备医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品中的应用。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210954027.9A CN116082493B (zh) | 2022-08-10 | 2022-08-10 | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 |
PCT/CN2023/111028 WO2024032467A1 (zh) | 2022-08-10 | 2023-08-03 | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210954027.9A CN116082493B (zh) | 2022-08-10 | 2022-08-10 | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116082493A true CN116082493A (zh) | 2023-05-09 |
CN116082493B CN116082493B (zh) | 2023-11-07 |
Family
ID=86197942
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210954027.9A Active CN116082493B (zh) | 2022-08-10 | 2022-08-10 | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116082493B (zh) |
WO (1) | WO2024032467A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116655808A (zh) * | 2023-06-01 | 2023-08-29 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用 |
WO2024032467A1 (zh) * | 2022-08-10 | 2024-02-15 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102146135A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-10 | 陕西九州生物医药科技园发展有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白及其生产方法 |
CN103102407A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-15 | 西安益力欣生物科技有限公司 | 基因重组人胶原蛋白 |
CN105061589A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-11-18 | 华南理工大学 | 一种重组人ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法 |
CN113185604A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-07-30 | 江苏创健医疗科技有限公司 | 一种重组人xvii型胶原蛋白、制备方法和应用 |
CN114106150A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-01 | 江苏创健医疗科技有限公司 | 重组胶原蛋白、制备方法及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7238783B2 (en) * | 2000-02-22 | 2007-07-03 | The Texas A&M University System | Prokaryotic collagen-like proteins and uses thereof |
US20090291474A1 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Szu-Wen Wang | Collagen-like polypeptides and encoding polynucleotides |
CN111040021B (zh) * | 2018-10-12 | 2023-06-02 | 浙江道尔生物科技有限公司 | 一种改善生物活性蛋白性质的载体蛋白 |
CN116082493B (zh) * | 2022-08-10 | 2023-11-07 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 |
-
2022
- 2022-08-10 CN CN202210954027.9A patent/CN116082493B/zh active Active
-
2023
- 2023-08-03 WO PCT/CN2023/111028 patent/WO2024032467A1/zh unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102146135A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-10 | 陕西九州生物医药科技园发展有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白及其生产方法 |
CN103102407A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-15 | 西安益力欣生物科技有限公司 | 基因重组人胶原蛋白 |
CN105061589A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-11-18 | 华南理工大学 | 一种重组人ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法 |
CN113185604A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-07-30 | 江苏创健医疗科技有限公司 | 一种重组人xvii型胶原蛋白、制备方法和应用 |
CN114106150A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-01 | 江苏创健医疗科技有限公司 | 重组胶原蛋白、制备方法及其应用 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024032467A1 (zh) * | 2022-08-10 | 2024-02-15 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 |
CN116655808A (zh) * | 2023-06-01 | 2023-08-29 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用 |
CN116655808B (zh) * | 2023-06-01 | 2024-02-06 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116082493B (zh) | 2023-11-07 |
WO2024032467A1 (zh) | 2024-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN116082493B (zh) | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 | |
KR102559311B1 (ko) | 재조합 인간 xvii형 콜라겐, 제조방법 및 응용 | |
CN114106150B (zh) | 重组胶原蛋白、制备方法及其应用 | |
WO2024002149A1 (zh) | 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法 | |
CN115558612A (zh) | 重组全长ⅲ型人源化胶原蛋白酵母工程菌株及构建方法 | |
CN112521491B (zh) | 一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法 | |
CN110590939A (zh) | 一种利用基因工程获得重组人纤连蛋白的方法 | |
CN116375847A (zh) | 酵母重组xvii型人源化胶原蛋白及其制备方法 | |
CN116970503A (zh) | 一种强化囊泡转运的产乳铁蛋白毕赤酵母及促进胞外分泌的方法 | |
RU2478706C1 (ru) | Способ получения суспензий гидрогелевых микрочастиц с заданными размерами на основе рекомбинантного белка паутины и их применение | |
CN115896073A (zh) | 一种高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶及其表达应用 | |
CN113880941B (zh) | 重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用 | |
CN116948013B (zh) | 重组小分子胶原蛋白及其表达系统与制备方法 | |
CN115806960B (zh) | 一种高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表达应用 | |
RU2451023C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного белка паутины, слитый белок, рекомбинантная днк, вектор экспрессии, клетка-хозяин и штаммы-продуценты | |
CN107778365A (zh) | 一种多点整合的重组蛋白表达方法 | |
CN116509764A (zh) | 一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液 | |
CN115960211B (zh) | 一种重组人源ⅵ型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
CN115992117B (zh) | 一种重组人溶菌酶及其制备方法和应用 | |
KR20220108113A (ko) | 아스퍼질러스 자포니쿠스로부터의 프룩토실트랜스퍼라제의 제조를 위한 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 방법 | |
CN117025655B (zh) | 一种提高人源ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体、基因工程菌及方法和应用 | |
CN116655808B (zh) | 梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
CN107881178A (zh) | 八目鳗口腔腺CystatinF、制备方法及应用 | |
CN118146354A (zh) | 重组vii型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
CN117510618B (zh) | 一种合成i型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |