CN117025655B - 一种提高人源ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体、基因工程菌及方法和应用 - Google Patents

一种提高人源ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体、基因工程菌及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体、基因工程菌及方法和应用。所述基因表达载体是将pPIC9K‑COⅢ表达载体自身的α‑factor信号肽替换为AF2信号肽；所述AF2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用信号肽工程技术筛选到了适宜Ⅲ型重组胶原蛋白高效分泌表达的AF2信号肽，然后将pPIC9K‑COⅢ表达载体自身的α‑factor信号肽替换为AF2信号肽，进而获得可以高产人源Ⅲ型重组胶原蛋白的基因工程菌SMD1163/pPIC9K‑AF2‑COⅢ。本发明还提供了利用基因工程菌SMD1163/pPIC9K‑AF2‑COⅢ提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白的方法，使得本发明人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量达到了20.25g/L。

Description

一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体、基因 工程菌及方法和应用
技术领域
本发明涉及一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体、基因工程菌及方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
胶原蛋白是一类纤维状、大分子蛋白质，具有优异的生物相容性和生物可降解性等生物学功能特性，已成为生物材料和再生医学等领域最广泛使用的蛋白质材料之一，广泛应用于美容填充、药物递送系统、手术缝合和组织工程支架等领域，起到支撑、修复、抗衰老作用。依据其蛋白质结构和氨基酸组成的差异，人体胶原蛋白可分为28种，Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白主要存在于皮肤、肌腱、韧带、关节等结缔组织，构成细胞外基质网状结构，是真皮层中最主要的胶原蛋白类型，因此Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白在医美美容、功效护肤、护发等产品中应用最广。
传统的胶原蛋白主要来源于动物组织，一般利用酸解、碱解或酶解进行组织提取，此类胶原蛋白存在病毒隐患、免疫原性、成分复杂、易导致免疫排斥反应等缺陷。重组胶原蛋白与动物来源的天然胶原蛋白相比，具有成分单一、保留胶原空间结构和生物活性、与人体同质同源且亲和力高、无病毒风险、不易发生过敏反应和品质可控等优势。
中国专利文献CN110606896A公开了一种重组Ⅲ型胶原蛋白α1链及其应用，所述α1链从氨基端依次包含亲和纯化标签、人源Ⅲ型胶原成熟肽链和羧基端亲和纯化标签，其表达的Ⅲ型胶原蛋白成熟肽链，去掉了两端的前肽。然而该专利未报道重组Ⅲ型胶原蛋白表达量，可能无法工业化生产重组Ⅲ型胶原蛋白。
中国专利文献CN109593126A提供了重复序列组成的多肽，以及其表达载体、宿主细胞、生产方法和应用，其表达的Ⅲ型胶原蛋白HC16在Ni柱和阴离子交换后，1L菌液得到8mg左右纯蛋白，TE16C经过纯化后，得到15mg左右纯蛋白，其表达量和纯化收率都比较低，难以实现在大规模工业尺度的量产。
中国专利文献CN112552393A公开了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统。将人源Ⅲ型胶原蛋白部分肽段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的Gly X Y结构肽以使用频率较高的不含上述氨基酸的Gly X Y结构肽替换，根据替换后肽段获得编码肽段的基因序列，然后构建用于串联表达不同重复数目肽段的基因表达载体并转化毕赤酵母宿主菌，筛选获得高表达重组人源III型胶原蛋白的菌株。但是该专利甲醇诱导后发酵产量仅为4～5g/L，根本无法满足现有需求。
重组胶原蛋白在发酵表达时存在分泌效率低下、易于降解等问题，导致其总表达量较低且下游纯化复杂，产品质量不稳定，影响后续应用，因此急需研发一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体和基因工程菌。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体、基因工程菌及方法和应用。
本发明的技术方案如下：
一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体，所述基因表达载体是将pPIC9K-COⅢ表达载体自身的α-factor信号肽替换为AF2信号肽；所述AF2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述pPIC9K-COⅢ表达载体是委托华大基因科技公司人工合成人源Ⅲ型胶原蛋白的基因，通过限制性内切酶EcoR I和NotI酶切位点连接至表达载体pPIC9K，构建得到。
根据本发明优选的，所述人源Ⅲ型重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明制备的胶原蛋白选取自人源Ⅲ型胶原蛋白全长序列的第479位氨基酸至1135位氨基酸，是人源Ⅲ型胶原蛋白三螺旋结构区域的核心功能区，其蛋白氨基酸序列与人源Ⅲ型胶原蛋白全长序列的同源性为100％，与全长序列相比具有更高的生物活性、更高的表达水平、不易降解。
本发明还提供了上述提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体的构建方法，具体是：
以pPIC9K-COⅢ表达载体为骨架，将AF2信号肽克隆到pPIC9K-COⅢ表达载体BamHⅠ和SnaBⅠ两个酶切位点间，替换掉pPIC9K-COⅢ表达载体自身的α-factor信号肽，得到提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体pPIC9K-AF2-COⅢ。
本发明还提供了含有上述提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因表达载体的基因工程菌。
根据本发明优选的，所述基因工程菌的基础菌为蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163。
本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，具体是：
将线性化的基因表达载体pPIC9K-AF2-COⅢ转化至毕赤酵母感受态细胞中，然后涂布于MD固体培养基，置于30℃培养箱培养3～4d，挑选阳性重组子，得到提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ。
本发明还提供了上述基因表达载体或上述基因工程菌在提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量中的应用。
本发明还提供了一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，将上述基因工程菌在培养基中进行培养。
根据本发明优选的，所述提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)将基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ按照5％～10％体积比的接种量接种于YPD液体培养基，在25～35℃、200～240r/m下摇床振荡培养20～24h，得到种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液按照5～10％的体积比接种至含有BSM Plus培养基的全自动发酵罐中，在29～31℃下初始培养20～22h，然后流加甘油溶液，培养至菌体湿重达到180～190g/L时，停止流加甘油，降低发酵温度至24～26℃，饥饿培养50～70min后流加甲醇，自流加甲醇后开始计时，诱导发酵培养72～84h后添加蛋白酶抑制物，继续诱导发酵培养至100～108h，得到含有人源Ⅲ型重组胶原蛋白的发酵液。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述BSM Plus培养基为：甘油35～45g/L，硫酸钾9g/L，七水硫酸镁7.5g/L，氢氧化钾2.5～3g/L，磷酸15～20g/L，二水硫酸钙0.42g/L，酵母浸粉5～10g/L，消泡剂0.6g/L。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述全自动发酵罐的容积为10L，反应初始时全自动发酵罐含有4L的BSM Plus培养基。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述初始培养的条件为：pH值为5.0，搅拌转速200r/m，通气量为10L/m，控制溶氧＞20％。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述甘油溶液的浓度为50％(w/V)，并且含有12mL/L的PTM1微量元素液，甘油流加速率为70～90g/h。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述甲醇的浓度为100％，并且含有12mL/L的PTM1微量元素液，甲醇流加速率为10～40g/h。
进一步优选的，所述甲醇流加速率具体为：先按照12～13g/h流加1～2h，然后按18～19g/h流加2～3h，再按24～25g/h流加1～3h，最后按33～35g/h流加至诱导发酵结束。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述蛋白酶抑制物为酪蛋白水解物、植物蛋白胨、硫酸铵或尿素的中的一种或几种混合物，添加后的终浓度为1～2g/L。
本发明的有益效果在于：
1、本发明利用信号肽工程技术筛选到了适宜Ⅲ型重组胶原蛋白高效分泌表达的AF2信号肽，然后将pPIC9K-COⅢ表达载体自身的α-factor信号肽替换为AF2信号肽，得到的基因表达载体pPIC9K-AF2-COⅢ能够促进人源Ⅲ型重组胶原蛋白的表达，提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白的产量，再以蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163作为表达宿主菌，进而获得可以高产人源Ⅲ型重组胶原蛋白的基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ。
2、本发明还提供了利用基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白的方法，通过高密度发酵优化工艺参数，通过控制甲醇流加速率，实现高密度发酵，又通过控制细胞密度值来实现重组Ⅲ型胶原蛋白的高产，同时在发酵过程中补加抑制胶原蛋白降解的抑制物减少胶原蛋白的降解，提高胶原蛋白的表达量，使得本发明人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量达到了20.25g/L。
附图说明
图1为pPIC9K-COⅢ表达载体的结构示意图。
图2为实施例3中SDS-PAGE分析人源Ⅲ型重组胶原蛋白表达情况电泳图。
图3为实验例分析不同甲醇诱导时间10-L发酵罐高密度发酵液蛋白电泳图；
图中，N+24代表甲醇诱导24h，N+48代表甲醇诱导48h，N+72代表甲醇诱导72h，N+84代表甲醇诱导84h，N+96代表甲醇诱导96h，N+108代表甲醇诱导108h。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图，对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。除非特殊说明，本发明中所运用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。除非特殊说明，本发明中所涉及的试剂及药品均为普通市售产品。
本发明中使用的蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163、大肠杆菌E.coli-DH5α均为普通市售菌种，在Invitrogen公司有售。
实施例1、表达载体的构建
1、委托华大基因科技公司合成SEQ ID NO.4所示的人源Ⅲ型胶原蛋白的基因，通过限制性内切酶EcoR I和Not I酶切位点连接至表达载体pPIC9K，得到pPIC9K-COⅢ基因表达表达载体。通过NCBI blast功能搜索与α-factor信号肽具有较低同源性的信号肽序列，分析信号肽在促进蛋白分泌方面的潜力，选定HKR1、YTP1、SCS3、nsB、AF1、AF2和AF3信号肽，委托华大基因科技有限公司按照氨基酸序列人工合成以上信号肽的基因序列，5’端带有BamH I限制性内切酶酶切位点，3’端带有SnaB I酶切位点。
2、以pPIC9K-COⅢ表达载体(图1)为骨架，将HKR1、YTP1、SCS3、nsB、AF1、AF2和AF3信号肽克隆到pPIC9K-COⅢ表达载体BamHⅠ和SnaBⅠ两个酶切位点间，替换掉pPIC9K-COⅢ表达载体自身的α-factor信号肽，得到基因表达载体pPIC9K-HKR1-COⅢ、pPIC9K-YTP1-COⅢ、pPIC9K-SCS3-COⅢ、pPIC9K-nsB-COⅢ、pPIC9K-AF1-COⅢ、pPIC9K-AF2-COⅢ和pPIC9K-AF3-COⅢ。
所述克隆信号肽可采取限制性内切酶双酶切后连接，或融合PCR方法进行，两者属于常规分子克隆方法。
然后将基因表达载体pPIC9K-HKR1-COⅢ、pPIC9K-YTP1-COⅢ、pPIC9K-SCS3-COⅢ、pPIC9K-nsB-COⅢ、pPIC9K-AF1-COⅢ、pPIC9K-AF2-COⅢ和pPIC9K-AF3-COⅢ分别转化至大肠杆菌E.coli-DH5α中，经过氨苄抗性筛选得到菌株E.coli-DH5α/pPIC9K-HKR1-COⅢ、E.coli-DH5α/pPIC9K-YTP1-COⅢ、E.coli-DH5α/pPIC9K-SCS3-COⅢ、E.coli-DH5α/pPIC9K-nsB-COⅢ、E.coli-DH5α/pPIC9K-AF1-COⅢ，E.coli-DH5α/pPIC9K-AF2-COⅢ和E.coli-DH5α/pPIC9K-AF3-COⅢ，经由华大基因科技有限公司进行测序验证，确认表达载体构建成功。
所述所述AF2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。所述HKR1、YTP1、SCS3、nsB、AF1和AF3信号肽的氨基酸序列如表1所示。
表1
实施例2、重组菌株的构建
1、重组质粒的提取和线性化
将菌株E.coli-DH5α/pPIC9K-HKR1-COⅢ、E.coli-DH5α/pPIC9K-YTP1-COⅢ、E.coli-DH5α/pPIC9K-SCS3-COⅢ、E.coli-DH5α/pPIC9K-nsB-COⅢ、E.coli-DH5α/pPIC9K-AF1-COⅢ，E.coli-DH5α/pPIC9K-AF2-COⅢ和E.coli-DH5α/pPIC9K-AF3-COⅢ在LB固体培养基上(含氨苄青霉素100mg/L)培养至长出单菌落，然后分别挑取单菌落接种于LB液体培养基中(含氨苄青霉素100mg/L)，在37℃、220r/m震荡培养过夜，按照质粒提取试剂盒的要求提取重组质粒，得到重组质粒pPIC9K-HKR1-COⅢ、pPIC9K-YTP1-COⅢ、pPIC9K-SCS3-COⅢ、pPIC9K-nsB-COⅢ、pPIC9K-AF1-COⅢ、pPIC9K-AF2-COⅢ和pPIC9K-AF3-COⅢ。
分别取重组质粒pPIC9K-HKR1-COⅢ、pPIC9K-YTP1-COⅢ、pPIC9K-SCS3-COⅢ、pPIC9K-nsB-COⅢ、pPIC9K-AF1-COⅢ、pPIC9K-AF2-COⅢ和pPIC9K-AF3-COⅢ各20μL，加入酶切buffer 2.5μL，加入限制性内切酶SalⅠ2.5μL，37℃酶切60min，得到线性化的基因表达载体pPIC9K-HKR1-COⅢ、pPIC9K-YTP1-COⅢ、pPIC9K-SCS3-COⅢ、pPIC9K-nsB-COⅢ、pPIC9K-AF1-COⅢ、pPIC9K-AF2-COⅢ和pPIC9K-AF3-COⅢ。
2、毕赤酵母感受态细胞的制备和电击转化
将蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163在YPD固体培养基上划线活化培养2d，挑取单菌落接种于50mL YPD液体培养基，在30℃，220r/m摇床过夜。再以1％体积百分比的接种量转接至100mL YPD液体培养基，过夜培养至OD600达到1.3～1.5，取培养液，在4℃、5000r/m离心5min，弃上清，用100mL冰预冷无菌水将菌体重悬，在4℃、5000r/m离心10min，弃上清，用50mL冰预冷的无菌水将菌体重悬，在4℃、5000r/m离心10min，弃上清，用10mL 1.0mol/L的山梨醇洗涤1次，离心溶于100μL 1.0mol/L的冰预冷的山梨醇，得到蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163感受态细胞以备转化。
在100μL蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163中分别加入20μL线性化的基因表达载体pPIC9K-HKR1-COⅢ、pPIC9K-YTP1-COⅢ、pPIC9K-SCS3-COⅢ、pPIC9K-nsB-COⅢ、pPIC9K-AF1-COⅢ、pPIC9K-AF2-COⅢ和pPIC9K-AF3-COⅢ，于冰上放置15min后，迅速转移至0.2cm电击杯中冰预冷、电击，再迅速加入山梨醇，涂布于MD固体培养基，置于30℃培养箱培养3～4d，得到基因工程菌SMD1163/pPIC9K-HKR1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-YTP1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-SCS3-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-nsB-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-AF1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ和SMD1163/pPIC9K-AF3-COⅢ。
同时按照相同的方法将pPIC9K-COⅢ表达载体转化至蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163中，得到对照菌株SMD1163/pPIC9K-α-factor-COⅢ。
实施例3、高产人源Ⅲ型重组胶原蛋白基因工程菌的筛选
1、取实施例2在MD固体培养基生长出的基因工程菌SMD1163/pPIC9K-HKR1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-YTP1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-SCS3-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-nsB-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-AF1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-AF3-COⅢ和对照菌株，分别划线点种于含有不同G418抗性浓度的YPD固体平板上，置于30℃培养箱培养1～2d，所述G418浓度分别是1g/L、2g/L、4g/L、6g/L，选择能在6g/L抗性浓度上长出来的基因工程菌单菌落。
2、挑取6g/L抗性浓度上长出来的基因工程菌单菌落接种于YPD液体培养基中，在30℃，220r/m摇床震荡培养20～24h，取种子液，以5％体积百分比的接种量接种于BMGY培养基(酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10g/L，pH 6.0磷酸钾缓冲液100mL)中，在30℃，220r/m摇床震荡培养至OD600达到10～15，在4℃5000r/m离心5min，去上清液，用BMMY培养基(酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇10mL/L，pH 6.0磷酸钾缓冲液100mL)重悬沉淀，25℃220r/m诱导培养至96h，每24h补加1％体积的甲醇。取发酵液离心，取离心上清液进行SDS-PAGE分析，根据条带的强弱判断人源Ⅲ型重组胶原蛋白表达情况，结果如图2所示。
在同样上样量10μL的前提下，摇瓶发酵上清液中蛋白含量与SDS-PAGE上条带的亮度正相关，由图2可知，SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ菌株发酵上清液中蛋白含量明显高于SMD1163/pPIC9K-HKR1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-YTP1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-SCS3-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-nsB-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-AF1-COⅢ、SMD1163/pPIC9K-AF3-COⅢ和对照菌株，说明AF2信号肽能够有效促进人源Ⅲ型胶原蛋白的表达，进而提高人源Ⅲ型胶原蛋白的产量。
实施例4
一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)将基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ按照5％的体积比接种于YPD液体培养基，在30℃、220r/m下摇床振荡培养22h，得到种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液按照10％的接种量接种于10L全自动发酵罐(反应初始时全自动发酵罐含有4L的BSM Plus培养基)，控制温度为30℃，使用25％氨水调节pH为5.0，搅拌转速200r/m，通气量为10L/m，通过提高搅拌转速和通气量维持溶氧在20％以上，培养至20h时，初始甘油消耗完毕，出现溶氧回升，按照75g/h速率流加50％(w/V)甘油溶液(含12mL/L PTM1微量元素液)，搅拌转速与溶氧相关联，控制溶氧＞20％，待菌体湿重达到180g/L时，停止甘油流加，降低发酵温度至25℃，饥饿培养60min，然后流加100％甲醇(含12mL/L PTM1微量元素液)，自流加甲醇后开始计时，诱导发酵培养72h(诱导发酵过程控制溶氧＞20％)，再添加1g/L的蛋白酶抑制物，诱导发酵培养至100h，停止诱导发酵培养，得到含有人源Ⅲ型重组胶原蛋白的发酵液。
其中，所述甲醇流加速率具体为：先按照12g/h流加2h，然后按18g/h流加2h，再按24g/h流加2h，最后按33g/h流加至诱导发酵结束。
所述BSM Plus培养基为：甘油40g/L，硫酸钾9g/L，七水硫酸镁7.5g/L，氢氧化钾2.6g/L，磷酸15g/L，二水硫酸钙0.42g/L，酵母浸粉5g/L，消泡剂0.6g/L。蛋白酶抑制物为酪蛋白水解物和尿素质量比为40：60组成的混合物。
实施例5
一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)将基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ按照10％的体积比接种于YPD液体培养基，在30℃、220r/m下摇床振荡培养22h，得到种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液按照5％的接种量接种于10L全自动发酵罐(反应初始时全自动发酵罐含有4L的BSM Plus培养基)，控制温度为29℃，使用25％氨水调节pH为5.0，搅拌转速200r/m，通气量为10L/m，通过提高搅拌转速和通气量维持溶氧在20％以上，培养至19h时，初始甘油消耗完毕，出现溶氧回升，按照85g/h速率流加50％(w/V)甘油溶液(含12mL/L PTM1微量元素液)，搅拌转速与溶氧相关联，控制溶氧＞20％，待菌体湿重达到190g/L时，降低发酵温度至25℃，饥饿培养1h，然后流加100％甲醇(含12mL/L PTM1微量元素液)，自流加甲醇后开始计时，诱导发酵培养72h(诱导过程控制溶氧＞20％)，再添加2g/L的蛋白酶抑制物，诱导发酵培养至108h，停止诱导发酵培养，得到含有人源Ⅲ型重组胶原蛋白的发酵液。
其中，所述甲醇流加速率具体为：先按照13g/h流加1h，然后按19g/h流加3h，再按25g/h流加2h，最后按35g/h流加至诱导发酵结束。
所述BSM Plus培养基为：甘油45g/L，硫酸钾9g/L，七水硫酸镁7.5g/L，氢氧化钾3g/L，磷酸15g/L，二水硫酸钙0.42g/L，酵母浸粉8g/L，消泡剂0.6g/L。所述蛋白酶抑制物为酪蛋白水解物、植物蛋白胨、硫酸铵、尿素质量比为40：25：15：20组成的混合物。
在甲醇诱导发酵过程中，分别在甲醇诱导的第24h，48h，72h，96h，108h取发酵液，对发酵液离心，取离心上清液进行SDS-PAGE分析，在同样上样量10μL的前提下，发酵上清液中蛋白含量与SDS-PAGE上条带的亮度正相关结果如图3所示。
由图3可知，随着甲醇诱导时间的延长发酵上清液中人源Ⅲ型重组胶原蛋白的含量在不断增加。
实施例6
一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)将基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ按照10％的体积比接种于YPD液体培养基，在30℃、220r/m下摇床振荡培养22h，得到种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液按照5％的接种量接种于10L全自动发酵罐(反应初始时全自动发酵罐含有4L的BSM Plus培养基)，控制温度为29℃，使用25％氨水调节pH为5.0，搅拌转速200r/m，通气量为10L/m，通过提高搅拌转速和通气量维持溶氧在20％以上，培养至19h时，初始甘油消耗完毕，出现溶氧回升，流加50％(w/V)甘油溶液(含12mL/LPTM1微量元素液)，搅拌转速与溶氧相关联，控制溶氧＞20％，待菌体湿重达到190g/L时，降低发酵温度至25℃，饥饿培养1h，然后流加100％甲醇(含12mL/L PTM1微量元素液)，自流加甲醇后开始计时，诱导发酵培养84h(诱导过程控制溶氧＞20％)，再添加2g/L的蛋白酶抑制物，诱导发酵培养至108h，停止诱导发酵培养，得到含有人源Ⅲ型重组胶原蛋白的发酵液。
其中，所述甘油加速率具体为：先按照70g/h流加2h，然后按80g/h流加2h，最后按85g/h流加至菌体湿重达到190g/L。所述甲醇流加速率具体为：先按照12g/h流加1h，然后按19g/h流加2h，再按25g/h流加3h，最后按35g/h流加至诱导发酵结束。
所述BSM Plus培养基为：甘油40g/L，硫酸钾9g/L，七水硫酸镁7.5g/L，氢氧化钾3g/L，磷酸15g/L，二水硫酸钙0.42g/L，酵母浸粉10g/L，消泡剂0.6g/L。蛋白酶抑制物为酪蛋白水解物、植物蛋白胨、硫酸铵、尿素质量比为40：25：15：20组成的混合物。
对比例1
一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，具体步骤同实施例5，不同之处在于甲醇诱导发酵培养过程中不添加蛋白酶抑制物。
对比例2
将实施例2中构建的对照菌株SMD1163/pPIC9K-α-factor-COⅢ按照实施例5所述的方法制备人源Ⅲ型重组胶原蛋白。
对比例3
一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，具体步骤同实施例5，不同之处在于，流加100％甲醇(含12mL/L PTM1微量元素液)后，诱导发酵培养24h。
对比例4
一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，具体步骤同实施例5，不同之处在于，流加100％甲醇(含12mL/L PTM1微量元素液)后，诱导发酵培养48h。
实验例
1、发酵液中人源Ⅲ型重组胶原蛋白含量的测定方法
采用中国药典蛋白含量测定第四法2,2’-联喹啉-4,4’-二羧酸法(BCA法)检测实施例4～6和对比例1～4所得发酵离心上清液中的人源Ⅲ型重组胶原蛋白含量。
试剂铜-BCA试液取2,2’-联喹啉-4,4’-二羧酸钠1g；无水碳酸钠2g，酒石酸钠0.16g；氧氧化钠0.4g与碳酸氨钠0.95g，加水使溶解成100mL，调节pH值至11.25，作为甲液；另取4％硫酸铜溶液作为乙液。临用前取甲液100mL，加入乙液2ml，混匀，即得。
对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每1ml中含0.8mg的溶液。
供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。
测定法精密量取对照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL(对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整)，分别置具塞试管中，各加水至0.5mL，再分别加入铜-BCA试液10.0mL，立即混匀，置37℃水浴中保温30分钟，放冷，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，立即在562nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。
2、发酵液菌体湿重的测定方法
取2支干净的5mL离心管，用万分之一的分析天平称量其质量，计数为m0，然后每支离心管中加入4mL发酵液，10000r/m离心5min，轻轻倒出上清液，把离心管内壁残留的液滴吸干，称量离心管质量m1，菌体湿重(g/L)＝(m1-m0)*250。计算结果以两支离心管试验结果取平均数为准。
3、采用以上方法，测定实施例4～6和对比例1～4所得的发酵液中人源Ⅲ型重组胶原蛋白含量和菌体湿重，结果如表2。
表2
由表2可知，实施例4～6所得的发酵液中人源Ⅲ型重组胶原蛋白含量明显高于对比例2，说明本发明采用AF2信号肽构建的基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ的人源Ⅲ型重组胶原蛋白明显高于对照菌株SMD1163/pPIC9K-α-factor-COⅢ，说明了AF2信号肽能够有效促进人源Ⅲ型胶原蛋白的表达，进而提高人源Ⅲ型胶原蛋白的产量。实施例4～6所得的发酵液中人源Ⅲ型重组胶原蛋白含量明显高于对比例1，说明了本发明在发酵过程中补加抑制胶原蛋白降解的抑制物，有效减少胶原蛋白的降解，提高胶原蛋白的表达量。实施例4～6所得的发酵液中人源Ⅲ型重组胶原蛋白含量明显高于对比例3～4，说明了本发明提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白的方法，通过高密度发酵优化工艺参数，通过控制甲醇流加速率，实现高密度发酵，又通过控制细胞密度值来实现重组Ⅲ型胶原蛋白的高产。并且以上几个因素结合后，使得本发明人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量达到了20.25g/L。

Claims (4)

1.一种提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，其特征在于，包括步骤如下：
（1）将基因工程菌SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ按照5%~10%体积比的接种量接种于YPD液体培养基，在25~35℃、200~240r/m下摇床振荡培养20~24h，得到种子液；
其中，所述SMD1163/pPIC9K-AF2-COⅢ是含有基因表达载体pPIC9K-AF2-COⅢ的基因工程菌；所述基因表达载体pPIC9K-AF2-COⅢ是将pPIC9K-COⅢ表达载体自身的α-factor信号肽替换为AF2信号肽而得到；所述AF2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）将步骤（1）得到的种子液按照5~10%的体积比接种至含有BSM Plus培养基的全自动发酵罐中，在29~31℃下初始培养20~22h，然后流加甘油溶液，培养至菌体湿重达到180~190g/L时，停止流加甘油，降低发酵温度至24~26℃，饥饿培养50~70min后流加甲醇，自流加甲醇后开始计时，诱导发酵培养72~84h后添加蛋白酶抑制物，继续诱导发酵培养至100~108h，得到含有人源Ⅲ型重组胶原蛋白的发酵液。
2.如权利要求1所述的提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，其特征在于，所述人源Ⅲ型重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.如权利要求1所述的提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，其特征在于，所述基因工程菌的基础菌为蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163。
4.如权利要求1所述的提高人源Ⅲ型重组胶原蛋白产量的方法，其特征在于，步骤（2）中， 所述蛋白酶抑制物为酪蛋白水解物、植物蛋白胨、硫酸铵或尿素的中的一种或几种混合物，添加后的终浓度为1~2g/L。
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