CN115896073A - 一种高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶及其表达应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶及其表达应用，基于结构分析，结合多种稳定性设计软件的系统性测试，探究胃蛋白酶的热力学结构弱点并以此进行突变体筛选，获得了在70℃半衰期分别提高了200.0％和66.3％的D52N和S129A突变体，并与市售的胃蛋白酶制剂进行活性比较，与商业化胃蛋白酶的比活力没有显著性差异，重组胃蛋白酶可以代替商业化动物脏器提取的胃蛋白酶。

Description

一种高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶及其表达应用

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表达应用。

背景技术

能够切割蛋白质中肽键的酶被称为蛋白酶，它们在自然界中广泛存在。在酸性条件下发生反应的天冬氨酸蛋白酶是从属于蛋白酶的一个大类，其中包括胃蛋白酶。胃蛋白酶是第一个被测得氨基酸序列的天冬氨酸酶，也是第二个被解析晶体结构的酶。因此，胃蛋白酶是研究天冬氨酸蛋白酶最经典常用的模型蛋白。除此之外，胃蛋白酶具有较广的底物特异性，被用于多种大蛋白质的水解，在饲料添加剂、奶制品凝乳、果汁澄清、酿酒原料加工、皮革处理等工业生产中有广泛应用。

酶的热稳定性表征酶分子在高温下维持自身结构和活性的能力，是评价酶应用价值的重要标准。热稳定的酶拥有良好的动力学稳定性，能够在高温下进行反应，具备加快反应速率、增强底物溶解、降低微生物污染等优势，因而备受工业青睐。提高酶热稳定性的策略可分为物理添加、化学修饰和生物改造，其中物理添加的成分主要是固定化试剂或明胶、甘油等稳定剂，化学修饰是与氨基酸侧链的官能团反应或交联吸附，生物改造常用基于计算分析后的定向进化获得优势突变体。

胃蛋白酶是研究天冬氨酸蛋白酶最经典常用的模型蛋白，且在饲料添加剂、奶制品凝乳、果汁澄清、酿酒原料加工、皮革处理等工业生产中有广泛应用。因此，需要制备得到高产量、高质量、高稳定的胃蛋白酶以投入实验和生产。然而，传统的胃蛋白酶是从猪、羊、牛等动物消化脏器通过酸法、碱法、两相分离、亲和色谱等方法提取，这些方法不仅存在受到动物器官资源限制、不同批次产品质量不一等缺陷，而且动物脏器提取的胃蛋白酶无法用于清真食品加工。目前，国内外研究者建立了大肠杆菌、毕赤酵母的胃蛋白酶工业表达体系，但是表达量远不足工业生产需求，且在大肠杆菌中表达时会产生不利于后续操作的包涵体。同时，工业应用对酶的热稳定性有较高要求，而胃蛋白酶的热稳定性较差，无法满足饲料加工中的制粒要求，限制了它的应用范围和使用效果。提高酶热稳定性的策略可分为物理添加、化学修饰和生物改造，前两种策略需要附加额外工艺处理，一方面进一步增加了生产成本，另一方面添加的化学试剂会给生产加工过程带来新的污染。

因此，如何从生物分子层面对胃蛋白酶进行改造并获得高热稳定性的人工改造酶一直是本领域技术人员致力于研发的方向之一。

发明内容

本申请的主要目的在于提供一种高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶及其表达应用，以解决目前的问题。

为了实现上述目的，本申请提供了如下技术：

本发明提供了一种高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.5所示。

编码上述高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶的基因。

上述基因的核苷酸基因序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

包含上述核苷酸序列的重组表达载体。

包含上述重组表达载体的宿主细胞。

本发明还提供了高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶的基因在分泌表达胃蛋白酶中的应用。

将所述的通过理性设计、定点突变得到的新的人工改造的胃蛋白酶基因在原核细胞中，与用于原核细胞进行基因操作所用的穿梭表达质粒连接构成重组表达质粒；将重组表达质粒转化入真核细胞表达蛋白并整合入真核细胞基因组中得到重组酵母；培养重组酵母，诱导胃蛋白酶的分泌表达。

上述应用中，原核细胞为大肠杆菌，真核细胞表达蛋白是毕赤酵母Pichiapastoris GS115表达蛋白。

与现有技术相比较，本申请能够带来如下技术效果：

本发明基于结构分析，结合多种稳定性设计软件的系统性测试，探究胃蛋白酶的热力学结构弱点并以此进行突变体筛选，获得了在70℃半衰期分别提高了200.0％和66.3％的D52N和S129A突变体，并与市售的胃蛋白酶制剂进行活性比较，与商业化胃蛋白酶的比活力没有显著性差异，重组胃蛋白酶可以代替商业化动物脏器提取的胃蛋白酶。

本发明制备的胃蛋白酶，可以满足饲料加工中的制粒要求，提高胃蛋白酶的应用范围和使用效果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

本实施例中，所涉及到的各种生物反应试剂、反应设施、硬软件设施，仅仅为本申请的一种胃蛋白酶制备方法选择试剂，作为本技术的最优实施方案进行展示，但是并不代表本申请在试剂、反应设施、硬软件设施等应用选择上，仅仅利用下述实施例所提供的材料进行表达，只要本领域技术人员可以替换性实施的各种生物反应试剂、反应设施、硬软件设施，可以达到本申请的技术目的，皆可用于本研究的应用，皆应收到保护。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考实施例来详细说明本申请。

下面将具体描述各个制备步骤的实施方法。各个蛋白的氨基酸编码以及基因序列，详见序列表附件。

本发明通过PoPMuSiC、HoTMuSiC、ETSS、DeepDDG和Fireprot稳定性软件的结果进行胃蛋白酶突变体的筛选，并发现在紧密堆积的α螺旋和β折叠上的突变会引起蛋白质结构变化进而失去活性，而位于表面的α螺旋和柔性链则是胃蛋白酶的主要热力学弱点，基于此进行的突变可有效提高热稳定性。

本申请所得的突变体D52N和S129A，其制备原理一致，其制备原理一致，其中，突变体D52N的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；突变体S129A的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例1：重组质粒的构建

(1)以猪胃蛋白酶原基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，人工合成制备得到)为模板，通过PCR扩增在两端插入EcoRI、NotI酶切位点并引入突变，具体引物设计如下表所示：

在目的基因与载体pPIC9K中分别加入EcoRI、NotI Fast Digest内切酶进行双酶切，步骤如下：32μL目的基因/载体，2μL Fast Digest EcoRI限制性内切酶，2μL FastDigest NotI限制性内切酶，4μL 10×酶切缓冲液。

(2)将双酶切产物按预设体积比混合后，加入T4 DNA连接酶进行质粒重组，步骤如下：2μL酶切后载体，6μL酶切后目的基因，1μL T4 DNA连接酶，1μL 10×连接缓冲液。

(3)将连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，取转化细胞涂布于抗性固体LB培养基平板上倒置培养后送样测序。步骤如下：

①E.coli DH5α感受态细胞制备后保存于-80℃冰箱，一周内使用，取出的感受态细胞立即冰浴处理，等待细胞解冻；

②无菌操作环境下，将10μL连接产物与100μL刚刚融解的感受态细胞轻柔混匀，冰上静置25min；

③将感受态细胞于42℃静置热激1min，并立即冰浴静置2min；

④加入1mL LB液体培养基(0.5％(m:V)酵母粉，1.0％(m:V)蛋白胨，1.0％(m:V)NaCl，超纯水溶解，121℃灭菌20min)，37℃培养1h；

⑤6000×g离心2min，保留70-100μL液体重悬菌体，将菌液均匀涂布于LB固体平板上(含1.5％(m:V)琼脂、100μg/mL Amp、50μg/mL Kan)，37℃恒温培养箱倒置过夜培养。送样测序。

(4)对测序结果阳性的重组菌株抽提质粒，步骤如下：将质粒扩增菌株接种于10mLLB液体培养基(含100μg/mL Amp、50μg/mL Kan)中，37℃、220rpm过夜培养至OD600超过1.5，利用质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。

实施例2：表达菌株的构建

(1)选用SalI位点实现重组质粒的线性化，步骤如下：34μL重组质粒，2μL FastDigest SalI限制性内切酶，4μL 10×酶切缓冲液。种子液

(2)制备酵母感受态细胞，步骤如下：

①将毕赤酵母甘油菌在YPD平板(1.5％(m:V)琼脂)上划线，于30℃恒温培养箱培养2-3d；

②从YPD平板上选取光滑圆润的单菌落，挑取单菌落接种于10mL YPD液体培养基(1.0％(m:V)酵母粉，2.0％(m:V)蛋白胨，2.0％(m:V)葡萄糖，超纯水溶解，115℃灭菌30min)中，30℃、200rpm培养36-48h；

③取5mL种子液转接100mL YPD液体培养基，30℃、200rpm培养至OD600 1.0-1.2左右；

④于4℃下8000×g离心5min，弃上清，收集菌体，加入10mL预冷无菌水轻柔洗涤菌体；

⑤重复步骤④，再次洗涤菌体；

⑥于4℃下8000×g离心5min，弃上清，收集菌体，加入10mL预冷1M山梨醇溶液悬浮菌体；

⑦重复步骤⑥，用5mL预冷1M山梨醇溶液悬浮菌体；

⑧于4℃下8000×g离心5min，弃上清，收集菌体，加入1mL预冷1M山梨醇溶液悬浮菌体，分装90μL/管，冻存于-80℃。

(3)电转化酵母感受态细胞，步骤如下：0.2cm电击杯用无水乙醇冲洗干净后放入75％乙醇中浸泡过夜，使用前在超净工作台中拿出，在紫外灯下照射吹干。制备的毕赤酵母感受态细胞冰浴溶解，加入10μL线性化质粒，混合均匀。以上体系全部转移到预冷的0.2cm电击杯中，冰浴5-10min。打开电转仪中预设的真核生物-毕酵母的程序，进行电穿孔操作。电击后立刻在无菌环境中向电击杯内体系加入900μL预冷的1M山梨醇溶液，然后将溶液全部转移到1.5mL无菌eppendorf管(EP管)中，30℃静置1-2h。在4℃下8000×g离心2min收集菌体，均匀涂布于MD平板(2.0％(m:V)葡萄糖，1.5％(m:V)琼脂，超纯水溶解并定容至90mL，115℃灭菌30min，加入预灭菌的10×YNB 10mL；10×YNB：13.4％(m:V)YNB，0.22μm滤膜过滤除菌)上，30℃正置培养24h后，倒置继续培养48-72h。

(4)筛选构建成功的菌株，步骤如下：将MD平板上长出的单克隆挑取若干个，转接在脱脂牛奶-BMMY复合平板(A液：称取3.00g脱脂奶粉，超纯水溶解，用HCl调节pH为2.0，定容50mL，灭菌锅预热至95℃左右放入，121℃灭菌20min，灭菌结束后立刻手动泄压取出，防止褐变；B液：称取2.00g琼脂，50mL超纯水溶解，121℃灭菌20min；趁热将A液、B液混合均后，倒入平板)上进行活性筛选，平板盖上加入100μL甲醇以维持甲醇环境浓度诱导目的蛋白表达。30℃恒温培养箱中培养3-5d，每天观察菌落周围脱脂牛奶-BMMY复合平板中牛奶层水解情况，记录并比较透明圈出现时间和透明圈大小。根据底物水解产生的透明圈情况挑选3株高表达重组子，接种于5mL YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养36h，用酵母基因组抽提试剂盒抽提基因组。送样测序。

实施例3：胃蛋白酶的表达和纯化

(1)毕赤酵母发酵，步骤如下：测序正确的高酶活力菌株按照1％接种量接种至10mL YPD液体培养基中，在30℃、200rpm条件下活化48-72h；将活化后的种子液按照2％接种量转接100mL BMGY液体培养基(1.00g酵母粉，2.00g蛋白胨，1.00mL甘油，超纯水溶解并定容至80mL，121℃灭菌20min，加入预灭菌的10×磷酸盐缓冲液和10×YNB各10mL；10×磷酸盐缓冲液：13.20mL 1mol/L K2HPO4，86.80mL 1mol/L KH2PO4混合，用KOH和磷酸调节pH为6.0，121℃灭菌20min)中，30℃、200rpm下培养14h后，4℃、8000×g离心5min收集菌体，用100mL BMMY液体培养基(1.00g酵母粉，2.00g蛋白胨，超纯水溶解并定容至80mL，121℃灭菌20min，加入预灭菌的10×磷酸盐缓冲液和10×YNB各10mL、过滤除菌的甲醇1mL)重新悬浮菌体，在30℃恒温摇床中发酵72h，每隔24h补加1mL甲醇。发酵完成后，将菌液在4℃、12000×g条件下离心10min，收集发酵上清液。

(2)由于发酵液体积大、杂质多、色素重，首先要进行硫酸铵沉淀，达到浓缩蛋白、去除部分杂质的目的。步骤如下：将硫酸铵颗粒仔细研磨，用300目筛网筛到的硫酸铵粉末进行后续实验。离心得到的100mL发酵液上清在冰浴条件下，边搅拌边缓缓加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵终浓度达到80％饱和浓度，然后在冰浴条件下继续搅拌4h，使蛋白质充分沉淀。沉淀完成后，4℃、20000×g离心20min，弃上清，沉淀用10mL镍柱平衡缓冲液(三羟甲基氨基甲烷(Tris)2.42g，NaCl 29.22g，超纯水溶解，用HCl调节pH为7.5，定容至1L，0.22μm滤膜过滤后，超声15min脱气)重新溶解获得粗酶液。由于胃蛋白酶原的分子量为40kDa左右，因此选用截留分子量为10kDa的透析袋，粗酶液用1L镍柱平衡缓冲液在4℃下透析过夜。

(3)镍柱纯化蛋白，步骤如下：透析后的浓缩发酵液在4℃、20000×g条件下离心20min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤除去不溶性杂质和颗粒，然后用HisTrap HP 1mL柱子进行蛋白纯化，用镍柱洗脱缓冲液(Tris 2.42g，NaCl 29.22g，咪唑34.04g，超纯水溶解，用HCl调节pH为7.5，定容至1L，0.22μm滤膜过滤后，超声15min)进行线性梯度咪唑洗脱得到纯化胃蛋白酶原。

(4)Con A柱纯化蛋白，步骤如下：将镍柱纯化得到的含目的蛋白的洗脱液用截留分子量为10kDa的超滤管置换缓冲液以除去咪唑，用伴刀豆球蛋白A(ConA)琼脂糖凝胶柱吸附糖基化的胃蛋白酶原，流穿液即为未糖基化胃蛋白酶原(ConA洗脱液：Tris 0.24g，NaCl2.92g，α-甲基-D-甘露糖苷7.77g，超纯水溶解，用HCl调节pH为7.5，定容至100mL，0.22μm滤膜过滤后，超声15min)。

(5)胃蛋白酶原的体外活化，步骤如下：将获得的未糖基化胃蛋白酶原浓缩，加入适量的1.5％0.9M HCl调节pH约2.0，室温活化一段时间后，加入10％的1M乙酸钠中和缓冲液(8.20g乙酸钠，超纯水溶解，用乙酸调节pH为5.3，定容至100mL，0.22μm滤膜过滤后，超声15min)终止反应。采用截留分子量为10kDa的超滤管来去除前导肽片段，同时将缓冲液置换为20mM乙酸钠蛋白保存缓冲液(1.64g乙酸钠，超纯水溶解，用乙酸调节pH为5.3，定容至1L，0.22μm滤膜过滤后，超声15min)。

(6)通过BCA蛋白浓度测定法，得到突变体D52N表达蛋白浓度为91mg/L，得到突变体S129A表达蛋白浓度为88mg/L，是目前胃蛋白酶异源表达的最高水平，且此表达量未经过发酵条件优化。

实施例4：胃蛋白酶突变体的酶活测试

对上述制备得到的突变体D52N和S129A胃蛋白酶进行活性测定。胃蛋白酶活性测定参考了2016版中华人民共和国国家标准(GB 1886.174-2016)。在pH＝2、60℃下，取预热的1.00mL酶液与预热的1.00mL 1％牛血红蛋白溶液(1.000±0.001g牛血红蛋白，用95mL0.1M柠檬酸钠缓冲液溶解，HCl调节pH后用缓冲液定容至100mL)混合，震荡反应10min后，先体系内加入2.00mL三氯乙酸溶液(三氯乙酸65.40g，超纯水溶解并定容至1L)终止反应。反应液在4℃、20000×g条件下离心5min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。向1.00mL上清液中加入5mL碳酸钠溶液(无水碳酸钠42.40g，超纯水溶解并定容至1L)调节体系pH，混匀后再次加入1.00mL福林酚试剂，40℃下孵育20min后，在680nm处测定吸光度值。蛋白酶活力为1g或1mL酶液在一定条件下，1min水解牛血红蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，单位为U·mg^-1或U·mL^-1。

以酪氨酸绘制标准曲线测定突变胃蛋白酶的比活力，分别测定了突变体D52N和S129A，并以未突变的市售胃蛋白酶制剂(Sigma公司)作为对照组，测试结果如下：

酶	<![CDATA[比活力(U·mg<sup>-1</sup>)]]>
		市售胃蛋白酶制剂	3318±44
D52N	2164±5
		S129A	2433±14

从上述数据可以看到，突变体D52N和S129A的比酶活与市售胃蛋白酶制剂相比，略有下降。

实施例5：胃蛋白酶突变体的热稳定性测定

利用发酵液进行突变体热稳定性初筛，在65℃和70℃测定D52N、S129A和未突变的市售胃蛋白酶制剂(Sigma公司)的半衰期t_1/2，具体方法如下：

纯化的重组蛋白用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH2.0)稀释，在65℃和70℃孵育，定期取样进行冰浴降温处理，并在最适条件(60℃和pH 2.0)下测量不同孵育时间样品的剩余活性。

结果如下表所示：

上述结果表明，突变体S129A在65℃和70℃的半衰期t1/2分别提升了55.6％和66.3％，D52N在65℃和70℃的半衰期t1/2分别提高了308.1％和200.0％。虽然突变体的比活力略低于市售胃蛋白酶制剂，但随着反应时间的增加，市售胃蛋白酶制剂的比活力迅速下降，在65℃、3.2分钟和70℃、0.8分钟后就低于突变体的比活力。因此，本发明构建的热稳定性突变体在长时间的反应中更具有应用价值。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。

2.编码权利要求1所述高热稳定性胃蛋白酶的人工改造酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

4.一种重组表达载体，其包含权利要求3中所述的核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，其包含权利要求4中所述的重组表达载体。

6.权利要求2所述基因在分泌表达胃蛋白酶中的应用。

7.根据权利要求6中所述的基因在分泌表达胃蛋白酶中的应用，其特征在于：

将所述的通过理性设计、定点突变得到的新的人工改造的胃蛋白酶基因在原核细胞中，与用于原核细胞进行基因操作所用的穿梭表达质粒连接构成重组表达质粒；将重组表达质粒转化入真核细胞表达蛋白并整合入真核细胞基因组中得到重组酵母；培养重组酵母，诱导胃蛋白酶的分泌表达。

8.根据权利要求7中所述的应用，原核细胞为大肠杆菌。

9.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于：真核细胞表达蛋白是毕赤酵母Pichiapastoris GS115表达蛋白。