CN107881178A - 八目鳗口腔腺CystatinF、制备方法及应用 - Google Patents

八目鳗口腔腺CystatinF、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种八目鳗口腔腺CystatinF、制备方法及应用，八目鳗口腔腺Cystatin F（Lm‑Cystatin F）与已报道的蛇毒蛋白cystatin仅有不到29%的序列一致性，与其他物种的序列一致性也非常低（30%~40%），能够以剂量依赖性的方式显著抑制人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）的增殖，能够抑制血管内皮细胞分化形成小管结构，即具有抗血管新生活性。本发明以优化的八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F，表达周期短且表达率高，所得蛋白为可溶性蛋白，不需要酶切，一步层析，具有操作简单、得率高等优点。

Description

八目鳗口腔腺CystatinF、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白、制备方法及应用，尤其是一种具有抗血管新生活性的八目鳗口腔腺Cystatin F、制备方法及应用。
背景技术
近年研究指出血管新生与多种疾病的发生及发展进程密切相关，例如脉络膜新生血管病、慢性炎症、银屑病、视网膜病、类风湿性关节炎，骨髓增生异常综合症以及肿瘤等等。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂为一类对半胱氨酸蛋白酶具有抑制作用的蛋白质。根据分子结构及功能的不同，半胱氨酸蛋白酶抑制剂可分为胞内型stefins、分泌型cystatin和激肽原家族蛋白（kininogens）。II型cystatin家族成员主要分布于体液或分泌腺中，含有两对高度保守的链内二硫键以及用于胞外定位的信号肽。目前研究发现，II型cystatin主要能够抑制组织蛋白酶B、H、L和S，以及天冬酰胺内肽酶等蛋白酶的活性、在蛋白质代谢、细胞生长分化、血管新生、肿瘤发生发展进程、免疫调节等方面发挥重要作用。
目前，制备cystatin的方法有以下几种，存在着不同问题：
1. 从组织中分离纯化，步骤繁琐，需要几步层析联合使用，易残留杂蛋白，得率低；
2. 采用毕氏酵母表达，表达步骤繁琐，周期长；
3. 采用原核表达，表达量相对较少且以包涵体形式存在，蛋白无活性，需要经过后期的变性及复性过程才能使蛋白具有生物学功能，操作步骤繁琐；还有部分研究亦是采用原核表达，其所选载体需含有较大分子量的促溶标签才能得到可溶性蛋白，增加了后续酶切标签的步骤，不仅操作复杂，而且也容易引起新的杂蛋白，降低蛋白的得率。
迄今为止，尚未有关于八目鳗口腔腺cystatin F的分子特征及生物学功能的研究报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种具有抗血管新生活性的八目鳗口腔腺Cystatin F、制备方法及应用。
本发明的技术解决方案是：一种八目鳗口腔腺Cystatin F，其特征在于DNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述八目鳗口腔腺Cystatin F的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 将DNA序列如SEQ ID NO:2所示的基因克隆至表达载体pCold I并构建pCold I-Lm-cystatin F原核表达重组质粒；
b. 将pCold I-Lm-cystatin F原核表达重组质粒及含有分子伴侣pTf16的重组质粒同时转化至大肠杆菌BL21表达菌中；
c. 将阳性转化子接种至5 mL含有终浓度为0.1 mg/mL氨苄及终浓度为0.02 mg/mL氯霉素的LB培养基中，于37℃、120 rpm过夜振荡培养；
d. 将菌液加入到体积为500 mL的LB培养基中，于37℃、180 rpm培养至菌体达到对数生长期，即OD600值为0.4~0.6；
e. 诱导表达：IPTG的终浓度为0.1 mM；L-Arabinose的终浓度为0.5 mg/ml；温度为15℃；转数为100 rpm；时间为24 h；
f. 采用His-tag亲和层析柱纯化rLm-cystatin F：采用0.22 µm的滤器过滤得菌液上清；上样平衡后分别采用40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、200 mM、250 mM、300 mM、350 mM、400mM的咪唑洗脱并收集洗脱液，即得到重组八目鳗口腔腺Cystatin F。
上述八目鳗口腔腺Cystatin F在制备抗血管新生药物中的应用。
本发明的八目鳗口腔腺Cystatin F（Lm-Cystatin F）与已报道的蛇毒蛋白cystatin仅有不到29%的序列一致性，与其他物种的序列一致性也非常低（30%~40%），能够以剂量依赖性的方式显著抑制人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVECs）的增殖，能够抑制血管内皮细胞分化形成小管结构，即具有抗血管新生活性。本发明以优化的八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F，表达周期短且表达率高，所得蛋白为可溶性蛋白，不需要酶切，一步层析，具有操作简单、得率高等优点。
附图说明
图1本发明实施例所得纯化产物SDS-PAGE电泳图。
图2是本发明实施例所得rLm-cystatin F能够显著抑制HUVECs的增殖示意图。
图3是本发明实施例rLm-cystatin F能够在体外抑制HUVECs分化形成小管结构示意图。
图4是以未优化的八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺CystatinF所得菌液SDS-PAGE电泳图。
图5是以未优化的八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺CystatinF所得菌液超声破碎的上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。
图6是以优化的八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F所得菌液SDS-PAGE电泳图。
图7是以优化的八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F所得菌液超声破碎的上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
实施例：
本发明在进食60分钟的东北八目鳗口腔腺分泌液内鉴定出了cystatin F（Lampetra morii cystatin F，Lm-cystatin F），Lm-cystatin F的开放阅读框序列含有459个核苷酸，由152个氨基酸组成，DNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中M1-A21为信号肽。Lm-cystatin F表观分子量为17.1 kDa，理论等电点为10.31，含有两对二硫键且具有该家族蛋白典型的结构域：即位于序列N端的甘氨酸G、位于序列中部的QXVXG模体以及位于序列C端的脯氨酸和色氨酸（PW）。序列分析结果表明来自东北八目鳗的cystatin F与其他物种cystatin的同源性较低。
制备方法依次按照如下步骤进行：
a. 将DNA序列如SEQ ID NO:2所示的基因克隆至表达载体pCold I并构建pCold I-Lm-cystatin F原核表达重组质粒；
b. 将pCold I-Lm-cystatin F原核表达重组质粒及含有分子伴侣pTf16的重组质粒同时转化至大肠杆菌BL21表达菌中；
c. 将阳性转化子（单菌落）接种至5 mL含有终浓度为0.1 mg/mL氨苄及终浓度为0.02mg/mL氯霉素的LB培养基中，于37℃、120 rpm过夜振荡培养；
d. 将菌液加入到体积为500 mL的LB培养基中，于37℃、180 rpm培养至菌体达到对数生长期，即OD600值为0.4~0.6；
e. 诱导表达：IPTG的终浓度为0.1 mM；L-Arabinose的终浓度为0.5 mg/ml；温度为15℃；转数为100 rpm；时间为24 h；
f. 采用His-tag亲和层析柱纯化rLm-cystatin F：采用0.22 µm的滤器过滤得菌液上清；上样平衡后分别采用40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、200 mM、250 mM、300 mM、350 mM、400mM的咪唑洗脱并收集洗脱液，即得到重组八目鳗口腔腺Cystatin F。经测序与SEQ ID NO:1所示八目鳗口腔腺Cystatin F氨基酸序列完全相同。
本发明实施例所得纯化产物的电泳实验结果如图1所示。图1中，M：低分子量蛋白质marker；1：rLm-cystatin F纯化产物。
结果表明：在约19.85 kDa处有特异性表达的目的蛋白条带，即重组蛋白（rLm-cystatin F），表达量较高。
本发明实施例所得rLm-cystatin F抗血管新生生物学活性如下：
1.MTT法检测rLm-cystatin F对HUVECs增殖的影响
（1）将生长状态良好的HUVECs加入至96孔细胞培养板中，于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中、并在温度为37℃、无菌的二氧化碳培养箱中培养24 h；
（2）以PBS为对照组，用不含有胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释rLm-cystatin F至不同浓度（0~11.3 µM），依次加入等体积的PBS以及不同浓度的rLm-cystatin F，于37℃、二氧化碳培养箱中继续培养24 h；
（3）加入MTT溶液（终浓度为0.5 mg/mL），于37℃、二氧化碳培养箱中继续培养4 h；
（4）吸去培养液（不要吸到蓝紫色的甲瓒），加入100 μL DMSO，于37℃
摇床中振荡培养10 min；
（5）在492 nm处，利用酶标仪检测对照组和rLm-cystatin F处理组HUVECs的吸收值，并根据如下公式计算rLm-cystatin F对HUVECs增殖的影响。
HUVECs的增值率=rLm-cystatin F处理组在492 nm下吸光值的平均值/PBS组在492 nm下吸光值的平均值×100%，结果如图2所示。
结果表明：重组Lm-cystatin F（recombinant Lm-cystatin F，rLm-cystatin F）能够以剂量依赖性的方式显著抑制人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVECs）的增殖，其IC50为5 μM。
2. rLm-cystatin F对HUVECs分化形成小管的影响
（1）将96孔细胞培养板与枪头放入4℃冰箱过夜预冷；
（2）采用不含血清的1640培养液以1:1的比例稀释人工基底膜基质胶（Matrigel，8 mg/mL）；
（3）在96孔细胞培养板中分别加入40 μL稀释后的Matrigel胶，注意避免产生气泡；
（4）将96孔细胞培养板放入37℃细胞培养箱中40 min以促使Matrigel胶凝固；
（5）分别将混有PBS以及不同浓度的rLm-cystatin F（3和7 μM）的HUVECs细胞悬液缓慢均匀地加入到凝固好的Matrigel胶孔中（100 μL/孔），设置相应复孔；
（6）将96孔细胞培养板放入37℃细胞培养箱中培养4~12 h，随时观察小管形成的状态；
（7）采用光学显微镜观察膜上细胞小管状态并拍照，随机选择4个视野拍照并进行统计分析。
其中一个视野的图片及统计结果如图3所示。图3中0 μM为PBS对照培养孔，3 μM和7 μM分别为混有3 μM rLm-cystatin F和7 μM rLm-cystatin F的培养孔。
结果表明：在PBS处理组中，HUVECs分化形成的小管结构比较明显，能够形成一个交叉互联的网络结构，而经rLm-cystatin F处理后的HUVECs，在相同条件下HUVECs则不能分化形成小管结构。与PBS处理组相比，rLm-cystatin F能够以剂量依赖性地方式显著抑制HUVECs分化形成小管结构。rLm-cystatin F处理后的HUVECs，其分化形成的小管数量显著减少，表面积显著降低。与对照组相比，3和7 μM的rLm-cystatin F能够促使HUVECs分化形成小管的表面积分别下降了23.1% ± 6%（P < 0.05）和58.2% ± 6.23%（P < 0.01）。rLm-cystatin F能够抑制血管内皮细胞分化形成小管结构。
综上所述，rLm-cystatin F具有抗血管新生活性，即八目鳗口腔腺的cystatin F可应用于制备抗血管新生类药物。
对比实验：
一.未优化八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F
1. 将SEQ ID NO:1所示的基因克隆至表达载体pCold I并构建pCold I-Lm-cystatinF原核表达重组质粒；将测序正确的重组质粒pCold I-Lm-cystatin F 转化至E.coli BL21表达菌中，采用不同浓度的IPTG（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mM）于15℃分别诱导蛋白表达24 h。诱导后的菌液进行SDS-PAGE电泳以检测重组蛋白表达情况，结果如图4所示。图4中M：低分子量蛋白质marker；1：未诱导重组质粒pCold I-Lm-cystatin F；2-7：15℃分别采用不同终浓度IPTG（第二道至第七道分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mM）诱导pCold I-Lm-cystatin F表达24 h的菌液。
结果表明：在约19.85 kDa处（rLm-cystatin F为带有组氨酸标签的融合蛋白）有特异性表达的目的蛋白条带，但重组蛋白（rLm-cystatin F）的表达量极低。
2. 超声破碎表达菌，分别得到上清和沉淀，SDS-PAGE电泳图如图5所示。
图5中，M：低分子量蛋白质marker；1：未诱导重组质粒； 2、4、6、8、10、12：IPTG（终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mM）诱导pCold I-Lm-cystatin F表达的破菌上清；3、5、7、9、11、13：IPTG（终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mM）诱导pCold I-Lm-cystatinF表达的破菌沉淀。
结果表明：rLm-cystatin F不仅蛋白表达量极低，而且以包涵体形式存在。
二.优化八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F
1.优化八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F得到菌液的SDS-PAGE电泳如图6所示。图6中，1：低分子量蛋白质marker；2：未诱导pCold I-Lm-cystatin F；3：0.1 mM IPTG（终浓度）于15 ℃诱导空质粒pCold I表达24 h；4-9：采用终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mM的IPTG于15 ℃诱导pCold I-Lm-cystatin F表达24h。结果表明：在约19.85 kDa处有特异性表达的目的蛋白条带，且rLm-cystatin F的表达量相对较高。
结果表明：优化后的rLm-cystatin F表达量显著增加。
2. 优化八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F得到菌液上清和沉淀的SDS-PAGE电泳如图7所示。图7中，M：低分子量蛋白质marker；1：未诱导pCold I-Lm-cystatin F；2：诱导表达空质粒pCold I；3：采用终浓度为0.1 mM的IPTG诱导表达pCold I-Lm-cystatin F的破菌上清；4：采用终浓度为0.1 mM的IPTG诱导表达pColdI-Lm-cystatin F的破菌沉淀。
结果表明：优化后的rLm-cystatin F基因所得菌液在破菌上清中的表达含量比优化前显著上调，说明大部分rLm-cystatin F以可溶形式表达，为正确折叠的蛋白质。
序列表
<110> 辽宁师范大学
<120> 八目鳗口腔腺Cystatin F、制备方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> Lampetra morii
<220>
<221> exon
<222> (1)..(459)
<400> 1
tgtcccgtgt ggcatcgttg tccctactgc tgtgtggcct ctgcacttct gctgcgaggc 60
gctgcccgaa actcgctgga ggcccatgtg ggtgccccga ccgccatcca gaccacggac 120
ccgggcctcc accggcggcc gcggaggcca ctcgcctctt caactcgggc ctcaacgccg 180
cacggtctac agactcgaca gggtgacgaa ggccacacgc agattgtgag cggtctcaag 240
tacatctttg aggcagacct gaaggcacgg aatgcttgaa aatggaggaa cgagtggctg 300
aggactgcac tttcacgacg atggtgtagc cactgttttc aagtgccgct ttaggtgtgg 360
acaatcccct ggcgcaagca gaccaaggtg ctcagtaaag ctgcgagcaa aacaacccaa 420
tcaaaccttc taccatgcca acgcctaa 448
<210> 2
<211> 459
<212> DNA
<213> Lampetra morii
<220>
<221> exon
<222> (1)..(459)
<400> 2
atgtcccgtg tggcatcgtt gtccctactg ctgtgtggcc tctgctactt ctgctgcgag 60
gcgctgccgg aaacccgttg gcgtccgatg ctgggtgctc cgaccgctat ccagaccacc 120
gacccgggtc tgcacaccgc tgctgctgaa gctacccgtc tgttcaactc tggtctgaac 180
tctcgtaccg tttaccgtct ggaccgtgtt accaaagcta cccgtcagat cgtttctggt 240
ctgaaataca tcttcgaagc tgacctgaaa tctaccgaat gcctgaaaat ggaagaacgt 300
gttgctgaag actgcaactt ccacgacgac ggtgttgcta ccgttttcaa atgccgtttc 360
gaagtttgga ccatcccgtg gcgtaaacag accaaagttc tgtctcagtc ttgcgaacag 420
aacaacccga tcaaaccgtc taccatgccg aacgcttaa 459

Claims (3)

1. 一种八目鳗口腔腺CystatinF，其特征在于DNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2. 一种如权利要求1所述八目鳗口腔腺Cystatin F的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 将DNA序列如SEQ ID NO:2所示的基因克隆至表达载体pCold I并构建pCold I-Lm-cystatin F原核表达重组质粒；
b. 将pCold I-Lm-cystatin F原核表达重组质粒及含有分子伴侣pTf16的重组质粒同时转化至大肠杆菌BL21表达菌中；
c. 将阳性转化子接种至5 mL含有终浓度为0.1 mg/mL氨苄及终浓度为0.02 mg/mL氯霉素的LB培养基中，于37℃、120 rpm过夜振荡培养；
d. 将菌液加入到体积为500 mL的LB培养基中，于37℃、180 rpm培养至菌体达到对数生长期，即OD600值为0.4~0.6；
e. 诱导表达：IPTG的终浓度为0.1 mM；L-Arabinose的终浓度为0.5 mg/ml；温度为15℃；转数为100 rpm；时间为24 h；
f. 采用His-tag亲和层析柱纯化rLm-cystatin F：采用0.22 µm的滤器过滤得菌液上清；上样平衡后分别采用40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、200 mM、250 mM、300 mM、350 mM、400mM的咪唑洗脱并收集洗脱液，即得到重组八目鳗口腔腺Cystatin F。
3. 一种如权利要求1所述八目鳗口腔腺Cystatin F在制备抗血管新生药物中的应用。
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